protocolo acessível para aula prática sobre fatores físicos e

ISSN: 1677-3118
Nº. 01/2012
Artigo A
PROTOCOLO ACESSÍVEL PARA AULA PRÁTICA SOBRE FATORES FÍSICOS E
QUÍMICOS QUE AFETAM A INTEGRIDADE DAS BIOMEMBRANAS
Thiago Barros Galvão; Diana Aline Nôga Morais Ferreira; Leonardo Emmanuel Fernandes de Carvalho;
Natânia Carol Cavalcante Rezende; Eduardo Luiz Voigt*
Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, Caixa Postal 1501, CEP 59072-970, Natal – Rio Grande do Norte. Telefone: 84 3211-9209
Fax: 84 3215-3424. [email protected]
*Autor para correspondência
Resumo:
O presente trabalho tem como objetivo a reformulação de um protocolo usado em aula prática
para demonstrar os fatores que afetam a integridade das biomembranas. Cubos de beterraba
foram usados como modelo experimental, pois os danos causados nas membranas podem ser
visualizados pelo extravasamento de betacianinas, pigmentos hidrossolúveis presentes nos
vacúolos. Os testes foram realizados em baterias experimentais analisando-se o efeito de fatores
físicos e produtos químicos presentes no cotidiano do aluno. Para testar a temperatura, os cubos
foram colocados em tubos de ensaio submetidos à condição de calor, frio e do efeito combinado
de ambos, em diferentes tempos de exposição. Quando produtos químicos foram testados, os
cubos foram tratados com solventes orgânicos (álcool e acetona comercial) ou substâncias
polares e anfipáticas (desinfetante à base de detergente, detergente comercial, água oxigenada e
água sanitária). Os resultados obtidos foram discutidos quanto à capacidade dos fatores físicos e
químicos causarem danos às membranas. A reformulação deste protocolo com o uso de
reagentes simples, baratos e encontrados na vida cotidiana do aluno, foi capaz de representar
com clareza o efeito produzido pelos fatores testados, viabilizando a realização desta aula prática
em espaços didáticos com condições limitadas.
Palavras-chave: Prática de laboratório – Membranas biológicas – Permeabilidade.
Abstract:
The aim of the current work is to review a protocol used in practical classes to demonstrate some
factors that affect biomembrane integrity. Sugar-beet fragments were utilized as the experimental
model as membrane damage could be visualized by leakage of betacyanins, hydrophilic pigments
accumulated in the cell vacuoles. The tests were carried out as discrete experiments utilizing
physical agents and chemical products present in the student daily routine. To test the effect of
temperature, sugar-beet fragments were submitted to heat, cold or both at different times of
exposition. When chemical products were tested, sugar-beet fragments were exposed to organic
solvents (common alcohol and acetone) or polar and amphipathic substances (disinfectant,
detergent, hydrogen peroxide, and sodium hypochlorite). The obtained results were discussed in
terms of the capacity of the physical and chemical factors to cause membrane damage. The review
of this protocol using reagents that are present in the student daily routine were able to
demonstrate clearly the effect of the different tested factors, allowing the utilization of this practical
class under limited conditions.
Keywords: Practical classes – Biological membranes – Permeability.
Galvão, T. B.; Ferreira, D. A. N. M.; Carvalho, L. E. F.; Rezende, N. C. C.; Voigt, E. L.
I.
A2
INTRODUÇÃO
O ensino de Biologia Celular e Molecular é uma tarefa desafiadora, pois essa
disciplina trata de estruturas e processos microscópicos, sendo assim fundamentada em
conceitos abstratos. Além disso, esta área do conhecimento tem apresentado muitos
avanços recentes, estando sujeita a mudanças decorrentes do surgimento de novos
conceitos [1]. Para alcançar a apreensão destes conceitos de maneira clara e eficiente, o
professor necessita atualizar continuamente seus conhecimentos teórico-práticos, bem
como fazer uso de instrumentos didáticos adequados [2].
Algumas estratégias são largamente empregadas em sala de aula por demonstrar
rendimento e praticidade. Figuras esquemáticas, gráficos, vídeos explicativos e modelos
tridimensionais, são alguns dos recursos utilizados para demonstrar estruturas e
processos da maneira como eles ocorrem in vivo. No entanto, as aulas práticas se
destacam como instrumentos didáticos promissores, porque tornam o conteúdo mais
atrativo, envolvente e concreto [3].
As aulas práticas propiciam uma oportunidade para a vivência de todas as etapas
do método científico, nas quais a observação e a compreensão de fenômenos levam o
aluno ao registro sistematizado de dados e à formulação de hipóteses [4, 5, 6]. A
manipulação de técnicas utilizadas em laboratório permite que o docente exercite
habilidades e competências, como a cooperação com os colegas, a organização na
bancada e a manipulação de equipamentos, imprescindíveis na formação acadêmica [7].
Além de permitirem a interação do aluno com os conceitos vistos em teoria, as
aulas práticas realizam papel importante no aprendizado, ao fazer com que o professor
estimule no aluno o caráter investigativo e a busca pelo conhecimento científico como
uma conquista pessoal [8]. Apesar disso, a maioria das escolas apresenta escassez de
material biológico, reagentes e equipamentos, devido ao custo elevado ou acesso restrito
[5]. Como consequência, esta atividade acaba sendo banida da maioria das instituições
públicas de ensino como escolas de nível fundamental e médio, assim como de
faculdades e centros universitários [1].
Neste trabalho, um protocolo utilizado em aula prática para demonstrar os fatores
que afetam a integridade das biomembranas foi reformulado com o intuito de tornar esta
atividade mais acessível e demonstrar como produtos utilizados no cotidiano podem ser
amplamente aplicados [6]. A escolha deste protocolo está relacionada à natureza abstrata
do conteúdo, além das metodologias utilizadas para o estudo das membranas geralmente
requererem equipamentos sofisticados e custos elevados, sendo necessárias iniciativas
para viabilizar à realização destas demonstrações. Como modelo experimental, foram
utilizados cubos de beterraba. Além de ser acessível e adequado aos propósitos da aula
prática, este material possibilita ao aluno a observação de agentes que causam lesões
nas membranas pelo extravasamento do pigmento hidrossolúvel betacianina, armazenado
nos vacúolos.
Neste sentido, o objetivo deste trabalho é reformular um protocolo de aula prática
com o intuito de demonstrar a ação de agentes físicos e químicos sobre as membranas
biológicas, utilizando produtos presentes na vida cotidiana do aluno. A reformulação deste
protocolo não apenas viabiliza a realização de aulas práticas em condições mais
limitadas, mas pode servir de modelo para a readequação de outros protocolos.
II.
MATERIAIS E MÉTODOS
A aula prática foi proposta em baterias experimentais, avaliando a ação de fatores
físicos e químicos sobre a permeabilidade das biomembranas. No primeiro momento, foi
avaliado o efeito da temperatura, submetendo os cubos de beterraba ao calor e ao frio de
forma isolada ou combinada. Posteriormente, foram utilizados produtos químicos
Galvão, T. B.; Ferreira, D. A. N. M.; Carvalho, L. E. F.; Rezende, N. C. C.; Voigt, E. L.
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rotineiramente usados como produtos de limpeza. Estas substâncias foram separadas
pela sua natureza química em solventes orgânicos, substâncias polares e anfipáticas.
II.I EFEITO DA TEMPERATURA
Materiais








Para determinar o efeito da temperatura foram utilizados os seguintes materiais:
Beterraba
Estilete
Pinça
Fogareiro
Placa de Petri
Tubos de ensaio
Pipetas graduadas
Água destilada
Métodos
Organize uma bateria de tubos de ensaio numerados de acordo com a tabela 1 e
transfira os volumes com o auxílio de pipetas.
Tabela 1. Preparação da prática para avaliação do efeito da temperatura.





Tubo
Volume (5 mL)
Tratamento
1
Água destilada
25 º C (controle)
2
Água destilada
100º C - 20 s (calor)
3
Água destilada
-18º C - 15 min (frio)
4
Água destilada
-18º C -15 min + 100 º C - 20 s (calor + frio)
Corte quatro cubos de beterraba e os lave em água corrente até a água ficar
incolor;
Coloque um cubo no tubo 1 e outro no tubo 2, mantendo em repouso por 15 min;
Coloque dois cubos sobre uma placa de Petri levando ao congelador (-18 ºC) por
15 min. Logo depois, transfira os cubos para os tubos 3 e 4;
Exponha ao calor em banho fervente (100 ºC) os tubos 2 e 4, durante 20 s e resfrie
à temperatura ambiente;
Observe e compare o extravasamento do pigmento.
II.II EFEITO DE SOLVENTES ORGÂNICOS
Materiais
Para testar o efeito dos solventes orgânicos, foram utilizados os seguintes
materiais e reagentes:
 Beterraba
 Estilete
 Pinça
 Tubos de ensaio
 Pipetas graduadas
 Filme de PVC
 Água destilada
Galvão, T. B.; Ferreira, D. A. N. M.; Carvalho, L. E. F.; Rezende, N. C. C.; Voigt, E. L.


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Acetona comercial (removedor de esmalte)
Álcool comercial a 96º GL
Métodos
Organize uma bateria de tubos de ensaio numerados de acordo com a tabela 2 e
transfira os volumes com o auxílio de pipetas.
Tabela 2. Preparação da prática para avaliação do efeito dos solventes.
Tubo
Volume (5 gotas)
Tubo
Volume (5 mL)
1A
Água destilada
1B
Água destilada
2A
Acetona comercial
2B
Água destilada
3A
Álcool comercial
3B
Água destilada




Corte três cubos de beterraba e os lave em água corrente até a água ficar incolor;
Coloque um cubo em cada um dos tubos 1A, 2A, 3A, vede com filme PVC e incube
à temperatura ambiente por 5 min;
Em seguida, transfira os cubos para os tubos 1B, 2B e 3B;
Observe e compare o extravasamento do pigmento.
II.III EFEITO DE SUBSTÂNCIAS POLARES E ANFIPÁTICAS
Materiais
Para verificar o efeito de substâncias polares e anfipáticas, foram utilizados os
seguintes materiais e reagentes:
 Beterraba
 Estilete
 Pinça
 Tubos de ensaio
 Pipetas graduadas
 Água destilada
 Desinfetante comercial 20% (v/v)
 Detergente comercial 10% (v/v)
 Água oxigenada comercial 10 volumes
 Água sanitária comercial 1:4 (v/v)
Métodos
Organize uma bateria de tubos de ensaio numerados de acordo com a tabela 3 e
transfira os volumes com o auxílio de pipetas.
Tabela 3. Preparação da prática para avaliação do efeito de substâncias polares e anfipáticas.
Tubo
Volume (5 mL)
Tubo
Volume (5 mL)
1C
Água destilada
1D
Água destilada
2C
Desinfetante comercial 20%
2D
3C
Detergente comercial 10%
3D
Água destilada
4C
Água oxigenada comercial
4D
Água destilada
5C
Água sanitária comercial
5D
Água destilada
Galvão, T. B.; Ferreira, D. A. N. M.; Carvalho, L. E. F.; Rezende, N. C. C.; Voigt, E. L.




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Corte cinco cubos de beterraba e os lave em água corrente até a água ficar incolor;
Coloque um cubo em cada um dos tubos 1C, 2C, 3C, 4C e 5C, incubando à
temperatura ambiente por 5 min;
Em seguida, transfira os cubos para os tubos 1D, 2D, 3D, 4D e 5D;
Observe e compare o extravasamento do pigmento.
III.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
No presente trabalho, pretende-se demonstrar que protocolos de aulas práticas
relativamente elaborados podem ser reformulados de modo a viabilizar a sua utilização
em condições limitadas de reagentes e equipamentos. Neste sentido, são propostos
métodos acessíveis para ilustrar os efeitos de fatores físicos e químicos sobre as
biomembranas. O protocolo original sobre fatores que afetam a permeabilidade das
membranas tem sido empregado em aulas práticas de Fisiologia Vegetal. Com a
reformulação, este protocolo pode ser empregado na ilustração de fenômenos
relacionados a outras disciplinas, como a Biologia Celular e a Bioquímica. Além disso, a
execução desta prática permite o ensino do método científico e o desenvolvimento de
diversas habilidades de manipulação e interpretação.
O efeito dos diferentes agentes químicos e físicos sobre as membranas é estimado
a partir do extravasamento de betacianinas, que são pigmentos hidrossolúveis contidos
nos vacúolos das células de beterraba [13]. Para que haja o extravasamento das
betacianinas, é necessário romper a membrana plasmática e a vacuolar das células de
beterraba, caracterizando danos de membranas [14].
III.II EFEITO DA TEMPERATURA
O efeito da temperatura sobre as membranas biológicas pode ser testado de forma
simples, utilizando equipamentos comuns e facilmente disponíveis, como lamparina e
geladeira. A exposição dos fragmentos de beterraba ao calor (100 °C) causou danos de
membrana progressivos, à medida que aumentava o tempo de exposição (10, 15 e 20 s).
Os danos causados pelo calor são consequências da desorganização das biomoléculas
que as compõem [14]. Desta forma, o calor promove o aumento na mobilidade dos
lipídeos de membrana, assim como a desnaturação das proteínas associadas, permitindo
assim, o extravasamento das betacianinas para o meio externo [9,11,12].
O aumento do tempo de exposição ao frio (10, 15 e 20 min) também ocasionou
danos progressivos nas membranas, indicados pelo aumento do extravasamento das
betacianinas. O frio é capaz de promover a formação de cristais de gelo no meio
intracelular, os quais podem causar rupturas nas membranas durante o descongelamento
[10,13].
O efeito combinado de baixa e alta temperatura acarreta o aumento dos danos de
membrana e intensifica o extravasamento de betacianinas (Figura 1). A combinação de
frio (-18 °C) e calor (100 °C) por tempos de 20 min e 20 s, respectivamente, foi suficiente
para causar mais danos do que os tratamentos aplicados isoladamente. Além disso, é
notável que um menor tempo de exposição ao calor causa mais danos às membranas
que um maior tempo de tratamento com frio, pois os efeitos do calor são mais drásticos
[14].
Galvão, T. B.; Ferreira, D. A. N. M.; Carvalho, L. E. F.; Rezende, N. C. C.; Voigt, E. L.
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Figura 1: Efeito de fatores físicos sobre a integridade de biomembranas em tecidos de beterraba. (a)
Controle (temperatura ambiente); (b) Calor (100 °C); (c) Frio (-18 °C); (d) Calor e frio.
III.II EFEITO DE SOLVENTES ORGÂNICOS
Assim como os fatores físicos, solventes orgânicos causam o
extravasamento das betacianinas para o meio externo, por meio de danos na membrana
plasmática e na membrana vacuolar [13-14]. Para avaliar o efeito destes solventes, foram
selecionadas duas substâncias, álcool e acetona comerciais, ambas facilmente
encontradas em drogarias. Dentre os agentes químicos, estes foram os que mais
afetaram a integridade das membranas, provocando maiores danos (Figura 2).
A acetona e o álcool são solventes que apresentam caráter hidrofóbico e agem
solubilizando as caudas de ácidos graxos dos lipídeos e desnaturando as proteínas
associadas, pois são capazes de interferir nas interações hidrofóbicas que dão
estabilidade a estes componentes nas membranas [11-12]. Por apresentar caráter mais
hidrofóbico do que o álcool, a acetona teve maior efeito sobre as membranas,
aumentando assim os danos observados (Figura 2).
Figura 2: Efeito de solventes orgânicos apolares sobre a integridade de biomembranas em tecidos de
beterraba. (a) Controle (água destilada); (b) Acetona comercial; (c) Álcool comercial 70% (v/v).
Galvão, T. B.; Ferreira, D. A. N. M.; Carvalho, L. E. F.; Rezende, N. C. C.; Voigt, E. L.
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III.III EFEITO DE SUBSTÂNCIAS ANFIPÁTICAS E POLARES
O efeito de substâncias anfipáticas e polares pode ser facilmente demonstrado
utilizando substâncias encontradas em supermercados e farmácias, como desinfetante
comercial à base de detergente, detergente comum, água oxigenada e água sanitária
comercial.
São denominadas anfipáticas as substâncias que possuem uma porção hidrofílica
(com afinidade pela água) e uma porção hidrofóbica (sem afinidade pela água) [12]. A
porção hidrofóbica do detergente se intercala entre os lipídeos de membrana e causa a
formação de micelas, o que destrói a integridade da membrana. Além disso, a porção
hidrofóbica dos detergentes é capaz de se ligar com as regiões hidrofóbicas das proteínas
de membrana, formando complexos detergente-proteína [9]. Já a porção hidrofílica, que
no caso do detergente e do desinfetante é iônica, causa desnaturação de diversas
proteínas de membrana, o que também afeta a integridade das membranas [9]. Como o
efeito do detergente e do desinfetante é similar (Figura 3), pode-se atribuir o maior
extravasamento de betacianinas provocado pelo desinfetante ao fato de esse possuir em
sua composição tensoativos não iônicos, além do princípio ativo (compostos quaternários
de amônio), que também atua na desorganização das membranas.
Em comparação com os demais tratamentos, as substâncias exclusivamente
polares, como o peróxido de hidrogênio e o hipoclorito de sódio, aparentemente causaram
os menores danos às membranas (Figura 3). Tendo em vista que estes compostos são
agentes oxidantes capazes de danificar tanto as proteínas quanto os lipídios de
membrana [12], seria esperado que provocassem elevado extravasamento. No entanto, a
coloração menos intensa do meio de reação não necessariamente indica menor extensão
de danos às membranas. Considerando que as betacianinas podem ser degradadas na
presença de agentes oxidantes [15], a interpretação do dano causado às membranas com
base na coloração do meio de reação deve ser cautelosa.
Figura 3: Efeito de substâncias anfipáticas e polares sobre a integridade de biomembranas em tecidos de
beterraba. (a) Controle (água destilada); (b) Desinfetante comercial à base de detergente 20% (v/v); (c)
Detergente comercial 10% (v/v); (d) Água oxigenada comercial (10 volumes); (e) Água sanitária comercial
1:4 (v/v).
Galvão, T. B.; Ferreira, D. A. N. M.; Carvalho, L. E. F.; Rezende, N. C. C.; Voigt, E. L.
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III.IV APLICAÇÕES DIDÁTICO-PEDAGÓGICAS.
O desenvolvimento desta atividade prática permite que o aluno desenvolva
habilidades, como o manuseio de equipamentos e utensílios, e competências, como
capacidade de organização, trabalho em grupo e capacidade de desenvolver o
pensamento lógico, observando um fenômeno e formulando algumas hipóteses. Além
disso, por ser uma atividade em laboratório, proporciona o exercício de uma postura
profissional, a qual é exigida pelo ambiente de trabalho.
Durante a aula prática é necessário direcionar a atividade dos alunos, afim de
aumentar a fixação de conceitos importantes, por meio de questões pertinentes que
incitem a curiosidade. Desta forma, sugerimos questões que podem ser utilizadas pelo
professor ao final ou durante a aula prática. Neste sentido, é interessante que as questões
abranjam desde os conceitos mais básicos até possíveis aplicações do conhecimento
apreendido. São elas:
1.
Por que a exposição a temperaturas elevadas (100º C) causa danos às
membranas mais rapidamente do que a exposição a temperaturas mais baixas (-18º C)?
2.
Que relação pode ser observada entre a hidrofobicidade do composto e sua
capacidade de causar danos às membranas?
3.
O que são substâncias anfipáticas e de que forma elas podem atuar sobre
as membranas?
4.
Como os diferentes desinfetantes (álcool, desinfetante comercial, água
sanitária e água oxigenada) demonstrados atuam para eliminar microorganismos?
5.
De que forma os agentes oxidantes podem lesar os tecidos? Considerando
que muitas células eucarióticas produzem alguns destes agentes durante o metabolismo,
por que não sofrem lesões constantes?
As questões iniciais (1 a 3) visam fixar alguns conceitos e mecanismos importantes
contemplados na atividade, como a capacidade do calor de desorganizar membranas; a
relação entre hidrofobicidade do composto e sua capacidade de solubilizar os lipídeos de
membrana; e o conceito de substâncias anfipáticas. Já as questões seguintes (4 e 5)
visam levar o aluno a estabelecer relações, como a capacidade das substâncias
causarem danos à membrana com sua propriedade antimicrobiana.
IV.
CONCLUSÃO
Concluímos que a reformulação do protocolo sobre fatores que afetam a
integridade das biomembranas com o uso de reagentes simples, baratos e encontrados
na vida cotidiana do aluno, foi capaz de representar com clareza o efeito produzido
fatores químicos e físicos testados. Além disso, a reformulação deste protocolo ampliou
os tipos de materiais que podem ser utilizados e as áreas do conhecimento nas quais
pode ser aplicado, viabilizando a realização desta prática em espaços didáticos com
condições limitadas.
V.
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