Bioensaios celulares: Princípios e Aplicações

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Bioensaios celulares:
Princípios e Aplicações
Letícia Veras Costa Lotufo
Laboratório de Oncologia Experimental
Departamento de Fisiologia e Farmacologia,
UFC
[email protected] PROGRAMA:
• 11/02
– aula 1 - Princípios básicos – Ensaios de
citotoxicidade
– aula 2 –Aplicações no estudo de novas drogas
anticâncer
• 12/02
– aula 3 – Aplicações no estudo de novas drogas
anticâncer
– aula 4 - Morte celular: apoptose versus necrose
CITOESQUELETO
Microtúbulos
(Tubulina)
Actina
Proteínas
motoras
Aurora,
Pólo
quinases
Quinesinas
MICROTÚBULOS
Segregação
cromossômica
Aurora
papel
central
na
orientação
dos
cromossomos
Mayer
et
al.,
1999,
Science
286,
971.
BIOENSAIOS:
• Polimerização
de
tubulina
in
vitro
• Ensaios
de
ligação
(“binding”)
–
sítios:
taxol,
alcalóides
da
vinca
e
colchicina
• Microscopia
confocal
Polimerização/despolimerização
Tubulina
Ensaio clássico – baseia-se na leitura de absorbância a 340 nm Atualmente pode ser realizado a partir da incorporação de um
marcador fluorescentes na tubulina
Ensaios
de
Ligação
Ensaios
de
Ligação
Ensaios
de
Ligação
Ensaios
de
saturação
Ligação
Ensaios
de
competição
Log [Ligante] M
Imunofluorescência
para
citoesqueleto
Microscopia
confocal
24h
Adição
das
drogas
24h
PBS
Fixadas
e
Permeabilizadas
RNAse
PI
Zeiss
LSM
510
α‐tubulina
24h
Ac‐Cy5
3h
Faloidina‐FICT
VIAS DE MORTE
CELULAR
Apoptose vs. Necrose
APOPTOSE
Definição
• Descrita em 1972 e denominada
seguindo o termo grego “cair fora”.
• Termo “ morte programada da célula
( PCD ) ”
Apoptose
Apoptose-like PCD
Necrose-like PCD
APOPTOSE
Definição
• “É uma forma de morte celular destinada a
eliminar células indesejáveis, do hospedeiro,
através da ativação de uma série coordenada e
programada de eventos executados por um
conjunto exclusivo de produtos gênicos”.
( Robbins, 2000).
APOPTOSE
1. Durante o desenvolvimento 2. Mecanismo homeostático
para manter as
populações celulares nos tecidos
3. Mecanismo de defesa, como nas reações
imunes
4. Quando as células são lesadas por uma
doença ( corpúsculos de Councilman) ou
agentes nocivos ( calor, radiação, hipóxica,
drogas anti-câncer citotóxicas)
5. Envelhecimento MECANISMOS MOLECULARES
Via Intrínseca:
MECANISMOS MOLECULARES
• Via extrínsica
Ativação de pro-caspases pelo TNF-α e Fas ligante.
Receptores da superfície celular associa-se com uma proteína
adaptadora com domímio de morte.
• Apoptose mediada por Fas-Fas ligante ( eliminação de linfócitos
ativados de uma reação imune)
MECANISMOS MOLECULARES
Via extrínsica
• Apoptose
induzida
por
TNF
TNF
–
R1
TRADD
FADD
Ativação
do
fator
de
transcrição
nuclear
‐
κB
ao
estimular
a
degradação
do
seu
inibidor
(
I
κB)
MECANISMOS MOLECULARES
• Apoptose
estimulada
por
linfócitos
T
citotóxicos
LTC
–
estimula
a
secreção
de
perfurina
Serina‐protease
granzima
B
–
cliva
proteínas
com
resíduos
de
aspartato
e
ativa
caspases.
• Apoptose
após
privação
de
fator
de
crescimento
Bcl‐2
movem‐se
para
o
citosol
Aumento
da
permeabilidade
da
membrana
• Apoptose
mediada
por
lesão
de
DNA
DNA
lesado
–
acúmulo
de
p53
–
interrompe
o
ciclo
celular
na
fase
G1.
Falha
do
reparo
apoptose.
Vias não-apoptóticas de morte
celular
• Necrose
• Morte
celular
autofágica
• Morte
celular
independente
de
caspase
Ativação
de
caspases
Clivagem
da
bomba
de
cálcio
Fragmentação
de
DNA
por
caspases
Análise morfológica – Coloração Diferencial
por Brometo de Etídio/Laranja de Acridina
Montar placa
Incubar com
droga
BE
LA
Contagem
24h
Célula viável
Célula apoptótica
Núcleo
Célula necrótica
MCGAHON et al., 1995
Citometria de fluxo
Fluxo
de
Amostra
Detectores
Forward Angle
Foward
Light Scatter
Light
Angle
Scatter
Amostra
Side Angle
Side
Light Scatter
Tampão
Filtros
Ópticos
Laser
Lixo
Sistema
de Luzes
Sistema
Fluídico
Light
Angle
Scatter
Green
Green
fluorescence
Flourescen
FL1
ce (FL1
)
Red-Orange
Orang
-Red
Flourescen
efluorescence
FL2
ce (FL2
)
Red
Red
fluorescence
Flourescen
FL3
ce (FL3
)
Sistema Óptico e
Eletrônico
Forward Angle
Light Scatter
Fluorescência
Sistemas de Controle
e Arquivo de Dados
Visão dos Dados
• HISTOGRAMA:
– Intensidade de fluorescência x número de células
FITC
FITC
FITC
Number of Events
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
Counts
FITC
Positive cells
FITC
100
101
102
FL-2
Intensidade de Fluorescência
103
104
INTEGRIDADE DA MEMBRANA CELULAR
CITOMETRIA DE FLUXO
Montar placa
Incubar
PBS
com droga centrifuga
24h
PI
Fragmentação do DNA
Citometria de fluxo
Montar placa
Incubar
com droga
24h
PI + tampão de lise
centrifuga
30 mim
DNA
Ladder
Potencial transmembrânico da
mitocôndria - Citometria de fluxo
Montar placa
Rodamina
Incubar
com droga
24h
centrifugar
centrifugar
15 mim
PBS
Identificação de fosfotidilserina
externalizada - Anexina V
Ativação
de
CASPASES
• Citometria
de
fluxo
• Western
Blot
(Eletroforese)
• Kits
colorimétricos
• Kits
fluorimátricos

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