de dissertação em pdf - Pós

Universidade Federal da Bahia
Escola de Medicina Veterinária
Programa de Pós Graduação em Ciência Animal nos Trópicos
Metapneumovírus Aviário: Levantamento
Soroepidemiológico e Caracterização Molecular em Criações
Industriais e de Galinhas de Quintal no Pólo Avícola da Bahia
Tatiane Santana Sales
Salvador-Bahia
2010
ii
TATIANE SANTANA SALES
METAPNEUMOVÍRUS AVIÁRIO: LEVANTAMENTO
SOROEPIDEMIOLÓGICO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR EM
CRIAÇÕES INDUSTRIAIS E DE GALINHAS DE QUINTAL NO PÓLO
AVÍCOLA DA BAHIA
Dissertação apresentada à Escola de
Medicina Veterinária da Universidade
Federal da Bahia, como requisito para
a obtenção do título de Mestre em
Ciência Animal nos Trópicos, na área
de Saúde Animal.
Orientadora: Prof. Dra. Lia Muniz Barretto Fernandes
Salvador – Bahia
2010
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
SALES, Tatiane Santana
Metapneumovírus Aviário: Levantamento Soroepidemiológico e Caracterização
Molecular em Criações Industriais e de Galinhas de Quintal no Pólo Avícola
da Bahia/ Tatiane Santana Sales. – Salvador, 26/03/2010. 83p. Dissertação
(Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) - Escola de Medicina Veterinária
da Universidade Federal da Bahia, 2010.
Professora Orientadora – Prof. Dra. Lia Muniz Barretto Fernandes
Palavras-chave – Metapneumovírus Aviário, Frangos de corte, Galinhas de
quintal, Elisa indireto, reação em cadeia de polimerase-Nested-transcriptase
reversa.
1 – Sales, Tatiane Santana 2 – Metapneumovírus Aviário 3 – Infecção em frangos
de corte e galinhas de quintal I- Metapneumovírus Aviário: Levantamento
Soroepidemiológico e Caracterização Molecular em Criações Industriais e de
Galinhas de Quintal no Pólo Avícola da Bahia.
iv
METAPNEUMOVÍRUS AVIÁRIO: LEVANTAMENTO
SOROEPIDEMIOLÓGICO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR EM
CRIAÇÕES INDUSTRIAIS E DE GALINHAS DE QUINTAL NO PÓLO
AVÍCOLA DA BAHIA
TATIANE SANTANA SALES
Dissertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal
nos Trópicos.
Salvador, 26 de março de 2010.
Comissão Examinadora:
__________________________________________________
Prof. Dra. Lia Muniz Barretto Fernandes – Universidade Federal da Bahia
Orientadora
__________________________________________________
Prof. Dra. Silvia Ines Sardi – Universidade Federal da Bahia
__________________________________________________
Prof. Dra. Deborah Bittencourt Mothé Fraga – Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz
/FIOCRUZ/BA.
v
Aos meus pais, Dinalva e Albis,
pelo incentivo constante e amor,
em todos os momentos.
vi
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Prof. Dra. Lia Muniz Barretto Fernandes, pelos ensinamentos,
pelo imenso apoio e incentivo e pela atenção constante a mim dispensada, mas, em
especial por ter sido responsável pelo meu despertar para a pesquisa científica e o
trabalho acadêmico na área de Avicultura;
Ao Prof. Paulo César Costa Maia, pelo apoio constante e incentivo, pelos ensinamentos,
e pelo exemplo de paciência e sabedoria;
A meus pais e minha irmã, Taisa, por todo o amor e incentivo e por estarem ao meu
lado, sempre;
A Raildo, pelo amor, dedicação e paciência; por sempre acreditar em mim e fazer com
que, ao seu lado, qualquer obstáculo pareça fácil de ser ultrapassado;
As minhas queridas amigas, Cida, Amanda, Elen e Leane nenhuma palavra poderia
fielmente representar o quanto a nossa amizade é importante para mim;
Aos meus amigos, Deco, Jamille, Nanda, Miriam, Ilka, Vivi, Alexandra, Aninha e
Madiane pelo conforto através de palavras doces e verdadeiras;
À Izabella e Priscila, pela convivência harmoniosa e pelos bons momentos
compartilhados;
Ao grupo GESAV, por toda alegria presente nos momentos de trabalho e diversão;
As colegas do Laboratório de Diagnóstico das Parasitoses em Animais, principalmente,
Rosa, Katty, Sara e Lari, pelo imensurável apoio;
Ao Colegiado de Pós-Graduação da Escola de Medicina Veterinária da Universidade
Federal da Bahia;
vii
A todos os professores, funcionários e estudantes da Pós-Graduação da Escola de
Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, pelos bons momentos
compartilhados no período do mestrado, especialmente, aos colegas Vitor, Karine,
Luciana, Laura, Bárbara, Alfeu, Thadeu e Aroldo;
À CAPES pela concessão da bolsa de mestrado;
Por fim, a todos que contribuíram direta ou indiretamente, para a realização desse
trabalho.
viii
Há muitas razões para duvidar e
uma só para crer."
(Carlos Drummond de Andrade)
ix
ÍNDICE
LISTA DE TABELAS ................................................................................................ X
LISTA DE FIGURAS ...............................................................................................XI
LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................ XII
RESUMO................................................................................................................XIII
SUMMARY ............................................................................................................. XIV
1. INTRODUÇÃO...........................................................................................................1
2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 2
2.1. DEFINIÇÃO ......................................................................................................... 2
2.2. HISTÓRICO E DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA ............................................ 4
2.3. CARACTERÍSTICAS DO AGENTE.................................................................. 5
2.3.1. CLASSIFICAÇÃO E ESTRUTURA DO AMPV ...................................... 5
2.3.2. REPLICAÇÃO VIRAL .............................................................................. 7
2.3.3. SUBTIPOS DO AMPV..................................................................................8
2.4. EPIDEMIOLOGIA .......................................................................................... ..10
2.4.1. ESPÉCIES SUSCEPTÍVEIS .................................................................. ..10
2.4.2. TRANSMISSÃO ..................................................................................... ..11
2.4.3. PATOGENIA ............................................................................................. 12
2.4.4. SINAIS CLÍNICOS E LESÕES ANATOMOPATOLÓGICAS ............. .13
2.5. IMUNOLOGIA .................................................................................................. 15
2.6. DIAGNÓSTICO.....................................................................................................17
2.6.1. CLÍNICO......................................................................................................17
2.6.2. SOROLOGIA...............................................................................................18
2.6.3. ISOLAMENTO VIRAL..............................................................................20
2.6.4. IDENTIFICAÇÃO VIRAL.........................................................................21
2.6.5. DETECÇÃO DO GENOMA VIRAL.........................................................22
2.7. PREVENÇÃO E CONTROLE DO AMPV.........................................................22
3. ARTIGOS CIENTÍFICOS.......................................................................................26
3.1. ARTIGO 1........................................................................................................26
3.2. ARTIGO 2........................................................................................................41
4. CONSIDERAÇÕES GERAIS .............................................................................. 60
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 61
x
LISTA DE TABELAS
ARTIGO 1
FREQUÊNCIA DE ANTICORPOS CONTRA METAPNEUMOVÍRUS AVIÁRIO
EM CRIAÇÕES INDUSTRIAIS E DE GALINHAS DE QUINTAL NO PÓLO
AVÍCOLA DA BAHIA.
TABELA 1- Frequência de anticorpos, valores de titulação, coeficiente de variação e
desvio padrão pela infecção pelo Metapneumovírus aviário em aves de criações de
frangos de corte e de galinhas de quintal no pólo avícola da Bahia ............................. 31
TABELA 2- Frequência de anticorpos contra o Metapneumovírus aviário em lotes de
frangos de corte e propriedades de galinhas de quintal no pólo avícola da Bahia ........ 32
ARTIGO 2
DETECÇÃO DO METAPNEUMOVÍRUS AVIÁRIO EM CRIAÇÕES DE
FRANGOS DE CORTE E GALINHAS DE QUINTAL ATRAVÉS DA TÉCNICA
DE REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE-NESTED-TRANSCRIPTASE
REVERSA (NESTED RT-PCR) NO PÓLO AVÍCOLA DA BAHIA.
TABELA 1- Frequência de títulos de anticorpos contra Metapneumovírus Aviário e
detecção viral em criações de frangos de corte e galinhas de quintal no Pólo avícola da
Bahia............................................................................................................................... 47
TABELA 2- Detecção do Metapneumovírus Aviário em criações de frangos de corte e
galinhas de quintal em diferentes estações do ano no Pólo avícola da Bahia ............... 50
xi
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO DE LITERATURA
FIGURA 1-
Comparação
entre
os
genomas
dos
gêneros
pneumovírus
e
metapneumovírus. (Adaptado de Easton, 2004) .............................................................. 5
ARTIGO 1
FREQUÊNCIA DE ANTICORPOS CONTRA METAPNEUMOVÍRUS AVIÁRIO
EM CRIAÇÕES INDUSTRIAIS E DE GALINHAS DE QUINTAL NO PÓLO
AVÍCOLA DA BAHIA.
FIGURA 1- Análise das amostras de soro na infecção pelo Metapneumovírus aviário
em frangos de corte e galinhas de quintal no pólo avícola da Bahia, em relação à
presença e ausência de sintomas respiratórios, por percentual ...................................... 33
ARTIGO 2
DETECÇÃO DO METAPNEUMOVÍRUS AVIÁRIO EM CRIAÇÕES DE
FRANGOS DE CORTE E GALINHAS DE QUINTAL ATRAVÉS DA TÉCNICA
DE REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE-NESTED-TRANSCRIPTASE
REVERSA (NESTED RT-PCR) NO PÓLO AVÍCOLA DA BAHIA.
FIGURA 1- Distribuição dos títulos de anticorpos contra o Metapneumovírus Aviário
no lote de frangos de corte, positivo para a detecção viral............................................. 48
FIGURA 2 - Distribuição dos títulos de anticorpos contra o Metapneumovírus Aviário
em criações de galinhas de quintal, positivas para a detecção viral............................... 49
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
AMPV - Metapneumovírus Aviário
TRT - Vírus da Rinotraqueíte dos Perus
SCI - Síndrome da Cabeça Inchada
Kb - Quilobase
nm - nanômetro
vRNA - RNA viral
mAbs - anticorpos monoclonais
EUA - Estados Unidos da América
hMPV - Metapneumovírus Humano
pH - Potencial hidrogeniônico
IFI - Imunofluorescência Indireta
SN - Soroneutralização
ELISA - Ensaio de imunoadsorção enzimática
SPF - ave livre do patógeno específico
TOC - cultura de órgão traqueal de embriões de galinhas
VERO - Células renais do macaco Verde Africano
CEF - cultura de fibroblasto de embriões de galinha
Células QT-35 - Células de fibrosarcoma de codornas japonesas
CER - Células rugosas de embriões de galinha
BGM - Células de rins de macaco Grivet
CEL - Células de fígado de embriões de galinha
VN - vírus neutralização
IFD - Imunofluorescência direta
IP- imunoperoxidase
PCR - reação em cadeia da polimerase
RT-PCR - reação em cadeia pela polimerase-transcriptase reversa
RFLP - polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição
RRT-PCR - reação em cadeia da polimerase - transcriptase reversa em tempo real
pb - pares de bases
mm - milímetro
xiii
SALES, T. S. Metapneumovírus Aviário: Levantamento Soroepidemiológico e
Caracterização Molecular em Criações Industriais e de Galinhas de Quintal no
Pólo Avícola da Bahia. Salvador, Bahia, 2010. 83p. Dissertação (Mestrado em Ciência
Animal nos Trópicos) - Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia,
2010.
RESUMO
A infecção pelo Metapneumovírus Aviário (AMPV) em galinhas é frequentemente
associada a problemas respiratórios e à Síndrome da Cabeça Inchada (SCI),
enfermidade responsável por perdas econômicas significantes no sistema intensivo de
produção avícola. Existem poucas informações quanto à ocorrência de infecção pelo
AMPV em lotes de frangos de corte e criações de galinhas de quintal nas diferentes
regiões do Brasil. Este trabalho teve como objetivo investigar a incidência da infecção
pelo AMPV em criações não vacinadas de frangos de corte e galinhas de quintal no pólo
avícola do Estado da Bahia. Amostras séricas de 622 frangos de corte e 268 galinhas de
quintal foram coletadas para a realização de análise sorológica através da técnica de
ELISA indireto. Também foi realizada a detecção molecular utilizando o Nested RTPCR. Os resultados obtidos demonstraram que 144 (23,15%) amostras de frangos de
corte e 187 (69,78%) amostras de galinhas de quintal apresentaram títulos positivos para
a infecção pelo AMPV. Os lotes de frangos de corte avaliados apresentaram freqüência
de anticorpos contra o vírus de 77,14% e as criações de galinhas de quintal 94,12%. No
Nested RT-PCR foi detectado o RNA do AMPV subtipo A em 11,11% dos lotes de
frangos de corte e 22,22% das criações de galinhas de quintal. Estes resultados
demonstram a presença da infecção pelo AMPV em ambos os sistemas de criação
avaliados. Além disso, sugerem que diferentes tipos de criações e as condições
climáticas podem influenciar na presença do AMPV no ambiente. Novos estudos devem
ser realizados a fim de verificar se as condições climáticas, bem como a presença de
aves migratórias ou comércio de aves vivas, podem influenciar na presença do
Metapneumovírus aviário no meio ambiente e sua disseminação nas criações avícolas
do Estado da Bahia.
Palavras-chave: Metapneumovírus Aviário; Frangos de corte; Galinhas de quintal;
Elisa indireto; reação em cadeia de polimerase-Nested-trancriptase reversa.
xiv
SALES, T. S. Avian Metapneumovírus: Serological survey and molecular
characterization in broilers and backyard chicken reared at the avian pole of
Bahia Salvador, Bahia, 2010. 83p. Dissertation (Master of Animal Science in the
Tropics) – School of Veterinary Medicine, Federal University of Bahia, 2010.
SUMMARY
Avian Metapneumovírus (AMPV) infection in chickens is frequently associated to
respiratory problems and to the Swollen Head Syndrome (SCI), illness that causes
significant economic losses in poultry industry. Little information is available
concerning the occurrence of AMPV infection in broiler and backyard chicken creations
in the different regions of Brazil. The aim of this work was investigate the incidence of
AMPV infection in broiler and backyard chicken not vaccinated reared in the avian pole
of the State of the Bahia. Serum samples of 622 broilers and 268 of backyard chickens
were collected in order to perform serological analysis using indirect ELISA.
Molecular detection was carried out the utilizing the Nested RT-PCR. The results
obtained showed that 144 (23,15%) of broiler samples and 187 (69,78%) of backyard
chicken samples presented positive titers. Broilers flocks analyzed had frequency of
antibodies against the virus of 77.14% and the backyard chicken creations of 94,12%.
RNA of AMPV subtype A was detected using nested RT-PCR in 11.11% of broilers
flocks and 22.22% of backyard chicken creations. These results indicate that AMPV
infection was present in both systems of production studied. Beyond that, suggest that
factors related to the poultry management and the climatic conditions can influence the
presence of the AMPV in the environment. Subsequent studies are necessary in order to
verify if climatic conditions, as well as the presence of migratory birds or commerce of
a live birds, can influence the presence of the Avian Metapneumovírus in the
environment and its dissemination in poultry flocks of the State of the Bahia.
Keywords: Avian Metapneumovírus; broilers; backyard chicken; indirect Elisa; Nested
RT-PCR.
1
1. INTRODUÇÃO
A avicultura ocupa posição de destaque dentre as atividades agroindustriais brasileiras,
liderando o ranking das exportações agropecuárias nacionais, correspondendo a 43% das
exportações avícolas em todo o mundo. De acordo com a União Brasileira de Avicultura
(UBA) e a Associação Brasileira dos Produtores e Exportadores de Frango (ABEF), em
2009 o país produziu 10.969 milhões de toneladas de carne de frango, sendo que, desse
total, 3,6 milhões de toneladas foram enviados para 146 países, gerando uma receita
cambial de US$ 6,158 bilhões (LANA, 2000; QUEVEDO, 2009).
As regiões Sul e Sudeste do Brasil ainda concentram a produção avícola nacional, mas a
expansão da área de produção de grãos vem promovendo o desenvolvimento da atividade
em outras regiões. A região Nordeste, que tem o estado da Bahia como principal produtor
de carne de frango, apresentou taxa de crescimento de abate de 27,95% entre os anos de
1994 e 2005 (EVANGELISTA et al., 2008; SANTOS FILHO et al., 2009).
A crise mundial, iniciada no final de 2008, afetou todos os setores da economia, causando a
queda da renda per capita na maioria dos países do mundo. Essa redução se refletiu na
importação da carne brasileira, gerando impacto sobre o setor avícola e resultando na
diminuição de 2,79% nas exportações mundiais em comparação com o ano de 2008
(QUEVEDO, 2009).
Em momentos de crise econômica, reduzir custos é fundamental para a manutenção da
viabilidade. Os custos diretos e indiretos relacionados à sanidade avícola podem ser
minimizados a partir do conhecimento a respeito dos patógenos mais frequentes. Os
problemas respiratórios possuem extrema relevância para a avicultura industrial e, dentre
eles a Síndrome da Cabeça Inchada (SCI) vem se destacando não só por sua manifestação
clínica, mas também por causar imunossupressão, favorecendo a associação com outros
agentes (COOK, 2000; CHARY et al., 2002a).
2
Considerando a falta de informações a respeito da epidemiologia da Síndrome da Cabeça
Inchada na Bahia, este estudo se propôs a avaliar a presença do Metapneumovírus aviário
em plantéis comerciais e não comerciais do Estado, identificando o subtipo circulante e
observando também os fatores ambientais que podem favorecer a presença do vírus na
região.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. DEFINIÇÃO
O Metapneumovírus aviário (AMPV) é o agente etiológico da Rinotraqueíte dos Perus
(TRT) e é responsável por infecções agudas do trato respiratório superior de perus. Em
galinhas a infecção pelo AMPV é frequentemente associada a problemas respiratórios e à
Síndrome da Cabeça Inchada (SCI). Uma enfermidade emergente que acomete as galinhas
em todas as idades, pode apresentar-se na forma subclínica ou aguda e encontra-se
disseminada por todo o mundo (O’BRIEN, 1985; COOK, et al., 1988; NUNOYA et al.,
1991).
Tendo em vista que não se consegue reproduzir a doença somente com a infecção pelo
AMPV, pois este tem o papel de agente primário afetando o trato respiratório das aves. As
galinhas podem estar infectadas e não apresentar sintomatologia clínica (DROUAL &
WOOLCOCK, 1994; AL-ANKARI et al., 2001). Contudo, os sintomas clínicos na infecção
pelo AMPV podem evoluir para um quadro respiratório severo e prolongado, quando o
vírus abre porta para as infecções secundárias virais e/ou bacterianas, principalmente pela
Escherichia coli (AUNG et al., 2008).
A Síndrome da Cabeça Inchada é resultante da interação do AMPV com agentes
responsáveis pela coinfecção em aves como a Pasteurella spp., Mycoplasma synoviae,
3
Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma imitans, Bordetella avium, Ornithobacterium
rhinotracheale, Escherichia coli, o vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas, Doença de
Newcastle e Doença Infecciosa Bursal (MORLEY & THOMSON, 1984; COOK et al.,
1991; NAYLOR et al., 1992; JONES, 1996; EMPEL et al., 1996; MAJO´ et al., 1997;
GANAPATHY et al., 1998; KHEHRA et al., 1999; COOK et al., 2001; VAN DE ZANDE
et al., 2001b).
A severidade e duração da SCI também estão relacionadas aos fatores ambientais, tais
como, manejo inadequado, ventilação insuficiente, altos níveis de amônia, densidade
populacional elevada e más condições de higiene do galpão (HAFEZ, 1993; AL-ANKARI
et al., 2004).
Em frangos de corte infectados pelo AMPV, os sintomas clínicos manifestam-se entre três
a seis semanas de idade e a enfermidade tem curso de duas a três semanas. A morbidade e
mortalidade variam, de acordo com o agente secundário, tipo de criação, manejo e
condições ambientais presentes. Nestas aves as perdas econômicas podem chegar a 20%,
causando elevada taxa de morbidade (100%) e um baixo índice de mortalidade que pode
variar de 1 a 5%. Geralmente menos de 4% do galpão mostra o inchaço na cabeça. Todavia
quando ocorrem infecções secundárias virais e/ou bacterianas o índice de mortalidade do
plantel pode alcançar de 20% a 30%; e a condenação de carcaça no abatedouro encontra-se
entre 5 a 15% (PATTISON et al., 1989; JING et al., 1993; GOUGH et al., 1994).
As matrizes e poedeiras comerciais são afetadas principalmente no início do pico de
postura, podendo estender até o final da produção. Em matrizes a morbidade varia de 3 a
10%, com índice de mortalidade em torno de 1 a 3%. Também ocorrem perdas devido à
queda de postura durante a segunda e terceira semanas pós-infecção e aumento da
mortalidade embrionária em torno de 3 a 10%, além de ser observado nascimento de
pintinhos de má qualidade e problemas na qualidade interna dos ovos. Já em poedeiras
comerciais, as taxas de morbidade e mortalidade ficam em trono de 8 e 2%, com queda da
4
produção de ovos e alteração da qualidade da casca dos ovos (MORLEY & THOMSON,
1984; O`BRIEN, 1985; BELL & ALEXANDER, 1990).
2.2. HISTÓRICO E DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA
O AMPV foi primeiramente isolado em perus, na África do Sul, no final da década de 1970
(BUYS & DU PREEZ, 1980; BUYS et al., 1989). Posteriormente, a infecção pelo vírus foi
identificada sorologicamente em poedeiras comerciais na Europa (COOK, 2000), Reino
Unido (MCDOUGALL & COOK, 1986), em frangos de corte na Espanha (DIAZ DE
ESPADA & PERONA, 1984), França (GIRAUD et al., 1986), em matrizes na Inglaterra
(WIETH et al., 1987), em galinhas em Israel (WEISMAN et al., 1988), em frangos de corte
no Marrocos (EL HOUADFI et al., 1991), em matrizes no México (DECANINI et al.,
1991), em frangos de cortes, matrizes e poedeiras das principais regiões avícolas do Brasil
(ARNS & HAFEZ, 1992), Alemanha (NAYLOR & JONES, 1993), Holanda (COOK et al.,
1993a), em frangos de corte e matrizes no Taiwan (LU et al., 1994), América Central e na
América do Sul (JONES, 1996) e frangos de corte no Paquistão (AHMAD et al., 2005). A
sorologia positiva para o AMPV também foi relatada em avestruzes no Zimbábue
(CADMAN et al., 1994) e em gaivotas no mar Báltico (HEFFELS-REDMANN et al.,
1998). O AMPV foi isolado em galinhas na Inglaterra (JONES et al., 1987), em frangos de
corte e matrizes na Alemanha (HAFEZ, 1992), em matrizes nos Estados de Minas Gerais e
São Paulo no Brasil (ARNS & HAFEZ, 1995), em frangos de corte no Japão (TANAKA et
al., 1995; TANAKA et al., 1996a), em frangos de corte, matrizes e poedeiras em Israel
(BANET-NOACH et al., 2005) e na Jordânia (GHARAIBEH & ALGHARAIBEH, 2007).
Nos Estados Unidos da América o primeiro isolamento de AMPV ocorreu em criações
comerciais de perus no Colorado, após um surto de doença respiratória em 1997 (SENNE
et al., 1997; SEAL, 1998; COOK, et al., 1999). Na França, duas amostras do vírus foram
isoladas de patos no ano de 1985 (BAYON-AUBOYER et al., 2000).
5
2.3 CARACTERÍSTICAS DO AGENTE
2.3.1. CLASSIFICAÇÃO E ESTRUTURA DO AMPV
O Metapneumovírus Aviário, pertence à Ordem Virinae, Família Paramyxoviridae,
Subfamília Pneumovirinae, gênero Metapneumovírus (LING et al., 1992; PRINGLE, 1999;
NJENGA et al., 2003). Anteriormente este patógeno pertencia ao gênero Pneumovírus, mas
recentemente foi classificado como um Metapneumovírus, pois contém oito genes (3´-N-PM-F-M2-SH-G-L-5’) organizados de forma diferente dos 10 genes (3’-NS1-NS2-N-P-MSH-G-F-M2-L-5’) dos pneumovírus (EASTON et al., 2004). O genoma dos
metapneumovírus não possui os genes NS1 e NS2; e os genes F e M2 estão localizados
entre os genes M e SH, enquanto que nos pneumovírus, eles se localizam entre os genes G
e L (YU et al., 1992b; RANDHAWA et al., 1997; PRINGLE, 1998).
Figura 1: Comparação entre os genomas dos gêneros pneumovírus e metapneumovírus.
(Adaptado de Easton, 2004).
O AMPV possui um genoma de 13.3Kb, composto por RNA de fita simples, sentido
negativo, envelopado e não segmentado; que codifica oito genes, denominados,
Nucleoproteína (N), fosfoproteína (P), proteína Matrix (M), proteína de Fusão (F), segunda
Matrix (M2), pequena proteína hidrofóbica (SH), proteína de ligação (G) e a proteína RNA
polimerase dependente do RNA viral (L) (EVANS et al., 1996; NJENGA et al., 2003). O
6
vírus apresenta um acentuado pleomorfismo e projeções de 13 a 14 nm, distribuídas
uniformemente na superfície. A forma esférica, muitas vezes observada, apresenta diâmetro
de 80 a 200 nm, podendo apresentar longos filamentos de até 400 nm de comprimento
(BÄCHI & HOWE, 1973). O envelope viral, derivado da membrana plasmática da célula
hospedeira, é coberto por projeções e o nucleocapsídeo tem conformação helicoidal. O
Metapneumovírus Aviário não apresenta atividade hemaglutinante e neuramínica, sendo
incapaz de aglutinar eritrócitos de mamíferos e aves (GIRAUD et al, 1986; WYETH et al.,
1987; EASTON et al., 2004).
O complexo RNA-polimerase do vírus é composto pelo RNA genômico viral (vRNA)
associado às proteínas N, L e P. Este complexo é o modelo ativo para replicação e
transcrição viral (EASTON et al., 2004). A proteína L é o componente principal deste
complexo e se liga a sequência promotora na porção 3’ do RNA genômico, iniciando a
síntese de novos RNAs virais, incluindo o RNA mensageiro. Contudo, a proteína L não tem
capacidade de começar a transcrição ou replicação sem a presença da proteína P, que
fornece o prolongamento que a proteína L necessita para a sua liberação e produção dos
transcritos internos. A proteína N possui uma estreita associação com o RNA genômico e
induz o RNA viral a formar uma estrutura helicoidal (BARIK, 2004; EASTON et al.,
2004).
Nos vírus RNA de fita simples negativa, a proteína M esta associada à face interna da
membrana das células infectadas (WUNNER & PRINGLE, 1976). Esta proteína tem duas
funções: associar se a proteína N para impedir a transcrição viral durante a montagem e
promover a associação da proteína N com o envelope nascente. Sendo provável que as
proteínas M e M2 dividam estas funções (GHILDYAL et al., 2002).
No envelope viral estão inseridas, duas glicoproteínas de superfície: a proteína G, que está
envolvida na ligação do vírus com o receptor da célula hospedeira (LEVINE et al., 1987); e
a proteína F, que é responsável pela fusão entre o envelope viral com a membrana celular, e
também na formação de sincício nas células infectadas (SCHOWALTER et al., 2006). A
7
proteína F é sintetizada como um precursor inativo F0, que no momento que chega ao
Complexo de Golgi é clivado por proteases para formar as subunidades F1 e F2
biologicamente ativas. Portanto, a clivagem de F0 é determinante para a infectividade e
patogenicidade viral.
(WALSH & HRUSKA, 1983; LAMB et al., 2006). A terceira
proteína de superfície SH, tem função desconhecida; com uma elevada expressão na
superfície das células infectadas, mas é pouco incorporada pelo vírus (HUANG et al., 1985;
OLMSTED & COLLINS, 1989; BROOR & BHARAJ, 2007).
As glicoproteínas de ligação (G) e de fusão (F), além de realizarem as funções descritas
acima, são os dois principais antígenos do AMPV, que efetivamente estimulam a resposta
de anticorpos neutralizantes no hospedeiro natural (QINGZHONG et al., 1994; JUSASZ &
EASTON, 1994; KAPCZYNSKI, 2004).
2.3.2. REPLICAÇÃO VIRAL
A etapa inicial é a adsorção da glicoproteína G com o receptor celular. Após esta ligação, a
glicoproteína F também presente no envelope viral sofre uma mudança conformacional e se
funde a membrana celular. Em seguida, o complexo da RNA-polimerase responsável por
toda a síntese do RNA viral é liberado no citoplasma. O genoma do RNA viral é utilizado
como molde tanto para a síntese do RNA mensageiro (mRNA), quanto para a síntese da fita
antigenômica (+). A replicação viral ocorre no citoplasma da célula, após a síntese do
mRNA e das proteínas virais. O antigenoma (+) produzido é utilizado como molde para as
cópias de RNA genômico (-). A montagem do complexo RNA-polimerase também ocorre
no citoplasma, a partir da associação da nucleoproteína com o RNA viral (RNA-N)
formando a estrutura helicoidal do genoma viral. Em seguida este complexo RNA-N se
associa com as proteínas P e L dando origem ao complexo RNA-polimerase. A montagem
do envelope viral ocorre na superfície celular. As glicoproteínas da membrana viral são
sintetizadas no retículo endoplasmático da célula hospedeira sofrendo uma maturação
conformacional antes de serem transportadas para o Complexo de Golgi, onde a proteína F
8
é clivada formando as moléculas F1 e F2 funcionais. Por fim, as glicoproteínas são
transportadas à membrana citoplasmática, ocorrendo o alinhamento do complexo RNApolimerase associado à proteína M próximo às regiões modificadas da membrana celular, e
em seguida, novos vírions são liberados na superfície celular (EASTON et al., 2004).
2.3.3. SUBTIPOS DO AMPV
No final da década de 1990 acreditava-se que só existia um sorotipo do AMPV, contendo
dois subtipos distintos diferenciados com base na utilização de anticorpos monoclonais
(mAbs) (COLLINS et al., 1993; COOK et al., 1993a) e na análise da sequência de
nucleotídeos do gene da glicoproteína G altamente variável (JUHASZ & EASTON, 1994;
NAYLOR et al., 1997a; COOK et al., 1999; COOK & CAVANAGH, 2002). Estas
amostras do vírus foram classificadas como subtipos A e B presentes no continente europeu
(JUHASZ & EASTON, 1994). Tendo, o subtipo A do AMPV sido isolado pela primeira
vez na África do Sul e Grã-Betanha, ao passo que o subtipo B foi isolado em países do
continente europeu, tais como: Hungria, Espanha e Itália; e na Jordânia (COOK &
CAVANAGH, 2002; GHARAIBEH & ALGHARAIBEH, 2007). Ambos os subtipos
também foram identificados no Japão e nas Américas do Sul e Central (SEAL, 1998; SEAL
et al., 2000; MASE et al., 2003). Vinte anos depois do primeiro isolamento do vírus, o
subtipo C foi descrito após identificação em isolados do AMPV no Colorado, Estados
Unidos da América (EUA), em criações de perus (COOK et al., 1999; SHIN et al., 2000b;
SHIN et al., 2002a). O subtipo C foi identificado a partir da comparação das sequências dos
genes das proteínas M (SEAL, 1998), F (SEAL, 2000), N e P (DAR et al., 2001) com a
sequência dos genes dos subtipos A e B. O AMPV isolado nos EUA apresentava uma
identidade genética significativamente diferente dos subtipos da Europa (NJENGA et al.,
2003). Em 1985 na França, foi relatada uma nova variante do AMPV geneticamente
diferente dos subtipos A e B denominada de subtipo D, identificada de dois isolados
obtidos de patos (BÃYON-AUBOYER et al., 2000). Os subtipos A, B e D do AMPV são
mais intimamente relacionados uns com os outros do que com o subtipo C (SHIN et al.,
9
2002a). As sequências de aminoácidos dos genes G, SH e L do subtipo C apresentam uma
maior semelhança com os isolados de Metapneumovírus Humano (hMPV) do que com os
outros subtipos do AMPV (TOQUIN et al., 2003).
A glicoproteína G do AMPV é uma importante determinante dos subtipos, pois é uma
região muito variável do genoma e demonstra heterogeneidade genômica entre os subtipos
(JUHASZ & EASTON, 1994). O gene G dos subtipos A, B, C e D apresenta diferentes
sequências de aminoácidos e nucleotídeos (RANDHAWA et al., 1997; BÄYONAUBOYER et al., 1999; JACOBS et al., 2003; ALVAREZ et al., 2003).
A análise filogenética dos genes F e M do AMPV mostram semelhanças na sequência de
aminoácidos de 83% e 89%, respectivamente, entre os subtipos A e B (YU et al., 1992a;
YU et al., 1992b). O subtipo C do vírus compartilha 78% e 67% da sequência de
aminoácidos do gene das proteínas M e F, respectivamente, idênticos aos subtipos A e B
(SEAL, 1998; SEAL, 2000). Já o subtipo D tem 70% e 80,5% de similaridade na sequência
de aminoácidos com os subtipos A e B; e 77,6% a 97,2% de identidade com o subtipo C
(BÃYON-AUBOYER et al., 2000).
No Brasil, o primeiro isolamento do AMPV foi realizado em criações de matrizes nos
Estados de Minas Gerais e São Paulo (ARNS & HAFEZ, 1995). O sequenciamento do gene
da glicoproteína G foi realizado em dois isolados de matrizes com SCI, sendo identificados
como subtipo A e possuindo uma similaridade de 99% na sequência de aminoácidos do
gene G com o subtipo A europeu (DANI et al., 1999a).
Recentemente, o subtipo B foi isolado pela primeira vez em criações de poedeiras
comerciais, não vacinadas, no Estado de São Paulo. A comparação da sequência de
aminoácidos do gene G deste isolado brasileiro com isolados do subtipo B de outros países
apresentam semelhança de 96.1% (CHACÓN et al., 2007).
10
2.4. EPIDEMIOLOGIA
2.4.1. ESPÉCIES SUSCEPTÍVEIS
O AMPV tem como hospedeiros naturais perus e galinhas. Além dessas espécies
domésticas, as galinhas d’angola e os faisões também têm sido infectados com êxito pelo
vírus (PICAULT et al., 1987; GOUGH et al., 1988; CATELLI et al., 2001). Os pombos,
gansos e patos foram considerados por muito tempo como refratários à infecção pelo
AMPV (GOUGH et al., 1988). No entanto, em 1999 demonstrou-se a doença em patos da
Moscóvia (TOQUIN et al., 1999). Logo depois, o vírus foi isolado de pardais, gansos,
andorinhas e estorninhos selvagens nos EUA (SHIN et al., 2000b) e também de gansos
Canadenses (BENNETT et al., 2002). Sugere-se que estas espécies de aves selvagens
participam na manutenção e disseminação do vírus no meio ambiente. Anticorpos contra o
AMPV foram encontrados em avestruzes (CADMAN et al., 1994) e em gaivotas do Mar
Báltico (HEFFELS-REDMANN et al.,1998), mas o vírus não foi isolado dessas duas
espécies.
A doença respiratória causada pelo Metapneumovírus aviário é aguda e contagiosa,
acometendo aves comerciais e silvestres em várias partes do mundo. O vírus tem sido
isolado de galinhas de todas as idades (ALEXANDER et al., 1986; PICAULT et al., 1987;
TANAKA et al., 1995; COOK, 2000). Entretanto, frangos de corte de duas a seis semanas
de idade; e matrizes e poedeiras comerciais entre 24 e 36 semanas de idade são mais
susceptíveis a doença induzida pelo AMPV (MORLEY & THOMSON, 1984; HAFEZ &
LÖHREN, 1990; HAFEZ, 1993).
Nas criações de galinhas a doença causada pelo vírus pode ser mais severa em aves jovens
do que em aves mais velhas; embora as galinhas mais velhas sejam mais susceptíveis a
infecção pelo AMPV (ALEXANDER et al., 1986; COOK et al., 1993b). Em criações de
matrizes e poedeiras as aves mais velhas com oviduto maduro e em produção são mais
11
suscetíveis a infecção, do que as aves jovens que possuem o oviduto imaturo (COOK et al.,
2000).
2.4.2. TRANSMISSÃO
O vírus pode ser transmitido pelo contato direto de aves doentes com aves sadias, ou
contato indireto, através de pessoas, equipamentos e veículos. Não há provas até o
momento de transmissão vertical em galinhas, havendo relatos apenas da passagem de
anticorpos maternos para a progênie (GIRAUD et al., 1986; JONES, 1996).
A principal forma de disseminação do AMPV das aves doentes para sadias é através de
aerossóis. No entanto, a contaminação da água e alimento por muco e secreções nasais das
aves doentes, pode ser considerada outra via de contágio. Além disso, podem existir dentro
do plantel aves portadoras assintomáticas, que transmitem o vírus para as aves saudáveis. É
importante ressaltar que o vírus excretado nas fezes e pelo trato respiratório das aves
infectadas, tem um curto período de viabilidade no ambiente (JONES, 1996).
A disseminação do vírus nos galpões parece ser muito rápida (cerca de 24 horas) em lotes
de frangos de corte e matrizes criados em contato direto e mantidos sobre a cama, em
condições de clima seco, calor intenso, poeira e baixa umidade bem como má ventilação.
No caso das poedeiras comerciais criadas em gaiolas, e aves em galpões separados, a
transmissão da doença é relativamente mais lenta (cerca de uma a duas semanas)
(O’BRIEN, 1985; BAXTER- JONES et al., 1989a; ARNS & HAFEZ, 1995; ALKHALAF
et al., 2002).
Em criações comerciais, as secreções nasais das aves doentes podem contaminar superfícies
inanimadas, como instalações, bandejas de ovos, madeira, telhas de cerâmica, botas de
borracha, pneus e plástico (TIWARI et al., 2006). Contudo, a sobrevivência do vírus nas
instalações e equipamentos do galpão pode ser afetada por muitas variáveis químicas e
12
físicas, incluindo a temperatura, umidade, pH, presença de matéria orgânica e exposição a
vários produtos químicos (TOWNSEND et al., 2000; VELAYUDHAN et al., 2003).
O vírus apresenta sensibilidade à ação de desinfetantes virucidas (clorofórmio, compostos
fenólicos, glutaraldeído e compostos de amônia quaternária) e a sanitizantes para as mãos a
gel, com formulação a base de álcool, que podem ser utilizados pelos funcionários das
granjas (ARNS & HAFEZ, 1992; PATNAYAK et al., 2008). Ele também pode ser
inativado pelo calor à temperatura de 56oC ou 60oC por 30 minutos. E é estável em
intervalos de pH entre 3,0 e 9,0 (MCDOUGALL & COOK, 1986; COLLINS & GOUGH,
1988; BUYS et al., 1989).
Em galpões que possuem aves infectadas pelo AMPV, é recomendada após a saída do lote
a realização do vazio sanitário, que deve ser mantido por mais de seis dias, para que se
tornem seguros para o realojamento das aves nos pólos avícolas (TIWARI et al., 2006).
2.4.3. PATOGENIA
As aves se infectam por inalação do Metapneumovírus aviário presente no ar ou partículas
de poeira carreadoras do vírus. O vírus penetra pelo trato respiratório superior, e tem
predileção pelas células epiteliais ciliadas da mucosa dos cornetos nasais, da laringe e da
traquéia, que são barreiras naturais de defesa do trato respiratório e onde ocorre à
replicação primária do vírus causando ciliostase (parada do movimento ciliar) e destruição
do epitélio. Conseqüentemente, outras bactérias e vírus, não podem ser retidos, o que
facilita a ocorrência de infecções secundárias. Posteriormente, o vírus migra para o oviduto,
via corrente sanguínea, onde ocorre uma segunda replicação viral no epitélio ciliado do
trato reprodutivo da mesma maneira como ocorreu no trato respiratório (JONES et al.,
1988; COOK et al., 1991; CATELLI et al., 1998; VAN DE ZANDE et al., 1999).
13
A detecção do vírus é realizada principalmente no trato respiratório superior da ave
infectada, embora sua permanência nesta região ocorra por um curto período de tempo
(CHARY et al., 2002a). Apesar de rara pode haver detecção do vírus nos sacos aéreos e
pulmões; quando em decorrência da presença de outros patógenos, e dos danos causados
por estes nos tecidos do trato respiratório superior, o AMPV se dissemina para outros
órgãos da ave, principalmente para os que compõem o trato respiratório inferior (COOK et
al., 1991; CATELLI et al., 1998; VAN DE ZANDE et al., 1999; SEAL, 2000).
O AMPV também pode causar doenças reprodutivas, derivadas da replicação viral tanto no
epitélio ciliado do trato reprodutor das fêmeas, quanto nas células epiteliais ciliadas e não
ciliadas dos ductos eferentes dos testículos dos machos (AIRE, 1980; PRADHAN et al.,
1983; VILLARREAL et al., 2007).
Nos diferentes subtipos do AMPV existe uma variação na extensão e sítio de replicação. O
subtipo A invade principalmente o trato respiratório superior, infectando duas vezes mais
células epiteliais e produzindo uma quantidade maior de partículas virais do que o subtipo
B (VAN DE ZANDE et al., 1999).
2.4.4. SINAIS CLÍNICOS E LESÕES ANATOMOPATOLÓGICAS
A infecção pelo AMPV em criações de frangos de corte causa uma doença respiratória
caracterizada pela presença de espirros, tosse, ronqueira, estertores, lacrimejamento,
conjuntivite, descargas nasais, muco na traquéia, sonolência e depressão. Quando o AMPV
associa-se as infecções secundárias virais e/ou bacterianas, principalmente pela Escherichia
coli, o quadro respiratório se agrava desenvolvendo a Síndrome da Cabeça Inchada (SCI)
que é constituída pelo edema submandibular, inchaço do tecido periorbital da face e dos
seios infraorbitais. O edema subcutâneo pode ser tão extenso a ponto de forçar o
fechamento dos olhos, com isso as aves encontram dificuldade em se movimentarem dentro
do galpão na busca de alimento, o que faz com que morram por inanição. (O’BRIEN, 1985;
14
MCDOUGALL & COOK, 1986; COOK et al., 1988; PATTISON et al., 1989; HAFEZ,
1993; LU et al., 1994; JONES, 1996).
Em matrizes à infecção pelo AMPV causa à SCI que é seguida por sintomas nervosos na
fase final da doença com a presença de movimentos involuntários da cabeça, tremores,
torcicolo e opistótono, que não são provocados por lesões do sistema nervoso, mas sim
devido à inflamação do ouvido interno e órgãos responsáveis pelo equilíbrio, em um
percentual significativo das aves. Além disso, pode-se observar uma redução na fertilidade
e eclodibilidade dos ovos férteis. (O’BRIEN, 1985; PATTISON et al., 1989; HAFEZ,
1993; VILLEGAS, 1998).
Em galos reprodutores o vírus causa doença respiratória, edema facial e redução da
fertilidade, em razão de uma baixa concentração de espermatozóides viáveis. Em condições
geralmente precárias também podem ser observadas penas quebradas, crista cianótica e
depressão (VILLARREAL et al., 2007).
Nas criações de poedeiras comerciais o vírus causa uma leve doença do trato respiratório,
com sintomas clínicos, como: espirros, tosse e estertores, que evoluem e resultam na SCI,
que ocorre junto com uma momentânea queda na produção de ovos e perda da qualidade da
casca do ovo, resultando em casca fina; e a presença de diarréia (JING et al., 1993; COOK
et al., 2000; SUGIYAMA et al., 2006).
Em relação às lesões anatomopatológicas, as principais lesões macroscópicas observadas na
infecção pelo AMPV em frangos de corte, matrizes e poedeiras incluem a destruição do
epitélio ciliar dos seios nasais e da traquéia resultando em congestões, hemorragias
petequiais, lesões necróticas da mucosa da cavidade nasal, traqueal e fenda palatina; com
posterior surgimento de uma traqueíte e uma rinite catarral com secreção mucopurulenta
(COOK et al., 1991; MAJÓ et al., 1995; VAN DE ZANDE et al., 1999; AUNG et al.,
2008). É observada também no tecido subcutâneo uma extensa área gelatinosa amarelada
que evolui para um edema purulento e congesto no espaço inter-mandibular, periorbital,
15
barbela e pescoço das aves (LU et al., 1994). As matrizes e poedeiras podem apresentar
também uma variedade de anormalidades do trato reprodutivo incluindo congestão do
ovário, presença da gema do ovo no peritônio, causando peritonite e a regressão do ovário,
oviduto e dos folículos ovarianos. Em aves que expressam manifestações nervosas, é
observado constantemente inflamação do ouvido médio com acúmulo de pus (JONES et
al., 1988; COOK et al., 1996; SHIN et al., 2002b).
A infecção natural com o AMPV é mais severa que a infecção experimental, e este fato é
resultante da atuação do vírus com outros agentes secundários, demonstrando que existe um
sinergismo entre o AMPV e outros patógenos respiratórios desempenhando um papel
proeminente no processo da doença clínica com a presença de sinais respiratórios por um
longo período, além de originar lesões anatomopatológicas mais severas. A infecção
secundária pode exacerbar a infecção pelo AMPV, causando à perda de cílios na superfície
epitelial do trato respiratório superior; permitindo dessa maneira que o vírus penetre mais
profundamente no trato respiratório da ave e tenha uma persistência mais longa no tecido
(VAN DE ZANDE et al., 2001a; ALKHALAF et al., 2002; TURPIN et al., 2002; JIRJIS et
al., 2004).
2.5. IMUNOLOGIA
A produção de anticorpos específicos na infecção pelo AMPV em frangos de corte,
matrizes e poedeiras comerciais, ocorre três semanas após a infecção, mas nem sempre está
relacionada com a manifestação da doença, pois o AMPV pode infectar as galinhas sem
necessariamente causar sinais clínicos, ou seja, não existe correlação entre a presença de
anticorpos e a doença clínica, mas sim com a infecção. Os anticorpos neutralizantes
chegam ao nível mais elevado de produção em cinco a seis semanas após a infecção
(WYETH et al., 1987; COOK et al., 1988; HAFEZ & LÖHREN, 1990).
16
Após o desafio viral, mecanismos de proteção são ativados, como a produção de anticorpos
locais (IgA) que protegem a mucosa oculonasal, neutralizam a ação do vírus e impedem o
início da infecção pelo vírus nas células-alvo susceptíveis na superfície da mucosa. As
imunoglobulinas IgA são secretadas pela glândula de Harder, que é um órgão linfóide
secundário localizado na região medial dos olhos da ave; este é um dos principais locais de
apresentação do antígeno para os anticorpos, constituindo então no principal sítio de defesa
contra infecção respiratória. A localização desta glândula determina o contato primário com
o vírus, estimulando a agregação de células linfóides proliferativas que participam da
resposta imune local (GALLEGO et al., 1992; CHARY et al., 2002a; BENNETT et al.,
2005; CHA et al., 2007; AUNG et al., 2008).
A imunidade celular também participa na defesa contra o AMPV na superfície da mucosa
do trato respiratório superior das aves (BENNETT et al., 2005; GANAPATHY et al.,
2005).
A resposta imune humoral produz as imunoglobulinas IgM e IgG, que também são
responsáveis pela neutralização do vírus. Os anticorpos circulantes são detectados a partir
do quinto dia após o aparecimento dos sinais clínicos, através do emprego de técnicas
sorológicas que mensuram os títulos de anticorpos tanto na vacinação contra o AMPV,
quanto na infecção pelo o vírus. A imunidade humoral também tem ação importante na
proteção do trato reprodutivo contra o vírus (BAXTER-JONES et al., 1986; JONES, 1996;
COOK, 1997; TURPIN et al., 2002).
Em pintos de um dia de vida os títulos de anticorpos maternos oriundos de reprodutoras
vacinadas contra o AMPV permanecem por volta de 15 a 20 dias. Os anticorpos maternos
não previnem contra a infecção pelo vírus e não interferem na ação da vacina viva atenuada
(COOK et al., 1989b; NAYLOR et al., 1997b).
17
O Metapneumovírus Aviário tem ação imunossupressora, pois a infecção por este vírus
resulta na redução da resposta mitogênica dos linfócitos T, temporariamente. Esta inibição
coincide com a fase aguda da doença (CHARY et al., 2002a). A ação imunossupressora
acarreta numa elevada suscetibilidade a outras doenças e reduz a capacidade das aves de
responder as vacinas vivas virais rotineiramente utilizadas no sistema avícola de produção
(CHARY et al., 2002b).
2.6. DIAGNÓSTICO:
O diagnóstico e a detecção da infecção pelo AMPV são difíceis, pois envolvem tanto a
dificuldade em isolar o vírus do hospedeiro, devido ao curto tempo de replicação do vírus
no trato respiratório superior da ave, quanto à ausência de sinais clínicos da doença em aves
infectadas pelo AMPV na fase aguda da doença, que dura cerca de uma semana (COOK et
al., 1991; JONES, 1996; JIRJIS et al., 2000).
2.6.1. CLÍNICO
Em galinhas o diagnóstico clínico não é sugestivo da infecção pelo AMPV, pois o AMPV
serve como agente primário propiciando a instalação de infecções secundárias virais e/ ou
bacterianas, principalmente causada pela Escherichia coli, resultando no agravamento dos
sinais clínicos, como o surgimento da Síndrome da cabeça inchada (SCI) associada à tosse,
espirro, ronqueira, descarga nasal e conjuntivite, além de torcicolo e opistótono, resultantes
de infecção bacteriana no ouvido médio da ave (O’BRIEN, 1985; NUNOYA et al., 1991).
As condições ambientais também podem influenciar no aparecimento da SCI nas aves,
como o manejo inadequado, ventilação deficiente, alta densidade de aves, altos níveis de
amônia, além da presença de agentes de infecções secundárias (HAFEZ, 1993).
18
Sendo assim, os sintomas clínicos da infecção pelo vírus em galinhas não são suficientes
para identificação da enfermidade, havendo a necessidade de recorrer a métodos de
diagnóstico laboratoriais para se obter o diagnóstico definitivo da doença e confirmação da
ação do vírus (JONES, 1996).
2.6.2. SOROLOGIA
Na rotina da avicultura industrial, as aves são monitoradas utilizando métodos sorológicos,
que representam uma alternativa mais rápida e eficiente, possibilitando o acompanhamento
do status vacinal dos plantéis e/ou a circulação do vírus a campo na região (COOK, 1997).
A resposta imune humoral para o Metapneumovírus Aviário pode ser detectada pelas
técnicas sorológicas de Imunofluorescência Indireta (IFI), Soroneutralização (SN) e o
ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA). Estas técnicas são freqüentemente utilizadas
por serem consideradas ferramentas úteis para o diagnóstico sorológico deste agente.
(BAXTER-JONES et al., 1989b; VILLEGAS, 1998; ALKAHALAF et al., 2002; BROOR
& BHARAJ, 2007).
A Imunofluorescência Indireta (IFI) é um teste sensível e específico e pode ser utilizado
como teste de triagem, pois detecta a presença de anticorpos contra o AMPV, antes de
serem realizadas as técnicas de isolamento e identificação viral (BAXTER-JONES et al.,
1986).
O ensaio Imunoenzimático indireto (ELISA Indireto) por ser mais sensível e específico,
quando comparada aos outros testes sorológicos, é indiscutivelmente a técnica mais
comumente utilizada para a detecção de anticorpos contra o AMPV em plantéis avícolas.
Esse teste é de realização rápida e pode ser utilizado para a avaliação de um elevado
número de amostras de soros. Além disso, permite o monitoramento sorológico da ação das
vacinas viva atenuada e inativada nas aves, bem como o estudo epidemiológico do AMPV
19
nas criações avícolas (O’LOAN et al., 1989; ETERRADOSSI et al., 1995; JONES, 1996;
MEKKES & WIT, 1998; VILLEGAS, 1998; LIMA et al., 1999; ALKAHALAF et al.,
2002).
Diferentes tipos de Kit de ELISA estão disponíveis comercialmente para o diagnóstico do
AMPV em diferentes espécies de aves, e estes Kits podem ser sensíveis ou não para o
diagnóstico de subtipos heterólogos (JONES, 1996; CHIANG et al., 2000). Os ELISAs
baseados no vírus bruto e purificado são amplamente utilizados (CHETTLE & WYETH,
1988; O’LOAN et al., 1989).
Existem também, em diferentes laboratórios, testes de ELISA desenvolvidos para o
diagnóstico do AMPV baseados em proteínas recombinantes virais, tais como a proteína
matriz (M) e a nucleoproteína (N) expressa pela Escherichia coli (GULATI et al., 2000;
GULATI et al., 2001); além do ELISA de bloqueio e o ELISA baseado no peptídeo da
Nucleoproteína (N) (TURPIN et al., 2003; ALVAREZ et al., 2004). Para diferenciar os
isolados ou subtipos AMPV identificados em alguns países, foi desenvolvido o ELISA
baseado em anticorpos monoclonais (COLLINS et al., 1993).
Vários reagentes específicos para a detecção da infecção pelo AMPV vêem sendo
desenvolvidos. Os anticorpos monoclonais são utilizados por serem capazes de diferenciar
cepas dos subtipos A e B do AMPV, além de servirem como nova ferramenta para o estudo
da infecção, da patogênese e do diagnóstico da doença causada pelo vírus (COOK et al.,
1993a). Já foram criados também anticorpos monoclonais com ações que envolvem tanto, a
neutralização da molécula F1 da proteína de fusão (F) do vírus inibindo a fusão deste com
membrana celular, quanto à capacidade de reagirem com a Nucleoproteína (N) do subtipo
C do AMPV (TANAKA et al., 1996b; YU et al., 2006).
20
2.6.3. ISOLAMENTO VIRAL
O isolamento do AMPV em casos de infecção a campo é raro, pois as tentativas podem ter
resultados negativos se não forem realizadas no início do curso da infecção, ainda com a
presença do vírus no trato respiratório superior da ave. Isto ocorre devido ao fato de que o
vírus se replica e persiste por um curto espaço de tempo neste tecido, não estando mais
presente quando aparecem os sinais clínicos mais evidentes resultantes da infecção
secundária (COOK et al., 1991; JONES, 1996; ALKHALAF et al., 2002; CHARY et al.,
2002a). Se as aves manifestarem sinais clínicos, é indicado selecionar outras aves da
mesma propriedade ou em um galpão ao lado, que ainda não apresentam sinais clínicos
visíveis, mas já possam estar infectadas pelo vírus para se tentar o isolamento do AMPV
(COOK et al., 1988).
Para a realização do isolamento do AMPV são coletadas amostras que incluem swabs
traqueal e cloacal ou fragmentos de tecidos da traquéia, cornetos nasais e pulmões. São dois
os métodos de rotina empregados para isolamento viral utilizando estas amostras. A
utilização de ovos embrionados de galinha livre do patógeno específico (SPF) com seis dias
de incubação, através do saco vitelino, sendo necessárias algumas passagens para serem
observadas hemorragias, atrofia e mortalidade nos embriões; além da obtenção do fluido
alantóide e da membrana do saco vitelino infectados pelo AMPV (COOK et al., 1999;
GOYAL et al., 2000). É também empregada a inoculação em cultivo celular, onde ocorre a
replicação e atenuação do vírus após algumas passagens. Alguns exemplos de cultivos
celulares são: cultura de órgão traqueal de embriões de galinhas (TOC), onde se observa a
ciliostase; cultivo de linhagens de células renais de macaco Verde Africano (VERO),
células do fibroblasto de embriões de galinha (CEF), células QT-35 (células de
fibrosarcoma de codornas japonesas), células rugosas de embriões de galinha (CER),
células BGM (células de rins de macaco Grivet) e células de fígado de embriões de galinha
(CEL). Todas estas células podem apresentar efeito citopático, áreas focais de
arredondamento celular e formação de sincícios quando ocorre a replicação do AMPV
(MCDOUGALL & COOK, 1986; WILLIAMS, et al., 1991a; COOK et al., 1999; GOYAL
21
et al., 2000; BENNETT et al., 2002; SABARA & LARENCE, 2002).
2.6.4. IDENTIFICAÇÃO VIRAL
O efeito citopático não é uma característica especifica do Metapneumovírus Aviário, logo
existem técnicas de detecção do vírus que devem ser utilizadas em meios de cultivo celular,
tais como: Vírus neutralização (VN) (JONES, 1996), Imunofluorescência direta (IFD)
(JONES et al., 1987; COOK & CAVANAGH, 2002), imunoperoxidase (IP) (MAJÓ et al.,
1995; CATELLI et al., 1998), microscopia eletrônica e métodos imunoquímicos
(MCDOUGALL & COOK, 1986; JONES et al., 1988; CATELLI et al., 1998; YU et al.,
2006).
O AMPV pode ser detectado em cultivo de células VERO, através da técnica de
Imunofluorescência Indireta (IFI) (JIRJIS et al., 2002). A Soroneutralização (SN) é uma
técnica sensível e pode ser utilizada em vários meios de culturas celulares, como: TOC,
CEF, CEL, VERO (GIRAUD et al., 1986; O’LOAN et al., 1989; WILLIAMS et al., 1991a;
COOK et al., 1993a).
A técnica de Vírus Neutralização (VN) tem elevada sensibilidade e embora demorada, tem
sido utilizada para comparar amostras do vírus através da neutralização cruzada (BAXTERJONES et al., 1987).
Os meios aplicados na identificação do vírus em secções de tecidos como traquéia, cornetos
nasais e pulmões; incluem imunoperoxidase (IP), Imunohistoquímica, Imunofluorescência
direta (IFD) e microscopia eletrônica (JONES, 1996; CATELLI et al., 1998; JIRJIS et al.,
2000; JIRJIS et al., 2001; VELAYUDHAN et al., 2005).
22
2.6.5. DETECÇÃO DO GENOMA VIRAL
A biologia molecular é utilizada para detecção e tipificação do AMPV, tendo como
vantagem a capacidade de detectar o vírus numa amostra que apresente baixa carga viral,
além de fornecer resultado mais rápido e mais sensível, quando comparado ao isolamento
viral (JING et al., 1993). É composta por técnicas como PCR (reação em cadeia da
polimerase), RT-PCR (reação em cadeia pela polimerase-transcriptase reversa), análise por
enzimas de restrição e sequenciamento de aminoácidos de um fragmento do gene, RFLP
(análises polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição), PCR em tempo real,
Nested RT-PCR e RRT-PCR (PCR- transcriptase reversa em tempo real) (DANI et al.,
1999a; DANI et al., 1999b; VELAYUDHAN et al., 2005).
A técnica mais utilizada para detecção do RNA do vírus é a RT-PCR tipo-específica, que
utiliza os primers para a sequência do gene G viral (CAVANAGH et al., 1999; SHIN et al.,
2000a). Ela é utilizada para identificar outros subtipos que possam vir a acometer os
plantéis brasileiros, além dos subtipos A e B (DANI et al., 1999a; CHACÓN et al., 2007).
Contudo, a técnica da Nested RT-PCR vem demonstrando ser mais sensível, quando
comparada ao RT-PCR (MASE et al., 1996; DANI et al., 1999b). A vantagem da Nested
RT-PCR é que ela já identifica o subtipo não havendo necessidade de isolamento viral em
ovos embrionados ou em cultivos celulares, assim como não necessita da realização de
sequeciamento ou da análise com enzimas de restrição do amplificado para a identificação
dos subtipos do AMPV. Estes pontos acabam agilizando a identificação do agente em caso
de suspeita de infecção pelo AMPV a campo.
2.7. PREVENÇÃO E CONTROLE DO AMPV
Para fins de prevenção e controle da infecção do AMPV e da ocorrência da SCI, deve-se
determinar quais os “fatores predisponentes” em potencial que incidem sobre o plantel de
aves, como: tipo de ave acometida (frango de corte, poedeira comercial, reprodutora) e o
23
período de ocorrência (idade). O emprego de medidas de biosseguridade, boas condições de
higiene e práticas de manejo como a limpeza e desinfecção de equipamentos e instalações,
boas condições da cama, utilização de vazio sanitário, densidade populacional adequada,
aves com a mesma idade e boas condições de ambiência (variações de temperatura e
ventilação adequada), são importantes para ajudar a prevenir ou minimizar os efeitos da
infecção pelo AMPV (COOK, 2000; GOYAL et al., 2003; AL-ANKARI et al., 2004).
Os surtos causados pelo Metapneumovírus aviário nas criações avícolas comerciais são
contidos através de ações como o rápido despovoamento e/ou quarentena de pólos afetados
pelo vírus. Além disso, é necessária a aplicação imediata e rigorosa de medidas de
biosseguridade e desinfecção de fômites e instalações contaminadas, as quais podem ser
deixadas em vazio sanitário por um período de tempo adequado para que o APMV
desapareça por processo natural (TIWARI et al., 2006).
Embora não exista tratamento para a infecção pelo AMPV, avanços relacionados à
compreensão da patogênese da doença causada pelo vírus em determinados hospedeiros
naturais
fornecem estratégias combinadas de
terapias
imunomoduladoras/ anti-
inflamatórias e antivirais. Além disso, antibióticos devem ser utilizados para controlar as
infecções bacterianas secundárias que se instalam após a infecção pelo vírus (COOK, 2000;
GOYAL et al., 2003; EASTON et al., 2004).
Os programas de vacinação são um importante reforço para as estratégias de controle do
Metapneumovírus aviário no sistema intensivo de produção avícola. Em frangos de corte a
utilização de vacina viva atenuada, resulta em uma proteção local de quatro a cinco dias
pós-vacinação e a soroconversão é normalmente detectada após duas semanas. A vacina
viva atenuada confere uma proteção eficaz tanto em relação à doença clínica após o desafio
com o vírus, quanto na habilidade de induzir anticorpos, embora não evite que as aves
sejam infectadas pelo AMPV (COOK, 1997; VILLEGAS, 1998; GANAPATHY &
JONES, 2007).
24
A administração cuidadosa e correta da vacina viva atenuada proporciona excelente
proteção às aves (COOK et al., 1989a; WILLIAMS et al., 1991a). Logo deve se tomar
cuidado com alguns fatores que podem alterar a qualidade da água de beber utilizada na
administração da vacina viva para as aves, afetando assim a viabilidade desta vacina, tais
como: cloro, detergente e matéria orgânica. Para neutralizar esses elementos e manter a
viabilidade da vacina, são utilizados estabilizadores, tais como o leite em pó desnatado, que
são adicionados na água de beber oferecida as aves no momento da vacinação (CSEREP,
2003).
As vacinas vivas atenuadas de AMPV são rotineiramente utilizadas na Europa e América
do Sul para proteger os frangos de corte da Síndrome da Cabeça Inchada (TARPEY et al.,
2007). Entretanto, deve-se ter cautela ao utilizar a vacina viva, pois o AMPV é um vírus
com genoma RNA sendo mais instável geneticamente. Logo, a vacina viva pode sofrer
mutação e com isso ocorrer à reversão da virulência, que pode acarretar no aparecimento da
doença nas aves (JONES, 1996; CATELLI et al., 2006). Além disso, a patogenicidade
residual do AMPV utilizado nas vacinas pode resultar na eliminação do vírus para o meio
ambiente, levando para à contaminação deste e dificultando assim os esforços empregados
para erradicação do vírus (CHA et al., 2007).
No início da criação de matrizes e poedeiras comerciais a administração da vacina viva
atenuada impede a ocorrência da doença respiratória nas aves; e a vacina inativada aplicada
por via ocular ou spray antes do início da postura, garante um bom desempenho quanto à
proteção do sistema reprodutivo, diminuindo a ocorrência de queda na postura dos ovos, no
caso de um surto de AMPV. O emprego de esquema de vacinação com estes dois tipos de
vacina confere uma melhor proteção nestas aves, que têm um ciclo de produção longo
(COOK et al., 1996; COOK et al., 2000; SUGIYAMA et al., 2006).
O esquema de vacinação para machos reprodutores também consiste na aplicação dos dois
tipos de vacinas, a vacina viva com oito e 14 semanas de idade e a vacina inativada com 20
semanas (VILLARREAL et al., 2007).
25
Para a prevenção da infecção pelo AMPV em galinhas e perus, vacinas vivas e inativadas
dos subtipos A e B têm sido desenvolvidas e utilizadas nas criações comercias em todo o
mundo. Alguns autores afirmam que existe uma excelente proteção cruzada entre vacinas
contra o AMPV dos subtipos A e B (WILLIAMS et al., 1991b; ETERRADOSSI et a.l,
1995; PATNAYAK et al., 2002). As vacinas dos subtipos A e B protegem contra o AMPV
do subtipo C (COOK et al., 1999). No entanto, aves imunizadas com o subtipo C não são
protegidas de desafios com os subtipos A e B.
A aplicação simultânea das vacinas vivas atenuadas de AMPV, vírus da Doença de
Newcastle (NDV) e vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas (IBV), reduz a produção de
anticorpos contra o AMPV nas aves vacinadas, pois o NDV e o IBV competem pelo
mesmo sítio de ligação no epitélio da mucosa da traquéia. Logo, deve se respeitar o
intervalo de aplicação de no mínimo 15 dias entre estas vacinas (CAVANAGH et al., 1999;
TURPIN et al., 2002; TARPEY et al., 2007).
Atualmente a vacinação no ovo embrionado de galinhas e perus com 18 e 24 dias de
incubação, respectivamente, vem sendo utilizada como via de administração da vacina viva
atenuada contra o AMPV. A vacinação no ovo embrionado não causa efeitos adversos na
incubação e saúde das aves pós-eclosão, e também confere títulos de anticorpos vacinais
elevados (WORTHINGTON et al., 2003; HESS et al., 2004).
Outros tipos diferentes de vacinas vêm sendo desenvolvidos para a prevenção do AMPV,
como a vacina virosoma que é produzida para conter proteínas da membrana do vírus num
complexo lipossoma, ela não é infecciosa porque não possui o ácido nucléico; e também
não contém as proteínas (L, N ou P) de replicação viral. Quando esta vacina é administrada
no trato respiratório das aves diminui tanto os sinais clínicos da doença, quanto à carga
viral, além de estimular a resposta imune celular e humoral das aves (KAPCZYNSKI,
2004). Outro tipo de vacina contra o vírus desenvolvida é a vacina de DNA com genes do
AMPV, que levou a diminuição significativa da carga viral no tecido respiratório e redução
dos sinais clínicos em aves após o desafio com o vírus (KAPCZYNSKI & SELLERS,
26
2003).
3. ARTIGOS CIENTÍFICOS
3.1. ARTIGO 1
FREQUÊNCIA DE ANTICORPOS CONTRA METAPNEUMOVÍRUS AVIÁRIO
EM CRIAÇÕES INDUSTRIAIS E DE GALINHAS DE QUINTAL NO PÓLO
AVÍCOLA DA BAHIA.
SALES, Tatiane Santana 1*; HERVAL, Elen Fabiane Guimarães1; SILVA, Priscila Sousa
da1; LIMA, Jamille Machado de1; RAMOS, Izabella1; MAIA, Paulo César Costa1;
FERNANDES, Lia Muniz Barretto1
1
Universidade Federal da Bahia, Escola de Medicina Veterinária, Departamento de
Medicina Veterinária Preventiva, Avenida Ademar de Barros, 500, Ondina, Salvador,
Bahia, Brasil.
* Correspondência para o autor - E-mail: [email protected]
RESUMO
Este estudo teve como objetivo determinar a freqüência de anticorpos contra o
Metapneumovírus Aviário (AMPV) em criações, não vacinadas, de frangos de corte e
galinhas de quintal no pólo avícola do Estado da Bahia. Coletaram-se 622 amostras de soro
de criações de frangos de corte e 268 amostras de galinhas de quintal. A sorologia foi
realizada por meio do Kit comercial de ELISA indireto FlockChek* AMPV (Lab. IDEXX
©). Na análise estatística utilizou-se o Teste T de Student com intervalo de confiança de
95%. Detectou-se aves soropositivas para o AMPV tanto nos frangos de corte (144;
23,15%) quanto nas galinhas de quintal (187; 69,78%) (p = 0,1). Os lotes de frangos de
corte tiveram freqüência de anticorpos contra o AMPV de 77,14% e as propriedades de
27
aves caipiras 94,12%. No grupo de frangos de corte evidenciou-se anticorpos contra o vírus
em 66,67% e 33,33% das aves com e sem sintomas respiratórios, respectivamente. Já nas
aves caipiras foram encontradas soropositivas tanto nas aves com sintomas respiratórios
(60,43%) quanto naquelas sem sintomas (39,57%). Os resultados demonstram que houve
infecção pelo vírus nas criações de frangos de corte e de galinhas de quintal, sugerindo a
presença do AMPV no pólo avícola da Bahia.
PALAVRAS-CHAVES: Metapneumovírus aviário, frangos de corte, galinhas de quintal,
ELISA indireto.
FREQUENCY OF ANTIBODIES AGAINST AVIAN METAPNEUMOVIRUS IN
INDUSTRIAL CREATIONS AND BACKYARD CHICKENS ON POULTRY POLE
OF BAHIA.
ABSTRACT
This study aimed to determine the frequency of antibodies against avian metapneumovirus
(AMPV) in broilers and backyard chickens raised in the Pole of Avian Production of Bahia.
There were collected 622 and 268 serum samples of broilers and backyard chickens,
respectively. Serology was realized using indirect ELISA FlockChek* AMPV (Lab.
IDEXX ©) and statistical analysis was performed using Student T, with confidence interval
of 95%. Seropositives were detected in 144 broilers (23,15%) and in 187 backyard chickens
(69,78%). Flocks of broilers had frequency of antibodies against AMPV totalizing 77,14%
and backyard chickens totalizing 94,12%. In broilers group, antibodies were observed in
66,67% and 33,33% of birds with or without respiratory signs respectively. In backyard
chickens high frequency was found in birds with symptoms (60,43%) as in asymptomatic
ones (39,57%). Results showed that broilers and backyard chickens had been infected by
the virus, suggesting the presence of AMPV on Avian Pole of Bahia.
KEY WORDS: Avian Metapneumovirus, broilers, backyard chickens, indirect ELISA.
28
INTRODUÇÃO
O Metapneumovírus aviário (AMPV) vem sendo observado com maior freqüência no
sistema intensivo de produção avícola, se destacando entre os agentes respiratórios de
importância para avicultura industrial e causando perdas econômicas significantes (GAMA
et al., 2006). É também conhecido como o vírus da Rinotraqueíte Infecciosa dos Perus
(TRT) e em galinhas está associado à Síndrome da Cabeça Inchada (SCI) (ARNS &
HAFEZ, 1992).
O AMPV pertence à família Paramyxoviridae, subfamília Pneumovirinae, gênero
Metapneumovírus (NJENGA et al., 2003). Este vírus tem como hospedeiros naturais perus
e galinhas. Contudo, ele também já foi isolado em aves silvestres como patos (TOQUIN et
al., 1999), faisões, pombos (GOUGH et al., 1988), galinha d’ angola (PICAULT et al.,
1987) pardais, gaivotas, gansos, andorinhas (SHIN et al., 2002) e avestruzes (CADMAN et
al., 1994).
Os primeiros relatos da presença do AMPV ocorreram em perus e subseqüentemente em
galinhas no final dos anos 70, na África do Sul (BUYS & DU PREEZ, 1980; BUYS et al.,
1989). Posteriormente, em muitos países europeus, no Japão e nos Estados Unidos
ocorreram relatos da presença do vírus (DROUIN et al., 1985; WYETH et al., 1987; COOK
et al., 1988; DECANINI et al., 1991; HAFEZ, 1993; TANAKA et al. 1995; COOK et al.
1999). No Brasil, um estudo sorológico demonstrou a presença de anticorpos contra AMPV
nas principais regiões avícolas brasileiras (ARNS & HAFEZ, 1992). Desde então, a alta
prevalência da infecção por este agente em criações de frangos de corte tem sido observada
nestas regiões (ARNS et al., 1997). O diagnóstico sorológico mais freqüentemente utilizado
nas infecções pelo AMPV é o ensaio imunoenzimático (ELISA) (GRANT et al., 1987).
Em plantéis de frangos de corte o AMPV é frequentemente associado à SCI, que
caracteriza-se pela presença de um quadro respiratório, inchaço do seio infraorbital e edema
submandibular (SILVA et al., 1994). Em reprodutoras e poedeiras comerciais, a
29
enfermidade pode apresentar, além dos sinais respiratórios, sintomatologia nervosa como
torcicolo, opistótono e falta de coordenação; e queda na produção e qualidade dos ovos
(ARNS et al., 2000; RISTON, 2007). Frequentemente os quadros respiratórios são
agravados pela associação do AMPV com infecções secundárias, principalmente por
Escherichia coli (VAN DE ZANDE et al., 2001).
Os prejuízos econômicos do AMPV sobre a produção decorrem da piora da conversão
alimentar, custo com medicamentos, redução da postura, diminuição do ganho de peso e
aumento das taxas de mortalidade e condenação de carcaças (COOK, 1997; GAMA, et al.,
2006). O controle do AMPV é baseado no emprego de medidas de biosseguridade e
programas de vacinação nas criações avícolas industriais, além do uso de quimioterápicos
no combate às infecções secundárias (ARNS, 2006).
Observando-se a frequência com que frangos de corte manifestam sintomas respiratórios e
a possibilidade da ocorrência da SCI na região em estudo, o presente trabalho teve como
objetivo determinar a freqüência de anticorpos contra o AMPV em criações não vacinadas
de frangos de corte e galinhas de quintal no pólo avícola do Estado da Bahia.
MATERIAL E MÉTODOS
As amostras de soro foram obtidas de criações de frangos de corte, não vacinados, oriundas
de empresas avícolas e de propriedades com criação de galinhas de quintal, também não
vacinadas, localizadas nos municípios de Conceição da Feira, São Gonçalo dos Campos,
Feira de Santana, Muritiba, Entre Rios, Santo Antônio de Jesus, Conceição do Coité, Santo
Amaro da Purificação, Cícero Dantas, Irará, Governador Mangabeira e Ribeira do Pombal,
pertencentes ao pólo avícola do Estado da Bahia. Foram analisadas 890 amostras, sendo
622 amostras de frangos de corte oriundas de 35 lotes, coletadas no período de maio de
2007 a março de 2009 e 268 amostras de galinhas de quintal coletadas em 17 pequenas
propriedades entre os meses de abril de 2008 a março de 2009. Foram obtidos soros de aves
30
de criação comercial com idade entre 30 a 60 dias de vida e de aves de fundo de quintal
com idade de quatro meses a três anos.
As amostras de sangue dos frangos de corte e das galinhas de quintal foram coletadas,
através da punção da veia braquial e após a retração do coágulo, os soros foram transferidos
para tubos tipo eppendorf devidamente identificados e mantidos congelados a -20oC até a
avaliação sorológica.
Em cada uma das propriedades de criações comerciais e caipiras estudadas foi preenchida
uma ficha com informações sobre o histórico clínico das aves.
As análises dos soros foram realizadas no Laboratório de Sanidade Avícola da Bahia
(LASAB) da Escola de Medicina Veterinária (EMEV) da Universidade Federal da Bahia
(UFBA).
Os soros foram testados utilizando o teste de imunoadsorção enzimática (ELISA indireto),
através do Kit comercial FlockChek* AMPV (Lab. IDEXX ©) para a detecção de
anticorpos contra o AMPV. A execução e interpretação dos testes foram realizadas de
acordo com as recomendações do fabricante.
Os resultados foram calculados e interpretados através do programa xChek ®, em que as
densidades ópticas (D.O) de cada uma das amostras são relacionadas com os controles
positivos e negativos da placa utilizada, gerando um índice denominado razão S/P
(sample/positive). A razão S/P determina o ponto de corte, ou seja, o valor de densidade
óptica no teste que determina os soros positivos e negativos A soropositividade é
estabelecida através de um limite de titulação, sendo considerados positivos títulos acima
de 396 (OWOADE et al., 2006).
A análise estatística do estudo foi realizada utilizando o programa SPSS 12.0. Os dados
foram analisados pelo Teste T de Student. Considerando o intervalo de confiança de 95%.
31
RESULTADOS
No presente trabalho, foram encontrados anticorpos contra o Metapneumovírus aviário em
144 frangos de corte e 187 galinhas de quintal, ambos os grupos não vacinados. Observouse um maior percentual de aves soropositivas em criações de galinhas de quintal (69,78%)
em relação aos frangos de corte (23,15%), p=0,1 (Tabela 1).
TABELA 1. Frequência de anticorpos, valores de titulação, coeficiente de variação e
desvio padrão pela infecção pelo Metapneumovírus aviário em aves de criações de frangos
de corte e de galinhas de quintal no pólo avícola da Bahia.
Grupos
Nº
Aves
Nº aves positivas
(%)
Nº aves negativos
Títulos
(%)
min e max
CV
SD
Frangos de corte
622
144 (23,15)
478 (76,85)
1-18814
281,19
2311,52
Galinhas de quintal
268
187 (69,78)
81 (30,22)
1-27196
131,85
4884,42
p=0,1
Como observado na Tabela 1, foram obtidos elevados coeficientes de variação (CV) nos
dois grupos do estudo, sugerindo que não houve uniformidade da resposta imunológica
dessas aves frente a possíveis desafios de campo pelo AMPV. Ainda assim, o CV do grupo
de galinhas de quintal foi menor do que o de frangos de corte, o que demonstra uma maior
homogeneidade no primeiro grupo.
Em relação à presença de anticorpos contra o Metapneumovírus aviário, nos lotes de
frangos de corte a freqüência foi menor (77,14%) do que nas propriedades de aves caipiras
(94,12%). Nos dois grupos, houve a presença de uma ou mais amostras de soro positiva
(Tabela 2).
32
TABELA 2. Frequência de anticorpos contra o Metapneumovírus aviário em lotes de
frangos de corte e propriedades de galinhas de quintal no pólo avícola da Bahia.
Grupos
Nº de lotes - propriedades
Nº de lotes – propriedades
positivas *
Frequência
(%)
Frangos de corte
35
27
77,14
Galinhas de quintal
17
16
94,12
* Presença de uma ou mais aves soropositivas
No grupo de criação industrial foram identificados anticorpos contra o AMPV em 66,67% e
33,33% das aves com e sem relatos de sintomas respiratórios, respectivamente. Já nas
galinhas de quintal foram observadas freqüências de títulos tanto nas aves que
apresentavam os sintomas respiratórios (60,43%) quanto naquelas com ausência destes
sintomas (39,57%) (Figura 1).
33
FIGURA 1. Análise das amostras de soro na infecção pelo Metapneumovírus aviário em
frangos de corte e galinhas de quintal no pólo avícola da Bahia, em relação à presença e
ausência de sintomas respiratórios, por percentual.
Com sintomas respiratórios
Sem sintomas respiratórios
80
66,67
70
60,43
60
50
39,57
40
33,33
30
20
10
0
Frangos de corte
Caipiras
DISCUSSÃO
Não existe no Estado da Bahia até o momento um estudo soroepidemiológico a respeito da
presença de anticorpos contra o AMPV, embora a alta prevalência da infecção por este
agente em criações de frangos de corte já tenha sido observada nas principais regiões
avícolas brasileiras (ARNS et al., 1997).
Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que a infecção pelo Metapneumovírus
aviário está presente nas criações, não vacinadas, industriais e de galinhas de quintal no
pólo avícola da Bahia, com uma maior freqüência nas criações caipiras do que nas criações
de frangos de corte. Este fato pode ser atribuído a diferença na faixa de idade das aves nos
grupos estudados, onde se observa que as aves caipiras permanecem por mais tempo em
contato com o vírus a campo. Além disso, o emprego de medidas de biosseguridade, boas
condições de higiene e práticas de manejo que fazem parte da rotina das criações
comerciais devem contribuir para esse resultado (AL-ANKARI et al., 2004). Já nas
34
criações de aves de fundo de quintal, a ausência de um controle sanitário eficiente é
resultante da falta de manejo efetivo da criação, da incorporação de aves de condição
sanitária desconhecida, das condições precárias de higiene e limpeza dos abrigos, do
sistema de criação semi-extensivo das aves, e da presença de aves de diferentes idades
numa mesma criação, aliada à falta de atenção oficial para esse segmento (SALES et al.,
2007).
A frequência de frangos de corte soropositivos foi de 23,15% na região estudada. Resultado
semelhante ao obtido na Inglaterra (COOK et al., 1988) e em um estudo realizado por
PERES et al. (2006) no Estado de Mato Grosso do Sul, onde foram encontrados 18,3% de
amostras positivas em frangos de corte. ARNS & HAFEZ (1992), demonstraram títulos
positivos, através da técnica de ELISA, para a infecção pelo AMPV em 63% das criações,
não vacinadas, de frangos de corte, matrizes pesadas e poedeiras comerciais, nos estados de
Pernambuco, Minas Gerais, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul.
Já o percentual dos lotes comerciais soropositivos é considerado elevado (77,14%),
demonstrando a presença de uma ou mais aves sororeagentes para o vírus. PERES et al.
(2006) identificaram 90,7% dos lotes com títulos positivos ou suspeitos para o AMPV. Em
contrapartida, OWOADE et al. (2006) em estudo realizado na Nigéria identificaram
somente 30% de lotes de frangos de corte soropositivos.
Outros estudos foram realizados por DROUAL & WOOLCOCK (1994); TORO et al.
(1998) e BOARO et al. (2004) que relataram a ausência de anticorpos contra AMPV em
plantéis de frangos de corte na região Central da Califórnia, na região Central do Chile e na
região do Planalto Médio no Estado do Rio Grande do Sul, respectivamente.
Logo, na tentativa de eliminar ou reduzir os riscos de infecção pelo AMPV nos plantéis de
frangos de corte no pólo avícola da Bahia, um controle sanitário efetivo para a presença do
agente a campo deve ser implantando, através do emprego de medidas que melhorem as
35
condições de ambiência; limpeza e desinfecção das instalações e a realização do vazio
sanitário nestes plantéis avícolas (BERNARDINO, 2007).
Identificamos neste trabalho altos percentuais de títulos individuais (69,78%) e
propriedades de galinhas de quintal soropositivas (94,12%) para o AMPV no pólo avícola
da Bahia. Resultados semelhantes foram encontrados em estudo realizado na Nigéria por
OWOADE et al (2006), que identificou elevados níveis de anticorpos contra o AMPV em
cerca de 70% das aves caipiras, não vacinadas, e em 65% das criações destas aves na
Nigéria.
A elevada freqüência de anticorpos em galinhas de quintal contra o AMPV evidenciada
neste estudo confirma a hipótese de que estas aves foram infectadas pelo vírus, servindo
como portadoras do AMPV e podendo também ser utilizadas como sentinelas em
determinadas
localidades,
possibilitando
dessa
maneira
o
acompanhamento
soroepidemiológico da circulação do vírus a campo. Programas educacionais para informar
os criadores de aves de quintal sobre noções adequadas de criação e manejo para melhorar
a condição sanitária destas criações, são de grande importância no meio rural. Além, de
favorecer o controle do vírus, reduzindo o risco da manutenção do agente no ambiente
(ALBINO et al., 2005).
COOK et al. (1988) afirmaram que pode-se encontrar anticorpos contra o AMPV em aves
aparentemente saudáveis. Esta hipótese foi confirmada neste trabalho, que identificou
títulos de anticorpos contra o AMPV nas aves de criações industriais e caipiras
aparentemente saudáveis. Entretanto, foram identificadas também aves com sinais
respiratórios soropositivas para o vírus corroborando com os dados obtidos por PERES et al
(2006) e ARNS & HAFEZ (1992).
Este estudo foi o primeiro relato da evidência sorológica do AMPV no pólo avícola da
Bahia em criações, não vacinadas, de frangos de corte e galinhas de quintal. Os resultados
apresentados neste trabalho reforçam a necessidade do conhecimento da epidemiologia do
36
AMPV na região estudada, através da realização de pesquisas para a identificação da
amostra circulante do AMPV a campo, por meio do isolamento e caracterização viral.
CONCLUSÃO
Verificou-se a presença da infecção pelo Metapneumovírus aviário nas criações, não
vacinadas, de frangos de corte e galinhas de quintal no pólo avícola da Bahia. A avaliação
sorológica das criações comerciais e caipiras revelaram a presença de anticorpos contra o
vírus em ambos os grupos estudados independente do sistema de criação e das condições
sanitárias.
REFERÊNCIAS
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41
3.2. ARTIGO 2
DETECÇÃO DO METAPNEUMOVÍRUS AVIÁRIO EM CRIAÇÕES DE
FRANGOS DE CORTE E GALINHAS DE QUINTAL ATRAVÉS DA TÉCNICA DE
REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE-NESTED-TRANSCRIPTASE
REVERSA (NESTED RT-PCR) NO PÓLO AVÍCOLA DA BAHIA.
SALES, Tatiane Santana 1*; HERVAL, Elen Fabiane Guimarães1; SILVA, Priscila Sousa
da1; LIMA, Jamille Machado de1; RAMOS, Izabella1; MAIA, Paulo César Costa1;
FERNANDES, Lia Muniz Barretto1
1
Universidade Federal da Bahia, Escola de Medicina Veterinária, Departamento de
Medicina Veterinária Preventiva, Avenida Ademar de Barros, 500, Ondina, Salvador,
Bahia, Brasil.
* Correspondência para o autor - E-mail: [email protected]
RESUMO
O Metapneumovírus aviário (AMPV) é o agente etiológico da Síndrome da Cabeça Inchada
(SCI) em galinhas. O objetivo deste estudo foi realizar a detecção molecular do AMPV a
campo em criações não vacinadas de frangos de corte e de galinhas de quintal no pólo
avícola da Bahia, utilizando a técnica Nested RT-PCR. Os resultados obtidos demonstraram
a presença do subtipo A do AMPV em lotes de frangos de corte (11,11%) e em criações de
galinhas de quintal (22,22%). Este é o primeiro relato sobre a detecção do AMPV em
criações avícolas no Estado da Bahia. Esses resultados sugerem que os fatores relacionados
ao manejo das criações, condições climáticas e de ambiência podem influenciar na presença
do AMPV no meio ambiente e sua disseminação nas criações industriais do pólo avícola da
Bahia.
42
PALAVRAS-CHAVES: Metapneumovírus aviário, frangos de corte, galinhas de quintal,
Nested RT-PCR.
DETECTION OF AVIAN METAPNEUMOVIRUS IN BROILER AND BACKYARD
CHICKENS RAISED IN THE AVIAN POLE OF BAHIA USING NESTED RT-PCR.
SUMMARY
Avian metapneumovirus is the etiological agent of the swollen head syndrome in chickens.
The aim of this study was detect the infection in no vaccinated broilers and backyard
chickens raised at the avian pole of Bahia, using Nested RT-PCR. Results showed the
presence of AMPV subtype A in broilers (11,11%) and backyard chickens (22,22%). This
is the first relate of AMPV detection in avian flocks of Bahia. These results suggest that
factors related to flock management, climatic and ambient conditions can influence in the
presence of the AMPV in the environment and the dissemination in the industrial flocks of
the avian pole of the Bahia.
KEYWORDS: Avian Metapneumovirus, broilers, backyard chicken, Nested RT-PCR.
INTRODUÇÃO
O Metapneumovírus Aviário (AMPV) é o agente etiológico da Rinotraqueíte dos Perus
(TRT) e em galinhas é frequentemente associado à Síndrome da Cabeça Inchada (SCI),
doença de início súbito e rápida disseminação no plantel. A primeira descrição da infecção
pelo AMPV ocorreu em perus, em 1978 na África do Sul, e desde então tem sido isolado
tanto de perus quanto de galinhas na Europa, Ásia, Israel, América Central e no Brasil
(BUYS & DU PREEZ, 1980; OTSUKI et al., 1996, ARNS & HAFEZ, 1995; COOK, 2000;
BENNETT et al., 2004; BANET-NOACH et al., 2005).
43
O vírus pertence à família Paramyxoviridae, Subfamília Pneumovirina e ao gênero
Metapneumovírus (PRINGLE, 1999). O AMPV tem como genoma o RNA de fita simples,
de simetria helicoidal, sentido negativo e não segmentado. É composto por oito genes que
codificam a Nucleoproteína (N), Fosfoproteína (P), proteína Matriz (M), glicoproteína de
Fusão (F), segunda Matriz (M2), pequena proteína hidrofóbica (SH), glicoproteína de
ligação (G) e a proteína RNA polimerase dependente do RNA viral (L). Os genes do
AMPV têm a seguinte ordem 3´-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5’ (COLLINS et al., 1986; LING et
al., 1992). Os quatro subtipos (A, B, C e D) do AMPV são diferenciados com base na
característica antigênica e na análise da sequência de nucleotídeos do gene da glicoproteína
G (COOK, 2000). Enquanto a maioria dos isolados do vírus na Europa, Ásia e América do
Sul pertencem ao subtipo A e B, o AMPV subtipo C foi primeiramente relatado, em 1996,
nos EUA. (SEAL, 1998; COOK et al., 1999). Na França, o subtipo D foi identificado de
dois isolados obtidos de patos, em 1985 (BÄYON-AUBOYER et al., 2000).
No Brasil estudos sorológicos evidenciaram a disseminação do AMPV em criações
avícolas industriais de várias regiões do país. Até 2005, todas as amostras de AMPV
identificadas no Brasil pertenciam ao subtipo A (D’ARCE et al., 2005). Contudo,
recentemente o subtipo B foi isolado pela primeira vez em criações de poedeiras comerciais
no Estado de São Paulo (CHACÓN et al., 2007).
Para a detecção do AMPV em criações de galinhas a campo tem sido utilizada a técnica de
Nested RT-PCR baseada na sequência do gene da glicoproteína G. Esta técnica é escolhida
por ser mais sensível e específica que o RT-PCR, além de permitir a diferenciação entre os
subtipos A e B do Metapneumovírus Aviário sem a necessidade do sequenciamento
(NAYLOR et al., 1997; BÄYON-AUBOYER et al., 1999; HESS et al., 2000; HESS et al.,
2004).
As variações nas condições climáticas das diferentes regiões brasileiras podem influenciar
na epidemiologia do AMPV nas criações avícolas comerciais de cada região. Existem
poucas informações quanto à prevalência da doença e a incidência de infecção pelo vírus
44
em lotes de frangos de corte e criações de galinhas nas diferentes estações do ano no Brasil.
No entanto, já se tem conhecimento de que a maioria das ocorrências de surtos com os
vírus respiratórios pertencentes à subfamília Pneumovirinae (Metapneumovírus humano)
acontece em meses com altos índices pluviométricos ou em meses com baixas temperaturas
(BROOR & BHARAJ, 2007).
A ocorrência sazonal de surtos do AMPV em criações de perus nos EUA demonstrou que a
maior incidência de aves soropositivas, ocorreu com maior frequência nas estações do ano
de primavera (março a maio) e outono (outubro a dezembro) (SHIN et al. 2002). Uma
possível explicação para esta incidência sazonal do vírus consiste na presença de um grande
número de aves migratórias na região central dos EUA nestes períodos do ano (GOYAL et
al. 2000; GOYAL et al., 2003).
A disseminação do AMPV entre diferentes regiões e países requer atenção, pois está
relacionada tanto com a migração das aves selvagens, que são consideradas reservatórios
assintomáticos do vírus transmitindo-o para as criações de aves comerciais e domésticas,
quanto ao trânsito e comércio de aves vivas. Além disso, as criações de galinhas de quintal
representam um risco na introdução do AMPV nos plantéis avícolas industriais, uma vez
que estas aves estão mais susceptíveis à infecção pelo AMPV presente a campo (GOYAL
et al. 2000; OWOADE et al., 2006; LEE et al., 2007).
O presente estudo teve como objeto realizar a detecção molecular do Metapneumovírus
aviário circulante a campo, utilizando a técnica Nested RT-PCR, em criações não vacinadas
de frangos de corte e de galinhas de quintal no pólo avícola da Bahia.
45
MATERIAS E MÉTODOS
Amostras
Foram coletadas amostras de sangue e swabs traqueais de frangos de corte e galinhas de
quintal, não vacinados, localizados nos municípios de Feira de Santana, Conceição da
Feira, São Gonçalo dos Campos, Muritiba, Entre Rios e Irará pertencentes ao pólo avícola
do Estado da Bahia, no período de julho de 2008 a julho de 2009.
Detecção de Anticorpos: ELISA Indireto
Os ensaios foram realizados no Laboratório de Sanidade Avícola (LASAB) - UFBA. Do
total de 450 amostras analisadas, 225 foram obtidas de nove aviários de frango de corte e
225 amostras foram obtidas de nove criações de galinhas de quintal. Em cada
lote/propriedade foram coletadas 25 amostras. Os soros foram testados utilizando a técnica
de imunoadsorção enzimática (ELISA indireto), através do Kit comercial FlockChek* APV
(Lab. IDEXX ©) de acordo com as recomendações do fabricante. De acordo com o
fabricante a especificidade do teste utilizado foi estimada em 98%. Os resultados foram
calculados e interpretados através do programa xChek ®, em que as densidades óticas
(D.O) de cada uma das amostras são relacionadas com os controles positivos e negativos da
placa, gerando um índice denominado razão S/P (sample/positive). A razão S/P determina o
ponto de corte, ou seja, o valor de densidade ótica no teste que determina os soros positivos
e negativos.
Detecção do vírus: Nested RT-PCR
Para detecção do vírus, foram coletados 18 pools de swabs traqueais, nove pools
provenientes de frango de corte e nove pools de galinhas de quintal. Cada pool era
composto por 10 swabs de aves selecionadas aleatoriamente. Os mesmos foram
acondicionados e armazenados a temperatura de -20ºC no LASAB até serem encaminhados
46
para processamento no JF Laboratório (Campinas-SP), onde foi utilizada a técnica Nested
RT – PCR para a detecção viral.
A extração do RNA
As amostras de swabs traqueais foram colocadas em água MiliQ, e em seguida foram
congeladas e descongeladas três vezes e centrifugadas a 14.000 g por 20 minutos. Após
colher o sobrenadante foram adicionados solução GIT, fenol (pH 4,0), acetato de sódio 2M
e B-mercaptoetanol. Em seguida realizou-se agitação e foi adicionada solução de
clorofórmio álcool isoamílico, procedendo-se na seqüência uma nova centrifugação. A fase
aquosa (sobrenadante) foi transferida para outro tubo contendo isopropanol para
precipitação de RNA e centrifugada a 12.000 x 4ºC por 15 minutos. Desprezou-se o
sobrenadante e lavou-se o “pellet” com etanol 75%. O RNA foi dissolvido em água MiliQ e
incubado a 56ºC por 10 minutos.
A metodologia empregada para a realização do Nested RT-PCR, baseado na sequência do
gene da glicoproteína G, utilizou os primers e condições de reação descritas por Cavanagh
et al.(1999) e Juhasz & Easton (1994). O produto do Nested RT-PCR foi analisado em gel
de agarose a 2 %, foram consideradas positivas para AMPV as amostras que resultaram na
visualização de uma banda de 268 pares de bases (bp) do subtipo A ou 361 bp do subtipo
B.
RESULTADOS
Os resultados da frequência de títulos (mínimo e máximo) de anticorpos contra o
Metapneumovírus Aviário em lotes de frangos de corte e criações de galinhas de quintal,
não vacinados, estão apresentados na Tabela 1. As galinhas de quintal apresentaram títulos
de anticorpos (mínimo e máximo) mais elevados, quando comparado aos frangos de corte.
47
Como observado na Tabela 1, dos nove pools de swabs traqueais dos lotes de frangos de
corte e das criações de galinhas de quintal testados, utilizando a técnica de Nested- RTPCR para a detecção do AMPV, um lote de frangos de corte (11,11%) e duas criações de
galinhas de quintal (22,22%) foram positivos para subtipo A do AMPV.
TABELA 1. Frequência de títulos de anticorpos contra Metapneumovírus Aviário e
detecção viral em criações de frangos de corte e galinhas de quintal no Pólo
avícola da Bahia.
Amostra
Ave
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Frango de corte
Frango de corte
Frango de corte
Frango de corte
Frango de corte
Frango de corte
Frango de corte
Frango de corte
Frango de corte
Galinha de quintal
Galinha de quintal
Galinha de quintal
Galinha de quintal
Galinha de quintal
Galinha de quintal
Galinha de quintal
Galinha de quintal
Galinha de quintal
Títulos
min. – máx.
1-1
1-1
1-2097
1-913
1-499
1-1
1-1161
1-1919
1-190
1083-15717
1069-17756
144-8596
1447-13853
1-4643
1-6592
180-11193
1-12454
91-2117
Frequência de
aves positivas (%)
0
0
4
4
4
0
4
8
0
100
100
88
100
40
60
84
76
72
Subtipo
A
A
A
-
Os frangos de corte do lote positivo para o Nested RT- PCR não apresentaram títulos de
anticorpos contra o vírus, sendo 100% das amostras sorologicamente negativas para o
AMPV (Figura 1).
48
FIGURA 1. Distribuição dos títulos de anticorpos contra o Metapneumovírus Aviário no
lote de frangos de corte, positivo para a detecção viral.
≤ 396
100
90
80
N0 de aves
70
60
50
40
30
25 (100%)
20
10
0
As duas propriedades de galinhas de quintal positivas para a detecção do RNA viral
revelaram títulos variando de 1 a 15717 (Tabela 1). Os títulos das amostras analisadas
nestas propriedades foram distribuídos desta forma: 20% das amostras com títulos menores
ou iguais a 396; 10% das amostras com títulos de 397 até 1000; 36% das amostras com
títulos de 1001 até 5000; 18% das amostras com títulos de 5001 até 10000 e 16% das
amostras acima de 10000. A disposição dos títulos encontrados pode ser observada na
Figura 2.
49
FIGURA 2. Distribuição dos títulos de anticorpos contra o Metapneumovírus Aviário em
criações de galinhas de quintal, positivas para a detecção viral.
≤ 396
397 - 1000
1001 - 5000
5001 - 10000
> 10000
100
90
80
N0 de aves
70
60
50
40
30
20
10
18 (36%)
10 (20%)
5 (10%)
9 (18%)
8 (16 %)
0
No presente estudo, o RNA do AMPV foi detectado em um lote de frango de corte
(amostra 6) e em duas propriedades de galinhas de quintal (amostras 10 e 15), em duas
estações do ano. Nas amostras 6 e 10 o RNA viral foi detectado na primavera de 2008,
enquanto que na amostra 15 a detecção viral ocorreu no outono de 2009 (Tabela 2).
Na tabela 2 também estão apresentadas a média da temperatura e o índice pluviométrico
dos períodos em que o RNA do AMPV foi detectado nas amostras 6 e 10 (19,4-30,2oC/
195mm) e na amostra 15 (21,6-33,5 oC/ 65mm).
50
TABELA 2. Detecção do Metapneumovírus Aviário em criações de frangos de corte e
galinhas de quintal em diferentes estações do ano no Pólo avícola da Bahia
Amostra
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Ave
Estações do ano/ano Média da Temperatura Índice Pluviométrico Subtipo
min. - máx.
(mm)
0
199,3
Frango de corte
Inverno/2008
17,1 - 25,6 C
0
199,3
Frango de corte
Inverno/2008
17,1 - 25,6 C
0
199,3
Frango de corte
Inverno/2008
17,1 - 25,6 C
0
Inverno/2009
115,6
Frango de corte
18,8 - 27,4 C
0
115,6
Frango de corte
Inverno/2009
18,8 - 27,4 C
Frango de corte
Frango de corte
Frango de corte
Frango de corte
Galinha de quintal
Galinha de quintal
Primavera/2008
Primavera/2008
Outono/2009
Outono/2009
Primavera/2008
Primavera/2008
19,4 - 30,20C
0
19,4 - 30,2 C
0
21,6 - 33,5 C
0
21,6 - 33,5 C
0
19,4 - 30,2 C
0
19,4 - 30,2 C
0
Galinha de quintal
Galinha de quintal
Galinha de quintal
Galinha de quintal
Primavera/2008
Verão/2009
Verão/2009
Outono/2009
19,4 - 30,2 C
0
20,8 - 32,6 C
0
20,8 - 32,6 C
21,6 - 33,50C
Galinha de quintal
Outono/2009
21,6 - 33,5 C
Galinha de quintal
Galinha de quintal
Inverno/2009
Inverno/2009
18,8 - 27,4 C
0
18,8 - 27,4 C
0
0
195
195
65
65
195
195
195
159,7
159,7
65
65
115,6
115,6
A
A
A
-
DISCUSSÃO
Amostras do subtipo A e B do AMPV já foram identificadas em criações comerciais nas
principais regiões avícolas do Brasil (DANI et al., 1999; CHACÓN et al., 2007). No
entanto até o momento não existe nenhum relato sobre a detecção molecular do AMPV em
criações comerciais no Estado da Bahia, apesar da exposição ao AMPV já ter sido
observada em criações, não vacinadas, de frangos de corte e galinhas de quintal no pólo
avícola baiano (dados não publicados).
51
Neste estudo foram apresentados resultados que demonstraram a presença do subtipo A do
Metapneumovírus Aviário em criações, não vacinadas, de frangos de corte e de galinhas de
quintal no pólo avícola da Bahia. Observou-se a detecção viral em duas propriedades de
galinhas de quintal (22,22%) e um lote de frango de corte (11,11%).
Os frangos de corte do único lote positivo para detecção do RNA do AMPV não
apresentaram títulos de anticorpos contra o vírus. Este fato pode ter sido decorrente da
infecção inicial pelo AMPV, com a presença do vírus no trato respiratório superior das
aves, sem a ocorrência de soroconversão, já que a produção de anticorpos específicos só
ocorre três semanas após a infecção (COOK et al., 1993;TURPIN et al., 2002).
Também foram observadas aves comerciais e caipiras soropositivas para a infecção pelo
AMPV e negativas para a detecção viral. Isto provavelmente é resultado do curto período
de tempo que o AMPV se replica no epitélio traqueal após a infecção inicial (COOK et al.,
1993; CATELLI et al., 1998). Segundo OWOADE et al. (2008) as aves negativas para o
detecção do RNA viral podem ter sido infectadas anteriormente pelo vírus e em seguida têlo eliminado.
Resultado semelhante foi encontrado em um estudo realizado em Israel em dois pólos de
frangos de corte, não vacinados, que apesar de apresentarem elevados títulos de anticorpos
contra o AMPV foram negativos para a detecção do RNA viral (BANET-NOACH et al.,
2009).
As galinhas caipiras das duas propriedades onde o subtipo A do AMPV foi detectado,
também apresentaram títulos de anticorpos elevados contra o vírus. Este resultado pode ser
atribuído às condições precárias de biosseguridade, ao fato destas aves serem criadas por
um período mais longo e ao sistema de criação semi-extensivo das aves que favorece o
contato destas com a amostra a campo, contribuindo desta forma para a reinfecção das
galinhas (COOK, 2000; BANET-NOACH et al., 2009). Como estas aves podem
52
permanecer portadoras assintomáticas do AMPV e de outros agentes infecciosos, há o risco
de transmissão para os plantéis avícolas comerciais (SALES, 2007).
Em um estudo realizado no Sudoeste da China foi observada uma prevalência de 39% do
RNA do AMPV subtipo A no mercado de aves vivas oriundas de propriedades avícolas
comerciais e familiares. Estes autores sugerem que o comércio de aves vivas pode ter um
papel subestimado na disseminação do AMPV, já que as propriedades de galinhas na região
sustentam uma alta taxa de infecção (OWOADE et al.,2008).
A presença dos subtipos A e B do AMPV em criações industriais no Japão também tem
sido justificada pela importação de aves, que pode favorecer a entrada dos outros subtipos
do vírus no país (MASE et al., 2003).
O RNA do AMPV pertencente aos subtipos A e B também foi detectado em 15% das
criações de frangos de corte na Nigéria. Este resultado é inferior a soroprevalência de 40%
observada anteriormente nas criações comerciais da mesma região (OWOADE et al.,2006).
Segundo Owoade et al. (2008) esta diferença é justificada pela fato de algumas aves
negativas para o RT-PCR terem sido infectadas anteriormente pelo AMPV e depois de um
período o eliminarem.
O subtipo A do AMPV encontrado na Nigéria e China são idênticos aos relatados
previamente no Brasil e no Reino Unido, sugerindo que seja resultante do comércio entre
estes países (OWOADE et al.,2008).
A presença da infecção pelo AMPV nas criações comerciais pode ser decorrente de falhas
no emprego de medidas de biosseguridade e práticas de manejo (AL-ANKARI et al., 2004).
Segundo Chacón et al. (2007) as condições precárias de biosseguridade e o manejo
inadequado, podem favorecer a transmissão do AMPV a campo entre os plantéis e
propriedades. Estas condições são observadas com mais frequência nas criações de galinhas
53
de fundo de quintal, que apresentam higiene precária e ausência de apoio técnico
especializado (JORGE et al., 2000).
Existe também a hipótese das aves selvagens estarem envolvidas na epidemiologia do
AMPV. Estas aves são consideradas reservatórios do vírus, transmitindo-o para as criações
comerciais (SHIN, et al., 2000; COOK & CAVANAGH, 2002; BENNETT et al., 2004;
TURPIN et al., 2008; VELAYUDHAN, 2008). Lee et al. (2007) também afirmaram que o
subtipo C do AMPV, detectado em faisões comercializados no mercado de aves vivas na
Coréia, foi originado de aves selvagens que circulam na região.
Buscamos identificar neste trabalho se as condições climáticas influenciam na presença do
Metapneumovírus Aviário nos plantéis avícolas e criações de galinhas de fundo de quintal
na Bahia. A detecção da amostra circulante do AMPV no outono (março a junho) e
primavera (setembro a dezembro) sugere uma tendência sazonal para a presença do vírus na
região. Em um estudo realizado nos EUA, onde a maioria dos surtos do AMPV em criações
de perus foi observada na primavera (março a maio) e outono (outubro a dezembro), foi
sugerido que a migração das aves selvagens pode estar envolvida com a disseminação do
vírus (SHIN et al., 2001; SHIN et al., 2002; TURPIN et al., 2008). No entanto, mais
estudos devem ser realizados para avaliar se há uma relação direta com a temperatura e
pluviometria, bem como se outros fatores, como a presença de aves migratórias ou
comércio de aves vivas, são responsáveis pela presença do vírus no ambiente.
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60
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Neste trabalho foi determinada a freqüência sorológica e realizada a detecção molecular do
Metapneumovírus Aviário em criações não vacinadas de frangos de corte e de galinhas de
quintal no pólo avícola do Estado da Bahia. Pode-se afirmar que os frangos de corte e as
galinhas de quintal foram infectados pelo AMPV, demonstrando a circulação do vírus na
região estudada. Este é o primeiro relado da identificação do Metapneumovírus aviário na
Bahia e a primeira identificação em galinhas de quintal no Brasil. Essas aves devem ser
alvos de maiores estudos para avaliação do risco de transmissão do agente para as criações
comerciais, uma vez que podem ser consideradas portadoras assintomáticas do vírus.
Os diferentes tipos de criações e às condições climáticas da região foram relacionados à
presença do Metapneumovírus Aviário no ambiente e sua disseminação entre as criações
avícolas. No entanto mais estudos se fazem necessários para avaliar a influência destes na
epidemiologia do AMPV na Bahia.
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