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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
FACULDADE DE FARMÁCIA
Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas
FABRÍCIA SABA FERREIRA
ESTUDO
DA
MAGNÉTICAS
ENCAPSULAÇÃO
EM
VESÍCULAS
DE
LIPÍDICAS
NANOPARTÍCULAS
E
ASSOCIADAS OU NÃO A FÁRMACOS ESTERÓIDES
Goiânia - 2008
POLIMÉRICAS
Livros Grátis
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FABRÍCIA SABA FERREIRA
ESTUDO
DA
MAGNÉTICAS
ENCAPSULAÇÃO
EM
VESÍCULAS
DE
NANOPARTÍCULAS
LIPÍDICAS
E
POLIMÉRICAS
ASSOCIADAS OU NÃO A FÁRMACOS ESTERÓIDES
Dissertação de mestrado apresentada à
Faculdade de Farmácia da Universidade Federal
de Goiás como requisito parcial para a obtenção
do titulo de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Profa. Dra. Eliana Martins Lima
Goiânia-2008
A Deus pela vida!
Aos meus pais que sempre me apoiaram!
AGRADECIMENTOS
A meus pais Maria e Walterson pelo apoio e carinho ao longo de toda a minha formação pessoal e
acadêmica.
As minhas irmãs Andréa e Beatriz pela amizade e apoio, por caminharem ao meu lado desde o
princípio e por terem acompanhado cada momento do meu crescimento.
a
a
À Prf Dr Eliana Martins Lima, pelo incentivo e confiança no meu trabalho, por estar sempre disposta
a discutir os resultados e esclarecer as dúvidas, pela amizade e por ter me proporcionado a
oportunidade de ampliar meus conhecimentos.
A meus amigos e colegas do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica, Ana Lúcia, Danielle, Dione,
Erika, Fernanda Steger, Fernanda Bellato, Ieda, Lidiane, Lívia, Luciana, Marco Júnio, Mariana,
Patrícia, Rodinelli e Thaís pelo apoio e companheirismo em todos os momentos.
Ao Prf. Dr. Andris Figueiroa Bakuzis e sua equipe de alunos, em especial o Emílio pelo incentivo, pelo
auxílio na execução de algumas das análises que foram feitas ao longo do projeto, pelo tempo gasto,
pelos conhecimentos passados no decorrer de todo o trabalho.
Ao Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, pela oportunidade de minha formação
acadêmica.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq, pela concessão da bolsa
de estudos.
À banca examinadora pela atenção dedicada a este trabalho.
A todos que colaboraram de alguma forma para este trabalho.
SÚMARIO
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................................7
LISTA DE TABELAS ...............................................................................................................................9
LISTA DE QUADROS............................................................................................................................10
LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................................................11
RESUMO ................................................................................................................................................12
ABSTRACT ............................................................................................................................................13
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................................................14
2 REVISÃO DE LITERATURA ..............................................................................................................16
2.1 LIPOSSOMAS..................................................................................................................... 16
2.1.1 Conceitos ............................................................................................................................................ 16
2.1.2 Constituição dos lipossomas ............................................................................................................... 17
2.1.3 Classificação dos lipossomas ............................................................................................................... 19
2.1.4 Métodos de Preparação dos lipossomas ............................................................................................ 20
2.1.5 Magnetolipossomas ............................................................................................................................ 22
2.2 NANOCÁPSULAS POLIMÉRICAS.......................................................................................... 22
2.2.1 Conceitos básicos ................................................................................................................................ 22
2.2.2 Métodos de preparação das nanocápsulas ........................................................................................ 24
2.2.3 Nanopartículas poliméricas magnéticas ............................................................................................. 27
2. 3 NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS ...................................................................................... 28
2.3.1 Conceitos básicos: ............................................................................................................................... 28
2.3.2 Métodos de Síntese das nanopartículas magnéticas .......................................................................... 29
2.3.3 Estabilização das nanopartículas magnéticas ..................................................................................... 32
2.4 APLICAÇÕES BIOMÉDICAS ................................................................................................. 33
2.4.1 Vetorização de Fármacos .................................................................................................................... 33
2.4.2 Agente de contraste em Imagem de ressonância magnética (IRM) ................................................... 35
2.4.3 Hipertermia ......................................................................................................................................... 37
2.5 MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO DOS NANOSSISTEMAS MAGNÉTICOS ............................... 39
2.5.1 Birrefringência magnética ................................................................................................................... 39
2.5.2 Determinação do diâmetro por técnica de espalhamento de luz ...................................................... 40
2.5.3 Cromatografia de exclusão por tamanho ........................................................................................... 41
2.5.4 Ressonância paramagnética Eletrônica .............................................................................................. 43
2.6 FÁRMACOS MODELOS ....................................................................................................... 44
2.6.1 Dexametasona .................................................................................................................................... 44
2.6.2 Etinilestradiol ...................................................................................................................................... 45
3 OBJETIVOS ........................................................................................................................................47
3.1 OBJETIVO GERAL: .............................................................................................................. 47
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ................................................................................................... 47
4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................................................48
4.1 MATERIAIS........................................................................................................................ 48
4.1.1 Equipamentos: .................................................................................................................................... 48
4.1.2 Substâncias e Reagentes ..................................................................................................................... 48
4.1.3 Vidraria e Utensílios diversos .............................................................................................................. 49
4.1.4 Fármacos modelo................................................................................................................................ 50
4.1.5 Ferrofluido .......................................................................................................................................... 51
4.2 MÉTODOS ......................................................................................................................... 53
4.2.1 Preparação dos Nanossistemas .......................................................................................................... 53
4.2.2 Medida do diâmetro dos nanossistemas – Técnica de Espalhamento de Luz (Light Scattering) ....... 56
4.2.3 Determinação dos parâmetros analíticos da dexametasona e do etinilestradiol .............................. 57
4.2.4 Determinação da eficiência de encapsulação do fármaco ................................................................. 60
4.2.5 Ensaios para quantificação das nanopartículas magnéticas encapsuladas ........................................ 62
4.2.6 Estudo de Birrefringência Magnética.................................................................................................. 64
4.2.7 Ressonância Paramagnética Eletrônica .............................................................................................. 65
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..........................................................................................................67
5.1 PREPARAÇÃO DOS NANOSSISTEMAS ................................................................................. 67
5.2 DETERMINAÇÃO DO TAMANHO DOS NANOSSISTEMAS...................................................... 70
5.2.1 Lipossomas e magnetolipossomas ...................................................................................................... 70
5.2.2 Nanocápsulas ...................................................................................................................................... 74
5.3 PARÂMETROS ANALÍTICOS DA DEXAMETASONA E DO ETINILESTRADIOL ............................ 74
5.3.1 Dexametasona .................................................................................................................................... 74
5.3.2 Etinilestradiol ...................................................................................................................................... 76
5.4 DETERMINAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO DO FÁRMACO EM LIPOSSOMAS ......... 77
5.4.1 Separação do fármaco livre ................................................................................................................ 77
5.4.2 Cálculo da eficiência de encapsulação ................................................................................................ 79
5.5 RESSONÂNCIA PARAMAGNÉTICA ELETRÔNICA (RPE).......................................................... 81
5.6 QUANTIFICAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS ..................................................... 84
5.6.1 Quantificação de ferro ........................................................................................................................ 84
5.6.2 Determinação da quantidade de nanopartículas magnéticas encapsulada ....................................... 85
5.6.3 Estabilidade da preparação quanto à perda de nanopartículas magnéticas encapsuladas durante o
armazenamento ........................................................................................................................................... 90
5.7 BIRREFRINGÊNCIA MAGNÉTICA ......................................................................................... 95
6 CONCLUSÕES .................................................................................................................................102
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................................104
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DE UM LIPOSSOMA MULTILAMELAR. ..................................................................... 17
FIGURA 2: ESTRUTURA QUÍMICA E REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA FOSFATIDILCOLINA......................................................... 18
FIGURA 3: ESTRUTURA QUÍMICA DO COLESTEROL E REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DO COLESTEROL NA BICAMADA LIPÍDICA. .......... 18
FIGURA 4: CLASSIFICAÇÃO DOS LIPOSSOMAS. ................................................................................................................... 19
FIGURA 5: REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DE UMA HIDRATAÇÃO DE FILME LIPÍDICO ............................................................... 21
FIGURA 6: HIDRATAÇÃO DO FILME LIPÍDICO. ................................................................................................................... 21
FIGURA 7: FOTOMICROGRAFIAS REPRESENTATIVAS DA ESTRUTURA DE UMA NANOCÁPSULA POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE
VARREDURA (MEV) (A) E UMA NANOESFERA (B). ................................................................................................... 23
FIGURA 8: REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DE NANOCÁPSULAS E NANOESFERAS, A) FÁRMACO DISSOLVIDO NO NÚCLEO OLEOSO DA
NANOPARTÍCULA; B) FÁRMACO ADSORVIDO NA PAREDE POLIMÉRICA DA NANOCÁPSULA; C) FÁRMACO ADERIDO NA MATRIZ
POLIMÉRICA DA NANOESFERA; D) FÁRMACO ADSORVIDO OU DISPERSO NA MATRIZ POLIMÉRICA ........................................ 24
FIGURA 9: REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DE ALGUMAS METODOLOGIAS DE PREPARO DE NANOCÁPSULAS E NANOESFERAS............ 27
FIGURA 10: REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA COERCIVIDADE EM FUNÇÃO DO DIÂMETRO DAS PARTÍCULAS(D). ONDE DP É O
DIÂMETRO CRÍTICO DA PARTÍCULA MAGNÉTICA PARA HC=0. A PARTIR DE DS A PARTÍCULA É CONSIDERADA
MULTIDOMÍNIO.SENDO QUE SPM É SUPERPARAMAGNETISMO, SD É DOMÍNIO ÚNICO E MD É MULTIDOMÍNIO................... 29
FIGURA 11: REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA MOSTRANDO OS MECANISMOS DE REAÇÃO PARA A FORMAÇÃO DA MAGNETITA........... 31
FIGURA 12: REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DAS NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS COMO SISTEMAS DE LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS. ... 34
FIGURA13: REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA SEPARAÇÃO POR DIFERENÇA DE TAMANHO ....................................................... 42
FIGURA 14: ESTRUTURA QUÍMICA DO 5-DOXIL ÁCIDO ESTEÁRICO E ESPECTRO DE RPE, MOSTRANDO O (2T//). ............................ 44
FIGURA 15: ESTRUTURA QUÍMICA DA FOSFATIDILCOLINA DE SOJA. ....................................................................................... 49
FIGURA 16: ESTRUTURA QUÍMICA DA DEXAMETASONA. ..................................................................................................... 50
FIGURA 17: ESTRUTURA QUÍMICA DO ETINILESTRADIOL. .................................................................................................... 51
FIGURA 18: REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICO DA METODOLOGIA PARA PREPARO DE LIPOSSOMAS POR HIDRATAÇÃO DO FILME LIPÍDICO.
..................................................................................................................................................................... 53
FIGURA 19: PROCESSADOR ULTRASSÔNICO MISONIX XL2020 UTILIZADO PARA A OBTENÇÃO DE SUVS. ...................................... 54
FIGURA 20: ZETA SIZER NANO. ..................................................................................................................................... 57
FIGURA 21: ESPECTROFOTÔMETRO UV-VIS ACOPLADO COM LEITOR DE FIBRA ÓPTICA. ............................................................ 58
FIGURA 22: CROMATÓGRAFO LÍQUIDO DE ALTA EFICIÊNCIA................................................................................................ 59
FIGURA 23: REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO DE TAMANHO. .............................................. 61
FIGURA 24: REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DO EQUIPAMENTO UTILIZADO PARA A OBTENÇÃO DAS MEDIDAS DE BIRREFRINGÊNCIA
MAGNÉTICA ESTÁTICA. ....................................................................................................................................... 65
FIGURA 25: LIPOSSOMAS CONTENDO NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS DE MAGNETITA E MAGHEMITA. A) MAGNETITA; B) MAGHEMITA.
..................................................................................................................................................................... 67
FIGURA 26: FOTOMICROGRAFIA DE LIPOSSOMAS CONTENDO NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS REVESTIDAS COM ÁCIDO OLÉICO, SEM
SONICAÇÃO. ..................................................................................................................................................... 69
FIGURA 27: FOTOMICROGRAFIA DE LIPOSSOMAS MULTILAMELARES E DE VÁRIOS FORMATOS. .................................................... 69
FIGURA 28: A) NANOCÁPSULA COM NANOPARTÍCULA MAGNÉTICA; B) NANOCÁPSULA SEM NANOPARTÍCULA MAGNÉTICA............... 70
FIGURA 29: A- INTENSIDADE DE ESPALHAMENTO DE LUZ DAS AMOSTRAS DE LIPOSSOMAS; B- VOLUME OCUPADO PELAS VESÍCULAS EM
FUNÇÃO DO TAMANHO....................................................................................................................................... 71
FIGURA 30: INTENSIDADE DE ESPALHAMENTO DE LUZ DE AMOSTRAS DE LIPOSSOMAS ______COM DEXAMETASONA; ______ SEM
DEXAMETASONA. .............................................................................................................................................. 72
FIGURA 31: INTENSIDADE DE ESPALHAMENTO DE LUZ DE AMOSTRAS DE LIPOSOMAS ________COM ETINILESTRADIOL; ________
SEM ETINILESTRADIOL. ....................................................................................................................................... 72
FIGURA 32: INTENSIDADE DE ESPALHAMENTO DE LUZ DAS AMOSTRAS DE LIPOSSOMAS MAGNÉTICOS COM NANOPARTÍCULAS
MAGNÉTICAS REVESTIDAS COM CITRATO OU REVESTIDAS COM CARBOXILDEXTRANA, COM E SEM FÁRMACO. A) LIPOSSOMAS
MAGNÉTICOS CONTENDO NANOPARTÍCULAS REVESTIDAS COM CARBOXILDEXTRANA; B) LIPOSSOMAS MAGNÉTICOS CONTENDO
NANOPARTÍCULAS REVESTIDAS COM CARBOXILDEXTRANA E ETINILESTRADIOL C) LIPOSSOMAS MAGNÉTICOS CONTENDO
NANOPARTÍCULAS REVESTIDAS COM CITRATO; D) LIPOSSOMAS MAGNÉTICOS CONTENDO NANOPARTÍCULAS REVESTIDAS COM
CITRATO E ETINILESTRADIOL. QUANTIDADES DE FOSFATIDILCOLINA:............................................................................. 73
FIGURA 33: ESPALHAMENTO DE LUZ DE NANOCÁPSULAS BRANCAS E NANOCÁPSULAS CONTENDO NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS
REVESTIDAS COM ÁCIDO PALMÍTICO ________ NC SEM NANOPARTÍCULA; ________ NC COM NANOPARTÍCULA
ENCAPSULADA. ................................................................................................................................................. 74
FIGURA 34: VARREDURA DE SOLUÇÃO DE DEXAMETASONA EM ESPECTROFOTÔMETRO UV/VIS. ................................................ 75
FIGURA 35: CROMATOGRAMA DA DEXAMETASONA. CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS: FASE MÓVEL ACETONITRILA E ÁGUA (45:55);
FLUXO DE 1.2 ML/MIN, COLUNA C18 (250X4,6MM; CHROMSPHER®), COMPRIMENTO DE ONDA DE 240NM, DETECTOR UV75
FIGURA 36: CURVA DE CALIBRAÇÃO DA DEXAMETASONA, OBTIDA POR CLAE. CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS: FASE MÓVEL
®
ACETONITRILA E ÁGUA (45:55); FLUXO DE 1.2 ML/MIN, COLUNA C18 (250X4,6MM; CHROMSPHER ), COMPRIMENTO DE
ONDA DE 240NM, DETECTOR UV. ........................................................................................................................ 76
FIGURA 37: VARREDURA DE SOLUÇÃO DE ETINILESTRADIOL EM ESPECTROFOTÔMETRO UV/VIS. ................................................ 76
FIGURA 38: CROMATOGRAMA DE ETINILESTRADIOL. CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS: FASE MÓVEL ACETONITRILA E ÁGUA (50:50);
®
FLUXO DE 1 ML/MIN, COLUNA C18 (250X4,6MM; CHROMSPHER ), COMPRIMENTO DE ONDA DE 279NM, DETECTOR UV. ... 77
FIGURA 39: CURVA DE CALIBRAÇÃO DO ETNILESTRADIOL, OBTIDA POR CLAE. CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS: FASE MÓVEL
®
ACETONITRILA E ÁGUA (50:50); FLUXO DE 1 ML/MIN, COLUNA C18 (250X4,6MM; CHROMSPHER ), COMPRIMENTO DE ONDA
DE 279NM, DETECTOR UV. ................................................................................................................................ 77
FIGURA 40: PERFIL DE ELUIÇÃO DOS LIPOSSOMAS CONTENDO DEXAMETASONA. FRAÇÕES CONTENDO DEXAMETASONA ENCAPSULADA
(13-19 ........................................................................................................................................................... 78
FIGURA 41: PERFIL DE ELUIÇÃO DOS LIPOSSOMAS CONTENDO ETINILESTRADIOL. FRAÇÕES CONTENDO ETINILESTRADIOL ENCAPSULADO
(13-23).......................................................................................................................................................... 78
FIGURA 42: ESTRUTURA QUÍMICA DA DEXAMETASONA (A) E DO ETINILESTRADIOL (B). ............................................................ 81
FIGURA 43: A) ESTRUTURA QUÍMICA DA DEXAMETASONA; B) ESTRUTURA QUÍMICA DO COLESTEROL C) ESTRUTURA QUÍMICA DO
ETINILESTRADIOL. .............................................................................................................................................. 82
FIGURA 44: A) ESPECTROS DE RESSONÂNCIA PARAMAGNÉTICA ELETRÔNICA DE LIPOSSOMAS CONTENDO FOSFATIDILCOLINA (VERDE);
FOSFATIDILCOLINA:COLESTEROL (AZUL); FOSFATIDILCOLINA:DEXAMETASONA: COLESTEROL (VERMELHO),
FOSFATIDILCOLINA:DEXAMETASONA (PRETO) B) FOSFATIDILCOLINA (VERDE); FOSFATIDILCOLINA:COLESTEROL (AZUL);
FOSFATIDILCOLINA:ETINILESTRADIOL: COLESTEROL (LARANJA); FOSFATIDILCOLINA:ETINILESTRADIOL (ROXO); VARREDURA DE
CAMPO EM 100 GAUSS...................................................................................................................................... 83
FIGURA 45: VARREDURA DA SOLUÇÃO GERADA POR REAÇÃO COLORIMÉTRICA, REALIZADA EM ESPECTROFOTÔMETRO UV/VIS......... 84
FIGURA 46: SOLUÇÕES UTILIZADAS NA CURVA DE CALIBRAÇÃO. ........................................................................................... 85
FIGURA 47: CURVA DE CALIBRAÇÃO PARA A DETERMINAÇÃO DA QUANTIDADE DE FERRO NA AMOSTRA. REALIZADA EM
ESPECTROFOTÔMETRO UV/VIS............................................................................................................................ 85
FIGURA 48: A) ESTRUTURA QUÍMICA DO CITRATO; B) ESTRUTURA QUÍMICA DA DEXTRANA ...................................................... 89
FIGURA 49: REPRESENTAÇÃO DE UMA NANOPARTÍCULA MAGNÉTICA REVESTIDA COM CARBOXILDEXTRANA. ................................. 89
FIGURA 50: NÚMERO DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS EM FUNÇÃO DO TEMPO DE AMOSTRAS DE LIPOSSOMAS CONTENDO NPM
REVESTIDAS COM CARBOXILDEXTRANA A) LIPOSSOMAS SEM ETINILESTRADIOL; B) LIPOSSOMAS COM ETINILESTRADIOL. ........ 92
FIGURA 51: NÚMERO DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS EM FUNÇÃO DO TEMPO EM AMOSTRAS DE LIPOSSOMAS CONTENDO NPM
REVESTIDAS COM CITRATO. A) LIPOSSOMAS SEM ETINILESTRADIOL; B) LIPOSSOMAS COM ETINILESTRADIOL. ........................ 94
FIGURA 52: REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DE UM LIPOSSOMA CONTENDO NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS ALINHADAS DEVIDO À
APLICAÇÃO DE UM CAMPO MAGNÉTICO. ................................................................................................................ 95
FIGURA 53: GRÁFICO DE INTENSIDADE EM FUNÇÃO DO CAMPO MAGNÉTICO. ......................................................................... 96
FIGURA 54: BIRREFRINGÊNCIA MAGNÉTICA EM FUNÇÃO DO CAMPO MAGNÉTICO DE AMOSTRAS DE LIPOSSOMAS COM COLESTEROL
(DIÂMETRO MÉDIO 198 NM) E SEM COLESTEROL (DIÂMETRO MÉDIO 143 NM). ............................................................ 97
FIGURA 55: A) BIRREFRINGÊNCIA MAGNÉTICA EM FUNÇÃO DO CAMPO MAGNÉTICO DE AMOSTRAS DE LIPOSSOMAS COM 10MM E
20MM DE FOSFATIDILCOLINA. B) HISTOGRAMA DA INTENSIDADE DE ESPALHAMENTO DE LUZ EM FUNÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO DO
TAMANHO DE AMOSTRAS COM 10 E 20MM DE FOSFATIDILCOLINA. ............................................................................ 98
FIGURA 56: BIRREFRINGÊNCIA MAGNÉTICA EM FUNÇÃO DO CAMPO MAGNÉTICO DE AMOSTRAS DE LIPOSSOMAS CONTENDO
NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS EM DIFERENTES MOMENTOS DE ELUIÇÃO PELA COLUNA CROMATOGRÁFICA DE EXCLUSÃO POR
TAMANHO. F1 – DIÂMETRO MÉDIO 118 NM E F2 – DIÂMETRO MÉDIO 108 NM. .......................................................... 99
FIGURA 57: INTENSIDADE DE ESPALHAMENTO DE LUZ EM FUNÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO DO TAMANHO DE AMOSTRAS F1 E F2 . ____ F1
(DIÂMETRO MÉDIO 118NM); ____ F2 (DIÂMETRO MÉDIO 108NM). ....................................................................... 100
FIGURA 58: A) BIRREFRINGÊNCIA MAGNÉTICA EM FUNÇÃO DO CAMPO MAGNÉTICO DE AMOSTRAS DE LIPOSSOMAS CONTENDO
NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS EM FUNÇÃO DO TEMPO TRANSCORRIDO DO PREPARO DA AMOSTRA................................ 101
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO DA DEXAMETASONA EM LIPOSSOMAS CONTENDO 50MM DE FOSFATIDILCOLINA (E% EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO EM %- EC EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO COM RELAÇÃO A QUANTIDADE DE FOSFATIDILCOLINA –
RAZÃO MOLAR). ................................................................................................................................................ 80
TABELA 2: EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO DO ETINILESTRADIOL EM LIPOSSOMAS CONTENDO 50MM DE FOSFATIDILCOLINA (E% EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO EM %- EC EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO COM RELAÇÃO A QUANTIDADE DE FOSFATIDILCOLINA –
RAZÃO MOLAR). ................................................................................................................................................ 80
TABELA 3: EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO DE FERRO E DE QUANTIDADE DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS REVESTIDAS COM
CARBOXILDEXTRANA ENCAPSULADAS DENTRO DOS LIPOSSOMAS COM E SEM ETINILESTRADIOL (EE). A) LIPOSSOMAS SEM
ETINILESTRADIOL ; B) LIPOSSOMAS COM ETINILESTRADIOL. ........................................................................................ 87
TABELA 4: EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO DE FERRO E DE QUANTIDADE DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS REVESTIDAS COM CITRATO
ENCAPSULADAS DENTRO DOS LIPOSSOMAS COM E SEM ETINILESTRADIOL (EE). A) LIPOSSOMAS SEM ETINILESTRADIOL; B)
LIPOSSOMAS COM ETINILESTRADIOL. ..................................................................................................................... 88
TABELA 5: NÚMERO DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS REVESTIDAS COM CARBOXILDEXTRANA ENCAPSULADAS EM LIPOSSOMAS COM E
SEM ETINILESTRADIOL (EE), EM FUNÇÃO DO TEMPO DE ARMAZENAMENTO (A) SEM ETINILESTRADIOL; (B) COM
ETINILESTRADIOL. .............................................................................................................................................. 91
TABELA 6: NÚMERO DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS DENTRO REVESTIDAS COM CITRATO EM LIPOSSOMAS COM E SEM
ETINILESTRADIOL, EM FUNÇÃO DO TEMPO DE ARMAZENAMENTO (A) SEM ETINILESTRADIOL; (B) COM ETINILESTRADIOL. ....... 93
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1: NOMENCLATURA E TAMANHO APROXIMADO DE VÁRIOS LIPOSSOMAS [ADAPTADO DE VEMURI E RHODES, 1995]. ... 19
QUADRO 2: NOMES COMERCIAIS , NOMES GENÉRICOS E INDÚSTRIA FABRICANTE, DE PRODUTOS CONTENDO NANOPARTÍCULAS
MAGNÉTICAS UTILIZADAS COMO AGENTES DE CONTRASTE, DISPONÍVEIS NO MERCADO MUNDIAL ....................................... 36
LISTA DE ABREVIATURAS
5-DAS
Abs
AC
B
BMS
D
DEXencapsulada
DEX adicionada
E%
EC
EE
Fe2O3
Fe3O4
H
HFL
IRM
LUV
MLV
NPM
PC
PCL
PdI
PEG
pH
PLA
PLGA
RMN
RPE
SM
SPOF
SUV
TES
ULV
UV
Vis
5-doxil-ácido esteárico
Absorbância
Campo magnético alternado
Indução magnética
Birrefringência magnética estática
Coeficiente de difusão translacional
Dexametasona encapsulada
Dexametasona adicionada na preparação
Eficiência de encapsulação em %
Eficiência de encapsulação em relação à quantidade de fosfatidilcolina
Etinilestradiol
Maghemita
Magnetita
Campo magnético
Hidratação do Filme Lipídico
Imagem de Ressonância magnética
Vesículas unilamelares grandes (Large unilamellar vesicles)
Vesículas multilamelares (multilamellar vesicles)
Nanopartículas magnéticas
Fosfatidilcolina
Poli(ε-caprolactona)
Índice de Polidispersibilidade.
Polietilenoglicol
Potencial hidrogênionico
Poli-ácido-lático
Poli-ácido lático co-glicólico
Ressonância magnética nuclear
Ressonância paramagnética eletrônica
Solução mãe
Superparamagnético de óxido de ferro
Vesículas unilamelares pequenas (Small unilamellar vesicles)
Ácido N-tris(hidroximetil)metal-2-amino-etano sulfônico
Vesículas unilamelares(unilamellar vesicles)
Ultravioleta
Visível
RESUMO
Lipossomas são vesículas compostas de uma ou mais bicamadas de fosfolipídios
englobando um interior aquoso. As nanocápsulas são sistemas reservatórios que
possuem um núcleo oleoso envolto por uma camada polimérica. As nanopartículas
magnéticas têm sido investigadas nos últimos anos para uma série de aplicações
biomédicas bem como para a vetorização de fármacos. Neste trabalho foi estudada
a encapsulação de nanopartículas magnéticas (NPM) revestidas com
carboxildextrana, citrato, ácido oléico ou com ácido palmítico dentro de lipossomas
unilamelares pequenos e NPM revestidas com ácido palmítico dentro de
nanocápsulas. Lipossomas foram também utilizados para encapsular etinilestradiol
ou dexametasona, que foram utilizados como fármacos modelo. Lipossomas com e
sem fármaco contendo nanopartículas magnéticas foram preparados pelo método de
hidratação do filme lipídico sendo posteriormente caracterizados pelas técnicas de
espalhamento de luz, birrefringência magnética e ressonância paramagnética
eletrônica. As nanocápsulas foram preparadas pela técnica de deposição interfacial
do polímero pré-formado. A cromatografia de exclusão por tamanho foi utilizada para
separar o fármaco encapsulado do fármaco livre, a mesma técnica foi utilizada para
separar nanopartículas magnéticas encapsuladas das nanopartículas magnéticas
livres. A eficiência de encapsulação do fármaco foi determinada por cromatografia
líquida de alta eficiência. A eficiência de encapsulação de nanopartículas
magnéticas foi realizada por espectrofotometria no UV-Vis, após uma reação
colorimétrica. Preparações de magnetolipossomas estáveis foram alcançadas
quando foram utilizadas NPM revestidas com carboxildextrana ou com citrato. A
eficiência de encapsulação para a dexametasona foi muito baixa quando comparada
à eficiência de encapsulação do etinilestradiol, esta última chegando a 4 mg quando
foram utilizados 50mM de fosfatidilcolina. Foi possível determinar o número de
nanopartículas magnéticas dentro das vesículas com variadas quantidades de
fosfatidilcolina e fármaco. O estudo de birrefringência magnética permitiu prever o
número de NPM presentes no interior de um lipossoma. O trabalho realizado
mostrou que a encapsulação de nanopartículas magnéticas dentro de lipossomas
com ou sem fármaco é possível e viável, empregando uma técnica simples, abrindo
perspectivas para a utilização terapêutica desse sistema.
Palavras-chave: magnetolipossomas, nanocápsulas magnéticas.
ABSTRACT
Liposomes are vesicles in which one or more lipid bilayers enclose an interior
aqueous compartment. Nanocapsules are characterized by an oily core surrounded
by a polymeric wall. Magnetic nanoparticles have been investigated for biomedical
applications and drug delivery. In this work, the encapsulation of magnetic
nanoparticles (MNP) coated with carboxyldextran, citrate, oleic acid or palmitic acid
inside small unilamelar liposomes and MNP coated with palmitic acid inside
nanocapsules were investigated. Liposomes were used to encapsulate
ethinylestradiol and dexametasone, as model drugs. Liposomes with and without
drug and magnetic nanoparticles were obtained by the lipid film hydration method.
The characterization of the liposomes was performed by dynamic light scattering,
static magnetic birefringence and electron paramagnetic resonance. Nanocapsules
were prepared using an interfacial polymer deposition method. Non encapsulated
drug was separated by size exclusion chromatography; the same method was used
to separate non encapsulated MNP. High performance liquid chromatography was
used for the analysis of drug content. Encapsulation efficiency for MNP was
determined by UV/Vis spectrophotometry after a colorimetric reaction. Stable
magnetoliposomes were obtained using MNP coated with carboxyldextran and
citrate. Encapsulation of dexamethasone was too low compared with ethinylestradiol,
which resulted in an average of about 4 mg of encapsulated drug when 50mM of
phosphatidylcholine was used. The number of magnetic nanoparticles was
determined inside vesicles with different concentrations of phosphatidylcholine and
drug by static magnetic birefringence. Encapsulation of magnetic nanoparticles into
liposomes and polymeric nanocapsules was proven efficient, with a relative stability
of the magnetic nanocarrier, which may lead to potential therapeutical uses of these
formulations.
Keywords: magnetoliposomes; magnetic nanocapsules.
14
1 INTRODUÇÃO
A tecnologia no controle da liberação de fármacos representa uma fronteira
na ciência, que envolve a aproximação de múltiplos conhecimentos, contribuindo
para o desenvolvimento de produtos voltados à saúde humana. Estes sistemas de
liberação oferecem inúmeras vantagens quando comparados com os sistemas
convencionais de liberação de fármacos, incluindo melhora na eficácia, redução da
toxicidade e melhora da adesão do paciente ao tratamento [KUMAR, 2000]. Dentre
as tecnologias utilizadas para o controle da liberação de fármaco está o emprego da
nanotecnologia englobando os sistemas nanocarreadores, como os lipossomas e as
nanocápsulas.
Nanotecnologia envolve o estudo, caracterização, produção e aplicação de
estruturas, artifícios e sistemas controlando sua forma e tamanho em escala
nanométrica. Os modelos de nanoescala são de 100-10.000 vezes menores que as
células humanas e são de tamanho similar a muitas moléculas biológicas como
enzimas e receptores. Os nanocomponentes podem ter em comum, muitas
propriedades das estruturas de escalas nanométrica naturais sendo possível
desenvolver nanoestruturas artificiais que mimetizam as nanoestruturas naturais e
com propriedades terapêuticas [STYLIOS et al, 2005]. A nanomedicina é uma
ramificação da aplicação da nanotecnologia em desafios médicos e farmacêuticos, e
tem sido desenvolvida com foco principal em sistemas de liberação de fármacos
[SCHATZLEIN, 2006].
Lipossomas são vesículas esféricas, constituídas de uma ou várias
bicamadas concêntricas de lipídeos, que isolam um ou vários compartimentos
aquosos interno do meio externo [FRÉZARD et al, 2005].
Nanocápsulas são constituídas por um invólucro polimérico disposto ao redor
de um núcleo oleoso, podendo o fármaco estar dissolvido nesse núcleo ou adsorvido
na parede polimérica [SCAFFAZICK et al, 2003].
Nas últimas duas décadas, o uso de micro e nanopartículas magnéticas em
aplicações biomédicas têm recebido maior interesse dos pesquisadores. Alguns
trabalhos experimentais têm como foco principal o desenvolvimento de fluidos ou
partículas magnéticas para serem usadas no tratamento de tumores por hipertermia,
no controle e transporte direcionado de fármacos e material genético [PANKHURST
et al, 2003].
15
Neste trabalho foi estudada a encapsulação de nanopartículas magnéticas,
usando dexametasona e etinilestradiol como fármacos modelo, tanto em vesículas
lipídicas (lipossomas) quanto em vesículas poliméricas (nanocápsulas).
16
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 LIPOSSOMAS
2.1.1 Conceitos
Os lipossomas foram apresentados primeiramente por Alec Bangham e
colaboradores em meados da década de 1960, no entanto a utilização dessas
vesículas como carreadores de fármacos foi proposta e demonstrada no início dos
anos 70 [GREGORIADIS, 1995; LASIC, 1998].
Lipossomas são vesículas esféricas de tamanho variando de alguns
nanômetros a centenas de micrômetros, constituídas de uma ou mais bicamadas
lipídicas que encapsulam um meio aquoso em seu interior [GULATI et al, 1998].
Durante as décadas de 1970 e 1980 estudaram-se as vesículas multilamelares
grandes cujo diâmetro encontra-se na faixa micrométrica enquanto que nas
investigações posteriores as vesículas preparadas passaram a apresentar diâmetro
entre 50-150nm [LASIC, 1998].
As bicamadas lipídicas que compõem os lipossomas assemelham-se à
membrana biológica [VEMURI e RHODES, 1995]. São compostas de materiais
biodegradáveis, biocompatíveis, não tóxicos e não imunogênicos podendo ser
empregados na sua preparação lipídios naturais ou sintéticos [GREGORIADIS,
1995; SHARMA, A. e SHARMA, S., 1997]. Devido a essas propriedades, as
vesículas lipídicas são fortes candidatas a serem usadas como vesículas
carreadoras de fármacos [GREGORIADIS, 1995].
Devido ao fato dos lipossomas possuírem uma característica bifásica, eles
podem agir como carreadores de fármacos hidrofílicos ou lipofílicos. Dependendo da
solubilidade e das características de partição do fármaco, as moléculas ficarão
localizadas em diferentes regiões nos lipossomas, podendo estar na bicamada
lipídica, no compartimento aquoso ou na interface [GULATI et al, 1998; SHARMA, A.
e SHARMA, S., 1997]. A encapsulação de fármacos lipofílicos tem mostrado ser
vantajosa em termos de custo, estabilidade e utilidade. Um grande número de
moléculas com variada solubilidade têm sido estruturalmente alteradas para
tornarem-se mais lipofílicas e proporcionarem uma preparação lipossomas ótima
[GULATI et al, 1998].
17
Figura 1: Representação esquemática de um
www.biopharmasci.com. Acesso em 11. nov. 2007.
lipossoma
multilamelar.
Adaptado
de:
A espessura da membrana dos lipossomas é em torno de 4nm, e nela podem
estar contidos polímeros e/ou ligantes com funções definidas, como moléculas de
reconhecimento específico [LASIC, 1998].
Apesar de sua composição lipídica ser semelhante à membrana das células,
os lipossomas são tidos como estranhos pelas células do sistema mononuclear
fagocitário, resultando assim em sua rápida remoção da circulação sanguínea
[ALLEN e CHONN, 1987]. Para contornar essa situação, uma maneira de se
aumentar a meia vida do lipossoma na circulação é através da modificação da
membrana dos lipossomas acrescentando polímeros hidrofílicos como o polietileno
glicol (PEG), fazendo com que eles fiquem “invisíveis” ao sistema imunológico
passando a ser desta forma lipossomas de longa circulação [CHONN e CULLIS,
1995; GREGORIADIS, 1995].
2.1.2 Constituição dos lipossomas
2.1.2.1 Fosfolipídios
Podem ser empregados na preparação dos lipossomas lipídios sintéticos e/ou
lipídios naturais, como a fosfatidilcolina (Figura 2) [SHARMA, A. e SHARMA, S.,
1997].
Diferenças
na
porção
hidrofóbica
da
molécula
podem
mudar
as
características dos fosfolipídios. Eles podem diferir no número de átomos de
carbono na cadeia ou no grau de insaturações [VEMURI e RHODES, 1995]. As
propriedades físico-químicas dos lipídios (carga, densidade e permeabilidade) que
18
compõem o lipossoma vão determinar a interação desses com componentes do
sangue e outros tecidos após administração sistêmica [SHARMA, A. e SHARMA, S.,
1997].
Figura 2: Estrutura química e representação esquemática da fosfatidilcolina. Disponível em
www.livonlabs.com. Acesso dia 11. nov. 2007.
2.1.2.2 Colesterol
O colesterol é um esteróide encontrado na membrana celular dos animais.
Tem sido utilizado na preparação dos lipossomas para reduzir a fluidez da bicamada
lipídica, reduzir a permeabilidade de moléculas solúveis em água e aumentar a
estabilidade da bicamada na presença de fluidos biológicos como plasma e sangue,
devido ao aumento no empacotamento das moléculas de fosfolipídios (Figura 3).
Lipossomas sem colesterol tendem a interagir rapidamente com proteínas do
sangue [CÓCERA et al, 2003; KIRBY et al, 1980; VEMURI e RHODES, 1995].
Figura 3: Estrutura química do colesterol e representação esquemática do colesterol na bicamada
lipídica. Disponível em: www.uic.edu. Acesso em 11.nov.2007.
19
2.1.3 Classificação dos lipossomas
Lipossomas podem ser classificados de acordo com o número de bicamadas
presentes em sua estrutura ou pelo seu tamanho. Quando são descritos pelo o
número de bicamadas recebem as seguintes nomeclaturas: Vesículas Unilamelares
(ULV) ou Vesículas Multilamelares (MLV), quando baseados no seu tamanho são
denominados Vesículas Unilamelares Grandes (LUV) ou Vesículas Unilamelares
Pequenas (SUV) (Figura 4). Podem também serem classificados de acordo com o
método de preparação, o que não é muito utilizado. A descrição de lipossomas por
lamelaridade e tamanho é mais comum que pelo método de preparação. [VEMURI e
RHODES, 1995].
Quadro 1: Nomenclatura e tamanho aproximado de vários lipossomas [adaptado de VEMURI e
RHODES, 1995].
Classificação
Por tamanho
Números de lamelas
Lipossoma
Tamanho aproximado (nm)
SUV
25 - 50
LUV
100
MLV
50 – 10.000
ULV
25 - 100
Figura 4: Classificação dos lipossomas. Disponível em: www.azonano.com. Acesso em: 11.nov.2007.
20
A faixa de tamanho e o número de lamelas influenciam na eficiência de
encapsulação (aumenta com o aumento do tamanho); na estabilidade (diminui com
o aumento do tamanho) e na tendência para extravasar o material encapsulado
(diminui com o aumento do tamanho) [LASIC, 1998; SHARMA, A. e SHARMA, S.,
1997].
2.1.4 Métodos de Preparação dos lipossomas
Dentre os métodos de preparação cita-se: injeção de solvente, hidratação do
filme lipídico, injeção de clorofórmio entre outros, para a obtenção de lipossomas
com diferentes tamanhos e características.
2.1.4.1 Hidratação do Filme Lipídico
O método de hidratação do filme lipídico é o método mais simples e
amplamente usado na preparação de lipossomas multilamelares. Um filme lipídico é
hidratado com tampão aquoso em temperatura acima da temperatura de transição
do lipídio. O fármaco pode ser incorporado no momento da hidratação do filme,
juntamente com o tampão aquoso ou durante o preparo do filme, para fármacos
lipofílicos. [GREGORIADIS e SÊNIOR, 1980; KIRBY, 1980; SHARMA, A. e
SHARMA, S., 1997] (Figuras 5 e 6).
O método de hidratação do filme lipídico produz populações heterogêneas de
vesículas multilamelares que após serem sonicadas ou passarem pelo processo de
extrusão originam vesículas unilamelares pequenas [SHARMA, A. e SHARMA, S.,
1997; VEMURI E RHODES, 1995].
21
Figura 5: Representação esquemática de uma hidratação de filme lipídico (ALVES, 2005).
Figura 6: Hidratação do Filme Lipídico. Disponível em: www.unesp.br. Acesso em: 15.nov.2007.
22
2.1.5 Magnetolipossomas
Na década de 80, lipossomas contendo nanopartículas magnéticas foram
propostos [DE CUYPER, 1988; KIWADA et al, 1986] e denominados de
Magnetolipossomas por De Cuyper (1988). Devido à sua biocompatibilidade, esses
sistemas
são
apropriados
para
serem
usados
em
diversas
aplicações
biotecnológicas e médicas [LACAVA et al, 2004].
No Brasil, a rede de Nanobiomagnetismo foi estruturada a partir do fomento
concedido pelo Ministério da Ciência e Tecnologia MCT/CNPq, sendo formada por
pesquisadores de diversas áreas e universidades, com foco no desenvolvimento de
plataformas que compartilhem a pesquisa original relacionada com aplicações da
nanotecnologia nos campos biomédicos, incluídas as pesquisas com nanopartículas
magnéticas e lipossomas. Outros grupos de pesquisas não integrantes da rede
também estão estudado nanopartículas magnéticas encapsuladas dentro de
lipossomas.
2.2 NANOCÁPSULAS POLIMÉRICAS
2.2.1 Conceitos básicos
As nanopartículas foram primeiramente desenvolvidas por volta de 1970,
tendo sido inicialmente utilizadas como dispositivos carreadores de fármacos antineoplásicos e vacinas [KUMAR, 2000]. Nas últimas décadas, tem aumentado
consideravelmente
o
interesse
no
desenvolvimento
de
nanopartículas
biodegradáveis como sistemas de liberação de fármacos [SOPPIMATH et al, 2001].
O termo nanopartícula é usado para definir dispersões particuladas ou
partículas sólidas com tamanho variando de 10-1000nm. Dependendo do método de
preparação, nanocápsulas ou nanoesferas podem ser obtidas. O fármaco pode ficar
dissolvido, encapsulado ou preso na matriz polimérica [ANDREO-FILHO et al, 1999;
MOHANRAJ e CHEN, 2006; MOINARD-CHÉCOT et al, 2008; REIS et al, 2006]
(Figura7).
23
Figura 7: Fotomicrografias representativas da estrutura de uma nanocápsula por microscopia
eletrônica
de
varredura
(MEV)
(A)
e
uma
nanoesfera
(B).
Disponível
em:
e
http://ase.tufts.edu/chemistry/walt/research/projects/Add_apps.htm
http://www.aapspharmscitech.org/view.asp?art=pt0802047. Acesso em 04/02/2008.
As nanocápsulas são constituídas de um núcleo oleoso circundado por uma
membrana polimérica e a substância ativa fica solubilizada no núcleo oleoso
[MOHANRAJ e CHEN, 2006; MOINARD-CHÉCOT et al, 2008]. A nanoesfera é um
sistema matricial, no qual o fármaco é fisicamente ou uniformemente disperso
[ANDREO-FILHO et al, 1999] (Figuras 7 e 8).
A matriz polimérica das nanopartículas deve reunir uma série de requisitos
como: biocompatibilidade, biodegradabilidade e resistência mecânica [MU E FENG,
2003]. Polímeros biodegradáveis são amplamente utilizados na fabricação de
nanopartículas, como: poli ácido (D,L latico) – PLA [CAUCHETIER et al, 2003];
polibutilcianoacrilato; poli(ε-caprolactona) – PCL; poli ácido(lático-co-glicolico) –
PLGA [MAGALHÃES et al, 2000; MU e FENG, 2003]. Uma ampla variedade de
biopolímeros também tem sido estudada para aplicação em sistemas de liberação
de fármacos, tais como albumina bovina, albumina humana, gelatina e colágeno [MU
e FENG, 2003].
Os polímeros e copolímeros do poli-ácido lático são os de maior interesse
para
aplicação
como
carreadores
de
fármacos
devido
à
sua
completa
biodegradabilidade gerando metabólitos não tóxicos e bem tolerados pelos tecidos
[GUTERRES et al, 1995].
24
Figura 8: Representação esquemática de nanocápsulas e nanoesferas, a) fármaco dissolvido no
núcleo oleoso da nanopartícula; b) fármaco adsorvido na parede polimérica da nanocápsula; c)
fármaco aderido na matriz polimérica da nanoesfera; d) fármaco adsorvido ou disperso na matriz
polimérica [SCHAFFAZICK et al, 2003].
Os maiores desafios no design das nanopartículas como sistemas de
liberação para alcançar o sítio de ação específico são: o controle do tamanho,
propriedades de superfície e controle da liberação do agente farmacologicamente
ativo [MOHANRAJ e CHEN, 2006]. As características da superfície da nanopartícula
são um obstáculo na vetorização de fármacos. De fato, logo que alcançam a
circulação
sanguínea,
as
nanopartículas
convencionais
e
as
carregadas
negativamente podem ser rapidamente opsonizadas e removidos pelos macrófagos
[KUMAR et al, 2001]. A modificação da superfície dos sistemas nanoparticulados
com polímeros hidrofílicos, tais como PEG (polietileno glicol), é um caminho eficiente
para controlar o processo de opsonização [REIS et al, 2006; SOPPIMATH et al,
2001].
As nanopartículas são utilizadas com êxito nas rotas de administração
sistêmica, oral, pulmonar, transdérmica entre outras, com vários propósitos como
vetorização de fármacos, aumento da biodisponibilidade do fármaco, proteção de
moléculas bioativas e estabilidade [MU e FENG, 2003].
2.2.2 Métodos de preparação das nanocápsulas.
As nanopartículas podem ser preparadas utilizando-se uma variedade de
materiais como proteínas, polissacarídeos e polímeros sintéticos. A seleção do
material matricial é dependente de muitos fatores dentre eles o tamanho da partícula
desejado; propriedades inerentes ao fármaco (solubilidade e estabilidade);
características
de
superfície
como
carga
e
permeabilidade;
grau
de
biodegradabilidade, biocompatibilidade e toxicidade; perfil de liberação desejado e
antigenicidade do produto final [KREUTER, 2004; MOHANRAJ e CHEN, 2006].
25
Muitos métodos têm sido desenvolvidos para preparar nanopartículas. Esses
métodos podem ser classificados em duas grandes categorias, reações de
polimerização e precipitação do polímero pré-formado (Figura 9).
2.2.2.1 Deposição interfacial do polímero pré-formado e deslocamento do solvente
Os métodos de deposição interfacial e deslocamento do solvente são
métodos similares, baseados na emulsificação espontânea de uma fase interna
orgânica dentro de uma fase externa aquosa. Entretanto o método de deslocamento
do solvente forma nanoesferas e nanocápsulas enquanto que a deposição interfacial
forma apenas nanocápsulas [REIS et al, 2006]. O método de deposição interfacial
do polímero pré-formado foi originalmente proposto por Fessi et al (1989).
O método de deslocamento do solvente orgânico envolve a precipitação de
um polímero pré-formado presente na solução orgânica e a difusão do solvente
orgânico no meio aquoso na ausência ou presença de um tensoativo sendo opcional
o uso de óleo. A cavidade central oleosa das nanocápsulas permite uma alta
eficiência de encapsulação [BARICHELLO et al, 1999; GALINDO-RODRIGUEZ et al,
2004].
A deposição interfacial é uma técnica utilizada para a obtenção de
nanocápsulas. Neste processo, ocorre a deposição do polímero sob a gotícula de
óleo. O meio aquoso é utilizado como dispersante [FESSI et al, 1989].
2.2.2.2 Método de evaporação do solvente ou emulsificação
O método de evaporação do solvente envolve dois passos. O primeiro passo
requer a emulsificação da solução polimérica dentro de uma fase aquosa. No
segundo passo ocorre a evaporação do solvente, induzindo a precipitação do
polímero formando nanoesferas [REIS et al, 2006]. O tamanho das nanoesferas
pode ser controlado através da velocidade de agitação, temperatura; pelo tipo e
quantidade do agente dispersante e viscosidade tanto da fase orgânica quanto da
fase aquosa [TICE et al, 1985].
Entretanto, esse método pode ser apenas aplicado para fármacos
lipossolúveis e as limitações estão no escalonamento, pois o método exige uma alta
energia na homogeneização [SOPPIMATH et al, 2001].
26
2.2.2.3 Processo de emulsão-difusão
Este processo é baseado em dois passos, sendo o primeiro uma
emulsificação convencional seguido da remoção de parte da fase oleosa como
segundo passo. Primeiramente uma emulsão água em óleo é fabricada, com uma
fase oleosa contendo polímero, óleo e solvente orgânico. Uma pequena quantidade
de fase aquosa é colocada nessa etapa, para que ocorra a formação da emulsão.
A eliminação do solvente orgânico contido na fase oleosa causa a separação do
polímero e do óleo com conseqüente redução do tamanho da partícula. Sendo
assim, o solvente orgânico pode ser removido através da difusão dentro de uma fase
aquosa causada por adição de um solvente aquoso, podendo desta forma ser
eliminado facilmente por evaporação à pressão reduzida [MOINARD-CHÉCOT et al,
2008].
2.2.2.4 Polimerização de monômeros
Neste método os monômeros são polimerizados formando nanopartículas em
uma solução aquosa. O fármaco pode ser incorporado no momento da
polimerização ou depois que ela for concluída. Durante a polarização são utilizados
alguns estabilizadores e tensoativos [REIS et al, 2006].
A polimerização de monômeros para fabricação de nanocápsulas pode ser
realizada através de emulsão, polimerização interfacial e policondensação interfacial
[REIS et al, 2006].
27
Figura 9: Representação esquemática de algumas metodologias de preparo de nanocápsulas e
nanoesferas [Schaffazick et al, 2003].
2.2.3 Nanopartículas poliméricas magnéticas
A tecnologia de carreadores magnéticos tem sido empregada em aplicações
in vitro tais como separação de células, imobilização enzimática e imunoensaios
[BÍLKOVÁ et al, 2002; LIU et al, 2005; ŠAFAŘÍK et al, 1999; SUZUKI et al, 1995]. O
interesse em se utilizar carreadores magnéticos biocompatíveis e biodegradáveis
consiste na realização de ensaios mais avançados in vivo, incluindo aplicações em
humanos [CHENG et al, 2006; HAFELI, 2004]. Carreadores específicos para
aplicações in vivo utilizam nanofases poliméricas que são incorporadas em várias
formas e polímeros biodegradáveis e não tóxicos. Para a vetorização de fármacos,
esses carreadores possuem a característica de serem guiados por um campo
magnético externo [LIU et al, 2007].
Uma série de trabalhos tem relatado a fabricação de partículas poliméricas
magnéticas [ASTETE et al, 2007; HU et al, 2006; LE et al, 2004; LIU et al, 2007 ].
Widder et al (1979) relataram o preparo de microesferas encapsulando
doxorrubicina. Muller et al (1996) demonstraram o preparo de partículas de PLA e
PLGA contendo magnetita. Liu et al (2007) prepararam nanoesferas pelo método de
emulsão óleo em água e evaporação do solvente, utilizando os polímeros de PLA e
PLGA e um óxido de ferro revestido com ácido oléico, obtendo nanopartículas de
28
diâmetro médio de 360-370nm. Astete et al (2007) utilizaram essa mesma
metodologia para preparar as nanopartículas poliméricas magnéticas.
2. 3 NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS
2.3.1 Conceitos básicos:
Nas duas últimas décadas, o uso de micro e nanopartículas em aplicações
biomédicas têm sido bastante investigado. As micro e nanopartículas magnéticas
foram primeiramente usadas como agentes de contraste em imagem de ressonância
magnética, na separação magnética de células e em imunoensaios, feitos nos
laboratórios de patologia. Entretanto, alguns trabalhos experimentais têm como foco
principal o desenvolvimento de partículas magnéticas/ fluido, para serem usadas no
tratamento de tumores por hipertermia, no controle e transporte direcionado de
fármacos e genes [DOBSON, 2006; PANKHURST et al, 2003].
Diversas investigações dos vários tipos de óxidos de ferro têm sido realizadas
no campo das nanopartículas magnéticas de tamanho nanométrico. Dentre as
nanopartículas magnéticas mais estudadas cita-se a maghemita, γ-Fe2O3 e a
magnetita, Fe3O4, de diâmetro variando de 5 a 20nm. Dentre elas, a magnetita é
uma candidata muito promissora devido a sua já comprovada biocompatibilidade
[GUPTA et al, 2005; SCHWERTMANN e CORNELL, 1991].
Óxidos férrico ou ferroso são os principais constituintes das partículas
magnéticas. Metais como cobalto e níquel são usados em outros campos de
aplicação, pois são tóxicos e susceptíveis a oxidação. Conseqüentemente cobalto e
niquel são de pouco interesse para aplicações biomédicas [WORMUTH, K. 2001;
BERRY, 2005]. Importantes propriedades das partículas magnéticas para aplicação
médica são: não toxicidade; biocompatibilidade; injetabilidade e alto nível de
acumulação nos tecidos alvos ou órgãos [ITO et al, 2005]. As partículas devem ser
pequenas o bastante para permanecerem na circulação após a injeção e para
passarem sem interrupção pelos capilares de tecidos e órgãos evitando assim um
embolismo [JORDAN et al, 2001; TARTAJ et al, 2003].
Com superfície de revestimento apropriada, essas nanopartículas magnéticas
podem se dispersar em um solvente adequado formando uma suspensão
homogênea, chamada de ferrofluido [BABINCÓVA et al, 2001; GUPTA et al, 2005;
29
WANG, 2001]. Tais suspensões podem interagir com um campo magnético externo
e serem posicionadas para uma área específica, facilitando imagens de ressonância
magnética para diagnóstico do câncer e auxiliando na terapia do câncer
[BONNEMAIN, 1998].
Partículas de óxido de ferro são classificadas por sua resposta magnética a
um campo magnético externo. A descrição de orientações de momentos magnéticos
na partícula ajuda a identificar os tipos de magnetismo observados na natureza. As
propriedades magnéticas dessas partículas podem ser representadas pela
dependência da indução magnética B e pelo campo magnético H [GUPTA, 2005].
Sendo B=µ0(M+H). Onde µ0 é a permeabilidade magnética, M a magnetização, B a
indução magnética e H o campo magnético.
A teoria superparamagnética foi introduzida por Bean e Livingston (1959). O
superparamagnetismo ocorre em nanopartículas magnéticas que possuem o
diâmetro menor que o diâmetro crítico, essas nanopartículas magnéticas são de
domínio único e apresentam coercividade (Hc) igual a zero. Partículas magnéticas
de óxido de ferro de tamanho nanométrico que possuem as propriedades acima são
consideradas superparamagnéticas.
Figura 10: Representação esquemática da coercividade em função do diâmetro das partículas(D).
Onde Dp é o diâmetro crítico da partícula magnética para Hc=0. A partir de Ds a partícula é
considerada multidomínio.Sendo que SPM é superparamagnetismo, SD é domínio único e MD é
multidomínio. Adaptado de www.irm.umn.edu/hg2m/hg2m_d/hg2m_d.html. Acesso em 12.03.2008.
2.3.2 Métodos de Síntese das nanopartículas magnéticas
A síntese de nanopartículas magnéticas com tamanho, forma, distribuição do
tamanho, superfície química da partícula e conseqüentes propriedades magnéticas
desejadas tem sido um desafio científico e tecnológico [BATTLE e LABARTA, 2002;
MORALES et al, 1999; TARTAJ et al, 2003]. Os métodos físicos como deposição de
30
gás e litografia por feixes de elétrons são procedimentos elaborados que não são
capazes de controlar o tamanho das partículas na faixa nanométrica [GUPTA, 2005;
LEE et al, 2001].
Os métodos químicos são mais simples, manejáveis e mais eficientes com
apreciável controle do tamanho, composição e forma das nanopartículas. Alguns
métodos de síntese são: precipitação de solução, microemulsão, co-precipitação e
decomposição de precursores orgânicos em altas temperaturas [TARTAJ et al,
2003].
Uma dificuldade relatada dos ferrofluidos é que as NPM (nanopartículas
magnéticas) possuem uma alta razão de área de superfície por volume, tendendo a
aglomerar para reduzir sua energia de superfície (>100 dyn/cm). O problema
principal na produção de fluido magnético é prevenir a aglomeração durante a
síntese e do processo de revestimento [KIM et al, 2001].
2.3.2.1 Método de co-precipitação
Óxidos de ferro (Fe3O4 ou γ-Fe2O3) podem ser sintetizados através de coprecipitação de solução aquosa do sal Fe+2 e Fe+3 por adição de uma base
[GUEDES et al, 2005; KHALAFALLA et al, 1980; KONERACKÁ et al, 2005; LIU et al,
2007; ZÁVIŠOVÁ et al, 2007] (Figura 11). O controle do tamanho, da forma e a
composição da nanopartícula magnética dependem do tipo de sal usado (ex.
cloretos, sulfatos, nitratos, perclorados, etc.), razão Fe+2 e Fe+3, pH e força iônica do
meio [GUPTA et al, 2005; SJOGREN et al, 1994]. Sendo este o método mais fácil e
mais popular [lIDA, 2007].
A preparação dessas nanopartículas, pelo método de co-precipitação é
convencionalmente efetuada através da adição de uma base a uma mistura aquosa
de cloreto de Fe2+ e Fe3+, gerando um precipitado de magnetita de coloração preta
[DENG et al, 2003; KHALAFALLA et al, 1980; KIM et al, 2001]. Essa mistura
representa uma razão inicial molar de Fe3+ para Fe2+ de 3:2, no entanto a razão ideal
é de 2:1 [KHALAFALLA et al, 1980]. Com o intuito de prevenir uma possível
oxidação pelo ar e também aglomeração, as nanopartículas de Fe3O4 produzidas
são revestidas com moléculas orgânicas e inorgânicas. O processo de oxidação da
nanopartícula magnética pode ser evitado realizando a preparação em um ambiente
livre de oxigênio através da ambientação com gás nitrogênio. Um ambiente livre de
31
oxigênio não apenas protege a partícula da oxidação como também reduz o
tamanho da partícula quando comparado com o ambiente que tem oxigênio [GUPTA
et al, 2004; KIM et al, 2001].
Iida et al (2007) propuseram a síntese de nanopartículas de Fe3O4 pela
hidrólise de uma solução aquosa contendo sais de ferro e uma base em temperatura
e atmosfera ambiente. Foram utilizados na preparação sulfato ferroso, sulfato férrico,
cloreto ferroso e cloreto férrico como sais de ferro e 1,6-hexanodiamina como a
base, variando-se o tipo de sal utilizado e a razão molar dos íons férricos e ferrosos.
Observou-se que o mecanismo de formação das nanopartículas de Fe3O4 quando
foram utilizados sais férrico e ferroso na razão de 2:1, foi reação de co-precipitação.
Em contrapartida, quando íons ferrosos estavam sozinhos na preparação, o
mecanismo de formação das nanopartículas foi a reação de desidratação de
hidróxido ferroso e de oxi-hidróxido férrico, sendo que o composto final foi produzido
por uma oxidação parcial de hidróxido ferroso por oxigênio.
Figura 11: Representação esquemática mostrando os mecanismos de reação para a formação da
magnetita. [GUPTA et al, 2005]. Com algumas adaptações.
2.3.2.2 Decomposição de precursores orgânicos em altas temperaturas
A decomposição de precursores de ferro na presença de tensoativo orgânico
aquecido tem gerado amostras com o rendimento notadamente aumentado, com um
bom controle de tamanho, distribuição de tamanho estreita e boa cristalinidade
[TARTAJ et al, 2003]
32
Lattuada e Hatton (2007) propuseram uma estratégia para a preparação de
nanopartículas magnéticas monodispersas com superfícies funcionalizadas por uma
variedade de estabilizadores e polímeros. Inicialmente, nanocristais magnéticos
estabilizados por ácido oléico foram preparados através da rota de síntese orgânica.
Os grupos de ácido oléico, inicialmente presentes na superfície da nanopartícula
magnética, foram substituídos através da reação de troca do ligante. Este
procedimento
foi
conduzido
em
altas
temperaturas,
utilizando
ferro
tri(acetilacetonato), 1,2-tetradecanodiol, acido oléico, oleilamina e éter benzilico.
2.3.3 Estabilização das nanopartículas magnéticas
Na preparação e armazenamento de nanopartículas magnéticas na forma
coloidal, a estabilidade do colóide é de grande importância. Ferrofluido é o termo
dado a suspensões coloidais de partículas magnéticas, que possui uma ampla
variedade de aplicações. Esta suspensão coloidal é formada por um fluido
magnetizado que permanece líquido mesmo sob um campo magnético mais intenso.
Na ausência de algum revestimento na superfície da nanopartícula magnética, as
partículas magnéticas de óxido de ferro têm superfícies hidrofóbicas. Devido à
interação hidrofóbica entre as partículas, elas se unem formando aglomerados bem
grandes que provocam um aumento no tamanho da partícula. Muitos estabilizadores
como polímeros e tensoativos são adicionados no momento da preparação com a
finalidade de prevenir agregação desses materiais nanoparticulados [CHARLES e
POPPLEWELL, 1980; KHALLAFALLA, 1980].
Diferentes métodos de estabilização podem ser utilizados na preparação de
colóides magnéticos [KIM et al, 2003] podendo ser feito o revestimento das
nanopartículas magnéticas com materiais inorgânicos ou orgânicos como:
fosfatidilcolina [GIRI et al, 2005], ácido láurico [DE CUYPER, 1988]; oleato de sódio
[ZÁVIŠOVÁ et al, 2007], ácido oléico [LIU et al, 2007]; látex [DENG et al, 2003];
polietileno glicol [GUPTA, 2004]. A estabilização pode ser feita ainda através da
encapsulação das nanopartículas magnéticas dentro de lipossomas, de matrizes
poliméricas (nanoesferas) ou de nanocápsulas [NEUBERGER et al, 2005].
33
2.4 APLICAÇÕES BIOMÉDICAS
Nanopartículas magnéticas oferecem atrativas possibilidades para serem
utilizadas em biologia e em medicina. Elas possuem o tamanho variando de poucos
nanômetros a centenas de nanômetros, que quando colocadas em dimensões da
escala biológica, são menores que ou de tamanho comparável a células (10-100µm),
vírus (20-450nm), proteínas (5-50nm) ou a genes (2-100nm). São magnéticas
podendo ser manipuladas por um campo magnético externo e responderem a
variações do campo magnético externo, ocorrendo a transferência de energia do
campo para a nanopartícula [PANKHURST et al, 2003].
NPM de óxido de ferro superparamagnéticas com superfície quimicamente
modificada têm sido amplamente utilizadas para inúmeras aplicações in vivo como
agente de contraste em ressonância por imagem, reparação de tecidos,
imunoensaios, detoxificação de fluidos biológicos, hipertermia, liberação de
fármacos, separação de células etc [GUPTA et al, 2004; ITO et al, 2005;
PANKHURST et al, 2003] .
2.4.1 Vetorização de Fármacos
A administração de fármacos é pode ser realizada por via injetável, dentro da
circulação sanguínea. O material injetado espalha-se por todo organismo, atingindo
muitos tecidos e com potencial efeito tóxico. [BABINCOVÁ et al, 1999; PANKHURST
et al, 2003]. Com o intuito de superar esse obstáculo uma variedade de carreadores
de fármacos tem sido desenvolvidos [KUZNETSOV et al, 2001; ZHANG et al, 2005].
A utilização de micro e nanopartículas magnéticas para que possam agir
como carreadores de fármacos direcionados a sítios específicos do organismo
surgiu no fim dos anos 70, com o desenvolvimento de carreadores poliméricos
[DOBSON, 2006; MOSBACH e SCHRODER,1979; SENYEI et al, 1978]. Já em
1986, Kiwada et al desenvolveram lipossomas contendo nanopartículas magnéticas
para atuarem na vetorização magnética de fármacos para o sítio de ação desejado
(Figura 12).
O primeiro estudo clínico para terapia do câncer, foi realizado utilizando
microesferas, por Lübber et al (1996) na Alemanha no tratamento de tumor sólido
34
avançado em 14 pacientes. Estudo de fase I (pré clinico) mostrou claramente a
baixa toxicidade do método e o acúmulo de microesferas no sítio alvo [HÄFELI,
2004].
O direcionamento magnético é baseado na atração das nanopartículas
magnéticas por um gradiente de campo magnético externo. O complexo
fármaco/carreador é injetado via intravenosa ou arterial. Um campo magnético
externo de alto gradiente gerado por imã permanente de terra rara é utilizado para
guiar e concentrar o fármaco no alvo desejado. O agente terapêutico é então
liberado do carreador magnético, via enzimática ou através de mudanças nas
condições fisiológicas tais como pH, osmolaridade ou temperatura [ALEXIOU et al,
2000].
Figura 12: Representação esquemática das nanopartículas magnéticas como Sistemas de Liberação
de fármacos. Figura adaptada de Dobson, 2006.
As propriedades ideais para um carreador de fármaco que responde
magneticamente são: ser de pequeno tamanho para permitir a distribuição a nível de
capilar e ter um espalhamento uniforme no sítio de ação desejado; ter uma resposta
magnética adequada; ter a habilidade para carrear uma ampla variedade de
fármacos; ser capaz de controlar a taxa de liberação do fármaco no sítio alvo; ter
propriedades de superfície biocompatíveis e não imunogênicos; ser biodegradável
[SENYEI et al, 1978].
35
Muitos fatores podem ser considerados quanto ao design das nanopartículas
magnéticas baseadas em sistemas alvos, podendo ser incluído parâmetros físicos
como propriedades magnéticas e tamanho das partículas carreadoras, força do
campo, geometria do campo, capacidade de ligação ao fármaco e parâmetros
fisiológicos como profundidade do alvo, taxa de fluxo sanguíneo, suprimento
vascular e peso corporal [NEUBERGER et al, 2005; PANKHURST et al, 2003]
Babincová et al (1999) demonstraram a liberação de 6-carboxifluoresceína
causado por um rompimento da bicamada lipídica dos magnetolipossomas induzido
por pulsos de laser. A liberação ocorre pelo fato das partículas magnéticas
absorverem a energia do campo eletromagnético ocorrendo um aquecimento da
bicamada lipídica acima da temperatura de transição da fase cristalina gel - líquido
(Tc), o que leva à fluidez dos fosfolipídios dos magnetolipossomas provocando a
liberação do seu conteúdo. Isso ocorre com lipossomas que possuem os
fosfolipídios com a temperatura de transição levemente acima da temperatura
fisiológica [BABINCOVÁ et al, 2001; BABINCOVÁ et al, 1999].
Segundo Kuznetsov et al (2001) a vetorização magnética de relaxantes
musculares para promover a relaxação do músculo local é mais eficiente que a
administração do fármaco sem a realização da vetorização magnética, podendo este
sistema ser utilizado em cirurgias das extremidades sem necessitar de uma
anestesia geral. Zhang et al (2005) demonstraram que os magnetolipossomas foram
direcionados para a região tumoral com a ajuda de um campo magnético,
aumentando a eficácia do fármaco anti-câncer e promovendo a diminuição dos
efeitos tóxicos. Magnetolipossomas catiônicos mostraram-se capazes de promover
uma maior retenção na região do tumor com a aplicação de um campo magnético
[DANDAMUDI et al, 2007].
2.4.2 Agente de contraste em Imagem de ressonância magnética (IRM)
Partículas superparamagnéticas representam uma classe alternativa de
agentes de contraste em ressonância magnética nuclear (RMN) [TARTAJ, 2003].
A técnica IRM (Imagem de ressonância magnética) oferece a vantagem de
alta resolução espacial em contrastes diferentes entre os tecidos. Para que a
imagem seja obtida é necessário desenvolver um agente de contraste efetivo que
36
aumentará a utilidade diagnóstica. Íons quelados paramagnéticos ou nanopartículas
superparamagnéticas ou ferromagnéticas, com tamanho geralmente na faixa de 310nm, tem sido utilizadas como agente de contraste em RMN, pois seu efeito resulta
em um contraste negativo [ITO et al, 2005].
O aumento da taxa de relaxação produzida por uma partícula magnética é
atribuído a vários mecanismos complexos. A partícula possui um grande momento
magnético na presença de um campo magnético estático e a interação dipolar entre
os núcleos superparamagnéticos e os prótons do solvente circundante resultam em
um aumento de taxas de relaxação longitudinal e transversal, especialmente com
partículas cujo diâmetro é abaixo de 10 nm [FREED, 1978; MORALES et al, 2003;
TARTAJ, 2003].
Alguns dos agentes de contraste superparamagnético de óxido de ferro
(SPOF) designados de agentes SPOF oral, agentes padrão SPOF ou de agentes
SPOF ultra-pequenos, já foram aprovados para a aplicação clinica ou estão sendo
testados clinicamente [ WANG et al, 2001] (Tabela 2).
Quadro 2: Nomes comerciais , nomes genéricos e indústria fabricante, de produtos contendo
nanopartículas magnéticas utilizadas como agentes de contraste, disponíveis no mercado mundial.
Partícula magnética
Nome
Indústria Fabricante
Comercial
Óxido de ferro superparamagnético revestido com
Gastromark®
silicone (Ferumoxsil). Administração oral.
Óxido de ferro superparamagnético revestido com
AMAG
Pharmaceuticals
Lumirem
®
Guerbet
silicone (Ferumoxsil). Administração oral. Na Europa é
aprovado a administração retal.
Óxido de ferro superparamagnético revestido com
Feridex®
dextrana (Ferumoxides).
Bayer Healthcare
Pharmaceutics
Administração intravenosa
Óxido de ferro superparamagnético revestido com
Resovist®
Schering
Sinerem®
Guerbet
carboxildextrana.
Administração intravenosa
Partículas de óxido de ferro superparamagnéticas superpequenas (Ferumoxtran)
37
2.4.3 Hipertermia
Como Hippocrates (460-370 BC) descreveu em seu provérbio, acreditava-se
que qualquer doença podia ser curada pelo aquecimento do corpo do paciente.
Hipertemia é um caminho promissor na terapia do câncer, e vários métodos
indutores de hipertermia tais como uso de água, aquecimento capacitativo e
induzido, têm sido empregados [ITO et al, 2005].
Hipertermia é o aquecimento de certos órgãos ou tecidos a temperaturas
entre 41ºC e 46ºC, preferencialmente para o tratamento do câncer. Altas
temperaturas acima de 56ºC, que levam a necrose, coagulação ou carbonização
(dependendo da temperatura) são chamadas de termo-ablação [JORDAN et al,
1999].
A hipertermia clínica moderna tem como objetivo principalmente a otimização
da homogeneidade térmica na massa alvo, um problema é que requer extenso
esforço e avançados sistemas de terapia e termometria [JORDAN et al, 1999].
O aumento da temperatura tem sido utilizado por muitos anos no tratamento
de uma ampla variedade de tumores tanto em animais experimentais quanto em
pacientes [ZEE, 2002]. O tratamento com a hipertermia é baseado no fato de as
células tumorais serem mais sensível ao calor que os tecidos sadios [SUZUKI et al,
2003]. Isso ocorre devido a diferenças fisiológicas do tecido normal e tumoral. A
vasculatura de tumores sólidos é desordenada, resultando em regiões com hipoxia e
baixo pH, diferentemente do que é encontrado nos tecidos normais. São esses
fatores ambientais que fazem com que a célula seja mais sensível à hipertermia
[REINHOLD et al, 1986].
Um problema técnico da aplicação do tratamento de hipertermia é a
dificuldade de aquecer a região do tumor à temperatura pretendida sem causar
danos no tecido normal. Diante dessas dificuldades, muitos pesquisadores têm
estudado a hipertermia intracelular através do desenvolvimento de nanopartículas
magnéticas e magnetolipossomas para induzir a hipertermia [SUZUKI et al, 2003;
ITO et al, 2003; LE et al, 2001]. Se as partículas podem se acumular no tecido
tumoral, elas podem gerar calor sob um campo magnético de alta freqüência para
proporcionar um aquecimento específico no tumor [SHINKAI et al, 2001].
As nanopartículas magnéticas podem gerar calor quando submetidas à
alteração de um campo magnético externo alternado (AC). Esse fenômeno pode ser
38
baseado na relaxação de Néel-Brown ou na relaxação Browniana. A relaxação
corresponde à rotação da partícula dentro do fluido ou a rotação do momento
magnético atômico dentro de cada partícula. A rotação da partícula refere-se à
relaxação Browniana e a rotação do momento magnético dentro de cada partícula é
conhecida como relaxação de Néel. Cada um desses processos é caracterizado por
um tempo de relaxação: ‫ּז‬B para o processo Browniano, depende das propriedades
hidrodinâmicas do fluido, enquanto ‫ּז‬N é utilizado para o processo de Néel e é
determinado pela energia de anisotropia magnética [ROSENSWEIG, 2002;
PANKHURST et al, 2003].
A quantidade de aquecimento gerado depende da natureza do material
magnético e do campo magnético [GORDON et al, 1999].
Existem uma série de trabalhos encapsulando nanopartículas magnéticas
para serem utilizados no tratamento do câncer por hipertermia [ITO et al, 2003;
PRADHAN et al, 2007; SHINKAI et al, 2001; SUZUKI et al, 2003].
Suzuki et al (2003) encapsularam nanopartículas magnéticas dentro de
lipossomas catiônicos para serem utilizados no estudo de tratamento por hipertermia
de melanoma. O tratamento promoveu a morte das células tumorais pelo
aquecimento e também através de resposta imune, sem provocar grande aumento
na temperatura dos tecidos circundantes.
Ito e colaboradores (2003) também estudaram o tratamento do câncer
utilizando lipossomas catiônicos magnéticos. Os lipossomas catiônicos magnéticos
foram desenvolvidos com o intuito de aumentar a absorção e acumulação nas
células tumorais devido à interação eletrostática com a membrana da célula
[YANASA et al, 1997]. Le et al (2001) prepararam magnetolipossomas conjugados a
fragmentos de anticorpos para que se tornassem mais específicos ao tumor,
podendo fazer um tratamento por hipertermia mais eficiente.
Viroonchatapan et al (1997) mostraram que é necessário uma alta
concentração de magnetita dentro dos lipossomas para manter a temperatura em
42oC resistindo a um efeito de resfriamento para uma temperatura controlada de
37ºC, simulando uma situação in vivo.
39
2.5 MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO DOS NANOSSISTEMAS MAGNÉTICOS
2.5.1 Birrefringência magnética
A birrefringência magnética estática (BMS) tem se comprovado como uma
excelente técnica para a investigação da freqüência de estruturas magnéticas
distintas em fluido magnético. A representação do sinal de birrefringência magnética
envolve aglomerados e partículas de tamanho polidisperso, permitindo a obtenção
da freqüência relativa de monômeros, dímeros, trímeros e estruturas altamente
magnéticas [GRAVINA et al, 2002]. A orientação de nanopartículas isoladas não
esféricas gera pequenos sinais de birrefringência magnética, enquanto que grandes
sinais de birrefringência magnética são provavelmente devidos à orientação de
aglomerados pré-existentes [MORAIS et al, 2006].
A birrefringência magnética é dada pelo efeito Cotton-Mouton ou Faraday. No
efeito Cotton-Moutton, a birrefringência magnética é medida com a aplicação do
campo magnético paralelo ao plano da amostra e perpendicular ao laser, enquanto
que no efeito Faraday o campo magnético e o laser são paralelos. A origem do efeito
é atribuída à rotação, sob aplicação do campo magnético, de nanopartículas
isoladas, aglomerados preexistentes e aglomerados induzidos pelo campo [BENICIO
et al, 2007].
O arranjo experimental das medidas de birrefringência magnética ocorre da
seguinte maneira: A luz produzida no laser atravessa o chopper, para que ocorra a
modulação da freqüência, chega ao polarizador, atravessa amostra, o analisador e
alcança o detector que vai gerar um sinal. A amostra é inserida em um porta
amostra de vidro, entre o analisador e o polarizador, localizado entre os pólos do
eletromagneto. Com a passagem do feixe de laser através da amostra e a aplicação
de campos magnéticos variados, provoca-se a rotação das nanopartículas
magnéticas com conseqüente rotação do feixe de luz polarizada (laser) gerando um
sinal em função do campo magnético [ELOI, 2004].
A luz do laser e o campo magnético são perpendiculares entre si. O
analisador e o polarizador também são perpendiculares entre si, de modo que, na
ausência de amostra entre eles, a luz do laser não consegue atravessar o analisador
não sendo então detectada [ELOI, 2004].
40
2.5.2 Determinação do diâmetro por técnica de espalhamento de luz
Espalhamento de luz dinâmico, também mencionado como espectroscopia de
fotocorrelação ou espalhamento de luz quase elástico, é uma técnica não invasiva,
bem estabelecida para medir o tamanho de moléculas na região sub-micrométrica.
As aplicações típicas são medidas de tamanho e distribuição de tamanho de
partículas, em emulsões e moléculas dispersas ou dissolvidas no líquido [MALVERN
INSTRUMENTS; PITCHER, 2002; STRAWBRIDGE, 1995].
O princípio da técnica baseia-se o fato de as moléculas, partículas e
emulsões estarem em movimento browniano. O movimento browniano é um
movimento aleatório da partícula devido ao bombardeamento por moléculas do
solvente que a circunda. Partículas grandes possuem um movimento mais lento. As
partículas menores possuem um movimento mais rápido. Se as partículas ou
moléculas são incididas com laser, a intensidade de luz espalhada flutuante é
dependente do tamanho da partícula. A velocidade do movimento Browniano é
definida por uma propriedade conhecida como coeficiente de difusão translacional
(D). O tamanho da partícula é calculado pelo coeficiente de difusão translacional
através
da
equação
de
Stokes-Einstein
[MURPHY,
1997;
MALVERN
INSTRUMENTS].
Onde:
DH= diâmetro hidrodinâmico
D=coeficiente de difusão translacional
T= temperatura absoluta
KB=constante de Boltzman
η= viscosidade
A lei de Stokes-Einstein é válida para partículas de tamanhos semelhantes. O
raio obtido através do seu cálculo é denomidado raio hidrodinâmico (Rh), o qual é
geralmente muito próximo do raio geométrico da esfera. Através de Rh, obtém-se o
diâmetro hidrodinâmico das partículas (Z médio) [MALVERN INSTRUMENTS].
41
2.5.3 Cromatografia de exclusão por tamanho
A cromatografia de exclusão por tamanho, também chamada de filtração em
gel é uma técnica simples que separa moléculas com base na diferença de
tamanho. Para realizar a separação, as moléculas passam através de um gel
empacotado na coluna, para que a filtração seja realizada.
O gel empacotado
dentro da coluna possui uma matriz porosa na forma de partículas esféricas. A
coluna empacotada é equilibrada com um tampão que preenche os poros da matriz
e o espaço entre as partículas. As amostras são eluídas isocraticamente, não tendo
a necessidade de se utilizar diferentes tampões durante a separação. O passo de
lavagem com o tampão é realizado no final da separação para remover alguma
molécula que ficou retida e preparar a coluna para a próxima corrida [GRABIELLEMADELMONT, 2003; AMERSHAM BIOSCIENCE, 2002].
As partículas menores entram nos poros da matriz, fazendo com que a sua
eluição fique retardada. As partículas maiores não são capazes de entrar nos poros
da matriz do gel, desta forma saem mais rapidamente. Para ter uma alta resolução
de fracionamento, o volume da amostra deve corresponder a cerca de 0,5-4% do
volume da coluna. Os tipos gel de exclusão mais utilizados para este processo de
separação são Sephadex G10, G25 ou G50 [AMERSHAM BIOSCIENCE, 2002].
42
Figura13: Representação esquemática da separação por diferença de tamanho [Amersham
Bioscience].
43
2.5.4 Ressonância paramagnética Eletrônica
Ressonância paramagnética eletrônica (RPE) é uma técnica que pode ser
utilizada para monitorar a dinâmica molecular dos lipídios, determinando a fluidez e
mudanças na estrutura da bicamada lipídica dos lipossomas. A técnica
espectroscópica permite detectar mudanças no movimento de rotação trópica dos
elétrons desemparelhados. [SULKOWSKI et al, 2005]. Biomoléculas, como a
fosfatidilcolina e o colesterol, que não possuem elétrons desemparelhados podem
ser estudadas por RPE quando são quimicamente ligadas a um radical livre estável,
o nitróxido, denominados de marcadores de spin [SULKOWSKI et al, 2005].
Este radical livre ou marcador de spin produz um espectro de RPE que
fornece informações a respeito do ambiente molecular do marcador. Exemplos de
marcadores para estes sistemas são o 5-doxil-ácido-estearico (5-DAS) e o 16-doxil
ácido
esteárico
(16-DAS).
Estes
marcadores
possuem
uma
cadeia
de
hidrocarbonetos que age como suporte para um radical doxil, que contém o nitróxido
ligado na posição 5 (5-DAS) ou 16 (16-DAS) da cadeia alquila, determinando o perfil
de movimentação das regiões da bicamada próxima a cadeia polar ou no final da
cadeia hidrofóbica [CORDECH et al, 2000].
O marcador 5-DAS se estrutura na membrana refletindo sua dinâmica
molecular. O espectro de RPE com o 5-DAS dentro da membrana lipídica, mostra
um movimento anisotrópico e a fluidez da membrana pode ser estimada pela
separação entre os pontos mais extremos do espectro (desdobramento paralelo
hiperfino - 2T//), ou seja, é a separação em Gauss do primeiro pico de ressonância
do espectro até a ultima depressão (Figura 14). O valor de 2T// reflete o movimento
rotacional livre dos fosfolipídios próximo à região polar da bicamada lipídica. Este
valor diminui com o aumento da fluidez da membrana [CORDECH et al, 2000].
Uma série de autores tem utilizado a RPE para estudar o comportamento de
diversas moléculas frente à bicamada lipídica. Deo (2002) utilizou a RPE para
estudar o comportamento da bicamada lipídica na presença de dodecil sulfato de
sódio. Budai (2004) verificou a interação molecular do ácido nalidíxico e lipossomas.
44
2T//
Figura 14: Estrutura química do 5-doxil ácido esteárico e espectro de RPE, mostrando o (2T//).
2.6 FÁRMACOS MODELOS
2.6.1 Dexametasona
A Dexametasona é um fármaco pertencente à classe dos glicocorticóides,
apresenta a fórmula molecular C22H29FO5 e peso molecular igual a 392, 464 g/mol
[USP 30]. Solubilidade em água igual a 89 mg/L e ponto de fusão de 262º C . Sua
estrutura básica é mesma de todos os esteróides, caracterizando–se pelo o núcleo
ciclopentanoperidrofenantreno.
2.6.1.1 Uso terapêutico
Os glicocorticóides estão entre os fármacos mais utilizadas em todo o mundo,
em várias condições. Constituem indicação absoluta e permanente nos pacientes
com insuficiência adrenal congênita, quando se utilizam doses de reposição a fim de
restabelecer a homeostase do organismo. Na maioria dos casos, eles são usados
como antiinflamatórios, sendo necessários doses suprafisiológicas, o que acarreta o
aparecimento de efeitos adversos e podendo chegar à síndrome de Cushing
exógena [OLIVEIRA, 2002].
Os glicocorticóides são inibidores do processo de inflamação celular,
proliferação de células do músculo liso e formação de colágeno [KALLINERI et al,
2002].
Alguns
estudos
relatam
que
fármacos
antiinflamatórios
como
a
Dexametasona inibem o desenvolvimento de arteriosclerose in vivo. Sendo que o
45
efeito anti-arteriosclerose é mais potente quando a dexametasona está
encapsulada em vesículas lipídicas [CHONO et al,2005].
Indicações terapêuticas incluem: [OLIVEIRA, 2002]
•
Insuficiência supral renal aguda;
•
Prevenção da síndrome da membrana hialina;
•
Tratamento da síndrome da angústia respiratória em adultos por insuficiência
pulmonar pós-traumática;
•
Tratamento do choque por insuficiência adrenocortical e como coadjuvante do
choque associado com reações anafiláticas;
•
Tratamento de processos alérgicos e inflamatórios graves, agudos e crónicos
envolvendo o olho e seus anexos;
•
Tratamento de doenças do colágeno;
•
Tratamento de doenças do aparelho digestivo, como colite ulcerativa.
2.6.2 Etinilestradiol
Etinilestradiol é um fármaco pertencente que apresenta a fórmula molecular
C20H24O2 e peso molecular igual a 296,403 g/mol [USP 30]. Solubilidade em água
igual a 11,3 mg/L e ponto de fusão de 183º C .
2.6.2.1 Estrogênios – Conceitos básicos
Os estrogênios são substâncias de origem natural ou artificial, assim
denominadas pela capacidade de induzirem o estro em animais e por serem
responsáveis tanto por modificações às observadas na primeira fase do ciclo como
pelo desenvolvimento dos caracteres sexuais secundários na espécie humana.
[MAGALHAES NETTO e MAIA FILHO, 2002].
Os estrogênios podem ser classificados em relação à sua estrutura como
esteróide e não esteróide e quanto sua origem em naturais e artificiais. Os
estrogênios naturais são produzidos pelas células granulosas, tecais , células tecaluteínica no corpo lúteo, pela supra renal, especialmete pela zona reticular e
siniciciotrofoblasto. Destes, o mais ativo é o 17-ß-estradiol, que sendo metabolizado
e inativado no fígado, tem como os seus principais derivados o sulfato de estrona e
o glicuronato de estriol [MAGALHAES NETTO e MAIA FILHO, 2002].
46
2.8.2.2 Etinilestradiol - usos terapêuticos
O estradiol é o hormônio estrogênico natural mais potente usado
principalmente para a terapia de reposição pós-climáterio [RODRIGUEZ TENREIRO et al, 2007] e o etinilestradiol é um hormônio sintético utilizado em
contraceptivos orais e reposição hormonal. Sua administração causa um significante
impacto no fígado, aumento no substrato renina e ativação do sistema reninaangiotensina-aldosterona e também tem sido observada vasoconstrição e retenção
de sódio e água. A retenção de água não é clinicamente significativa, resulta apenas
em um aumento de peso [MACHADO et al, 2006].
Alterações nos parâmetros homeostáticos de usuários de contraceptivos orais
têm sido atribuídas às doses de estrógenos contidas nesses medicamentos. Com
isso, as formulações mais recentes têm utilizado uma dose reduzida de
etinilestradiol o que resultou em uma diminuição da magnitude das mudanças prócoagulantes e aumento a atividade fibrinolítica [FERREIRA, 2000].
Subramanian et al (2003) verificaram que o etinilestradiol abaixava os fatores
regulatórios da inflamação e inibia o recrutamento de células inflamatórias para
dentro do sistema nervoso central (SNC) de ratos. Com isso Lutton et al (2004)
acreditam que o etinilestradiol possa ser um potencial candidato a ser utilizado em
Esclerose múltipla.
Sendo assim o uso de lipossomas contendo nanopartículas
magnéticas poderia ser utilizado para carrear o fármaco até o SNC.
Com base nessas características e nas potenciais vantagens terapêuticas do
direcionamento de fármacos ao sítio de ação farmacológica, dexametasona e
etinilestradiol foram selecionados como fármacos modelo para o desenvolvimento de
formulações de nanosistemas carreadores contendo nanopartículas magnéticas.
47
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL:
O objetivo deste trabalho foi desenvolver e caracterizar vesículas lipídicas e
poliméricas
contendo
partículas
magnéticas
encapsuladas
utilizando
a
etinilestradiol
e
dexametasona e o etinilestradiol como fármacos modelo.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Obter
vesículas
lipidícas
contendo
dexametasona,
nanopartículas magnéticas.
Determinar a eficiência de encapsulação da dexametasona, do etinilestradiol e
das nanopartículas magnéticas;
Determinar a eficiência de encapsulação das nanopartículas magnéticas em
lipossomas contendo fármaco;
Obter vesículas poliméricas contendo nanopartículas magnéticas;
Efetuar a caracterização físico-química dos nanossistemas obtidos.
48
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 MATERIAIS
4.1.1 Equipamentos:
Agitador magnético, marca Tecnal, modelo TE-085;
Agitador tipo vórtex, marca Phoenix, modelo AP-56;
Agulha 23G1 (0,6x25) marca BD;
Balança Analítica, marca Gehaka, modelo AG-200;
Banho de refrigeração, marca Tecnal, modelo TE-184;
Banho Ultra-Sônico, marca Unique, modelo USC1400;
Bomba à vácuo, marca Tecnal, modelo TE-0581;
Centrífuga, marca Sigma, modelo 3-18 K;
Cromatógrafo Líquido, marca Varian , Pro Star, módulos: Sistema de injeção
automático- 410; Bomba quaternária- 240; Detector UV- Visível- 310
Eletromagneto;
Espectrofotômetro UV-VIS, marca Varian, modelo Cary 50;
Espectrômetro de RPE, marca Bruker, modelo ESP 300 com cavidade
ressonante ER 4102 ST, operando em banda X (9,4 GHz);
Evaporador Rotativo, marca Tecnal, modelo TE-210;
Microscópio óptico, marca Leica acoplado a câmara digital CCD em campo
claro.
pHmetro digital , marca Gehaka, modelo PG 1800 ;
Processador ultrassônico, marca Misonix, modelo XL2020;
Seringa de 10 mL, marca Injex;
Zetasizer Nano, marca Malvern Instruments, UK, modelo ZEN1600.
4.1.2 Substâncias e Reagentes
•
Fosfatidilcolina de soja (Figura 15) - Epikuron 200 (Degussa, lote 139031),
composta por uma mistura de cadeias de ácidos graxos saturados : 17%
de Palmitoil, 6% de Estearoil e insaturados: 13% de Oleoil, 59% de
Linoleoil e 5% de Linolenoil.
49
Figura 15: Estrutura química da fosfatidilcolina de soja.
•
Acetonitrila e metanol (grau HPLC);
•
Ácido Clorídrico, marca Quimex, lote: 27593;
•
Água ultra pura Milli-Q;
•
Citrato de Sódio.
•
Cloridrato de Hidroxilamina, marca Vetec, lote 0601895;
•
Clorofórmio, metanol (grau analítico);
•
Clorofórmio,metanol, acetonitrila (grau analítico);
•
Colesterol (Avanti Polar Lipids®, lote CH-33);
•
Hidróxido de Sódio;
•
Lutrol® F-68- Poloxamer 188 (copolímero de polietileno glicol e
polipropilenoglicol), marca Basf;
•
Marcadores lipídicos derivados do ácido esteárico: 5-Doxil-L- Ácido
Esteárico -5d, Metil 5-Doxil- Ácido Esteárico -5m (Sigma Chem. Co., St.
Louis, Mo).
•
Óleo de soja, marca Soya;
•
Orto-Fenantrolina, marca Vetec, lote 0506807;
•
Poli acido lático (PLA), marca Purac Biochem, lote 0411000675;
•
Sephadex G-50 Fine (Amersham Bioscience®);
•
TES ácido N-tris-(hidroximetil)metil-2-amino sulfônico, marca Sigma
Aldrich, lote026K5453;
•
Triton X 100 - polietilenoglicol p-(1, 1, 3,3-tetrabutil) fenil éter, (tensoativo
não iônico), marca Bandeirante química.
4.1.3 Vidraria e Utensílios diversos
•
Balão de fundo chato;
•
Balão de fundo redondo.
50
•
Balões volumétricos de vidro de 10, 50 mL;
•
Bureta;
•
Erlenmeyers;
•
Espátulas de aço inox;
•
Garras;
•
Micropipetas;
•
Pipetas volumétricas de 1,2, 3, 5 e 10 mL;
•
Proveta;
•
Tubos de ensaio;
4.1.4 Fármacos modelo
4.1.4.1) Dexametasona: Pó cristalino branco, praticamente insolúvel em água
(Fornecedor
Galena,
lote:
040614).
Fórmula
molecular:
C22H29FO5.
LogP/Hidrofobicidade:1,772. (Figura 16).
Figura 16: Estrutura química da dexametasona.
4.1.4.2 Etinilestradiol: Pó cristalino branco ou levemente amarelado, praticamente
insolúvel em água (Fornecedor: Henrifarma Produtos Químicos e Farmacêuticos
LTDA, lote: 200512001). Fórmula molecular: C20H24O2. LogP/Hidrofobicidade:3,731.
(Figura 17).
51
Figura 17: Estrutura química do Etinilestradiol.
4.1.5 Ferrofluido
4.1.5.1 Fluido magnético contendo nanopartículas magnéticas revestidas com
carboxildextrana.
O fluido magnético (ferrofluido) utilizado foi composto de nanopartículas
magnéticas de Fe3O4 (magnetita), revestidas com carboxildextrana, com diâmetro
médio de 9 nm. A amostra de fluido magnético foi gentilmente cedida pelo professor
Andris Bakuzis do Instituto de Física da UFG.
4.1.5.2 Fluido magnético contendo nanopartículas magnéticas revestidas com ácido
palmítico.
Nanopartículas magnéticas de γ-Fe2O3 (maghemita), revestidas com ácido
palmítico, diâmetro médio de 8,9 nm. A amostra foi gentilmente fornecida pela
professora Patrícia P. C. Sartoratto do Instituto de Química da UFG.
4.1.5.3 Fluido magnético contendo nanopartículas magnéticas revestidas com citrato
Nanopartículas magnéticas de γ-Fe2O3 (maghemita), revestidas com citrato,
diâmetro médio de 8,9 nm. A amostra foi gentilmente fornecida pela professora
Patrícia P. C. Sartoratto do Instituto de Química da UFG.
52
4.1.5.4 Fluido magnético contendo nanopartículas magnéticas revestidas com ácido
oléico
Nanopartículas magnéticas de γ-Fe2O3 (maghemita), revestidas com ácido
oléico, diâmetro médio de 8,0 nm, A amostra foi gentilmente fornecida pela
professora Patrícia P. C. Sartoratto do Instituto de Química da UFG.
53
4.2 MÉTODOS:
4.2.1 Preparação dos Nanossistemas
4.2.1.1 Preparação dos lipossomas
Lipossomas foram preparados empregando-se a metodologia de hidratação
do filme lipídico (HFL) (Figura 18). Para preparação dos lipossomas utilizou-se
fosfatidilcolina (PC) ou fosfatidilcolina e colesterol. Estes lipídios são os
componentes estruturais dos lipossomas e constituem a fase orgânica da
preparação quando dissolvidos em clorofórmio.
Preparou-se uma solução mãe (SM) de fosfatidilcolina e uma de colesterol,
em clorofórmio, ambas na concentração de 150 mM. Dependendo da quantidade de
lipídios desejada, uma alíquota de volume determinado da SM foi retirada e
colocada em um tubo de ensaio, no qual formou-se um filme lipídico por evaporação
do clorofórmio, induzida por gás nitrogênio. O filme foi hidratado com 2 mL de fase
aquosa (tampão TES – 1,14 g de TES em 1 litro de água destilada, o pH foi acertado
para 7.0 com hidróxido de amônio) por 45 minutos e levado ao agitador tipo vórtex,
obtendo-se vesículas multilamelares e fragmentos de bicamadas. Após 10 minutos
de sonicação em processador ultrassônico (Figura 19) obteve-se uma preparação
contendo vesículas unilamelares pequenas de tamanho mais uniforme.
Após a sonicação as amostras foram centrifugadas a 3000 rpm por 5 minutos
com o intuito de remover possíveis resíduos de titânio oriundos da probe de
sonicação (Figura 19).
Figura 18: Representação esquemático da metodologia para preparo de lipossomas por hidratação
do filme lipídico.Adaptado de: www.avantilipidis.com. Acesso em 10.nov.2007.
54
Caixa
redutora de
ruído
Sonda de titânio
Controlador de
freqüência
Figura 19: Processador ultrassônico Misonix XL2020 utilizado para a obtenção de SUVs.
4.2.1.2 Preparação dos lipossomas contendo dexametasona
Para preparação dos lipossomas contendo Dexametasona utilizou-se
fosfatidilcolina na concentração de 50mM (665µl de SM). A preparação foi
realizada de acordo com o item 4.2.1.1.
Preparou-se uma solução de dexametasona em metanol de concentração
igual a 20mg/mL, da qual diferentes volumes foram adicionados na fase orgânica
da preparação dos lipossomas, devido ao caráter lipofílico da molécula resultando
em preparações contendo 2 mg, 3 mg, 4 mg ou 5 mg de dexametasona.
4.2.1.3 Preparação dos lipossomas contendo etinilestradiol
Para
preparação
dos
lipossomas
fosfatidilcolina na concentração de 50mM.
contendo
etinilestradiol
utilizou-se
55
Preparou-se uma solução de etinilestradiol em metanol de concentração igual a
20mg/mL, da qual diferentes volumes foram adicionados na fase orgânica da
preparação dos lipossomas, devido ao caráter lipofílico da molécula resultando em
preparações contendo 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 8 mg ou 10 mg de etinilestradiol.
4.2.1.4
Preparação
dos
lipossomas
contendo
nanopartículas
magnéticas
(magnetolipossomas)
Para preparação dos lipossomas contendo nanopartículas magnéticas
utilizou-se fosfatidilcolina nas concentrações de 10mM, 20mM ou 50mM ou
fosfatidilcolina nessas mesmas concentrações e colesterol com razão molar 2:1
(fosfatidilcolina e colesterol).
Diferentes quantidades de fluido magnético, contendo magnetita revestida
com carboxildextrana ou maghemita revestida com citrato ou ácido oléico, foram
adicionadas à preparação no momento da hidratação do filme lipídico juntamente
com a fase aquosa. O preparo de lipossomas por hidratação do filme lipídico foi
realizado conforme o item 4.2.1.1.
Lipossomas contendo nanopartículas magnéticas revestidas com ácido
palmítico foram preparados pela técnica de injeção de clorofórmio da seguinte
maneira: a fase orgânica contendo fosfatidilcolina na concentração de 50mM, 50µl
de fluido magnético e 1mL clorofórmio foi injetada sobre a fase aquosa (tampão
TES) a uma temperatura de 60oC, sob agitação. Após a injeção, a mistura foi
mantida sob agitação por mais 15 minutos, a uma velocidade de 150rpm, obtendo
vesículas unilamelares grandes. Após 10 minutos de sonicação foram reduzidas a
vesículas unilamelares pequenas.
4.2.1.5
Preparação
dos
lipossomas
contendo
nanopartículas
magnéticas
(magnetolipossomas) e etinilestradiol
Utilizou-se
na
preparação
dos
lipossomas
contendo
nanopartículas
magnéticas e etinilestradiol, fosfatidilcolina nas concentrações de 10mM, 20mM ou
50mM , etinilestradiol na razão de 10mM de PC para 1 mg de fármaco e 50µl de
fluido magnético contendo magnetita revestida com carboxildextrana ou maghemita
revestida com citrato.
56
4.2.1.6 Preparação de nanocápsulas
As nanocápsulas foram preparadas usando o método de deposição interfacial
de polímero pré-formado, descrito por Fessi et al (1989).
Inicialmente preparou-se a fase orgânica misturando 80mg de óleo de soja,
150mg de PLA, 150mg de PC em 22 mL de acetona e 5 mL de metanol. Mantevese essa mistura sob agitação para que ocorresse completa solubilização de todos
os componentes. Para a preparação da fase aquosa, adicionou-se em um balão de
fundo chato de capacidade para 250 mL, 150 mg de Poloxamer 188® em 50 mL de
água. Em seguida a fase orgânica foi colocada dentro de uma seringa (diâmetro
1,7 cm, e comprimento 7,5 cm) com uma agulha acoplada (G23) e injetada sobre a
fase aquosa através de gotejamento promovido pela força da gravidade. Durante
esse processo a fase aquosa foi mantida sob agitação a uma velocidade de
aproximadamente 150 rpm, em agitador magnético. Após a injeção da fase
orgânica, a mistura foi mantida sob agitação por 30 minutos. Posteriormente, a
preparação foi colocada em um balão de fundo redondo e acoplada ao
rotaevaporador para remoção do solvente orgânico utilizando-se pressão de
600mmHg a 45ºC. A suspensão coloidal foi concentrada para 10 mL através da
remoção da água sob as mesmas condições de remoção do solvente orgânico.
4.2.1.7 Preparação de nanocápsulas contendo nanopartículas magnéticas
Para a preparação das nanocápsulas contendo nanopartículas magnéticas,
colocou-se 150µl de fluido magnético contendo nanopartículas magnéticas
revestidas com ácido palmítico na fase orgânica da preparação e o método foi
executado conforme o item 4.2.1.6.
4.2.2 Medida do diâmetro dos nanossistemas – Técnica de Espalhamento de
Luz (Light Scattering)
A média e a distribuição do tamanho das vesículas foram determinadas
utilizando-se a técnica de espalhamento de luz em um equipamento Zeta Sizer Nano
(Figura 20).
57
Uma alíquota (1,0 mL) de cada amostra foi introduzida na cubeta, inserida no
equipamento e analisada à temperatura ambiente. Em cada leitura foi obtido o Zaverage, que corresponde ao diâmetro médio aproximado dos lipossomas e o
índice de polidispersibilidade (PdI) que é a medida da distribuição do tamanho dos
lipossomas. O PdI varia de 0 quando a amostra é totalmente monodispersa a 1
para amostras polidispersas.
Figura 20: Zeta Sizer Nano.
4.2.3 Determinação dos parâmetros analíticos da dexametasona e do
etinilestradiol
4.2.3.1 Determinação do comprimento de onda de absorção máxima da
Dexametasona em espectrofotômetro.
Foi
realizada
uma
varredura
do
espectro
de
absorbância,
em
espectrofotômetro UV-VIS (Figura 21), no intervalo de comprimento de onda de
200 a 400 nm de uma solução de Dexametasona em metanol na concentração de
0,004mg/mL, para verificar o comprimento de onda de máxima absorção.
58
Figura 21: Espectrofotômetro UV-Vis acoplado com leitor de fibra óptica.
4.2.3.2 Determinação do comprimento de onda de absorção máxima do
Etinilestradiol em espectrofotômetro.
Foi
realizada
uma
varredura
do
espectro
de
absorbância,
em
espectrofotômetro UV-VIS, no intervalo de comprimento de onda de 250-350 de
uma solução de Etinilestradiol em metanol na concentração de 0,2 mg/mL, para
verificar o comprimento de onda de máxima absorção.
4.2.3.4 Desenvolvimento de metodologia para a quantificação da Dexametasona
por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.
Preparou-se uma solução de dexametasona em metanol na concentração de
0,02 mg/mL. Para o desenvolvimento do método cromatográfico, por cromatografia
líquida de alta eficiência (Figura 22), testaram-se diferentes composições de fase
móvel e fluxo. As análises foram realizadas usando uma coluna C18 (250x4,6mm;
Chromspher®), detector UV no comprimento de onda de 240nm. A fase móvel
escolhida para a realização das análises subseqüentes foi constituída por
59
acetonitrila e água (45:55 v/v) com fluxo de 1.2 mL/min. A quantidade de amostra
injetada foi de 20µl.
Figura 22: Cromatógrafo Líquido de alta Eficiência.
4.2.3.5 Metodologia para a quantificação do Etinilestradiol por Cromatografia Líquida
de Alta Eficiência ( CLAE)
Preparou-se uma solução de etinilestradiol em metanol na concentração de
0,04 mg/mL. Utilizou-se a metodologia proposta pela USP 30 (2007) com algumas
modificações. As análises foram realizadas usando coluna C18 (250x4,6mm;
Chromspher®), detector UV no comprimento de onda de 279 nm. Utilizou-se como
fase móvel acetonitrila: água (50:50 v/v), com fluxo de 1mL/min.
4.2.3.6 Determinação da Curva de calibração da Dexametasona
Foi preparada uma solução mãe de concentração 0,4 mg/mL em metanol.
Esta solução foi diluída, obtendo-se os seguintes pontos: 0,04 mg/mL; 0,02 mg/mL;
0,01 mg/mL; 0,008 mg/mL; 0,004 mg/mL; 0,003 mg/mL; 0,002 mg/mL; 0,001
mg/mL; 0,0008 mg/mL. As soluções foram preparadas em triplicata e as leituras
foram realizadas por CLAE, no comprimento de onda de 240nm.
60
4.2.3.7 Determinação da Curva de calibração do Etinilestradiol
Foi preparada uma solução mãe de concentração 0,2 mg/mL em metanol.
Esta solução foi diluída, obtendo-se os seguintes pontos: 0,06 mg/mL; 0,04 mg/mL;
0,02 mg/mL; 0,01 mg/mL; 0,008 mg/mL; 0,006 mg/mL; 0,004 mg/mL; 0,003 mg/mL;
0,002 mg/mL; 0,001 mg/mL; 0,0008 mg/mL e 0,0006 mg/mL. As soluções foram
preparadas em triplicata e as leituras foram realizadas por CLAE, no comprimento
de onda de 279 nm.
4.2.4 Determinação da eficiência de encapsulação do fármaco
4.2.4.1 Separação do fármaco livre
Lipossomas contendo o fármaco encapsulado foram separados do fármaco
livre por cromatografia de exclusão por tamanho (Figura 23), utilizando uma bureta
de 10 mL empacotada com Sephadex G-50 “fine”, de 24,5 cm de altura
correspondendo a um volume de 12,3 mL. O volume injetado correspondeu a 2,43%
do volume total da coluna, para que fosse obtida uma alta resolução de separação, o
fluxo da fase móvel pela coluna foi de 200 µl/min.
O procedimento foi realizado da seguinte maneira: 300 µl da preparação de
lipossomas contendo fármaco foram aplicados sobre a coluna de Sephadex
lentamente pelas paredes da coluna com o intuito de evitar perturbação da parte
superior da coluna. A eluição da amostra aplicada foi feita com tampão TES. Após a
aplicação, frações de 200 µl foram coletadas, sendo 55 frações para lipossomas
contendo dexametasona e 45 frações para lipossomas contendo etinilestradiol.
Lipossomas contidos nas frações eluídas foram rompidos com 800 µl de
metanol, para posterior quantificação do fármaco encapsulado. A quantificação foi
feita por cromatografia líquida de alta eficiência no comprimento de onda de 240 nm
para a dexametasona e 279 nm para o etinilestradiol.
61
Figura 23: Representação esquemática da cromatografia por exclusão de tamanho. Disponvel em :
www.science.fau.edu. Acesso em: 10.nov.2007
4.2.4.2 Cálculo da eficiência de encapsulação
A quantificação do fármaco encapsulado foi realizada pela técnica de
cromatografia líquida de alta eficiência. Os cálculos foram realizados com base nas
respectivas curvas de calibração.
Para a realização da cromatografia, foi efetuado o rompimento dos lipossomas
com 800µl de metanol, que foi acrescido a cada fração recolhida da coluna contendo
fármaco
encapsulado
dentro
de
lipossomas.
Posteriormente
realizou-se
a
homogeneização da solução.
A solução obtida foi colocada em vials para a injeção no cromatógrafo nas
condições descritas no item 4.2.3.5 quando se realizou a quantificação da
dexametasona e no item 4.2.3.6 para a quantificação do etinilestradiol. A integração
da área do pico cromatográfico para cada amostra resultou na determinação
quantitativa do fármaco encapsulado em cada fração. Através de cálculos
matemáticos chegou-se a quantidade total de fármaco encapsulado na preparação.
62
4.2.5 Ensaios para quantificação das nanopartículas magnéticas encapsuladas
4.2.5.1 Reação colorimétrica para a quantificação do ferro
A quantidade de nanopartícula magnética encapsulada foi determinada
baseada nos íons ferrosos utilizando a orto-fenantrolina, através de uma reação
colorimétrica (KIWADA et al, 1986): 0,1 mL de preparação lipossomas ou de fluido
magnético foi misturado com 0,1 mL de solução de Triton X-100 a 5% (v/v), depois o
óxido de ferro foi ionizado por adição de 0,5 mL de HCl concentrado; 0,5 mL de
solução de cloridrato de hidroxilamina (10%) foi adicionada para reduzir o íon férrico.
Depois de 15 minutos, 1 mL da solução de orto-fenantrolina (0,5%) foi colocada, a
mistura foi neutralizada com 0,5mL de NaOH a 12N e o pH ajustado para 4 com
solução de citrato de sódio a 30%. O volume da amostra foi ajustado para 10mL.
4.2.5.2 Determinação do comprimento de onda de absorção máxima do íon ferroso
por espectrofotometria.
Para a verificação do comprimento de onda de absorção máxima realizou-se
a reação colorimétrica como descrita no item 4.2.5.1, utilizando um fluido
magnético contendo concentração de ferro de 7,5x10-8 mol/mL. Foi feita uma
varredura do espectro de absorbância nos comprimentos de onda de 400 a 800
nm, com o propósito de determinar o comprimento de onda de máxima absorção.
4.2.5.3 Determinação da curva de calibração.
Realizou-se a reação colorimétrica utilizando um fluido magnético cuja
concentração de ferro era conhecida, partindo de uma solução mãe cuja
concentração de ferro era de 1,5 µmol /mL. A solução mãe foi diluída obtendo-se
os seguintes pontos: 0,15 µmol/mL; 0,12 µmol/mL; 7,5x10-2 µmol/mL; 4,5x10-2
µmol/mL; 1,5x10-2 µmol/mL; 1,2x10-2 µmol/mL. As leituras foram realizadas por
espectrofotômetria no comprimento de onda de 509nm, em triplicata.
63
4.2.5.4 Separação da nanopartícula magnética livre (não encapsulada)
Lipossomas
contendo
nanopartículas
magnéticas
encapsuladas foram
separados das nanopartículas magnéticas livres por cromatografia de exclusão por
tamanho, utilizando uma bureta de 10 mL empacotada com Sephadex G-50 “fine”,
de 23,5 de altura correspondendo a um volume de 11,8. O volume injetado
correspondeu a 2,54 do volume total da coluna, para que fosse obtida uma alta
resolução de separação. O fluxo de fase móvel pela coluna foi de 200µl/min.
A separação das nanopartículas livres foi realizada da mesma forma do
procedimento descrito no item 4.2.4.1, de separação do fármaco livre.
As frações eluídas contendo lipossomas com nanopartícula encapsulada
foram
combinadas
e
homogeneizadas,
para
posteriormente
promover
a
quantificação de nanopartículas magnéticas encapsuladas.
4.2.5.5 Determinação da quantidade de Nanopartículas magnéticas encapsuladas.
A quantificação das nanopartículas magnéticas encapsuladas foi executada
utilizando-se espectrofotometria. Os cálculos foram efetuados a partir da curva de
calibração.
Para a determinação espectrofotométrica, retirou-se 0,1 mL das frações
contendo lipossomas com nanopartícula encapsulada depois de combinadas e
homogeneizadas. Foi realizada a reação colorimétrica de acordo com o
procedimento do item 4.2.5.1 para a quantificação da concentração de ferro na
preparação. Foi efetuada a leitura da absorbância no comprimento de onda de
máxima absorção.
A partir da medida da absorbância, obteve-se, por meio da curva de
calibração, a concentração de ferro em µmol/mL que através de cálculos
matemáticos chegou-se o número de nanopartículas magnéticas encapsuladas.
64
4.2.5.6 Estudo da estabilidade da preparação quanto à perda de nanopartículas
magnéticas encapsuladas (vazamento) durante o armazenamento.
Para a verificação de uma possível perda de nanopartículas magnéticas
encapsuladas durante o período de armazenamento, foi avaliado o número de
nanopartículas magnéticas imediatamente após a preparação dos lipossomas e
depois de transcorridas 24 e 168 horas (1 e 7 dias, respectivamente) de
acondicionamento em geladeira. A determinação do número de nanopartículas
magnéticas encapsuladas foi efetuada conforme descrito nos itens 4.2.5.4 e 4.2.5.5.
4.2.6 Estudo de Birrefringência Magnética
O Estudo de Birrefringência magnética foi realizado no laboratório
de
Magnetoóptica do Instituto de Física da Universidade Federal de Goiás. Para a
realização do ensaio foram utilizadas amostras de magnetolipossomas com
diferentes quantidades de fosfatidilcolina, fosfatidilcolina e colesterol e de fluido
magnético com nanopartículas revestidas com carboxildextrana. Os ensaios foram
realizados após a separação de NPM livres de NPM encapsuladas, utilizando a
técnica de cromatografia por exclusão de tamanho conforme o item 4.2.5.4.
Os estudos realizados foram:
1) Avaliação da diferença da intensidade do sinal em função do campo
magnético entre uma amostra de magnetolipossomas contendo 50mM de PC
e 50µL de fluido magnético e uma amostra de fluido magnético contendo NPM
revestidas com carboxildextrana.
2) Comparação entre amostras com e sem colesterol, utilizando-se
lipossomas contendo 10mM de PC e lipossomas com 10mM de PC e 5 mM
de colesterol, ambos com 50µL de fluido magnético. Comparação entre
magnetolipossomas com 10mM e 20mM de PC e ambas com 25 µL de fluido
magnético também foi feita.
3) Durante a separação das NPM livres das NPM encapsuladas de
amostras de magnetolipossomas contendo PC 50mM e 50µL de fluido
magnético, foram obtidos dois conjuntos de frações, F1 e F2. A fração F1 é
65
referente à reunião das primeiras frações eluídas, com diâmetro médio maior,
já a fração F2 foi formada pelas frações que eluem posteriormente, com
diâmetro médio menor. O ensaio de birrefringência foi feito com as duas
frações.
4) Avaliação da estabilidade das preparações em função do tempo dos
magnetolipossomas contendo 50mM de PC e 25µl de fluido magnético, da
seguinte maneira: as NPM encapsuladas foram separadas das NPM livres, a
amostra foi deixada em repouso na geladeira a uma temperatura de 40C e
realizou-se a birrefringência magnética após 24 horas, 48 horas e 72 horas
desse procedimento.
Através destes estudos foi possível determinar a média de nanopartículas
magnéticas em um aglomerado, ou seja, no aglomerado dentro do lipossoma.
Quando uma amostra de magnetolipossomas é colocada no porta amostra,
com a aplicação do campo magnético e conseqüente rotação do eixo de luz
polarizada, a luz do laser consegue atravessar o analisador que encontra
perpendicular ao polarizador gerando um sinal que será detectado, em função do
campo magnético aplicado
Figura 24: Representação esquemática do equipamento utilizado para a obtenção das medidas de
birrefringência magnética estática.
4.2.7 Ressonância Paramagnética Eletrônica
A interação dos fármacos com o fosfolipídio foi estudada através da técnica
de Ressonância Paramagnética Eletrônica, utilizando como marcador o 5-doxilácido-esteárico. As análises foram realizadas no Laboratório de Ressonância
Magnética do Instituto de Física da Universidade Federal de Goiás.
66
O ensaio foi executado em espectrômetro de EPR marca Bruker, modelo ESP
300 com cavidade ressonante ER 4102 ST, operando em banda X(9,4 GHz). Em um
tubo de ensaio foi colocado 1µl de solução estoque de marcador (10mM) dissolvido
em etanol. Após seco o solvente, 50µl de amostra contendo as vesículas
lipossomais suspensas foram acrescidos no tubo de ensaio inicial. A amostra foi
agitada em agitador tipo vortex por 1 minuto. Pequeno volume dessa amostra
marcada foi introduzido em tubo capilar e levado ao aparelho para as medidas de
RPE.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 PREPARAÇÃO DOS NANOSSISTEMAS
No processo de obtenção dos lipossomas, foi formada uma dispersão com
aparência leitosa, azulada e translúcida, após a sonicação dos lipossomas, devido à
diminuição do tamanho das vesículas. Ao acrescentar fármaco, notadamente a
dexametasona, a preparação perdeu o brilho azulado e ficou com aparência mais
opaca, devido ao fármaco livre presente na amostra. O processo de centrifugação
realizado para a remoção de resíduos de titânio fez com que parte do fármaco livre
presente na amostra se depositasse no fundo do frasco com isso a preparação
voltou a apresentar o brilho azulado.
Os lipossomas contendo nanopartículas magnéticas encapsuladas resultaram
em preparação de coloração escura quando foi utilizada magnetita revestida com
carboxildextrana e coloração mais alaranjada quando se utilizou maghemita
revestida com citrato (Figura 25). A maghemita (γ-Fe2O3), uma estrutura semelhante
à magnetita (Fe3O4), difere apenas com os íons Fe (II) oxidados a Fe (III), ou seja,
na maghemita o Fe está em sua maioria no estado trivalente (TARTAJ et al, 2003).
Essa diferença no estado de oxidação gera a modificação na coloração do fluido
magnético.
Figura 25: Lipossomas contendo nanopartículas magnéticas de magnetita e maghemita. A)
magnetita; B) maghemita.
O método de hidratação do filme lipídico utilizado na preparação dos
magnetolipossomas foi também utilizado por vários outros autores (KIWADA et al,
1986; FORTIN-RIPOCHE et al, 2006; SABATÉ et al, 2007; PLASSAT et al, 2007).
68
Wijaya et al (2007) prepararam lipossomas contendo NPM pela técnica de
evaporação de fase reversa. Alguns trabalhos prepararam os lipossomas por
sonicação e as nanopartículas magnéticas foram inseridas após as vesículas
estarem formadas pela técnica de diálise [DE CUYPER, 1988; LACAVA et al, 2004;
DE CUYPER, 2006].
As nanopartículas magnéticas revestidas com carboxildextrana ou com citrato
ficaram no compartimento aquoso do lipossoma, pois o revestimento presente nas
NPMs é hidrofílico. Era esperado que as nanopartículas revestidas com ácido
palmítico e com ácido oléico ficassem localizadas na bicamada lipídica da vesícula
devido à característica lipofílica do revestimento. No entanto, essas nanopartículas
magnéticas não ficaram inseridas na bicamada, mas aglomeraram-se dentro e fora
dos lipossomas (Figura 26). Com isso, houve a formação de grumos e a preparação
ficou muito viscosa. Após alguns dias de armazenamento na geladeira houve a
precipitação de aglomerados de nanopartículas magnéticas nestas amostras.
As nanopartículas magnéticas utilizadas possuíam média de diâmetro de 8-9
nm, e a bicamada lipídica tem em média de 3,5-4,0nm de largura [ LASIC, 1998]. Em
conseqüência de possuir dimensão maior, a nanopartícula não ficou inserida na
bicamada e sim se aglomerou. Na Figura 26 pode-se observar os aglomerados na
preparação, e não se observam vesículas multilamelares. A Figura 27 apresenta
fotomicrografia de uma preparação de magnetolipossomas sem sonicação,
mostrando vesículas multilamelares e de formatos variados. Kuznetsov et al (2001)
não observaram diferença na estabilidade, motilidade e nas propriedades funcionais
e magnéticas entre lipossomas com partículas magnéticas estabilizadas com
gelatina inseridas na bicamada lipídica ou contidas no compartimento aquoso. Estes
autores observaram que é possível que as nanopartículas migrem da bicamada
lipídica para o compartimento aquoso e vice-versa. Neste trabalho, esta dinâmica
das nanopartículas não foi observada. Possivelmente devido às características das
substâncias utilizadas no recobrimento das NPM.
69
Figura 26: Fotomicrografia de lipossomas contendo nanopartículas magnéticas revestidas com ácido
oléico, sem sonicação.
Figura 27: Fotomicrografia de lipossomas multilamelares e de vários formatos.
As nanocápsulas preparadas sem nanopartículas magnéticas possuem um
aspecto fluorescente, esbranquiçado e opalescente. Já as nanocápsulas contendo
nanopartículas magnéticas possuem uma coloração amarelada, fluorescente e
opalescente como pode ser observado na Figura 28. A metodologia utilizada foi a
proposta por Fessi et al (1989), de deposição interfacial de polímeros pré-formados
tendo a formação de nanocápsulas com nanopartículas magnéticas inseridas no seu
núcleo oleoso, diferentemente de uma série de trabalhos que produzem nanoesferas
magnéticas, ou seja, nanoesferas contendo nanopartículas magnéticas como núcleo
desta [HU et al, 2006; LIU et al, 2007; ZÁVIŠOVÁ et al, 2007; ASTETE et al, 2007].
Esta preparação de nanocápsulas mostrou-se estável, sendo que mesmo após 10
70
dias armazenada na geladeira, a dispersão coloidal de nanocápsulas permaneceu
estável, sem separação de fases ou formação de precipitados.
Figura 28: A) nanocápsula com nanopartícula magnética; B) nanocápsula sem nanopartícula
magnética.
5.2 DETERMINAÇÃO DO TAMANHO DOS NANOSSISTEMAS
5.2.1 Lipossomas e magnetolipossomas
Durante a obtenção dos lipossomas o processo de sonicação faz com que os
fosfolipídios presentes nas bicamadas lipídicas se reorganizem gerando estruturas
com diâmetro menores e mais homogêneas. Logo após a hidratação do filme lipídico
os lipossomas alcançaram a forma de vesículas multilamelares e com isso
apresentam um diâmetro mais elevado e um alto índice de polidispersibilidade. Já
com a sonicação, o diâmetro das vesículas é reduzido e o menor índice de
polidispersibilidade indica maior homogeneidade da população de vesículas.
A Figura 29 representa a distribuição das populações lipossomais dada pela
medida de espalhamento de luz em relação ao diâmetro das vesículas antes e
depois do processo de sonicação. Observa-se que as amostras lipossomais antes
de serem sonicadas apresentaram estruturas grandes e de tamanhos variados e que
após os 10 minutos de sonicação o diâmetro das estruturas era menor. Observa-se
pela Figura 29 B que as vesículas maiores, acima de 1 µm ocupavam maior parte da
amostra antes de passar pelo processo de sonicação e depois de sonicadas as
vesículas de 10-100 nm representam o maior volume da preparação.
71
A
B
Figura 29: A- Intensidade de espalhamento de luz das amostras de lipossomas; B- Volume ocupado
pelas vesículas em função do tamanho ________ antes da sonicação; ________ depois da
sonicação.
A comparação entre o diâmetro dos lipossomas formados apenas com
fosfatidilcolina e o diâmetro dos lipossomas contendo dexametasona permitiu
observar que na presença de dexametasona houve um aumento no diâmetro médio
das vesículas. O diâmetro médio do lipossoma sem dexametasona foi de 66 nm e do
lipossoma com dexametasona foi de 97,1nm. Ocorreu também uma redução do
índice de polidispersibilidade, ou seja, as vesículas ficaram com o tamanho mais
homogêneo quando foi adicionado o fármaco (Figura 30). O mesmo ocorreu com
lipossomas contendo etinilestradiol, com aumento no diâmetro médio do lipossoma e
diminuição do índice de polidispersibilidade. O diâmetro médio dos lipossomas com
etinilestradiol foi de 101nm (Figura 31).
72
Figura 30: Intensidade de espalhamento de luz de amostras de lipossomas ______com
dexametasona; ______ sem dexametasona.
Figura 31: Intensidade de espalhamento de luz de amostras de liposomas ________com
etinilestradiol; ________ sem etinilestradiol.
Pela
Figura
32,
observa-se
que
os
magnetolipossomas
contendo
etinilestradiol apresentaram estruturas grandes, acima de 1 µm, o que foi devido ao
fármaco livre presente na amostra que sofreu cristalização no meio aquoso.
Observa-se também que não houve grande diferença na distribuição de tamanho
das
vesículas
com
diferentes
quantidades
de
fosfatidilcolina,
nas
várias
preparações. Nas Figuras 32 B e D observa-se que nas preparações que continham
PC 50mM e 5 mg de etinilestradiol, as estruturas acima de 1 µm estavam mais
evidentes. A média de diâmetro dos lipossomas contendo nanopartículas
magnéticas variou de 92,5-118 nm e nos lipossomas contendo nanopartículas
magnéticas e etinilestradiol variou de 101-155. Dandamudi et al (2007) obtiveram
vesículas cuja média de diâmetro era de 483±187,02 nm, valor este bem acima do
que foi conseguido neste trabalho. Já Martina et al (2007) obtiveram vesículas com
tamanho de 208±61nm e 182±52nm.
73
A
B
C
D
Figura 32: Intensidade de espalhamento de luz das amostras de lipossomas magnéticos com
nanopartículas magnéticas revestidas com citrato ou revestidas com carboxildextrana, com e sem
fármaco. A) Lipossomas magnéticos contendo nanopartículas revestidas com carboxildextrana; B)
Lipossomas magnéticos contendo nanopartículas revestidas com carboxildextrana e etinilestradiol C)
Lipossomas magnéticos contendo nanopartículas revestidas com citrato; D) Lipossomas magnéticos
contendo nanopartículas revestidas com citrato e etinilestradiol. Quantidades de fosfatidilcolina:
________PC 10mM; ________ PC 20mM _________PC 50mM
74
5.2.2 Nanocápsulas
As
nanocápsulas
(NC)
preparadas
sem
nanopartículas
magnéticas
apresentaram um diâmetro médio de 192 nm e o índice de polidispersibilidade igual
a 0,159 considerado baixo, ou seja, a amostra apresenta nanocápsulas de tamanhos
homogêneos. As nanocápsulas contendo nanopartículas magnéticas apresentaram
diâmetro médio de 176 nm e índice de polidispersibilidade igual a 0,206. A Figura 33
representa a distribuição de populações de nanocápsulas sem e com nanopartículas
magnéticas. Estes dados indicam que a presença das NPM não alterou as
características de formação das nanocápsulas.
Figura 33: Espalhamento de luz de nanocápsulas brancas e nanocápsulas contendo nanopartículas
magnéticas revestidas com ácido palmítico ________ NC sem nanopartícula; ________ NC com
nanopartícula encapsulada.
5.3 PARÂMETROS ANALÍTICOS DA DEXAMETASONA E DO ETINILESTRADIOL
5.3.1 Dexametasona
A dexametasona apresentou máxima absorção no comprimento de onda de
240 nm, de acordo com o valor preconizado pela USP 30 (2007) que é de 239 nm. O
comprimento de onda de 240 nm foi utilizado nas análises posteriores realizadas
para a quantificação da dexametasona (Figura 34).
75
Figura 34: Varredura de solução de dexametasona em espectrofotômetro UV/Vis.
No ensaio quantitativo por CLAE a dexametasona apresentou tempo de
retenção de 4,143 minutos (Figura 35). O pico cromatográfico mostrou-se simétrico,
sem cauda e com um tempo de análise adequado.
Figura 35: Cromatograma da dexametasona. Condições cromatográficas: fase móvel acetonitrila e
água (45:55); fluxo de 1.2 mL/min, coluna C18 (250x4,6mm; Chromspher®), comprimento de onda de
240nm, detector UV.
Obteve-se pela regressão linear da curva um coeficiente de correlação igual a
0, 9998, demonstrando sua linearidade dentro da faixa de concentração analisada e
a seguinte equação da reta: y= 107x+1003,5 (Figura 36).
76
Figura 36: Curva de Calibração da dexametasona, obtida por CLAE. Condições cromatográficas:
®
fase móvel acetonitrila e água (45:55); fluxo de 1.2 mL/min, coluna C18 (250x4,6mm; Chromspher ),
comprimento de onda de 240nm, detector UV.
5.3.2 Etinilestradiol
O etinilestradiol apresentou máxima absorção no comprimento de onda de
279 nm, consistente com o preconizado pela USP 30 que é de 281 nm. O
comprimento de onda de 279 nm foi utilizado nas análises posteriores realizadas
para a quantificação do etinilestradiol (Figura 37).
Figura 37: Varredura de solução de etinilestradiol em espectrofotômetro UV/Vis.
O cromatograma do etinilestradiol apresentou pico do fármaco no tempo de
retenção de 7,084 minutos (Figura 35).
77
Figura 38: Cromatograma de etinilestradiol. Condições cromatográficas: fase móvel acetonitrila e
®
água (50:50); fluxo de 1 mL/min, coluna C18 (250x4,6mm; Chromspher ), comprimento de onda de
279nm, detector UV.
Obteve-se pela regressão linear da curva, o coeficiente de correlação igual a
1, comprovando a linearidade da curva e a seguinte equação da reta: y= 106x457,92.
Figura 39: Curva de Calibração do etnilestradiol, obtida por CLAE. Condições cromatográficas: fase
®
móvel acetonitrila e água (50:50); fluxo de 1 mL/min, coluna C18 (250x4,6mm; Chromspher ),
comprimento de onda de 279nm, detector UV.
5.4 DETERMINAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO DO FÁRMACO EM
LIPOSSOMAS
5.4.1 Separação do fármaco livre
As Figuras 40 e 41 demonstram o perfil de eluição dos lipossomas através da
coluna de separação. Preparações de lipossomas contendo dexametasona
apresentaram uma quantidade de fármaco livre muito superior à concentração de
fármaco encapsulado (Figura 40). Os lipossomas eluíram nas frações de 13 a 19,
78
sendo que o fármaco livre começou a eluir logo em seguida, evidenciando maiores
concentrações a partir da fração 26. A separação é dependente do tamanho e forma
dos componentes presentes na amostra sendo que os componentes da amostra são
separados em virtude da diferença de tamanho existente entre eles [GRABIELLEMADELMONT et al, 2003]. Os lipossomas contendo fármaco encapsulado
apresentam um diâmetro superior ao fármaco na sua forma livre, com isso saem
mais rapidamente, eluindo nas primeiras frações enquanto que o fármaco livre sai
nas frações posteriores, pois fica retido nos poros da coluna e sua eluição fica
retardada. Já no perfil de eluição dos lipossomas contendo etinilestradiol, pode-se
observar que a concentração de fármaco encapsulado é maior que a quantidade de
fármaco livre. As frações nas quais eluem os lipossomas contendo etinilestradiol são
13-23 (Figura 41).
Figura 40: Perfil de eluição dos lipossomas contendo dexametasona. Frações contendo
dexametasona encapsulada (13-19).
Figura 41: Perfil de eluição dos lipossomas contendo etinilestradiol. Frações contendo etinilestradiol
encapsulado (13-23).
79
5.4.2 Cálculo da eficiência de encapsulação
A eficiência de encapsulação foi calculada para amostras com diferentes
concentrações de dexametasona ou de etinilestradiol. Os resultados estão
apresentados nas Tabelas 1 e 2.
Para efetuar o doseamento do fármaco, as vesículas foram rompidas com 800
µL de metanol. Portanto a cada fração (200 µL) recolhida da coluna, adicionou-se
800 µl de metanol, sendo realizada a quantificação do fármaco por CLAE em cada
fração. Para exemplificar os cálculos, serão apresentados dados da preparação
contendo 5 mg de etinilestradiol.
Realizou-se a quantificação do fármaco contido em cada fração recolhida da
coluna por CLAE, determinando a área do pico cromatográfico de etinilestradiol
nessas frações. Em seguida efetuaram-se os seguintes cálculos para cada fração
recolhida da coluna que continha fármaco encapsulado: pela equação da curva
analítica de calibração, calculou-se a concentração de fármaco em cada fração
eluída. Essas concentrações foram somadas, obtendo a concentração total de
0,6262572 mg/mL, no volume de 1 mL das frações. Logo, a quantidade total de
etinilestradiol que eluiu da coluna foi 0,6262572/0,3 mL= 2,087524, que corresponde
à quantidade de etinilestradiol presente dentro dos lipossomas que eluíram pela
coluna após a aplicação de 0,3mL de amostra. Multiplicando-se esse valor por 2,
encontra-se a quantidade de etinilestradiol presente dentro dos lipossomas nos 2 mL
de amostra preparada, sendo então igual a 2,087524x2 = 4,175 mg de fármaco. E a
eficiência de encapsulação foi calculada pelas seguintes fórmulas:
Tabela 1: Eficiência de encapsulação da Dexametasona em lipossomas contendo 50mM de
fosfatidilcolina (E% - eficiência de encapsulação em %- EC eficiência de encapsulação com relação a
quantidade de fosfatidilcolina – razão molar).
Eficiência de Encapsulação
DEXadicionada
DEX(encapsulada)
E%
EC (Dex:PC)
2 mg
0,19 mg
9,83%
0,0026 (1:200)
3 mg
0,15mg
5,05%
0,0022 (1:260)
4 mg
0,15 mg
3,69%
0,0019 (1:260)
5 mg
0,21 mg
4,16%
0,0027 (1:190)
Tabela 2: Eficiência de encapsulação do Etinilestradiol em lipossomas contendo 50mM de
fosfatidilcolina (E% - eficiência de encapsulação em %- EC eficiência de encapsulação com relação a
quantidade de fosfatidilcolina – razão molar).
Eficiência de Encapsulação
EEadicionada
EE (encapsulada)
E%
EC (EE:PC)
2 mg
1,84mg
77,5 %
0,0245 (1:16)
3 mg
2,01mg
66 %
0,0268 (1:15)
4 mg
2,83 mg
70%
0,0377 (1:10)
5 mg
4,17mg
81 %
0,0556 (1:7)
8 mg
4,19mg
52,4 %
0,0558 (1:7)
10 mg
4,04 mg
40,44%
0,0538 (1:7)
Embora dexametasona e etinilestradiol sejam derivados da estrutura do anel
esteróide, observa-se que a eficiência de encapsulação da dexametasona é muito
menor que a do etinilestradiol. Essa diferença na eficiência de encapsulação pode
ser explicada com base no coeficiente de partição da dexametasona e do
etinilestradiol. Fármacos com o coeficiente de partição entre 1,7<log Poctanol/água<4
ficam divididos entre a fase lipídica e aquosa e são facilmente perdidos dos
lipossomas.
Fármacos
altamente
lipofílicos
com
log
Poctanol/água>5
ficam
completamente inseridos na bicamada lipídica dos lipossomas [GULATI et al,1998].
Como o etinilestradiol apresenta um log Poctanol/água igual a 3,731, maior que da
dexametasona (log Poctanol/água =1,772), foi evidente sua melhor capacidade de ser
encapsulado dentro dos lipossomas devido a sua maior lipofilicidade. Ao analisar a
estrutura química do etinilestradiol e da dexametasona observa-se que a presença
de 5 oxigênios (3 deles em radicais OH) e de 1 flúor na estrutura da dexametasona
aumenta a polaridade da molécula, já o etinilestradiol possui apenas 2 oxigênios (em
radicais OH) apresentando característica mais apolar quando comparado à
dexametasona (Figura 42). Em virtude da baixa eficiência de encapsulação dos
lipossomas contendo dexametasona, estes não foram utilizados em análises
posteriores com nanopartículas magnéticas.
A
B
Figura 42: Estrutura química da dexametasona (A) e do etinilestradiol (B).
Utilizando-se 50mM de fosfatidilcolina na preparação dos lipossomas foi
possível encapsular uma quantidade limite de aproximadamente 4 mg de
etinilestradiol. Isso foi observado quando adicionou-se quantidades crescentes de
fármaco 5, 8 ou 10 mg
não tendo um aumento significativo na quantidade de
fármaco encapsulada permanecendo na faixa de 4 mg. Como as preparações nas
quais foram adicionados 8 e 10 mg de etinilestradiol não elevaram a eficiência de
encapsulação, as análises posteriores foram realizadas com 5 mg de etinilestradiol
em 50 mM de fosfatidilcolina, sendo que a razão molar entre o etinilestradiol
(6,75mM) e a fosfatidilcolina (50mM) foi de 1:7.
5.5 RESSONÂNCIA PARAMAGNÉTICA ELETRÔNICA (RPE)
O
estudo
de
ressonância
paramagnética
eletrônica
possibilitou
o
entendimento a respeito da interação da dexametasona e do etinilestradiol com o
fosfolipídio dos lipossomas. A dexametasona apresenta em sua estrutura química
um anel esteróide da mesma forma que o colesterol. O colesterol melhora as
características de empacotamento da bicamada lipídica, diminuindo a fluidez da
membrana [KIRBY et al, 1980] em temperaturas abaixo da temperatura de transição
de fase do fosfolipídeo. No entanto, através do estudo de RPE verificou-se que a
dexametasona promoveu maior mobilidade à membrana, provocando então um
efeito oposto ao que acontece com o colesterol. Já com etinilestradiol verificou-se
um pequeno aumento na rigidez da bicamada lipídica.
A)
B)
C)
Figura 43: A) Estrutura química da dexametasona; B) Estrutura química do Colesterol C) Estrutura
química do etinilestradiol.
83
(2T//)
2T//=51.3
(2T//)
PC5D
2T//=53.4
PCCOL
2T//=53.7
PCETCOL
2T//=52.4
PCET
2T//=53.2
PC5D
2T//=54.2
PCCOL
2T//=53.2
PCCOLDEX
2T//=51.6
PCDEX
Figura 44: A) Espectros de Ressonância Paramagnética Eletrônica de lipossomas contendo
fosfatidilcolina (verde); fosfatidilcolina:colesterol (azul); fosfatidilcolina:dexametasona: colesterol
(vermelho), fosfatidilcolina:dexametasona (preto) B) fosfatidilcolina (verde); fosfatidilcolina:colesterol
(azul); fosfatidilcolina:etinilestradiol: colesterol (laranja); fosfatidilcolina:etinilestradiol (roxo); Varredura
de campo em 100 Gauss.
Na Figura 44A, ao analisar amostras contendo apenas PC e amostras
contendo PC e etinilestradiol, o 2T//
variou de 51,3 (PC) para
52,4 (PCET),
mostrando um aumento no 2T//, o que indica aumento na rigidez da bicamada
lipídica. Em ambos os experimentos (Figura 44 A e B), nas amostras contendo
PC:colesterol confirma-se a diminuição da fluidez da bicamada lipídica, através de
um aumento no valor de 2T// com relação a amostra controle de fosfatidilcolina. Na
Figura 44B, observa-se que na amostra contendo apenas PC (controle) o 2T// foi de
53,2G. Na presença de dexametasona houve uma diminuição do 2T//, o que indica
que a bicamada lipídica está mais fluida. Isso foi confirmado quando foi efetuado o
ensaio com amostra contendo dexametasona, PC e colesterol, resultando em valor
do 2T// igual ao da amostra que continha apenas PC, anulando o efeito de
enrijecimento provocado pelo colesterol.
84
Apesar da semelhança na estrutura química entre a dexametasona e o
colesterol, a dexametasona apresenta uma série de grupamentos polares (Figura
43) que podem provocar o aumento na fluidez da membrana, em função da maneira
com que eles se arranjam no interior da bicamada lipídica. Estas características
também
foram
responsáveis
pela
baixa
eficiência
de
encapsulação
da
dexametasona, fazendo com que as formulações contendo dexametasona fossem
excluídas dos ensaios com nanopartículas magnéticas, sendo usado apenas o
etinilestradiol como fármaco modelo nestes ensaios. Ao analisar a estrutura química
do etinilestradiol, verifica-se que a quantidade de grupamentos polares é menor
quando comparado ao da dexametasona, não provocando assim o mesmo efeito
que a dexametasona provoca na memmbrana lipídica.
5.6 QUANTIFICAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS
5.6.1 Quantificação de ferro
A reação colorimétrica para a quantificação do ferro gera uma solução de
coloração alaranjada. Promoveu-se a varredura do espectro de absorbância dessa
solução, verificando que o comprimento de onda de máxima absorção foi 509 nm
(Figura 45).
Figura 45: Varredura da solução gerada por reação colorimétrica, realizada em espectrofotômetro
UV/Vis.
85
Utilizando esse comprimento de onda foi obtida uma curva analítica de
calibração, cujo coeficiente de correlação foi igual a 0,999 e a equação da reta foi
expressa por y= 5,1889x-0,0273 (Figura 47). As soluções da curva de calibração
apresentavam coloração alaranjada em diferentes intensidades como pode ser
observado na Figura 46.
Figura 46: Soluções utilizadas na curva de calibração.
Figura 47: Curva de calibração para a determinação da quantidade de ferro na amostra. Realizada
em espectrofotômetro UV/Vis.
5.6.2 Determinação da quantidade de nanopartículas magnéticas encapsulada
A quantidade de magnetita ou maghemita e o número de nanopartículas
magnéticas encapsuladas dentro dos lipossomas foi calculada para amostras de
lipossomas preparadas com diferentes quantidades de fosfatidilcolina ou de
fosfatidilcolina e fármaco e uma quantidade fixa de fluido magnético de 50µl.
86
Após a eluição pela coluna de exclusão por tamanho, os magnetolipossomas
recuperados estavam livres de NPM não encapsuladas.
Para proceder ao doseamento das nanopartículas encapsuladas, as frações
coletadas da coluna contendo NPM dentro de lipossomas foram reunidas e
homogeneizadas. Retirou-se dessa mistura 100µl, para efetuar a reação
colorimétrica e posterior leitura da absorbância em espectrofotômetro.
Para exemplificar essa análise, os dados apresentados a seguir referem-se à
preparação de lipossomas contendo 50mM de fosfatidilcolina e 50µl de
nanopartículas magnéticas revestidas com carboxildextrana.
Através da equação da curva de calibração do ferro determinada
espectrofotometricamente, obteve-se a concentração de 3,883x10-2 µmol/mL de Fe
no volume de 10 mL, formados por 100 µl das frações coletadas na coluna e 9,9 mL
de reagentes utilizados para a realização da reação. Logo, a quantidade de ferro nas
frações de lipossomas foi calculada multiplicando-se esse valor por 10:
, sendo encontrada a concentração de ferro em 100 µl das
frações de lipossomas contendo NPM encapsuladas.
Em seguida, a quantidade total de ferro que passou pela coluna foi 0,3883/0,1
= 3,883 µmol de Ferro. Isso corresponde à quantidade de ferro que eluiu na coluna
dentro dos lipossomas após a aplicação de 0,3 mL da preparação. A quantidade
total
de
ferro
encapsulado
foi
encontrada
através
do
cálculo:
, os 2 mL referem-se à quantidade total de lipossomas
preparados.
A partir da concentração molar de Ferro encapsulado dentro dos lipossomas e
conhecendo a massa de uma partícula e a massa molar da magnetita, consegue-se
chegar ao número de nanopartículas magnéticas encapsuladas e à massa de
magnetita. Da seguinte maneira, encontra-se a quantidade de ferro em g:
1 mol de ferro--------55,845 g de Fe
2,588x10-5 mol-------x
x= 0,001254 g de Ferro
Logo, a massa de magnetita na amostra é encontrada através do seguinte
cálculo: 231,531g de Fe3O4 (massa molar do oxido de ferro) x 0,001254 g , tudo isso
é dividido por 167,535g de Fe (massa de 3 átomos de ferro em g) que será igual a
0,001998g de magnetita (aproximadamente 2 mg de magnetita).
87
O número de partículas magnéticas encapsuladas foi calculado de duas
formas: pela massa (g) Fe3O4 de cada partícula magnética, e a partir do
conhecimento da estrutura cristalina e parâmetro de rede da magnetita. Os
resultados estão apresentados na Tabela 3. A variação dos resultados obtidos entre
as duas formas de cálculo para a determinação do número de nanopartículas
magnéticas encapsuladas é da ordem de 10-15% cuja significância fica reduzida
diante da magnitude do dado quantitativo encontrado, da ordem de 1014 a 1015
nanopartículas encapsuladas.
A eficiência de encapsulação foi calculada como a razão a quantidade de
magnetita ou maghemita em gramas e a quantidade de fosfatidilcolina em mol.
Tabela 3: Eficiência de encapsulação de ferro e de quantidade de nanopartículas magnéticas
revestidas com carboxildextrana encapsuladas dentro dos lipossomas com e sem etinilestradiol (EE).
A) lipossomas sem etinilestradiol ; B) lipossomas com etinilestradiol.
A)
Amostra
Quantidade de
Quantidade de
Eficiência de encapsulação
Fe3O4 (mg)
nanopartícula magnética
(g de Fe3O4/mol de PC)
(*)
PC 10mM
PC 20mM
PC 50mM
1,733
(**)
14
7,55x10
14
1,606
6,99x10
14
1,998
8,706x10
14
8,741x10
86,66
14
8,101x10
40,16
15
1,007x10
19,98
B)
Amostra
Quantidade
Quantidade de nanopartícula
Eficiência de encapsulação (g
de Fe3O4 (mg)
magnética
de Fe3O4/mol de PC)
(*)
PC 10mM +
1mg EE
PC 20mM +
2mg EE
PC 50mM+
5mg EE
(**)
14
2,106
9,177x10
1,936
8,43x10
3,046
1,327x10
14
15
15
1,06218x10
14
48,4
15
30,5
9,7666x10
1,5362x10
(*) cálculo pela massa (g) Fe3O4
(**) cálculo a partir da estrutura cristalina da magnetita
105,5
Tabela 4: Eficiência de encapsulação de ferro e de quantidade de nanopartículas magnéticas
revestidas com citrato encapsuladas dentro dos lipossomas com e sem etinilestradiol (EE). A)
lipossomas sem etinilestradiol; B) lipossomas com etinilestradiol.
A)
Amostra
Quantidade de
Quantidade de nanopartícula
Eficiência de
γ-Fe2O3 (mg)
magnética
Encapsulação (g de γ-Fe2O3
/mol de PC)
PC 10mM
PC 20mM
PC 50mM
3,373
3,139
3,915
15
1,8666x10
168,5
15
1,7364x10
78,47
15
2,1659x10
39,15
B)
Amostra
Quantidade de
Quantidade de
Eficiência de encapsulação (g de
γ-Fe2O3 (mg)
nanopartícula magnética
γ-Fe2O3 /mol de PC)
PC 10mM +
1mg EE
PC 20mM +
2 mg EE
PC 50mM +
5 mg EE
15
168,5
15
87,95
3,369
1,864x10
3,518
1,946x10
4,68
2,59x10
15
46,8
Os resultados apresentados pelas Tabelas 3 e 4, A e B demonstram que os
magnetolipossomas contendo fármaco foram capazes de encapsular uma maior
quantidade de NPM quando comparados aos magnetolipossomas sem fármaco.
Observa-se que a quantidade de óxido de ferro em g/mol de PC foi maior quando se
usou 10mM de fosfatidilcolina. Nos lipossomas contendo magnetita revestida com
carboxildextrana, a razão entre a quantidade de óxido de ferro (g) e a quantidade de
fosfatidilcolina em (mol) foi menor quando comparada às amostras com maghemita
estabilizadas com citrato. Isto pode ser explicado quando se analisa a estrutura
química do citrato e da carboxildextrana (Figura 48). O carboxildextrana é uma
molécula mais volumosa (Figura 49) quando comparado ao citrato, gerando NPM
revestidas que apresentem volume maior, ocupando maior espaço dentro do
compartimento aquoso dos lipossomas, fazendo com que menor quantidade possa
ser encapsulada.
89
A)
B)
Figura 48: A) Estrutura química do Citrato; B) Estrutura química da dextrana.
Figura 49: Representação de uma nanopartícula magnética revestida com carboxildextrana.
Sabaté et al (2007) foram capazes de encapsular uma quantidade máxima de
22,19 g de Fe2O3/mol de PC. No presente trabalho, foi encapsulada uma quantidade
máxima de 168,5 g de Fe2O3/mol de PC quando foi utilizada maghemita estabilizada
com citrato em lipossomas de PC 10mM contendo 1 mg de etinilestradiol, permitindo
um conteúdo alto de maghemita encapsulada. Kiwada et al (1986), conseguiram
encapsular uma quantidade máxima de 41,1 5 g de Fe2O3/mol de PC.
O conteúdo de NPM encapsuladas deve ser suficiente para responder a um
campo
magnético
externo
[Dandamudi
et
al,
2000].
Desta
forma,
os
magnetolipossomas obtidos neste trabalho demonstram capacidade de resposta
superior ao campo magnético externo quando comparados àqueles descritos pela
literatura.
90
5.6.3 Estabilidade da preparação quanto à perda de nanopartículas magnéticas
encapsuladas durante o armazenamento
Os resultados dos ensaios realizados para verificar a possível perda de
nanopartículas magnéticas durante o armazenamento estão representados nas
Tabelas 5 e 6.
Nos lipossomas contendo nanopartículas magnéticas revestidas com citrato,
observa-se que não ocorreu perda de nanopartículas magnéticas durante o período
de 1 mês de armazenamento. A preparação manteve-se estável, não sendo
observado nenhum precipitado aparente no fundo do frasco. Sabaté et al, 2007 não
notaram mudanças na estabilidade da preparação durante as 3 semanas em que
estas permaneceram armazenadas, após este período houve o aparecimento de um
precipitado preto.
A manutenção da estabilidade também pode ser observada através dos
gráficos (51 A e B) e Tabelas (6 A e B) os quais demonstram que o número de
nanopartículas magnéticas nas amostras que não continham fármaco foi mantido,
não ocorrendo perda alguma após 24horas e 7 dias de armazenamento das
amostras. Nas amostras contendo fármaco uma pequena perda foi observada
apenas na amostra contendo 50mM de PC e 5 mg de etinilestradiol.
Nos lipossomas contendo magnetita revestida com carboxildextrana houve
perda de NPM durante o período 7 dias de armazenamento das amostras. Contudo,
a perda ocorreu de maneira mais pronunciada nas amostras contendo fármaco,
quando
comparada
à
sem
fármaco,
no
período
de
24
horas.
Nos
magnetolipossomas sem fármaco a diminuição do número de NPM acentuou-se
após 7 dias de armazenamento, já nas amostras com fármaco, após 24 horas
observou-se queda no número de NPM, especialmente na amostra com 50mM de
PC e 5 mg de etinilestradiol.
91
Tabela 5: Número de nanopartículas magnéticas revestidas com carboxildextrana encapsuladas em
lipossomas com e sem etinilestradiol (EE), em função do tempo de armazenamento (A) sem
etinilestradiol; (B) com etinilestradiol.
A)
Amostra
PC 10 mM
0h(100%)
14
8,741 x10
PC 20 mM
8,101 x10
PC 50 mM
Número de nanopartículas magnéticas encapsuladas
24h
%
168 h
14
14
8,156 x10
93,3
4,75081 x10
14
14
8,211 x10
15
100
14
1,007 x10
9,406 x10
PC 10 mM + 1 mg EE
PC 20 mM + 2 mg EE
PC 50 mM + 5 mg EE
Número de nanopartículas magnéticas encapsuladas
0h(100%)
24h
%
168 h
%
15
1,062 x10
14
9,766 x10
15
1,54 x10
14
8,521 x10
14
7,316 x10
7,8 x10
14
80,23
75
50,64
67,04
14
79,95
8,05637 x10
B)
Amostra
14
5,43093 x10
93,35
14
60,93
14
85,21
6,471 x10
8,321 x10
14
4,22 x10
27,40
%
54,35
A)
B)
Figura 50: Número de nanopartículas magnéticas em função do tempo de amostras de lipossomas
contendo NPM revestidas com carboxildextrana A) lipossomas sem etinilestradiol; B) lipossomas com
etinilestradiol.
93
Tabela 6: Número de nanopartículas magnéticas dentro revestidas com citrato em lipossomas com e
sem etinilestradiol, em função do tempo de armazenamento (A) sem etinilestradiol; (B) com
etinilestradiol.
A)
Amostra
PC 10 mM
Número de nanopartículas magnéticas encapsuladas
0h
24h
%
168 h
%
1,866x1015
1,866x1015x1015 100 1,866x1015 100
PC 20 mM 1,736 x1015
1,736 x1015
100 1,736 x1015 100
PC 50 mM 2,166 x1015
2,180 x1015
100 2,166 x1015 100
B)
Número de nanopartículas magnéticas encapsuladas
0h
24h
%
168 h
%
15
15
15
PC 10 mM + 1 mg EE 1,864x10
2,009x10
100 2,017 x10
100
Amostra
PC 20 mM + 2 mg EE 1,946x1015
2,017 x1015 100
2,060x1015
100
PC 50 mM + 5 mg EE 2,590x1015
2,45 x1015
94,6 2,083x1015
80,4
94
A)
B)
Figura 51: Número de nanopartículas magnéticas em função do tempo em amostras de lipossomas
contendo NPM revestidas com citrato. A) lipossomas sem etinilestradiol; B) lipossomas com
etinilestradiol.
95
5.7 BIRREFRINGÊNCIA MAGNÉTICA
Com o estudo de birrefringência magnética foi possível estimar a média do
número de nanopartículas magnéticas em um aglomerado (conteúdo interno de
cada magnetolipossoma) dado pelo valor de Q.
As NPM estão encapsuladas dentro das vesículas lipídicas, ficando
aglomeradas, de modo que com a aplicação do campo magnético ocorre o
alinhamento formando aglomerados maiores (Figura 52). Assim, o valor de Q
encontrado refere-se à média do número de nanopartículas presentes nos
aglomerados dentro de um lipossoma.
Figura 52: Representação esquemática de um lipossoma contendo nanopartículas magnéticas
alinhadas devido à aplicação de um campo magnético.
Através da Figura 53, que representa a intensidade do sinal em função do
campo magnético, observa-se que para os magnetolipossomas é necessário um
campo magnético menor para que ocorra a rotação das nanopartículas magnéticas e
a geração do sinal expresso pela intensidade. Aglomerados pré-existentes de
nanopartículas magnéticas irão promover a rotação do eixo de luz polarizada mais
facilmente que nanopartículas magnéticas isoladas. Como, nos lipossomas, as NPM
ficam envoltas por uma bicamada de fosfolipídios conseqüentemente aglomeradas,
o campo necessário para que se obtivesse um aumento do sinal foi menor. No fluido
96
magnético, as NPM estão dispersas isoladamente no liquido dispersante, então para
que ocorra a rotação das NPM e a conseqüente geração de sinal é preciso aplicar
um campo magnético maior. Foi necessário um campo magnético acima de 1000 Oe
para que ocorresse a elevação da intensidade do sinal no fluido magnético, já nos
magnetolipossomas um campo magnético de 10 Oe promove a elevação da
intensidade do sinal.
Figura 53: Gráfico de intensidade em função do campo magnético.
A Figura 54, que representa a birrefringência magnética em função do campo
magnético de preparações contendo 10 mM de PC com e sem colesterol, permite
observar que a preparação lipossomas que não continha colesterol apresentou um
valor de Q e um sinal de birrefringência magnética menor que o encontrado na
preparação lipossomas com colesterol. Isso ocorre pois a média de diâmetro das
vesículas com colesterol é de 198 nm, enquanto que das vesículas sem colesterol é
de 143 nm. Com o diâmetro da vesícula menor, o espaço disponível para que ocorra
a organização de maneira alinhada será também menor, resultando em menor
número de nanopartículas magnéticas no aglomerado. Isso gera um menor valor de
Q. Assim, lipossomas menores encapsulam menor quantidade de partículas
magnéticas, ocasionando menor sinal de birrefringência magnética
97
0,12
50µl of MF
10mM de PC
Q = 7.40 ± 0.19
com colesterol
Birrefringência magnética (a.u.)
0,10
Q = 5.01 ± 0.25
0,08
sem colesterol
0,06
0,04
0,02
0,00
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
Campo magnético (kOe)
Figura 54: Birrefringência magnética em função do campo magnético de amostras de lipossomas
com colesterol (diâmetro médio 198 nm) e sem colesterol (diâmetro médio 143 nm).
Na Figura 55 está apresentada a birrefringência magnética em função do
campo magnético para lipossomas com diferentes quantidades de fosfatidilcolina
(10mM e 20mM), obtidos com a mesma quantidade de fluido magnético (25µl) e com
média de diâmetro semelhante (≈ 138nm). Observa-se que os valores de Q para as
duas preparações foram semelhantes, em virtude da semelhança na média do
diâmetro. No entanto, a intensidade do sinal de birrefringência magnética foi maior
para as amostras preparadas com 20 mM de fosfatidilcolina, pois a quantidade de
lipossomas contendo nanopartículas magnéticas é o dobro com relação às
preparações contendo PC 10mM, gerando assim um maior sinal de birrefringência
magnética. Como, em ambas as amostras, as vesículas possuem diâmetro médio
semelhante, as preparações com 20mM de fosfatidilcolina possuem um número
maior de vesículas que as preparações com apenas 10mM de PC.
98
A)
Birrefringência magnética (a.u.)
0,10
25µl of MF
0,08
Q = 13.36 ± 0.25
0,06
0,04
20mM PC
Q = 12.25 ± 0.72
10mM PC
0,02
0,00
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
Campo magnético (kOe)
B)
Figura 55: A) Birrefringência magnética em função do campo magnético de amostras de lipossomas
com 10mM e 20mM de fosfatidilcolina. B) Histograma da intensidade de espalhamento de luz em
função da distribuição do tamanho de amostras com 10 e 20mM de fosfatidilcolina.
A Figura 56 apresenta a birrefringência magnética de amostras F1 e F2
(frações eluídas da coluna de exclusão), mostrando que o valor de Q da amostra F1
foi superior ao da amostra F2. Isso ocorre porque na amostra F1 estão os
99
lipossomas com maior diâmetro, que eluem mais rapidamente saindo nas primeiras
frações. Nas frações posteriores saíram os lipossomas de diâmetro inferior,
contendo número menor de NPM encapsuladas. O sinal de birrefringência
magnética para amostra F1 foi maior que para a amostra F2.
Diante disso, verifica-se na Figura 57 de distribuição do tamanho em função
do espalhamento de luz que a amostra F1 teve uma média de diâmetro igual a 118
nm que é 10 nm superior à média de diâmetro da F2 (108nm) espaço suficiente para
acomodar mais uma NPM cujo diâmetro médio é de 9 nm, como pode ser observado
na Figura 53 através do valor de Q.
20
F1
F2
Q = 5 .01 ± 0 .18
Birrefringência magnética (a.u.)
16
12
Q = 3 .72 ± 0 .15
8
4
0
0,0
0,2
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
Campo magnético (kOe)
1,6
Figura 56: Birrefringência magnética em função do campo magnético de amostras de lipossomas
contendo nanopartículas magnéticas em diferentes momentos de eluição pela coluna cromatográfica
de exclusão por tamanho. F1 – diâmetro médio 118 nm e F2 – diâmetro médio 108 nm.
100
Figura 57: Intensidade de espalhamento de luz em função da distribuição do tamanho de amostras
F1 e F2 . ____ F1 (diâmetro médio 118nm); ____ F2 (diâmetro médio 108nm).
O estudo de birrefringência magnética em função do tempo (Figura 58) de
amostras contendo fosfatidilcolina na concentração de 50mM e colesterol na
concentração de 25mM demonstrou que após 72 horas do preparo das amostras de
magnetolipossomas
não
ocorreu
perda
por
vazamento
de
nanopartículas
magnéticas encapsuladas, ou seja, os valores de Q permaneceram constantes.
Lesieur et al (2003), demonstraram que as nanopartículas magnéticas com diâmetro
acima de 8 nm são muito grandes para atravessar a bicamada de fosfolipídio
passivamente e ocorrerá vazamento apenas quando houver a formação de poros na
bicamada.
101
6
24 h
Birrefringência magnética (a.u.)
PC 50mM/ Col 25mM
48 h
5
72 h
4
Q = 5.01 ± 0.05
Q = 5.51 ± 0.05
3
Q = 5.59 ± 0.06
2
0,1
1
10
100
1000 10000
Campo magnético (Oe)
Figura 58: A) Birrefringência magnética em função do campo magnético de amostras de
lipossomas contendo nanopartículas magnéticas em função do tempo transcorrido do preparo
da amostra.
Conforme exposto anteriormente observa-se que foi possível encapsular em
um mesmo nanocarreador um fármaco lipofílico (etinilestradiol) e nanopartículas
magnéticas recobertas com moléculas hidrofílicas (carboxildextrana e citrato)
estendendo perspectivas para a utilização de outros fármacos com essa mesma
característica em magnetolipossomas, para serem utilizados em diversas aplicações
terapêuticas.
6 CONCLUSÕES
A técnica de hidratação do filme lipídico mostrou-se eficiente para a
obtenção dos lipossomas contendo nanopartículas magnéticas revestidas
com citrato ou com carboxildextrana, contendo dexametasona ou
etinilestradiol.
A técnica de espalhamento de luz foi satisfatória para a determinação da
média do diâmetro dos lipossomas e da distribuição de tamanho das
vesículas na amostra, possibilitando assim um acompanhamento do perfil
dos lipossomas.
A cromatografia de exclusão por tamanho mostrou ser uma técnica
simples e eficaz para a separação de lipossomas contendo fármaco
encapsulado do fármaco livre presente na amostra.
A eficiência de encapsulação do etinilestradiol dentro de lipossomas
(utilizando 50mM de fosfatidilcolina) foi de aproximadamente 4 mg. Já a
eficiência de encapsulação da dexametasona não foi satisfatória, devido
ao baixo log P do fármaco.
A análise da interação da dexametasona com os fosfolipídios da bicamada
lipídica dos lipossomas através da técnica de RPE demonstrou que a
dexametasona promove aumento na fluidez da membrana lipídica.
A técnica colorimétrica para a quantificação do ferro mostrou-se uma
técnica viável para a determinação do número de nanopartículas
magnéticas encapsuladas.
O estudo de estabilidade em função do tempo mostrou que as
nanopartículas
magnéticas
revestidas
com
citrato
tiveram
menor
vazamento quando comparado às NPM revestidas com carboxildextrana.
103
A
técnica
de
birrrefringência
magnética
demonstrou
ser útil
na
determinação do número de nanopartículas magnéticas presentes dentro
de um aglomerado que está dentro de um lipossoma.
Com o estudo de birrefringência magnética foi possível certificar que as
nanopartículas magnéticas estão realmente encapsuladas dentro da
vesícula lipídica.
O estudo de birrefringência magnética em função do tempo mostrou que o
número de NPM não variou durante 72 horas de armazenamento.
O trabalho realizado mostrou que a encapsulação de nanopartículas
magnéticas dentro de lipossomas com ou sem fármaco é possível e viável,
empregando uma técnica simples, abrindo perspectivas para a utilização
terapêutica desse sistema.
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