MICROVESÍCULAS TUMORAIS: Papel na Biologia do

Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Bioquímica Médica
LUIZE GONÇALVES LIMA
MICROVESÍCULAS TUMORAIS:
Papel na Biologia do Tumor com Ênfase em
Processos Imunossupressivos
e Pró-Trombóticos
Rio de Janeiro
Março de 2008
MICROVESÍCULAS TUMORAIS:
Papel na Biologia do Tumor com Ênfase em
Processos Imunossupressivos e Pró-Trombóticos
Luize Gonçalves Lima
Dissertação submetida ao Instituto de
Bioquímica
Médica
-
IBqM
da
Universidade Federal do Rio de Janeiro
- UFRJ, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do grau de
Mestre em Química Biológica
Orientador: Dr. Robson Q. Monteiro
Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica/CCS/UFRJ
Co-orientador: Dr. Marcello A. Barcinski
Professor Titular do Departamento de Parasitologia/ICB/USP
Rio de Janeiro
Março de 2008
iii
Folha de Aprovação
Luize Gonçalves Lima
MICROVESÍCULAS TUMORAIS: papel na biologia do tumor com
ênfase em processos imunossupressivos e pró-trombóticos
Rio de Janeiro, 07 de março de 2008.
_______________________________________
(Dr. Robson de Queiroz Monteiro, Prof. Adjunto do IBqM, UFRJ)
_______________________________________
(Dr. Marcello Barcinski, Prof. Titular do Instituto de Ciências Biomédicas, USP)
_______________________________________
(Dra. Russolina Benedeta Zingali, Profª. Adjunta do IBqM, UFRJ )
_______________________________________
(Dr. Hugo Caire de Castro Faria Neto, Pesquisador Titular da FIOCRUZ, RJ)
_______________________________________
(Dr. Roger Chammas, Prof. Associado da Faculdade de Medicina da USP, SP)
_______________________________________
(Dra. Vivian Mary B. D. Rumjanek, Profª. Titular do IBqM, UFRJ)
_______________________________________
(Dra. Sandra König, Profª. Adjunta do Instituto de Ciências Biomédicas, UFRJ)
iv
Ficha Catalográfica
Lima, Luize Gonçalves.
Microvesículas tumorais: papel na biologia do tumor com ênfase em
processos imunossupressivos e pró-trombóticos / Luize Gonçalves
Lima. – Rio de Janeiro, 2008.
xviii, 120f.
Dissertação (Mestrado em Química Biológica) – Universidade Federal
do Rio de Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica – CCS, 2008.
Orientador: Robson de Queiroz Monteiro
Co-orientador: Marcello André Barcinski
1. Palavras chaves:
I. Monteiro, Robson de Queiroz (Orient.). II. Universidade Federal do
Rio de Janeiro. Instituto de Bioquímica Médica. III. Título.
v
A Bete,
por me apresentar à carreira científica de maneira tão prazerosa,
e por me iniciar no “Fantástico Mundo das Microvesículas”,
dois empreendimentos importantes que me trouxeram até esse momento.
vi
Agradecimentos
Gostaria de aproveitar este espaço para agradecer àqueles que foram de
fundamental importância para a realização deste trabalho, assim como às
pessoas que contribuíram, de alguma forma, para a minha formação profissional,
assim como para meu crescimento pessoal.
Primeiramente, agradeço a esta força superior cósmica, que me guia e que
me abre portas, e a qual já foi citada por Albert Einstein como “a mais forte
motivação da pesquisa científica”, por se mostrar sempre presente e por tornar
impossível duvidar de sua existência.
Aos meus heróis, meus queridos pais, palavras não são suficientes para
expressar minha enorme gratidão por todo apoio e por todo suporte físico,
emocional e afetivo, acompanhados sempre de seu amor incondicional. Obrigada,
mãe e pai, pela amizade, pela confiança em meus passos e pelo orgulho que
sentem de minhas conquistas, as quais são sempre comemoradas como se
fossem suas próprias.
Por toda sua dedicação e carinho, gostaria de agradecer a minha ‘vó
Cecília’, que me estimula sempre a correr atrás de meus sonhos.
Agradeço ainda aos meus irmãos, especialmente a meu eterno ‘maninho’
Rafael, assim como às minhas queridas cunhadas, pela nossa relação de
amizade, por todo amor e apoio.
E a vocês, meus outros “irmãos”, amigos especiais que escolhi para
fazerem parte de minha vida (e cujos nomes não serão citados porque corro sério
risco de esquecer alguém!), obrigada pela amizade e carinho irrestritos.
A essa pessoa tão especial em minha vida, meu amado companheiro
Osny, agradeço por todos os momentos compartilhados, sejam eles felizes ou
tristes, por toda a ansiedade e estresse suportados, pelo sorriso nas horas
difíceis, pelo amor e cuidado dedicados. Sua presença é essencial em minha
vida, e graças a todo apoio que me destina, continuo construindo meu caminho
nessa atividade apaixonante que é a pesquisa. Aproveito para agradecer pela
segunda família que colocou em minha vida, meus sogros e meu cunhado
queridos, aos quais dedico todo amor e gratidão.
vii
Agradeço ao caríssimo Dr. Marcello Barcinski – Marcello, sem formalidades
– por me acolher na Divisão de Medicina Experimental e especialmente no Grupo
Infecção e Câncer. Obrigada pela confiança em meu trabalho e por todo
direcionamento.
Ao Robson, obrigada por me receber em seu grupo, por toda orientação,
pela troca e doação de idéias, pelos desabafos ouvidos pacientemente, por seu
infinito entusiasmo e pela compreensão e apoio sempre.
Não poderia deixar de agradecer ainda à professora Vivian, pelos
valiosíssimos conselhos e dicas, os quais foram de extrema importância para
determinar os rumos de meu trabalho.
Agradeço também aos “amigos trombóticos” pelo dia-a-dia compartilhado,
repleto de deliciosas conversas, nem sempre muito “científicas”, as quais tornam
a rotina de trabalho bastante agradável. Especialmente às meninas, Andréa,
Andreia, Angélica, Camilla, Dani, Fabiana, Flávia, Luciana, Morgana, Renata e
Tati, é um grande prazer conviver e dividir com vocês não só bancadas, materiais,
computadores, etc., mas também importantes momentos da minha vida.
Aos amigos que fiz na Divisão de Medicina Experimental, e que não
necessariamente
continuam
por
lá,
especialmente
aos
Barcinskianos,
Bonomianos e Martinianos, “companheiros do mesmo lado”, agradeço pela troca
de experiências, pelas pipetas e materiais emprestados, pelas prazerosas (e cada
vez mais raras, no meu caso) pausas para o café... Jéssica, João Luiz, Poli,
Lúcia, Fernanda, Aline, Sheila, João Paulo, Rafa, Ana Paula, Rômulos, Carol,
Chica, Gustavo, enfim, obrigada a todos pela amizade que por vezes extrapolou
as paredes do INCa, proporcionando encontros muito felizes.
À minha aluna talentosíssima, Juliana, obrigada pela nossa relação de
amizade e por me proporcionar desenvolver essa gratificante atividade que é a
orientação, a qual me permite aprender muito mais do que ensinar.
Agradeço aos professores/colaboradores: Dra. Lina Zingali, Dra. Sandra
König, Dr. Roger Chammas, Dr. Ernesto de Meis, Dr. José Morgado, que de
alguma forma contribuíram para a realização desse trabalho, seja através da troca
de idéias e da disponibilidade constante, dos reagentes e materiais emprestados,
ou ainda, dos ensinamentos compartilhados para sempre.
Quero agradecer também ao IBqM, por toda oportunidade e conhecimento
transmitido, e por me permitir conhecer e conquistar amigos maravilhosos.
viii
Finalmente, gostaria de agradecer às agências e instituições de fomento
(Faperj, CNPq, FUJB, INCa/FAF, Swiss Bridge) pello importante suporte
financeiro. Obrigada por todo crédito e investimento no trabalho e, principalmente,
por fazer as coisas acontecerem.
ix
"A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original."
- Albert Einstein -
x
Resumo
Microvesículas (MVs) são fragmentos de membrana liberados a partir da
superfície de diversos tipos celulares, após processos como ativação celular e
apoptose, e sua formação está intimamente ligada à perda de assimetria
fosfolipídica de membrana, especialmente à exposição de fosfatidilserina (PS).
Embora os efeitos biológicos de MVs sejam extremamente variados, acredita-se
que a produção de MVs desempenha uma importante função na biologia tumoral,
com possível envolvimento na modulação de estados imunossupressivos e prótrombóticos. Nesse contexto, procuramos esclarecer o papel de microvesículas
produzidas pelo melanoma no estabelecimento do tumor maligno. Dessa forma,
observamos que células B16F10, uma linhagem de melanoma altamente
metastática, produz, in vitro, grandes quantidades de MVs expondo PS. Tais MVs
foram capazes de estimular, in vitro, a produção de TGF-β1 – um fator
imunorregulatório com grande importância no processo de progressão maligna –
por macrófagos, assim como aumentar o potencial metastático in vivo de células
B16F10. Ambos os efeitos foram dependentes de PS, sendo revertidos por
anexina V. Interessantemente, MVs de melanoma induziram ainda metástases
pulmonares após inóculo de células B16F10 em camundongos BALB/c,
normalmente resistentes a essa linhagem celular. Além disso, buscamos
caracterizar as propriedades pró-coagulantes de MVs produzidas pela linhagem
de melanoma Tm1, tal como comparada à sua linhagem parental de melanócitos
não-tumorigênicos (melan-A). Apesar da taxa de produção de MVs ser
consideravelmente maior na linhagem celular tumoral, a exposição de PS foi
bastante semelhante em MVs derivadas de ambas as linhagens melan-A e Tm1.
Isso se refletiu na capacidade dessas estruturas em promover a formação do
complexo pró-coagulante protrombinase, um processo dependente da presença
de superfícies aniônicas ricas em PS. Como esperado, ambas as MVs permitiram
a ativação de protrombina em níveis similares. Por outro lado, MVs derivadas de
melanoma aceleraram o tempo de coagulação plasmático de maneira mais
eficiente, sugerindo uma maior exposição da proteína iniciadora da coagulação
Fator Tecidual, a qual foi detectada na superfície de células Tm1, mas não de
melan-A. Finalmente, MVs obtidas de plasma de camundongos inoculados com
células de melanoma apresentaram um padrão pró-coagulante similar ao de MVs
produzidas in vitro pela linhagem Tm1. Em conjunto, nossos resultados
demonstram que MVs tumorais desempenham importante papel no
estabelecimento do melanoma maligno in vivo, e indicam sua participação na
modulação de respostas inflamatórias e imunes anti-tumorais, assim como na
ativação do processo de coagulação sanguínea.
xi
Abstract
Microvesicles (MVs) are membrane fragments that can be shed from the cell
surface of various cell types under conditions such as cell activation and
apoptosis, being this phenomenon closely associated with loss of phospholipid
asymmetry, especially to phosphatidylserine (PS) exposure. Despite the variety of
biological effects related to MVs, it is supposed that MVs production play an
important role in tumor biology and might modulate immunosupressive and
prothrombotic states. Within this context, we attempted to elucidate the
contribution of melanoma-derived MVs to the establishment of malignant tumor.
Herein we observed that B16F10 cells, a highly metastatic melanoma cell line,
produce large quantities of PS-containing microvesicles in vitro. Tumor MVs
increased TGF-β1 production by cultured macrophages and, in vivo, enhanced the
metastatic potential of B16F10 cells in C57BL/6 mice, both effects being reversed
by annexin V. Most strikingly, MVs induced melanoma metastasis in BALB/c mice,
which are normally resistant to this tumor cell line. Furthermore, we characterized
the procoagulant properties of MVs produced by the tumorigenic melanoma cell
line Tm1, as compared to its counterpart non-tumorigenic melanocyte-derived cell
line, melan-A. Although the rate of MVs production was considerably higher in the
tumorigenic cell line, PS exposure was nearly identical in MVs from both melan-A
and Tm-1. This result is reflected by the ability of these structures to assembly the
procoagulant complex prothrombinase, a process that is dependent on the
presence of PS-rich anionic membranes. As expected, both MVs supported
prothrombin activation at similar rates. On the other hand, melanoma-derived MVs
shortened the coagulation time of murine plasma in a lower concentration range
than melan-A MVs, suggesting the presence of higher amounts of the clotting
initiator, Tissue Factor. In support of this observation, Tissue Factor was detected
on the surface of Tm1 but not melan-A cells. Finally, MVs obtained from plasma of
melanoma-bearing mice showed a similar procoagulant pattern as compared to
Tm1 MVs produced in vitro. Altogether, our results show that tumor-derived MVs
play an important role in the in vivo establishment of malignant melanoma and
further indicate their involvement in the modulation of host’s inflammatory and/or
anti-tumoral immune responses, as well as in blood coagulation activation.
xii
Lista de Siglas e Abreviaturas
ADP
adenosina difosfato
An V
anexina V
ATP
adenosina trifosfato
BSA
albumina sérica bovina
DME
Dulbecco’s Modified Eagle (meio de cultura)
EDTA
ácido etilenodiaminotetracético
FITC
isoticianato de fluoresceína
FIX
fator IX
FIXa
fator IX ativado
FSC
espalhamento de luz frontal
FVa
fator V ativado
FVIIa
fator VII ativado
FVIIIa
fator VIII ativado
FX
fator X
FXa
fator X ativado
FXI
fator XI
FXIa
fator XI ativado
IFNγ
interferon gama
IL-1β
interleucina 1 beta
IL-10
interleucina 10
IL-12
interleucina 12
LPS
lipopolissacarídeo
MAA
antígeno associado a melanoma
MHC
complexo maior de histocompatibilidade
xiii
Mφ
macrófagos
MVs
microvesículas
PAR
receptor ativado por protease
PBS
salina tamponada por fosfato
PI
iodeto de propídeo
PMA
forbol 12-miristato 13-acetato
PS
fosfatidilserina
PSGL-1
glicoproteína ligante de P-selectina 1
SFB
soro fetal bovino
SSC
espalhamento de luz lateral
TEV
tromboembolismo venoso
TF
fator tecidual
TGF-β
fator de crescimento tumoral beta
TNFα
fator de necrose tumoral alfa
VEGF
fator de crescimento do endotélio vascular
xiv
Lista de Figuras
Figura 1 – Exemplos de MVs liberadas por diferentes tipos celulares
ativados ............................................................................................................
3
Figura 2 – Mecanismos associados ao processo de formação de MVs ..........
5
Figura 3 – Presença de microvesículas no microambiente tumoral ................
8
Figura 4 – Modelo de modulação da resposta imune por microvesículas
tumorais ...........................................................................................................
13
Figura 5 – Cascata de coagulação sanguínea ................................................
15
Figura 6 – Reações da coagulação dependentes de superfícies de
membrana ........................................................................................................
16
Figura 7 – Caracterização de MVs produzidas in vitro por células B16F10 ....
40
Figura 8 – Detecção da exposição do antígeno MAA em MVs de melanoma
por citometria de fluxo ......................................................................................
40
Figura 9 – Análise da exposição PS na superfície de células B16F10 ...........
42
Figura 10 – Análise da exposição de PS em MVs derivadas de células
B16F10 ............................................................................................................
43
Figura 11 – Formação do complexo protrombinase promovida por MVs de
melanoma B16F10 ...........................................................................................
44
Figura 12 – Efeito inibitório de anexina V sobre a formação do complexo
protrombinase induzida por MVs de melanoma ..............................................
45
Figura 13 – Modulação da produção de TGF-β1 por MVs de melanoma em
culturas de macrófagos ativados .....................................................................
46
Figura 14 – Papel de MVs tumorais no estabelecimento do melanoma
B16F10 em camundongos C57BL/6 ................................................................
47
Figura 15 – Papel de MVs tumorais no estabelecimento do melanoma
B16F10 em camundongos BALB/c ..................................................................
49
Figura 16 – Produção de MVs pelas linhagens celulares melan-A e Tm1
51
xv
Figura 17 – Análise da exposição de PS em MVs derivadas de células Tm1
e melan-A .........................................................................................................
53
Figura 18 – Formação do complexo protrombinase promovida por MVs de
melanócitos melan-A e de melanoma Tm1 .....................................................
54
Figure 19 – Atividade pró-coagulante de MVs derivadas das linhagens
celulares melan-A e Tm1 .................................................................................
56
Figura 20 – Análise da exposição de Fator Tecidual em células Tm1 e
melan-A ............................................................................................................
56
Figura 21 – Análise da presença de MVs em plasma de camundongos
C57BL/6 inoculados com células de melanoma Tm1 ou melanócitos
melan-A ............................................................................................................
58
Figure 22 – Atividade pró-coagulante de MVs obtidas ex vivo a partir do
plasma de camundongos inoculados com a linhagem celular Tm1 ................
59
xvi
Sumário
1. Introdução .................................................................................................
1
1.1. Microvesículas .......................................................................................
2
1.1.1. Breve histórico ....................................................................................
2
1.1.2. Processo de formação de microvesículas ..........................................
4
1.2. Características funcionais de microvesículas ........................................
6
1.3. Microvesículas e câncer ........................................................................
7
1.3.1. Câncer e imunossupressão ................................................................
9
1.3.1.1. Papel do TGF-β1 no câncer .............................................................
10
1.3.1.2. Microvesículas tumorais como partículas imunossupressoras ........
11
1.3.2. Câncer e coagulação ..........................................................................
13
1.3.2.1. Coagulação sanguínea ....................................................................
13
1.3.2.2. Estados hipercoagulantes no câncer ...............................................
17
1.3.2.3. Câncer e microvesículas pró-coagulantes .......................................
20
1.4. Papel de microvesículas no estabelecimento do melanoma maligno ...
23
2. Objetivos ...................................................................................................
26
2.1. Objetivo geral .........................................................................................
27
2.2. Objetivos específicos .............................................................................
27
3. Materiais e métodos ..................................................................................
28
3.1. Cultura de células ..................................................................................
29
3.2. Purificação de MVs secretadas em sobrenadantes de cultura de
células ...........................................................................................................
29
3.3. Análises por citometria de fluxo .............................................................
30
3.3.1. Avaliação da exposição de fosfatidilserina .........................................
30
3.3.2. Avaliação da exposição do antígeno associado a melanoma MAA ...
31
xvii
3.3.3. Avaliação da exposição de Fator Tecidual .........................................
31
3.4. Microscopia de fluorescência .................................................................
32
3.5. Microscopia eletrônica ...........................................................................
33
3.6. Ensaio de ativação da protrombina .......................................................
34
3.7. Quantificação de TGF-β1 em co-culturas de macrófagos e MVs de
melanoma B16F10 ........................................................................................
35
3.8. Estabelecimento in vivo do melanoma B16F10: modelo de metástase
35
3.9. Ativação da coagulação sanguínea in vitro ...........................................
36
3.10. Purificação de MVs a partir do plasma de camundongos C57BL/6
inoculados com células de melanoma Tm1 ou melanócitos melan-A ..........
36
3.11. Análises estatísticas ............................................................................
37
4. Resultados ................................................................................................
38
4.1. Papel de microvesículas de melanoma B16F10 na metástase tumoral
39
4.1.1. Células de melanoma B16F10 produzem microvesículas in vitro ......
39
4.1.2. Células B16F10 e microvesículas de melanoma expõem PS em sua
superfície externa .........................................................................................
41
4.1.3. Microvesículas derivadas de células B16F10 modulam a produção
de TGF-β1 por macrófagos ...........................................................................
45
4.1.4. Microvesículas tumorais aumentam o potencial metastático de
células B16F10 em camundongos C57BL/6 .................................................
46
4.1.5. Microvesículas tumorais aumentam o potencial metastático de
células B16F10 em camundongos BALB/c ...................................................
48
4.2. Caracterização da atividade pró-coagulante de microvesículas
derivadas de melanócitos e melanoma ........................................................
50
4.2.1. Produção de microvesículas por melanócitos murinos melan-A e
células de melanoma Tm1 ............................................................................
50
4.2.2. Exposição de PS e promoção da formação do complexo
protrombinase por ambas as MVs produzidas por melanócitos e células de
51
xviii
melanoma .....................................................................................................
4.2.3. MVs de melanoma aceleram o tempo de coagulação de plasma
murino de maneira mais eficiente do que MVs produzidas por melanócitos
54
4.2.4. MVs derivadas ex vivo de camundongos C57BL/6 inoculados com
células de melanoma Tm1 apresentam potencial pró-coagulante
semelhante àquelas obtidas in vitro ..............................................................
57
5. Discussão .................................................................................................
60
6. Conclusão .................................................................................................
68
7. Referências ...............................................................................................
70
Anexos ..........................................................................................................
83
Anexo 1 – Tumor-derived microvesicles modulate the establishment of
metastatic melanoma in a phosphatidylserine-dependent manner ...............
84
Anexo 2 – Procoagulant properties of human MV3 melanoma cells …….....
113
1
INTRODUÇÃO
2
1.1
MICROVESÍCULAS
Microvesículas (MVs) são fragmentos liberados a partir da membrana
plasmática de células viáveis ou danificadas, normais ou malignas, quando estas
são submetidas a estados de ativação celular, os quais incluem crescimento e
proliferação celulares, ou ainda, ao processo de morte celular por apoptose
(FREYSSINET, 2003). Essas estruturas vesiculares intactas são bastante
heterogêneas em tamanho (seu diâmetro pode variar de 0,1-1 μm) e composição,
sendo constituídas principalmente de diferentes lipídios e proteínas de membrana
similares àqueles presentes na célula da qual se originam. Além disso, podem
conter proteínas e transcritos de RNA mensageiro derivados do meio
intracitoplasmático (RATAJCZAK et al., 2006a) ou, ainda, seqüestrarem organelas
inteiras como mitocôndrias (SPEES et al., 2006).
1.1.1 Breve histórico
A primeira evidência da existência de MVs surgiu ainda na década de 40,
quando Chargaff e West observaram que frações subcelulares de soro e plasma
humanos continham um fator precipitável que facilitava a geração de trombina e
conseqüente formação de fibrina (CHARGAFF e WEST, 1946). Contudo, apenas
em 1967, com o surgimento de técnicas mais eficientes de microscopia eletrônica,
Wolf foi capaz de demonstrar que este fator, obtido a partir da ultracentrifugação
de plasma livre de plaquetas, consistia, na verdade, em pequenas vesículas
derivadas da membrana celular de plaquetas ativadas, as quais apresentavam
atividade pró-coagulante comparável à célula de origem (WOLF, 1967).
3
Desde então, a produção de MVs já foi descrita em diversos tipos celulares
(Fig. 1), e vários termos já foram utilizados para denominar essas estruturas,
originalmente chamadas de “poeira de plaquetas”. Estas mesmas MVs derivadas
de plaquetas ativadas, por exemplo, são atualmente mais conhecidas como
“micropartículas”, enquanto MVs liberadas por leucócitos polimorfonucleares
ativados são freqüentemente chamadas de “ectossomos”. Apesar de produzidas
por praticamente todos as células eucarióticas, grande ênfase tem sido dada ao
estudo de MVs derivadas de células sanguíneas, provavelmente devido ao fato de
estas serem componentes constitutivos do plasma humano normal, sendo
secretadas por leucócitos, eritrócitos, células endoteliais e plaquetas. Além disso,
MVs têm seu número aumentado no sangue periférico em processos como injúria
celular, inflamação, trombose, hipóxia, entre outros, e podem ser produzidas
também por células neoplásicas (RATAJCZAK et al., 2006b). Isso explica os
maiores níveis de MVs circulantes em pacientes com infecções, doenças
cardiovasculares e câncer, além de evidenciar a grande relevância clínica desses
fragmentos.
Figura 1 – Exemplos de MVs liberadas por diferentes tipos celulares ativados. (A)
Microscopia eletrônica de varredura mostrando a liberação de MVs por células endoteliais de
veia umbilical humana (HUVEC) após estímulo com interleucina 1. (B) MV (seta branca)
liberada por células K562 tratadas com dose sublítica de anticorpo e complemento.
Microscopia ótica, tamanho da vesícula: ∼1 μm. (C) Ectossomos liberados por células
polimorfonucleares ativadas com fMLP. Microscopia eletrônica de transmissão, marcação
negativa. Adaptado de Diamant et al., 2004; e Pilzer et al., 2005.
4
1.1.2 Processo de formação de microvesículas
Os mecanismos exatos envolvidos no processo de formação de MVs ainda
não são completamente conhecidos. Porém, sabe-se que este fenômeno
demanda gastos de energia e é dependente do aumento dos níveis intracelulares
de cálcio, assim como da conseqüente ativação de proteases como a calpaína,
que desestabilizam a ancoragem da membrana plasmática ao citoesqueleto
através da clivagem de filamentos de actina e de outras proteínas a estes
associadas (FOX et al., 1990; FOX et al., 1991; PICCIN, MURPHY e SMITH,
2007).
Ao mesmo tempo, outras duas enzimas presentes na membrana
plasmática, em particular, têm sua atividade modulada pelos níveis aumentados
de cálcio no citoplasma: aminofosfolipídio translocase e escramblase. A primeira,
também conhecida como flipase dependente de adenosina trifosfato (ATP), e
inibida por cálcio, é a principal responsável pela manutenção da assimetria da
membrana
plasmática,
uma
vez
que
transporta
os
aminofosfolipídios
fosfatidilserina (PS) e fosfatidiletanolamina (PE) da camada externa para a
camada interna da membrana, de modo específico e contra seu gradiente de
concentração. Já a segunda, ativada por cálcio, atua no transporte lipídico
bidirecional não-específico. Em conjunto, a inibição da aminofosfolipídio
translocase e a ativação da escramblase por altas concentrações de cálcio
provocam o colapso da assimetria de membrana, levando a uma distribuição
randômica de fosfolipídios entre ambas as faces da membrana plasmática. Tal
processo é normalmente acompanhado pelo brotamento de MVs “simétricas” a
partir da superfície celular; logo, a microvesiculação parece ser parte integrante
do processo de remodelamento de membranas plasmáticas, estando intimamente
5
ligada à externalização de PS (COMFURIUS et al., 1990; ZWAAL e SCHROIT,
1997). De fato, dados na literatura mostram que células provenientes de
indivíduos portadores da Síndrome de Scott, uma desordem hemorrágica
hereditária caracterizada por uma deficiência na atividade escramblase induzida
por cálcio, apresentam uma redução do transporte de PS para a face externa da
membrana plasmática, assim como uma incapacidade de liberar MVs a partir de
sua superfície celular (TOTI et al., 1996; CASTAMAN et al., 1997), o que
corrobora essa forte associação.
Portanto, pode-se afirmar que ao menos o colapso da assimetria
fosfolipídica de membrana e a degradação do citoesqueleto a ela associado pela
protease calpaína, ambos os eventos desencadeados pelo aumento da
concentração de cálcio intracelular, são necessários para a formação de MVs
(Fig. 2).
Figura 2 – Mecanismos associados ao processo de formação de MVs. Na presença de
níveis elevados de cálcio, a distribuição aleatória de PS (representada na figura em azul) entre
ambas as camadas da membrana plasmática é induzida, através da regulação positiva e
negativa das enzimas escramblase e aminofosfolipídio translocase, respectivamente, e a
assimetria fosfolipídica é perdida; além disso, observa-se a ativação da enzima calpaína,
provocando a degradação do citoesqueleto associado à membrana e permitindo a liberação de
MVs expondo PS. Adaptado de Zwaal e Schroit, 1997.
6
1.2
CARACTERÍSTICAS FUNCIONAIS DE MICROVESÍCULAS
Sendo MVs fragmentos de membrana complexos, com uma rica
composição molecular – herdada tanto da superfície quanto do meio
intracitoplasmático de sua célula de origem –, é razoável supor que estas possam
interagir com outras células e, dessa forma, influenciar a biologia de tais tipos
celulares. Realmente, vários autores têm abordado o seu papel em diversos
processos biológicos, levando-nos a considerá-las como parte importante e
integral do ambiente intercelular.
Recentemente, diversos trabalhos têm discutido, de maneira geral, o papel
de MVs como importantes mediadores de comunicação intercelular. Diferentes
mecanismos, através dos quais MVs poderiam influenciar a biologia de diversos
tipos celulares, já foram relatados na literatura, tais como a atuação como
“complexos sinalizadores” (apresentam ligantes de superfície capazes de
desencadear inúmeras respostas biológicas na célula-alvo), e a transferência de
receptores de superfície entre tipos celulares distintos, assim como de conteúdo
intracitoplasmático (proteínas, RNAs mensageiros e lipídios bioativos).
Tomando o ambiente vascular como modelo, podemos citar várias
respostas biológicas desencadeadas por MVs. Micropartículas derivadas de
plaquetas ativadas, por exemplo, são capazes de ativar células endoteliais,
leucócitos e, inclusive, suas próprias células de origem, desencadeando
processos como agregação plaquetária e produção de prostaglandinas pelo
endotélio (BARRY et al., 1997), e aumento da aderência entre monócitos e
células endoteliais provocado pela regulação positiva de moléculas de adesão em
ambos os tipos celulares (BARRY et al., 1998). Tais efeitos parecem ser
mediados pela transferência intercelular de ácido aracdônico, um lipídio bioativo
7
presente nestas micropartículas, e envolvem, pelo menos em parte, a ativação de
vias de sinalização celular como fosfatidilinositol 3-cinase (PI3-K), proteína cinase
C (PKC) e proteínas cinase ativadas por mitógeno (MAPK p42/p44, p38 cinase e
JNK1) (BARRY et al., 1999). Já MVs produzidas por leucócitos humanos
demonstraram modular o potencial inflamatório e pró-coagulante de células
endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC), através da indução da liberação
de citocinas como a proteína quimiotática de monócitos, MCP-1, e a interleucina
6, além da expressão de Fator Tecidual, com envolvimento de vias de sinalização
possivelmente associadas à fosforilação da cinase JNK1 (MESRI e ALTIERI,
1999). Do mesmo modo, MVs derivadas de células endoteliais ativadas podem
interagir com células da linhagem monocítica THP-1, estimulando sua atividade
pró-coagulante (SABATIER et al., 2002).
Outros modelos têm sugerido ainda o envolvimento de MVs em
mecanismos de reprogramação epigenética e transferência intercelular de
organelas, como mitocôndrias (RATAJCZAK et al., 2006b). Contudo, embora o
processo de vesiculação seja observado em diversos tipos celulares e os efeitos
das MVs sejam extremamente variados, estudos atuais vêm se acumulando no
papel de MVs na biologia tumoral, coagulação sangüínea, e resposta imune
(RATAJCZAK et al., 2006b). Sua relação com tais processos será mais bem
discutida a seguir.
1.3
MICROVESÍCULAS E CÂNCER
O interesse pelo estudo do papel de MVs na progressão tumoral deve-se
essencialmente à grande quantidade de vesículas encontradas em fluidos
biológicos de pacientes com câncer em estágio avançado, e à sua escassez ou
8
ausência nos fluidos corporais de indivíduos normais (GINESTRA et al., 1999;
KIM et al., 2003). Apesar da origem dessas estruturas ainda não estar
completamente esclarecida, observa-se que seu acúmulo ocorre freqüentemente
em culturas de células neoplásicas, estimuladas ou não, e alguns autores já
demonstraram sua capacidade de interagir com células normalmente presentes
no microambiente tumoral, como fibroblastos, células endoteliais e diferentes tipos
de leucócitos, modulando suas atividades (RATAJCZAK et al., 2006b) (Fig. 3).
Além
disso,
sua
abundância
e
conteúdo
proteolítico
–
sobretudo
de
metaloproteinases de matriz – parecem se correlacionar com a invasividade de
linhagens celulares tumorais in vitro (GINESTRA et al., 1998), que por sua vez se
correlaciona com a capacidade metastática de alguns tumores in vivo (GRAVES
et al., 2004).
Figura 3 – Presença de microvesículas no microambiente tumoral. MVs presentes no sítio
de desenvolvimento neoplásico podem interagir com diversos elementos celulares contidos em
tal microambiente (como vasos neo-formados, células estromais, leucócitos, e as próprias
células do tumor) e, dessa forma, modular as atividades da célula-alvo em questão,
influenciando toda a biologia tumoral. Adaptado de Ratajczak et al., 2006b.
Além de atividades proteolíticas, funções imunossupressivas e prócoagulantes já descritas para MVs são possivelmente as principais características
9
responsáveis pelo seu envolvimento no estabelecimento de uma grande
variedade de tumores, uma vez que estas estão relacionadas a processos
centrais no desenvolvimento neoplásico, como aquisição de capacidade invasiva
e metastática, indução de angiogênese e escape da vigilância imune.
1.3.1 Câncer e imunossupressão
Em 1909, Paul Erlich postulou que, se o sistema imune não fosse capaz de
remover “germes aberrantes” de nosso organismo (tumores “recém-natos”), todos
nós morreríamos de câncer. Mais tarde, outros pesquisadores reafirmaram a
proposta de Erlich como a teoria da vigilância imune contra o câncer, a qual
estaria associada a algumas hipóteses: (i) células malignas apresentariam
características antigênicas distintas daquelas presentes no tipo celular do qual se
originou, tornando possível o seu reconhecimento por células T e a montagem de
uma resposta antitumoral eficiente; (ii) a incidência da doença maligna seria maior
em períodos de relativa ineficiência imunológica, como na idade avançada; (iii)
estados de imunossupressão, genética ou induzida por fatores como drogas,
radiação, infecções, etc., aumentariam a incidência de câncer; e (iv) a regressão
espontânea de tumores deveria ser observada. De certa forma, essa teoria tem se
mostrado de acordo com uma grande variedade de estudos clínicos e
experimentais, os quais têm demonstrado por diversos princípios a existência de
uma resposta imune específica contra diferentes tipos de tumores.
Contudo, o fato de que a grande maioria dos tumores consegue se
desenvolver, e eventualmente é fatal ao seu hospedeiro no caso de nenhuma
intervenção terapêutica, indica claramente que células neoplásicas podem
escapar do controle imune. Mecanismos imunossupressores utilizados por células
10
tumorais para transpor as barreiras imunológicas que restringem a progressão da
doença envolvem contatos célula-célula e a liberação de fatores solúveis. A
apresentação ineficiente de antígenos tumorais, ou seja, a ativação da resposta
de células T na ausência de co-estímulos apropriados, por exemplo, pode levar a
um
estado
de
anergia
desses
linfócitos,
normalmente
observado
no
microambiente tumoral (RIVOLTINI et al., 2002). Já no contexto da liberação de
fatores solúveis, uma importante citocina capaz de modular a resposta imune é o
fator de crescimento tumoral beta (TGF-β).
1.3.1.1
Papel do TGF-β1 no câncer
O TGF-β1 atua, normalmente, como um potente inibidor de proliferação,
crescimento e diferenciação celulares; porém, no que se refere às células
tumorais, sabe-se que, em determinado momento do processo de transformação
maligna, a maioria das células transformadas se torna parcial ou totalmente
resistente a esses efeitos, devido a mutações ou perda de expressão de
diferentes membros da via de sinalização de TGF-β1 (PASCHE, 2001;
MOUSTAKAS et al., 2002). Em geral, estas células cancerosas passam, inclusive,
a secretar níveis não-fisiológicos dessa citocina que afetam, de maneira
autócrina, seu crescimento e diferenciação e, de forma parácrina, todo o ambiente
celular adjacente, contribuindo para sua progressão e metástase (MOUSTAKAS
et al., 2002). Estudos clínicos mostraram, por exemplo, que pacientes com
melanoma, quando comparados a controles sadios, apresentam níveis séricos
elevados de TGF-β1 relacionados à disseminação tumoral (KRASAGAKIS et al.,
1998). Além disso, a análise de amostras de melanoma primário mostrou altos
níveis de mensagem dessa citocina em áreas de lesão progressiva, o que não foi
11
observado nas lesões em processo de regressão (CONRAD et al., 1999). Essa
forte associação entre a secreção de TGF-β1 e estágios avançados de progressão
tumoral pode ser explicada pelo fato deste fator desempenhar um importante
papel na regulação da resposta imunológica, através da supressão do
crescimento e diferenciação de células do sistema imune, inclusive das linhagens
linfocíticas B e T (MOUSTAKAS et al., 2002). Isso previne respostas auto-imunes
inadequadas, porém, no contexto do câncer, essa função imunossupressora pode
significar o escape das células tumorais de uma resposta imune protetora. Um
estudo com camundongos transgênicos, onde um receptor para TGF-β tipo II
dominante negativo foi expresso apenas em células T, mostrou, por exemplo, que
o bloqueio da sinalização de TGF-β nestas células leva a um aumento da
resistência a tumores (GORELIK e FLAVELL, 2001), o que reforça a idéia de
correlação entre a produção de TGF-β e desenvolvimento tumoral.
1.3.1.2
Microvesículas tumorais como partículas imunossupressoras
Efeitos inibitórios de MVs tumorais sobre diferentes células do sistema
imune, tais como bloqueio de proliferação e atividade citotóxica e indução de
apoptose em linfócitos (TAYLOR et al., 2000; ANDREOLA et al., 2002; KIM et al.,
2004), e supressão da expressão de moléculas de MHC classe II por
monócitos/macrófagos (POUTSIAKA et al., 1985), têm sido descritos na literatura,
o que sugere uma importante associação entre a produção de MVs e estados de
imunossupressão.
No contexto da morte celular por apoptose, o fosfolipídio PS, presente na
superfície de MVs e células apoptóticas, é capaz de estimular respostas
antiinflamatórias e imunossupressivas, permitindo a remoção “imunologicamente
12
silenciosa” de células apoptóticas por fagócitos (SAVILL et al., 2002). Fadok e
colaboradores observaram, por exemplo, que macrófagos humanos, quando
estimulados na presença de neutrófilos apoptóticos, produzem grandes
quantidades de fatores imunorregulatórios como TGF-β1 (FADOK et al., 1998).
Mais tarde, estudos in vivo demonstraram que a secreção de TGF-β1 por
macrófagos, dependente de PS, acelera a resolução da inflamação aguda em
modelos inflamatórios peritoneal (injeção de tioglicolato) e pulmonar (instilação de
lipopolissacarídeo, LPS) (HUYNH, FADOK e HENSON, 2002), além de inibir
outros fenótipos inflamatórios tais como a indução da apoptose em células
tumorais por macrófagos estimulados com interferon-γ (IFN-γ) e LPS (REITER,
KRAMMER e SCHWAMBERGER, 1999).
Por isso, uma vez que análises semi-quantitativas de PS na face externa
da membrana plasmática de linhagens celulares humanas mostraram que células
tumorais expõem altos níveis de PS em relação a células normais (CONNOR et
al., 1989; UTSUGI et al., 1991), e considerando que a formação de MVs e a
exposição de PS são fenômenos estritamente relacionados, podemos supor o seu
envolvimento no estabelecimento tumoral, possivelmente através da regulação da
produção de TGF-β1 e conseqüente modulação da ativação de células do sistema
imune como macrófagos (Fig. 4). Assim sendo, MVs poderiam inibir respostas
inflamatórias antitumorais, propiciando o escape do tumor de uma resposta imune
efetiva.
13
Figura 4 – Modelo de modulação da resposta imune por microvesículas tumorais. MVs
funcionariam como estruturas amplificadoras dos sinais tumorais, através da manutenção da
PS externalizada e de sua interação com diversos tipos celulares do sistema imune presentes
no microambiente do tumor, como macrófagos (MO), células dendríticas (DC) e linfócitos (LO).
Como possível conseqüência dessa interação, observa-se exemplos de supressão da
resposta imune, como a inibição da produção de citocinas pró-inflamatórias (TNFα, IL-1β e IL12) e a indução da liberação de fatores antiinflamatórios (TGF-β1 e IL-10) por fagócitos
profissionais (MO e DC); e, ainda, a regulação negativa do crescimento e da diferenciação
linfocitários
1.3.2 Câncer e coagulação
1.3.2.1
Coagulação sanguínea
O processo de coagulação sanguínea é parte integrante de um complexo
mecanismo denominado sistema hemostático, cuja função primordial consiste em
reconhecer danos vasculares e recrutar uma apropriada combinação de células e
enzimas, que levam à produção de um "tampão" insolúvel, constituído de
plaquetas e fibrina, interrompendo assim a perda de sangue. A cascata de
coagulação pode ser explicada de maneira simplificada como uma série de
reações proteolíticas de ativação de zimogênios, que culmina na geração de
14
trombina e conseqüente formação de fibrina a partir de uma proteína solúvel do
plasma denominada fibrinogênio (Fig. 5). Esse evento envolve, de forma geral,
três importantes pilares: fatores de coagulação plasmáticos; íons cálcio; e
superfícies membranares pró-coagulantes. Quando devidamente combinados,
esses três grupos formam os efetores centrais do processo de coagulação: os
complexos tenase extrínseco e intrínseco, e o complexo protrombinase. Em cada
caso, uma enzima serino-protease ativa se liga ao seu co-fator protéico, na
presença de íons Ca2+, de maneira a formar um complexo enzimático em uma
superfície de membrana. Em situações onde há injúria vascular, o complexo
iniciador, tenase extrínseco, é formado quando a enzima fator VIIa, presente no
plasma, entra em contato com o Fator Tecidual (TF), uma proteína
transmembranar de 47 kD constitutivamente expressa na superfície de células
sub-endoteliais e em alguns tecidos extravasculares (BROZE, 1995), mas que
também pode estar presente na membrana de células vasculares ativadas como
monócitos e células endoteliais. Esse complexo (TF/fator VIIa) converte o
zimogênio fator X em uma serino-protease ativa, o fator Xa. Este se dissocia do
complexo tenase e se associa ao co-fator protéico fator Va, íons Ca2+ e
superfícies celulares ricas em fosfolipídios aniônicos, especialmente PS, para
formar o complexo protrombinase, que ativa o zimogênio protrombina na serinoprotease trombina. Finalmente, a trombina promove a clivagem de fibrinogênio,
permitindo a formação de polímeros de fibrina, que por sua vez darão origem ao
coágulo de fibrina. O complexo tenase extrínseco converte ainda o zimogênio
fator IX na sua forma ativa, fator IXa, que associado ao co-fator protéico fator
VIIIa, íons Ca2+ e fosfolipídios forma o complexo tenase intrínseco e também
catalisa a ativação do fator X.
15
Figura 5 – Cascata de coagulação sanguínea. Esquema simplificado do processo de
coagulação in vivo. Cores indicam: zimogênios, verde; enzimas ativas, laranja; co-fatores,
azul. FVIIa, FIX, FIXa, FX, FXa, FVIIIa, FVa, FPA e FPB representam, respectivamente, os
fatores VIIa, IX, IXa, X, Xa, VIIIa e Va, e os fibrinopeptídeos A e B.
Como pode ser observado, membranas celulares são elementos essenciais
para a ativação da coagulação sanguínea, tanto no início, durante a exposição de
Fator Tecidual ao plasma, permitindo a montagem do complexo tenase
extrínseco, quanto na fase de propagação da cascata, onde a presença de
fosfolipídios aniônicos, em especial PS, é crítica para a formação dos complexos
tenase intrínseco e protrombinase (KALAFATIS et al., 1994) (Fig. 6).
16
Figura 6 – Reações da coagulação dependentes de superfícies de membrana.
Representação esquemática dos principais complexos enzimáticos da coagulação, onde cada
serino-protease está associada ao seu co-fator protéico e substrato apropriados, em uma
superfície de membrana expondo Fator Tecidual (no caso do complexo tenase extrínseco) ou
fosfatidilserina, representada em azul (no caso dos complexos tenase intrínseco e
protrombinase). Adaptado de Kalafatis et al., 1994.
A conservação da integridade do sistema vascular – e conseqüentemente o
bom funcionamento do sistema hemostático – é essencial para a manutenção da
vida humana, uma vez que este é responsável por funções vitais que incluem o
transporte de oxigênio e nutrientes para os tecidos e restos metabólicos para vias
de excreção adequadas. Contudo, apesar da existência de mecanismos
complexos de regulação, o processo de hemostasia pode acontecer também na
ausência de dano vascular, levando à formação de trombos capazes de ocluir os
vasos sanguíneos. Essa ativação não específica do sistema hemostático está
relacionada ao desenvolvimento de diversas doenças tromboembólicas, tais como
a trombose venosa profunda e o embolismo pulmonar, e ocorre em maior
freqüência em diferentes estados patológicos como diabetes, aterosclerose,
sepse e câncer (RICKLES e LEVINE, 2001; HIRSH, O'DONNELL e WEITZ,
2005).
17
1.3.2.2
Estados hipercoagulantes no câncer
Uma importante correlação entre câncer e estados de hipercoagulação foi
descrita há mais de um século pelo clínico francês Armand Trousseau (18011867), e desde então é amplamente discutida na literatura.
A ocorrência de trombose é comumente observada em indivíduos com
neoplasias malignas, sendo esta incidência variável de acordo com o tipo de
câncer, e particularmente alta em tumores de pâncreas, pulmão e do trato
gastrointestinal, além de gliomas e algumas leucemias (HOFFMAN, HAIM e
BRENNER, 2001; RICKLES e LEVINE, 2001). Em muitos casos, a doença
tromboembólica é diagnosticada como a primeira manifestação clínica de um
tumor, sendo freqüentemente a principal complicação nos pacientes oncológicos
e a segunda causa de óbito na maioria dos tipos de neoplasia (DONATI, 1995;
MANDALA et al., 2003). Além disso, estudos epidemiológicos têm demonstrado
uma significativa correlação entre a ocorrência de trombose e um pior prognóstico
da doença (SORENSEN et al., 2000).
Corroborando os diversos dados clínicos que evidenciam uma íntima
associação entre a progressão tumoral e o desenvolvimento de um estado de
hipercoagulabilidade
no
paciente
em
questão,
análises
histopatológicas
demonstram a presença de depósitos de fibrina e de agregados de plaquetas
dentro e em volta de diferentes tumores, indicando uma ativação local da
coagulação. Além disso, mesmo pacientes com câncer sem manifestações
clínicas de trombose apresentam anormalidades em testes laboratoriais de
coagulação (alterações hemostáticas levando à hipercoagulabilidade ocorrem em
60% a 100% destes indivíduos), caracterizadas por diferentes níveis de ativação
da coagulação sanguínea, e que incluem: redução do tempo de tromboplastina
18
parcial ativada; níveis elevados de proteínas da coagulação (fibrinogênio, fatores
V, VIII, IX e X); trombocitose; aumento dos produtos de degradação de fibrina e
fibrinogênio, entre outros (ZWICKER, FURIE e FURIE, 2007).
Essa condição hipercoagulável dos pacientes com câncer pode ser
parcialmente explicada por mecanismos gerais de resposta do hospedeiro à
doença maligna, como por exemplo, respostas inflamatórias, mudanças no
metabolismo protéico e estase venosa. Contudo, a ativação do sistema
hemostático desses indivíduos deve-se, sobretudo, a propriedades prócoagulantes específicas das células tumorais, as quais incluem: (i) a síntese de
moléculas pró-coagulantes, particularmente Fator Tecidual e o pró-coagulante
neoplásico CP, um ativador direto do fator X; (ii) a síntese de citocinas próinflamatórias, como o fator de necrose tumoral alfa (TNFα), interleucina 1 beta (IL1β) e interferon gama (IFNγ), as quais podem ativar células endoteliais e
monócitos a expressarem o Fator Tecidual em sua membrana externa, por
exemplo; (iii) a interação direta com células vasculares, resultando na ativação
destas últimas e na conseqüente modulação do sistema hemostático; e (iv) a
exposição do fosfolipídio fosfatidilserina (PS) na membrana externa das células
tumorais, permitindo a geração de superfícies lipídicas que suportam os
complexos da coagulação sanguínea.
É importante ressaltar que as evidências que suportam a relação entre
trombose e neoplasia não se restringem apenas à maior incidência de eventos
trombóticos em pacientes com câncer, e vice-versa, mas também ao fato de que
pacientes com trombose e câncer têm uma neoplasia de comportamento mais
agressivo do que aqueles que não apresentaram fenômenos de trombose.
19
Em um importante estudo nessa área, Sorensen e colaboradores
observaram, por exemplo, que em pacientes diagnosticados concomitantemente
com câncer e tromboembolismo venoso (TEV), a taxa de sobrevida após um ano
foi de 12%, contra 36% em pacientes com câncer sem diagnóstico de eventos
tromboembólicos
(diferença
essa
que
se
mostrou
bastante
importante
particularmente nos dez primeiros anos após o diagnóstico da neoplasia), o que
os levou à conclusão de que episódios de TEV estão frequentemente associados
a um estágio avançado do câncer, assim como a um pior prognóstico
(SORENSEN et al., 2000).
Neste contexto, vários autores têm enfatizado cada vez mais a importância
do
sistema
de
coagulação
sanguínea
em
diferentes
processos
do
desenvolvimento neoplásico, principalmente no que diz respeito a angiogênese e
metástase tumorais. Através do estudo de culturas de células, assim como de
amostras de pacientes, diferentes trabalhos têm demonstrado, por exemplo, uma
forte associação entre a expressão de Fator Tecidual e o padrão agressivo de
células neoplásicas (GUAN et al., 2002; ISHIMARU et al., 2003). A presença de
Fator Tecidual tem se correlacionado ainda com a produção do fator de
crescimento do endotélio vascular (VEGF), um dos principais fatores próangiogênicos já descritos, assim como a uma maior densidade microvascular
(GUAN et al., 2002; NAKASAKI et al., 2002). Além disso, a superexpressão de
receptores sensíveis às enzimas da coagulação, denominados PAR (do inglês
Protease Activated Receptor), em células tumorais, e sua conseqüente ativação
por essas proteínas também têm sido associadas a vários aspectos da biologia do
câncer, incluindo migração, invasão, sobrevivência, e a produção de fatores
angiogênicos, metaloproteinases e citocinas pró-tumorais (EVEN-RAM et al.,
20
1998; BELTING, AHAMED e RUF, 2005; RAO e PENDURTHI, 2005). Portanto, o
estudo dos mecanismos pró-coagulantes associados ao desenvolvimento
neoplásico, responsáveis pelos estados pró-trombóticos observados, poderia
revelar não apenas possíveis alvos terapêuticos contra tal efeito colateral (os
eventos tromboembólicos), mas também contra a doença primária, o câncer.
1.3.2.3
Câncer e microvesículas pró-coagulantes
Microvesículas, de uma forma geral, transportam antígenos de membrana de
seu tecido de origem. Logo, MVs produzidas por células neoplásicas poderiam
mimetizar e amplificar suas propriedades pró-coagulantes específicas já
mencionadas acima. De fato, em 1981, Dvorak e colaboradores demonstraram
pela primeira vez que fragmentos de membrana liberados por linhagens celulares
tumorais em cultura apresentavam comportamento pró-coagulante consistente
com a atividade de Fator Tecidual (DVORAK et al., 1981). Desde então, a
presença de Fator Tecidual em MVs tumorais tem sido apontada como
responsável, pelo menos em parte, pela atividade pró-coagulante/estado prótrombótico observado em linhagens tumorais e pacientes com câncer,
respectivamente, de diversas origens, como glioma, certos tipos de leucemia
(incluindo as leucemias promielocítica e monocítica agudas, e a leucemia mielóide
crônica), carcinoma de pulmão, e adenocarcinomas de pâncreas e mama
(BASTIDA et al., 1984; CARR, DVORAK e DVORAK, 1985; DEL CONDE et al.,
2007; TESSELAAR et al., 2007). Além disso, a exposição de PS em MVs
tumorais possibilita a montagem do complexo pró-coagulante protrombinase
(DVORAK et al., 1983; VANDEWATER et al., 1985), dependente de membranas
carregadas negativamente, as quais, em condições de dano vascular, são
21
constituídas pela superfície de plaquetas ativadas no sítio de lesão em questão
(MONROE, HOFFMAN e ROBERTS, 2002).
Em paralelo, a grande maioria das células do compartimento vascular,
quando submetidas a um estímulo pró-coagulante, pró-inflamatório ou apoptótico,
também apresenta o fenômeno de perda da assimetria da membrana plasmática,
tendo como conseqüência a exposição de PS na sua face extracelular e
concomitante liberação de MVs, que podem conter, além de PS, outras proteínas
que sejam expressas por estas células de origem.
Por serem ricas em PS, MVs originadas de plaquetas ativadas, por exemplo,
podem funcionar como superfícies para a ligação de proteínas da cascata de
coagulação – como os fatores VIIIa, IXa, Va e Xa – e conseqüente montagem dos
complexos dependentes de membranas carregadas negativamente, contribuindo
assim para a geração de trombina (DIAMANT et al., 2004; FURIE et al., 2005;
ZWICKER, FURIE e FURIE, 2007). Além disso, MVs derivadas de células
endoteliais e monócitos ativados, que carregam Fator Tecidual a partir de sua
célula de origem (SATTA et al., 1994; COMBES et al., 1999), podem ser
superfícies adequadas à interação com o fator VIIa. Estas últimas são capazes,
ainda, de se ligar às plaquetas nos locais de injúria vascular através da interação
entre a glicoproteína ligante de P-selectina (PSGL-1), presente nas MVs, e a Pselectina,
presente
nas
plaquetas
ativadas
(MCGREGOR,
MARTIN
e
MCGREGOR, 2006). Subseqüentemente, estas podem fundir-se às plaquetas,
em um processo dependente de PSGL-1 e Fator Tecidual. Ao se fundirem, ocorre
a transferência de Fator Tecidual e de outras proteínas à membrana plaquetária,
o que a torna uma superfície com maior potencial pró-coagulante, aumentando a
22
atividade Fator Tecidual-fator VIIa e a geração de local de trombina (RAUCH et
al., 2000; EILERTSEN e ØSTERUD, 2004).
O papel pró-coagulante in vivo de MVs tem sido ainda reforçado por
diferentes evidências na literatura. Como exemplos principais, podemos citar a
importante relação entre números elevados de MVs circulantes no plasma
humano e o risco aumentado de complicações tromboembólicas, a qual tem sido
demonstrada em diversos estudos (KAHN, ZUCKER-FRANKLIN e KARPATKIN,
1975; MALLAT et al., 2000; ANDO et al., 2002). Por outro lado, uma maior
tendência a eventos hemorrágicos e níveis reduzidos de MVs circulantes também
têm sido associados em síndromes severas raras (GEMMELL, SEFTON e YEO,
1993; CASTAMAN et al., 1997). Finalmente, MVs obtidas a partir de indivíduos
normais, assim como de diferentes populações de pacientes, são capazes de
promover a coagulação in vitro, e, ao mesmo tempo, sabe-se que a administração
sistêmica de MVs, em modelo de trombose venosa em ratos, leva a uma
formação significativa de trombos (BIRÓ et al., 2003). Em conjunto, esses dados
sugerem fortemente a grande relevância clínica e fisiológica dessas estruturas no
processo de coagulação in vivo.
MVs produzidas por células tumorais e células vasculares ativadas
poderiam exercer, portanto, um papel importante na biologia tumoral, através da
manutenção de PS externalizada e da presença de outras moléculas, como o
Fator Tecidual, contribuindo para a ativação do processo de coagulação.
Contudo, apesar de diversos trabalhos indicarem a presença de MVs prócoagulantes em uma grande variedade de pacientes com câncer que apresentam
conhecidamente uma alta incidência de eventos tromboembólicos, maiores
esforços devem ser direcionados a fim de se confirmar se altas concentrações de
23
MVs
pró-coagulantes
seriam
clinicamente
importantes
marcadores
de
complicações tromboembólicas, além de se determinar se tais estruturas
desempenham realmente um papel central (‘causal’) na patogênese da trombose
associada ao câncer e vice-versa.
1.4
PAPEL
DE
MICROVESÍCULAS
NO
ESTABELECIMENTO
DO
MELANOMA MALIGNO
Nesse estudo, buscamos entender o papel de MVs em modelos de
melanoma maligno, um tipo de câncer que se origina dos melanócitos, os quais
são as células da pele produtoras de melanina. Embora apresente a menor
incidência entre todos os tipos de câncer de pele, sua letalidade é bastante
elevada, sendo considerado o mais grave, principalmente devido à sua grande
capacidade metastática.
Como vimos, MVs, de uma forma geral, transportam moléculas de
superfície de suas células de origem, o que inclui o fosfolipídio PS. A exposição
de PS em membranas celulares está envolvida em processos biológicos como a
apoptose – onde é responsável pelo reconhecimento e remoção antiinflamatória
de células apoptóticas por fagócitos – e a ativação da cascata de coagulação
sanguínea, onde participa da montagem de diferentes complexos enzimáticos
pró-coagulantes.
Análises semiquantitativas de PS na face externa da membrana plasmática
de linhagens celulares humanas mostraram que células tumorais expõem altos
níveis de PS em relação às células normais (CONNOR et al., 1989; UTSUGI et
al., 1991), sugerindo o envolvimento desse fosfolipídio na biologia tumoral. Por
isso, considerando o papel modulador de PS na atividade antiinflamatória
24
macrofágica, é possível que seu reconhecimento em membranas de MVs seja
capaz de inibir o desenvolvimento de uma resposta inflamatória anti-tumoral,
regulando positivamente a liberação de fatores imunorregulatórios como o TGFβ1, um importante mediador do processo de progressão maligna. Assim sendo,
propiciaria, de forma semelhante ao que é visto em células apoptóticas, uma
resposta imune menos efetiva e um processo inflamatório pouco desenvolvido. De
fato, estudos clínicos mostraram que pacientes com melanoma, quando
comparados a controles sadios, apresentam níveis séricos elevados de TGF-β1,
sendo estes relacionados à disseminação tumoral. Além disso, a análise de
amostras de melanoma primário mostrou altos níveis de mensagem dessa
citocina em áreas de lesão progressiva, o que não foi observado nas lesões em
processo de regressão.
Ainda no contexto do câncer, sabe-se que a exposição de PS em MVs
tumorais possibilita a montagem de complexos pró-coagulantes dependentes de
membranas carregadas negativamente, algo que possivelmente contribui para a
seu papel pró-trombótico, e sugere sua participação nos mecanismos patogênicos
implicados na associação bidirecional entre câncer e estados hipercoagulantes.
Além disso, a presença do fator pró-coagulante Fator Tecidual nessas partículas
derivadas de células neoplásicas tem sido também apontada como responsável,
pelo menos em parte, pela atividade pró-coagulante/estado pró-trombótico
observado em linhagens tumorais e pacientes com câncer, respectivamente.
Como já citado, o melanoma é um tipo de câncer altamente metastático, e
há
fortes
evidências
sugerindo
que
suas
propriedades
pró-coagulantes
contribuam para o seu comportamento agressivo (MUELLER et al., 1992;
BROMBERG et al., 1995). Tal padrão é refletido ainda em um perfil
25
hipercoagulante de pacientes com melanoma, quando estes são analisados
através de testes laboratoriais de ativação da coagulação sanguínea (BOTTASSO
et al., 1996).
Portanto, MVs produzidas por células tumorais poderiam exercer um papel
importante no estabelecimento do tumor, através da manutenção da PS
externalizada e da amplificação dos sinais tumorais, interagindo com diversos
tipos celulares presentes no microambiente do tumor. Dentre estes fenômenos, a
modulação das respostas imune e inflamatória, assim com a ativação do processo
de coagulação, seria de grande importância.
É importante ressaltar que a identificação das MVs em pacientes com
câncer e o seu papel na progressão tumoral ainda são pouco compreendidos e,
por isso, esperamos contribuir para a elucidação dos mecanismos responsáveis
pela importante ação pró-tumoral desempenhada por estas estruturas.
.
26
2
OBJETIVOS
27
2.1
OBJETIVO GERAL
Esclarecer o papel de microvesículas produzidas pelo melanoma maligno
no reconhecimento, estabelecimento e metástase do tumor.
Para esse fim, utilizamos a linhagem celular de melanoma B16F10, a qual
é amplamente utilizada na literatura, devido a sua alta capacidade metastática.
Além disso, trabalhamos com um modelo comparativo entre a linhagem celular de
melanoma Tm1 e sua linhagem celular parental de melanócitos, melan-A
(CORREA et al., 2005).
2.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Identificar a produção de MVs in vitro pelo melanoma B16F10, assim como
a exposição funcional de PS em ambas as estruturas;
•
Investigar a modulação da resposta inflamatória de macrófagos por MVs
derivadas de células B16F10, principalmente no que diz respeito à produção de
TGF-β1;
•
Investigar o papel de MVs e da exposição de PS no modelo de metástase
in vivo do melanoma B16F10;
•
Observar e comparar a produção de MVs in vitro pelas linhagens celulares
de melanoma Tm1, e de melanócitos, melan-A;
•
Caracterizar in vitro a atividade pró-coagulante de MVs liberadas na cultura
de células de Tm1 e melan-A;
•
Avaliar a presença de MVs tumorais no plasma de camundongos pré-
inoculados com células de melanoma, além de caracterizar suas propriedades
pró-coagulantes ex vivo.
28
3
MATERIAIS E MÉTODOS
29
3.1
CULTURA DE CÉLULAS
As linhagens celulares murinas B16F10 e Tm1 (melanomas), e melan-A
(melanócitos) (estas últimas gentilmente doadas pelo Dr. Roger Chammas,
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo) foram
mantidas à 37ºC, em estufa com 5% de CO2, através de duas passagens
semanais em garrafas de cultura contendo meio DME (Dulbecco´s Modified Eagle
Medium, GibcoBRL), acrescido de 10% (v/v) de soro fetal bovino (SFB), e
suplementado com 2,4 g/L de HEPES, 3,7 g/L de bicarbonato de sódio, 125 mg/L
de fosfato de sódio dihidrogenado, 110 mg/L de piruvato de sódio, 100.000 U/L de
penicillina, 100 mg/L de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina e 55 μM de βmercaptoetanol, além de 200 nM do éster de forbol PMA (forbol 12-miristato 13acetato), no caso da linhagem melan-A. Após separação do sobrenadante de
cultura para posterior purificação de microvesículas, as células eram soltas com
tampão Hank’s contendo 10 mM de HEPES e 0,2 mM de EDTA, centrifugadas a
350 x g por 7 min, ressuspendidas em meio DME contendo 10% (v/v) de SFB
(suplementado como descrito acima) e transferidas para outra garrafa de cultura –
ou ainda, mantidas a 4oC até sua utilização.
3.2
PURIFICAÇÃO DE MVS SECRETADAS EM SOBRENADANTES DE
CULTURA DE CÉLULAS
Sobrenadantes de cultura de células eram centrifugados primeiramente a
800 x g por 10 min (para eliminação de possíveis células mortas) e, em seguida, a
16.000 x g por 15 min, sempre a 4°C. O precipitado obtido era então lavado uma
vez e ressuspendido em salina tamponada por fosfato (PBS, do inglês phosphate
30
buffer saline), quantificado por contagem em um citômetro de fluxo BD
FACScalibur™ (Becton, Dickinson and Company), e conservado a –80°C até sua
utilização. A quantificação de microvesículas por análise citofluorimétrica foi ainda
validada por quantificação protéica, através do ensaio de Bradford.
Cabe ressaltar que vesículas menores (os chamados exossomos) não
foram incluídas neste estudo, uma vez que ultracentrifugações mais vigorosas
(100.000 x g por 60 min, por exemplo) dos sobrenadantes de cultura não foram
realizadas.
3.3
ANÁLISES POR CITOMETRIA DE FLUXO
3.3.1 Avaliação da exposição de fosfatidilserina
Para detecção da exposição de PS, células e MVs B16F10 foram
ressuspendidas em 150 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1 mM de
MgCl2 e 10 mM de HEPES, pH 7,3 (tampão de ligação de anexina) e incubadas
com 25 μg/mL de anexina V conjugada a fluoresceína (FITC) (Molecular Probes)
por 15 min à temperatura ambiente. Células B16F10 foram ainda marcadas com
10 μg/mL de iodeto de propídeo (PI) para exclusão daquelas que tivessem
perdido a integridade de sua membrana plasmática, tornando-se for permeáveis a
PI.
Já MVs derivadas de células melan-A e Tm1 foram ressuspendidas em
PBS contendo 10% (v/v) de soro bovino adulto (necessário para ligação do
anticorpo a PS), e incubadas por 15 min à temperatura ambiente com anticorpo
monoclonal murino anti-PS 3G4 (previamente descrito por RAN et al., 2005 e
gentilmente doado pelo Dr. Philip E. Thorpe, Department of Pharmacology and
31
Simmons and Hamon Cancer Centers, University of Texas Southwestern Medical
Center at Dallas, Texas) conjugado a Alexa 488 e diluído 1:200. As amostras
foram então lavadas extensivamente com PBS e, assim como células e MVs de
melanoma B1F10, adquiridas em um citômetro de fluxo BD FACScaliburTM
(Becton, Dickinson and Company) (total de 10.000 eventos por amostra), e os
dados coletados analisados pelo programa BD CellQuest ProTM (Becton,
Dickinson and Company).
3.3.2 Avaliação da exposição do antígeno associado a melanoma MAA
MVs derivadas de células B16F10 foram ressuspendidas em PBS contendo
1% (m/v) de albumina bovina sérica (BSA) e incubadas por 1 h a 4ºC com
anticorpo monoclonal murino anti-MAA (MM29B6, sobrenadante de hibridoma
gentilmente doado pelo Dr. Roger Chammas, Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo, São Paulo), diluído 1:1. As amostras foram então
lavadas com PBS, e incubadas com anticorpo secundário anti-IgG murino
conjugado a FITC (Sigma), diluído 1:800, por 1 h a 4ºC. Um controle para
marcação secundária não-específica foi feito incubando-se uma alíquota somente
com o anticorpo anti-IgG murino. Após extensivas lavagens com PBS, amostras
foram adquiridas em um citômetro de fluxo BD FACScaliburTM (Becton, Dickinson
and Company) (total de 10.000 eventos por amostra), e os dados coletados
analisados pelo programa BD CellQuest ProTM (Becton, Dickinson and Company).
3.3.3 Avaliação da exposição de Fator Tecidual
32
Células foram lavadas com PBS contendo 2% de soro normal de
camundongo
(bloqueio
para
ligações
inespecíficas
utilizado
durante
as
incubações), e incubadas por 30 min a 4ºC com 200 μg/mL de anticorpo policlonal
anti-TF murino (American Diagnostica) ou controle isotipo IgG de coelho (Santa
Cruz Biotechnology Inc.). As amostras foram então fixadas com paraformaldeído
1%, incubadas com 15 μg/mL de anticorpo secundário anti-IgG de coelho
conjugado a biotina (Invitrogen) por 30 min a 4ºC, e finalmente incubadas com 2.5
μg/mL de estreptavidina conjugada a ficoeritrina (BD Pharmingen), também por 30
min a 4ºC. Após serem lavadas duas vezes com PBS (o que foi realizado também
entre as incubações), as amostras foram adquiridas em um citômetro de fluxo BD
FACScaliburTM (Becton, Dickinson and Company) (total de 10.000 eventos por
amostra), e os dados coletados analisados pelo programa BD CellQuest ProTM
(Becton, Dickinson and Company).
3.4
MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA
Células B16F10 foram crescidas em lamínulas depositadas em placa de 24
poços (TPP) (105 células/mL de meio DME suplementado contendo 10% (v/v) de
SFB), mantidas a 37°C, em estufa com 5% de CO2, por 24h. As células foram
então lavadas três vezes com tampão Hank’s, incubadas com anexina V
conjugada a biotina (PharMingen), diluída 1:10, em tampão de ligação de anexina
por 15 min à temperatura ambiente, e incubadas em seguida com 2,5 µg/mL de
estreptavidina-FITC (PharMingen), novamente em tampão de ligação de anexina
por 15 min à temperatura ambiente. Após cada incubação, as lamínulas foram
lavadas três vezes, sempre em tampão de anexina. Estas foram então dispostas
sobre lâminas, montadas com n-propilgalato e seladas com esmalte incolor, e
33
observadas em um microscópio Axiovert S 100 equipado com um analisador de
imagens KS300 (Zeiss).
Um controle de marcação secundária não-específica foi feito incubando-se
MVs
diretamente
com
estreptavidina-FITC.
Além
disso,
uma
amostra
permeabilizada foi preparada após fixação com 2% de paraformaldeído em PBS
por 30 min e posterior tratamento com 40 µM de digitonina por 10 min antes das
incubações com anexina V e estreptavidina.
3.5
MICROSCOPIA ELETRÔNICA
Para localização de resíduos de fosfatidilserina por microscopia eletrônica
de transmissão, MVs derivadas de células B16F10 foram pré-fixadas por 10 min a
4oC, em uma solução contendo 0,1% de glutaraldeído e 4% de paraformaldeído
em 0,1 M de tampão cacodilato, pH 7,2. Após pré-fixação, as amostras foram
lavadas três vezes em tampão de anexina contendo 3% de BSA, incubadas por
30 min a 4oC com anexina V biotinilada (Pharmingen) – diluída 1:10 –, e pósincubadas com 0,5 U/mL de estreptavidina conjugada a partículas de ouro
coloidal de 10 nm (Sigma), também por 30 min a 4oC. Um controle da marcação
secundária não-específica foi feito a partir da incubação direta das MVs com a
estreptavidina.
Após a última incubação, MVs foram lavadas três vezes em tampão de
anexina contendo 3% de BSA, fixadas por 1 h a 37o C em uma solução contendo
2,5% de glutaraldeído, 1% de paraformaldeído, 8% de sacarose e 2,5 mM de
CaCl2 em 0,1 M de tampão cacodilato, pH 7,2, e lavadas três vezes mais em 0,1
M de tampão cacodilato contendo 2,5 mM de CaCl2. Estas foram ainda pósfixadas em incubação com tetróxido de ósmio e ferrocianeto de potássio (1:1) por
34
30 min a 4°C, no escuro, e lavadas quatro vezes novamente em 0,1 M de tampão
cacodilato contendo 2,5 mM de CaCl2.
As amostras foram então desidratadas com acetona (30%, 50%, 70%,
90%, 100% e super seca, seqüencialmente, a cada 10 min) e incluídas em resina
epon por 48 h a 60°C. Cortes ultrafinos foram marcados com acetato de uranila e
citrato de chumbo, lavados com água destilada, e examinados em um
microscópio eletrônico de transmissão Zeiss CEM 900 (Zeiss).
Para a simples visualização das MVs, um protocolo similar foi seguido,
porém sem os passos de marcação com anexina V e estreptavidina.
3.6
ENSAIO DE ATIVAÇÃO DA PROTROMBINA
A ativação da protrombina pelo complexo protrombinase (fator Xa/fator Va)
foi realizada em 50 mM de HEPES, 100 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2, 1 mg/mL
de BSA, pH 7,5 (tampão HEPES-BSA). Fator Xa (10 pM, concentração final) foi
incubado com Fator Va (1 nM, concentração final), na presença de MVs, por 2
min a 37°C. A reação foi então iniciada pela adição de protrombina (500 nM,
concentração final), e alíquotas de 10 µL foram removidas a cada 1 min e
adicionadas a poços de microplaca contendo 40 µL de tampão Tris-EDTA. Após a
adição de 50 µL do peptídeo sintético S-2238 200 µM (substrato cromogênico
para trombina preparado em tampão Tris-EDTA – Chromogenix), a absorbância a
405 nm foi lida a 37°C, por 20 min, a intervalos de 6 s, através de um leitor de
microplacas Thermomax Microplate Reader (Molecular Devices). Velocidades
(mOD/min) obtidas nos primeiros minutos de reação foram utilizadas para o
cálculo da concentração de trombina formada.
35
O efeito da anexina V sobre a formação de trombina foi ainda analisado
através da incubação de MVs (3,6 x 104/mL) com concentrações variáveis de
anexina V (0-100 nM) por 5 min a 37°C em tampão HEPES-BSA. MVs foram
então incubadas com fator Xa (10 pM) e fator Va (1 nM) por 2 min a 37°C, e, em
seguida, com protrombina (500 nM). Alíquotas de 10 µL foram removidas após 5
min, e adicionadas a poços de microplaca contendo 40 µL de tampão Tris-EDTA.
A concentração de trombina formada foi avaliada como descrito anteriormente,
utilizando-se o substrato cromogênico S-2238.
3.7
QUANTIFICAÇÃO DE TGF-Β1 EM CO-CULTURAS DE MACRÓFAGOS E
MVS DE MELANOMA B16F10
Macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, ativados com tioglicolato
(Sigma-Aldrich), foram recolhidos e lavados em meio DME contendo 10% (v/v) de
SFB (suplementado como descrito anteriormente). Após contagem de células, 5 x
105 macrófagos foram crescidos em placa de 24 poços (TPP), mantidos a 37°C,
em estufa com 5% de CO2. Após 2 h de incubação para aderência, células foram
lavadas e cultivadas na presença de MVs de melanoma B16F10 (pré-incubadas
ou não com anexina V Pharmingen diluída 1:250 por 15 min) por 12-18 h a 37°C,
em meio DME livre de soro. A liberação de TGF-β1 nos sobrenadantes das coculturas foi então analisada por ELISA (DuoSet kit; R&D Systems).
3.8
ESTABELECIMENTO IN VIVO DO MELANOMA B16F10: MODELO DE
METÁSTASE
36
Camundongos isogênicos C57BL/6 ou BALB/c, de 6-8 semanas, foram
inoculados por via intravenosa (veia lateral da cauda) com 104 células B16F10
ressuspendidas em 100 μL de meio DME. Após duas a quatro semanas, os
animais foram mortos por inalação de CO2, os pulmões foram removidos, e o
número de nódulos tumorais pulmonares foi contado apenas na face convexa
desse órgão (o que foi realizado com o auxílio de uma lupa).
Para investigar o efeito de MVs de melanoma B16F10 nesse modelo,
camundongos foram inoculados por via intravenosa com 5 x 104 MVs
ressuspendidas em 100 μL de meio DME (pré-incubadas ou não com anexina V
Pharmingen diluída 1:250 por 15 min), 2h antes ou ao mesmo tempo do inóculo
de células B16F10.
3.9
ATIVAÇÃO DA COAGULAÇÃO SANGUÍNEA IN VITRO
A habilidade de MVs estudadas em potencializar a coagulação sanguínea
in vitro foi avaliada através de ensaio de recalcificação do plasma, de acordo com
o seguinte protocolo: 50 μL de plasma murino pobre em plaquetas contendo
citrato de sódio (citrato de sódio 3,8%, 1:9, v/v) foi incubado com 50 μL de
microvesículas ressuspendidas em PBS, em diferentes concentrações – ou ainda,
com 50 μL apenas de PBS –, por 1 min a 37 oC. Adicionou-se então 100 μL de
CaCl2 6,25 mM, e o tempo necessário para ocorrência de coagulação foi
monitorado em um Coagulômetro KC-4 micro Amelung (Amelung Ltd, Diagnostic
Grifols).
37
3.10
PURIFICAÇÃO DE MVS A PARTIR DO PLASMA DE CAMUNDONGOS
C57BL/6
INOCULADOS
COM
CÉLULAS
DE
MELANOMA
TM1
OU
MELANÓCITOS MELAN-A
Camundongos isogênicos C57BL/6, de 6-8 semanas, foram inoculados por
via subcutânea com 5 x 105 células Tm1 ou melan-A ressuspendidas em 100 μL
de meio DME, ou apenas com o veículo de inoculação. Após 17 dias, animais
foram anestesiados e amostras de sangue foram recolhidas por punção cardíaca
na presença de citrato de sódio (citrato de sódio 3,8%, 1:9, v/v). O plasma foi
separado por centrifugação do sangue total, e purificado de acordo com o mesmo
protocolo de purificação de MVs produzidas in vitro. A presença de MVs foi então
analisada e quantificada por contagem em um citômetro de fluxo BD
FACScalibur™ (Becton, Dickinson and Company).
3.11 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Teste t não pareado com correção de Welch foi realizado através do
programa InStat (GraphPad).
38
4
RESULTADOS
39
4.1
PAPEL
DE
MICROVESÍCULAS
DE
MELANOMA
B16F10
NA
METÁSTASE TUMORAL
4.1.1 Células de melanoma B16F10 produzem microvesículas in vitro
Células de melanoma murino B16F10, uma linhagem tumoral altamente
metastática, foram selecionadas in vivo por sua alta capacidade de formar
nódulos tumorais pulmonares em seu hospedeiro singeneico – a linhagem de
camundongos isogênicos C57BL/6 – quando inoculadas por via intravenosa
(FIDLER, 1973). A fim de investigar o papel da formação de MVs no
estabelecimento do melanoma maligno, examinamos a produção in vitro destas
estruturas pela linhagem celular B16F10, amplamente utilizada na literatura.
Através de sucessivas centrifugações diferenciais de sobrenadantes de cultura
dessas células, conseguimos isolar um precipitado de MVs, as quais foram
caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão e citometria de fluxo.
Com a primeira técnica, pudemos observar fragmentos de membrana circulares,
com uma morfologia relativamente homogênea, apresentando um diâmetro
estimado de 200 nm – o qual se encaixa no padrão de tamanhos já descritos na
literatura para essas estruturas (0,1-1 μm) – e carregando um material
eletrondenso em sua porção interna, interpretado como melanina (Fig. 7A). Cabe
ressaltar que a presença de DNA foi descartada pela marcação negativa com
iodeto de propídeo e por análise em gel de agarose, o que as diferencia de corpos
apoptóticos. Já a citometria de fluxo nos permitiu determinar um perfil de
espalhamento de luz frontal/lateral dessas MVs (forward vs. side light scattering –
FSC vs. SSC) (Fig. 7B), o qual se tornou o principal parâmetro utilizado para
monitorar a purificação freqüente de MVs.
40
Figura 7 – Caracterização de MVs produzidas in vitro por células B16F10. (A) Morfologia
de MVs: fotomicrografia obtida por microscopia eletrônica de transmissão. (B) População de
MVs analisada por citometria de fluxo. Perfil de espalhamento de luz frontal (FSC – eixo x) vs.
espalhamento de luz lateral (SSC – eixo y).
Uma vez que MVs expressam marcadores moleculares característicos da
célula a partir da qual se originam, MVs produzidas in vitro por células B16F10
foram analisadas para a presença de moléculas de superfície tumorais. De fato,
verificamos que tais MVs carregam o antígeno associado a melanoma MAA,
específico de melanomas originados em camundongos C57BL/6 e codificado por
um retrovírus ecotrópico (MelARV) (LI et al., 1998). Análises citofluorimétricas
mostraram que toda a população de MVs apresenta uma alta intensidade de
fluorescência quando marcada com anticorpo específico para o antígeno MAA
(Fig. 8).
Figura 8 – Detecção da exposição do
antígeno MAA em MVs de melanoma por
citometria
de
fluxo.
Linha
aberta
representa a marcação com anticorpo
monoclonal anti-MAA (hibridoma MM29B6)
seguida por marcação com anticorpo
secundário conjugado à fluoresceína (FITC);
curva cinza representa marcação com
anticorpo secundário na ausência de
anticorpo anti-MAA.
41
4.1.2 Células B16F10 e microvesículas de melanoma expõem PS em sua
superfície externa
Considerando que a formação de MVs e a exposição de fosfatidilserina
(PS) são fenômenos estritamente relacionados, examinamos então a exposição
de PS por células B16F10, assim como em MVs por estas produzidas. Utilizando
anexina V como um marcador para PS, foi possível detectar, por citometria de
fluxo, uma marcação positiva para PS na superfície de células B16F10 (Fig. 9A),
confirmando evidências anteriores da literatura (KIRSZBERG, RUMJANEK e
MONTEIRO, 2005). A ligação de anexina V foi confirmada e melhor caracterizada
através da técnica de microscopia de fluorescência, a qual evidenciou que o
fosfolipídeo PS está exposto na porção externa da membrana plasmática de
células B16F10 íntegras sob a forma de agregados moleculares (Fig. 9B, painel
central). Essa exposição se diferencia claramente da distribuição mais
homogênea observada em células previamente permeablizadas com o detergente
digitonina (Fig. 9B, painel direito), onde tantos os sítios externos como os sítios
internos de ligação a PS estão disponíveis para a anexina V. Já o controle com o
marcador secundário (estreptavidina conjugada à fluoresceína) mostrou a não
ocorrência de ligações inespecíficas entre este e as células (Fig. 9B, painel
esquerdo).
Assim como suas células de origem, MVs de melanoma apresentaram uma
marcação positiva para PS quando analisadas por citometria de fluxo, embora
com níveis mais variados de intensidade de fluorescência (Fig. 10A). Essa
distribuição heterogênea não foi observada quando MVs foram previamente
permeabilizadas com digitonina, o que sugere que essas estruturas carregam
quantidades similares de PS em suas membranas, mas o expõem de maneira
42
mais variável. A exposição de PS por MVs de B16F10 foi confirmada ainda
através da análise da marcação de anexina V por microscopia eletrônica de
transmissão (Fig. 10B); contudo, esse resultado pode estar sendo subestimado,
uma vez que procedimentos clássicos envolvidos nessa técnica, tais como fixação
com glutaraldeído e inclusão da amostra em resina epon, podem levar a uma
perda significativa (70-90%) do conteúdo lipídico do material a ser analisado
(MANETA-PEYRET et al., 1999).
Figura 9 – Análise da exposição PS na superfície de células B16F10. (A) Análise da
exposição de PS por citometria de fluxo. Curva em preto representa células não marcadas;
linha aberta representa marcação com anexina V-FITC. Histograma mostrado se refere
apenas às células B16F10 marcadas negativamente para iodeto de propídeo. (B) Localização
de PS na superfície das células por microscopia de fluorescência. Painel esquerdo
(CONTROLE NEGATIVO), marcação com estreptavidina-FITC na ausência de anexina V
biotininilada; painel central (CÉLS MARCADAS), marcação com anexina V-biotinilada seguida
por estreptavidina-FITC; painel direito [CÉLS MARCADAS (+DIGITONINA)], marcação com
anexina V-biotinilada seguida por estreptavidina-FITC após pré-tratamento com digitonina 40
μM por 10 min.
43
Figura 10 – Análise da exposição de PS em MVs derivadas de células B16F10. (A) Análise
da exposição de PS por citometria de fluxo. Curva em cinza representa MVs não marcadas;
linha mais clara representa marcação com anexina V-FITC; e linha mais escura representa
marcação com anexina V-FITC após tratamento com digitonina 40 μM por 10 min. (B) Análise
da exposição de PS por microscopia eletrônica de transmissão. Figura representa marcação
com anexina V-biotinilada seguida por estreptavidina conjugada a partículas de ouro coloidal.
O fenômeno de translocação de PS da porção interna para a porção
externa da membrana plasmática pode acontecer mais extensivamente sob certas
condições tais como a ativação de plaquetas, onde é essencial para a montagem
de diferentes complexos da cascata de coagulação (MONROE, HOFFMAN e
ROBERTS, 2002). A fim de determinar se os resíduos de PS expostos pelas MVs
de melanoma são funcionalmente ativos, investigamos sua capacidade de
promover a formação do complexo protrombinase (fator Xa/fator Va/Ca2+/PS), a
qual já foi relacionada à geração de trombina por células e MVs tumorais
(DVORAK et al., 1983; VANDEWATER et al., 1985). Como pode ser observado
na figura 11, MVs derivadas de células B16F10 são capazes de eficientemente
promover a ativação de protrombina pelo complexo em questão (Fig. 11A), o que
se correlaciona diretamente com a concentração de MVs utilizada na reação (Fig.
11B). A formação de trombina não foi detectada quando a protrombina foi
44
incubada na presença dos fatores Xa e Va e ausência de MVs, ou apenas na
presença dessas últimas (Fig. 11A).
50
A
FXa / FVa
MVs B16F10
[α-Trombina] nM
40
FXa / FVa + MVs B16F10
30
20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
tempo (min)
B
[α-Trombina] nM
12
10
8
6
4
2
0
36.0
18.0
9.0
4.5
2.25
1.3
-
número de MVs x 103/mL
Figura 11 – Formação do complexo protrombinase promovida por MVs de melanoma
B16F10. (A) Cinética de ativação de protrombina (500 nM) por FXa (10 pM) e FVa (1 nM), na
ausência (•) ou na presença (ƒ) de MVs tumorais (3,6 x 104/mL). Um controle negativo foi
incluído pela incubação de protrombina (500 nM) com MVs (3,6 x 104/mL) na ausência de FXa
e FVa (c). (B) Influência da concentração de MVs para a ativação de protrombina (500 nM) na
presença de FXa (10 pM) e FVa (1 nM). Resultados estão expressos como a concentração
absoluta de trombina formada. A determinação da formação de trombina está descrita na
seção de Materiais e Métodos. Cada ponto representa a media ± SD de três determinações.
45
A formação eficiente do complexo protrombinase promovida pelas MVs foi
ainda progressivamente inibida por concentrações crescentes de anexina V (Figs.
12A e B). Esses dados confirmam a exposição de PS funcional por essas
partículas.
25
[α-Trombina] nM
A
20
15
10
5
0
0
3
6
12
25
50
100
B
% Ativação de protrombina
[Anexina V] nM
100
80
60
40
20
0
0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
[Anexina V] nM
Figura 12 – Efeito inibitório de anexina V sobre a formação do complexo protrombinase
induzida por MVs de melanoma. MVs derivadas de células B16F10 (3,6 x 104 /mL) foram
pré-incubadas com diferentes concentrações de anexina V por 5 min, e então incubadas com
FXa (10 pM), FVa (1 nM) e protrombina (500 nM). Resultados estão expressos como a
concentração absoluta de trombina formada (A) ou como porcentagem de ativação de
protrombina relativa à amostra controle que não foi incubada com anexina V (0 nM) (B). A
determinação da formação de trombina está descrita na seção de Materiais e Métodos. Cada
ponto representa a media ± SD de três determinações.
46
4.1.3 Microvesículas derivadas de células B16F10 modulam a produção de
TGF-β1 por macrófagos
A exposição de PS é um dos mais importantes sinais para o
reconhecimento de células apoptóticas por fagócitos e conseqüente modulação
de respostas antiinflamatórias (SAVILL et al., 2002), levando à produção de
fatores imunorregulatórios como TGF-β1 (FADOK et al., 1998). Para investigar a
integridade funcional e atividade sinalizadora dos resíduos de PS apresentados
por MVs produzidas pelo melanoma B16F10, quantificamos a produção de TGFβ1 por macrófagos peritoneais murinos ativados com tioglicolato, cultivados na
presença ou ausência de MVs expondo PS (pré-tratadas ou não com anexina V,
que bloqueia os sítios de ligação a PS). Os fagócitos co-cultivados com MVs de
melanoma secretaram significativamente maiores concentrações de TGF-β1
quando comparados àqueles cultivados sozinhos, efeito esse que foi bloqueado
pela pré-incubação de MVs com anexina V (Fig. 13). Esses resultados mostram
que MVs derivadas de células B16F10 são capazes de modular a ativação de
0.20
*
0.15
0.10
0.05
(A
n
M
+
M
φ+
M
M
Vs
φ
V)
Vs
φ
M
Vs
0.00
M
níveis de TGF-β 1 (D.O. 450 nm)
fagócitos profissionais, de maneira dependente de PS.
Figura 13 – Modulação da produção
de TGF-β1 por MVs de melanoma em
culturas de macrófagos ativados.
nos
Concentrações
de
TGF-β1
sobrenadantes
de
macrófagos
peritoneais ativados por tioglicolato
cultivados na ausência (Mφ) ou na
presença de MVs – pré-tratadas [Mφ +
MVs (An V)] ou não (Mφ + MVs) com
anexina V – foram determinadas por
ELISA. Um controle da presença de
TGF-β1 nas culturas de MVs sozinhas
está representado em MVs. Asterisco
indica p < 0,05 relativo à cultura de
macrófagos controle (Teste t).
47
4.1.4 Microvesículas tumorais aumentam o potencial metastático de células
B16F10 em camundongos C57BL/6
A produção de MVs por células tumorais tem sido relacionada à aquisição
de capacidade metastática e escape da vigilância imune por tais tumores
(CASSARA et al., 1998; GINESTRA et al., 1998). Por isso, investigamos um
possível papel para MVs expondo PS no estabelecimento do melanoma in vivo.
Comparando dois diferentes modelos de adição de MVs ao inóculo de
células B16F10, observamos que apenas a sensibilização com MVs 2 h antes da
inoculação intravenosa de células de melanoma aumentou significativamente o
número
de
nódulos
tumorais
pulmonares
em
camundongos
C57BL/6
(hospedeiros singeneicos) quando estes foram comparados ao grupo controle (p
< 0,001), em contraste com os resultados obtidos pela co-inoculação de MVs e
células de melanoma (p > 0,05) (Fig. 14A). Em outro experimento, dessa vez
utilizando apenas o modelo de pré-sensibilização, esse aumento do número de
nódulos tumorais pulmonares pôde ser bloqueado através da pré-incubação de
MVs com anexina V (Fig. 14B), o que sugere o envolvimento deste fosfolipídeo na
modulação de respostas singeneicas por estas MVs.
A
número de nódulos pulmonares
48
60
40
30
20
10
0
número de nódulos pulmonares
B
***
50
ctrl
+ MVs (co)
+ MVs (pre)
100
**
***
80
60
40
20
0
ctrl
+ MVs
+ MVs (AX)
Figura 14 – Papel de MVs tumorais no estabelecimento do melanoma B16F10 em
camundongos C57BL/6. (A) Comparação de dois diferentes modelos de adição de MVs ao
inoculo de células B16F10. Animais foram inoculados i.v. com 104 células B16F10 sozinhas
(ctrl), co-inoculados com células e MVs (5 x 104) [+ MVs (co)] ou inoculados com células 2 h
após o pré-inóculo de MVs [+ MVs (pre)]. (B) Efeito negativo da inibição de PS na
exacerbação do tumor induzida por MVs de melanoma. No mesmo modelo de présensibilização dos animais com MVs, um grupo de animais foi adicionado: camundongos présensibilizados com MVs tumorais pré-tratadas com anexina V [+ MV (AX)]. Resultados estão
expressos como a mediana do número de nódulos tumorais observados na face convexa dos
pulmões dos animais de cada grupo, 14 dias após o inóculo das células de melanoma.
Asteriscos indicam p < 0,01 (**) e p < 0,001 (***) (Teste t).
49
4.1.5 Microvesículas tumorais aumentam o potencial metastático de células
B16F10 em camundongos BALB/c
Após analisar o papel das microvesículas produzidas in vitro pela linhagem
celular B16F10 no estabelecimento do melanoma em seu hospedeiro singeneico,
passamos a investigar um possível efeito supressor dessas partículas sobre a
eficiente resposta anti-tumoral que é induzida após a inoculação de células da
linhagem B16 em camundongos BALB/c, nos quais o tumor é normalmente
rejeitado. Para isso, utilizamos o modelo de co-inóculo intravenoso de células e
MVs e acompanhamos o surgimento de nódulos tumorais pulmonares. A adição
de MVs ao inóculo de células B16F10 permitiu o desenvolvimento do tumor em
camundongos BALB/c, aumentando não apenas o número de nódulos tumorais
pulmonares (Fig. 15A), mas também suas dimensões (Fig. 15B), sugerindo que
MVs derivadas de células de melanoma são capazes de suprimir respostas
imunes anti-tumorais.
É importante notar que a inoculação de MVs por si só, em ambas as
linhagens de camundongos BALB/c e C57BL/6, não levou ao aparecimento de
nódulos pulmonares de melanoma (dados não mostrados).
50
Figura 15 – Papel de MVs tumorais no estabelecimento do melanoma B16F10 em
camundongos BALB/c. Animais foram inoculados i.v. com 104 células B16F10,
adicionadas (+ MV) ou não (ctrl) de MVs (5 x 104). (A) Resultados estão expressos como
a média ± SD do número de nódulos tumorais observados na face convexa dos pulmões
dos animais de cada grupo (n=5), 28 dias após o inóculo das células de melanoma.
Asteriscos indicam p < 0,01 (**) (Teste t). (B) Fotos representativas dos pulmões (face
convexa) relacionados aos grupos em A.
51
4.2
CARACTERIZAÇÃO
DA
ATIVIDADE
PRÓ-COAGULANTE
DE
MICROVESÍCULAS DERIVADAS DE MELANÓCITOS E MELANOMA
4.2.1 Produção de microvesículas por melanócitos murinos melan-A e
células de melanoma Tm1
Como discutido anteriormente, uma importante correlação entre estados
hipercoagulantes e câncer foi descrita há mais de um século pelo clínico francês
Armand Trousseau, e desde então várias evidências sugerem um papel crítico
para proteínas da coagulação sanguínea na biologia tumoral.
Portanto, uma vez que MVs liberadas pelo melanoma murino B16F10
desempenharam uma importante função pró-tumoral in vivo, assim como foram
capazes de promover a geração de trombina pelo complexo pró-coagulante
protrombinase in vitro, ambos os efeitos dependentes da exposição de PS,
passamos a investigar as propriedades pró-coagulantes de MVs produzidas pela
linhagem celular de melanoma murino Tm1, tal como comparada à sua linhagem
parental não-tumorigênica de melanócitos murinos, melan-A (CORREA et al.,
2005).
A medida da liberação de MVs nos sobrenadantes de cultura de ambas as
linhagens de melanoma e melanócitos mostrou que a taxa de produção de MVs é
consideravelmente maior na linhagem tumorigênica Tm1. Através da contagem do
número de partículas por citometria de fluxo (Figs. 16A e B) e da quantificação de
seu conteúdo protéico pelo método de Bradford (Fig. 16C), observamos que a
linhagem de melanoma Tm1 produz em média duas vezes mais MVs do que a
linhagem de melanócitos melan-A, como evidenciado pela razão entre os dados
52
obtidos para Tm1 e aqueles obtidos para melan-A em ambas as técnicas
utilizadas (Fig. 16D).
A
B
C
D
Figura 16 – Produção de MVs pelas linhagens celulares melan-A e Tm1. (A) Quantificação
da produção de MVs por citometria de fluxo. Precipitados de MVs foram obtidos a partir de
sobrenadantes de cultura de 24 h de células melan-A e Tm1 (cultivadas sob as mesmas
condições), ressuspendidos em volumes iguais de PBS e quantificados em um citômetro de
fluxo (contagem do número de partículas presentes em determinado volume da amostra). (B)
Perfil de espalhamento de luz frontal (FSC – eixo x) vs. espalhamento de luz lateral (SSC –
eixo y) de MVs derivadas de culturas de células melan-A e Tm1, as quais estão quantificadas
em A. (C) Dosagem de proteínas pelo método de Bradford nos extratos totais das amostras de
MVs relacionadas em A e B. (D) Razão entre os dados obtidos para amostras de MVs
derivadas de células Tm1 e aqueles obtidos para MVs derivadas de células melan-A em
ambas as técnicas utilizadas (contagem do número de partículas em citômetro de fluxo e
dosagem protéica pelo método de Bradford). Média ± SD de quantificações de três diferentes
amostras de MVs de melan-A e Tm1.
4.2.2 Exposição
de
PS
e
promoção
da
formação
do
complexo
protrombinase por ambas as MVs produzidas por melanócitos e células de
melanoma
53
Após identificar a produção de MVs pelas linhagens celulares Tm1 e
melan-A, analisamos a exposição de PS por estas estruturas através da
citometria de fluxo. MVs produzidas tanto por melanócitos como por células de
melanoma apresentaram marcação positiva com anticorpo monoclonal que
reconhece o fosfolipídeo PS (3G4, RAN et al., 2005) (Fig. 17A), evidenciada pelo
aumento da intensidade de fluorescência das amostras marcadas quando
comparadas aos controles não marcados, demonstrando que ambas as MVs
expõem PS em sua superfície externa. Além disso, através do cálculo de
intensidade de fluorescência específica para marcação com anticorpo anti-PS
(média geométrica de intensidade de fluorescência das amostras marcadas média geométrica de intensidade de fluorescência das amostras não-marcadas),
verificamos que não há diferença significativa de marcação entre MVs derivadas
de células Tm1 e MVs derivadas de células melan-A (Fig. 17B).
Utilizando ensaios enzimáticos com proteínas purificadas, investigamos
então a participação de ambas as MVs na formação do complexo multimolecular
protrombinase, cuja montagem, como mencionado anteriormente, é dependente
da presença de superfícies aniônicas tais como membranas ricas em PS. Como
esperado, MVs derivadas de ambas as células melan-A e Tm1 foram capazes de
promover a ativação de protrombina pelo complexo pró-coagulante em questão
(Fig. 18A), em contraste com o controle realizado na ausência de MVs. Não foi
observada a formação de trombina quando a protrombina foi incubada na
presença das MVs e na ausência dos fatores Xa e Va. Além disso, a produção de
trombina dependente da presença de MVs tanto de melan-A como de Tm1 pode
ser inibida, em ambos os casos, pelo bloqueio dos sítios de ligação de PS por
concentrações crescentes de anexina V (Fig. 18B). Esses dados definitivamente
54
implicam essas MVs como membranas ricas em PS, e sugerem que ambas as
MVs analisadas expõem níveis semelhante de PS em sua superfície externa –
corroborando os resultados prévios obtidos por citometria de fluxo –, além de
demonstrar a habilidade de tais estruturas em aumentar a ativação de
protrombina pelo complexo protrombinase de forma dependente de PS.
.
B
marcação específica com anti-PS (dMIF)
A
210
180
150
120
90
60
30
0
Tm1
melan-A
Figura 17 – Análise da exposição de PS em MVs derivadas de células Tm1 e melan-A por
citometria de fluxo. (A) Histogramas de intensidade de fluorescência para ambas as MVs.
Curva em cinza representa MVs não marcadas; linha preta representa marcação com
anticorpo monoclonal anti-PS conjugado a Alexa 488. (B) Intensidade de fluorescência
específica para marcação com anticorpo anti-PS (dMIF representa a diferença entre a média
geométrica de intensidade de fluorescência das amostras marcadas e a média geométrica de
intensidade de fluorescência das amostras não-marcadas) observada para MVs derivadas de
células Tm1 e MVs derivadas de células melan-A. Barras representam média ± SD de três
diferentes determinações.
55
A
[α-Trombina] nM
50
40
30
20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
tempo (min)
FXa + FVa
MVs Tm1
FXa + FVa + MVs Tm1
MVs melan-A
FXa + FVa + MVs melan-A
% Ativação de protrombina
B
100
MVs melan-A
MVs Tm1
80
60
40
20
0
0.00
3.00
6.00
12.50
[Anexina V] nM
Figura 18 – Formação do complexo protrombinase promovida por MVs de melanócitos
melan-A e de melanoma Tm1. (A) Cinética de ativação de protrombina (500 nM) por FXa (10
pM) e FVa (1 nM), na ausência (♦) ou na presença („/•) de MVs (3,6 x 104/mL). Um controle
negativo foi incluído pela incubação de protrombina (500 nM) com MVs (3,6 x 104/mL) na
ausência de FXa e FVa (c/d). (B) Efeito inibitório da anexina V na ativação de protrombina
por MVs. MVs derivadas de tanto de células melan-A como de células Tm1 (3,6 x 104 /mL)
foram pré-incubadas com diferentes concentrações de anexina V por 5 min, e então incubadas
com FXa (10 pM), FVa (1 nM) e protrombina (500 nM). Resultados estão expressos como a
concentração absoluta de trombina formada (A) ou como porcentagem de ativação de
protrombina relativa à amostra controle que não foi incubada com anexina V (0 nM) (B). A
determinação da formação de trombina está descrita na seção de Materiais e Métodos. Cada
ponto representa a media ± SD de três determinações.
56
4.2.3 MVs de melanoma aceleram o tempo de coagulação de plasma murino
de maneira mais eficiente do que MVs produzidas por melanócitos
A fim de determinar o efeito de MVs produzidas tanto pela linhagem celular
melan-A como pela linhagem Tm1 sobre a ativação geral da cascata de
coagulação, avaliada através da formação do coágulo de fibrina, utilizamos o
ensaio de recalcificação de plasma. Plasma murino com o anti-coagulante citrato
de sódio foi incubado na presença de concentrações crescentes de MVs, e o
processo de coagulação disparado pela adição de cálcio à cubeta de reação.
Dessa forma, verificamos que MVs derivadas tanto de melan-A como de Tm1
diminuíram significativamente o tempo de coagulação quando comparado ao
plasma controle, de maneira dependente de sua concentração (Fig. 19). Contudo,
observamos claramente que o efeito acelerador de MVs de melanoma sobre o
processo de coagulação foi mais pronunciado do que o de MVs de melanócitos,
uma vez que, nas concentrações de 2 x 103 e 2 x 104/mL, as primeiras reduziram
em 30% e 64% o tempo de recalcificação do plasma murino, respectivamente
(Fig. 19, linha vermelha), enquanto as últimas provocaram uma redução
significativa (24%) apenas quando utilizadas na maior concentração (Fig. 19, linha
azul).
Embora a presença de PS em ambas as MVs já pudesse por si só ser
responsável pela aceleração do tempo de coagulação, a atividade pró-coagulante
mais potente observada em MVs derivadas de células de melanoma sugere a
exposição diferencial de outro fator por estas partículas. Um forte candidato é a
proteína iniciadora da cascata de coagulação Fator Tecidual, uma vez que,
através de marcação com anticorpo específico e posterior análise por citometria
57
de fluxo, sua presença só pôde ser detectada em células de melanoma Tm1, em
contraste com melanócitos melan-A (Fig. 20).
tempo de recalcificação (s)
200
175
150
***
125
***
100
75
plasma ctl
50
+ MVs melan-A
25
+ MVs Tm1
0
10 2
10 3
***
10 4
10 5
número de MVs/mL
Figure 19 – Atividade pró-coagulante de MVs derivadas das linhagens celulares melan-A
e Tm1. MVs (ressuspendidas em PBS) produzidas por melanócitos melan-A (linha azul) ou
células de melanoma Tm1 (linha vermelha) foram incubadas, nas concentrações indicadas,
com plasma murino, seguido da recalcificação com 6,25 mM de CaCl2. O controle do tempo de
recalcificação do plasma murino na ausência de MVs está indicado pelo círculo preto. Cada
ponto representa média ± SD de três diferentes experimentos. Asteriscos indicam p < 0,001
(***) relativo ao controle (Teste t).
Figura 20 – Análise da exposição de Fator Tecidual em células Tm1 e melan-A. Análise
da exposição de Fator Tecidual por citometria de fluxo. Curva em cinza representa células
incubadas com anticorpo isotipo controle; linha preta representa células marcadas com
anticorpo monoclonal anti-Fator Tecidual murino.
58
4.2.4 MVs derivadas ex vivo de camundongos C57BL/6 inoculados com
células de melanoma Tm1 apresentam potencial pró-coagulante semelhante
àquelas obtidas in vitro
Para investigarmos a relevância da produção in vivo de MVs para o
estabelecimento de um estado pró-trombótico, inoculamos células da linhagem
tumorigênica Tm1, por via subcutânea, em camundongos C57BL/6 e, após 17
dias, verificamos a presença de MVs no plasma desses animais, a partir do
mesmo protocolo de centrifugações utilizado para purificação de MVs in vitro.
Dessa forma, pudemos obter uma população de partículas com perfil de
espalhamentos de luz frontal e lateral (FSC vs. SSC), analisado por citometria de
fluxo, bastante similar ao já determinado para MVs produzidas in vitro (Fig. 21A).
Do contrário, tal população não pode ser observada no plasma de animais
inoculados apenas com veículo de inoculação (meio DME), ou ainda, com células
da linhagem não-tumorigênica de melanócitos, melan-A, como demonstrado pelas
contagens de partículas apresentadas na figura 21, painel B.
59
A
B
número de partículas
(x 104/mL plasma)
300
250
200
150
100
50
0
ctl
melan-A
Tm1
Figura 21 – Análise da presença de MVs em plasma de camundongos C57BL/6
inoculados com células de melanoma Tm1 ou melanócitos melan-A. Animais foram
inoculados por via subcutânea com 5 x 105 células, Tm1 ou melan-A, ou apenas com veículo
de inoculação (meio DME). Após 17 dias, plasmas foram purificados e a presença de MVs foi
analisada por citometria de fluxo. (A) Perfil de espalhamento de luz frontal (Foward Scatter –
eixo x) vs. espalhamento de luz lateral (Side Scatter – eixo y) de partículas purificadas a partir
do plasma de animais inoculados com células Tm1. (B) Quantificação do número de partículas
purificadas corrigido por volume (mL) de plasma obtido de cada camundongo.
A partir daí, analisamos o potencial pró-coagulante de tais partículas
obtidas ex vivo a partir do plasma de camundongos inoculados com células Tm1,
comparando-as a MVs purificadas in vitro a partir do sobrenadante de cultura da
mesma linhagem celular. Através do ensaio de recalcificação de plasma murino,
observamos que as amostras analisadas reduziram significativamente o tempo de
coagulação (Fig. 22), a níveis comparáveis ao resultado obtido com MVs
produzidas in vitro por células de melanoma Tm1, principalmente em menores
concentrações (10% vs. 15% e 30% vs. 42%, nas concentrações de 2 x 103 e 2 x
104/mL, respectivamente).
60
tempo de recalcificação (s)
180
150
**
**
120
**
**
90
60
30
plasma ctl
MVs in vitro
MVs ex vivo
0
10 3
10 4
10 5
número de MVs/mL
Figure 22 – Atividade pró-coagulante de MVs obtidas ex vivo a partir do plasma de
camundongos inoculados com a linhagem celular Tm1. Partículas (ressuspendidas em PBS)
obtidas ex vivo a partir do plasma de camundongos inoculados por via subcutânea com células de
melanoma Tm1 („) ou purificadas in vitro do sobenadante de cultura das mesmas células (▲) foram
3
4
incubadas, na concentração de 2 x 10 ou 2 x 10 MVs/mL, com plasma murino, seguido da
recalcificação com 6,25 mM de CaCl2. O controle do tempo de recalcificação do plasma murino na
ausência de MVs está indicado pelo círculo preto (plasma ctl). Cada barra representa média ± SD de
três diferentes determinações. Asteriscos indicam p < 0,01 (**) relativo ao controle (Teste t).
A utilização de marcadores específicos faz-se ainda necessária a fim de se
confirmar a origem dessas estruturas. Contudo, em conjunto, esses dados
sugerem uma relevância fisiológica para a produção de MVs no estabelecimento
do melanoma e indicam a capacidade dessas partículas de modularem o
processo de coagulação in vivo.
61
5
DISCUSSÃO
62
A liberação de microvesículas (MVs) a partir de membranas plasmáticas é
um fenômeno fisiológico, observado em diversos tipos celulares, que ocorre após
certos estímulos de ativação celular e durante a morte por apoptose. Tal processo
tem sido cada vez mais associado ao desenvolvimento e progressão de uma
grande variedade de tumores, p.ex. carcinoma de ovário e câncer gástrico
(GINESTRA et al., 1999; KIM et al., 2003; GRAVES et al., 2004), embora os
mecanismos exatos responsáveis por essa importante correlação ainda não
sejam bem conhecidos. Sabe-se que o processo de formação de MVs está
intimamente ligado à perda de assimetria lipídica de membrana e conseqüente
exposição de fosfatidilserina (PS). Quando exposto em superfícies celulares, PS é
capaz de estimular respostas antiinflamatórias e imunossupressivas e, ainda,
participar diretamente da ativação da coagulação sanguínea. Por isso, nesse
trabalho, investigamos a participação de MVs expondo PS no estabelecimento do
melanoma maligno, com ênfase em um possível papel imunomodulatório e prótrombótico.
Primeiramente, observamos que MVs produzidas por células B16F10, uma
linhagem de melanoma murino altamente metastática, carregam moléculas de
membrana tais como o antígeno associado a melanomas MAA (LI et al., 1998),
confirmando sua habilidade em transportar antígenos de suas células de origem.
Além disso, expõem em sua superfície resíduos funcionais de PS, o que foi
observado por citometria de fluxo e posteriormente confirmado através de sua
capacidade de promover a formação do complexo pró-coagulante protrombinase,
um processo que depende da presença de membranas negativas ricas em
fosfolipídios aniônicos (MONROE, HOFFMAN e ROBERTS, 2002).
63
Como a exposição de PS é normalmente associada ao processo
apoptótico, é importante notar que células B16F10 utilizadas nesse estudo
mantiveram-se saudáveis e viáveis em cultura (como monitorado por microscopia
ótica e eletrônica) e não apresentaram fragmentação de DNA ou outros fenótipos
apoptóticos (dados não mostrados). De modo interessante, a presença de PS na
membrana de células B16F10 na forma de agregados evidencia ainda uma
importante atividade funcional para esse ligante de superfície, já que tal
distribuição foi associada a um aumento da afinidade de PS por seu(s)
receptor(es) (HENSON, BRATTON e FADOK, 2001).
Como mencionado anteriormente, o reconhecimento de PS é capaz de
modular respostas inflamatórias através da indução da liberação de fatores
imunorregulatórios como TGF-β1, um importante mediador do processo de
progressão maligna. De fato, MVs de melanoma B16F10 estimularam a produção
dessa citocina por macrófagos murinos de maneira dependente de PS, o que
indica sua atuação como elementos sinalizadores complexos, os quais poderiam
afetar o microambiente tumoral, incluindo uma possível modulação do sistema
imune. Tal sugestão é apoiada por dados anteriores da literatura que
demonstraram um contato direto entre MVs tumorais e monócitos capaz de alterar
características imunofenotípicas e a atividade biológica desses últimos (BAJKRZYWORZEKA et al., 2006). Além disso, Valenti e colaboradores identificaram
recentemente um novo mecanismo imunossupressivo, mediado por MVs
tumorais, associado à diferenciação de macrófagos em células supressoras
mielóides produtoras de TGF-β (VALENTI et al., 2006; VALENTI et al., 2007).
A partir daí, analisamos o papel de MVs no estabelecimento do melanoma
maligno in vivo, e observamos que estas aumentam o potencial metastático de
64
células B16F10 em camundongos C57BL/6 (hospedeiro singeneico), efeito esse
também dependente de PS. Isso indica o envolvimento de tal fosfolipídio, exposto
por estas partículas, no processo de metástase do melanoma maligno, e está de
acordo com outros resultados prévios, os quais demonstraram que o bloqueio de
PS por anexina V em células de linfoma RMA reduz significativamente sua
habilidade de formar tumores em camundongos (BONDANZA et al., 2004). Em
outro modelo in vivo, verificamos ainda que co-inóculo de MVs e células de
melanoma permitiu o desenvolvimento do tumor em camundongos BALB/c,
hospedeiros alogeneicos normalmente resistentes à linhagem celular B16F10.
Nesse ensaio, observamos um aumento não apenas do número, mas também do
tamanho dos nódulos tumorais pulmonares, o que sugere que MVs derivadas de
células de melanoma são capazes de suprimir respostas imunes antitumorais. Um
mecanismo alternativo para explicar o efeito pró-tumoral in vivo observado para
MVs de melanoma seria uma possível definição de “nichos metastáticos” por
essas estruturas, papel já descrito por outros autores para sobrenadantes de
células tumorais (KAPLAN et al., 2005). Tal função estaria associada à migração
de MVs tumorais para certos sítios preferenciais e a uma subseqüente mudança
das condições locais, facilitando a localização e o crescimento celular
metastáticos.
Finalmente, considerando que MVs derivadas de melanoma carregam
moléculas de superfície tais como PS, envolvido na regulação positiva de fatores
imunorregulatórios como TGF-β1, postulamos que estas poderiam prevenir
respostas inflamatórias e conseqüentemente modular negativamente respostas
imunes inatas e adaptativas. Contudo, sabe-se que a molécula de PS também
está envolvida em outros fenômenos fisiológicos, como o processo de coagulação
65
sanguínea, que envolve uma série de reações de ativação de zimogênios,
catalisadas por complexos enzimáticos constituídos de uma serino-protease, um
co-fator protéico e membranas ricas em fosfolipídios aniônicos. Além disso, uma
correlação entre câncer e estados pró-coagulantes tem sido descrita há mais de
um século, e várias evidências sugerem um papel significativo de proteínas da
coagulação na biologia tumoral. Por isso, uma vez que MVs liberadas por células
de melanoma B16F10 demonstraram ser capazes de promover a formação do
complexo
enzimático
protrombinase
in
vitro,
convertendo
eficientemente
protrombina em trombina, acreditamos que sua capacidade de facilitar o
estabelecimento do tumor in vivo poderia estar relacionada não somente a uma
possível função antiinflamatória, mas também a uma provável atividade prócoagulante dessas estruturas.
Investigamos então essa segunda atividade em um modelo comparativo
entre a linhagem celular de melanoma Tm1 e sua linhagem parental de
melanócitos não-tumorigênicos, melan-A, onde procuramos caracterizar o perfil
pró-coagulante de MVs produzidas por ambos os tipos celulares. Dessa forma,
observamos primeiramente que a taxa de produção de MVs pela linhagem de
melanoma Tm1, em um período de 24 h, foi consideravelmente maior
(aproximadamente o dobro). De fato, sabe-se que linhagens celulares com alta
taxa proliferativa produzem maiores quantidades de MVs quando comparadas a
linhagens de proliferação mais lenta (RATAJCZAK et al., 2006b), o que se
encaixa nos perfis das linhagens Tm1 e melan-A, respectivamente (CORREA et
al., 2005). Além disso, essa marcante diferença quantitativa na produção de MVs
é reforçada por trabalhos onde uma importante associação entre o processo de
microvesiculação e a aquisição de fenótipos malignos agressivos foi previamente
66
discutida, tanto em modelos de melanoma quanto em outras linhagens celulares
(TAYLOR et al., 1988; CASSARA et al., 1998; GINESTRA et al., 1998). Cabe
ainda ressaltar que melanócitos da linhagem melan-A são dependentes de éster
de forbol (PMA) como um fator de crescimento, o qual, sendo um importante
agente de ativação celular, poderia estar induzindo uma liberação “não-fisiológica”
de MVs nos sobrenadantes de cultura dessas células. Em contraste, a linhagem
de melanoma Tm1, assim como outras células tumorais (TAYLOR e BLACK,
1986), são capazes de produzir MVs mesmo na ausência de estímulos de
ativação, o que sugere um fenômeno espontâneo de microvesiculação in vivo. De
acordo com essas observações, verificamos a presença de MVs apenas no
plasma de camundongos inoculados por via subcutânea com células de
melanoma Tm1, o que não foi observado no plasma de animais inoculados com
células da linhagem não-tumorigênica melan-A, ou ainda, somente com o veículo
de inoculação (meio DME). A possível origem dessas estruturas será mais bem
discutida ao final dessa seção.
O passo seguinte foi investigar possíveis diferenças qualitativas entre MVs
produzidas por ambas as linhagens celulares melan-A e Tm1. A análise da
presença de PS na superfície de MVs derivadas de células Tm1 e melan-A,
através da citometria de fluxo, mostrou perfis de exposição de tal fosfolipídio
bastante similares. Isso se refletiu na capacidade de ambas as MVs de promover
a formação do complexo protrombinase (fator Xa/fator Va/protrombina), levando à
formação de níveis semelhantes de trombina, de maneira dependente de PS.
Realmente, praticamente todos os tipos de MVs já descritos – isto é, MVs de
diversas origens celulares – expõem PS em sua membrana externa, inclusive
aquelas obtidas de pacientes com diferentes patologias. Não por acaso, a
67
proteína anexina V, capaz de se ligar a PS com grande afinidade, é utilizada
freqüentemente como marcador de MVs em métodos de quantificação dessas
partículas (DIAMANT et al., 2004). Logo, a exposição de PS parece ser, de fato,
inerente ao processo de microvesiculação (ou vice-versa), corroborando
sugestões prévias de outros autores (COMFURIUS et al., 1990; TOTI et al., 1996;
CASTAMAN et al., 1997; ZWAAL e SCHROIT, 1997). Por outro lado, no caso da
produção in vivo de MVs expondo PS ser exclusiva de células de melanoma
transformadas, em contraste com melanócitos normais não-ativados, podemos
supor que a capacidade dessas estruturas de promover a geração de trombina no
microambiente neoplásico seria de grande importância para a biologia tumoral.
Tal enzima aumenta o potencial metastático de células de melanoma murino
(WOJTUKIEWICZ et al., 1993), assim como sua inibição diminui a implantação,
crescimento, migração e metástase tumorais (ESUMI, FAN e FIDLER, 1991;
ASANUMA et al., 2004). Por fim, diferentes trabalhos já demonstraram diversas
ações de trombina sobre células de melanoma mediadas pela ativação de
receptores ativados por proteases (NIERODZIK et al., 1998; TELLEZ e BAR-ELI,
2003; SHI et al., 2004), os quais requerem a presença da enzima cataliticamente
ativa.
Posteriormente, avaliamos o efeito de MVs sobre a ativação geral da
cascata de coagulação, determinada através da formação do coágulo de fibrina, e
verificamos que, apesar de apresentarem níveis semelhantes de PS exposto,
MVs derivadas de células de melanoma aceleram o tempo de coagulação de
plasma murino de modo mais eficiente do que MVs produzidas pela linhagem de
melanócitos não-tumorigênicos. Isso sugere, portanto, a exposição diferencial de
outro fator pró-coagulante, possivelmente a proteína iniciadora do processo de
68
coagulação, Fator Tecidual, a qual foi detectada na superfície de células Tm1,
mas não de melan-A. De fato, níveis de expressão dessa proteína parecem se
correlacionar
com
o
perfil
maligno/agressivo
de
diferentes
linhagens
(AMIRKHOSRAVI et al., 1996). A expressão de Fator Tecidual tem sido
relacionada ainda ao potencial metastático de células de melanoma, por
mecanismos dependentes ou não de sua atividade pró-coagulante (BROMBERG
et al., 1999), e sua inibição reduz significativamente a implantação e metástase
pulmonares desse tumor (AMIRKHOSRAVI et al., 2002; WANG et al., 2004).
Logo, MVs liberadas por células Tm1 poderiam constituir uma importante fonte de
Fator Tecidual tumoral, o que já foi observado em diferentes linhagens malignas,
como de carcinoma colo-retal, carcinoma de células escamosas e glioblastoma,
(BASTIDA et al., 1984; YU e RAK, 2004). Isso amplificaria seu potencial prócoagulante, levando a uma maior geração de enzimas ativas da coagulação
durante o desenvolvimento neoplásico, além de contribuir para um maior depósito
de fibrina no estroma tumoral, fenômeno bem estabelecido que pode facilitar
processos pró-tumorais como a angiogênese (NAGY et al., 1989; FERNANDEZ,
PATIERNO e RICKLES, 2004).
Finalmente, MVs obtidas a partir do plasma de camundongos préinoculados com células de melanoma apresentaram um padrão pró-coagulante
similar ao de MVs purificadas in vitro de células Tm1, observado através de sua
capacidade de acelerar o tempo de coagulação de plasma murino in vitro. Do
mesmo modo, a presença de MVs pró-coagulantes nos produtos do sangue
(plasma e/ou soro) de pacientes com diferentes neoplasias (p.ex., carcinomas de
pulmão, pâncreas, mama e colo-retal) foi recentemente verificada (DEL CONDE
et al., 2007; HRON et al., 2007; TESSELAAR e tal., 2007). Nesses estudos, uma
69
importante correlação entre a atividade de Fator Tecidual associada a MVs e a
ocorrência de eventos pró-trombóticos/estados de hipercoagulabilidade nos
pacientes em questão é relatada, assim como uma menor sobrevida destes
indivíduos (TESSELAAR et al., 2007). Além disso, a origem dessas estruturas é
discutida, e a procura por marcadores tanto de células tumorais quanto de células
sanguíneas tais como monócitos e, principalmente, plaquetas neste complexo
grupo de MVs demonstrou, de maneira geral, que estas poderiam ser produzidas
por diferentes tipos celulares, incluindo o próprio tumor e células vasculares
ativadas. Contudo, a principal diferença observada em pacientes com câncer,
quando comparados aos grupos controle, seria justamente o conteúdo de MVs
expondo Fator Tecidual de origem tumoral, as quais são citadas como a provável
fonte primária de tal proteína no plasma desses indivíduos. Estas poderiam ser
ainda responsáveis pela presença de Fator Tecidual detectada em MVs derivadas
de plaquetas, através de mecanismos de fusão e/ou transferência de moléculas
de superfície entre ambas as MVs, hipótese levantada por estes autores.
Em conjunto, esses dados sugerem que a aquisição do fenótipo maligno
por melanócitos aumenta a produção de microvesículas pró-coagulantes e
indicam sua participação na ativação do processo de coagulação sanguínea in
vivo, com provável envolvimento na patogênese de eventos pró-trombóticos
associados ao câncer.
.
70
6
CONCLUSÃO
71
Nesse estudo, mostramos que microvesículas produzidas pelo melanoma
maligno desempenham importante papel pró-tumoral in vivo, possivelmente
associado à modulação de respostas imunes e inflamatórias, assim como à
ativação do processo de coagulação, ambos os processos dependentes da
exposição do fosfolipídio fosfatidilserina.
Em conclusão, a demonstração de que microvesículas de melanoma
podem carregar diferentes moléculas de superfície a partir de suas células de
origem e, conseqüentemente, modular diferentes respostas biológicas no
organismo hospedeiro em questão, indica que esses complexos fragmentos de
membrana poderiam mimetizar e amplificar sinais tumorais, interagindo com
diversos tipos celulares presentes em ou distantes do microambiente neoplásico,
e, dessa forma, influenciar positivamente o estabelecimento do melanoma
maligno.
72
7
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ANEXOS
84
Anexo 1 - Tumor-derived microvesicles modulate the establishment of
metastatic melanoma in a phosphatidylserine-dependent manner.
Manuscrito submetido ao periódico internacional Cancer Letters.
Autores: Luize G. Lima, Roger Chammas, Robson Q. Monteiro, Maria Elisabete C.
Moreira e Marcello A. Barcinski.
85
Tumor-derived microvesicles modulate the establishment of metastatic
melanoma in a phosphatidylserine-dependent manner
Luize G. Limaa,b*, Roger Chammasc, Robson Q. Monteirob, Maria Elisabete C. Moreiraa
and Marcello A. Barcinskia,d
a
Division of Experimental Medicine, National Cancer Institute, RJ, Brazil; bInstitute of
Medical Biochemistry, Federal University of Rio de Janeiro, RJ, Brazil; cLaboratory of
Experimental Oncology, School of Medicine, University of São Paulo, SP, Brazil;
d
Department of Parasitology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo,
São Paulo, Brazil.
Short Title: Role of tumor microvesicles in metastasis
*Correspondence to: Instituto de Bioquímica Médica/CCS/UFRJ, Avenida Bauhínia 400
(Bloco H, segundo andar, sala 08), Cidade Universitária, Ilha do Fundão, Rio de Janeiro,
21941-590, Brazil.
E-mail: [email protected]. Phone number: +55-21-2562-6782. Fax: +55-21-22708647 (alternate number: +55-21-3233-1493).
86
Abstract
Exposure of phosphatidylserine (PS) on cellular membranes and membrane-derived
microvesicles stimulates a number of anti-inflammatory responses involved in malignant
processes. Herein we show that B16F10 cells, a highly metastatic melanoma cell line,
produce large quantities of PS-containing microvesicles in vitro. Tumor microvesicles
increased TGF-β1 production by cultured macrophages and, in vivo, enhanced the
metastatic potential of B16F10 cells in C57BL/6 mice, both effects being reversed by
annexin V. Most strikingly, microvesicles induced melanoma metastasis in BALB/c mice,
which are normally resistant to this tumor cell line. Altogether, this is the first
demonstration that tumor-derived microvesicles favor the establishment of melanoma
metastasis in a PS-dependent manner, possibly by down-regulating the host’s
inflammatory and/or anti-tumoral immune responses.
Key words: microvesicles; melanoma; metastasis; phosphatidylserine; TGF-β1.
1. Introduction
Microvesicles (MV), also known as microparticles, are membrane fragments that
can be shed from the cell surface of normal healthy or damaged cells under conditions such
as cell activation and growth and apoptosis [1, 2]. MV release from surface membranes
depends on an increase in cytosolic calcium and disruption of the cytoskeleton by calpain
[3, 4], which allows membrane budding and generates circular structures that are
heterogeneous (i) in size (0.1-1 μm) and (ii) in composition, which reflects their cellular
origin. They are rather different from exosomes, generally smaller vesicles (30-100 nm)
that are originated from endosomal compartments after exocytosis of secretory granules
[2].
87
Although observed in various cell types, microvesicles formation has been
particularly associated with tumor progression, due to the higher MV levels found in the
fluids of cancer patients when compared with healthy individuals [5, 6]. Indeed, data from
the literature show that the amount and proteolytic activities of MV correlate with the
invasiveness of human cancer cell lines in vitro [7], which can be related to the acquisition
of metastatic capability by these tumors [8]. Furthermore, MV carry numerous membrane
proteins and lipids similar to those present in the cell from which they originate (e.g., tissue
factor-bearing MV derived from monocytes) [9] and, in the context of neoplastic cells, the
transport of immunoregulatory molecules such as Fas ligand has already been
demonstrated [10, 11], which suggests an important association between MV production
and immunosuppression.
The exact mechanisms involved in MV formation are not fully understood but it is
known that this phenomenon is energy-dependent and results from cell membrane
remodeling and loss of lipid asymmetry, leading to phosphatidylserine (PS) exposure [12].
PS is an anionic phospholipid normally found in the inner leaflet of the cell membrane
bilayer. It is translocated to the outer leaflet by special aminophospholipid translocase and
scramblase activities [13], which can occur more extensively under certain conditions such
as platelet activation and apoptosis. The identification and clearance of apoptotic cells by
phagocytes such as macrophages, prior to membrane rupture, not only prevents the release
of potentially injurious intracellular contents into the surrounding tissue, but also actively
stimulates anti-inflammatory and immunosuppressive responses [14]. Fadok et al. have
shown that human macrophages, when stimulated in the presence of apoptotic neutrophils,
produce high levels of immunoregulatory factors such as transforming growth factor
(TGF)-β1 and interleukin (IL)-10 [15]. Later in vivo studies demonstrated that PSdependent TGF-β1 secretion by macrophages accelerates the resolution of acute
88
inflammation [16], and likewise inhibits extremely inflammatory phenotypes such as the
induction of tumor cell apoptosis by interferon (IFN)-γ/lipopolysaccharide (LPS)stimulated macrophages [17].
Non-physiological levels of TGF-β1 can also be produced by cancer cells
themselves. In an autocrine manner, this affects their growth and differentiation and, in a
paracrine manner, it affects the entire tumor microenvironment, contributing to tumor
progression and metastasis [18]. Clinical studies have shown, for example, that melanoma
patients present elevated levels of TGF-β1 associated with tumor growth and dissemination
[19, 20], which can be partly explained by the fact that this cytokine plays an important
role in the immune response regulation through the suppression of both proliferation and
differentiation of immune cells such as B and T lymphocytes [18]. Indeed, Gorelik and
Flavell demonstrated that the blockade of TGF-β signaling in T cells leads to tumor
eradication [21], which suggests a critical role for this molecule in the evasion of cancer
cells from immune surveillance and corroborates its association with tumor development.
Since semi-quantitative analyses of PS on the membrane outer surface of human
cell lines have shown that tumor cells expose higher PS levels when compared with normal
healthy ones [22], and considering that MV formation and PS exposure in cell membranes
are closely related phenomena, we postulate their involvement in the establishment of
B16F10 murine malignant melanoma, possibly through the up-regulation of TGF-β1
production and consequent downmodulation of macrophage activation. Here we
demonstrate that cells from the highly metastatic malignant melanoma cell line B16F10
produce large quantities of MV in vitro, which can up-regulate TGF-β1 production by
professional phagocytes. Furthermore, we have observed that MV injection prior to or
together with an intravenous inoculum of the B16F10 cell line increases the number of
pulmonary tumor nodules in vivo, in a PS- dependent fashion. Altogether, our data suggest
89
a potential role for PS-bearing melanoma microvesicles in tumor establishment, possibly
by down-regulating anti-tumoral immune responses.
2. Materials and Methods
2.1. Cell culture
The murine B16F10 melanoma cell line was grown at 37ºC in a humidified, 5%
CO2 atmosphere in culture flasks in Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM,
GibcoBRL) containing foetal bovine serum (FBS) 10% (v/v) and supplemented with 2.4
g/L HEPES, 3.7 g/L sodium bicarbonate, 125 mg/L sodium dihydrogen phosphate, 110
mg/L sodium pyruvate, 100.000 U/L penicillin, 100 mg/L streptomycin, 2 mM Lglutamine and 55 μM β-mercaptoethanol. After separation of cell culture supernatant for
posterior MV purification, tumor cells were detached with Hank’s solution containing 10
mM HEPES and 0.2 mM EDTA, spun at 350 x g for 7 min, resuspended in DMEM
containing 10% FBS (supplemented as previously described) and transferred to another
culture flask (or maintained at 4oC until utilization).
2.2. MV purification
B16F10 cell culture supernatants were consecutively centrifuged at 800 x g for 10
min and at 14,000 x g for 15 min, always at 4ºC. The final pellet was then washed once
and resuspended in phosphate-buffered saline (PBS), quantified by counting in a BD
FACScalibur™ Flow Cytometer (Becton, Dickinson and Company) and stored at - 80ºC
until utilization. Quantification of MV by FACS analysis was further validated by protein
quantification with the Bradford assay.
90
Also, it is noteworthy that smaller vesicles (as the so called exosomes) were not
included in the present study since more vigorous ultracentrifugation (100,000 x g for 60
min, for example) of cells supernatants was not performed.
2.3. Flow cytometric analyses
For surface phosphatidylserine detection, B16F10 cells and MV were resuspended
in 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 and 10 mM HEPES, pH 7.3
(annexin binding buffer) and incubated with 25 μg/mL annexin V-FITC (Molecular
Probes) for 15 min at room temperature. B16F10 cells were also labeled with 10 μg/mL
propidium iodide (PI) for exclusion of those that had lost plasma membrane integrity
becoming PI permeable.
MV were also resuspended in PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA)
and incubated for 1 h at 4ºC with a murine monoclonal antibody against melanoma
associated antigen MAA (MM29B6), hybridoma supernatant diluted 1:1. After washing to
remove unbound antibody, MV were incubated with anti-mouse IgG-FITC (Sigma),
diluted 1:800, for 1 h at 4ºC. MV were washed again and analyzed using a BD
FACScaliburTM Flow Cytometer (Becton, Dickinson and Company). Data were analyzed
by the BD CellQuest ProTM software (Becton, Dickinson and Company).
2.4. Electron microscopy
For localization of phosphatidylserine residues by transmission electron
microscopy, B16F10 MV were pre-fixed for 10 min at 4oC in a solution containing 0.1%
glutaraldehyde and 4% paraformaldehyde in 0.1 M cacodylate buffer, pH 7.2. After prefixation, samples were washed three times, incubated for 30 min at 4oC with biotinylated
annexin V (Pharmingen) – diluted 1:10 – and then post-incubated with streptavidin labeled
91
with 10 nm colloidal gold particles (Sigma), 0.25 U/mL, also for 30 min at 4oC. A control
for non-specific secondary labeling was done by directly incubating MV with streptavidin.
After the last incubation, MV were washed three times in annexin buffer containing
3% BSA, fixed for 1 hr in a solution containing 2.5% glutaraldehyde, 1%
paraformaldehyde, 8% sucrose and 2.5 mM CaCl2 in 0.1 M cacodylate buffer, pH 7.2, at
37oC, and washed three more times in 0.1 M cacodylate buffer containing 2.5 mM CaCl2.
Postfixation was carried out in osmium tetroxide and potassium ferricyanide (1:1) for 30
min at 4oC and followed by four washes in 0.1 M cacodylate buffer containing 2.5 mM
CaCl2.
MV were then dehydrated with acetone and embedded in epon resin. Ultrathin
sections were stained with uranyl acetate and lead citrate and examined in a Zeiss CEM
900 transmission electron microscope (Zeiss; Oberkochen, Germany).
For simple visualization of MV, a similar protocol was followed, but without the
steps of annexin V and streptavidin labeling.
2.5. Fluorescence microscopy
B16F10 cells were grown on glass coverslips. After achieving confluence, cells
were washed three times with PBS and incubated with biotinylated annexin V
(Pharmingen), diluted 1:10, in annexin binding buffer for 15 min. This was followed by
sequential incubation with 2.5 μg/mL streptavidin-FITC (Pharmingen), also for 15 min in
annexin binding buffer. The coverslips were washed in annexin binding buffer, mounted
with n-propylgallate, and observed in an Axiovert S 100 microscope equipped with a
KS300 image analyzer (Zeiss; Oberkochen, Germany).
A control for non-specific secondary labeling was done by directly incubating
B16F10 cells with streptavidin. In addition, a permeabilized sample was prepared by
92
fixation with freshly prepared 2% paraformaldehyde in PBS (pH 7.2) for 30 min and by
sequential treatment with 40 μM digitonin for 10 min before annexin V and streptavidin
incubations.
2.6. Prothrombin activation by MV
Activation of prothrombin by the prothrombinase complex (factor Xa/factor Va)
was performed in 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA, pH 7.5
(HEPES-BSA buffer), using a discontinuous assay. Factor Xa (10 pM, final concentration)
was incubated with factor Va (1 nM, final concentration) in the presence of B16F10 MV
(0-3.6 x 104/mL) for 2 min at 37ºC. Reaction was initiated by addition of prothrombin (500
nM, final concentration) and aliquots of 10 µL were removed every 1 min into microplate
wells containing 40 µL of Tris-EDTA buffer. After addition of 50 µL of 200 µM S-2238
prepared in Tris-EDTA buffer, absorbance at 405 nm was recorded, at 37ºC, for 20 min at
6-s intervals using a Thermomax Microplate Reader (Molecular Devices). Velocities
(mOD/min) obtained in the first minutes of reaction were used to calculate the amount of
thrombin formed.
The effect of annexin V on thrombin formation was also tested as follows: B16F10
MV (3.6 x 104/mL) were incubated with varying amounts of annexin V (0-100 nM) for 5
min at 37oC in HEPES-BSA buffer. Then, MV were incubated with factor Xa (10
pM)/factor Va (1 nM) for 2 min, at 37oC, followed by addition of prothrombin (500 nM).
Aliquots of 10 µL were removed after 5 min, and delivered to microplate wells containing
40 µL of Tris-EDTA buffer. The amount of thrombin formed was evaluated as described
above using its chromogenic substrate S-2238.
2.7. Quantification of TGF-β1 in co-cultures of macrophages and B16F10 MV
93
Thioglycollate (Sigma-Aldrich)-induced macrophages from BALB/c mice were
pooled and washed in DMEM containing 10% FBS (supplemented as previously
described). After differential cell count, 5 x 105 macrophages were plated in 24-well
chambers (TPP) at 37°C. After 2 h of incubation for adherence, cells were washed and
cultured with B16F10 MV (pre-incubated or not for 15 min with annexin V Pharmingen
diluted 1:250) overnight at 37°C in serum-free medium. After co-culture, active TGF-β1
production was assayed by ELISA (DuoSet kit; R&D Systems).
2.8. Quantification of B16F10 melanoma metastasis
Six- to 8-wk-old BALB/c and C57BL/6 mice maintained at our own facilities were
injected via the lateral tail vein with a 100 μL-bolus of 104 B16F10 cells (ressuspended in
DMEM). After 2-4 wks, animals were killed by carbon dioxide inhalation, lungs were
removed and the number of pulmonary tumor nodules was counted only on the convex
face of the organ.
To assess the effect of B16F10 MV in this model, mice were injected intravenously
with a 100 μL-bolus of 5 x 104 B16F10 MV (purified from normal cell cultures and preincubated or not for 15 min with annexin V Pharmingen diluted 1:250) 2 h prior to or at the
same time as the injection of tumor cells.
2.9. Statistical analysis
One-way ANOVA or unpaired t test with Welch correction were performed using
the InStat software (GraphPad).
3. Results
3.1. B16F10 cells produce microvesicles in vitro
94
In order to investigate the role of MV formation and PS exposure in the
establishment of malignant melanoma, we decided to work with the B16F10 malignant
melanoma cell line, which was selected for its high capacity to form pulmonary tumor
nodules in its syngeneic host, C57Bl/6 mice, when inoculated intravenously [23].
Moreover, this highly metastatic cell line was shown to produce TGF-β1 both in vitro and
in vivo [21], representing a good model to study the role of this cytokine in melanoma
establishment in vivo. First, we examined the shedding of MV by B16F10 cells in vitro. By
setting up a protocol of successive differential centrifugations of culture-derived
supernatant, we were able to isolate microvesicles that were characterized both by
transmission electron microscopy and flow cytometry. With the former we could observe
circular membrane structures rather homogeneous in morphology presenting an estimated
diameter of 200 nm (Fig. 1A), and carrying an internal electrondense material interpreted
as melanin. The presence of DNA was discarded by negative propidium iodide staining
and agarose gel analysis (data not shown). By flow cytometry we were able to detect and
determine a forward vs. side light scattering profile for MV (Fig. 1B). This flow cytometric
analysis became the major parameter used throughout the study to routinely monitor
isolated MV.
Since MV expresses molecular markers that are characteristic of the cell from
which they originate [9, 11, 24], we then analyzed B16F10 cell-derived MV for the
presence of different tumor surface molecules. Indeed, B16F10 microvesicles carry the
melanoma-associated antigen MAA (Fig. 1C), specific for melanomas originating in
C57BL/6 mice [25], encoded by an ecotropic retrovirus (MelARV). Flow cytometric
analysis shows that the entire population of MV stains with a high fluorescence intensity
for the MAA antigen.
95
3.2. B16F10 cells and microvesicles expose PS in their external surface
Considering that MV formation and phospholipid phosphatidylserine (PS) exposure
are closely related phenomena, we next examined PS exposure by the B16F10 cells (Fig.
2A and B) as well as in B16F10-derived MV (Figs. 2C and D). Using annexin V as a PS
label we detected by flow cytometry a positive staining for PS on the surface of B16F10
cells (Fig. 2B), confirming data from the literature [26]. Annexin V binding was confirmed
and extended by fluorescence microscopy, showing that PS is exposed in the outer leaflet
of the plasma membrane of non-permeabilized cells in the form of molecular aggregates
(Fig. 2A, middle panels), which clearly differs from a more homogeneous distribution
detected on cells previously permeabilized with digitonin (Fig. 2A, right panels) and
consequently with internal and external PS binding sites available for annexin V. Like the
original cells, B16F10 MV stained positively for PS when analyzed by flow cytometry,
although with a more heterogeneous distribution of fluorescence intensity (Fig. 2C). This
heterogeneous distribution was not observed when MV were previously permeabilized
with digitonin, which suggests that these structures carry similar amounts of PS in their
membranes, but expose it in a variable manner. PS exposure by MV was also confirmed by
transmission electron microscopy (Fig. 2D); however, this result can be an underestimate,
since the classical procedures for this technique, such as glutaraldehyde treatment and epon
resin inclusion, can lead to a very significant loss (70-90%) of lipid content from the
sample [27].
The phenomenon of PS translocation from the inner to the outer leaflet of the cell
membrane can occur more extensively under certain conditions such as platelet activation,
where it is essential for the assembly of different complexes of the coagulation cascade
[28]. To determine whether the PS exposed by MV is functionally active we looked for its
capacity to assemble the procoagulant prothrombinase complex (factor Xa/factor Va),
96
which has already been implicated in thrombin generation by tumor cells [29]. As can be
seen in figure 3A, B16F10 MV are able to efficiently promote activation of prothrombin
into thrombin, which directly correlates with the concentration of MV in the reaction
sample (Fig. 3B). Furthermore, this activity is inhibited in a dose-dependent way by
annexin V (Figs. 3C and D), which blocks PS binding sites.
3.3. B16F10 -derived microvesicles modulate TGF-β1 production by macrophages
PS exposure is one of the most important signals for the recognition of apoptotic
cells by phagocytes and the consequent modulation of anti-inflammatory responses [14],
leading to the production of immunoregulatory factors such as TGF-β1 [15]. To investigate
the functional integrity and signaling activity of PS moieties displayed by MV we
quantified TGF-β1 production by thioglycolate-elicited murine peritoneal macrophages
cultured in the presence or in the absence of PS-bearing melanoma MV, pre-treated or not
with annexin V. The co-cultured phagocytes produced significantly more TGF-β1 than the
ones cultivated alone, being this effect blocked by pre-treating melanoma MV with
annexin V (Fig. 4). This result confirms the ability of B16F10 MV to modulate phagocyte
activation in a PS-dependent manner.
3.4. Tumor-derived microvesicles increase the metastatic potential of B16F10 cells
Tumor cells vesiculation has been related to acquisition of metastatic capability and
to evasion from immune surveillance [8]. Therefore, we further examined a possible role
of PS-exposing MV in the establishment of malignant melanoma in vivo. First, we
observed that sensitization with MV 2 h prior to intravenous inoculation with cells
significantly increased the number of pulmonary tumor nodules in C57BL/6 mice
(syngeneic hosts) (p < 0.01) (Fig. 5A). This increase was abrogated by pre-treating MV
97
with annexin V, which suggests the involvement of PS molecule in the modulation of
syngeneic responses by these MV. Furthermore, MV addition to B16F10 cells inoculum
allowed tumor development in BALB/c mice, a strain that would normally mount an
efficient anti-tumoral response, not only increasing the number of pulmonary melanoma
nodules (Fig. 5B), but also significantly increasing their sizes (Fig. 5C). It is important to
note that inoculation of B16F10 MV itself into both C57BL/6 and BALB/c mice did not
lead to the appearance of pulmonary melanoma nodules (data not shown).
4. Discussion
The shedding of microvesicles from cell-surface membranes is a physiological
phenomenon observed in both normal and damaged cells upon certain activation stimuli [1,
2]. Important correlations between the process of MV formation and the establishment of a
variety of tumor types, e.g. ovarian carcinoma [5, 30], have been reported, although the
exact mechanisms responsible for this correlation are still unknown. This fact led us to
investigate the role of PS, present in a functionally active form on the surface of MV
derived from the B16F10 malignant melanoma, in the establishment of the tumor. When
exposed on the surface of apoptotic cells, PS is able to drive the course of tumor
progression by stimulating anti-inflammatory responses [17], inducing a state of
immunosuppression and the release of TGF-β1, an important mediator of the process of
malignant progression [31].
First we show that the B16F10 cells produce a large quantity of MV in vitro, which
is in accordance with earlier observations of Taylor and collaborators [32, 33]. These
membranous structures had an estimated diameter of 200 nm as observed by transmission
electron microscopy (Fig. 1A), which fits in the range of relative large vesicles sizes
already established in the literature (0.1-1 μm) [2, 4]. Furthermore, they do not contain
98
fragmented DNA (data not shown), differentiating them from apoptotic bodies. Finally,
confirming the ability of MV to bear antigens derived from the original tumor [24] we
observed that MV produced by the B16F10 cell line indeed carry the melanoma-associated
antigen MAA, which also corroborates, in this specific case, its origin in C57BL/6 mice
[25].
Since formation of MV results from cell membrane remodeling and loss of
phospholipid asymmetry [12], we next looked for the presence of PS moieties on the
surface of B16F10 MV, as well as on the melanoma cells themselves. Both structures, even
with their membrane integrity preserved, i.e. not permeabilized with digitonin, stained
positively with annexin V, a universally accepted PS label. As PS exposure is usually
associated with apoptotic process, it is important to note that the cells used in this study
were healthy and viable in culture (as monitored by optical and transmission electron
microscopy) and did not present other morphological features of apoptosis or DNA
fragmentation (data not shown). Interestingly, when analyzed by fluorescence microscopy,
PS moieties can be observed forming patches on the cell surface. This membrane
distribution has been described as important for the functional activity of PS as a cellsurface ligand, due to its ability to increase PS avidity for its cell-surface receptor [34]. PS
distribution on the surface of MV as observed by flow cytometry reveals a very
heterogeneous distribution. However, when permeabilized, thus allowing internalization of
the annexin V label, MV generates a sharp peak, indicating that the total amount of PS
moieties in the different vesicles is very similar. One possible interpretation for these
results is that since MV are unable to actively expose PS, the amount of externalized PS
observed may be a consequence of the cell surface density of moieties in the site from
which the MV originates.
99
Furthermore, B16F10 MV were able to increase, in a dose-dependent manner, the
formation of the procoagulant prothrombinase complex (factor Xa/factor Va), which
efficiently converts prothrombin into thrombin, and this enhancement was inhibited by preincubating MV with annexin V (Fig. 3). It is known that the optimized assembly of such
enzymatic complex depends on the presence of PS-rich membranes [28], which definitely
corroborates PS exposure by melanoma microparticles, as well as demonstrates its
functionality.
Thus, given that PS recognition stimulates anti-inflammatory responses and induces
the release of immunoregulatory factors such as TGF-β1 [14-17], an important mediator of
the process of malignant progression, we examined a possible role of PS-bearing MV in
the modulation of macrophage activation. Indeed, B16F10 MV up-regulated TGF-β1
production by professional phagocytes in a PS-dependent manner (Fig. 4), which
corroborates the idea that melanoma microparticles would be able to act as complex
signaling structures and consequently affect the tumor microenvironment, which includes a
possible modulation of the immune system by MV molecules such as PS, known to exert
anti-inflammatory and immunosuppressive activities. This is supported by recent findings
of Baj-Krzyworzeka et al. who described a direct tumor MV-monocyte contact able to alter
the immunophenotypic characteristics and the biological activity of the monocytes [35].
Indeed, inhibitory effects of these membrane fragments on different cells from the immune
system such as the blockade of proliferation and cytotoxic ability and induction of
apoptosis in lymphocytes [10, 11, 36], as well as the downregulation of class II MHC
expression by monocytes/macrophages [37] have been described. Furthermore, Valenti et
al. have recently identified a novel immunosuppressive pathway mediated by tumorderived MV that is associated with turning monocytes into TGF-β-producing myeloid
suppressive cells [38, 39]. One alternative mechanism for the effect of MV on tumor
100
establishment and metastasis formation is the possibility that they define metastatic niches
as described elsewhere for tumor supernatants [40]. By migrating to certain preferential
sites and changing the “in loco” conditions they might facilitate metastatic cell localization
and growth. We are at the moment defining the preferential localization of B16F10-derived
MV.
Within this context, we analyzed the in vivo role of MV in the establishment of
malignant melanoma. In C57BL/6 mice, the syngeneic host of B16F10 melanoma,
sensitization with MV prior to intravenous inoculation with B16F10 cells increased the
number of pulmonary tumor nodules, which was abrogated by pre-treating MV with
annexin V (Fig. 5A). In fact, previous data from the literature have shown that preincubation of RMA lymphoma with annexin V markedly reduced their ability to form
tumors in mice [41]. These results are in accordance with our results that suggest the
involvement of PS molecule in the modulation of syngeneic response by B16F10
melanoma MV. On the other hand, in in vivo assays with BALB/c mice, a strain that would
normally produce an efficient anti-tumoral response, we observed that MV addition to
melanoma cells inoculum allowed tumor development, increasing not only the number but
also the size of pulmonary tumor nodules (Figs. 5B and C), which indicates that MVs
derived from melanoma cells display the capacity to suppress anti-tumoral immune
responses.
Considering that B16F10 MV carry surface molecules such as PS, implicated in the
up-regulation of immunoregulatory factors such as TGF-β1, we postulate that they might
prevent inflammatory responses, and consequently downregulate innate and adaptive
immune responses. In conclusion, the demonstration that B16F10 MV carry different
surface molecules from their original cells suggests that these complex circular membrane
fragments could amplify tumor signals, interacting with diverse cell types present in or far
101
from melanoma microenvironment, and, in this way, influence the biology of the target
cells.
Acknowledgments
We thank Drs. Peter Henson, Jon Geske and Valerie Fadok for a very productive
scientific interaction; Martha Sorenson for careful revision of the manuscript; José
Morgado (Instituto Nacional do Câncer, RJ, Brazil) for help with the EM analysis; and
Elieser Gorelik (University of Pittsburgh Cancer Institute, Hillman Cancer Center) for
providing the MM29B6 hybridoma. This research was supported by Instituto Nacional do
Câncer (INCa)/Fundação Ary Frauzino para Pesquisa e Controle do Câncer (FAF),
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), and Fundação
de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro Carlos Chagas Filho (FAPERJ).
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107
Legends to figures:
Figure 1 – Identification of MV produced in vitro by B16F10 cells. (A) MV morphology:
photomicrograph obtained by transmission electron microscopy. (B) B16F10 MV
population analyzed by flow cytometry in a dot plot of forward light scattering (FSC) vs.
side light scattering (SSC). (C) Detection of MAA exposure on B16F10 MV. Open
histogram represents staining with monoclonal anti-MAA antibody (MM29B6) followed
by FITC-labeled secondary antibody; shaded histogram represents staining with secondary
antibody in the absence of anti-MAA.
Figure 2 – Detection of PS exposure on B16F10 cells and MV. (A) PS localization on
B16F10 cells surface by fluorescence microscopy. Left panel (NEGATIVE CTL), staining
with FITC-labeled streptavidin in the absence of biotin-conjugated annexin V; middle
panel (LABELED CELLS), staining with biotin-conjugated annexin V followed by FITClabeled streptavidin; right panel [LABELED CELLS (+Digitonin)], staining with biotinconjugated annexin V followed by FITC-labeled streptavidin after pre-treatment with 40
μM digitonin for 10 min. (B) Flow cytometric analysis of PS in B16F10 cells. Black fill
represents unstained cells; thin line represents staining with FITC-labeled annexin V.
Histogram shown refers only to B16F10 cells negatively stained for propidium iodide. (C)
Flow cytometric analysis of PS in B16F10 MV. Shaded curve represents unstained MV;
light gray line represents staining with FITC-labeled annexin V; and dark gray line
represents staining with FITC-labeled annexin V after pre-treatment with 40 μM digitonin
for 10 min. (D) Analysis of PS in B16F10 MV by transmission electron microscopy.
Picture represents staining with biotin-conjugated annexin V followed by gold particlesconjugated streptavidin.
108
Figure 3 – Assembly of prothrombinase complex on B16F10 MV is dependent on PS. (A)
Kinetics for the activation of prothrombin (500 nM) by FXa (10 pM) and FVa (1 nM), in
the absence (•) or in the presence (ƒ) of B16F10 melanoma MV (3.6 x 104/mL). A negative
control was included by incubating prothrombin (500 nM) with MV (3.6 x 104/mL) in the
absence of FXa and FVa (c). (B) Concentration dependence of B16F10 MV for the
activation of prothrombin (500 nM) in the presence of FXa (10 pM) and FVa (1 nM). (CD) Inhibitory effect of annexin V on prothrombin activation by B16F10 melanoma MV.
B16F10 MV (3.6 x 104/mL) were incubated with different concentrations of annexin V for
5 min prior to incubation with FXa (10 pM), FVa (1 nM) and prothrombin (500 nM).
Results are expressed as the absolute concentration of thrombin formed (A-C) or as the
percentage of prothrombin activation relative to the control sample not incubated with
annexin V (0 nM) (D). Assay conditions and determination of thrombin formation are
described in the Materials and Methods section. Each point represents mean ± SD of three
determinations.
Figure 4 – Modulation of TGF-β1 production in macrophages cultures by B16F10
melanoma MV. Concentrations of TGF-β1 in supernatants of thioglycolate-elicited
peritoneal macrophages cultured in the absence (TG-EPM) or in the presence of B16F10
MV – pre-treated [TG-EPM + MV (AX)] or not with annexin V (TG-EPM + MV) – were
assessed by ELISA. A control for TGF-β1 production by B16F10 MV alone is represented
as MV.
Figure 5 – Role of B16F10 MV in the establishment of malignant melanoma in vivo. (A)
Negative effect of PS inhibition on tumor exacerbation induced by B16F10 melanoma MV
109
in C57BL/6 mice. Animals were inoculated intravenously with 104 B16F10 cells alone
(ctrl) or B16F10 cells 2 h after a pre-inoculum of MV (5 x 104) pre-treated [+ MV (AX)] or
not [+ MV] with annexin V. Results are expressed as the median of the number of
pulmonary tumor nodules observed in the animals from each group on day 14 post-tumoral
inoculum. Asterisks indicate p < 0.01 (**) and p < 0.001 (***) (Student’s t-test). (B) Role
of B16F10 MV in the establishment of malignant melanoma in BALB/c mice. Animals
were inoculated intravenously with 104 B16F10 cells, with (+ MV) or without (ctrl) an
addition of B16F10 MV (5 x 104). Results are expressed as the mean of the number of
pulmonary nodules observed in the animals from each group (n = 5) on day 28 posttumoral inoculum. Asterisks indicate p < 0.01 (**) (Student’s t-test). (C) Representative
photographs of the lungs (convex face) related to groups in B.
110
Figure 1
Figure 2
111
Figure 3
Figure 4
*
112
Figure 5
113
Anexo 2 – Procoagulant properties of human MV3 melanoma cells.
Artigo publicado no periódico Brazilian Journal of Medical and Biological
Research, 2008, volume 41, páginas 99-105.
Autores: Diego L. A. Geaquinto, Renato S. Fernandes, Luize G. Lima, Cristina
Barja-Fidalgo e Robson Q. Monteiro.
114
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118
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CURRICULUM VITAE
Nome: Luize Gonçalves Lima
Nascimento: 20/12/1983
Naturalidade: Rio de Janeiro
Formação Acadêmica
•
•
Graduação em Ciências Biológicas Modalidade Médica pela Universidade
Federal do Rio de Janeiro – 2001 a 2005
Mestrado em Química Biológica pelo Instituto de Bioquímica Médica da
Universidade Federal do Rio de Janeiro – 2006 a 2008
Orientação de Estudante
•
Juliana Marques Reis – Programa Jovens Talentosos do Instituto de
Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, desde
fevereiro de 2007
Comunicações em Congresso
•
•
6 comunicações em congressos nacionais
3 comunicações em congressos internacionais
Artigos Publicados
•
Geaquinto, D.L.; Fernandes, R.S.; Lima, L.G.; Barja-Fidalgo, C.; Monteiro,
R.Q. (2008). Procoagulant properties of human MV3 melanoma cells. Braz J
Med Biol Res. 41:99-105.