1 Análise Farmacognóstica de Cunila microcephala Benth. (Lamiaceae) Alan da S. Felisbinoa, Patrícia A. Amaralb*, Vanessa M. de Andradeb a Acadêmico do Curso de Farmácia da Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC). b Professora do Curso de Farmácia da UNESC. a,b UNESC, Av. Universitária n 1105, Bairro: Universitário, CEP: 88806-000, Criciúma - SC, Brasil. *[email protected] RESUMO: “Análise Farmacognóstica de Cunila microcephala Benth. (Lamiaceae)”. A partir de estudos etnobotânicos identificou-se Cunila microcephala Benth., conhecida como poejinho e utilizada pela população da região sul de Santa Catarina, para indicações terapêuticas também descritas para Mentha pulegium L. (poejo). Essa última está contemplada na Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS) para tratamento de afecções respiratórias. Realizou-se estudo farmacognóstico a fim de detectar os metabólitos secundários presentes em C. microcephala, através de testes de precipitação e coloração. As análises apresentaram resultado positivo para substâncias fenólicas: taninos, cumarinas e flavonóides; não foi constatada a presença de alcalóides, antraquinonas, saponinas e heterosídeos cardiotônicos. Portanto, C. microcephala pode ser uma espécie promissora no tratamento de doenças que apresentam quadro de inflamação, uma vez que os compostos fenólicos são normalmente os responsáveis pela atividade medicinal. Maiores investigações devem ser realizadas de forma a aliar os resultados farmacognósticos com a avaliação biológica de C. microcephala. Palavras-chave: Análise farmacognóstica, estudo etnobotânico, Cunila microcephala, planta medicinal. 2 RESUMEN: “Análisis Farmacognóstica de Cunila microcephala Benth. (Lamiaceae)”. A partir de estudios etnobotánicos se identificó Cunila microcephala Benth, conocida como “poejinho” y utilizada por la población de la región sur de Santa Catarina para indicaciones terapéuticas también descritas para Mentha pulegium L. (“poejo”). Esa última está contemplada en la Ralación Nacional de Plantas Medicinales de Interés al SUS (RENISUS) para tratamieto de afecciones respiratorias. Se realizó estudio farmacognóstico con el intuito de detectar los metabolitos secundarios presentes en C. microcephala, a través de pruebas de precipitación y coloración. Los análisis presetaron resultado positivo para sustancias fenólica: taninos, cumarinas y flavonoides; no fue identificada la presencia de alcaloides, antraquinonas, saponinas y heterosideos cardiotónicos. Por lo tanto la planta en cuestión puede ser una especie interesante en el tratamiento de enfermedades que presentan cuadro de inflamación, una vez que los compuestos fenólicos son normalmente los responsables por la actividad medicinal; mayores investigaciones deben ser realizadas de forma a aliar los resultados farmacognósticos con la evaluación biológica de C. microcephala. Palabras clave: Análisi farmacognóstica, estudio etnobotánico, Cunila microcephala, plantas medicinales. ABSTRACT: Pharmacognostic analysis of the Cunila microcephala Benth. ( Lamiaceae ) Ethnobotanical studies identified to Cunila microcephala Benth., known as “poejinho” and used by the population of the southern region of Santa Catarina (Brazil) for therapeutic indications also described for Mentha pulegium L. (“poejo”). The latter is included in the 3 National Medicinal Plants of Interest to the SUS (RENISUS) for treatment of respiratory. Study was conducted of pharmacognosy in order to detect the secondary metabolites present in C. microcephala, through tests of precipitation and coloring. The analysis tested positive for phenolic substances: tannins, flavonoids and coumarins; was not identified the presence of alkaloids, anthraquinones, saponins and cardiotonic heterosides. So, the plant in question can be an interesting species in the treatment of diseases that present a profile of inflammation, since phenolic compounds are normally responsible for biological activities; further investigation should be undertaken in order to combine the results with the biological evaluation pharmacognostic C. microcephala. Keywords: Ethnobotany study, Cunila microcephala, pharmacognostic analysis, Medicinal plant. INTRODUÇÃO O homem através dos tempos, sempre utilizou plantas medicinais como recurso natural. As práticas indígenas brasileiras, aliadas aos conhecimentos orientais, são responsáveis, até hoje, pela forte influência na medicina popular. Muito inspirada nos rituais sobrenaturais, esta medicina é, com certeza, a alternativa de muitos brasileiros, principalmente, em regiões com infra-estrutura deficitária Mundial da Saúde (OMS) (1) . Segundo a Organização (2) , 80% da população mundial recorre às plantas medicinais dentro do sistema de atenção primária da saúde. O uso popular dessas plantas comprova que há uma gama quase infinita de aplicações curativas e preventivas e que o conhecimento – popular e científico – é imprescindível para se obter os resultados desejados. O estudo etnobotânico baseia-se na avaliação de interações dinâmicas do homem com o meio ambiente (3) consistindo também na compreensão dos usos e aplicações 4 tradicionais dos vegetais pelas pessoas. Ligada à botânica e à antropologia, é uma ciência interdisciplinar que também engloba conhecimentos farmacológicos, médicos, tecnológicos, ecológicos e lingüísticos (4). O Brasil detém a maior diversidade biológica do mundo, contando com uma rica flora e, portanto, despertando interesse das comunidades internacionais para estudo, conservação e utilização racional destes recursos (5). Em meio a essa biodiversidade encontra-se Cunila microcephala Benth., uma erva rasteira pertencente à família Lamiaceae, conhecida popularmente como poejinho e nativa da região sul do Brasil, Argentina e Uruguai. O poejinho possui cheiro aromático, sabor fracamente amargo (6) (FIGURA 1). Floresce e flutifica entre setembro e dezembro. Suas folhas e flores são usadas em forma de chá, como estimulante, aromático, anti-espasmódico e no tratamento de tosse crônica e infecções respiratórias (7). FIGURA 1. Poejinho (Cunila microcephala B.). Foto: Alan Felisbino, em Outubro/2009. O óleo essencial de Cunila microcephala apresenta composição química diversificada, com presença principalmente de mentofurano (82,3- 85,1%), limoneno (2,13,8%), -cariofileno (3,3-3,9%), além de -pineno, canfeno, -pineno, sabineno, -mirceno, 1-8-cineol, -ocimeno, -terpineno, linalol, pulegona, -terpineol e germacreno D (8). Não são conhecidos relatos de intoxicação pelo uso desta planta. No entanto, devido à presença de um teor elevado de mentofurano, sugere-se precaução no uso desta espécie, uma vez que 5 o composto mentofurano trata-se de uma substância hepatotóxica, que em contato com o organismo produz a formação de um metabólito eletrolítico que se liga à proteínas celulares através de uma ligação covalente, permanecendo desta forma por mais tempo no organismo (9) . Em um estudo realizado com administração isolada de mentofurano, uma vez ao dia, por via oral em camundongos, observou-se diminuição dos níveis do citocromo P450, enzima chave envolvida no metabolismo de xenobióticos (10). Levantamentos etnobotânicos mostraram que C. microcephala é uma das plantas medicinais mais utilizadas na região de Porto Alegre, Rio Grande do Sul (RS), Brasil (11). No sul de Santa Catarina, mais precisamente no município de Criciúma e região, por meio dos agentes da pastoral da Saúde, há relatos de uso de C. microcephala para afecções respiratórias. Reforçando, assim, os relatos populares de outras regiões do Brasil. Outro fato que estimula para a investigação científica desta espécie é que esta possui a mesma denominação popular da Mentha pulegium (poejo), planta européia cultivada no Brasil. M. pulegium está presente na Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS), a qual, na medicina popular é preconizada para afecções respiratórias, distúrbios estomacais, dentre outras afecções (11) , basicamente as mesmas indicações descritas para Cunila microcephala. Para Cunila microcephala foram encontradas poucas referências sobre os constituintes químicos, não sendo encontrados dados farmacológicos, ressaltando a carência de estudos com esta espécie nativa. Sendo assim, o presente trabalho tem por objetivo realizar estudos farmacognósticos do material vegetal de Cunila microcephala a fim de detectar os metabólitos secundários presentes na planta. METODOLOGIA 6 Foram utilizadas as folhas de Cunila microcephala, para análise. O material foi coletado no município de Grão-Pará/SC (28º 13’ 58,7” S e 49º 17’ 58,9” W) e uma exsicata da planta, previamente identificada pela botânica Dra. Vanilde Citadini Zanette, encontra-se armazenada no Herbário Pe. Dr. Raulino Reitz da UNESC, com registro CRI 7620. Para a identificação das classes de substâncias foram realizadas análises com as folhas submetidas à secagem, em estufa com temperatura máxima de 40ºC e a seguir moídas transformando-as em pó semi-fino (12) . Foram efetuados testes para a verificação da presença das seguintes classes de substâncias: fenólicas: antraquinonas, cumarinas, taninos, flavonóides; saponinas, alcalóides, heterosídeos cardiotônicos cromatografia em camada delgada (CCD) para análise de cumarinas (13, 14) . Foi realizada (15) e heterosídeos cardiotônicos (16). RESULTADOS E DISCUSSÃO Em função da importância, o elevado número e a grande diversidade química os metabólitos secundários despertam o interesse de pesquisadores de vários campos da ciência que vêem neles uma fonte promissora de novas moléculas potencialmente úteis ao homem (17). A partir das análises fitoquímicas pôde-se fazer a identificação e determinação do teor e grupos de metabólitos secundários existentes em C. microcephala. Essas substâncias podem estar relacionadas à ação farmacológica atribuída à espécie descrita pela população. A escolha da avaliação farmacognóstica sobre esses grupos de metabólitos pesquisados, citados na tabela 1, foi norteada pelas informações científicas encontradas na literatura, uma vez que esses compostos são, na sua grande maioria, responsáveis pelas atividades farmacológicas associadas às plantas medicinais. As reações de coloração e precipitação realizadas neste estudo apresentaram resultados positivos para substâncias fenólicas tais como: taninos, cumarinas e flavonóides; 7 e não foi verificada a presença de antraquinonas, saponinas, alcalóides e heterosídeos cardiotônicos, conforme demonstrado na tabela 1. Classe de substâncias Cunila microcephala Reações utilizadas Substâncias fenólicas + Cloreto férrico; Hidróxido de potássio. Taninos + Cloreto férrico; Solução de gelatina. Flavonóides ( ) Óxido de magnésio; Ácido Análises espectrofotométricas. Antraquinonas - Hidróxido de potássio. Cumarinas ( ) +* Reativo de KOH e NAOH; Visualização UV. Saponinas - Água destilada e agitação em cilindro graduado; Ácido clorídrico. Heterosídeos cardiotônicos - Reação de Baljet; Reação de Keller-Kiliani; Reação de Salkowsky. Alcalóides - +* clorídrico; Reativo de Mayer; Reativo de Dragendorf; Reativo de Brouchardat; Reativo de Bertrand. TABELA 1. Reações indicativas de substâncias presentes em Cunila microcephala. +: resultado positivo para reação. -: resultado negativo para reação. *: teste repetido. Os testes realizados com cloreto férrico e hidróxido de potássio foram positivos para a classe de compostos fenólicos (tabela 1). As substâncias fenólicas pertencem a uma classe que possui grande diversidade de estruturas; simples e complexas que apresentam pelo menos um anel aromático no qual, ao menos, um hidrogênio é substituído por um grupamento hidroxila (18). A atividade antioxidante dos compostos fenólicos é principalmente devido às suas propriedades de óxido-redução, as quais podem desempenhar importante papel na absorção e neutralização de radicais livres, quelando o oxigênio triplete e singlete ou decompondo peróxidos (19) . Resultados de estudos epidemiológicos têm confirmado uma correlação positiva entre o consumo de alimentos ricos em compostos fenólicos e uma diminuição em vários estados de doença crônica (20), doenças coronárias e cardiovasculares (21) . 8 Testes microquímicos (6) revelaram a presença de compostos fenólicos em C. microcephala, que fornecem um indicativo da presença de alguns metabólitos secundários, como, por exemplo, os taninos. Esse resultado foi confirmado neste estudo que detectou a presença de taninos condensados. Taninos são metabólitos vegetais solúveis em água, compostos polifenólicos de diferentes pesos moleculares abundantemente encontrados na natureza e têm a capacidade de precipitar em contato com proteínas (21) . Estes vêm recebendo atenção considerável nos campos da medicina, principalmente devido à sua atividade fisiológica, nas quais as evidências científicas atuais indicam que os taninos têm potencial significativo como atividade antioxidante (22) , efeito anti-microbiano (23) além de propriedade antiinflamatória (24). Numerosos estudos concentraram-se em determinar a atividade antioxidante dos flavonóides, que são biossintetizados a partir da via dos fenilpropanóides e constituem importante classe de polifenóis (25) . Tais compostos possuem uma série de propriedades farmacológicas que os faz atuarem sobre sistemas biológicos, podendo citar propriedade antitumoral, antiinflamatória (26, 27) tratamento de aterosclerose (28, 29) , antimicrobiana, antitrombocítica, como também . Os flavonóides juntamente com os diterpenos, são os compostos de maior ocorrência no gênero Cunila e são descritos como bons marcadores quimiotaxonômicos da família Lamiaceae. Apresentam-se normalmente como agliconas livres e muito raramente na forma glicosilada, o que é uma característica dessa família (30) . Estudos anteriores (31) detectaram e isolaram flavonóides do extrato de Cunila microcephala, constatou-se a presença de 5-hidroxi-6,7,8,3’,4’-pentametoxiflavona e 5, 3’, 4’-trihidroxi-7metoxiflavonona. Ao realizar ensaios de controle de qualidade, identificação e determinação do teor de substâncias ou grupos de substâncias ativas responsáveis pela ação farmacológica atribuída à Cunila microcephala, por espectrofotometria de UV, dosou em 0,06% de flavonóides na amostra analisada (32) . Esses estudos corroboraram para confirmar os resultados encontrados no presente estudo, onde o percentual de flavonóides encontrado na presente análise foi de 0,282%, resultado superior ao referenciado anteriormente. Esse fato pode ser explicado pela origem diferente das amostras, na qual em Marconatto (32) estas 9 foram adquiridas em dois estabelecimentos comerciais cuja procedência é desconhecida. Neste estudo as amostras foram selecionadas em terreno apropriado para técnicas de plantio e colheita, as quais podem ter influenciado em uma maior quantidade de flavonóides à espécie colhida. A partir de testes analisados sob luz UV em comprimento de 365 nm, verificou-se a presença de cumarinas, que foi confirmado em CCD. As cumarinas são um grande grupo de derivados de 1,2-benzopironas amplamente distribuídas na natureza (33) , são considerados compostos de interesse farmacológico devido ao seu amplo espectro de atividades farmacológicas, especialmente pelas atividades antioxidantes (34) , anti-agregantes, hipolipemiantes, os efeitos antiinflamatórios e vasodilatador podendo condicioná-los para o tratamento e/ou prevenção de doenças cardiovasculares (33, 35, 36) , foi o que mostrou estudos realizados in vivo, evidenciando o seu potencial terapêutico em algumas patologias cardiovasculares (37, 38, 39). CONCLUSÃO Na caracterização farmacognóstica da Cunila microcephala B., os compostos fenólicos foram detectados nos testes realizados, compreendendo, assim, taninos, flavonóides e cumarinas. Com isso, indicam uma possível responsabilidade pela atividade biológica descrita pela população, afecções respiratórias, uma vez que a literatura aponta em vários estudos a ligação dos flavonóides e taninos no combate ao processo inflamatório e como agente antioxidante. A concentração de flavonóides detectada no ensaio foi de 0,282% caracterizando uma concentração interessante desses compostos. A ausência de compostos como heterosídeos cardiotônicos, antraquinonas, saponinas e alcalóides direcionam estudos bioguiados, no sentido da escolha de testes in vivo e in vitro na busca de informações sobre a atividade biológica. 10 As folhas de C. microcephala possuem constituintes ativos com potencialidades para fins terapêuticos e deve ser melhor explorada. Deve-se relembrar neste momento que se trata de uma planta nativa e utilizada pela população da região de Criciúma e poucos dados são encontrados em literatura científica. Portando, para futuros estudos, novos trabalhos necessitam ser realizados para melhor investigação referente à Cunila microcephala para comprovação dos efeitos terapêuticos/farmacológicos e seus possíveis efeitos colaterais, visando garantir uso seguro da planta estudada, propondo medidas de controle e prevenção, resultando em melhor qualidade de vida. Estudos biológicos frente à genotoxicidade estão em andamento com intuito de verificar se há dano no DNA pelo uso de infusos de C. microcephala. REFERÊNCIAS 1. Lucca RA. Cura ameaçada. Os Caminhos da Terra. Revista Terra. São Paulo. 2004; 146: 60–71. 2. OMS - Organización Mundial de la Salud. Situación reglamentaria de los medicamentos herbarios. Reseña Mundial, 2000; 52. 3. Martin GJ. Ethnobotany - A methods manual. London, Ed. Chapman & Hall, 1995. 4. Amorozo MCM. Abordagem etnobotânica na pesquisa de plantas medicinais. En: Di Stasi LC. Plantas medicinais: arte e ciência - Um guia de estudo interdisciplinar. 47–68. São Paulo, 1996. 5. Giulietti AM, Harley RM, Queiroz LP, Wanderley MGL, Berg CVD. Biodiversidade e conservação das plantas no Brasil. Megadiversidade. 2005; 1: 52–61. 6. Toledo MGT, Alquini Y, Nakashima T. Caracterização anatômica das folhas de Cunila microcephala Benth. (Lamiaceae). Rev Bras Cienc Farm. 2004; 40: 487–493. 7. Simões CMO, Mentz LA, Schenkel EP, Irgang BE, Stehmann JR. Plantas da medicina popular no Rio Grande do Sul. Porto Alegre: UFGRS, Brasil, 1998; 5: 124–125. 8. Bordignon SAL, Schenkel EP, Spitzer V. The essential oil composition of Cunila microcephala and Cunila fasciculata. Phytochemistry. 1997; 44: 1283–1286. 9. Madyastha KM, Raj CP. Toxicology,1994; 89–119. 11 10. Thomassen D, Knebel N, Slattery JT, McClanahan RH, Nelson SD. Chemical Research in Toxicology, 1992; 5:123. 11. Mengue SS, Mentz LA, Lima JA, Petersen V, Spizziri MAA, Schenkei EP. Caderno de Farmácia. 1991; 7: D1–D3. 12. Farmacopéia Brasileira. 4.ed. São Paulo: Atheneu, 2002. 13. Costa AF. Farmacognosia. Fundação Colouste Gulbenkian. Lisboa. 6: 2, 2002. 14. Xorge AD. Métodos de Investigação Fitoquímica. Editorial Limusa. México, 1973. 15. Wagner H, Bladt S, Zgainski EM. Plant drug analysis. Berlin, Springer. 1984, 147–148. 16. British pharmacopoeia 1993: addendum 1997. London: The stationery office publications, 1997. 17. Lee KH. Discovery and development of natural product-derived chemotherapeutic agents based on a medicinal chemistry approach. J Nat Prod. 2010; 73(3):500–16. 18. Carvalho JCT, Gosmann G, Schenkel EP. Compostos fenólicos simples e heterosídicos. En: Simões CMO, Schenkel EP, Gosmann G, Mello JCP, Mentz LA, Petrovick PR. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5.ed. rev. Ampl; 519–536. Porto Alegre: UFRGS, 2003. 19. Halliwell B, Gutteridge JMC, Cross CE. Free radicals, antioxidants, and human disease: where are we now? The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 1992; 119, 598–620. 20. Kris-Etherton PM, Hecker KD, Bonanome A, Coval SM, Binkoski AE, Hilpert KF. Bioactive compounds in foods: Their role in the prevention of cardiovascular disease and cancer. American Journal of Medicine. 2002; 113, 71S–88S. 21. Spencer CM, Cai MY, Martin R, Gaffney SH, Goulding PN, Mangolato D et al. Polyphenol complexation – some thoughts and observations. Phytochemistry. 1988; 27: 2397–2409. 22. Lim YY, Murtijaya J. Antioxidant properties of Phyllanthus amarus extracts as affected by different drying methods. LWT-Food Sci Tech. 2007 ; 40 : 1664–1669. 23. Sisti M, De Santi M, Fraternale D, Ninfali P, Scoccianti V, Brandi G. Antifungal activity of Rubus ulmifolius Schott standardized in vitro culture. LWT - Food Sci Tech. 2008; 41: 946– 950. 24. Santos-Buelga C, Scalbert A. Proanthocyanidins and tannin-like compounds-nature, occurrence, dietary intake, and effects on nutrition and health. J Sci Food Agric. 2000 ; 80: 1094-1117. 25. Zuanazzi JAS, Montanha JA. Flavonóides. En: Simões CMO, Schenkel EP, Gosmann G, Mello JCP, Mentz LA, Petrovick PR. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5.ed. rev. ampl.; 577–614. Porto Alegre: UFRGS, 2003. 26. Caltagirone S, Rossi C, Poggi A, Ranelletti FO, Natali PG, Brunetti M et al. Flavonoids apigenin and quercetin inhibit melanoma growth and metastatic potential. Int J Câncer. 2000; 87: 595–600. 12 27. Hougee S, Sanders A, Faber J, Graus YM, Van den Berg WB, Garssen J et al. Decreased pro-inflammatory cytokine production by LPS-stimulated PBMC upon in vitro incubation with the flavonoids apigenin, luteolin or chrysin, due to selective elimination of monocytes/macrophages. Biochem Pharmacol. 2005; 69: 241–248. 28. Arai Y, Watanabe S, Kimira M, Shimoi K, Mochizuki R, Kinae N. Dietary antioxidant flavonols, flavones and isoflavones by Japanese women and the inverse correlation between quercetin intake and plasma LDL cholesterol concentration. Journal of Nutrition. 2000; 130: 2243–2250. 29. Havsteen BH. The biochemistry and medical significance of the flavonoids. Pharmacology and Therapeutics. 2002; 96: 67–202. 30. Simões CMO, Schenkel EP, Gosmann G, Mello JCP, Mentz LA, Petrovick PR. Farmacognosia: da planta ao medicamento. Porto Alegre: UFRGS, 5.ed. rev. ampl., 2003. 31. Bordignon SAL, Montanha JA, Schenkel EP. Flavones and flavanones from South American Cunila species (Lamiaceae). Biochemical Systematics and Ecology. 2003; 785– 788. 32. Marconatto V. Controle de qualidade e caracterização química dos principais metabólitos de Cunila microcephala Benth. (Poejinho). 2006. Monografia (Trabalho de Conclusão de Especialização em Ciências Ambientais) - Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões Campus de Frederico Westphalen/RS. Frederico Westphalen, RS, Brasil, 2006. 33. Borges F, Roleira F, Milhazes N, Santana L, Uriarte E. Simple coumarins and analogues in medicinal chemistry: occurrence, synthesis and biological activity. Curr Med Chem. 2005; 12: 887–916. 34. Wu CR, Huang MY, Lin YT, Ju HY, Ching H. Antioxidant properties of cortex Fraxini and its simple coumarins. Food Chem. 2007;104:1464–71. 35. Fylaktakidou KC, Hadjipavlou-Litina DJ, Litinas KE, Nicolaides DN. Natural and synthetic coumarin derivatives with anti-inflammatory/antioxidant activities. Curr Pharm Des. 2004; 10: 3813–3833. 36. Kostova I. Synthetic and natural coumarins as antioxidants. Mini Rev Med Chem. 2006; 6: 365–374. 37. Hoult JR, Paya M. Pharmacological and biochemical actions of simple coumarins: natural products with therapeutic potential. Gen Pharmacol. 1996; 27: 713–722. 38. Baccard N, Mechiche H, Nazeyrollas P, Manot L, Lamiable D, Devillier P et al. Effects of 7-hydroxycoumarin (umbelliferone) on isolated perfused and ischemic-reperfused rat heart. Arzneimittelforschung. 2000; 50: 890–896. 39. Chang TH, Adachi H, Okuyama T, Zhang KY. Effects of 30-angeloyloxy-40-acetoxy30,40-dihydroseselin on myocardial dysfunction after a brief ischemia in anesthetized dogs. Zhongguo Yao Li Xue Bao. 1994; 15: 388–391.