obtenção de derivado de ibuprofeno e ácido acetil salicílico

UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE - UNESC
GABRIEL HAHN HENDLER
OBTENÇÃO DE DERIVADO DE IBUPROFENO E ÁCIDO ACETIL
SALICÍLICO POR SÍNTESE ENZIMÁTICA UTILIZANDO A
ENZIMA COMERCIAL
CRICIÚMA, NOVEMBRO DE 2010
GABRIEL HAHN HENDLER
OBTENÇÃO DE DERIVADO DE IBUPROFENO E ÁCIDO ACETIL
SALICÍLICO POR SÍNTESE ENZIMÁTICA UTILIZANDO A
ENZIMA COMERCIAL
Trabalho de Conclusão de Curso, aprovado
pela Banca Examinadora para obtenção do
grau de Farmacêutico Generalista do Curso de
Farmácia da Universidade do Extremo Sul
Catarinense, UNESC.
CRICIÚMA, 25 DE NOVEMBRO DE 2010
BANCA EXAMINADORA
Prof. Eduardo João Agnes – UNESC
Orientador
Profª Patrícia Amaral – UNESC
Examinadora
Profª Simone Gnoatto - UNESC
Examinadora
OBTENÇÃO DE DERIVADO DE IBUPROFENO E ÁCIDO ACETIL
SALICÍLICO POR SÍNTESE ENZIMÁTICA UTILIZANDO A
ENZIMA COMERCIAL
Gabriel H. HENDLER1, Eduardo João AGNES2.
1
Acadêmico do Curso de Farmácia da Universidade do Extremo Sul Catarinense -
UNESC.
2
Professor Orientador do Curso de Farmácia da Universidade do Extremo Sul
Catarinense - UNESC.
Departamento de Farmácia – Universidade do Extremo Sul Catarinense – Criciúma –
SC Brasil.
Correspondência: Gabriel Hahn Hendler, Rua João Cardoso Rolin, nº 1123, Bairro
Centro, Três Cachoeiras – RS, Brasil. CEP: 95580 000
E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO
As enzimas são macromoléculas catalisadoras de sistemas biológicos altamente
eficientes e com uma grande diversidade de reações químicas devido a sua capacidade
de se ligar especificamente a uma ampla gama de moléculas. Grande parte das enzimas
conhecidas são proteínas, as quais possuem notáveis dispositivos moleculares que
determinam o perfil das transformações químicas uma vez que estas possuem alto poder
catalítico e grande especificidade (BERG; TYMOCZKO & STRYER, 2008).
As funções de todos os organismos vivos dependem de reações químicas, as quais
são catalisadas por enzimas específicas para cada sítio. Sem a atuação dessas enzimas,
as condições para reações dentro da célula tornam-se incompatíveis com a
sobrevivência. Assim, as enzimas desempenham um papel vital na função celular
normal (GENNARO, 2004).
A utilização de enzimas em diferentes campos como forma de aceleração ou de
rotas alternativas para obtenção de determinados produtos tem se tornado comum nas
indústrias química, farmacêutica, cosmética e de alimentos. O avanço das pesquisas nos
últimos anos levou a uma melhor compreensão do comportamento catalítico das
enzimas e, associado a engenharia molecular, conduziram a novas aplicações de várias
enzimas, tais como proteases, acilases, oxidases, amilases, glicosidases, celulases e
lipases (VILLENUEVE, 2007).
Além das vantagens inquestionáveis, existe uma série de problemas práticos na
utilização de enzimas. Dentre estes problemas, destaca-se: o elevado custo de
isolamento e de purificação de enzimas, a instabilidade das suas estrutura quando
isolada de seu ambiente natural e a dificuldade de detecção de substâncias inibidoras.
Vários métodos têm sido propostos para superar essas limitações, sendo que uma das
mais bem sucedidas é a imobilização enzimática (KRAJEWSKA, 2004).
Trabalhos desenvolvidos por Pereira et al. 2001 e Oliveira et al. 2000, mostraram
que a imobilização da lípase em quitosana apresentou resultados satisfatórios na técnica
de imobilização por adsorção física, sendo que houve um aumento na estabilidade da
lípase na reação de esterificação. Dessa forma, considerando um desempenho
satisfatório da quitosana como matriz de imobilização de lípase, julga-se conveniente
um estudo mais detalhado referente à aplicação do sistema imobilizado resultante em
reações típicas catalisadas pela lípase.
As lipases, em particular, constituem uma classe de enzimas de grande
importância na biocatálise em meio orgânico. Sua boa estabilidade na presença de
solventes orgânicos propicia a utilização na catálise de reações químicas envolvendo
substratos insolúveis em meio aquoso e em etapas intermediárias de processos químicos
convencionais. (BEVILAQUA, 2005).
As enzimas hidrolíticas são biocatalisadores versáteis capazes de catalisar reações
de
hidrólise,
esterificação,
interesterificação,
transesterificação,
aminólise
e
lactonização, tanto em meio aquoso como em meio orgânico. As lipases são
amplamente utilizadas em uma variedade de segmentos biotecnológicos como na
indústria de alimentos, no desenvolvimento de aromas e maturação de queijos; na
produção de detergentes e na indústria oleoquímica, na hidrólise de óleos e gorduras e
na síntese de biosurfactantes. No entanto, a sua aplicação atinge maior destaque na
indústria farmacêutica, onde esta proporciona a obtenção de fármacos ou insumos
farmacêuticos em suas formas enantioméricas ativas com elevado grau de pureza óptica,
uma vez que as lipases são capazes de reconhecer moléculas quirais e atuam de forma
seletiva em um dos isômeros de uma mistura racêmica (FABER, 2000 apud
CARVALHO et al.,, 2005).
Oss processos biocatalíticos demonstram um campo promissor dentro das novas
tecnologias para síntese de compostos com alto valor agregado, uma vez que a reação
de esterificação enantiosseletiva catalisada por lipases tem sido utilizada com sucesso
na resolução dos profenos (MARGOLIN,
(
1993 apud CARVALHO et al.,
al 2005).
Além disso, a biocatálise está se tornando uma importante ferramenta com grande
crescimento em companhias farmacêuticas e de química fina para obtenção de
intermediários farmacêuticos e de ingredientes ativos farmacêuticos, com o objetivo de
otimizar reações para o aumento da estereosseletividade
estereosseletividade e do rendimento além do
abrandamento das condições de reação. (ARNUM, 2007).
O ácido acetil salicílico
licílico é o mais usado nos salicilatos. Sua ação primaria é a
inativação da ciclo-oxigenase
oxigenase por acetilação irreversível da prostaglandinasintase,
enzima
zima que catalisa a primeira fase de biossíntese da prostaglandina a partir do ácido
araquidônico. (KOROLKOVAS & FRANÇA, 2008).
O outro fármaco que será utilizado é o ibuprofeno que foi introduzido
introd
como um
antiinflamatório não-esteróide
esteróide (AINEs) no Reino Unido em 1969 e nos Estados Unidos
Estados em 1974. Foi desenvolvido como resultado direto do problema associado ao
uso de corticóides no tratamento de irritação
i
e intolerância geral dos AINEs
AINE disponíveis
na época. (DAVIES, 1971; BUSSON et al, 1986).
Ibuprofeno, 2-(4-isobutilfenil)
isobutilfenil) ácido propiônico é um
um medicamento antianti
inflamatório não esteróide amplamente usado que pertence à família dos derivados do
ácido 2-aril propiônico
nico com um carbono assimétrico na segunda posição. Mesmo que o
S-(+)-enantiômero seja conhecido por ser cerca de 100 vezes mais ativo do que o seu
[R-(-)-enantiômero],
], o ibuprofeno é ainda comercializado
comercializad como racemato. Nos últimos
anos, vários métodos para a obtenção de compostos opticamente puros foram
publicados. Entre eles, o uso de enzimas
enzimas tem atraído muito interesse devido à sua
excelente estereosseletividade e condições brandas de reações (BERG; TYMOCZKO &
STRYER, 2008).
Com
om isso, analisando a característica química de determinados fármacos
pertencentes a classe dos antiinflamatórios
antiinflamatórios não esteroides, perceber que estes são
passíveis de sofrerem o processo de esterificação de sua estrutura, bem como o
Ibuprofeno e o Ácido Acetil Salícilico (AAS), os quais possuem um grupamento ácido
carboxílico em sua estrutura. A escolha dos
do medicamentos Ibuprofeno e o AAS foi em
função do seu fácil acesso e por suas características químicas como mostra o esquema 1.
1
Esterificação do AAS
O
O
Lipase-Livre
OH
O
CH3(CH2)6CH2OH
O
O
pH 7
25 0C
O
O
Esterificação do Ibuprofeno
Lipase-Livre
OH
O
CH3(CH2)6CH2OH
O
pH 7
25 0C
O
Esquema 1: Esterificação dos fármacos.
Nisso o presente trabalho buscou promover a esterificação destes fármacos por
meio da catalise enzimática proporcionada por lipases, buscando a obtenção de ésteres
com função farmacológica modificada ou ainda novos modos de utilização, como uma
possível via tópica.
MATERIAL E MÉTODOS
Materiais
Foram utilizado a lípase pancreática comercial adquirida de indústria Sigma
especializada. Como material de partida foi utilizado os fármacos (AAS e Ibuprofeno).
Outros reagentes utilizados foram solventes (acetona, álcool etílico, álcool octilico,
glutaraldeído 2,5%, hexano); sais (fosfato dibásico de potássio, fosfato monobásico de
potássio); bases (hidróxido de potássio), adquirida na industria Synth.
Aparelhos e equipamentos
Para a esterificação e imobilização da enzima foram utilizados o agitador
magnético, modelo Q-261-2 (QUIMIS); bomba á vácuo, modelo Q-355D2 (QUIMIS),
agitador de Kleine (BIOMIXER, TS 2000A), estufa (DELEO), IV e CCD.
Ativação do suporte
A quitosana foi embebida em solução de glutaraldeído 2,5% (v/v), tampão fosfato
de sódio 0,1M em pH na faixa entre 7 e 8, na proporção sólido líquido de 1:10 sendo
mantido sobre o agitação por 1 hora. Após este período, o suporte foi lavado
exaustivamente com água destilada e solução tampão de fosfato, sendo levado à estufa
(60 ºC) por 24 horas, como mostra o esquema 2 (PEREIRA et al 2001).
Ativação do suporte
Esquema 2: Ativação do suporte de quitosana.
Imobilização da lípase
Após o suporte ativado, este foi embebido em hexano na proporção 1:10 e
mantido sobre o agitação durante 2 horas. Após este período, para cada grama de
suporte ativado (matéria seca), foram adicionados 250 mg de lípase na forma livre. O
sistema foi mantido sob agitação até a completa evaporação do hexano,
hexano como mostra o
esquema 3 (PEREIRA et al, 2001).
Imobilização da lipase
Esquema 3: Imobilização
mobilização da enzima.
Determinação da atividade de esterificação
As amostras foram preparadas com replicações em frascos
frascos de Erlenmeyer de 125
mL e nestas foram adicionados 4 mL de álcool octílico,
octílico, 4 mL de solução tampão fosfato
de sódio 0,1 M (nos pHs de 6, 7 e 8), 0,125 mg de enzima e 100 mg de fármaco. Os
frascos ficaram a 25 ºC ou 37 ºC por 5 ou 10 minutos sob agitação.. Após o período,
período a
reação foi paralisada pela adição de 15 mL de uma mistura de acetona e etanol (1:1). A
determinação da atividade de esterificação por titulometria é baseada no método
utilizado por Aguiar e colaboradores (2010) que consiste na titulometria com solução de
KOH 0,02 M, utilizando fenolftaleína como indicador.
indicador Os cálculos foram realizados
pela equação (1) onde uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de
enzima que esterifica 1 µmol de ácido graxo por minuto de reação, nas condições do
ensaio.. Para cada análise de atividade, foi realizado um controle utilizando dos mesmos
reagentes, entretanto imediatamente inativado com a solução de acetona e etanol, ou
seja, tempo zero de atividade. As atividades foram expressas em µmoles/mg.min (U),
onde miligrama refere-se à massa de enzima livre ou imobilizada.
U(µmoles/ mg.min) = (Va - Vb) x M x 106
(1)
txm
onde: m = massa de enzima (mg); M = concentração da solução de KOH (M); t =
tempo de reação (minutos); Va = Volume de KOH gasto na titulação da amostra; Vb =
Volume do KOH gasto na titulação do branco.
Propriedades catalíticas da lípase livre e imobilizada em função do pH e da
temperatura
A lipase pancreática comercial na forma livre e imobilizada foi caracterizada
quanto à sua atividade específica em função do pH e da temperatura, bem como à sua
estabilidade térmica quando incubada em presença de solução-tampão. A influência do
pH e temperatura nas atividades da lipase livre e imobilizada foram estudadas
utilizando-se a reação de esterificação na faixa de pH entre 6 a 8, na temperatura de 25 e
37ºC (PEREIRA, 2001).
Análise qualitativa dos ésteres produzidos
As análises qualitativas das moléculas obtidas foram feitas por cromatografia em
camada delgada – CCD, para verificar a conversão em éster. Para isso, as moléculas
foram dissolvida em éter de petróleo e aplicada em uma placa cromatográfica contendo
sílica como fase estacionária. Os padrões empregados foram o ibuprofeno na primeira
amostra e AAS na segunda amostra além do álcool octílico utilizado, também
dissolvido em éter de petróleo. A fase móvel utilizada na cuba cromatográfica foi uma
mistura de éter de petróleo, éter etílico e ácido acético na proporção de 80:20:1,
respectivamente. As placas cromatográficas, após eluição, foram reveladas com
lâmpada UV e o Rf das manchas dos padrões e dos componentes das amostras foi
determinado e comparado (FERRARI, 2005; PINTO et al, 2005).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Sendo que o mecanismo de ação dos fármacos é inibir as enzimas
ciclooxigenases, o que podem interferir na atividade do biocatalizador, a imobilização
pode ser uma alternativa viável para obter-se um bom rendimento de atividade. Portanto
neste trabalho foram utilizadas a lipase livre e imobilizada em comparação para
determinar o melhor rendimento. Para isso, foi necessário a imobilizar a enzima em
quitosana com espaçador de glutaraldeído 2,5% como mostra a esquema 1. Estas foram
usadas em diversos experimentos, variando o pH e a temperatura para a esterificação
dos fármacos ibuprofeno e AAS com o objetivo de obter o melhor meio de reação.
Determinação da atividade de esterificação da lípase livre e imobilizada em
função da temperatura
O tempo de 5 e 10 minutos foram adotados para determinação da atividade
enzimática baseado em pesquisas e trabalhos já realizados por outros pesquisadores
como Aguiar e colaboradores (2010). Dessa forma, foi necessário determinar a melhor
faixa de temperatura onde a lipase livre e imobilizada expressam sua melhor atividade
catalítica para a esterificação dos fármacos.
As lípases são usualmente estáveis à temperatura ambiente, sendo que a maioria
apresenta uma atividade ótima na faixa de temperatura entre 30 a 40 ºC (TANG, 2006).
Sua termoestabilidade varia consideravelmente em função de sua origem.
Portanto, para a determinação da temperatura e pH ótimos da lipase livre e
imobilizada, variou-se a temperatura entre 25 e 37 ºC e o pH entre 6 a 8 nos
experimentos que foram utilizados os fármacos AAS e Ibuprofeno, como mostra a
Tabela 1.
Tabela 1: Determinação da atividade de esterificação das lipase livre e
imobilizada, dado em média de Unidade de Atividade (U).
AAS
pH
Atividade (U) 5`
minutos
Ibuprofeno
Atividade (U)
10` minutos
Atividade (U) 5`
minutos
Atividade (U)
10` minutos
Ensaio Realizado na Temperatura de 25°C, com a Lipase Livre
6
200
94,4
172,8
110,4
7
576
273,6
140,8
35,2
8
134,4
30,4
57,6
14,4
Ensaio Realizado na Temperatura de 37°C, com a Lipase Livre
6
0
0
0
0
7
387,2
194,4
0
0
8
78,4
0
0
0
Ensaio Realizado na Temperatura de 25°C e 37°C, com a Lipase Imobilizada
25°C
37°C
25°C
37°C
6
0
392
246,4
0
7
281,6
0
0
0
8
0
0
0
60,8
Pode-se observar que com os resultados da Tabela 1, que a máxima atividade da
lipase livre ocorreu com o fármaco AAS a 25 ºC no tempo de 5 minutos quando
alcançou 576 U. Enquanto a lipase imobilizada em quitosana apresentou uma atividade
máxima igual a 392 U com o AAS a 37 ºC no tempo de 10 minutos (Tabela 1).
Tanto a lipase livre quanto a imobilizada diminuíram sua atividade de
esterificação quando aumentou-se a temperatura. O aumento da temperatura pode
promover aumento da velocidade de desnaturação térmica da lípase reduzindo, a
velocidade de formação dos produtos. Os dados de atividade em função da temperatura
são úteis para estudar o efeito da temperatura sobre uma reação enzimática. Acima de
certo limite, à medida que se aumenta à temperatura, a atividade diminui, indicando a
inativação da enzima pelo efeito térmico (ZANIN, 2001).
Determinação da atividade de esterificação da lípase livre e imobilizada em
função do pH
A influência do pH na esterificação enzimática está correlacionada com o estado
de ionização de resíduos de aminoácido da enzima que são essenciais à esterificação.
Como as enzimas são proteínas e contém muitos grupos ionizáveis, estes podem estar
em diferentes estados de ionização, por isso, a atividade de esterificação é restrita a uma
pequena faixa de pH e na maioria dos casos há um pH ótimo definido (HARTMEIER,
1988). Nesse caso, a atividade da enzima deve ser então medida no pH ótimo.
Analisando os dados de atividade em função do pH observou-se que, a maior
atividade (576 U) da lipase livre frente ao AAS foi encontrada em pH 7,00 e para o
sistema imobilizada foi encontrada em pH 6,00 (392 U), indicando que a lipase
imobilizada apresentou uma maior estabilidade frente a um pH mais ácido. Já para o
ibuprofeno, observou-se que o pH ótimo de atividade é o pH 6, tanto para a enzima livre
quanto para a imobilizada.
Análise qualitativa dos ésteres produzidos por Cromatografia de Camada
Delgada (CCD)
As caracterização do comportamento em CCD das amostras, foram realizada
através da intensidade e valor de Rf.
Apesar de ser um método simples de análise, houve dificuldade em aplicar a
CCD, não tendo um resultado satisfatório. O eluente arrastou as amostras para o fronte
do eluente indicando que pode não ser o éter de petróleo, éter etílico e ácido acético, na
proporção de 80:20:1, respectivamente, a fase móvel adequada, já que não se sabe as
características do produto formado. Como também o éter de petróleo pode ser impróprio
para diluição das amostras, assim não obtendo um resultado satisfatório com a CCD.
Portanto existe a necessidade da repetição do método de analise ou utilização de
outro método como espectrofotometria na região do infravermelho, entretanto a
escassez de tempo para a elaboração do trabalho de conclusão de curso implicou em
deixar essas análises para o futuro.
A enzima por ter afinidade diferente ao substrato, provavelmente tenha mais
acesso ao sitio ativo para o AAS na forma livre, já para o ibuprofeno, a enzima
imobilizada teve uma melhor afinidade a esse substrato, pois ela torna-se mais estável
frente a variação de pH, temperatura e substratos diferentes. Com isso, os melhores
resultados de uma provável esterificação, foram com o fármaco AAS utilizando a lipase
livre. E na lipase imobilizada o ibuprofeno teve melhor esterificação mas menor
atividade em comparação com a esterificação do AAS.
CONCLUSÃO
Ao término do trabalho e posterior análise dos resultados pode-se observar que a
lipase, quando imobilizada possui uma atividade menor em comparação com a enzima
livre, porém sua resistência (estabilidade) aumenta significativamente.
Observa-se que a enzima livre trabalhou melhor na temperatura de 25ºC e a
imobilizada na temperatura de 37ºC. Assim quando em condições ideais de temperatura
a atividade catalítica da enzima utilizada pode aumentar.
A enzima lipase quando imobilizada teve menor rendimento quando comparada
com a enzima livre, porém a imobilizada trabalhou melhor numa faixa de pH 6 e por
mais tempo, diferenciado da livre que o pH com melhor atividade foi o pH 7 e atuou por
menor tempo.
Testes preliminares foram realizados para dar inicio a uma linha de pesquisa na
área de síntese de fármacos quirais por catálise enzimática, e desta forma alguns ensaios
deverão ser refeitos, (CCD, Infravermelho) além de novas analises deverão ser
desenvolvidas para otimização destas metodologias para o futuro.
Conclui-se com isso, que a utilização de enzimas lipase na esterificação como
biocatalisador mostrou-se potencialmente útil, possibilitando a obtenção de compostos
opticamente puros e assim, promovendo desenvolvimento na área de síntese de
fármacos.
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