Simone Walbrink Frühling

UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO
ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL - UNIJUÍ
SIMONE WALBRINK FRÜHLING
MODELAGEM MATEMÁTICA DO CRESCIMENTO
BACTERIANO NO LEITE CRU
Ijuí
2013
1
SIMONE WALBRINK FRÜHLING
MODELAGEM MATEMÁTICA DO CRESCIMENTO
BACTERIANO NO LEITE CRU
Dissertação apresentada ao Curso de PósGraduação em Modelagem Matemática da
Universidade Regional do Noroeste do Estado
do Rio Grande do Sul – UNIJUÍ, como
requisito parcial para a obtenção de título de
Mestre em Modelagem Matemática.
Orientador: Prof. Dr. Daniel Curvello de Mendonça Müller
Ijuí
2013
2
3
Aos meus pais, Bruno e Normélia, a minha
irmã Solange, ao meu esposo Gelson, e em
especial aos meus alunos, pelo incentivo,
carinho e confiança, lhes dedico este trabalho.
4
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Bruno e Normélia, pelo amor, dedicação, apoio e suporte, não medindo
esforços para proporcionar minha formação moral e acadêmica, além de serem os maiores
incentivadores do meu trabalho. Obrigada por tudo.
A minha irmã Solange, sem a sua ajuda e incentivo não chegaria ao final, também pelo
auxílio na formatação e revisão dos trabalhos.
Ao meu esposo Gelson pela paciência, pela confiança e pelo incentivo nos momentos
difíceis.
Ao professor Dr. Daniel Curvello de Mendonça Müller, pela atenção, disponibilidade e
orientação, aceitando o tema proposto, sendo fundamental para realização de um sonho.
Ao professor Dr. José Antonio Gonzalez da Silva pela co-orientação, pelo suporte na
análise estatística.
Ao laboratório SARLE pelas análises feitas, e ideias trocadas.
A Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul, ao IRDeR pela
infraestrutura oferecida.
Ao agrônomo Cesar Oneide Sartori, diretor do IRDER, que permitiu e propiciou a
estrutura para a pesquisa.
Professores do Mestrado em Modelagem Matemática da Unijuí pelos ensinamentos e
amizades.
Aos colegas e amigos, em especial a colega Juliana, agradecimento pelo
companheirismo, pelas ideias trocadas e amizade.
A Geni pela amizade e disposição a nos atender prontamente.
A professora Ms. Magda Inês Luz Moreira, pelo incentivo a seguir a formação
acadêmica, e prosseguir o estudo iniciado na especialização.
Ao Colégio Sinodal Ibirubá pelo incentivo, apoio e compreensão.
A Capes pelo apoio financeiro recebido.
A todas as pessoas que direta e indiretamente apoiaram a realização deste trabalho.
Meus sinceros e eternos agradecimentos.
5
“Somos o que repetidamente fazemos. A
excelência, portanto, não é um feito, mas um
hábito”.
(Aristóteles)
6
RESUMO
O leite é um alimento amplamente consumido pelo homem e pelo alto valor nutritivo é alvo
de grandes contaminações. São necessários rigorosos cuidados de higiene na obtenção,
armazenamento, transporte e industrialização desse produto, garantindo sua qualidade,
segurança e a satisfação do consumidor. A publicação da Instrução Normativa número 51 (IN
51) foi um marco para o setor leiteiro, pois previa a redução da Contagem Bacteriana Total
(CBT) de um milhão para 100 mil UFC/ml. Após revisão dessa normativa, foi publicada a
Instrução Normativa número 62 (IN 62) que passou a escalonar os prazos e estendeu o limite
da adequação até o ano de 2016. Neste trabalho, objetivou-se modelar matematicamente o
crescimento de bactérias no leite cru com a influência da temperatura e mistura das ordenhas
determinando assim sua dinâmica populacional, e estimar o melhor período para a remoção
do leite do tanque de expansão. A variável resposta de interesse foi a Contagem Bacteriana
Total (em UFC/mL) e a temperatura (em ºC), considerando as possíveis interações com o
momento de ordenha e o período de coleta (em horas). Esperava-se que o crescimento
bacteriano no leite cru seguisse uma linha exponencial, segundo o modelo de Malthus, pois a
mistura de ordenhas, além de elevar a temperatura, adiciona nutrientes ao meio, contribuindo
para a multiplicação bacteriana. Considerando a natureza das variáveis resposta, a equação
polinomial de grau dois se foi a que melhor se ajustou aos dados reais. Para modelar a
temperatura, a equação logarítmica apresentou melhor ajuste aos dados reais, sendo a
temperatura, a variável que mais se correlacionou com o número de bactérias. Os resultados
mostraram que para o leite de baixa contagem bacteriana inicial, a mistura dos momentos de
ordenha e o tempo de coleta do leite não interferem na contagem bacteriana, mantendo a
qualidade do leite e o limite legal de UFC/mL prevista na IN-62.
Palavras chave: Contagem Bacteriana Total; Temperatura; Tempo; Mistura de ordenhas;
Resfriamento do leite.
7
ABSTRACT
Milk is a food widely consumed by humans and due to its high nutritional value is susceptible
to large contamination. It takes rigorous hygiene care in obtaining, storage, transportation and
industrialization of the product, ensuring its quality, safety and customer satisfaction. The
publication of Normative Instruction number 51 (NI 51) was a milestone for the dairy sector,
as it provided for the reduction of total bacteria count (TBC) from one million to 100.000
CFU/ml. After reviewing the rules, Normative Instruction number 62 (NI 62) was published
and it now staggers the deadlines and extended the limits of appropriateness until the year
2016. This study aims to mathematically model the growth of bacteria in raw milk with the
influence of temperature and mixing milking thus determining their population dynamics, and
to estimate the best time to remove the milk from the bulk tank. The response variable of
interest was the Total Bacteria Count (CFU/ml) or temperature (in oC), which are altered by
the effects of time of milking and the collection period (in hours). It was expected that
bacterial growth in raw milk followed an exponentially line, according to the Malthus model,
as the mixing milking that besides increasing the temperature, add nutrients to the
environment, contributing to bacterial multiplication. Considering the nature of the variable
responses, a polynomial equation of degree two was the model that best fits the actual data.
To model the temperature, the logarithmic equation showed a better fit to the actual data,
being temperature the variable most correlated with the number of bacteria. The results
showed that milk of initial low bacterial count, mixing moments of milking and the time of
milk collection does not interfere with bacterial count, maintaining milk quality and legal
limit of UFC/ml provided in NI 62.
Keywords: Total Bacteria Count; Temperature; Time; Mixing milking; Milk cooling.
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Fases da curva de crescimento microbiano............................................................... 28
Figura 2- Fatores que contribuem para obtenção de leite higiênico. ........................................ 36
Figura 3- Gráfico demonstrando o coeficientes de proporcionalidade considerando natalidade
(  ) e mortalidade (  ). .............................................................................................. 46
Figura 4- Gráfico demonstrando a taxa de variação da população em função da população
atingindo seu limite máximo. ..................................................................................... 48
Figura 5- População que tende a superpopulação em determinado tempo............................... 49
Figura 6- Imagem da estrutura física do IRDeR. Observa-se à direita, os locais relacionados à
coleta do leite: sala de ordenha e canzil. .................................................................... 57
Figura 7- Coleta das amostras diretamente no tanque de expansão. Observa-se a utilização de
avental, luvas, gorro e máscara, evitando-se a contaminação da amostra.................. 58
Figura 8- Conjunto sala de ordenha e galpão de alimentação (acima). Animais aguardando
início da ordenha em ambiente de fácil limpeza (à esquerda). Canzil para
alimentação após a ordenha (à direita). ...................................................................... 59
Figura 9- Imagem dos animais dentro da sala de ordenha durante o procedimento de coleta do
leite. ............................................................................................................................ 59
Figura 10- Tanque de expansão a granel (resfriador) recebendo o leite diretamente pela
tubulação interligada à sala de ordenha. ..................................................................... 60
Figura 11- Representação dos períodos de coleta. Amostras C1, C7 e C13 (leite na
temperatura fisiológica do animal), representam a população de bactérias novas que
serão adicionadas ao resfriador, representando o momento t0. Amostras C2, C8 e
C14, ocorreram uma hora após começo da ordenha. As amostras C3, C9 e C15
representam a população de bactérias três horas após o início das ordenhas, as
amostras C4, C10 e C16, cinco horas após, as C5, C11 e C17, sete horas após e C6,
C12 e C18 nove horas após início das ordenhas. ....................................................... 62
Figura 12- Comparativo entre o modelo polinomial de grau dois (número de bactérias
estimado) e valores reais (número de bactérias real) encontrado nas amostras. (a)
Momento de Ordenha – 1ª (Tarde); (b) Momento de Ordenha – 2ª (Manhã); (c)
Momento de Ordenha – 3ª (Tarde). ............................................................................ 69
9
Figura 13- Comparativo entre o modelo polinomial de grau dois (Temperatura estimada) e
valores reais (Temperatura real) encontrado nas amostras. (a) Momento de Ordenha
– 1ª (Tarde); (b) Momento de Ordenha – 2ª (Manhã); (c) Momento de Ordenha – 3ª
(Tarde). ....................................................................................................................... 70
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Crescimento bacteriano, Contagem Bacteriana Total (CBT) frente às diferentes
temperaturas e período de armazenamento............................................................ 39
Tabela 2- Análise de variância ................................................................................................. 54
Tabela 3- Análise de variância de dois critérios (sem interação) ............................................. 55
Tabela 4- Resumo da análise de variância considerando os efeito de tempo de coleta do leite
sobre momento de ordenha, e suas interações, em várias temperaturas e número de
bactérias. ................................................................................................................ 63
Tabela 5- Valores médios pelo modelo de Scott-Knott para os efeitos de temperatura e
número de bactérias (NBac). ................................................................................. 65
Tabela 6- Resumo análise de variância de equação de regressão polinomial e seus parâmetros
para NBac no leite cru durante três ordenhas com os valores médios gerais de
tempo (T) de armazenamento do leite. .................................................................. 68
Tabela 7- Equações não lineares ajustadas para estimativa da temperatura............................. 70
11
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Valores médios de germes contidos em salas de ordenha ....................................... 38
Quadro 2- Efeito da temperatura na multiplicação dos microrganismos no leite em diferentes
condições de higiene. ............................................................................................. 39
12
SUMÁRIO
1 APRESENTAÇÃO DA DISSERTAÇÃO ............................................................................ 14
1.1 Introdução ........................................................................................................................... 14
1.2 Motivação ........................................................................................................................... 15
1.3 Objetivos............................................................................................................................. 17
1.3.1 Objetivo Geral ................................................................................................................. 17
1.3.2 Objetivo Específico ......................................................................................................... 17
1.4 Estrutura da dissertação .................................................................................................... 18
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................................................. 19
2.1 O Setor Lácteo no Brasil e Rio Grande do Sul ................................................................... 19
2.2 Legislação ......................................................................................................................... 20
2.3 Microbiologia ................................................................................................................... 22
2.3.1 Mundo Microbiano .......................................................................................................... 22
2.3.2 Classificação dos Reinos ................................................................................................. 23
2.3.3 Morfologia das bactérias ................................................................................................. 24
2.3.4 Metabolismo, Crescimento, Reprodução de Microrganismos ........................................ 24
2.3.5 Métodos de Determinação de Microrganismos ............................................................... 27
2.3.6 Ritmo e Controle do Crescimento Bacteriano ................................................................. 28
2.3.7 Microbiologia dos alimentos ........................................................................................... 30
2.4 Leite .................................................................................................................................. 31
2.4.1 Caminho do leite.............................................................................................................. 32
2.4.2 Microbiologia do Leite .................................................................................................... 34
2.4.3 Fatores que influenciam na Qualidade Microbiológica do Leite .................................... 35
2.4.4 Coleta das amostras ......................................................................................................... 41
2.4.5 Contagem de Microrganismos no Leite .......................................................................... 42
3 MODELOS MATEMÁTICOS ............................................................................................. 44
3.1 Modelagem Matemática ..................................................................................................... 44
3.2 Modelo da Dinâmica Populacional..................................................................................... 44
3.3 Expressões matemáticas do crescimento bacteriano .......................................................... 49
3.4 Microbiologia Preditiva ...................................................................................................... 50
4 ESTATÍSTICA ...................................................................................................................... 52
5 METODOLOGIA.................................................................................................................. 57
13
5.1 Caracterização do Local ..................................................................................................... 57
5.2 Delineamento Experimental ............................................................................................... 57
5.3 Procedimento Experimental ............................................................................................... 60
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................... 63
7 CONCLUSÕES ..................................................................................................................... 72
14
1 APRESENTAÇÃO DA DISSERTAÇÃO
1.1 Introdução
A pecuária leiteira é uma atividade de grande importância em diversas regiões
brasileiras, desempenhando papel relevante na complementação da renda para alguns
produtores rurais (COSTA, 2006), e muitos tem a atividade como principal fonte de renda na
propriedade.
A produção de leite no País passa por profundas transformações, em busca do
aprimoramento do produto final. Recentemente, aumentaram-se as exigências qualitativas,
através de novas instruções normativas. Em 2002 o governo brasileiro publicou a Instrução
Normativa número 51 (IN 51), que previa a redução da contagem bacteriana total (CBT) de
um milhão para 100 mil unidades formadoras de colônia por mililitro (UFC/mL). Tais
mudanças deveriam estar concluídas até julho de 2011. Com essa medida, muitos produtores
brasileiros não conseguiram cumprir o prazo para as adequações propostas, visto os elevados
níveis da CBT (SANTOS, 2012).
Segundo JoãoWalter Dürr, presidente do Conselho Brasileiro de Qualidade do Leite
(CBQL) e responsável pelo laboratório de Microbiologia da Universidade de Passo
Fundo/RS, 60% das amostras analisadas em seu laboratório, no ano de 2011, estavam fora dos
padrões legais quanto a CBT. Atenta-se para que o limite recomendado na IN 51 no referido
ano era de 1 milhão de UFC/mL (MILK POINT, 2012).
O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) revisou a IN
51/2002, sendo publicados novos limites para CBT e Contagem de Células Somáticas (CCS).
Essa nova edição, denominada IN 62, alterou a IN 51, contudo escalonou os prazos para que
produtores e indústria promovessem as devidas adequações até o ano de 2016.
A maior contaminação por bactérias ocorre durante a ordenha e armazenamento do
leite (SANTOS, 2012). O resfriamento imediato após a ordenha é a maneira mais eficiente de
inibir o metabolismo e a multiplicação desses microrganismos, que por sua vez, acarretam
grandes prejuízos ao produtor e à indústria.
Com o aumento das exigências no controle de qualidade do leite, tanto por parte dos
consumidores quanto da indústria e da legislação nacional, o produtor precisa estar ciente de
15
que para manter a atividade lucrativa torna primordial adequar-se às normas vigentes. A
qualidade do produto que sai para comercialização está diretamente relacionada à carga
microbiana nele presente, visto a influência direta dessa no sabor e aroma do leite, além de
reduzir o prazo de validade do produto disponível aos consumidores.
O presente trabalho teve como objetivo investigar o crescimento bacteriano no leite
cru, considerando a mistura de três ordenhas consecutivas ao longo de 42 horas. A análise foi
relacionada com os modelos matemáticos da dinâmica populacional, definindo aquele que
melhor se ajustasse a realidade observada. Com este trabalho é possível definir ou justificar o
melhor período de recolhimento do leite, ou ainda, afirmar se há correlação da mistura de
ordenhas sobre a contagem bacteriana, sendo essa uma possível justificativa para a
desconformidade encontrada nos produtos atualmente. Este capítulo apresenta a motivação
para a realização do trabalho e os objetivos a serem alcançados. Por fim é apresentada a
estrutura desta dissertação.
1.2 Motivação
A modelagem matemática ajuda na percepção, desenvolvimento e solução de
problemas aplicados, incluindo a teoria e o cálculo, pois esta envolve situações reais guiadas
por hipóteses. A biologia tem utilizado a matemática como ferramenta para interpretar os
eventos, compreender seus problemas e projetar soluções.
O estudo do crescimento populacional tem grande importância para a programação do
futuro, sendo que o primeiro modelo matemático para previsão de populações surgiu pela
preocupação com a falta de recursos para as futuras gerações. Existem diversos modelos de
crescimento populacional, dentre eles o de Thomas Robert Malthus e o modelo de Verhulst,
também conhecido como equação logística (ZILL, 2003).
As bactérias tem sido as maiores fontes causadoras de enfermidades em seres vivos,
podendo ocasionar doenças e até levar à morte. Invisíveis a olho nu, esses microrganismos
são encontrados em todas as estruturas, mas principalmente nos alimentos, já que são meios
de cultura ótimos para o seu crescimento (FORSYTHE, 2002).
O fato do leite ser um alimento com alto valor nutritivo o torna extremamente atraente
para o desenvolvimento de bactérias, constituindo-se alvo de grandes contaminações. São
16
necessários rigorosos cuidados de higiene para sua obtenção, armazenamento e
industrialização, incluindo não só o produto bruto, mas de seus derivados. Dessa forma, pode
ser possível garantir um produto seguro para a alimentação e adequado segundo as exigências
e necessidades do consumidor (PEREDA, 2005).
O Rio Grande do Sul é um grande produtor de leite e com excelente potencial de
ampliação. A inauguração de empresas nos últimos anos ampliou a capacidade de
processamento no estado e consequentemente, aumentou a procura pela matéria-prima de
qualidade, o que agregou renda à propriedade rural (TONDOLO; BITENCOURT, 2006;
SOUZA et.al, 2010).
Para incentivar o aumento da qualidade, algumas empresas criaram programas de
pagamento diferenciado, visto que o bom produto final, está diretamente relacionado a sua
carga microbiana (SANTOS, 2012). A contaminação bacteriana depende de vários fatores,
como saúde do animal, correta higiene das instalações e equipamentos de ordenha, qualidade
da água utilizada, temperatura e tempo de armazenagem do leite (FONSECA; SANTOS,
2000).
Na propriedade, o leite é armazenado e resfriado em tanques de expansão,
popularmente denominados de resfriador a granel, ou tanque de imersão, onde o leite é
depositado em latões os quais permanecem imersos em água fria. Esse último é um sistema
manual, no qual se deve agitar o leite periodicamente e a água ao redor deve ser trocada em
períodos pré-determinados. A facilidade de limpeza, a homogeneização automática, o
aumento da capacidade de armazenamento e redução da mão de obra, foram os fatores que
começaram a tecnificar o processo e fizeram com que o produtor trocasse o tanque de imersão
pelo de expansão.
Grande parte dos produtores promovem duas ordenhas diárias, com intervalo de 12
horas entre elas. Contudo, o primeiro leite que cai no resfriador, ou seja, a primeira ordenha,
só será recolhida 48 horas depois. Isso permite que o caminhão leve mais produto a cada
coleta, visto que após 48 horas, já ocorreram quatro ordenhas. Quando a produção de leite da
propriedade excede a capacidade diária do resfriador, o leite pode ser recolhido a cada 24
horas.
Considerou-se como hipótese para o problema da elevada carga microbiana, o fato da
adição de novas ordenhas, misturadas àquele leite já resfriado, elevaria a temperatura local,
estimulando o metabolismo das bactérias antes estabilizadas. Esse trabalho poderá encontrar
alternativas para melhorar a qualidade da matéria prima oferecida à indústria, mapeando
17
através da dinâmica do crescimento bacteriano, os possíveis pontos críticos durante o
processo de estocagem do leite.
1.3 Objetivos
1.3.1 Objetivo Geral
O objetivo desse trabalho foi modelar matematicamente o crescimento de bactérias no
leite cru, em razão da variação da temperatura provocada pela sucessão de ordenhas,
determinando assim sua dinâmica populacional.
1.3.2 Objetivo Específico

Determinar o melhor período para o esvaziamento do resfriador, obtendo-se uma
matéria prima de maior qualidade microbiológica.

Detectar efeito de interação entre o momento de ordenha e o tempo de coleta do
leite, para temperatura e número de bactérias.

Testar a viabilidade de estimar o crescimento bacteriano via regressão polinomial
definindo o grau do polinômio para o crescimento bacteriano no leite cru sob
condições de resfriamento.

Determinar o modelo matemático que melhor defina a variação da temperatura do
leite em três ordenhas sucessivas.
18
1.4 Estrutura da dissertação
Este trabalho estuda o crescimento de bactérias no leite cru, com a influência da
temperatura, em condição real, determinando assim a sua dinâmica populacional. Dessa
forma, pode-se prever o melhor período para a remoção do volume total de leite de dentro do
resfriador.
Para tanto, esse trabalho esta organizado em sete capítulos.
No Capítulo 2 é exposto o embasamento sobre o tema para uma melhor compreensão
do problema. Esse capítulo também apresenta uma abordagem dos aspectos e conceitos gerais
sobre microbiologia, microbiologia do leite e demais contextos relevantes.
O Capítulo 3 trás alguns modelos matemáticos de dinâmica populacional. No Capítulo
4 são apresentados conceitos, procedimentos, expressões e fórmulas estatísticas, que serão
utilizadas no trabalho.
O Capítulo 5 descreve a metodologia desenvolvida para a execução do trabalho,
elucidando pontualidades sobre a coleta das amostras.
No Capítulo 6 são apresentados os resultados obtidos através das análises estatísticas e
cálculos matemáticos, fazendo a discussão e comparação com os modelos da dinâmica
populacional, apresentando a validação dos modelos matemáticos. Finalmente, no Capítulo 7,
estão expostas as considerações finais e conclusões do trabalho.
19
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 O Setor Lácteo no Brasil e Rio Grande do Sul
A pecuária leiteira no Brasil vem sofrendo intensas transformações desde os anos
noventa, quando se iniciou o processo de desregulamentação do mercado e a abertura
comercial. Trata-se de uma atividade de grande relevância em diversas regiões brasileiras,
principalmente no Sul e Sudeste, desempenhando um papel relevante na complementação da
renda para os produtores rurais (COSTA, 2006).
A produção primária do leite no Brasil tinha como predominância marcante produtores
pouco especializados, produção sazonal, pequenos volumes de leite produzido por
propriedade e animais mestiços ou voltados para corte. A implementação de programas de
qualificação e a instauração de instruções normativas vêm excluindo do mercado os
produtores sem capacitação. Em longo prazo, a granelização e a revisão das normas de
produção e qualidade final dos produtos lácteos, resultará em mais produtores especializados
e, consequentemente, no desaparecimento de um terço dos atuais (COSTA, 2006, apud
ALMEIDA, 2001).
No Brasil, o processo de obtenção do leite algumas vezes é realizado sob precárias
condições higiênico-sanitárias, elevando as contagens de microrganismos no produto. Por
tratar-se de um alimento de grande importância nutricional, econômica, social e de saúde
pública, a qualidade do leite tem merecido a atenção de pesquisadores do mundo inteiro
(COSTA, 2006).
A produção leiteira do Brasil vem aumentando periodicamente. Na década de 90,
passou de 14,9 bilhões de litros produzidos, para 18,7 bilhões, em apenas oito anos. Esses
números continuaram subindo. Em 2004, a produção leiteira foi de 23,5 bilhões de litros. Em
2007 o país produziu 26,1 bilhões de litros de leite e em 2009 o Brasil alcançou o quinto lugar
dos países produtores de leite no mundo (BARROS; SIMÃO, 2009).
Em 2011, essa produção chegou a 32,1 bilhões de litros em todo Brasil isto segundo
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), obtendo um acréscimo de 4,5% sobre o
20
ano anterior, sendo que o Rio Grande do Sul foi responsável por 12,1% da produção nacional
(MILK POINT, 2013).
2.2 Legislação
Em 1952, foi publicado no Brasil, o Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de
Produtos de Origem Animal, onde foram estabelecidos parâmetros de qualidade para produtos
de origem animal, entre eles o leite e seus derivados. Em 1996 o Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento (MAPA) criou o Programa Nacional de Melhoria da Qualidade do
Leite (PNMQL), este programa veio para auxiliar a cadeia produtiva do leite que sofria
grandes perdas econômicas em decorrência da elevada acidez do leite e da alta incidência de
mastite nos rebanhos (OLIVEIRA et al. 2000, Apud, LEITE, 2006).
Em abril de 2002, o MAPA por meio da Instrução Normativa nº37 (IN 37), instituiu a
Rede Brasileira de Laboratórios de Controle da Qualidade do Leite (RBQL), com o objetivo
de realizar análises laboratoriais para a fiscalização de amostras de leite cru, coletadas em
propriedades rurais e em estabelecimentos de laticínios. A RBQL é composta por sete
laboratórios estrategicamente localizados nos Estados do Rio Grande do Sul, Paraná, São
Paulo, Goiás, Pernambuco e dois em Minas Gerais. Os laboratórios utilizam equipamentos
capazes de realizar análises de composição centesimal, contagem de células somáticas (CCS)
e contagem bacteriana total (CBT).
Em 18 de setembro de 2002 o MAPA, publicou a Instrução Normativa n°51 (IN 51)
onde definiu novos parâmetros de qualidade e estabeleceu critérios de avaliação para o leite
cru refrigerado. A IN 51 obriga a análise mensal de uma amostra de leite, proveniente de cada
uma das propriedades rurais que destinam o produto para estabelecimento sob inspeção
federal. Os parâmetros de qualidade vão desde a contagem de células somáticas, até a
determinação dos teores de gordura, proteína, lactose, sólidos totais, sólidos não gordurosos,
resíduos de antimicrobianos, crioscopia e contagem bacteriana total (BRASIL, 2002).
A IN 51 estabelece que o leite cru refrigerado precisa apresentar no mínimo 2,9% de
proteína, 3,0% de gordura e 8,4 % de Extrato Seco Desengordurado (ESD). O valor máximo
permitido para a contagem de células somáticas, nas Regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste, é
21
de 1.000.000 céls./mL. A partir de julho de 2008 este valor máximo foi reduzido para 750.000
céls./mL e, em julho de 2011, para 400.000 céls./mL. Na contagem bacteriana total os valores
máximos permitidos, nessas regiões foram de 1.000.000 UFC/mL de julho de 2005; 750.000
UFC/mL até julho de 2008 e 100.000 UFC/mL até julho de 2011. Estes padrões visavam
melhorar a qualidade do leite e derivados produzidos no Brasil, assemelhando-se com os
padrões estabelecidos mundialmente (BRASIL, 2002).
Em decorrência da grande desconformidade a IN 51, o MAPA publicou a IN 32 em
junho de 2011 a qual prorrogava por seis meses a vigência dos prazos estabelecidos para a
adoção de novos limites microbiológicos e de células somáticas. Essa medida entraria em
vigor a partir de 1º de julho de 2011 para as regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste, dispostos no
Anexo IV da Instrução Normativa nº 51, de 18 de setembro de 2002. Ainda foi instituído um
grupo de trabalho com objetivo de estabelecer novas diretrizes para o PNMQL.
Em dezembro de 2011 foi publicada a Instrução Normativa nº62 (IN 62), que alterou
normas de produção e qualidade do leite. A IN 62 passou a escalonar os prazos e limites antes
definidos na IN 51, prorrogando-os até o ano de 2016. A IN 62 mantém os parâmetros dos
teores de gordura, proteína e estrato seco desengordurado. O valor máximo permitido para a
contagem de células somáticas, nas Regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste, é de 750.000
céls./mL. A partir de janeiro de 2012 este valor máximo foi reduzido para 600.000 céls./mL e,
a partir de julho de 2014, passará para 500.000 céls./mL e, a partir de julho de 2016, para
400.000 céls/mL. Na contagem bacteriana total, os valores máximos permitidos alteraram de
750.000 UFC/mL para 600.000 UFC/mL em janeiro de 2012, 300.000 UFC/mL a partir de
julho de 2014 e 100.000 UFC/mL a partir de julho de 2016 (BRASIL, 2011).
22
2.3 Microbiologia
2.3.1 Mundo Microbiano
Com os estudos dos microrganismos se tornou insuficiente a divisão dos seres vivos
em dois reinos, animais e plantas. O zoólogo Ernet Haeckel, em 1866 criou um terceiro reino,
denominado Protista, englobando as bactérias, algas, fungos e protozoários (BORZANI et al,
2001).
Os microrganismos originaram-se a aproximadamente quatro bilhões de anos, e são
considerados ancestrais de todas as outras formas de vida. Em meio a tentativas e descobertas
é que pesquisadores reconheceram a microbiologia como ciência que estuda organismos
microscópicos. Alguns deles são nocivos e podem causar doenças no homem, em animais e
plantas. Outros são responsáveis pela deterioração, respondendo por importantes alterações
ambientais, essenciais para a manutenção da vida no planeta (PELCZAR; CHAN; KRIEG,
1997).
Antony Van Leeuwenhoek (1683 - 1723) através de um microscópio rudimentar ficou
impressionado quando viu o grande número de objetos móveis invisíveis a olho nu. Por volta
de 1850, Louis Pasteur (1822-1895), provou que a fermentação era resultado de uma série de
reações químicas, que ocorriam na presença de microrganismos. Examinando vinhos, Pasteur
concluiu que a seleção de microrganismos de determinado tipo poderia assegurar um bom
produto. Para destruir os microrganismos existentes ele primeiro aquecia o suco de uva e
depois resfriava ficando isento de micróbios, esse processo hoje é denominado pasteurização.
Pasteur criou uma nova teoria sobre a origem das doenças, foi desafiado e provou que um
microrganismo denominado protozoário era a causa da doença do bicho-da-seda (PELCZAR;
CHAN; KRIEG, 1997).
Louis Pasteur conseguiu comprovar que os microrganismos surgem a partir de outros
microrganismos preexistentes, utilizando frascos do tipo “pescoço de cisne” mostrou o
desenvolvimento e proliferação de micróbios presentes no ar. A partir de então a hipótese da
biogênese passou a ser mais aceitam (LOPES, 2008).
23
Robert Koch (1843-1910) descobriu em 1876, a bactéria do carbúnculo, mais tarde ele
e seus colegas descobriram as bactérias causadoras da cólera e da tuberculose. O postulado de
Koch conduziu a descoberta de várias bactérias causadoras de doenças humanas. O médico
utilizou-se dos métodos laboratoriais para organizar o seu postulado (PELCZAR; CHAN;
KRIEG, 1997).
Os estudos de Pasteur e Koch levaram ao desenvolvimento da microbiologia médica
depois foram comparadas com microrganismos presentes na agricultura e indústria,
aumentando a produção e a qualidade dos produtos. No início do século XX se teve
conhecimento da enorme capacidade dos microrganismos de realizarem transformações
químicas, pois estes são feitos de compostos químicos e vivem por meio de reações químicas
(PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997).
2.3.2 Classificação dos Reinos
Com os estudos mais avançados sobre a ultraestrutura celular demonstrou-se duas
categorias de células: as procarióticas e eucarióticas. Os procarióticos apresentam um único
cromossomo, sem membrana nuclear. Nos eucarióticos, o núcleo é limitado por uma
membrana nuclear contendo vários cromossomos em seu interior (TRABULSI et al. 2008).
Em 1969, Robert Harding Wittaker propôs nova classificação dos organismos, em
cinco reinos, Reino Monera, são aqueles procariontes que obtêm nutrientes somente por
absorção e não podem ingerir alimentos nem realizar fotossíntese. Nesse reino incluem-se as
bactérias. O Reino Protista, inclui seres vivos unicelulares, com células eucariontes como as
algas microscópicas e fungos. Os seres vivos unicelulares ou pluricelulares com células
eucarionte com parede celular, e que não tem pigmento fotossintético clorofila pertencem ao
Reino Fungi, no qual todos são heterotróficos como fungos microscópicos, leveduras e
bolores. O Reino Plantae é composto por seres com células eucariontes, pluricelulares e
autotróficos como as plantas verdes fotossintéticas e algas superiores. Seres vivos
pluricelulares, com células eucariontes e heterotróficos pertencem ao Reino Animalia, são
todos os animais que ingerem os alimentos. Considerando a classificação os microrganismos
estão em três reinos, o Monera, Protista e Fungi (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997).
24
2.3.3 Morfologia das bactérias
As bactérias são microrganismos procarióticos, a maioria é unicelular e apresenta
forma simples, invisível ao olho humano (BORZANI et al. 2001). Conforme Pelczar, Chan e
Krieg (1997), existe uma grande superfície através da qual os nutrientes podem entrar em
relação a um pequeno volume de substância celular a ser alimentada, isto é resultado da alta
taxa de metabolismo e crescimento da bactéria.
Segundo Borzani et al. (2001), as bactérias apresentam-se em três formas, podendo ser
esféricas, cilíndricas ou espiraladas. As de forma esférica denominam-se cocos, as cilíndricas,
bacilos e as espiraladas, apresentam várias espirais sendo denominadas espirilos, ou na forma
de vírgula ou meia espiral são designados de vibriões.
Os cocos podem se agrupar em pares dando origem aos diplococos, em cadeias,
estreptococos ou se agrupar em cachos chamados estafilococos. Os cocos isolados são
denominados micrococos. (BORZANI et al. 2001). Segundo Pelczar, Chan e Krieg (1997),
algumas bactérias tem flagelos, que são filamentos finos e que ajudam a bactéria a se
locomover. As bactérias esféricas e cilíndricas, se observadas em microscópio, estão
frequentemente acopladas umas às outras.
As bactérias geralmente possuem uma única forma, sendo essa uma característica
genética que em algumas condições ambientais e de cultivo podem fazer com que os
organismos apresentem formas e arranjos diferentes (TRABULSI et al. 2008). A membrana
citoplasmática das bactérias é composta de proteínas imersas em uma bicamada de lipídeos,
sendo os fosfolipídeos os mais importantes. As proporções desses componentes, também
variam conforme a espécie e as condições de cultivo (TRABULSI et al. 2008).
2.3.4 Metabolismo, Crescimento, Reprodução de Microrganismos
Os microrganismos precisam de um meio com nutrientes e condições físicas
apropriadas para seu crescimento e desenvolvimento, tendo a influência da temperatura, pH,
pressão osmótica e pressão atmosférica. Os processos de crescimento de microrganismos
25
dependem de reações químicas, que são afetadas pela temperatura. Em temperatura favorável
para o crescimento, o número de divisões celulares por hora, chamado taxa de crescimento
geralmente dobra para cada aumento de temperatura de 10ºC. A temperatura na qual uma
espécie de microrganismos cresce mais rapidamente é a temperatura ótima de crescimento. As
temperaturas mínima, ótima e máxima são denominadas temperaturas cardinais de uma
espécie de microrganismo (PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997).
Cada espécie de bactéria apresenta suas próprias temperaturas cardinais. A
temperatura mínima é considerada a menor temperatura onde a espécie é capaz de crescer. A
temperatura máxima é a temperatura mais alta onde ainda é possível o crescimento e a
temperatura ótima é aquela onde a espécie apresenta o melhor crescimento (TORTORA;
FUNKE; CASE, 2003). Para Pelczar, Chan e Krieg (1997), a temperatura ótima está próxima
do limite superior da variação de temperatura, visto que a velocidade das reações enzimáticas
aumenta com o aumento da temperatura, até as enzimas serem danificadas pelo calor e
cessaram o crescimento.
Os microrganismos são classificados em três grupos, de acordo com a variação de
temperatura para crescimento: psicrófilos, ou microrganismos que crescem em baixas
temperaturas, crescem melhor em temperaturas de 15 a 20°C, mesófilos, ou microrganismos
que crescem em temperaturas moderadas, crescem melhor entre 25 e 40°C, e os termófilos, ou
microrganismos que crescem em altas temperaturas, crescendo melhor entre 50 e 60°C
(TORTORA; FUNKE; CASE, 2003).
O metabolismo bacteriano é muito diversificado. Bactérias diferentes podem utilizar
como fonte de carbono e de energia nutrientes distintos e viver em diferentes temperaturas.
Isto explica a distribuição universal das bactérias, encontradas nos ambientes mais variados
(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2000).
Segundo Junqueira e Carneiro (2000), as bactérias podem ser divididas em
fototróficas, quando utilizam a luz solar como fonte de energia, e quimiotróficas, quando
utilizam a energia presente em compostos químicos. Algumas bactérias contêm como
componente de sua estrutura, ou liberam para o meio de cultura, substâncias tóxicas chamadas
de endotoxinas e exotoxinas bacterianas, que em parte são responsáveis pelos danos causados
pelas bactérias aos organismos por elas atacados.
Segundo Borzani et al. (2001), alguns compostos orgânicos são indispensáveis para o
crescimento dos microrganismos, como por exemplo, vitaminas, aminoácidos, nucleotídeos e
26
ácidos graxos. A água é um nutriente vital, pois regula a pressão osmótica das membranas. A
agitação favorece crescimento de aeróbios e facultativos, pois, promove a homogeneização
dos nutrientes no meio de cultura e a dispersão dos produtos metabólicos, favorecendo
crescimento de anaeróbios.
Pelczar, Chan e Krieg (1997), relatam que alguns microrganismos necessitam da
presença de gases para manutenção de suas atividades. Os aeróbios, por exemplo, necessitam
de oxigênio. Os anaeróbios não toleram o oxigênio, pois não utilizam o gás. Os
microaerófilos toleram em pequena quantidade enquanto os facultativos não necessitam do ar
atmosférico para sobreviverem. A grande parte das bactérias crescem mais dentro de
variações pequenas de pH. O pH ótimo para esse crescimento, se aproxima da neutralidade,
ou seja, entre 6,5 e 7,5 (TORTORA; FUNKE; CASE, 2003).
Os microrganismos se reproduzem de duas maneiras, assexuada e sexuada. A
Reprodução sexuada dos microrganismos eucarióticos ocorre por fusão de duas células
diferentes, gerando um único ser. O ciclo celular eucariótico é dividido em duas partes, a
interfase que consiste nas fases de crescimento 1, síntese de DNA e crescimento 2, onde a
fase M é mitótica. Existe também a reprodução assexuada das bactérias por fissão binária,
onde uma célula se divide em duas células idênticas. Uma célula se divide em duas, as duas se
dividem e se tornam quatro e assim por diante. As populações de células crescem
exponencialmente, por meio de uma progressão geométrica (PELCZAR; CHAN; KRIEG,
1997). Algumas espécies bacterianas se reproduzem por brotamento, formando uma região
que inicia um crescimento que quando atinge o tamanho ideal se separa. As bactérias
filamentosas se reproduzem através de uma cadeia de esporos (TORTORA; FUNKE; CASE,
2003).
De acordo com Pelczar, Chan e Krieg (1997), o tempo que o microrganismo leva para
se dividir e se duplicar varia pela influência da composição nutricional do meio e pelas
condições físicas de incubação. O crescimento pode ser caracterizado em termos
quantitativos, incluindo o número de gerações, período de incubação, tempo de geração e a
taxa de crescimento (número de gerações por hora).
De acordo com os mesmos autores, quando o meio de cultura é isolado em um frasco
ou tubo e nenhum novo nutriente é adicionado ao sistema, nenhum produto de excreção
metabólico é removido. Os microrganismos nessa situação, estão em um sistema fechado. O
27
crescimento exponencial de uma cultura em sistema fechado é um crescimento balanceado,
pois depois de atingir a população máxima, começam a morrer.
É possível manter um meio de cultura contínuo, ou seja, sistema de células em
crescimento no qual os nutrientes são adicionados continuamente e o volume do frasco
permanece constante pela retirada simultânea de meio já utilizado. Os valores médios de todas
as características, calculados por bactéria, permanecem constantes em qualquer intervalo de
tempo, se tornando um regime estacionário. Além do tamanho, composição química e
velocidade de crescimento permanecer constante por bactéria, também permanecem
constantes a composição do meio de cultura, a concentração de metabólitos e a massa de
células (TRABULSI et al. 2008).
2.3.5 Métodos de Determinação de Microrganismos
Para Borzani et al. (1997), o crescimento de uma população se dá em termos da massa
total em função do número de indivíduos. Pode-se calcular a massa pela dosagem de certos
componentes celulares como, proteína e ácidos nucléicos. Esse método é considerado
sensível, pois a composição química varia muito rapidamente de acordo com as condições de
crescimento.
Para Tortora, Funke e Case (2003) o crescimento bacteriano é considerado o aumento
do número de indivíduos e não o aumento de tamanho de uma determinada célula. Existem
diferentes métodos para quantificar o crescimento de uma população microbiana. Alguns
determinam o número de células enquanto outros analisam a massa total da população.
Em populações de bactérias se utiliza amostragem para determinação da população.
Sabendo-se que essa população é grande, o método utilizado para a contagem pode ser direto
ou indireto. O método de contagem em placa é a técnica mais utilizada, onde cada colônia se
origina de uma bactéria, o inoculo original é sempre homogêneo e não existe agregação das
células. Nessa técnica deve-se ter o cuidado de não haver crescimento de colônia
exageradamente comprometendo a acurácia dos resultados gerados. Para isso se utiliza o
método da diluição seriada. O aparecimento de colônias visíveis na placa ocorre em 24 horas,
o que se torna desvantajoso em algumas análises (TORTORA; FUNKE; CASE, 2003).
28
Segundo Borzani et al. (2001), o número de organismos pode ser determinado por
contagem do número total de indivíduos, vivos e mortos, com o uso do microscópio. Conta-se
o número de partículas em suspensão em determinado volume de diluição. Hoje existem
aparelhos eletrônicos que promovem essa leitura automaticamente. A contagem de
microrganismos viáveis, aquela que calcula o número de bactérias vivas é chamada de
contagem de unidade formadora de colônias (UFC).
Na natureza os microrganismos estão em culturas mistas, com várias espécies
ocupando o mesmo ambiente. Para determinar as características de um microrganismo ele
deve estar em cultura pura, onde todas as células possuam mesma origem. Em laboratórios os
microrganismos são cultivados em meios de cultura, sendo o mais utilizado o meio ágar
(PELCZAR; CHAN; KRIEG, 1997).
2.3.6 Ritmo e Controle do Crescimento Bacteriano
O crescimento bacteriano em meio líquido, gera uma curva quando se realiza sua
contagem por intervalo de tempos simulado na figura 1. Esse crescimento é dividido em
quatro fases: lag, log, estacionária e de declínio (TORTORA; FUNKE; CASE, 2003).
Figura 1- Fases da curva de crescimento microbiano.
Fonte: BORZANI, Walter et al. Biotecnologia industrial. São Paulo: Edgard Blücher, 2001.4 v. p.23
29
Quando as bactérias são colocadas em um novo meio de cultura, o número de células
sofre pequenas variações. Esse período é denominado fase de lag. Durante esse período as
células não se reproduzem imediatamente pois se encontram em estado de latência, onde
ocorre intensa atividade metabólica, síntese de DNA e de enzimas. Dependendo de certos
fatores a fase de lag não existe ou pode ser longa. Isso depende principalmente do estágio de
crescimento em que se encontra o inóculo. Fatores como inóculo pequeno ou que provenha de
uma cultura velha ou ainda quando o meio e a temperatura de incubação se alteram, alteram
também o período dessa fase (TRABULSI et al., 2008)
A fase log inicia assim que as células começam seu processo de divisão, entrando no
período de crescimento, onde o tempo de geração atinge um valor constante. A fase de
logaritmo é o período de maior atividade metabólica da célula, onde os microrganismos são
sensíveis às mudanças ambientais (TORTORA; FUNKE; CASE, 2003), e o crescimento é
exponencial. A velocidade de crescimento dx/dt em função da massa x e a velocidade
específica  é constante, sendo considerada a fase mais importante, onde é grande a
quantidade de nutriente (BORZANI et al. 2001).
A fase estacionária ocorre quando a velocidade de crescimento diminui e o número de
células mortas é equivalente ao número de células novas. A atividade metabólica de cada
célula diminui nesta fase, ocorrendo um período de equilíbrio (TORTORA; FUNKE; CASE,
2003). Nessa fase há o acúmulo de metabólitos tóxicos, esgotamento de nutrientes e oxigênio
(BORZANI et al. 2001).
A fase de declínio ocorre quando o número de células mortas é maior que o número de
células novas (TORTORA; FUNKE; CASE, 2003). A causa da morte das células, depois do
período de crescimento de uma cultura, pode estar relacionada com a natureza e a
concentração do fator limitante do crescimento. Um dos fatores limitantes é a falta de
nutrientes, pois os organismos que param de crescer continuam com atividade metabólica,
utilizando as reservas nutritivas como fonte de energia. Outro fator limitante é o acúmulo de
produtos metabólitos tóxicos, podendo haver a queda de pH, que resulta em redução
exponencial (TRABULSI et al. 2008).
Para Forsythe (2002), a duração de cada fase depende do organismo e do ambiente. A
taxa de morte aumenta com a presença de ácidos e diminui com a presença de gordura.
Pode-se fazer controle de microrganismos pela ação de agentes físicos, ocorrendo a
morte exponencial. Para matar microrganismos o agente físico mais eficiente e econômico é o
30
calor (BORZANI et al. 2001). Os microrganismos são considerados mortos quando perdem a
capacidade de se multiplicar. A morte ocorre pela desnaturação de proteínas e fluidificação
dos lipídeos na presença de calor úmido e por oxidação (TRABULSI et al. 2008).
A Pasteurização consiste no aquecimento a 62°C por 30 minutos, seguido de
resfriamento brusco. É um método muito utilizado para destruir microrganismos causadores
de doenças. Dependendo do produto a ser esterilizado, é realizado o congelamento a baixas
temperaturas, sendo por vezes utilizada a radiação ultravioleta ou ionizante e filtração para
destruição dos microrganismos (BORZANI et al. 2001)
O controle de microrganismos pode ser feito pela ação de agentes químicos, como
desinfetantes, que matam agindo diretamente na estrutura microbiana. Os agentes
quimioterápicos são substâncias que interferem nas vias metabólicas, podendo ser
microbicida, que ocasiona a morte do microrganismo, ou microbiostático, que apenas impede
sua proliferação. Os compostos podem ser esterilizantes, desinfetantes, antissépticos e
conservantes, dependendo da concentração e tempo de contato (BORZANI et al. 2001).
2.3.7 Microbiologia dos alimentos
Os fatores que afetam o crescimento microbiano são utilizados para controlar a
deteriorização de alimentos. A uma temperatura de -10°C, ocorre o congelamento, que
previne o crescimento de todos os microrganismos. A mesma ação, é obtida com o
branqueamento, onde a temperatura vai de 95 a 110°C, matando microrganismos superficiais
(FORSYTHE, 2002).
A maioria dos microrganismos cresce melhor com valores de pH em torno de 7,0
apesar de alguns ainda crescerem com pH abaixo de 4,0. Alguns alimentos têm acidez
inerente, outros são ácidos devido à ação de certos microrganismos, como a acidez biológica
que ocorre em leites fermentados. Os alimentos que resistem à variação de pH são
denominados tamponados, entretanto, os microrganismos que crescem em ambientes ácidos
tornam o substrato menos ácido. O pH influencia no funcionamento das enzimas e nos
transportes de determinados nutrientes, podendo, inclusive, afetar a morfologia de alguns
microrganismos (JAY, 2005).
31
As bactérias necessitam valores altos de a w , ou seja, a atividade da água deve ser
maior que 0,91. Quando se diminui a w , se aumenta à fase lag de crescimento e diminui a
velocidade e o tamanho da população final. O potencial de oxidação-redução de um substrato
depende da perda ou ganho de elétrons. Quando ocorre à perda, o substrato é oxidado e
quando há ganho, o substrato é reduzido (JAY, 2005).
Para o bom crescimento, os organismos necessitam de água, fonte de nitrogênio,
vitaminas e minerais aliadas a fatores de crescimento (JAY, 2005). O leite de vaca contêm
diversas substâncias que inibem o crescimento de microrganismos, como a lactoferrina,
conglutinina e o sistema lactoperiodase. O leite possui ainda, o inibidor do retrovírus, a
caseína e alguns ácidos graxos, que possuem atividade antimicrobiana. Os parâmetros
intrínsecos (do próprio alimento) e extrínsecos (do ambiente, como a temperatura) formam
obstáculos simultâneos, que quando combinadas, podem formam barreiras a serem
ultrapassadas pelos microrganismos, antes de destruir os alimentos. (JAY, 2005).
2.4 Leite
Denomina-se leite, o produto normal, fresco e integral oriundo da ordenha completa e
ininterrupta de vacas sadias (KIRCHOF, 1994). É um alimento de alto valor nutritivo,
indispensável aos mamíferos, principalmente nos primeiros meses de vida. Quando obtido em
circunstâncias naturais, é ligeiramente amarelado, possui odor suave e gosto adocicado
(BEHMER, 1999).
O leite bovino é secretado diretamente do úbere, ou seja, na glândula mamária, a qual
é constituída de tecido glandular. O úbere é composto por alvéolos, lóbulos, cisternas e tetos,
sendo envolvido por tecido muscular responsável pela proteção da glândula. O produto da sua
secreção é o leite, cuja função natural é a alimentação dos bezerros (PEREDA, 2005). O leite
é esbranquiçado pela refração à luz, que produz uma emulsão formada de gotas muito
pequenas de gordura, envolvidas por lecitina, dispersas em água e contendo sais em solução, e
um colóide protéico, estabilizando os microglóbulos de gordura (SALINAS, 2002).
O leite constitui um dos alimentos mais completos, que possibilita o processamento
industrial obtendo-se diversos produtos para a alimentação humana (FONSECA; SANTOS,
32
2000). Behmer (1999), afirma que a quantidade e qualidade do leite produzido pelo animal
sofre influência da raça, alimentação, idade, número de parições, tempo de lactação e as
variações climáticas. O leite é uma mistura de glóbulos graxos, estabilizada por substâncias
albuminóides, num soro que contém em solução a lactose, proteínas, sais minerais e
orgânicos, lecitina, uréia, aminoácidos, ácido láctico, ácido acético, álcool, lactocromo,
vitaminas e enzimas.
Conforme Fonseca e Santos (2000), a média da densidade do leite é de 1,032 g/mL. O
teste da densidade pode ser útil na detecção de adição de água. O ponto crioscópico indica a
temperatura de congelamento do leite, que é de - 0,531ºC, e é determinado pelos elementos
solúveis. A adição de água causa a alteração no ponto ocorrendo aumento da temperatura
necessária para atingir o congelamento.
O leite recém-ordenhado apresenta acidez natural variando o pH de 6,6 a 6,8. A
acidez pode ser medida em pH ou pelo método de Dornic, que considera a massa de ácido
lático, sendo a variação de 16 a 18 ºD. A presença de glóbulos de gordura e micelas de
caseína faz com que a viscosidade do leite seja maior que da água (FONSECA; SANTOS,
2000).
A densidade do leite a 15°C é de aproximadamente 1.030 gramas por litro, ácido em
estado natural, com pH aproximado a 6,57 (KIRCHOF, 1994). O único glicídeo livre é a
lactose, o componente mais abundante, mais simples e o mais constante, podendo ser um fator
limitante da produção do leite. A lactose é considerada o componente mais lábil diante da
ação microbiana, sendo um bom substrato para as bactérias, que a transformam em ácido
láctico (PEREDA, 2005).
2.4.1 Caminho do leite
Dentro das propriedades rurais, o leite é obtido através da ordenha e, imediatamente
após, deve ser resfriado. O leite sai do úbere da vaca a temperatura muito favorável ao
crescimento bacteriano, por isso é necessário resfria-lo rapidamente a 4°C e mantê-lo nessa
temperatura até sua remoção. As baixas temperaturas inibem o crescimento de bactérias
lácticas e coliformes, mais ainda ocorre a proliferação das bactérias psicrotróficas (PEREDA,
2005).
33
A temperatura de armazenamento recomendada é de no máximo 4ºC dentro de 2 horas
após o término da ordenha. Durante a mistura de uma nova ordenha consecutiva, a
temperatura deve permanecer menor que 10ºC e voltar à 4ºC após o término da ordenha
(FONSECA; SANTOS, 2000).
Segundo as normas vigentes, o leite deve ser transportado por veículos adequados,
diariamente ou em dias alternados. É imperativo que esse transporte seja executado em
caminhões equipados com cisterna isotérmica. O leite é transportado aos centros de coleta ou
diretamente para a indústria, onde é conservado novamente em silos isotérmicos para então
ser processado e destinado ao consumo. Para obter-se qualidade do produto final que chega
aos consumidores, é necessário que a matéria-prima seja de alta qualidade. Assim, uma vez
que o leite cru seja de boa qualidade, é possível destiná-lo a industrialização de qualquer
derivado (KIRCHOF, 1994).
Ao chegar à indústria o leite é resfriado a temperaturas de até 5ºC permanecendo
armazenado até o processamento, não devendo permanecer armazenado mais que 48 horas
(PEREDA, 2005). Nessa fase, é submetido a vários testes de qualidade, identificando-se
parâmetros que determinem até mesmo o seu descarte (KIRCHOF, 1994).
O Ministério da Agricultura recomenda a realização da prova do álcool, que deve ser
feita pelo transportador antes de fazer o carregamento do leite. Esse método estima a
estabilidade das proteínas do leite durante o processamento térmico, pois o álcool atua como
desidratante e simula as condições do aquecimento. O leite que não passa nesta prova
certamente apresentará problemas de estabilidade durante o processamento na indústria
(FONSECA; SANTOS, 2000).
O teste da densidade, chamado teste de crioscopia, é a prova realizada para verificar a
quantidade de água no produto. Em caso de excesso o leite congela, sendo normal admitir-se
percentual máximo de água de 87,5%. O teste do antibiótico, ou seja, resíduo alcalino
misturado indevidamente no leite agindo como conservante, altera a qualidade do produto
final, podendo causar danos aos consumidores (KIRCHOF, 1994).
34
2.4.2 Microbiologia do Leite
As bactérias que contaminam o leite podem ser classificadas de acordo com a faixa
ótima de crescimento e multiplicação. As psicrófilas crescem melhor de 0 a 15ºC; as
mesófilas entre 20 e 40ºC e as termófilas entre 44 e 55 ºC. Ainda temos as psicrotróficas que
crescem a baixas temperaturas menos que 7 ºC e as termodúricas que resistem a pasteurização
(FONSECA; SANTOS, 2000).
Conforme Cassoli (2005), o leite com alta contagem bacteriana pode acarretar na sua
acidificação, coagulação, aumento de viscosidade, produção de gás alterando a cor, sabor e
odor, diminuição da vida de prateleira e diminuição do rendimento. Nos anos noventa foi
implantado o processo de coleta a granel e melhores condições de transporte e refrigeração,
pois se pensou que teria diminuição de microrganismos. O processo minimizou as bactérias
mesófilas que crescem na temperatura ambiente, porém aumenta o número de bactérias
psicrotróficas que crescem em baixas temperaturas.
Segundo Cassoli (2005) há grande importância do conhecimento da carga microbiana
e qualidade do leite produzido. Para tanto se tem testes qualitativos, como o teste da redutase
fermentação e acidez, oferecem diagnóstico da qualidade, quanto aos quantitativos, a CBT,
faz-se contagem bacteriana em placa (CBP) que é o método de referência para estimar o
número de unidades formadoras de colônia (UFC) por mililitro de leite.
A qualidade microbiológica se destaca, pois pode ser um bom indicativo da saúde da
glândula mamária do rebanho e das condições de higiene adotadas na fazenda (FONSECA;
SANTOS, 2000).
Alguns microrganismos que contaminam o leite beneficiam o homem, pois causam
mudanças físicas, químicas e organolépticas que ocorrem no leite ao preparar diversos
produtos lácteos. Quando essa atividade não é controlada, há deterioração do produto, não
sendo possível o consumo, ainda que podem estar presentes microrganismos patogênicos
podendo causar diversas doenças em humanos (PEREDA, 2005).
O tipo de microbiota inicial, a taxa, a temperatura e o tempo de armazenamento são
parâmetros que influem na proliferação das bactérias durante o armazenamento em estado cru,
sendo possível fazer generalizações das mudanças na microbiota durante o transporte e o
armazenamento (PEREDA, 2005).
35
Analisando os modelos matemáticos que se relacionam com microrganismos constatase que, quando as bactérias estão em meio de cultura apropriado, sob condições ótimas para o
crescimento, há grande proliferação em espaço de tempo reduzido. Nesse sentido, quando há
disponibilidade de nutrientes e poucas substâncias tóxicas, o crescimento bacteriano é
exponencial, uma vez que sofre divisão binária (PELCZAR, CHAN E KRIEG, 1997).
De acordo com Pelczar, Chan e Krieg (1997), o crescimento exponencial de uma
cultura em um sistema fechado é um crescimento balanceado, pois após atingir a população
máxima, os microrganismos começam a morrer. Considera-se que em sistemas fechados não
há renovação de nutrientes, havendo a saturação do meio. No leite, essa saturação acontece
somente quando esse é mantido em altas temperaturas, ou seja, a temperatura natural de
ordenha (35 a 37°C). Essa temperatura é considerada ótima para proliferação bacteriana,
aumentando consideravelmente a atividade metabólica dos microrganismos, o que gera maior
consumo de nutrientes e consequentemente mais metabólicos tóxicos, ocasionando assim a
saturação (PEREDA, 2005).
2.4.3 Fatores que influenciam na Qualidade Microbiológica do Leite
Para se ter um leite de qualidade, devem ser tomados alguns cuidados básicos de
higiene e manejo nas etapas do processo, visto que de nada adianta a melhor tecnologia se
forem negligenciadas medidas simples de manuseio de equipamentos ou sanidade animal
(Figura 2) (KIRCHOF, 1994).
36
Figura 2- Fatores que contribuem para obtenção de leite higiênico.
Fonte: KIRCHOF, Breno. Exploração leiteira para produtores. Guaíba: Agropecuária, p.27, 1994.
A higiene da ordenha, a limpeza dos utensílios e o resfriamento do leite estão
diretamente ligados à contagem bacteriana total (CBT). O excesso de bactérias no leite
acarreta alterações do produto final, prejudicando seu aspecto nutricional, sabor, aroma,
textura e prazo validade. As vias de contaminação que aumentam os valores da CBT são os
tetos das vacas, utensílios, equipamentos de ordenha, mãos do ordenhador, a limpeza do
tanque de refrigeração e a velocidade de resfriamento (MENDONÇA, 2009).
Segundo Behmer (1999), a ordenha deve ser efetuada em local próprio com piso de
cimento paredes revestidas de azulejos ou material que propicie a fácil limpeza. Os estábulos
devem ser amplos, arejados, e iluminados. Deve-se evitar maus-cheiros, pois o leite absorve
os odores do ar. A limpeza não deve ocorrer em horários próximos à ordenha, pois provocam
elevação da poeira, aumentando o risco de contaminações.
O produtor é quem tem maior controle sobre a atividade, e é ele quem vai determinar a
qualidade do seu produto. O ordenhador é quem vai intermediar a ligação entre a vaca e a
ordenhadeira. Para que a vaca produza leite de qualidade deve ser tratada com tranquilidade,
receber rigoroso controle de sanidade, recebendo alimentação adequada e água à vontade. O
ordenhador deve ser uma pessoa saudável que preze pela limpeza. Deve vestir roupas limpas,
utilizar avental, não fumar e dar especial atenção às mãos e unhas. A vaca pode ser ordenhada
até três vezes ao dia, com intervalos iguais entre ordenhas Para melhor manejo o correto é
seguir sempre a mesma rotina, iniciando pela preparação da sala e seus equipamentos, onde
tudo deve ficar ao alcance do ordenhador. Quando muito sujos os tetos podem ser lavados
37
água morna e enxugados com um papel toalha. Do contrário, pode-se utilizar toalhas úmidas,
individuais e esterilizadas após o uso. Logo que concluída a ordenha, mergulham-se os tetos
em solução desinfetante a base de iodo, gerando uma proteção química antes de liberar o
animal. Essa manobra denomina-se pós-dipping (BEHMER, 1999).
Analisando as informações anteriores, pode-se resumir em seis as principais medidas
de obtenção do leite de qualidade: a higiene do ambiente de permanência das vacas, a
realização do pós-dipping, o tratamento imediato dos casos clínicos de mastite e
acompanhamento dos casos subclínicos, a limpeza e manutenção dos equipamentos de
ordenha, a terapia de vaca seca e a segregação e descarte das vacas cronicamente infectadas
(MENDONÇA, 2009).
Segundo Behmer (1999), os primeiros jatos do leite devem ser sempre desprezados,
pois estes estão retidos no canal galactófero, ficando em longo período em contato com o
ambiente. Devem-se evitar retenções de leite no úbere, promovendo diariamente o
esgotamento completo de todo o leite. A ordenha deve ser feita em lugar separado de onde se
alimentam as vacas. Quando ocorre a parição o ordenhador deve identificar o animal e
somente após 10 dias de nascimento do bezerro, a vaca retorna à ordenha com as demais,
nesse período o leite (colostro) será descartado ou oferecido ao bezerro. Essa medida é
preconizada, pois esse leite pós-parto contém excesso de caseína e albumina, sendo impróprio
ao consumo humano.
Segundo Kirchof (1994), as principais fontes de contaminação são as fezes do animal,
ar viciado, sujidades oriundas dos animais mal cuidados, ordenha feita sem a devida higiene,
falta de higiene corporal dos ordenhadores e tratadores, ambiente impróprio, demora no
transporte do leite, longa exposição do leite ao sol, elevando a temperatura. Sua pesquisa
comparou ordenhas sem que fossem tomadas quaisquer medidas recomendadas (cuidados
com a vaca, ordenhador e balde e sem desprezar os primeiros jatos) com ordenhas corretas
(sob abrigo, após limpeza do úbere e mãos do ordenhador com água e sabão, desprezando os
três primeiros jatos, com balde esterilizado). A diferença da quantidade de bactérias entre elas
foi de 321.700 bactérias por mL. Abaixo no quadro 1, é possível visualizar os valores médios
de bactérias dissipados na sala de ordenha.
38
Quadro 1- Valores médios de bactérias contidos em salas de ordenha
Existência no:
Número médio de bactérias:
Ar da sala de ordenha
70 por L
Água potável
10 a 250 por mL
Água não-potável
6.000 a 250.000 por mL
Areia
225.000 por g
Pó
78.000.000 por g
Capim
2.000.000 a 200.000.000 por g
Fenos e palhas
7.000.000 a 10.000.000 por g
Esterco de vaca
40.000.000 por g
Leite recém-ordenhdo
300.000 por mL
Leite na recepção da indústria
500.000 a vários milhões por mL
Fonte: KIRCHOF, Breno. Exploração leiteira para produtores. Guaíba: Agropecuária, p.29, 1994.
Conforme Kirchof (1994), o leite após ordenha deve ser filtrado para eliminar detritos
que possam ter caído durante a ordenha, evitando que arrastem grande quantidade de
microrganismos. O leite deve ser refrigerado o mais rápido possível, pois a temperatura que
sai da vaca é a temperatura ótima para multiplicação de microrganismos, considerando
sempre que essa medida apenas retarda o crescimento bacteriano.
O leite é resfriado na propriedade para conservá-lo durante o transporte até a indústria.
Quando chega à indústria é filtrado e novamente resfriado (BEHMER, 1999). No quadro 2
pode-se observar a interação da temperatura com a carga de microrganismos inicial em três
situações distintas.
39
Quadro 2- Efeito da temperatura na multiplicação dos microrganismos no leite em diferentes
condições de higiene.
Condições de
Temperatura
Contagem total de germes por mL
produção
em °C
Fresco
24 horas
48 horas
72horas
Vacas, meio
4,4
4.295
4.138
4.566
8.427
ambiente e
10,0
4.295
13.961
127.727
5.725.277
utensílios limpos
15,5
4.295
1.587.333
33.011.111
326500000
Vacas limpas,
4,4
39.082
88.028
121.864
186.245
meio ambiente e
10,0
39.082
177.437
831.615
1.761.458
utensílios sujos
15,5
39.082
4.461.111
99.120.000
633375000
Vacas, meio
4,4
136.533
281.546
538.775
749.030
ambiente e
10,0
136.533
1.170.546
13.662.115
25.687.541
utensílios sujos
15,5
136.533
24.673.571 639.884.615
2.047.083.330
Fonte: KIRCHOF, Breno. Exploração leiteira para produtores. Guaíba: Agropecuária, p.30, 1994.
Segundo Fonseca e Santos (2004) a taxa de multiplicação bacteriana está intimamente
relacionada com a temperatura de armazenamento do leite. Recomenda-se não permitir que a
temperatura após a mistura de ordenhas, ultrapasse 10°C, e, que essa, deve retornar para 4°C
dentro de 1h após o término da ordenha. Esses autores estudaram a projeção de bactérias nas
diferentes temperaturas e períodos de armazenamento, conforme demonstrado na tabela 1.
Tabela 1- Crescimento bacteriano, Contagem Bacteriana Total (CBT)
temperaturas e período de armazenamento.
Contagem
Temperatura de
CBT
CBT
bacteriana inicial
armazenamento
3h
9h
9000 col/ml
4º
9.000
9.000
9000 col/ml
15º
10.000
46.000
9000 col/ml
25º
18.000
1.000.000
9000 col/ml
35º
30.000
35.000.000
frente às diferentes
CBT
24h
10.000
5.000.000
57.000.000
800.000.000
Fonte: Fonseca e Santos, 2004.
A limpeza ou a sanitização inadequadas permite que uma grande quantidade de
bactérias que se encontram no equipamento de ordenha contamine o leite. A remoção dos
componentes orgânicos e minerais do leite que se encontram no equipamento e a sanitização
antes da ordenha, elimina os microrganismos que sobreviveram e cresceram durante os
intervalos das ordenhas. Os produtos para a limpeza adequada são soluções com detergentes
40
alcalinos clorados e detergentes ácidos, eliminando a grande maioria das bactérias
(FONSECA; SANTOS, 2004).
Segundo Fonseca e Santos (2000), as etapas da limpeza do tanque de expansão e dos
equipamentos de ordenha devem ser seguidas juntamente com o tempo adequado, temperatura
das soluções e a concentração dos detergentes deve ser rigorosamente seguidas para a
produção de leite de alta qualidade. Durante a pré-lavagem, há passagem de água morna de 35
a 45ºC, o detergente alcalino clorado contem 130 ppm de cloro e pH mínimo de 11 a
temperatura de 50ºC, já o detergente ácido que é utilizado após o detergente alcalino, deve
apresentar pH máximo de 3 e temperatura de 35 a 45ºC. O sanitizante utilizado antes da
ordenha contém 25 ppm de Iodo ou 130 ppm de Cloro a temperatura de 35 a 45ºC, sem
enxágue.
Conforme Kirchof (1994), o resfriamento é realizado por resfriadores de imersão e a
granel. Para o resfriador de imersão são necessários taros ou latões, pois estes ficam imersos
em água fria contida no tanque de resfriamento.
Os tanques a granel normalmente são encontrados com sistema de resfriamento a gás,
que pode resfriar diretamente o leite, ou resfriar a água, que circula nas grossas paredes do
tanque. Isso diminui a temperatura até chegar ao recomendado, ou seja, a temperatura
programada pelo produtor. É muito importante que ocorra o igual resfriamento do leite, e para
tanto, faz-se necessária a homogeneização. No tanque a granel é instalada uma pá que agita o
leite, este agitador pode ser programado. Quando em taros o leite deve ser agitado
manualmente por um homogeneizador especial (KIRCHOF, 1994).
O resfriamento em tanques de expansão é mais eficiente, pois apresenta grande
superfície de contato com o leite e possui um agitador automático, que auxilia na rápida
redução da temperatura. A utilização de resfriadores de imersão, nos quais os latões são
imersos na água gelada, as trocas de calor são muito lentas e a agitação deve ser feita
manualmente (FONSECA; SANTOS, 2004).
41
2.4.4 Coleta das amostras
As análises laboratoriais para determinação da contagem total de bactérias (CBT) no
leite são realizadas em pequenos volumes de aproximadamente 50 mL. Essa amostra deve ser
representativa do volume total de leite que se pretende avaliar. A fácil contaminação do leite e
a multiplicação de microrganismos podem causar danos a essa amostra (SOUZA; FARIA;
MORAES, 2008).
Conforme Souza, Faria e Moraes (2008), as amostras devem ser coletadas em
recipientes apropriados, limpos e esterilizados, devem ser encaminhadas ao laboratório da
RBQL a temperatura máxima de 7ºC. A IN 51 prevê a coleta mensal de pelo menos uma
amostra de leite de cada produtor, a confiabilidade dos resultados das análises depende muito
dos procedimentos estabelecidos para a coleta e transporte das amostras, e para isso o agente
de coleta recebe treinamento para seguir os procedimentos recomendados.
A coleta deverá ser feita na propriedade antes do recolhimento do leite pelo
transportador, seja o leite armazenado em tanque de expansão ou em latões. Os frascos
utilizados são de material plástico com tampas rosqueáveis para vedar o material de maneira
segura e evitar o vazamento do líquido ou para evitar a contaminação do leite. Os frascos e os
conservantes são fornecidos pelo laboratório responsável pelas análises. Esses frascos só
devem ser abertos no momento da coleta. Dentro dos frascos há um comprimido de
conservante que começa a se diluir no momento que se coloca o leite. É necessário agitar
levemente a amostra para que o conservante se misture e haja homogeneização de toda a
amostra. Este conservante é usado para garantir que as amostras de leite mantenham sua
integridade e características desde o momento da coleta até a realização da análise,
demonstrando a situação exata do momento em que foi coletado. Estas amostras podem ser
estocadas ao longo de 96 horas desde que mantidas sob refrigeração de até 7ºC, tendo o
cuidado para não congelar (SOUZA; FARIA; MORAES, 2008).
Segundo Souza, Faria e Moraes (2008), o laboratório cadastra os clientes e encaminha
etiquetas com código de barras para facilitar a identificação das amostras após cadastro junto
ao laboratório. Os frascos, utensílios ou equipamentos usados para a coleta devem ser
protegidos de contaminação antes e durante o uso, sendo higienizados com álcool etílico 70
ºGL após o uso. Segundo recomendação do MAPA, as amostras de leite devem ser
42
acondicionadas em caixas isotérmicas com gelo reciclável e a temperatura não dever
ultrapassar 7ºC e estas devem ser analisadas em no máximo 96 horas após a coleta.
O agente de coleta primeiramente observa se não há nenhuma anormalidade no leite,
após mede o volume, liga o sistema de agitação, anota a temperatura. Com o uso de um
coletor transfere o leite para o frasco não ultrapassando ¾ do frasco, para que permita a
mistura do leite ao conservante. Faz-se a identificação da amostra e imediatamente ela é
armazenada em caixa isotérmica com gelo reciclável. Essa etapa de coleta da amostra é
realizada utilizando luvas descartáveis (SOUZA; FARIA; MORAES, 2008).
2.4.5 Contagem de Microrganismos no Leite
Segundo Osowsky (1999), o termo Unidades Formadoras de Colônia (UFC) determina
o número de microrganismos capazes de se reproduzir, formando colônias num determinado
meio de cultura. Dessa forma não determina o número exato de microrganismos. O método
estima o número de bactérias e tem baixo custo, porém ocorre demora no processo de
preparação da inoculação e contagem de microrganismos.
A qualidade microbiológica do leite é medida pela contagem do número de bactérias
presente, sendo enumeradas em equipamentos automatizados ou contagem em placas. Os
equipamentos automatizados são encontrados nos Laboratórios da Rede Brasileira de
Controle da Qualidade do Leite (RBQL) e sua vantagem está na análise de um grande número
de amostras em um curto período de tempo (LANGE, 2008).
Segundo Cassoli (2005), para obtenção de valores mais precisos, foram desenvolvidos
equipamentos que usam o princípio da citometria de fluxo, para automação da contagem,
adaptado recentemente para análise da qualidade do leite. Para a análise não são necessárias
diluições, e não há distinção de células vivas e mortas, apenas faz a contagem individual de
bactérias (CIB).
Conforme Cassoli (2005), pelo sistema eletrônico os impulsos são traduzidos em CIB
e então transformados estatisticamente em UFC/mL por meio de uma curva de calibração
previamente elaborada, pelo laboratório.
A contagem padrão em placas é a mais utilizada, sendo o método de referência, para
determinar a contagem de bactérias presentes no leite. No Brasil o padrão exigido pela IN 51
43
utiliza as UFC, portanto é preciso o uso de uma equação de conversão entre os métodos para
transformar CIB em UFC (CASSOLI, 2005).
Ainda conforme Cassoli (2005), o método de citometria de fluxo permite a utilização
de substâncias bacteriostáticas, que param o crescimento de bactérias. A CBT por citometria,
recomenda a refrigeração a 7ºC juntamente com a solução de azidiol, o conservante aumenta a
vida útil da amostra que poderá ser analisada em até sete dias. A temperatura de
armazenamento das amostras é importante, deve-se evitar o aquecimento ou congelamento da
mesma somente a utilização do conservante não é suficiente para cessar o crescimento.
44
3 MODELOS MATEMÁTICOS
3.1 Modelagem Matemática
Segundo Triola (2005) o modelo matemático é uma função matemática que se “ajusta”
a dados do mundo real ou os descreve. O modelo pode ser uma equação que relacione uma
variável para o tamanho da população e outra variável que represente o tempo.
Os modelos podem ser expressos em termos de gráficos, de tabelas ou de equações.
Neles, o problema fundamental é encontrar uma função f que descreva com precisão a relação
física entre as variáveis, podendo ser sugerida por dados experimentais ou deduzida de
alguma teoria geral. Um bom modelo matemático produz resultados em conformidade com as
observações do mundo físico (ANTON, 1999).
Segundo Boyce e DiPrima (1994) as equações diferenciais são classificadas em
lineares e não-lineares. A equação diferencial ordinária é linear se F for uma função linear das
variáveis y, y’,...,y(n).
F ( x, y, y' ,..., y ( n) )  0
(1)
Assim, a equação diferencial ordinária linear, de ordem n, é:
a0 ( x) y ( n)  a1 ( x) y ( n1)  ...  an ( x) y  g ( x)
(2)
Uma equação que não tem a forma de (16) é uma equação não-linear.
3.2 Modelo da Dinâmica Populacional
Os fenômenos da vida real podem ser descritos em termos matemáticos sendo possível
a construção de um modelo que os represente. Para construção de um modelo, deve-se
identificar as variáveis que aparecem no fenômeno e elaborando hipóteses geradas pelas leis
aplicáveis ao mesmo. As hipóteses que envolvem taxas podem variar, formando equações
com derivadas, consistindo em equações diferenciais. Depois de elaborado, o modelo é
45
testado, sendo as soluções consistentes com dados experimentais o modelo se torna possível,
quando necessário são incluídas novas hipóteses ou é realizado ajuste das equações (ZILL,
2003).
O estudo da dinâmica populacional é essencial para prever o crescimento de diversas
populações entre elas populações humanas, plantas, bactérias entre outras (BORZANI et al,
2001). Segundo Bassanezi e Ferreira (1988), cientistas procuravam ferramentas matemáticas
para estimar o crescimento da população de pessoas, visto a necessidade de planejamento e
programação para que não falte recursos essenciais à sobrevivência. Os modelos de dinâmica
populacional são basicamente três: o crescimento exponencial, baseado no modelo de
Malthus, o crescimento logístico, considerado o aprimoramento do modelo de Verhulst, e o
crescimento de Gompertz.
Segundo Zill (2003), o economista e demógrafo inglês Thomas Robert Malthus
publicou em 1798, um modelo para crescimento populacional segindo uma progressão
geométrica, enquanto que para os recursos, o crescimento ocorria em progressão aritmética.
Essa discrepância mostrou que dessa forma não haveria condições de sustentar as
necessidades da população. Na época seus trabalhos serviram para refrear o otimismo
desvairado do momento. A idéia do modelo Malthusiano é a hipótese de que a taxa
populacional cresce num determinado instante proporcional à população total daquele
instante, ou seja, quanto mais pessoas houver no instante t, mais pessoas existirão no futuro.
De acordo com Bassanezi e Ferreira (1988), a Lei de Malthus leva em conta a
proporcionalidade de nascimentos e mortos em relação ao tamanho da população e ao
tamanho do intervalo de tempo considerado.
Para Boyce (1999), a população pode apresentar crescimento ou declínio num instante t,
porém, em longo prazo as condições ideais sofrem variações, pois existem limitações que
podem reduzir a taxa de crescimento ou declínio. A taxa de variação da população em relação
ao tempo é representada pela derivada
dP
, onde P é a população num instante, t é a variável
dt
tempo, k é a constante de proporcionalidade,  é o coeficiente de natalidade e  o de
mortalidade.
dP
 (   ) P
dt
ou seja, k    
(3)
46
dP
 kP
dt
(4)
Resolvendo-se essa equação e considerando que P(0)  P0 tem-se que,
P(t )  P0e(  )t
(5)
P(t )  P0 e kt
(6)
ou seja,
A constante de proporcionalidade e a taxa de crescimento ou declínio depende se é
positiva ou negativa:
k = 0 ou (  =  ): não varia
k > 0 ou (  >  ): cresce exponencialmente.
k < 0 ou (  <  ): decresce exponencialmente
Figura 3- Gráfico demonstrando o coeficientes de proporcionalidade considerando natalidade
(  ) e mortalidade (  ).
Fonte: BASSANEZI, R. C.; FERREIRA JR, W. C. Equações diferenciais com aplicações. São Paulo: Harbra,
1988. p. 49.
Conforme figura 3 quando a natalidade é igual a mortalidade o coeficiente é igual a
zero portanto, a população não varia. Quando o número de nascimentos é maior que o de
mortes temos um crescimento exponencial sendo o coeficiente maior que zero em um
decaimento exponencial quanto a natalidade é menor que a mortalidade a população diminui e
tende à extinção.
47
O modelo Malthusiano falha, pois prevê crescimentos cada vez maiores. Para resolver
esse impasse o matemático belga Pierre François Verhulst introduziu um novo modelo de
crescimento logístico (BASSANEZI; FERREIRA, 1988).
O modelo de Verhulst, representado abaixo, também conhecido como equação
logística, supõe que a população que vive em um determinado meio, atinge um limite máximo
sustentável, considerando uma variação de população sujeita a um fator de proporcionalidade
inibidor. A equação incorpora a queda de crescimento, à medida que a população cresce.
Segundo Boyce (1999), para levar em conta a velocidade de crescimento que depende
da população, se substituiu a constante k pela função f(P).
dP
 kP
dt
(7)
Segundo Bassanezi e Ferreira (1988) essa f(P) é a incorporação da queda do
crescimento onde,
P P
 ; k  0
f(P) = k  
 P 

dP
P

 kP1 
dt
 P 
(8)
(9)
Assim quanto menor o valor de P, maior será o de f(P) quando P se aproxima de P  ,
f(P) se torna bem pequeno.
Chegando a equação logística
P(t ) 
P0 L
P0  ( L  P0 )e kt
(10)
Segundo Boyce (1999)
P  = lim P(t)
t 
P  é o limite superior, é o nível de saturação ou capacidade ambiental de sustentação
da espécie.
Os pesquisadores Pearl e Reed em 1920 utilizaram a equação logística para o estudo
da população norte-americana (BASSANEZI; FERREIRA, 1988).
48
P(t ) 
P
 P  t
  1  1
 P0

(11)
Quando P0 > P a P(t) é decrescente e quando 0< P0 < P , a P(t) é crescente.
Na equação,
dP
dP
 2
 P 
 , o ponto de equilíbrio da equação
 0 onde as
dt
dt
P
raízes P=0 e P= P , e P(t) é constante.
Como   0 ,
P
P
dP
dP
crescente para 0  P   , e
é decrescente se   P  P .
2
2
dt
dt
Segundo Bassanezi e Ferreira (1988), o valor máximo de
=
dP
é atingido quando P(t)
dt
P
ou seja, a taxa de variação de uma população é atingida quando a população for igual à
2
metade da população limite (Figura 4).
Figura 4- Gráfico demonstrando a taxa de variação da população em função da população
atingindo seu limite máximo.
Fonte: BASSANEZI, R. C.; FERREIRA JR, W. C. Equações diferenciais com aplicações. São Paulo: Harbra,
1988. p. 52.
O instante em que a variação da população é máxima, considerando P0 
tM 
1

ln
P  P0
P0
P
.
2
(12)
49
Se P0  P a população decresce exponencialmente
Se 0  P0  P a população cresce
Se P0  0 ou P0  P a população vão varia
Segundo Bassanezi e Ferreira (1988), o modelo de Verhulst incorpora os efeitos da
superpopulação, assim a população tende a um valor fixo de P . De acordo com figura 5
quando a população inicial for maior que a população superior, esta população decresce
exponencialmente e cresce quando estiver entre zero e a saturação.
Figura 5- População que tende a superpopulação em determinado tempo.
Fonte: BASSANEZI, R. C.; FERREIRA JR, W. C. Equações diferenciais com aplicações. São Paulo: Harbra,
1988.
3.3 Expressões matemáticas do crescimento bacteriano
Considerando o crescimento de microrganismos em um meio de cultura, num
determinado espaço de tempo, quando há grande quantidade de nutrientes e poucas
substâncias tóxicas, o crescimento é exponencial, aumentando em progressão geométrica. A
multiplicação de bactérias, conforme visto no capítulo 2, se dá por divisão binária (BORZANI
et al, 2001).
A população final N de uma célula será:
N = 1 x 2n
(13)
50
Conforme Pelczar, Chan e Krieg (1997), o número de bactérias no tempo inicial não
será 1, portando utiliza-se N 0 , onde n, será o número de gerações:
N = N0 x 2n
(14)
log N  log N 0
0,301030
(15)
Isolando n, temos:
n=
O tempo de geração, ou seja, o tempo que leva para dobrar a população é determinado
por g onde t é um intervalo de tempo particular:
g=
t
n
(16)
3.4 Microbiologia Preditiva
Segundo Forsyth (2002), dentre os fatores mais importantes que afetam o crescimento
bacteriano são pH, atividade da água e a temperatura. A microbiologia de alimentos preditiva,
combina microbiologia, matemática e estatística, e tem o principal objetivo de descrever
matematicamente o desenvolvimento de microrganismos sob condições de crescimento
prescritas, para quantificar os riscos de segurança do produtos alimentícios.
Os modelos preditivos são classificados em três níveis. Os mais simples, quantificam o
aumento de biomassa microbiana com o tempo. Estes modelos de primeiro nível começam
com simples equações de condições de crescimento e condições de não crescimento. Já os
modelos subsequentes descrevem o tempo de incubação e o crescimento, descrevendo os
parâmetros de crescimento e plotagem da curva de crescimento durante a fase exponencial.
Ainda conforme Forsyth (2002) a função de Gompertz tornou-se o modelo primário
mais utilizado. Essa função produz uma curva sigmoidal que consiste de quatro fases da curva
de crescimento microbiano, sendo esta função definida como:
log( Nt )  A  Ce e(exp( B (t M )))
Onde:
Nt = densidade da população (UFC/mL) em um dado tempo t (horas)
(17)
51
A= densidade da população inicial (log(UFC/mL))
C= diferença entre as densidades da população inicial e máxima (log(UFC/mL))
M= tempo da taxa de crescimento máximo (horas)
B= faixa de crescimento máximo relativa a M (log(UFC/mL)/horas)
Os modelos de segundo nível descrevem os fatores ambientais como temperatura, pH
e atividade da água. A equação de superfície-resposta de segunda ordem, o modelo de raiz
quadrada e as relações de Arrhenius são os três modelos existentes.
Para gerar modelos que calculem a resposta microbiana às mudanças de condições e
comparem os efeitos das diferentes condições, se utilizam dos modelos de primeiro e segundo
nível, recaindo em um modelo de terceiro nível.
52
4 ESTATÍSTICA
A biologia por ser uma ciência experimental utiliza técnicas estatísticas para resolução
de problemas e análise de novos métodos que facilitam a obtenção de resultados
(RODRIGUES, 2002). Segundo Callegari (2003), os dados de uma pesquisa podem ser
organizados em tabelas e gráficos, tendo assim uma visão mais imediata da distribuição dos
valores.
O cálculo da média dos dados é realizado pela fórmula:
X 
onde
X
X
(18)
n
é a soma dos valores de X e n é o número de amostras.
Segundo Triola (2005), o desvio padrão de uma população é dado por:
( X  )

2
(19)
n
A variação de uma população de dados é dada por:

2
 ( X  )

2
(20)
n
sendo  a média da população.
Segundo Triola (2005), o desvio padrão para dados amostrais é dado por:
(X  X )
S
2
(21)
n 1
A variância amostral é dada por:
S2 
(X  X )
n 1
2
(22)
onde X é a media das amostras.
A variância é a medida de dispersão ou ainda diferença entre os valores extremos
levando em conta todos os valores observados.
53
Segundo Triola (2005), o Coeficiente de Variação (CV) descreve o desvio padrão
relativo à média e pode ser dado por:
CV 
S
.100%
X
(23)
Para amostra. Ou para população
CV 


.100%
(24)
Para mostrar que determinado fator é a causa de um fenômeno observado, deve se ter a
certeza de que nenhum outro fator seja considerado como responsável. Para isso realiza-se um
experimento controlado rigorosamente no qual todas as variáveis são mantidas fixas, exceto a
que se está estudando. Na prática é difícil realizar um experimento rigorosamente controlado.
Para evitar todos esses fatores não controlados, apela-se para a aleatorização, de modo que
possam ser combinadas variações causadas por fatores estranhos, sendo consideradas como
“acaso” (FREUND e SIMON, 2000).
Ainda baseado em Freund e Simon (2000), a análise de variância expressa uma
medida da variação total em um conjunto de dados, como uma soma de termos atribuídos a
uma causa específica. Os experimentos que envolvem o acaso, ou seja ocorrem variações
causadas por fatores não controlados com apenas um fator experimental, onde somente um
fator é considerado como a causa de um fenômeno, acarretam uma análise de variância de um
critério, onde a medida da variação total de kn observações consistindo de k amostras de
tamanho n. Para calcularmos a soma total de quadrados utilizamos a fórmula abaixo, onde x ij
é j-ésima observação e i-ésima amostra (i=1,2,...,k e j=1,2,...,n) e X é a média global, para
calcularmos a Soma Total dos Quadrados (STQ) acaso

(25)
STQ  SQ(Tr)  SQE
(26)
k
n

STQ   xij  x..
2
i 1 j 1
Ou ainda,
Sendo SQ(Tr) a soma dos quadrados dos tratamentos e SQE a soma dos quadrados de
erros.
O Quadrado Médio de Tratamento QM(Tr) é calculado dividindo
54
QM (Tr ) 
SQ(Tr )
k 1
(27)
E o Quadrado Médio de Erro QME por:
QME 
SQE
k (n  1)
(28)
O teste relativo a diferença de médias é calculado por:
F
QM (Tr )
QME
(29)
Os resultados são apresentados numa tabela 2.
Tabela 2- Análise de variância
Fonte de
Graus de
variação
liberdade
Tratamentos
k-1
Erro
Total
k(n-1)
kn - 1
Soma de
quadrados
SQ(Tr)
Quadrado médio
F
QM(Tr)
QM (Tr )
QME
SQE
STQ
QME
Fonte: Freund e Simon (2000), pág. 279
Conforme Freund e Simon (2000), a análise de variância de dois critérios é relativa a
experimentos em que se usam blocos, ou seja, duas variáveis em causa como tratamentos ou
experimentos de dois fatores, em que ambas as variáveis têm interesse material. Para esse tipo
de análise existe duas maneiras de analisar experimentos de dois fatores: como variáveis
independentes ou quando apresentam interação. A interação acontece quando há diferenças
entre fatores, enquanto que a igualdade apresenta a não interação revelando que as variáveis
são independentes.
A Soma de Quadrados de Blocos é calculada por:
SQB 
1 n 2 1 2
 T. j  kn .T ..
k j 1
(30)
Onde Tj. representa o total de todos os valores do j-ésimo bloco.
A Soma de Quadrado Total (SQT) é calculada assim:
SQT  SQ(Tr)  SQB  SQE
(31)
A Soma de Quadrados de Erros
SQE  STQ  [SQ(Tr)  SQB]
Construindo a seguinte tabela 3:
(32)
55
Tabela 3- Análise de variância de dois critérios (sem interação)
Fonte de
Graus de
Soma de
Quadrado médio
variação
liberdade
quadrados
SQ(Tr )
Tratamentos
k-1
SQ(Tr)
QM (Tr ) 
k 1
SQB
Bloco
n- 1
SQB
QMB 
n 1
SQE
Erro
(k - 1)(n - 1)
SQE
QME 
(k  1)(n  2)
Total
kn - 1
STQ
F
QM (Tr )
QME
QMB
QME
Fonte: Freund e Simon (2000), pág. 286
Para Callegari (2003), em muitos estudos de ciências biológicas é preciso avaliar a
existência da associação entre duas características quantitativas. Quando é possível
demonstrar essa associação, afirma-se que as duas variáveis estão correlacionadas. A
correlação nada mais é do que a medida da intensidade de associação existente entre duas
variáveis quantitativas.
O coeficiente de correlação produto-momento (r) foi proposto por Pearson em 1896
podendo ser denominado coeficiente de correlação de Pearson. Este coeficiente pode variar de
-1 a +1. Os valores quando negativos indicam correlação inversa, ou seja, quando x aumenta e
y diminui e se positivos correlação direta, isto é x e y variam no mesmo sentido (SOARES;
FARIAS; CESAR, 1991).
Para avaliar a correlação, os dados são representados em um diagrama de pontos ou
diagrama de dispersão. O valor máximo é obtido quando todos os pontos do diagrama estão
em uma linha reta inclinada, e quando essa correlação não existe, os pontos do diagrama se
distribuem em nuvens circulares. Quando os pontos do diagrama formam uma curva, é
necessária uma transformação, por exemplo, logarítmica, a uma ou as duas variáveis, pois
senão r não mede corretamente a associação entre elas (SOARES; FARIAS; CESAR, 1991).
A fórmula mais apropriada para o cálculo do coeficiente de correlação (r) é:
r
 xy 
( x)( y )
n

( x )  
( y ) 2 
2
2
 x 
. y 

n  
n 

2
(33)
O coeficiente de determinação é o quadrado do coeficiente de correlação ( r 2 ), o valor
informa que fração da variabilidade de uma característica é explicada estatisticamente pela
outra variável.
56
Para Callegari (2003), a regressão linear simples expressa a relação entre duas
variáveis quantitativas, a variável dependente y e a independente x. Para o estudo da relação
se inicia com o gráfico de dispersão dos pontos. Quando os pontos estão se aproximando de
uma linha reta temos equação linear com uma variável independente.
A equação da reta, y = A + Bx, onde y é a variável dependente; x a variável
independente; A coeficiente linear (intercepta y) e B coeficiente angular (inclinação da reta).
Para obtenção da reta de regressão de uma amostra da população são calculados a e b que são
estimativas de A e B.
Onde,
b
 xy 
x
2
 x y

n
( x) 2
n
(34)
a  y  bx
(35)
y = a + bx
(36)
assim temos:
A reta de regressão obtida representa o comportamento médio dos valores de y a
medida que os valores de x aumentam, pois para experimentos os valores dificilmente se
colocam exatamente em uma linha reta, mesmo tendendo a um alinhamento.
Os valores de a e b são obtidos pelo Método de Mínimos Quadrados (MMQ),
garantindo que a reta obtida fornece menores distâncias entre os valores observados, o método
é a minimização ou maximização de uma função matemática que procura encontrar o melhor
ajustamento para um conjunto de dados tentando minimizar a soma dos quadrados das
diferenças entre a curva ajustada e os dados. Para trabalhar com o MMQ é necessário analisar
a distribuição de probabilidade dos erros de observações experimentais.
Segundo Soares, Farias e Cesar (1991), a lei de distribuição de Gauss é um modelo
utilizado na análise de erros cometidos em medições experimentais, principalmente quando o
número de observações for grande.
Gauss estabeleceu uma equação de distribuição normal, que possui densidade dada
por:
f ( x) 
1
 2
exp
(x  )2
2 2
Onde,  é a média da distribuição,  é o desvio padrão e x a variável aleatória.
(37)
57
5 METODOLOGIA
5.1 Caracterização do Local
A pesquisa foi desenvolvida na unidade produtora de leite do Instituto Regional de
Desenvolvimento Rural (IRDeR) (Figura 6) pertencente ao Departamento de Estudos
Agrários (DEAg) da Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul
(UNIJUÍ). O IRDeR se encontra no município de Augusto Pestana, região noroeste do estado
do Rio Grande do Sul.
Figura 6- Imagem da estrutura física do IRDeR. Observa-se à direita, os locais relacionados à
coleta do leite: sala de ordenha e canzil.
5.2 Delineamento Experimental
A pesquisa foi realizada durante os dias 4 a 6 de julho do ano de 2012, onde foram
coletadas amostras de leite cru para análise de CBT (Contagem Bacteriana Total). Durante o
período de coleta a temperatura variou de 12,5 a 25ºC considerando período de precipitação
de chuva. O agente de coleta foi o mesmo em todos os momentos, tomando-se o cuidado de
evitar contaminação da amostra (Figura 7). As coletas ocorreram no mês de julho, durante o
período de inverno, sendo que as amostras coletadas sofreram influência da temperatura e da
58
mistura das ordenhas. Foram consideradas três misturas de ordenhas, as quais permaneceram
em tanque de expansão por até 42 horas.
Figura 7- Coleta das amostras diretamente no tanque de expansão. Observa-se a utilização de
avental, luvas, gorro e máscara, evitando-se a contaminação da amostra.
A unidade produtora do IRDeR tem rigoroso controle sanitário sobre seu rebanho. Os
animais recebem dieta alimentar controlada, cuidados de bem estar e adequado manejo,
evitando-se o estresse e consequentemente diminuição na produção. A sala de ordenha é
mecanizada e de fácil limpeza, operada por funcionário capacitado. Possui em sua saída, um
galpão de alimentação, denominado canzil, para onde os animais são conduzidos ao término
da ordenha (Figura 8). Alimentando-se nessa ocasião, as vacas mantêm-se em estação até que
os esfíncteres mamários voltem a ocluir. Esse manejo reduz significativamente a
contaminação bacteriana ascendente e consequentemente os casos de mastite clínica e
subclínica.
No IRDeR são realizadas duas ordenhas diárias de todas as vacas em lactação, sendo a
primeira realizada às sete horas e a segunda, às dezessete (Figura 9). O fato do intervalo de
ordenhas ser de 10 horas entre a ordenha da manhã e a da tarde e de 14 horas entre a ordenha
da tarde e a da manhã do dia, segue o quadro de horas dos funcionários envolvidos.
59
Figura 8- Conjunto sala de ordenha e galpão de alimentação (acima). Animais aguardando
início da ordenha em ambiente de fácil limpeza (à esquerda). Canzil para alimentação após a
ordenha (à direita).
Figura 9- Imagem dos animais dentro da sala de ordenha durante o procedimento de coleta do
leite.
60
No local de estudo, o tanque de expansão direta possui capacidade de armazenagem de
3.000 litros de leite (Figura 10). O procedimento de limpeza desse tanque segue o protocolo
de pré-enxágue, limpeza alcalina e ácida, e logo após seu esvaziamento, também é feita sua
sanitização. O leite ordenhado é colocado diretamente no tanque através de tubulação (Figura
10), permanecendo até a quarta ordenha consecutiva, quando é imediatamente recolhido. Os
resultados das amostras aqui analisadas, demonstraram excelente qualidade microbiológica do
leite, sugerindo ótimas práticas de manejo e higiene executadas no IRDeR.
Figura 10- Tanque de expansão a granel (resfriador) recebendo o leite diretamente pela
tubulação interligada à sala de ordenha.
5.3 Procedimento Experimental
As amostras foram coletadas seguindo as instruções sugeridas pelo laboratório no qual
seriam realizados os exames. Antes de realizar a coleta, o leite foi homogeneizado pelo
agitador do tanque de expansão, durante cinco minutos, quando foi verificada a temperatura.
Durante a coleta, conforme já citado anteriormente, o agente utilizou luvas descartáveis,
máscara, gorro e avental. A antissepsia dos instrumentos de coleta foi realizada com álcool
61
etílico 70%, evitando a contaminação iatrogênica do leite. Utilizando-se coletor de aço
inoxidável, foram obtidas amostras de diferentes pontos do resfriador e colocadas na jarra.
Imediatamente após, retirou-se o frasco com azidiol da embalagem, fazendo a identificação da
amostra. O leite coletado foi então colocado em frascos estéreis de 50 mL, e homogeneizado
levemente para que o comprimido de azidiol, já incluso individualmente por frasco, se
dissolvesse. As amostras foram acondicionadas e transportadas em caixa isotérmica, sob
refrigeração de gelo reciclável, até o laboratório da Universidade de Passo Fundo,
caracterizado a seguir, onde se realizou a contagem automatizada.
O laboratório de Serviço de Análise de Rebanhos Leiteiros (SARLE) pertence ao
Centro de Pesquisa em Alimentos (CEPA), da Universidade de Passo Fundo (UPF). Possui o
equipamento Bactocount IBC da Bentley, o qual executa as análises de forma automatizada,
obtendo-se os resultados em Unidades Formadoras de Colônias por mililitro (UFC/mL).
As coletas foram realizadas ao longo de três ordenhas, com amostras de diferentes
períodos, obtendo-se três repetições em cada tempo de coleta do leite. Ressalta-se novamente
que tais coletas ocorreram diretamente do tanque de expansão, sempre com a aferição
concomitante da temperatura.
A primeira ordenha foi realizada às 17 horas do dia 04 de julho de 2012, iniciando a
coleta das primeiras amostras diretamente da tubulação (Figura 11 - C1). As amostras
seguintes (C2, C3, C4, C5 e C6) foram coletadas de dentro do resfriador (conforme
representado na Figura 11).
A segunda ordenha foi realizada às 07 horas do dia 05 de julho de 2012, quando se
iniciou novamente pela coleta de amostras diretamente da tubulação (Figura 11 - C7), e as
demais amostras (Figura 11 - C8, C9, C10, C11 e C12) foram coletadas de dentro do
resfriador, consequentemente com o leite da primeira e segunda ordenha já misturado.
A terceira ordenha foi realizada às 17 horas do dia 05 de julho de 2012. A coleta
inicial repetiu o procedimento de retirada diretamente da tubulação (Figura 11 - C13), e as
demais amostras (Figura 11 - C14, C15, C16, C17 e C18) colhidas de dentro do resfriador, já
com a mistura das três ordenhas. A figura 11 representa esquematicamente todos os períodos
de coleta das amostras.
62
Figura 11- Representação dos períodos de coleta. Amostras C1, C7 e C13 (leite na
temperatura fisiológica do animal), representam a população de bactérias novas que serão
adicionadas ao resfriador, representando o momento t0. Amostras C2, C8 e C14, ocorreram
uma hora após começo da ordenha. As amostras C3, C9 e C15 representam a população de
bactérias três horas após o início das ordenhas, as amostras C4, C10 e C16, cinco horas após,
as C5, C11 e C17, sete horas após e C6, C12 e C18 nove horas após início das ordenhas.
1ª ORDENHA
2ª ORDENHA
3ª ORDENHA
04/07/2012
05/07/2012
05/07/2012
C7
C1
07h
17h
C13
17h
C2
18h
C8
08h
C14
18h
C3
20h
C9
10h
C15
20h
C4
22h
C10
12h
C16
22h
C5
24h
C11
14h
C17
24h
C6
02h
C12
16h
C18
02h
Considerou-se nesse trabalho, que para obtenção de baixa contagem bacteriana,
adotaram-se todos os cuidados necessários no processo de produção e coleta do leite,
resultando em um produto de boa qualidade, ou seja, com baixa carga microbiológica.
63
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na tabela 4 da análise da fonte de variação para o tempo de coleta e momento de
ordenha, foi observado que o efeito principal dessas fontes de variação se mostraram efetivas
em alterar a temperatura e o número de bactérias. Além disso, a magnitude de quadrado
médio potencializa o tempo de coleta como o mais importante em alterar a temperatura nestas
condições de ordenha. Por outro lado para o número de bactérias a magnitude entre ambos os
fatores mostrou de certa forma importância similar sobre esta variável.
Ressalta-se a interação significativa observada entre ambos os fatores o que recai na
necessidade de desenvolver modelos que permitam analisar os efeitos simples de cada
condição de momento de ordenha e tempo de coleta do leite. Observa-se os reduzidos valores
de coeficiente de variação, denotando em qualidade experimental e confiabilidade das
inferências a serem propostas.
Tabela 4- Resumo da análise de variância considerando os efeito de tempo de coleta do leite
sobre momento de ordenha, e suas interações, em várias temperaturas e número de bactérias.
Quadrado Médio
Graus de
Fonte de Variação
Temperatura
Número de Bactérias
Liberdade
(°C)
(x1000 UFC/mL)
Tempo de Coleta do
5
1430,94*
87,20*
Leite (TCL)
2
2,91*
64,50*
Momento de Ordenha (MO)
10
2,44*
17,90*
TCL X MO
36
0,38
2,00
Erro
Total
53
Média geral:
9,58
14,33
Coeficiente de Variação (%):
6,39
9,87
Após a comparação de médias, pelo modelo Scott-Knott (Tabela 5), foi observado que
a temperatura do leite retirado diretamente da tubulação, anterior à chegada do resfriador
(tempo 0), demonstrou valores entre 35,1° e 35,3°C nos diferentes momentos de ordenha. Tal
condição era esperada, visto representar a temperatura natural do leite que sai do úbere,
variando de 35° a 37°C, quando recém ordenhado (BEHMER, 1999). Nesse processo de
conservação do leite pelo frio, recomendasse que, na segunda hora após a ordenha, a
64
temperatura deva atingir 4°C, condição esta que não impede por completo a proliferação de
microrganismo (FAGUNDES et al. 2006).
No momento da primeira ordenha se percebe a acentuada redução de temperatura
(Tabela 5) ao finalizar a primeira hora de resfriamento. Além disso, no momento de ordenha 1
e 2 a partir da terceira hora de resfriamento, mostrou estabilidade da temperatura, situando-se
numa condição ao redor de 3,8 a 4,1°C. No Brasil o leite cru deve ser armazenado em tanques
de expansão à 4°C por um período máximo de 48h, até que seja recolhido por caminhões
específicos (ARCURI et al. 2006). Baseado nisso, entende-se que possam ocorrer até quatro
misturas de ordenhas, visto ocorrer sempre uma ordenha pela manhã e outra no período da
tarde, com intervalos médios de 10 a 12 horas.
A tabela 5 demonstra na coluna “Temperatura do leite/Momento de ordenha”, que
após a mistura do leite da segunda ordenha (2ª manhã), o tempo de resfriamento para se
atingir 4°C foi estatisticamente igual ao da primeira ordenha (1ª tarde). Ressalta-se que no
momento da terceira ordenha (3ª tarde) a estabilidade já foi adquirida a partir da primeira hora
dando subsídios para inferir que o volume de leite das ordenhas anteriores são decisivas na
redução mais drástica da temperatura e sua estabilidade, condição também comprovada ao
analisar a primeira hora de coleta do leite em que o momento 3 mostrou médias
estatisticamente mais reduzidas do que os momentos 1 e 2. Explica-se esse fato ao entender
que a cada nova adição de ordenhas, o leite adicionado é misturado a volumes cada vez
maiores de leite frio, diminuindo assim o tempo para se atingir 4°C.
65
Resfriador
Tabela 5- Valores médios pelo modelo de Scott-Knott para os efeitos de temperatura e
número de bactérias (NBac).
Tempo de Coleta
Temperatura do Leite
Número de Bactérias
do Leite
(ºC)
(x1000UFC/mL)
(horas)
Momento de Ordenha
Momento de Ordenha
1ª(tarde) 2ª(manhã) 3ª(tarde)
1ª(tarde) 2ª(manhã) 3ª(tarde)
Tubulação (0)
A 35,2 a A 35,3 a A 35,1 a
A 12 b
C5c
B8c
A 8,2 b
A8b
B 4,3 b
B 13 b
B 13 b
A 20 a
1
A 3,7 c
A 3,7 c
A 3,7 b
B 15 a
A 17 a
A 18 a
3
A 4,1 c
A 3,8 c
A 3,9 b
A 17 a
A 16 a
A 17 b
5
A 4,5 c
A 3,8 c
A 3,9 b
A 18 a
B 11 b
A 16 b
7
A 3,8 c
A 3,5 c
A 3,9 b
A 16 a
B 11 b
A 15 b
9
Dados Meteorológicos
Volume médio por momento de ordenha – 749,5 litros
Precipitação – 20 milímetros – 3ª(tarde)
Temperatura – 25°C - 1ª ordenha (tarde); 15°C - 2ª ordenha (manhã); 12,5°C - 3ª ordenha (tarde)
No momento esvaziar o resfriador a contagem estava em 17 mil UFC/mL. O caminhão fez a coleta
aproximadamente às 9h da manhã do dia 06 de julho.
Momento 0 – direto da tubulação
Médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas na Horizontal constituem grupo estatisticamente
homogêneo.
Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas na Vertical constituem grupo estatisticamente
homogêneo.
Considerando a proliferação bacteriana, é possível observar na tabela 5, que no
primeiro momento de ordenha, a análise do número de bactérias presentes no leite mostrou
valores menores àquele aferido na primeira hora de resfriamento. A partir daí, o crescimento
bacteriano foi estatisticamente superior aos demais tempos de resfriamento, porém mantendo
estabilidade ao redor de 15 a 18 mil UFC/mL.
Segundo PEREDA (2005) no interior do úbere, mesmo que o animal esteja saudável,
existem bactérias que contaminam o leite no momento da ordenha. Dessa forma, a contagem
de microrganismo é baixa, podendo variar de 500 à 1.000 bactérias/ml (FRAZER;
WESTHOFF, 1978). É preciso considerar ainda, os microrganismos presentes nos
equipamentos de ordenha e no tanque de expansão, que chegam a atingir até 20.000
bactérias/ml (FRAZER; WESTHOFF, 1978). Analisando a segunda ordenha, ou seja a
ordenha da manhã a adição do leite colhido da tubulação mostrou a mais reduzida densidade
bacteriana (5.000 bactérias/ml), condição possivelmente favorecida pelas temperaturas
amenas do amanhecer (15,14°C). Segundo ALVES (2006) as estações do ano interferem nos
valores de CBT. Durante o inverno ocorreram as menores taxa devido às condições
66
ambientais de menores temperaturas, umidade relativa do ar e precipitação pluviométrica,
sendo essas, condições desfavoráveis à multiplicação microbiana.
Obviamente, o resfriamento do leite deve estar associado com boas práticas de manejo
dos animais, higiene e limpeza dos tanques, além da sanitização dos utensílios utilizados na
ordenha. Esses cuidados devem ser ainda maiores para programa de captação de leite nas
fazendas a cada 48 horas, pois o risco de proliferação de microrganismos psicotróficos é ainda
maior (FONSECA; SANTOS, 2004). Retomando a análise da segunda ordenha, a partir da
primeira hora, houve crescimento bacteriano significativo até três horas após a retirada do
leite, ocorrendo estabilização até a sétima hora, quando ocorreu redução do crescimento e
nova estabilização.
Na terceira ordenha, ao se atingir a primeira hora de refrigeração, identificou-se o
maior crescimento bacteriano, fato que só veio a reduzir, após cinco horas de refrigeração,
quando houve a estabilização do número de bactérias (Tabela 5). De modo geral percebe-se
que de todos os tempos de coleta do resfriador, esse foi o que mostrou os maiores valores de
densidade bacteriana. A situação observada pode estar apoiada na condição climática, visto
que a média de precipitação pluviométrica nesse período de coleta foi de 25,93 mm,
corroborando com ALVES (2006) que correlaciona a chuva com as altas taxas de CBT. É
importante salientar que todos os valores de CBT aqui obtidos, encontram-se dentro dos
permitidos pela IN 62. Os baixos valores encontrados correlacionam-se com as corretas
práticas de higiene seguidas durante todo o processo de ordenha, resfriamento e amostragem
do leite.
O resfriamento do leite, por sua vez, diminui a velocidade específica do crescimento
ou da reprodução bacteriana, diminuindo assim sua atividade metabólica (TORTORA;
FUNKE; CASE, 2003). Segundo Fonseca e Santos (2000), após resfriado permanece um
pequeno crescimento, porém mais lento.
O sistema leiteiro aqui estudado refere-se ao de resfriamento a granel onde
necessariamente se estabelece um sistema aberto de renovação de nutrientes. Transcorrido um
período após a primeira ordenha, adiciona-se ao tanque de expansão uma segunda ordenha
para ser refrigerada, fornecendo novos nutrientes ao meio e elevando a temperatura. Esse
modelo pode ser contínuo em até quatro ordenhas, considerando a legislação, que prevê
armazenamento do leite por até 48horas.
Ao entender os princípios de crescimento populacional de Malthus, percebe-se que
tanto a adição de novos nutrientes, como a elevação da temperatura, a cada ordenha
67
adicionada, elevariam significativamente a proliferação bacteriana. Entende-se que não
ocorreria a saturação do meio, gerando um crescimento exponencial ilimitado, descrito por
uma equação exponencial. Entretanto, não foi esse o resultado observado nesse trabalho.
A tabela 6 apresenta o comportamento do Momento de Ordenha 1º (tarde). Nos
diferentes períodos, o número de bactérias mostrou tendência linear, com significância do
quadrado médio de grau 1 e com parâmetro de inclinação da reta (bij) também significativo.
Entretanto, o coeficientes de determinação obtido a partir da regressão polinomial foi maior
que o conseguido a partir da regressão polinomial de grau 2.
O comportamento dos Momentos de Ordenha 2 (manhã) e 3 (tarde), nos diferentes
períodos, mostrou tendência linear nas análises do número de bactérias, com significância do
quadrado médio de grau 2 e com parâmetro de inclinação da reta (bij) também significativo
(Tabela 6). De modo geral, os coeficientes de determinação obtidos a partir da regressão
polinomial de grau dois foram maiores que os conseguidos a partir da regressão polinomial de
grau um, expressando confiabilidade dos dados e das inferências a serem obtidas. As curvas
traçadas por equações quadráticas indicaram melhor ajuste que as retas obtidas utilizando o
método de regressão linear simples.
Percebeu-se que as temperaturas baixas, mantida dentro das normas exigidas pelos órgãos
competentes, neutralizaram o crescimento bacteriano durante o período das 42 horas
avaliadas. Pode-se observar inclusive, diminuição progressiva dos coeficientes de
determinação nos momento de ordenha 2 (manhã) e 3 (tarde), atribuindo-se essa condição ao
fato de que a cada nova ordenha misturada, o resfriamento do leite ocorria mais rápido,
considerando o grande volume de leite gelado que já havia no tanque (749,5 litros de leite
adicionado ao tanque a cada nova ordenha).
Estimou-se o tempo mínimo, necessário para se atingir o número máximo de bactérias
em cada ordenha (Tabela 6, coluna “Tempo mínimo/horas”). Após obtenção de tempo
mínimo, determinou-se qual era o número máximo de bactérias presentes cada ordenha,
através da equação de grau 2. Todos eles foram estatisticamente iguais aos valores reais
encontrados nesse trabalho. Optou-se por estimar o número de bactérias, no momento em que
o leite do tanque atingiu a temperatura de 4°C (temperatura determinada pela legislação como
a ideal para manutenção do leite até seu recolhimento). Pode-se observar, que novamente os
valores estimados foram estatisticamente iguais aos valores reais observados nesse trabalho.
68
Tabela 6- Resumo análise de variância de equação de regressão polinomial e seus parâmetros
para NBac no leite cru durante três ordenhas com os valores médios gerais de tempo (T) de
armazenamento do leite.
Momento
de
Ordenha
1ª
2ª
3ª
Fonte de
Variação
L
Quadrado
Médio
Número de
Bactérias
56,45*
Q
19,96*
Erro
0,47
L
12,36*
Q
179,84*
Erro
0,7
L
Q
10,13*
87,57*
Erro
2,07
Número de
Bactérias
y=a± bx±cx2
(x1000 UFC/mL)
12,85+0,56x
R2
(%)
P Tempo
NBac
NBac
NBac
(bix) Mínimo (x1000
(x1000
(x1000
(horas) UFC/mL) UFC/mL)
UFC/mL)
Estimado Estimado 3h Real 3h
70,12 *
-
11,62+1,72x-0,13x2 94,92
*
6,62
62,30
*
-
80,20
*
14,68+0,24x
59,23
12,11+2,68x-0,28x² 78,46
ns
11,08+0,26x
2
7,39+3,76x-0,40x
*
17,31
15,61
15
4,80
16,22
15,07
17
4,17
18,40
17,63
15
Na tabela 6 ainda podemos verificar o período até o qual se obtém maior número de
bactérias. Constata-se que no momento de ordenha 1ª (tarde) este tempo é maior (6,62 horas),
pois todo volume do resfriador está a 35ºC, o qual favorece o crescimento bacteriano. A partir
a 2ª ordenha este tempo diminui, pois o volume da 1ª ordenha já está resfriado, este valor
diminui ainda mais na 3ª ordenha onde o volume resfriado é maior que o recém depositado,
conforme já mencionado anteriormente. A necessidade dessa aferição é justificada na
literatura, visto a necessidade do rápido resfriamento do leite para dificultar a proliferação de
bactérias (SOUZA, 2006).
A validação matemática é realizada através de quantificação para verificar se o modelo
encontrado descreve bem os dados experimentais, ou seja a aderência entre os dados reais e
aqueles previstos pelo modelo estatístico (BRAULE, 2001). Observa-se a partir da figura 12 a
eficácia da resposta pelo modelo estimado, pois o mesmo tende a acompanhar o
comportamento real, durante o período de coleta, validando o modelo para número de
bactérias.
69
Figura 12- Comparativo entre o modelo polinomial de grau dois (número de bactérias
estimado) e valores reais (número de bactérias real) encontrado nas amostras. (a) Momento de
Ordenha – 1ª (Tarde); (b) Momento de Ordenha – 2ª (Manhã); (c) Momento de Ordenha – 3ª
(Tarde).
O comportamento dos Momentos de Ordenha nos diferentes períodos mostrou tendência
não linear nas análises de temperatura, com significância do quadrado médio para o modelo
Logarítmico 10 e com parâmetro de inclinação da reta (bij) também significativo (Tabela 7).
De modo geral, os coeficientes de determinação obtidos a partir da regressão de vários
modelos, foram maiores que os observados a partir das regressões polinomiais, expressando
confiabilidade dos dados e das inferências a serem obtidas. As curvas traçadas por equações
logarítmicas indicaram melhor ajuste que as retas obtidas utilizando o método de regressão
polinomial.
70
Tabela 7- Equações não lineares ajustadas para estimativa da temperatura.
Temperatura Temperatura
Momento de
P
R2
Equações
Estimada (°C) Real (°C)
(%)
Ordenha
(bix)
(3 horas)
(3 horas)
Temperatura do Leite
1ª
8,10-5,40Log(x)
0*
99,35
5,52
3,7
(Tarde)
2ª
7,84-5,47Log(x)
0*
99,55
5,23
3,7
(Manhã)
3ª
7,29-5,46Log(x)
0,01*
98,12
4,68
3,7
(Tarde)
As avaliações do modelo estimado sobre o valor real estão demonstradas na figura 13,
sob a forma de gráficos.
Figura 13- Comparativo entre o modelo polinomial de grau dois (Temperatura estimada) e
valores reais (Temperatura real) encontrado nas amostras. (a) Momento de Ordenha – 1ª
(Tarde); (b) Momento de Ordenha – 2ª (Manhã); (c) Momento de Ordenha – 3ª (Tarde).
71
Observa-se a partir da figura 13 a eficácia da resposta pelo modelo estimado, visto que
o mesmo tende a acompanhar o comportamento real durante o período de coleta, validando o
modelo encontrado para temperatura.
Para todas as análises, foi utilizado o programa computacional Genes (CRUZ, 2006).
Adotou-se o procedimento “Stepwise” para selecionar a variável que melhor explicasse à
variável resposta procurada. Para tanto, considerou-se os momentos de ordenha, o período de
coleta e a temperatura como variáveis independentes e o número de bactérias como variável
dependente. Após a análise, o modelo obtido pela regressão múltipla mostrou que a
temperatura foi a variável que influenciou no crescimento bacteriano, dentro do período
avaliado no projeto.
Silva (2008) relata, em seu trabalho, que os resultados da CBT não diferiram durante o
tempo de estocagem do leite cru refrigerado para as 72 horas avaliadas no período chuvoso já
no período seco a partir das 24 horas de armazenamento já ultrapassavam o limite da
legislação. No período seco a CBT foi mais elevada, mas a maior contagem de psicrotróficos
foi observada no período chuvoso, demonstrando que esses microrganismos não tem uma
relação direta com a CBT, os resultados dependem das condições de obtenção e manutenção
do produto (SILVA, 2008). Só foi possível corroborar tais resultados nas primeiras 42 horas,
considerando ainda depender da carga inicial de bactérias e da precipitação de chuva.
Ressalta-se novamente que todos os valores obtidos na CBT durante esse trabalho,
encontram-se dentro dos valores permitidos pela IN 62. Os baixos valores encontrados estão
relacionados às boas práticas de higiene e manejo desenvolvidas na propriedade foco do
estudo.
72
7 CONCLUSÕES
- A Mistura de até três ordenhas distintas em tanque de expansão acelera a velocidade
de resfriamento do leite.
- O tempo de manutenção do leite no resfriador não eleva o número de bactérias
durante as 42h.
- Baseados em regressões múltiplas “stepwise”, afirma-se que a temperatura é o fator
que eleva o número de bactérias.
- Durante o tempo de resfriamento do leite em tanque de expansão, há tendência
polinomial de grau dois para o número de bactérias, contudo a temperatura adequou-se ao
modelo não linear logarítmico.
73
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