selecao de linhagens de microrganismos capazes de

SELEÇÃO DE LINHAGENS DE MICRORGANISMOS CAPAZES DE CRESCER
EM ALTAS CONCENTRAÇÕES DE GLICEROL
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Luis Mesquita de Sousa Filho, 2 Jefferson Almeida
Rocha, 2 Laércio de Sousa Saraiva, 3 Juliana Rodrigues
Rocha, 3 Nayara Dannielle Costa de Sousa, 3 Iveli
Ferreira Guimarães, 4 Rosimery Rodrigues de Oliveira,
5
Geraldo Eduardo da Luz Júnior
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Francisca Lúcia De Lima
1
2
Bolsista PIBIC-CNPq
Aluno do curso de Ciências Biológicas
3
Biólogas- Bolsistas GERATEC
4
5
6
Química
Professor do Curso de Química
Orientadora e Coordenadora do LABMICRO/GERATEC
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INTRODUÇÃO
A demanda mundial por energia vem estimulando a pesquisa e o
desenvolvimento de novas fontes renováveis. Entre elas, o biodiesel vem se destacando no
Brasil e demais países do mundo. Entretanto, estes produtos levam a produção de um
excedente inevitável de glicerol, que já vem causando preocupações no seu processamento
e transformação em produtos de interesse industrial (Dharmadi, et al., 2008). Para se ter
uma idéia, o crescimento da indústria do biodiesel criou um excedente de glicerol que
resultou em uma diminuição de 10 vezes nos preços ao longo dos últimos 2 anos (Yazdani
& Gonzalez, 2007). Esta diminuição dos preços representa um problema para a produção
de glicerol e das indústrias de refino, afetando a viabilidade econômica da indústria do
biodiesel (McCoy, 2006; Dharmadi, et al., 2008). No Brasil que deve produzir 1,2 bilhões
de litros de biodiesel no ano de 2008, a quantidade de glicerina produzida deve ser de 120
milhões de litros (10% do total de biodiesel produzido). Levando a um excedente de
glicerina no mercado e conseqüentemente remetendo o preço para valores irrisórios. Essa
situação torna-se mais preocupante quando se verifica que esse volume de glicerina
corresponde somente à adição de 3% de biodiesel ao diesel no Brasil que tem um programa
Governamental de Biodiesel o qual prevê a adição de 5% já em 2010.
O co-produto de biodiesel, na sua forma final de descarte na fábrica (glicerina
bruta) é composta por água, álcool, sabões, ácidos graxos livres, triglicerídeos e glicerina o
constituinte em maior concentração. A purificação da glicerina bruta, proveniente das
indústrias de biodiesel por processos alcalinos, a maioria atualmente, é realizado através
das seguintes etapas: a evaporação do excesso de álcool; a neutralização dos álcalis com
ácido sulfúrico, onde se obtém dois produtos, a glicerina loira e a matéria graxa; a glicerina
loira é destilada, para a obtenção de glicerina pura. Esse processo demanda instalações em
aço inoxidável e um consumo constante de ácido que tem valor por litro, próximo ou
superior ao da glicerina obtida. Nesse processo, a obtenção da glicerina exige uma central
de vácuo (consumo de energia elétrica) e aplicação de energia térmica para aquecimento
do sistema a temperaturas acima de 160 °C. Levando-se em consideração o procedimento
acima descrito, a fermentação da glicerina bruta apresenta-se como um processo
alternativo, sobre o qual apresentamos uma discussão a seguir.
O glicerol apresenta uma abundante fonte de carbono, que pode ser aproveitada
para fermentação anaeróbica por microrganismos. O desenvolvimento de processos para
3
converter glicerol bruto em produtos de valor mais elevado é uma necessidade urgente. A
utilização de glicerol como matéria-prima em processos de fermentação ainda tem outra
vantagem, dada a natureza altamente reduzida dos átomos de carbono do glicerol,
combustíveis e produtos químicos gerados a partir dele tem rendimentos mais elevados do
que os obtidos a partir de açucares comuns, como a glicose ou xilose (Gonzalez, et al.,
2008). Para obtermos plenamente essas vantagens, a utilização de fermentações anaeróbias
é altamente desejável.
Embora muitos microrganismos sejam capazes de degradar o glicerol na
presença de elétrons externos (metabolismo respiratório), poucos são capazes de fazê-lo de
forma fermentativa (isto é, na ausência de elétrons). O metabolismo fermentativo de
glicerol tem sido relatado em espécie dos gêneros Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter,
Clostridium, Lactobacillus, Propionibacterium, e Anaerobiospirillum (Yazdani &
Gonzalez, 2007). No entanto, o potencial de utilização destes organismos de forma
industrial poderia ser limitado devido a várias questões que incluem patogenicidade,
exigência de condições anaeróbicas estritas, necessidade de suplementação com nutrientes
ricos, entre outras. A utilização de bactérias como a Escherichia coli, um organismo já
utilizado em condições industriais, poderia ajudar a superar os problemas mencionados.
Entretanto, acreditava-se que o metabolismo do glicerol em E. coli exigia a presença de
elétrons externos (Lin, 1976; Dharmadi, et al., 2008). Relatos recentes, afirmam que ao
contrário do que se pensava, este microrganismo pode fermentar o glicerol por via
anaeróbia (Neidhardt, et al., 1974, Dharmadi, et al., 2006; Dharmadi, et al., 2008).
Esses achados representam uma solução promissora para os problemas acima
mencionados, uma vez que poderia facilitar o desenvolvimento da E. coli para a conversão
do glicerol de baixo valor bruto a produtos químicos e combustíveis de maior valor, com
rendimentos superiores aos obtidos a partir de açucares comuns (Yazdani & Gonzalez,
2007). Esses autores preconizam ser economicamente viável e possível a utilização desses
microrganismos em escala industrial para obtenção desses produtos a partir do glicerol
bruto produzido nas usinas de biodiesel. Para tanto e necessário o isolamento de linhagens
capazes de sobreviver nesses resíduos.
Neste projeto propomos o isolamento de microorganismos do ambiente
capazes de crescer em altas concentrações de glicerol puro.
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OBJETIVOS
Isolar de ambientes naturais e modificados bactérias capazes de crescer em
glicerol.
METODOLOGIA
1.
Isolamento e identificação das amostras bacterianas
Foram utilizadas duas amostras oriundas de coletas realizadas no Rio Parnaíba
(Teresina-Piauí, próximo a boca de esgoto da ponte Presidente José Sarney) relacionadas
ao desenvolvimento do projeto “ Susceptibilidade a desinfetantes de bactérias isoladas de
afluentes da rede hospitalar na cidade de Teresina”, financiado pela FAPEPI/CNPq. Essas
bactérias foram isoladas do meio Chromagar ECC que e fazem parte agora do acervo da
bacterioteca do Laboratório de Pesquisa em Microbiologia (LABMICRO). Inicialmente,
esses microrganismos foram descongelados e foi retirado 10 µl com uma pipeta e depois
semeado em uma placa com o meio TSA (ágar triptona de soja), sendo uma bactéria em
cada placa. As duas placas contendo as bactérias foram incubadas em uma estufa B.O.D
por 24 horas a 35º C. Após o crescimento, foi realizado a coloração de Gram para
confirmação da pureza da cultura e a certificação de se tratar da espécie Escherichia Coli,
devido as mesmas terem sido isoladas em Chromagar ECC, que é seletivo e diferencial
para essa bactéria.
2.
Verificação da capacidade de crescimento em diferentes concentrações de
glicerol
O meio de cultura utilizado para o experimento apresentava 2 gramas de
peptona por litro (0,2%) e concentrações de glicerol variado de 0% (controle), 1, 2, 3, 4 e
5%. O pH do meio de cultura antes do inóculo das bactérias foi medido e padronizado em
7. As duas bactérias crescidas nas placas de TSA foram raspadas com ajuda de uma alça de
platina estéril e adicionando-se 1 ml de meio líquido, para fazer um homogenizado. Após
essa etapa, o material das duas placas foi juntado em um tubo de ensaio estéril e medido a
absorbância (OD) em espectrofotômetro a 600nm até acalçar a OD de 1,0 (equivalente a
3,0X 109) . O meio de cultura descrito acima foi dividido em 6 erlenmeyer contendo as
concentrações de glicerol mencionadas. Em cada frasco foi acrescentado o inóculo
bacteriano até atingir a concentração de 0,01 de OD ( 3,0 X 107). Após essa etapa os
frascos foram incubados em estufa a 35°C por 48 horas.
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3.
Medidas de pH e absorbância
O pH e a absorbância (OD em espectrofotômetro a 600 nm) foi medido nos
meios de cultura contendo o inóculo bacteriano antes da incubação em estufa a 35°C por
48 horas. Essas medidas são importantes para mensuração das condições de crescimento
do microrganismo e da utilização do glicerol.
4.
Obtenção dos extratos extracelulares
As amostras crescidas foram centrifugada em centrífuga a 5000 rpm e o
sedimento celular foi separado do sobrenadante. Foi obtido então o sobrenadante do
controle e dos crescimentos em diferentes concentrações de glicerol. Esse material foi
encaminhado ao Laboratório de Química da UESPI onde foram submetidos a destilação
simples. A solução a ser destilada foi aquecida no balão de destilação. Aumentando-se a
temperatura da solução, até cerca de 98 ºC, onde os compostos mais voláteis tendem a
evaporar e passando pelo condensador precipitam em um recipiente adequado para
posterior identificação do líquido obtido no processo de crescimento microbiano. As
amostras também foram colocadas em um roto-evaporador visando a obtenção e separação
de compostos produzidos.
O material obtido com esses processos será enviado a Laboratório de química
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte para identificação das substâncias
produzidas por HPLC e Cromatografia Gasosa acoplada ao MS (Espectrômetro de Massa).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As duas bactérias isoladas a partir da água do esgoto são da espécie E. Coli.
São coco bacilos Gram negativos e foram isoladas em meio seletivo e diferencial e em se
tratado da E. Coli, as colônias crescem com forte coloração azul e as demais bactérias
crescem em vermelho ou rosa.
As duas amostras foram misturadas obtendo-se um “pool” que foi inoculado no
experimento. Todas as amostras contendo glicerol cresceram (Quadro1 e Quadro 3) mais
que o controle, indicando haver sido utilizado o glicerol no metabolismo microbiano.
Segundo Goznalez (2008), bactérias entéricas como a E. coli são capazes de crescer em
meio de cultura mínimo contendo concentrações crescentes de glicerol e o utilizar para
fermentação. Quando comparamos o resultado do pH dos meios de cultura antes do
crescimento (Quadro 2), com o pH após o crescimento (Quadro 3) podemos perceber a
6
queda de pelo menos 2 pontos de pH, esse passando de 7,5 no controle, para 4,5 no
crescimento do meio contendo 1% de glicerol, evidenciando a formação de algum tipo de
ácido (Neidhardt, 1974).
O aumento da absorbância que pode ser observado em todas as concentrações
de glicerol, principalmente no 1% (Quadro 1) o que evidencia o aumento da massa
microbiana pela utilização do glicerol como fonte de energia (McCoy, 2006). Entretanto,
não houve diferenças significativas no crescimento quando se aumentou a quantidade de
glicerol no disponível no meio. A concentração de 1% foi considerada ideal para os
ensaios, pois favoreceu um crescimento significativo das bactérias.
O material obtido do sobrenadante de todas as concentrações e do controle
foram submetidas a processo de evaporação (roto evaporador) para obtenção dos produtos
de metabolismos. Esse material foi enviado a UFRN para ser submetido a colunas de
HPLC e Cromatografia Gasosa acoplada ao MS (Espectrômetro de Massa) para
quantificação e identificação dos compostos. Somente após os resultados é que teremos
informações para sabermos se essas bactérias tem um potencial para utilização da glicerol
puro e também da glicerina proveniente das usinas de biodiesel. Caso tenhamos um
resultado interessante, será dado continuidade ao trabalho com essas bactérias, ou
testaremos outras para o mesmo fim.
Amostras
Absorbância (nm)
Controle (Sem glicerol)
0,28
1%
0,4
2%
0,341
3%
0,344
4%
0,357
5%
0,34
Quadro 1: Leitura da absorbância após 48h de crescimento em estufa a 35°C.
7
Amostras
PH
Controle (Sem glicerol) 6,8
1%
6,9
2%
7,3
3%
6,8
4%
6,8
5%
7,0
Quadro 2: Leitura do pH do meio de cultura antes do crescimento (somente meio e
glicerol)
Amostras
PH
Controle (Sem glicerol)
7,5
1%
4,5
2%
4,2
3%
4,2
4%
4,3
5%
4,1
Quadro 3: Leitura do pH após 48h de crescimento das bactérias em estufa a 35°C.
CONCLUSÃO
1. As amostras de E. Coli utilizadas no trabalho são capazes de utilizar o glicerol
puro para seu crescimento.
2.
Durante o crescimento das amostras bacterianas houve a formação de
substâncias ácidas, evidenciado pela queda no pH.
3.
Os ácidos produzido durante o crescimento podem ser de interesse
industrial.
4.
É possível a utilização desses microrganismos para metabolizar o glicerol
oriundo das usinas de biodiesel.
8
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Melhoramentos, p. 931, 1990.
DHARMADI Y, MURARKA A, GONZALEZ R. (2006). Anaerobic fermentation of
glycerol by Escherichia coli: a new platform for metabolic engineering..Biotechnol
Bioeng. 5, v-94, 821-9.
GOZNALEZ R, MURARKA A, DHARMADI Y, YAZDANI S.S.(2008) A new model for
the anaerobic fermentation of glycerol in enteric bacteria: trunk and auxiliary pathways in
Escherichia coli. Metab Eng, v-10, 234-45.
LIN, E. C. C. (1976). Glycerol dissimilation and its regulation in bacteria. Annu. Rev.
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McCOY, M. (2006). Glycerin surplus. Chem. Eng. News v- 84, 7-8.
NEIDHARDT, F. C., P. L. BLOCH, & D. F. SMITH. (1974). Culture medium for
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YAZDANI, S. S., & R. GONZALEZ. (2007). Anaerobic fermentation of glycerol: a path
to economic viability for the biofuels industry. Curr. Opin. Biotechnol. V- 18, 213-219.