Modelo estatístico para a homogeneização de animais

Modelo estatístico para a homogeneização de animais induzidos à
estenose aórtica
Renan Mercuri Pinto1
Dijon Henrique Salomé de Campos2
Antonio Carlos Cicogna2
Carlos Roberto Padovani1
1 Introdução
Normalmente, devido à falta de conhecimento estatístico, muitos pesquisadores optam
por utilizar métodos empíricos ou subjetivos para a tomada de decisão, ignorando os
princípios básicos da experimentação animal e, consequentemente, influenciando seus
resultados.
Um exemplo de influência negativa muito comum ocorre no processo de
homogeneização de amostras, fator imprescindível para o processo de randomização em
pesquisas envolvendo animais como unidade experimental. Nessa situação, tem-se o hábito
errôneo de fazê-la de maneira fragmentada ou intencional, utilizando variáveis convenientes
para classificar o lote como homogêneo. Fator que, além de resultar numa homogeneização
viesada e inadequada, favorece a possibilidade de descartar animais por simples valor espúrio
do que por dessemelhança biológica.
O processo de homogeneização ideal deve considerar conjuntamente todas as variáveis
mensuradas na unidade experimental, pois estas são correlacionadas e, a melhor forma de
entender o comportamento animal está expressa no conjunto de medidas que representa todas
as características biológicas do animal. Dessa forma, há necessidade de métodos que levem
em consideração a situação biológica como um todo e não de maneira fracionada, já que o
animal reage de maneira conjunta a qualquer intervenção ou tratamento.
Neste enfoque de raciocínio, o Grupo de Pesquisa em Cardiologia Experimental da
Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB) - UNESP, tem procurado um critério objetivo e
com alta acurácia para a homogeneização de animais induzidos à Estenose Aórtica (EAo) no
estudo da Insuficiência Cardíaca.
Recentemente, o modelo de EAo supravalvar tem sido preferido para promover o
desenvolvimento gradual de hipertrofia ventricular esquerda em ratos (BREGANOLLO,
1
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Departamento de Bioestatística – IB/UNESP. e-mail: [email protected]
Faculdade de Medicina de Botucatu/UNESP. e-mail: [email protected]
1
2006). Neste modelo, quando a constrição aórtica é realizada, a sobrecarga pressórica
acentua-se progressivamente à medida que os animais crescem, assemelhando-se
parcialmente à EAo no homem (MESTRINEL, 2003). Destacam-se como algumas vantagens
neste procedimento experimental a ausência de lesões anatômicas no miocárdio e baixo custo
operacional (BREGANOLLO et al. ,2007).
Sob esse aspecto e aproveitando a diversidade de pesquisadores de várias áreas
envolvidos no Grupo de Pesquisa, buscou-se um modelo que considere descartar o menor
número possível de animais e preserve a máxima semelhança biológica entre os não
descartados.
2 Material e métodos
Todos os animais (ratos Wistar machos, com 21 dias de idade, originários do Biotério
Central da FMB) participantes do estudo “Influência do aumento energético derivado de dieta
hiperlipídica insaturada na atenuação da disfunção cardíaca em ratos com estenose aórtica
supravalvar: participação das miosinas de cadeia pesada e de bomba de cálcio do retículo
sarcoplasmático”, aprovada pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da FMB, sob o
número 850/2010, foram submetidos à cirurgia prévia para indução de EAo e permaneceram
em processo de seguimento temporal durante seis semanas quando foram avaliados por
ecocardiograma, o qual forneceu informações a respeito de 34 variáveis.
A construção do critério estatístico para verificar a homogeneidade do lote de ratos
envolveu simultaneamente todas as 34 variáveis mensuradas no animal e levou em
consideração toda a estrutura de variação existente nos dados, ou seja, a variação dentro
(intravariabilidade) e entre (intervariabilidade) as variáveis.
Inicialmente, foi realizada uma análise exploratória visando descartar possíveis
variáveis redundantes para a construção do critério, na qual buscou-se eliminar variáveis
associadas linearmente entre si, tomando-se como elemento de exclusão de uma das variáveis
do par em apreciação o valor absoluto da correlação linear de Pearson superior a 0,70.
Posteriormente, as variáveis foram padronizadas pelo escore Z (número de desvios
afastados da média) e, na sequência, tiveram sua matriz de dispersão (R) submetida à Análise
de Componentes Principais (ACP) na busca dos eixos descritores do sistema de
homogeneização para a identificação de animais espúrios. Este processo tem como princípio
básico a redução do espaço paramétrico sem perda da estrutura de variabilidade conjunta dos
dados e prejuízo da informação biológica do animal (SANDANIELO; PADOVANI, 2010).
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Para determinação do número de eixos, foram considerados os k primeiros
componentes principais associados aos maiores autovalores de R selecionados pelo diagrama
de autovalores. Estabelecido os eixos, construiu-se a região de 95% de confiança a partir do
centroide dos dados. Os 115 ratos do lote foram alocados no novo sistema cartesiano e os
animais cuja representação gráfica não pertencesse à região de confiança foram descartados e,
para o estudo, considerados como espúrios (“outliers”).
3 Resultados e discussão
A análise exploratória dos dados permitiu o descarte de 17 variáveis das 34 iniciais.
Posteriormente, os dados foram submetidos à ACP, resultando no diagrama de autovalores
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Autovalores
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representado na figura 1.
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10
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Ordem da componente
Figura 1: Diagrama de autovalores
Analisando o diagrama de autovalores, observou-se o decréscimo abrupto até o
terceiro autovalor. Dessa forma, a seleção pelo diagrama de autovalores sugere considerar
apenas os três primeiros autovalores para compor o sistema cartesiano ortogonal como eixos
descritores (representando 57,40% da variabilidade total dos dados).
Estabelecido o número de eixos descritores, os 115 valores foram inicialmente
transladados para o novo sistema cartesiano ortogonal e, em seguida, plotados no espaço
gerado pelos eixos. O gráfico tridimensional de dispersão pode ser obervado na figura 2.
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Figura 2: Elipsoide de confiança
A região de 95% de confiança considerada geometricamente por um elipsoide
(representado na figura 2) permitiu o descarte de 8 animais espúrios que situavam-se em seu
exterior, ou seja, assegura-se no nível de confiança estabelecido um lote homogêneo de 107
ratos para a execução do planejamento experimental.
Levando-se em conta o modelo convencional de descarte adotado pela maioria dos
pesquisadores, no qual se considera apenas uma variável para homogeneização do lote
(técnica dos dois desvios padrão), foram descartados 43 animais quando aplicado ao mesmo
conjunto de dados, tem-se um ganho expressivo em número de animais para o
desenvolvimento experimental e, além disso, uma segurança estatística-biológica da presença
da homogeneidade nos animais.
4 Conclusões
Comparando-se o número de descartes efetuados pelo modelo convencional de
homogeneização de animais induzidos à EAo ao critério apresentado, nota-se claramente uma
diferença acentuada, ou seja, há preservação do número de animais, além de considerar todas
as características biológicas do animal.
5 Agradecimentos
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Este trabalho é fruto de um projeto de pesquisa financiado pela Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e desenvolvido no Programa de Pós-Graduação
em Biometria, do Instituto de Biociências de Botucatu, com apoio do Grupo de Pesquisa em
Cardiologia Experimental da Faculdade de Medicina da UNESP do campus de Botucatu, São
Paulo, Brasil. Cabe ainda ressaltar, a contribuição de Luzia Aparecida Trinca no
desenvolvimento gráfico dos resultados apresentados.
6 Bibliografia
[1] BREGAGNOLLO, E. A. et al. Myocardial contractile dysfunction contributes to the
development of heart failure in rats with aortic stenosis. International Journal of
Cardiology. v. 113, p. 188-93. 2006.
[2] BREGAGNOLLO, E. A. et al. Papel relativo da remodelação geométrica do ventrículo
esquerdo, morfológica e funcional do miocárdio na transição da hipertrofia compensada para
a falência cardíaca em ratos com estenose aórtica supravalvar. Arquivos Brasileiros de
Cardiologia, v. 88, p. 225-33. 2007.
[3] FERREIRA, D.F. Estatística multivariada. 2ed. rev. e ampl. - Lavras: Ed. UFLA, 2011.
676p.
[4] HAIR JUNIOR, J.F. et al. Análise multivariada de dados. 5.ed. Porto Alegre: Bookman,
2005. 600p.
[5] JOHNSON, R. A.; WICHERN, D.W. Applied multivariate analysis, 5. ed. New Jersey:
Prentice-Hall, 2002, 767p.
[6] MESTRINEL, M. A. Avaliação morfológica, bioquímica e funcional do
remodelamento cardíaco desencadeado por sobrecarga pressórica em ratos com e sem
insuficiência cardíaca congestiva. Botucatu, 2003. Dissertação (Mestrado). Faculdade de
Medicina, Universidade Estadual Paulista, 2003.
[7] MINGOTI, S. A. Análise de Dados Através de Métodos de Estatística
Multivariada: Uma Abordagem Aplicada. Editora UFMG, 2005.
[8] SANDANIELLO, V. L. M.; PADOVANI, C. R. Construção de índice percentil de status
de desenvolvimento sustentável de assentos rurais utilizando procedimento estatístico
multivariado. Energia na Agricultura, Botucatu, v. 25, p. 137-53, 2010.
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