método de determinação do número mais provável (nmp)

MF-404.R-4 - MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL
(NMP) DE COLIFORMES TOTAIS EM AMOSTRAS DE ÁGUA DESTINADA AO
CONSUMO HUMANO, PELA TÉCNICA DOS TUBOS MÚLTIPLOS
Notas:
Aprovada pela Deliberação CECA nº 3 964, de 16 de janeiro de 2001
Publicada no DOERJ de 23 de janeiro de 2001
1
OBJETIVO
Definir o método de determinação do número mais provável (NMP) de
coliformes totais em água destinada ao consumo humano, pela técnica
dos tubos múltiplos.
2
DOCUMENTOS DE REFERÊNCIA
MN-707 - MANUAL DE AMOSTRAGEM DE QUALIDADE DE ÁGUA.
3
DEFINIÇÕES
Para efeito deste método são adotadas as seguintes definições:
3.1
BACILOS - Designação dada a certas bactérias que se apresentam sob a
forma de bastonetes.
3.2
COLORAÇÃO DE GRAM - Coloração diferencial através da qual as
bactérias são classificadas em Gram-positivas e Gram-negativas,
dependendo da retenção ou não do corante cristal violeta.
3.3
ESPOROS - Corpúsculos esféricos ou ovóides que se formam em certas
bactérias, mais resistentes aos efeitos do calor, dessecação,
congelamento, drogas deletérias e radiações do que as próprias células
que os formam.
3.4
COLIFORMES TOTAIS (GRUPO COLIFORME) - Bacilos Gram-negativos,
não formadores de esporos, aeróbios e anaeróbios facultativos, que
fermentam a lactose com produção de gás e ácido dentro de 48 horas a
35 ( 0,5) ºC. Neste grupo estão incluídos 4 gêneros da família
Enterobacteriaceae: Escherichia, Klebsiella, Citrobacter e Enterobacter.
3.5
NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) - Estimativa de densidade de
bactérias em uma amostra, calculada a partir da combinação de
resultados positivos e negativos, obtidos mediante a técnica dos tubos
múltiplos.
3.6
CALDO LACTOSADO (C.L) - Meio de enriquecimento no qual as
concentrações de lactose e peptona fornecem condições ótimas para o
crescimento de bactérias do grupo coliforme.
3.7
CALDO LAURIL TRIPTOSE (CLT) - Meio de enriquecimento para
bactérias do grupo coliforme em que o lauril sulfato de sódio atua como
agente seletivo, com supressão do crescimento de bactérias esporuladas
produtoras de gás, reduzindo a ocorrência de resultados falso-positivos no
ensaio presuntivo para detecção de coliformes.
3.8
CALDO LACTOSADO VERDE BRILHANTE BILE (C.L.V.B.B) - Meio
seletivo em que se obtém a inibição de bactérias Gram-positivas e de
especulados fermentadores da lactose, permitindo um bom
desenvolvimento de bactérias do grupo coliforme.
4
PRINCÍPIO DO MÉTODO
Este método é baseado no princípio de que as bactérias presentes em
uma amostra de água podem ser separadas umas das outras por
agitação, resultando em uma suspensão de células bacterianas
individuais, uniformemente distribuídas na amostra original.
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RESUMO DA TÉCNICA
A técnica para determinação do NMP de coliformes totais em amostras de
água destinada ao consumo humano consiste na inoculação de volumes
de 10 mL da amostra, em cada um dos 5 tubos de meios de cultura
adequados ao crescimento dos microorganismos pesquisados,
constituindo cada um dos 5 tubos de 10 mL uma porção padrão e o
conjunto deles uma amostra padrão.
A determinação do NMP de coliformes totais pela técnica dos tubos
múltiplos requer dois ensaios: presuntivo e confirmatório.
5.1
ENSAIO PRESUNTIVO
Consiste na semeadura de volumes determinados de amostra de água em
série de 5 tubos de C.L. ou C.L.T. que são incubados a 35 ( 0,5) ºC
durante 24 ou 48 horas , ocorrendo enriquecimento de organismos
fermentadores de lactose, se presentes na amostra. A produção de gás a
partir da fermentação da lactose é prova presuntiva positiva para a
presença de bactérias do grupo coliforme.
5.2
ENSAIO CONFIRMATÓRIO
Consiste na inoculação, em tubos de C.L.V.B.B., de porções das amostras
que apresentaram resultado positivo no ensaio presuntivo.
6
APLICABILIDADE
Este método é aplicável unicamente às águas destinadas ao consumo
humano, acondicionadas e preservadas de acordo com o MN-707.
7
INTERFERÊNCIAS
O cloro residual presente na amostra pode levar a resultados falsos,
devendo ser neutralizado no momento da coleta.
A temperatura da amostra e o tempo decorrido entre a coleta e a análise
também podem interferir nos resultados. A temperatura da amostra deve
ser mantida entre 4 e 10 ºC até o início da análise, que deverá ocorrer,
preferencialmente, dentro de 8 horas, ou no prazo máximo de 30 horas.
8
APARELHAGEM E MATERIAL
8.1
Os equipamentos e a vidraria necessários para a realização dos testes
consistem em:
Autoclave
Incubadora bacteriológica regulada para 35 ( 0,5) ºC
Balança de precisão de 0,1 mg
Medidor de pH
Tubos de ensaio
Tubos de Durhan
Pipetas tipo Mohr de 10 mL
Alças de inoculação de níquel-cromo, platina-irídio ou platina
Estante para tubos de ensaio
8.2
Todo material que entre em contato com a amostra deve ser
quimicamente inerte, preferencialmente de vidro.
8.3
Todo o material deve ser esterilizado a seco, antes do uso.
9
MEIOS DE CULTURA
Poderão ser utilizados meios de cultura prontos, encontrados no comércio
sob a forma de pó desidratado, ou preparados no laboratório, a partir dos
ingredientes básicos que devem ser de alta pureza (p.a.).
9.1
C.L DE CONCENTRAÇÃO DUPLA
Pesar e transferir para béquer de 2 L os seguintes sais:
26,0 g do meio desidratado pronto ou pesar 6,0 g de extrato de carne;
10,0 g de peptona; e
10,0 g de lactose.
Acrescentar 1 000 mL de água destilada fria. Aquecer, agitando
freqüentemente, até completa dissolução do meio, tomando cuidado para
que não seja atingida a temperatura de ebulição. Em tubos de ensaio
contendo no seu interior tubo de Duchan invertido, distribuir volumes
adequados para que o volume final, após esterilização, seja de 10 mL.
Tampar com algodão ou com cápsula de alumínio e esterilizar em
autoclave a 121 ºC, durante 15 minutos.
pH final, após esterilização: 6,9 ( 0,1) a 25 ºC.
9.2
CLT DE CONCENTRAÇÃO DUPLA
Pesar e transferir para béquer de 2 litros os seguintes sais:
71,2 g do meio desidratado pronto ou pesar 40,0 g de triptose;
10,0 g de lactose;
5,5 g de fosfato dibásico de potássio (K 2HPO4) p.a;
5,5 g de fosfato monobásico de potássio (KH2PO4) p.a;
10,0 g de cloreto de sódio (NaCl) p.a; e
0,2 g de lauril sulfato de sódio(C12H25O4SNa) p.a.
Acrescentar 1 000 mL de água destilada fria. Aquecer, agitando
freqüentemente, até completa dissolução do meio, tomando cuidado para
que não seja atingida a temperatura de ebulição. Em tubos de ensaio
contendo no seu interior tubo de Durhan invertido, distribuir volumes
adequados para que o volume final, após esterilização, seja de 10 mL.
Tampar com algodão ou cápsula de alumínio e esterilizar em autoclave a
121 ºC, durante 15 minutos.
pH final, após esterilização: 6,8 ( 0,2) a 25 ºC.
9.3
C.L.V.B.B a 2%
Pesar e transferir para béquer de 2 L os seguintes sais:
40,0 g do meio desidratado pronto ou pesar 10,0 g de peptona;
10,0 g de lactose;
20,0 g de bile de boi desidratada; e
0,0133 g de corante verde brilhante.
Acrescentar 1 000 mL de água destilada fria. Aquecer, agitando
freqüentemente até completa dissolução do meio, tomando cuidado para
que não seja atingida a temperatura de ebulição. Em tubos de ensaio
contendo no seu interior tubo de Durhan invertido, distribuir volumes
adequados para que o volume final, após esterilização, seja de 10 mL.
Tampar com algodão ou cápsula de alumínio e esterilizar em autoclave a
121 ºC, durante 15 minutos.
pH final, após esterilização: 7,2 ( 0,2) a 25 ºC
10
ENSAIOS
10.1
ENSAIO PRESUNTIVO
10.1.1 Preparar os tubos de C.L ou CLT de concentração dupla e dispô-los em
séries de 5 tubos em estantes.
10.1.2 Proceder a marcação dos tubos, anotando os números designados pelo
laboratório na ficha de registro de exames.
10.1.3 Homogeneizar a amostra, agitando vigorosamente o frasco.
10.1.4 Com uma pipeta esterilizada e obedecendo os cuidados de assepsia,
semear 10 mL da amostra em cada um dos 5 tubos de C.L. ou CLT de
concentração dupla.
10.1.5 Após a inoculação de todos os tubos, colocar a estante contendo os tubos
inoculados em estufa de cultura bacteriológica a 35 ( 0,5) ºC, durante 24
( 2) horas.
10.1.6 Após esse período de incubação, retirar os tubos da incubadora para
efetuar a primeira leitura dos resultados. Anotar na ficha de registro de
exames quais os tubos que apresentaram resultado positivo, separandoos para a execução do ensaio confirmatório.
10.1.7 Retornar à incubadora os tubos com resultados negativos para um período
adicional de 24 (± 1) horas a 35 ºC. Após esse novo período, os tubos com
gás são anotados e separados para execução do ensaio confirmatório e
os negativos são desprezados.
10.2
ENSAIO CONFIRMATÓRIO
10.2.1 Marcar os tubos de C.L.V.B.B em número igual ao dos tubos de ensaio
presuntivo que apresentaram resultado positivo.
10.2.2 Agitar cada tubo com resultado positivo e, com alça de inoculação, retirar
material e inocular no tubo correspondente de C.L.V.B.B, evitando a
película superficial que se forma no ensaio presuntivo positivo.
10.2.3 Incubar os tubos de C.L.V.B.B inoculados durante 48 ( 3) horas a 35 (
0,5) ºC, considerando positivos os tubos que, após esse período,
apresentarem formação de gás no tubo de Durhan invertido. Anotar o
resultado na ficha de registro de exames.
11
RESULTADO
A estimativa no NMP de coliformes em 100 mL de amostra (NMP/100 mL)
é feita através de consulta direta à tabela a seguir, a partir do número de
tubos que apresentou resultado positivo nos dois ensaios.
TABELA
NÚMERO MAIS PROVÁVEL POR 100 mL DA AMOSTRA
Nº DE TUBOS
NMP/mL
POSITIVOS(*)
0
2,2
1
2,2
2
5,1
3
9,2
4
16,0
5
16,0
(*) em cada 5 tubos de 10 mL
LIMITES DE CONFIANÇA EM 95%
Mínimo
Máximo
0
0,1
0,5
1,6
3,3
8,0
6,0
12,6
19,2
29,4
52,9
infinito
12.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
12.1
AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standard methods for the
examination of water and wastewater, 16th ed., Washington, D.C., 1985.
12.2
U.S.A. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY. Microbiological
methods for monitoring the environment. Water and wastes. EPA 600/878-017. Cincinnati, December, 1978.
12.3
KLABER, P.W.; CLARK. H.F. & GELDREICH, E.E. - Sanitary significance
of coliform and fecal coliform organism in surface water. Public Health
Reports, 79 (1): 57 - 60, 1964.