relação macho: fêmea de embriões bovinos

RELAÇÃO MACHO: FÊMEA DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO
DE ACORDO COM O ESTÁGIOS DE DESENVOLVIMENTO
RELATIONSHIP MALE:FEMALE OF BOVINE EMBRYOS IN VITRO PRODUCED
ACCORDING TO DEVELOPMENT STAGES
Camila de Menezes Watanabe – Graduanda em Engenharia Agronômica –
Unisalesiano – [email protected]
Marcelo Carnelli Frade – Mestre em Ciência Animal – Unesp –
[email protected]
Camila da Silva Frade – Doutora em microbiologia – Unesp –
[email protected]
RESUMO
A grande ocorrência de machos com o uso da produção in vitro de embriões
bovinos tem levado a estudos sobre o desvio na proporção macho:fêmea. O objetivo
do presente trabalho foi avaliar a relação macho:fêmea de acordo com o estágio de
desenvolvimento embrionário. Foram feitas aspirações foliculares guiadas por
ultrassom em doadoras da raça Nelore e recuperados os oócitos, os quais foram
fecundados in vitro com doses de sêmen de um único touro, os prováveis zigotos
oriundos destes acasalamentos foram cultivados até o dia 7 pós-fecundação. Os
embriões produzidos foram classificados (blastocisto/blastocisto expandido) e
envasados. Estes foram transferidos para receptoras, previamente sincronizadas.
Transcorrido 60 dias após a transferência dos embriões, foi realizado o diagnóstico
de gestação e sexagem fetal. Houve um maior número de embriões fêmeas entre os
blastocistos expandidos (348 embriões) contra os machos (322 embriões), entre os
blastocistos a proporção inverteu, sendo 159 fêmeas contra 183 machos. As fêmeas
apresentaram desenvolvimento embrionário mais rápido que os macho.
Palavras-chave: blastocisto. Sexagem. Sêmen.
INTRODUÇÃO
No sistema de produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, tem sido
observado um grande número de embriões machos. Vários estudos têm reportado
essa maior proporção de machos entre os embriões mamíferos produzidos in vitro
(AVERY et al., 1992; CARVALHO et al., 1996; KING et al., 1991; MARQUANT-LEGUIENNE et al., 1992; PEDORARO et al., 1998, HASLER et al., 1995; MASSIP et
al., 1996), fato este que pode limitar a aplicação da técnica de PIV, sobretudo em
rebanhos bovinos com aptidão leiteira.
Segundo Gutiérrez-Adán et al. (1996, 1998) embriões machos da espécie
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bovina desenvolvem-se mais rápido até o estágio de blastocisto, sendo assim uma
maior porcentagem destes embriões atingem o estágio de blastocisto expandido.
Podendo assim, justificar o elevado número de bezerros machos nascidos de
embriões produzidos in vitro (BEHBOODI et al., 1997). Esses achados condizem
com os de (AVERY et al., 1989; SELLER et al., 1987; ITOH et al., 1986; TSUNODA
et al., 1985), os quais encontraram 95% de embriões machos entre os blastocistos
expandidos PIV.
A glicose parece ser a responsável por este evento, estando envolvida na
ocorrência do desvio na proporção macho:fêmea resultando na diferente velocidade
de desenvolvimento entre os sexos (GUTIERREZ et al., 1993). Tiffin et al. (1991)
constataram que o metabolismo da glicose é significativamente maior em embriões
bovinos macho do que fêmea. A presença de radicais de oxigênio no meio de cultivo
também parece participar do mecanismo que determina este desvio macho:fêmea
relacionado com a velocidade de desenvolvimento. Estes radicais, embora
apresentem ação citotóxica, possuem também efeito estimulante sobre o
desenvolvimento dos embriões (RIEGER et al., 1992) e são encontrados em níveis
mais baixos nos embriões fêmeas do que nos machos (PEIPO et al., 1995)
Essas diferenças estão potencialmente relacionadas à expressão de genes
na fase na pré-implantação, os quais podem ser responsáveis pelo desenvolvimento
mais rápido dos embriões machos. Dois genes localizados no cromossoma X, a
glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) e hipoxantina fosforribosil transferase
(HPRT), estão envolvidos no controle da quantidade de radicais de oxigênio e,
portanto, eles podem ter influência no desenvolvimento do embrião. A expressão
diferencial de G6PD e HPRT no estágio inicial do desenvolvimento confirma que as
diferenças entre os sexos são evidentes antes da diferenciação gonadal. Estas
diferenças podem ser responsáveis pelo desenvolvimento mais rápido na cultura de
embriões bovinos machos PIV (GUTIERREZ et al., 2000).
O papel das enzimas ligadas ao cromossomo X envolvidas no metabolismo
de energia, especialmente de G6PD, a primeira enzima da pentose via de fosfato
(PPP), tem sido considerada como um possível indicador das diferenças de sexo
(RIEGER et al., 1992). A via pentose fosfato é quatro vezes mais ativa nos embriões
fêmea (TIFFIN et al., 1991), além disso esta enzima também desempenham outras
funções, tais como a desintoxicação de radicais de oxigénio (PEIPPO E
BREDBACKA, 1995). Estes radicais não estão apenas envolvidos em mecanismos
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de dano celular, mas eles também têm um efeito estimulante do crescimento
(RIEGER et al., 1992). O nível mais baixo de radicais de oxigênio nos embriões
fêmea, devido à dose dupla de HPRT, pode ser responsável pelo retardamento no
desenvolvimento; portanto, machos, com níveis de radicais de oxigênio adequado,
desenvolvem-se mais rápido do que os blastocistos fêmeas (GUTIERREZ et al.,
2000). Estes efeitos podem explicar porque os embriões PIV mostram um desvio
significativo da proporção de macho:fêmea, já que são expostos a condições
ambientais (oxigênio e luz) que facilitam a formação de radicais de oxigênio.
OBJETIVO
Avaliar a relação macho:fêmea em embriões bovinos produzidos in vitro, de acordo
com o estágio de desenvolvimento embrionário.
MATERIAL E MÉTODOS
Aspiração de oócitos das fêmeas doadoras
Doadoras das raças Nelore foram aspiradas para a coleta dos oócitos via
punção folicular guiada por ultrassom (OPU). Os animais foram contidos e foi
realizada a anestesia epidural caudal com 5 mL de lidocaína 2%, a fim de facilitar a
manipulação transretal. A vulva e a região perineal foram lavadas com água e secas
com papel toalha. Cada ovário foi localizado por palpação retal e direcionado para o
transdutor (5 MHz, probe transvaginal, Aloka SSD 500). Após a identificação dos
folículos presentes foi realizada a punção dos folículos com diâmetro superior a 3
mm. Os oócitos foram coletados em tubo cônico de 50 mL (Marca BD) com auxílio
de bomba vácuo (VMAR-5100, Cook Veterinary Products, Austrália) a uma pressão
de 80 mmHg. Após o procedimento de OPU, os oócitos foram lavados em
membrana filtrante com solução tamponada de fosfato (PBS, Nutricell), mantida a
temperatura de 38°C. Em seguida, foi realizada a contagem e classificação dos
oócitos viáveis. Os oócitos selecionados como viáveis foram enviados para o
laboratório para a realização dos procedimentos referentes às etapas de maturação,
fecundação e cultura in vitro.
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Produção in vitro dos embriões
Para a realização do procedimento de maturação in vitro (MIV), grupos de 20
a 25 oócitos foram transferidos para placas de Petri (35x10 mm) em gotas de 60 µL
meio base de maturação (MM-b), constituído de TCM-199 (M-3769, Sigma Co., St.
Louis, USA), 2,2 mg/mL de bicarbonato de sódio, 50 µg/ml de piruvato de sódio, 50
µg/mL de sulfato de gentamicina, suplementado com 1 g/mL de FSH (Folltropin®V, Bioniche Inc., Canadá), 5 µg/mL de LH (Lutropin® Bioniche Inc., Canadá) e 10%
de SFB (Nutricell Ltda, Brasil). As gotas foram dispostas sob óleo mineral. A
incubação foi realizada em estufa de cultura (Forma Scientific, USA), em atmosfera
úmida, com 5% CO2 e a 39oC por um período de 24 horas. No procedimento de
fertilização in vitro (FIV) foi realizada a seleção espermática pela técnica de
gradiente de Percoll. Utilizou-se doses de sêmen de um único touro. Desta forma,
em um tubo de 15 mL foi adicionado o volume de 1mL de Percoll a 45% e no fundo
do tubo, 1 mL de Percoll a 90%. Os tubos foram colocados em estufa de CO 2,
durante 1 hora. Após esse período, uma palheta de sêmen de touro escolhido para o
acasalamento, foi descongelada a 37oC por 30 segundos. A amostra de sêmen foi
cuidadosamente, depositada na superfície da solução de Percoll a 45% e o tubo foi
submetido à centrifugação a 700 x g, por 20 minutos. Após a centrifugação, o
sobrenadante foi removido e o “pellet” ressuspendido em 50 µL de meio TALP-FERT
(acrescido de 20 µg/mL de heparina e PHE: 2 mM de penicilamina, 1mM de
hipotaurina e 250 mM de epinefrina). Posteriormente, foi realizada a contagem
espermática em câmara de Neubauer (5 µL da suspensão de espermatozóides em
95 µL de solução formol-salina). A motilidade e o vigor dos espermatozóides foram
avaliados
por
microscopia
óptica.
Os
oócitos
foram
co-incubados
com
espermatozóides (concentração final de 1 x 10 6 sptz/100 µL), em gotas de meio
TALP-FERT, em atmosfera úmida a 5% de CO2 a 39oC durante 20 horas. Na cultura
in vitro (CIV) as células do cumulus foram removidas parcialmente, através de
sucessivas pipetagens, e os prováveis zigotos foram transferidos para gotas de meio
de cultura SOF-m (modificado), onde permaneceram durante as primeiras 52 horas.
Ao final desse período, ou seja, 72 horas pós-fecundação (PF) a clivagem foi
verificada e 50% de meio fresco foi adicionado às gotas. Este procedimento foi
repetido com 120 horas PF. A cultura dos embriões foi realizada sob as mesmas
condições descritas para a MIV e FIV. O desenvolvimento embrionário foi
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monitorado às 72, 144 e 168 horas pós-fecundação. No dia 7 (D7) os embriões
resultantes da produção in vitro foram classificados segundo estágio de
desenvolvimento embrionário em blastocisto inicial (Bi), blastocisto (BI), blastocisto
expandido (Bx) ou blastocisto eclodido (Be), envasados e transportados à
temperatura de 36°C até o local onde estavam as receptoras, as quais receberam os
embriões.
Sincronização dos estros e das ovulações no protocolo de TETF
As receptoras receberam dispositivo intravaginal contendo progesterona
(Cronipress 1g; Biogênesis, Curitiba - PR). Na colocação do dispositivo as novilhas
receberam 1 mg de Benzoato de Estradiol (Bioestrogen 1mg; Biogênesis, Curitiba PR), via IM. O dispositivo permaneceu no animal durante 8 dias. No momento da
retirada do dispositivo as novilhas receberam 0,150 mg de D-Cloprostenol
(Croniben 0,075mg; Biogênesis, Curitiba - PR), 300 UI de gonadotrofina coriônica
equina (Novormon 5000 UI; Intervet Schering, Cotia - SP) e 0,6mg de cipionato
de estradiol (ECP 2 mg/mL; Pfizer, São Paulo - SP), todos via IM.
As receptoras receberam os embriões e 60 dias após a transferência dos
embriões para as receptoras foi realizado o diagnóstico de gestação e sexagem
fetal.
Análise Estatística
A análise da diferença entre os embriões machos e fêmeas de acordo com o
estágio de desenvolvimento embrionário foi feita pelo teste de qui-quadrado, sendo
considerado diferença significativa para p<0,05.
RESULTADOS
Houve um maior número de embriões fêmeas entre os blastocistos
expandidos (348 embriões) quando comparado aos machos (322 embriões), já entre
os blastocistos a proporção inverteu, sendo 159 embriões fêmeas contra 183
machos. Sendo um total de 507 e 505 embriões, fêmeas e machos, respectivamente
(Figura 1).
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N° embriões
400
b
a
350
300
250
200
a
b
150
100
50
0
BL
BX
embrião macho
embrião fêmea
Figura 1. Embriões machos e fêmeas de acordo com o estágio de desenvolvimento
(blastocisto – BL e blastocisto expandido – BX).
a,bLetras
diferentes para o mesmo estágio embrionário, indica diferença significativa
(p<0,05).
DISCUSSÃO
A diferente velocidade de desenvolvimento entre os sexos, apesar de resultar
em uma maior proporção de machos entre os embriões mais desenvolvidos, não
necessariamente resulta em desvio na proporção macho:fêmea no número total dos
embriões PIV bovinos (CARVALHO et al., 1996; BREDBACKA e BREDBACKA,
1996 a,b; XU et al., 1992) e ovinos (BERNARDI e DELOUIS, 1996). Constatamos
em nosso estudo que entre os blastocistos expandidos PIV havia mais embriões
fêmeas.
Embora, o metabolismo total da glicose seja o dobro em embriões bovinos
machos, fato este que pode estar relacionado com o desenvolvimento mais rápido
dos embriões machos (RHEINGANTZ et al., 2004), levando a maior incidência de
machos entre os blastocistos expandidos, estes resultados não podem ser usados
para inferir o sexo dos embriões PIV, de forma não invasiva, já que há trabalhos
controversos.
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Por
exemplo,
alguns
estudos
mostram
que
os
embriões
machos
desenvolvem-se mais rápidos in vitro do que os embriões fêmeas nos bovinos
(Avery et al., 1992, Xu et al, 1992;. Lonergan et al., 1999), enquanto outros não
mostraram diferenças na estudando a mesma espécie (Holm et al., 1998), ou de
porcino (Kaminski et al., 1996). Estes resultados conflitantes podem ser devido a
heterogeneidade na cinética do embrião e subsequentes dificuldades do embrião ao
ser cultivado in vitro, em condições ótimas, ou variabilidade de acordo com o doador
de sêmen (Alomar et al., 2008).
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Estes resultados foram baseados o uso do sêmen de um touro, podendo ser
dada sequência ao estudo com o uso de sêmen de outros touros, a fim de fazer uma
análise comparativa. Ainda assim, pode-se concluir que o uso do estágio de
desenvolvimento embrionário como método não invasivo para sexagem de embriões
PIV não é uma técnica confiável em bovinos. Portanto, para atividades em que a
fêmea ou macho são determinantes, é recomendável o uso de sêmen sexado.
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