incorporação de hinoquinina em micropartículas de poli

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INCORPORAÇÃO DE HINOQUININA EM MICROPARTÍCULAS DE
POLI(ÁCIDO LÁTICO-CO-ÁCIDO GLICÓLICO) PARA AVALIAÇÃO DA
CITOXICIDADE SOBRE DIFERENTES LINHAGENS DE CÉLULAS TUMORAIS
R. G. de Lima 1; M. R. Moura1; R. S. de Laurentiz1.
¹Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira,
DFQ, Avenida Brasil Sul, 56, 15385-000, Ilha Solteira – SP, [email protected]
RESUMO
Os produtos naturais extraídos de plantas desempenham um importante papel
na descoberta de novos fármacos sendo que cerca de 25% dos fármacos em uso no
mercado são baseados direta ou indiretamente nesses compostos. A hinoquinina é
uma lignana biologicamente ativa que dentre suas propriedades biológica apresenta
citotoxicidade in vitro contra várias linhagens de câncer, entretanto apresenta baixa
solubilidade e permeabilidade dificultando sua absorção e com isso diminuindo sua
potência. Para potencializar os efeitos citotóxicos a hinoquinina foi encapsulada em
micropartículas polimérica de poli(ácido lático-co-ácido glicólico) (PLGA). A
hinoquinina foi incorporada nas micropartículas de PLGA pelo método de
preparação de emulsão/precipitação com evaporação do solvente. A verificação da
morfologia e tamanho das micropartículas ocorreu através de Microscopia eletrônica
de Varredura (MEV). A incorporação do hinoquinina foi confirmada através de
absorção de UV-vis, análise térmica e FTIR por comparação com os dados obtidos
para as nanopartículas de PLGA vazias e hinoquinina pura.
Palavras-chave: PLGA, micropartículas, hinoquinina, lignanas
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INTRODUÇÃO
O tratamento para câncer de cabeça e pescoço inclui cirurgia, terapia por
irradiação e quimioterapia. Quando a doença está avançada, o tratamento é
normalmente com quimioterapia, a grande maioria das drogas, usadas em
tratamentos quimioterápicos, causam muitos e sérios efeitos colaterais devido à
grande dosagem necessária, pois somente parte do fármaco é absorvida sendo
grande parte dele metabolizado antes de chegar ao sítio de absorção gerando
metabólitos tóxicos. A cirurgia é o método mais antigo utilizado como tratamento do
câncer, mas é um método altamente invasivo, podendo causar lesões estéticas
irrecuperáveis, com um significativo comprometimento funcional
(1).
Desta forma,
existe a necessidade de se buscar novos compostos com atividade antitumorais que
possam atuar sobre as células cancerígenas com menos efeitos colaterais graves
como os principais agentes quimioterápicos em uso. Neste contexto, os produtos
naturais extraídos de plantas são sem dúvida uma fonte de estruturas químicas
extraordinárias que devem ser investigados quanto às suas propriedades
biológicas(2).
As lignanas são metabólitos secundários produzidos pelas plantas que
apresentam grande diversidade estrutural e geralmente estão associados à defesa
da planta contra a ação de patógenos, ocorrem em várias espécies de plantas,
sendo frequentes no gênero Piper.
A Piper cubeba, é utilizada no tratamento
fitoterápico de gonorréia, desinteria, sífílis, dores abdominais, diarréia, enterite, asma
e tumores em geral
(3).
Piper cubeba contém várias lignanas com diferentes
estruturas químicas cujos constituintes de maior ocorrência são a hinoquinina,
cubebina e yateína às quais tem sido atribuída muitas das propriedades medicinais
da Piper cubeba. Dentre estas lignanas biologicamente ativas foi dada ênfase na
hinoquinina, como mostra a Figura 1, que apresenta atividade analgésica, antiinflamatória e antimicrobiana
(2).
Estudos recentes do nosso grupo de pesquisa
demonstraram resultados muito promissores da ação citotóxica da hinoquinina sobre
diferentes linhagens de câncer Hep-2 e SiHa. Entretanto, apesar de sua ação
biológica
a
hinoquinina
apresenta
baixa
solubilidade
e,
portanto,
baixa
biodisponibilidade, além de ser parcialmente degradada em condições muito ácidas.
Desta forma, visando melhorar a biodisponibilidade e estabilidade da hinoquinina a
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mesma foi incorporada em micropartículas de poli(ácido lático-co-ácido glicólico)
(PLGA).
Figura 1. Estrutura química da lignana Hinoquinina (4).
As micropartículas são utilizadas pra diminuir os efeitos coletareis causados em
tratamentos quimioterápicos devido à grande dosagem de drogas necessárias,
sendo que somente parte da droga é absorvida, pois grande parte é metabolizada
antes de chegar ao sítio de absorção gerando metabólitos tóxicos
(5).
Deste modo, o
uso das micropartículas ao encapsular esses fármacos impede que os mesmos
sejam decompostos antes de serem absorvidos e a liberação do fármaco é feita
lentamente e no local adequado, por isso pequenas doses são suficientes
(5).
Entretanto, nem todos os efeitos colaterais desses quimioterápicos podem ser
atribuídos à alta dosagem, alguns deles são tóxicos, mas são ainda assim usados
devido à potência e a velocidade com a qual atuam em destruir as células tumorais.
Desta forma, existe a necessidade de se buscar novos compostos com atividade
antitumorais que possam atuar sobre as células cancerígenas com menos efeitos
colaterais graves como os principais agentes quimioterápicos em uso(6). Neste
contexto, as lignanas se encontram entre os produtos naturais que apresentam as
mais variadas propriedades biológicas, como a citotoxidade sobre as linhagens de
câncer propostas neste trabalho. A lignana hinoquinina possui esqueleto químico da
mesma classe da enterolactona e enterodiol (lignanas naturais com potencial
anticâncer avaliadas nos ensaios preliminares in vitro sobre as linhagens de
câncer)(7).
Os polímeros de PLGA são utilizados por serem biodegradáveis e assim
sofrem hidrólise no corpo, produzindo metabólitos monoméricos biodegradáveis, tais
como ácido láctico e ácido glicólico. Essas micropartículas são biocompatíveis com
tecidos e células. Drogas poliméricas biodegradáveis nanopartículas conjugadas
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utilizadas para entrega de drogas são estáveis no sangue, não tóxicas e não
trombogênicas
(8).
Foram preparadas micropartículas de PLGA com a incorporação
da hinoquinina e micropartículas vazias, essas caracterizadas morfologicamente
através da Microscopia eletrônica de Varredura, a estabilidade das micropartículas
foram utilizadas a medida de potencial zeta (ξ) e a verificação das incorporações
feitas através de espectrometria de absorção de Uv-vis, Infravermelho por
transformada
de
Fourier
(FTIR),
Análise
Térmica
Diferencial
(DTA)
e
Termogravimetria (Tg) e a eficiência de encapsulamento foi por fotometria de
absorção de Uv-vis.
MATERIAIS E MÉTODOS
As lignanas de hinoquina foram extraídas do extrato etanólico das sementes
secas de Piper cubeba importadas de Floral Seed Company, Dehradun, Índia
(9).
As
micropartículas foram preparadas pelo método de emulsão/precipitação com
evaporação do solvente
(10)
utilizando polímeros pré-formados de PLGA (Sigma-
Aldrich com a razão ácido láctido: ácido glicólido: 65:35) (Mw = 45000 – 70000). Para
tal foram dissolvidos 100 mg de PLGA e 10 mg de hinoquinina (proporção
hinoquinina : PLGA = 1:10) em 24 ml de diclorometano os quais foram adicionados
lentamente, via seringa, a uma solução aquosa (20 mL) contendo 200 mg de álcool
polivinílico (PVA) (Mowiol® 18-88, Sigma-Aldrich) (Mw = 130000) usando agitação
mecânica por aproximadamente 2 horas em agitação de 5000 rpm. Após toda a
deposição da solução orgânica na solução aquosa, as amostras são retiradas da
agitação e separação das micropartículas foi realizada por centrifugação (1,680×g;
10 min), e assim, lavada com água destilada por três vezes e depois liofilizada por
12 horas. Por comparação micropartículas vazias, sem a incorporação da
hinoquinina, foram produzidas de mesmo modo.
As análises de morfologia para verificar os tamanhos das micropartículas
foram efetuadas em um microscópio eletrônico de varredura (MEV) da ZEISS
modelo EVO LS15; as imagens foram obtidas com um aumento de 5000 vezes.
Foram feito análises térmicas DTA e TG para verificar interações dos polímeros e
lignanas nas micropartículas através do equipamento da TA Instruments, SDT Q600,
usando suportes de alumina e na faixa de temperatura 25 °C a 500 °C, também
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foram feitas medidas de Infravermelho por transformada de Fourier para confirmar a
incorporação da lignana usando Espectrofotômetro IRTF da marca Nicolet do
Modelo: NEXUS 670, na faixa de número de ondas de 4000 a 400 cm -1, usando
pastilhas de KBr. As medidas de potencial zeta (ξ) reflete o potencial de superfície
das partículas, verificando a estabilidade dos sistemas, estas foram realizadas em
equipamento Zetasizer Nano ZS e os resultados obtidos em triplicada. A
porcentagem de fármaco encapsulado em micropartículas de PLGA foi medida
através do equipamento Espectrofotômetro de UV-Visível da marca Shimadzu do
modelo UV 1800, e foi representada pela equação: eficiência de encapsulação (%) =
quantidade total de determinada hinoquinina em micropartículas × 100 / quantidade
total de hinoquinina teoricamente associada com micropartículas, à absorbância
usada foi 288 nm, usando 3 mg de amostra em 3 ml de dclorometano, em cubeta de
quartzo. Também usando Espectrofotômetro de UV-Visível foi possível afirmar a
incorporação da hinoquina nas micropartículas. As medidas são sempre observadas
em comparação com os dados obtidos para as nanopartículas de PLGA vazias e
hinoquinina pura.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As microscopias eletrônicas de varredura das micropartículas de PLGA
obtidos como mostra a Figura 2, que tanto as amostras sem hinoquinina quanto com
as carregadas apresentam superfície lisa e esférica e com o tamanho de diâmetro
em média 2 µm. As micropartículas estão maior que o ideal que é cerca de 1 µm,
que seria mais adequadas para entrega parentérica (11).
(
(
a)
b)
Figura 2. (a) Imagem obtida pela análise de MEV das partículas de PLGA. (b)
Imagem obtida pela análise de MEV das partículas de PLGA com a hinoquinina.
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As medidas de FTIR foram feitas usando pastilhas de KBr, foram comparadas
as micropartículas de PLGA vazia, PLGA com a incorporação da hinoquinina e da
hinoquinina pura, como observado na Figura 3. Para amostra de hinoquinina pura
forneceu uma banda de absorção na faixa 3500 cm -1 característica de hidroxila. A
absorção em 2906 cm-1 foi atribuída a C-H sp³, observou-se absorção em 1768 cm -1
de C=O
(12).
Para amostra de PLGA vazia pode-se observar em 1750 cm-1 PLGA foi
mostrado uma banda de absorção C=O característico do PLGA
(13),
que também foi
observado nas micropartículas com a incorporação das nanopartículas. Comparando
as micropartículas com a hinoquinina pura, observamos que a amostra
PLGA/hinoquinina tem um pico de absorção mais intenso na faixa 2900 cm -1, que
pode ser da hinoquinina incorporada.
Figura 3. FTIR da hinoquinina pura, micropartículas de PLGA vazias e
micropartículas de PLGA incorporadas com hinoquinina.
Nas medidas de DTA pode-se observar na Figura 4 nas micropartículas PLGA
com e sem hinoquinina um pico em torno de 46 °C correspondente à temperatura da
transição vítrea do polímero. Em torno de 320 °C as micropartículas com hinoquinina
apresenta um deslocamento em relação às micropartículas vazias sugere interações
fracas entre a matriz de PLGA e da hinoquinina
(14).
Na medida de TG pode-se
observar quem 265°C a hinoquinina é degradada, nas micropartículas de PLGA
vazia a amostra degrada em 280°C e nas micropartículas de PLGA incorporadas às
amostras degrada em 286°C, então quando incorporadas as amostras aparentam
estar mais estáveis (14).
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Figura 4. (a) Analise de DTA da hinoquinina, micropartículas de PLGA com
hinoquinina e micropartículas de PLGA vazias. (b) Medida de TG hinoquinina,
micropartículas de PLGA com hinoquinina e micropartículas de PLGA vazias.
O estudo de estabilidade das micropartículas foi avaliado através da medição
do potencial zeta. O potencial zeta (ξ) das micropartículas de PLGA vazias é o valor
de -10,8 ± 0,2 mV indicam que não está estável, para as micropartículas de PLGA
com a hinoquinina o valor foi -10,1 ± 0,2 mV, com a incorporação a instabilidade não
foi alterada.
Os valores de potencial zeta negativos são devidos à hidrólise do
polímero, originando grupos carboxílicos na superfície das partículas (14).
A eficiência de encapsulação foi através um detector de UV de comprimento de
onda variável, ajustado no comprimento de 288 nm, a porcentagem de fármaco
encapsulado em micropartículas de PLGA foi representada pela equação: eficiência
de encapsulação (%) = quantidade total de determinada hinoquinina em
micropartículas × 100 / quantidade total de hinoquinina teoricamente associada com
micropartículas, usando a equação linear y = 24,43615x+0,09851 e o coeficiente de
correlação, r2=0,99943 como mostra a Figura 5, pode-se afirmar que a porcentagem
de incorporação foi de 84%.
Com a medida espectrometria de absorção de UV-vis pode-se confirmar na
Figura 6 que a incorporação da hinoquinina nas micropartículas de PLGA foram
obtidas.
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Figura 5. Curva de calibração da hinoquinina em várias concentrações.
Figura 6. Espectroscopia de UV-vis para a hinoquinina, micropartículas de
PLGA e micropartículas de PLGA incorporadas com a hinoquinina.
CONCLUSÃO
Sendo assim, este trabalho possibilitou a produção de micropartículas de PLGA
com tamanhos de diâmetros de 2 µm, sendo necessário diminuir. Com as medidas
de FTIR, DTA, e UV-vis pode-se confirma a incorporação da lignana hinoquinina nas
micropartículas. A analise térmica de TG pode-se observar que houve uma melhora
com a incorporação da lignana no polímero, porém com a medida de potencial zeta
não é possível confirmar a estabilidades das micropartículas. Pode – se confirmar
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que a hinoquinina foi incorporada nas partículas de PLGA com uma ótima eficiência.
Os resultados obtidos indicam que as nanopartículas de PLGA são candidatas
promissoras para a utilização como dispositivos de liberação de fármacos para o
tratamento de câncer Hep-2 e SiHa .
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HINOKININ A LOADED POLY(LACTIC-CO-GLYCOLIC ACID) (PLGA)
MICROPARTICLES FOR EVALUATION OF CYTOTOXIC ON CELL LINES
DIFFERENTS TUMOR
ABSTRACT
The hinokinin is a biologically active lignan extracted from piper cubeba that
display significant cytotoxic activity against several cancer lineage, however possess
low solubility e stability in acid pH. As form of lower these problems and increase the
power of this compound, it was encapsulated in polymeric microparticles of PLGA
(polylactic acid-co-glycolic acid). Microparticles of PLGA are biodegradable, are not
metabolized by digestive enzymes and possess stability on pH acid present in the
stomach carrying the unchanged drug to the intestine where it can be absorbed
slowly during decomposition of the microparticle. The hinokinin was incorporated in
PLGA microparticles by the nanoprecipitation method. The particle size and
morphology were examined using SEM. The incorporation of the hinokinin in the
microparticles PLGA was confirmed through UV Spectroscopy, DSC, and FTIR and
by comparison with data obtained for the empty PLGA microparticles and pure
hinokinin.
Key-words: Hinokinin, PLGA, microparticles, lignans
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