Bactérias anaeróbias

Bactérias anaeróbias
Aeróbios
Obrigatórios
Anaeróbios
Facultativos
Estritos
Propriamente
Estritos
Aerotolerantes
Metabolismo na presença de O2
Exigem O2 como aceitador final de electrões
Metabolismo na ausência de O2
Crescem aerobicamente, usando O2 como aceitador final de electrões e
anaerobicamente, obtendo energia pela fermentação de compostos orgânicos
Incapazes de usar O2 e inibidas por ele
Não tolera [O2] maior que 0,5%
São membros da flora normal
Toleram [O2] até 2-8%
Responsáveis pela maioria das infs.
Bactérias anaeróbias e toxicidade ao O2
Do metabolismo aeróbio bacteriano resultam espécies reactivas de O2
peróxido de hidrogénio
radicais hidroxilo
aniões superoxido
Estas espécies reactivas de O2 tornam-se tóxicas:
Causam danos no DNA
Destroem componentes lipidicos das células
Inactivam enzimas essenciais para as actividades metabólicas
Bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas têm enzimas protectoras
Catalase
Peroxidase
Superoxido dismutase
Conceito clássico – toxicidade do O2 nos anaeróbios dependia da ausência destas enzimas protectoras.
Actualmente:
Superoxido dismutase
Produção induzida pela exposição ao O2 em Bacteroides e outros
Os níveis de enzima são superiores nos Gram- que nos Gram+
Correlacionam-se com o grau de tolerância ao O2 nos anaeróbios obrigatórios moderados
Papel importante na tolerância ao O2 e na virulência de alguns anaeróbios
Catalase
Produção demonstrada em Bacteroides, Peptostreptococcus e Propionibacterium
Não se correlaciona com a tolerância ao O2
Peroxidase
A sua actividade não foi demonstrada em anaeróbios.
As razões pelas quais outros anaeróbios (Clostridium perfringens) são capazes de sobreviver a exposições
de O2 superiores a 72h ou mais apesar da ausência de enzimas protectoras são desconhecidas.
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Bactérias anaeróbias são predominantes no organismo
Maioria das inf. são endógenas, provocadas por bactérias que ganham virulência ou passam para
locais estéreis onde se tornam patogénicas
A identidade dos anaeróbios associados com infs. especificas pode frequentemente ser previsível pelo
local do organismo envolvido
Passagem através de barreiras muco-cutâneas (trauma ou cirurgia), propagação a partir de zonas
contíguas, exp., por aspiração.
Algumas inf. são exógenas associadas a agentes esporulados:
Botulismo – Clostridium botulinum
Tétano – Clostridium tetani
Gangrena Gasosa – Clostridium perfringes
Processo infeccioso envolve uma mistura de bactérias que actuam por sinergismo de virulência e
complementaridade metabólica – por vezes, associam-se a bactérias aeróbias que numa 1ª fase lhes
fornece alguns metabolitos.
SNC
Cabeça e pescoço
Pleuropulmonar
Intra-abdominais
Tracto genital feminino
Tecidos moles
Abcessos cerebrais
Abcesso periodontal
Outras infs. orais
Pneumonia por aspiração
Abcessos pulmonares
Pneumonia necrosante
Peritonites e abcessos
Abcessos tubo-ovarianos
Abcessos vulvo-vaginais
Aborto séptico
Gangrena gasosa (mionecrose)
Celulite crepitante
Fasceite necrosante
Colheita de amostras
Por aspiração com agulha e seringa
Amostra de tecido por biópsia
Zaragatoas – se possível, devem ser rejeitadas!
Mais susceptíveis de contaminação
Mais expostas ao O2 e à dessecação
Não permitem a preparação de um bom esfregaço
Colheita de pequeno volume de produto para amostra
Local
Sangue
Dentes
Espécimen aceitável
Sangue
Aspirados endodentarios
Aspirados de colecção purulenta
Faringe
Seios
Aspirados de abcessos com agulhas
Especimens colhidos por intervenção cirúrgica
Espécimen inaceitável
Raspados das superfícies
gengivais, dos dentes ou mucosa
vizinha
Zaragatoa
Irrigação ou aspirados
2
perinasais
Área pulmonar
SNC
Área
abdominal
Tracto genital
feminino
Tracto urinário
Tecidos moles
Aspiração transtraquel
Aspirados de colecções purulentas
Colheira por operação
Aspiração percutânea pulmonar
Liquido pleural
Aspirado por broncoscópio com protecção
terminal
LCR
Aspirados por paracentese
Bile
Colheitas por intervenção cirúrgica
Culdocentese
Colheita cirúrgica
Colheita por laparoscopia
Espécimen da cavidade endometrial com curette
de sucção
Aspirado de urina supra-púbico
Aspirados de feridas profundas
Aspirados com agulha através de zonas intactas
Colheira cirúrgica
Expectoração espectorada
Aspirados nasofaríngeos
Broncoscopia vulgar
Aspirado de traqueostomia
Conteúdo gástrico, Fezes
Amostras intraluminares
Zaragatoa rectal
Descarga vaginal
Amostras cervicais
Corrimento colhido com zaragatoa
Exsudado do endométrio
Urina
Amostra superficial
Transporte da amostra
Amostras mantidas a 37ºC
Evitar refrigeração das amostras – leva à diminuição do nº microrganismos viáveis
Em caso de atraso de 15-20 mins entre colheita e processamento
Velocidade de transporte tanto maior quanto menor a amostra colhida
Usados para pequenas amostras de tecido, fluidos aspirados ou especimens colhidos com zaragatoas
Tubos fechados ou frascos com uma atmosfera anaeróbica e base de agar isotonica que mantém
ambiente húmido – Port-A-Cul system, Anaerobic Transport Médium, Anaport e Anatube
Tubos de vidro ou plástico, com sistemas catalíticos para gerar um ambiente anaeróbico depois da
zaragatoa ser inserida – Vacutainer anaerobic specimen collector, Anaerobic Culturette system
Tubos com ambiente anaeróbico e meio de transporte reduzido – PRAS, anaerobic transport system,
anaerobic transport medium
Exame macroscópico
Inspecção visual – sugerem a presença de bactérias anaeróbias:
Purulência
Odor pútrido
Tecidos necrosados
Pus com “grãos de enxofre”
Exame com luz U.V. (360 nm) – pesquisa de fluorescência – vermelho tijolo: anaeróbios pigmentados
Porphyromonas e Prevotella
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Exame microscópico
Esfregaço corado pelo Gram – observação de morfologia típica de mts bacts
Bacteroides – bacilo Gram- pouco corado, pleomórfico
Fusobacterium – bacilo Gram- fusiforme e fino
Veillonella – coco Gram- pequeno
Actinomyces – bacilo Gram+ ramificado
Clostridium perfringens – bacilo Gram+ largo e rectangular
Método de Gram - funciona como um controlo de qualidade
Se espécimen transportada correctamente
Se meio de isolamento foi apropriado
Se sistema de incubação anaeróbico foi apropriado
Se subcultura anaeróbica foi feita correctamente
Se crescimento foi inibido pela presença de outras bactérias ou antibióticos
Microscopia de campo escuro e contraste de fase – demonstração de espiroquetas
Imunoflourescência com anticorpos monoclonais – rápida identificação de mts espécies anaeróbias,
caro, mts falsos + e –, não substitiu cultura
Outros procedimentos
Cromatografia gás-liquida (GLC) – analise directa dos AG de cadeia curta
Culturas de sangue – com algum valor
Analise directa de material purulento – pouco sensível e especifico
Testes serológicos – uso limitado, teste de antigenio do látex para Clostridium difficile
Selecção dos meios de cultura
Maioria das inf. são polimicrobianas
Vai depender – tipo de amostra, volume amostra, recursos económicos
Meios devem ser frescos e/ou pré-reduzidos
Meios não selectivos – devem ser enriquecidos com vit K1 e hemina
Agar-sangue – crescimento de anaeróbios estritos e facultativos
Brucella – bacilos Gram- anaeróbios
Brain-heart
Columbia
CDC – cocos anaeróbios
Schaedler – bacilos Gram- anaeróbios, alta dose de glicose, favorece crescimento de organismos
sacarolíticos
Fastidious Anaerobe agar – Fusobacterium
Meios selectivos
4
BBE agar (Bacteroides bile esculin agar) – crescimento selectivo de B. fragilis, ocasionalmente
outras bactérias crescem: Fusobacterium, Klebsiella, Enterococcus
KVLB agar (agar sangue lisado com vancomicina e kanamicina) – crescimento selectivo de
Bacteroides e aumenta a produção de pigmento nos Bacteroides pigmentados (Prevotella e
Porphyromonas); bacilos Gram- resistentes à kanamicina podem crescer neste meio
Agar sangue de carneiro com álcool fenietil – crescimento da maioria dos anaeróbios Gram- e +;
inibe bacilos anaeróbios facultativos Gram Agar sangue com colistina e acido nalidixico – crescimento dos anaeróbios estritos e facultativos
Gram +; maioria das bactérias Gram- são inibidas
Caldos – se sistema de incubação anaeróbico falhar, a espécimen em cultura não será perdida
Meio de tioglicolato enriquecido com hemina e vit K1 – isolamento de anaeróbios de crescimento
lento, como Actinomyces
Chopped meat broth (caldo de carne) – para isolamento de anaeróbios
Preparação das amostras para sementeiras
Volume liquido – concentração por centrifugação, semear o sedimento
Zaragatoa – extracçao suave num pequeno volume (0,5-1ml) de caldo de tioglicolato; semear o
espécimen no meio de cultura usando uma pipeta
Tecidos – homogeneização em 1ml caldo de tioglicolato suave e rápido, para evitar exposição ao O2
Usar sempre pipetas e ansas esterilizadas na inoculação dos meios
Incubação em anaerobiose
Composição habitual – 5% H2, 5% CO2, 90% N2
Sistemas produção de anaerobiose:
Jarra de anaerobiose
Saco de
anaerobiose
Baixo
Alto
Câmara de
anaerobiose
Alto
Moderado
Moderado
Moderado-grande
Sistema em
anaerobiose por
catalisador
palladium, reactivo
pelo calor a
160ºC/2h, ambiente
mantido seco por
gel de sílica (pode
empobrecer
crescimento bact)
Placas
inspeccionadas a
Custo inicial
Custo de
manutenção
Tempo
Espaço
Outras
características
Moderado
Moderado
Baixo
Moderado
Sistemas de válvulas
Sistema de evacuaçãosubstituição
Sistema gerador de gás
Sistema Gás-Pak –
catalisador palladium e
indicador de
anaerobiose
Baixo
Pequeno
1 ou 2 placas,
crescimento pode
ser detectado
examinando as
placas pelo saco
transparente
Vantagens
Simples, conveniente,
permite uso de técnicas
Placas
inspeccionadas a
Roll tube
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
Óptimo p/ espécies
extremamente
sensíveis ao O2,
não conveniente
para isolamento de
anaeróbios
obrigatórios
moderados
associados às infs.
humanas
Tubos
inspeccionados a
5
convencionais
Desvantagens
qq momento sem
perturbar as
condições de
anaerobiose;
simples,
conveniente,
permite uso de
técnicas
convencionais
Uso de apenas 2
placas,
possibilidade de
exposição
prolongada das
placas ao O2
durante
subculturas
Possibilidade de
exposição prolongada
das placas ao O2
durante
inspecção/subculturas
qq momento sob
condições de
anaerobiose,
isolamento
segundo técnicas
tradicionais
qq momento sem
perturbar as
condições de
anaerobiose
Ocupa mt espaço,
custo inicial
elevado, consumo
de tempo elevado
Tecnicamente
difícil, difícil
isolamento de
estirpes em cultura
pura, não permite
obs da morfologia
celular típica
Identificação das bactérias anaeróbicas
Presumptiva:
TSA – colistina, vancomicina, kanamicina
Provas bioquímicas - catalase, produção de indol, redução de nitratos, polianetolsulfonato de sódio,
crescimento em 20% bile, alanina peptidase, discos verdes brilhantes, urease, licitinase e lipase
Testes cromogénios – kits de identificação rápida (4-24h) – β-glicosidase, β-galactosidase, αglicosidase, α-fucosidase…
Definitiva
Cromatografia gás-liquida (GLC) – analise directa dos ac. gordos de cadeia curta
Testes bioquímicos PRAS – determinar actividade sacarolítica
Placas Presempto – testes diferenciais nos quadrantes das placas – I, II e III
Anaeróbios
Morfologia
Esporos
Dupla zona de
β-hemolise
kanamicina
colistina
vancomicina
Crescimento
em 20% bile
catalase
Alanina
peptidase
Produção de
indol
Redução de
nitratos
urease
lipase
lecitinase
Mobilidade
Sistemas rápidos de identificação API 20 A, Minitek system, API-ZYM system
B. fragilis
B. pigmentados
B. ureolyticus
Fusobacterium
Veillonella
Peptostreptococcus
C. perfringens
C. difficile
Propionibacterium
Eubacterium
B
CB/B
B
B
C
C
B
B
B
CB/B
+
+
-
+
-
R
R
S
S
S
V
S
S
S
S
R
V
S
S
S
R
R
R
R
R
R
V
R
R
R
S
S
S
S
S
+
V
+
+
-
V
V
V
+
-
+
+
V
+/V
V
V
V
V
+/-
+
+
V
+
+
V
-
V
V
-
+
-
V
+
-
6
Bactérias
anaeróbias
Bacilos anaeróbios,
Gram +,
formadores de
esporos
Bacilos anaeróbias,
Gram +, não
formadores de
esporos
Actinomyces
Mobiluncus
Bifidocterium
Eubacterium
Propionibacterium
Lactobacillus
Cocos anaeróbios
Gram +
Bactérias
anaeróbias
Gram –
Pele e mucosas (oral, TGI, genital) do Homem
e animais
Mts são oportunistas
Inf. graves com risco de vida
Crescimento lento
Actinomyces
Anaeróbios estrictos ou facultativos
Produção de inf. crónicas de desenvolvimento lento
Desenvolvimento de filamentos ou hifas – semelhante aos fungos
Crescimento lento em cultura – 2 semanas
A. israelli, A. meyeri, A. naelundii, A. odontolyticus, A. viscosus
Colonizam tracto resp. sup, TGI, TGU feminino
Baixa virulência – traumatismos, cirurgia, infs.
Actinomicose – macroscopicamente: “grãos de enxofre” amarelos ou laranja
Cervicofacial, torácica, abdominal, pélvica, SNC
Sensíveis à penicilina e resistentes ao metronidazole
Propionibacterium
Mobiluncus
Bacilos pequenos Gram + em cadeias curtas
Na pele, conjuntiva, ouvido externo,
orofaringe, TGU feminino
Anaeróbios facultativos ou estritos, imóveis,
catalase +, fermentadores de carbohidratos co
produção de ác. propriónico
P. acnes – acne e inf. oportunistas
P. propionicus - canaliculite lacrimal e
abcessos
Anaeróbios obrigatórios de crescimento lento
Gram variável ou Gram –
Bacilos encurvados com extremidades afiladas
Classificados como Gram +
Parede celular Gram+
Falta de endotoxina
Susceptível à vancomicina, clindamicina,
eritromicina e ampicilina
Resistente à colistina
Vaginose bacteriana
Lactobacillus
Bacilos anaeróbios facultativos ou obrigatórios
Boca, estômago e TGU (o + comum na uretra)
Frequentemente isolado na urina e sangue
Resistente à vancomicina
Bacteremia, endocardite, septicemia
oportunista
Tratamento – penicilina + aminoglicosídeo
Bifidobacterium e Eubacterium
Orofaringe, cólon e vagina
Baixa virulência – raramente causam infs.
7
Bactérias
anaeróbias
Bacilos anaeróbios,
Gram +,
formadores de
esporos
Bacilos anaeróbias,
Gram +, não
formadores de
esporos
Eram classificados como Peptostreptococcus
Colonizam cavidade oral, TGI, TGU e pele
Infs ocorrem qd bacts. Passam destes locais
para outros estéreis
Tracto resp. sup. – sinusite e inf.
pleuropulmonares
TGI – inf. intrabdominais
TGU – endometrite, abcessos pélvicos,
salpingite
Pele – celulite, infs. tecidos moles
Sangue – infs. ósseas
Dx lab difícil:
Necessário meio de transporte para
prevenir contaminação com outros agente que
colonizem as mucosas
Meio de transporte sem oxigénio
Meios de cultura nutricionalmente ricos
Incubação – 5-7 dias
Sensíveis à penicilina, metronidazole,
imipenem e cloramfenicol
Resistentes aos aminoglicosídeos (tds
anaeróbios)
Anaerococus, Fingoldia, Micromonas,
Peptostreptococcus, Schleiferella
Cocos anaeróbios
Gram +
Bactérias
anaeróbias
Gram –
Colonizam tracto resp.sup, TGI, TGU
(prevalentes)
Patogénicas possuem catalase e superóxido
dismutase – toleram exposição ao O2
Produzem enzimas citotóxicas
Causam infs. endógenas
Tracto resp.
Abcessos cerebrais
Intrabdominais
Ginecológicas
Cutâneas e dos tecidos moles
Bacteremia
Gastroenterite
Meios selectivos
Enriquecidos com bile
Enriquecidos com sangue lisado – estimula
produção de pigmento por Prevotella e
Porphyromonas
Bacteroides – bacilos, crescimento estimulado
em meios com 20% bile, crescimento rápido (2
dias), sem endotoxinas
B.fragillis – pleiomórfico, o + virulento,
produz BFT e β-lactamases , identificação:
Gram e morfologia das colónias
Resistência à kanamicina, vancomicina e
colistina
Crescimento estimulado em meios com
20%bile
Fusobacterium –
bacilos alongados,
produzem β-lactamases
Porphyromonas – bacilos assacarolíticos, bilesusceptivel, pigmentados, produzem β-lactamases
Prevotella – bacilos pequenos sacarolíticos,
bile-susceptivel, pigmentados e não-pigmentados,
produzem β-lactamases
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Bactérias
anaeróbias
Bacilos anaeróbios,
Gram +,
formadores de
esporos
Clostridium Bacilos anaeróbios,
Gram +, não
formadores de
esporos
Cocos anaeróbios
Gram +
Bactérias
anaeróbias
Gram –
Anaeróbios estritos
Ubiquitários – solo, água, TGI de humanos e animais
Maioria comensais
Capacidade de patogenicidade
Sobrevivência em condições adversas pela esporulação
Crescimento rápido em meios sem O2, enriquecidos nutricionalmente
Produção
Toxinas histoliticas
Enterotoxinas
Neurotoxinas
Clostridium perfringens
Bacilos grandes, rectangulares, Gram +
Esporos raramente obs (in vivo/in vitro)
Imóveis, crescimento típico de bacts. móveis
Hemolíticos – zona dupla de hemolise pelas
toxinas α e β em agar-sangue
Produção de toxinas letais: α, β, ε, ι
5 tipos (A-E): A – infs. + freq
C – enterite necrosante
Produção de lecitinase (PLC) = α-toxina (lise)
Dça por exposição exógena ou endógena
Infs. tecidos moles, celulite, miosite
supurativa, mionecrose ou gangrenas gasosas,
gastroenterite, intoxicação alimentar (autolimitada), enterite necrosante
Tratamento – penicilina
Clostridium tetani
Bacilo móvel, com esporos nas extremidades
Difícil crescimento – anaeróbios estritos
Proteoliticos, não fermentam carbohidratos
2 toxinas:
Tetanolisina – hemolisina, oxigénio-labil
Tetanospasmina – neurotoxina termo-labil
– provoca Tétano por desregulação da actividade
excitatória neuronial – paralisia espástica
Vacinação com toxoide tetânico
Testes de neutralização antitoxina tetânica
Tétano:sistémico, localizado, cefálico,neonatal
Clostridium difficile
Anaeróbios estritos
Infs. endógenas
Diarreia pós-antibioterapia
Colite pseudomembranosa
Produção:
Toxina A = enterotoxina
Toxina B = citotoxina
Hialuronidase
Factores de adesão
Diagnóstico – detecção de enterotoxina ou
citotoxina nas fezes
Tratamento – vancomicina e metanizadole
Clostridium botulinum
Anaeróbios estritos
Crescimento lento
Produção de 1 de 7 toxinas (A-G) – toxinas
botulinicas (termo-labeis)
Estirpes que causam dça produzem lipase,
proteínas digerem leite, gelatinases, fermentam glicose
Dça humana – toxinas A, B, E e F
Botulismo – bloqueio da libertação de Ach –
paralisia flácida
Isolar bacts – 10 mins a 80ºC
Toxinas inactivadas se 10 mins a 60-100ºC
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