Boletim de Pesquisa 139 e Desenvolvimento ISSN
Propaganda
Boletim de Pesquisa 139 e Desenvolvimento ISSN 1676 - 1340 Novembro, 2006 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DA PROTEÍNA RECOMBINANTE INSETICIDA Cry2Ab de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki CONTRA LARVAS DE S. frugiperda ISSN 1676 - 1340 Novembro, 2006 Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento 139 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DA PROTEÍNA RECOMBINANTE INSETICIDA Cry2Ab de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki CONTRA LARVAS DE S. frugiperda Raimundo Wagner de Souza Aguiar Érica Soares Martins Ramon Santos Fernandez Viviane Montagne Melatti Rosana Falcão Rose Gomes Monnerat Bergmann Morais Ribeiro Brasília, DF 2006 Exemplares desta edição podem ser adquiridos na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Serviço de Atendimento ao Cidadão Parque Estação Biológica, Av. W/5 Norte (Final) – Brasília, DF CEP 70770-900 – Caixa Postal 02372 PABX: (61) 3348-4739 Fax: (61) 3340-3666 www.cenargen.embrapa.br e.mail:[email protected] Comitê de Publicações Presidente: Sergio Mauro Folle Secretário-Executivo: Maria da Graça Simões Pires Negrão Membros: Arthur da Silva Mariante Maria de Fátima Batista Maurício Machain Franco Regina Maria Dechechi Carneiro Sueli Correa Marques de Mello Vera Tavares de Campos Carneiro Supervisor editorial: Maria da Graça S. P. Negrão Normalização Bibliográfica: Ligia Sardinha Fontes Editoração eletrônica: Maria da Graça S. P. Negrão 1ª edição 1ª impressão (2006): Todos os direitos reservados. A reprodução não autorizada desta publicação, no todo ou em parte, constitui violação dos direitos autorais (Lei nº 9.610). A 945 Avaliação da toxicidade da proteína recombinante inseticida Cry2Ab de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki contra larvas de S. frugiperda. / Raimundo Wagner de Souza Aguiar ... [et al.]. – Brasília, DF : Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2006. 38 p. - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento / Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, ISSN 1676-1340 ; 139). 1. Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. 2. Bactéria. 3. Cry2Ab – proteína. 4. Toxinas. 5. Spodoptera frugiperda. 6. Lagarta. 7. Controle biológico. I. Aguiar, Raimundo Wagner de Souza. II. Série. 632.96 – CDD 21 SUMÁRIO Introdução .................................................................................................................. 7 Material e Métodos .................................................................................................... 9 Resultados ............................................................................................................... 13 Discussão ................................................................................................................ 15 Referencias Bibliográficas (Artigo 1) .................................................................... 24 Referencias Bibliográficas (Artigo 2) ................................................................... 31 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DA PROTEÍNA RECOMBINANTE INSETICIDA Cry2Ab de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki CONTRA LARVAS DE S. frugiperda ______________________________________ Raimundo Wagner de Souza Aguiar1 Érica Soares Martins1, Ramon Santos Fernandez1 Viviane Montagne Melatti2 Rosana Falcão2 Rose Gomes Monnerat2 Bergmann Morais Ribeiro1. 1 Resumo O gene cry2Ab da estirpe brasileira S-447 de B. thuringiensis foi amplificado por PCR, clonado em um vetor de clonagem e seqüenciado. A análise da seqüência mostrou que o gene tem 100% de identidade com outros genes cry2Ab já descritos. O gene foi removido do vetor de clonagem e introduzido em um plasmídeo vetor de transferência (pSynXIVVI+X3) para construção de um baculovírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) recombinante. O DNA do plasmídeo recombinante (pSyncry2Ab) foi usado então, em uma co-transfecção com DNA do vírus recombinante vSyngalVI-(derivado do AcMNPV) em células de inseto em cultura. Pela recombinação homóloga, dentro das células de inseto, entre regiões flanqueadoras do gene cry2Ab no plasmídeo pSyncry2Ab e do gene lac-Z no genoma do vírus vSyngalVI-, o gene cry2Ab foi introduzido dentro do genoma do vírus, ficando sob o comando dos promotores em tandem pSyn e PXIV. O vírus recombinante, denominado de vSyncry2Ab, foi purificado por diluição seriada em placa de 96 poços. Células de inseto em cultura foram infectadas com o vírus vSyncry2Ab e a 72 h p.i., o mRNA extraído e a presença do transcrito do gene cry2Ab foi confirmada por RT-PCR. Os cristais purificados de extrato de larvas de S. frugiperda infectadas (96 h p.i.) com o vSyncry2Ab apresentaram, em SDS-PAGE, um polipeptídeo de aproximadamente 70.75 kDa, correspondente ao tamanho da 1 Laboratório de Microscopia Eletrônica. Dep. de Biologia Celular, IB; Universidade de Brasília. CEP 70910-900, Brasília, DF, Brasil. 2EMBRAPA/CENARGEN Parque Estação Biológica, CP02372, Final Avenida W5 Norte, CEP 70.770-900, Brasília, Brasil. 3EMBRAPA–Milho e Sorgo de Sete Lagoas MG. E-mail: [email protected] proteína Cry2Ab. Análise ultraestrutural de extratos de lagartas de S. frugiperda infectadas com o vírus recombinante mostrou a presença de grandes cristais cubóides, provavelmente formados pela proteína recombinante. Além disso, esses cristais, presentes em preparações semi purificadas, apresentaram toxicidade contra larvas de segundo instar de S. frugiperda com uma CL50 de 3,40 μg/mL. Palavras chave: Cry2Ab, Bacillus thuringiensis, AcMNPV. Introdução Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria de solo Gram-positiva, que produz proteínas entomopatogênicas durante a fase vegetativa e de esporulação, específicas para diferentes ordens de insetos. Entre as proteínas entomopatogênicas produzidas por Bt, as que apresentam maior interesse para o controle de insetos-praga são as δ-endotoxinas ou proteínas Cry. No entanto, várias proteínas Cry com diferenças nas especificidades contra diversas ordens de insetos têm sido reportadas (Hofte & Whiteley 1989, Schnepe et al., 1998, de maagd et al., 2003). A toxicidade das proteínas Cry ocorre a partir da ingestão dessas proteínas, na forma de um cristal protéico, juntamente com o esporo bacteriano, presente no ambiente, pelos insetos susceptíveis. Após a ingestão das proteínas, ocorre a solubilização do cristal em pH altamente alcalino no intestino médio, posteriormente, ocorre a ativação da pró-toxina pelas proteases presente no intestino, tornando a toxina ativa. Sendo que esta forma da toxina é a que se liga aos receptores presentes nas células epiteliais do intestino médio, ocasionando alteração no fluxo de íons nessas células, levando à paralisia do intestino e à morte do inseto (de Maagd et al., 2003, Schnepe et al., 1998, Knowles et al., 1991). Após a morte do inseto, os esporos bacterianos germinam e começa a colonização do cadáver pela bactéria, liberando no ambiente tanto os cristais da proteína como os esporos (Schnepe et al., 1998). B. thuringiensis é o microrganismo mais utilizado na fabricação de biopesticidas em todo o mundo e diversas formulações têm sido testadas para o controle de insetos-praga desde 1938 (Weiser, 1986). Porém, a comercialização de produto a base de B. thuringiensis no controle de insetos-praga foi realizada a partir de 1950 (Weiser, 1986; Edwards et al., 1998). O sucesso da utilização de B. thuringiensis está relacionado com a sua alta toxicidade e especificidade aos organismos alvos, diminuindo assim, o risco para os organismos não alvos, principalmente mamíferos. Atualmente, procura-se utilizar linhagens de Bt que apresentem diversas proteínas Cry diferentes como agentes de controle biológico, o que permite aumentar o espectro de ação dos bioinseticidas no controle dos organismos praga (Frutos et al., 1999). A classificação taxonômica das proteínas Cry é baseada na identidade da seqüência dos aminoácidos (Crickmore et al., 1998). Várias famílias dessas proteínas são alvo de interesse para a agricultura e saúde publica, apresentando toxicidade para insetos das ordens Lepidoptera (Cry1 e Cry2), Diptera (Cry2, Cry4, Cry10 e Cry11) e Coleoptera (Cry3) (Schnepe et al., 1998). O gene da classe cry2A codifica uma proteína de aproximadamente de 70.75 kDa que se acumula na bactéria formando um cristal cubóide durante a fase de esporulação (Widner et al., 1990; Yamamoto et al, 1981). Atualmente, foram caracterizados três genes da classe cry2A que são: cry2Aa (Donovan et al., 1988, Widner et al., 1989); cry2Ab (Dankocsik et al., 1990, Widner &, Whiteley 1989) e cry2Ac (Wu et al., 1991). Sendo que a proteína Cry2Aa é tóxica para espécies das ordens Lepidoptera e Diptera, de importância tanto para agricultura como para saúde pública no controle de vetores de doenças humanas. No entanto, as proteínas Cry2Ab e Cry2Ac apresentam atividade tóxica conhecida somente para as espécies Lepidopteras de importância agrícola. No operon onde o gene cry2Aa está localizado, existem duas outras fases abertas de leitura (ORFs) necessárias para o processo de cristalização da proteína Cry2Aa (Crickmore & Ellar, 1992, Wu et al., 1991). Por outro lado, o gene cry2Ab é um gene que normalmente não é expresso durante a fase de esporulação da bactéria, mas possui alta identidade de seqüência com o gene cry2Aa (Crickmore et al. 1994, 1992, Dankocsik et al. 1990, Liang et al., 1994, Widner et al., 1989). O baculovírus tem sido usado como vetor de expressão de vários genes exógenos (Jarvis, 1997, 2003, Kost et al., 2005, Kost et al., 2005), devido principalmente à alta expressão da proteína recombinante em células de inseto, na fase tardia da infecção viral. Vários trabalhos têm se utilizado desse sistema para a expressão de proteínas Cry de B. thuringiensis (Ribeiro & Croock, 1993,1998; Pang et al. 1992; Martens et al., 1990) com o objetivo de melhorar a patogenicidade viral (Chang et al., 2003). Neste trabalho, nós clonamos, seqüenciamos e introduzimos o gene cry2Ab, obtido da cepa S447 de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, no genoma do baculovírus AcMNPV e analisamos a expressão da proteína recombinante em células de inseto em cultura e em insetos. Além disso, analisamos a toxicidade da proteína recombinante contra larvas de segundo instar de S. frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae). Material e Métodos Amplificação, clonagem e seqüenciamento do gene cry2Ab. O gene cry2Ab derivado da estirpe de B. thuringiensis cepa S447 pertencente ao banco de Bacillus spp. entomopatogênicas da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Monnerat et al., 2001) foi amplificado por uma reação de PCR consistindo de 50 ng de DNA, que foi purificado de acordo com procedimentos realizados por Monnerat et al., 2001, 0.4 µM de cada oligonucleotídeo (F1-Bam HI: 5’-GGGATCCATGAATAATGTATTGAATAGTGGAAG- 3’ e R1-BamHI: 5’GGGATCCTTAATAAAGTGGTGGAAGATTAGTTGGC- 3’), 10 µM de cada dNTP, 2,5 μL de tampão de Taq polimerase, 2mM MgCl2 e 1U de Taq polimerase (Invitrogen) em um volume total de 25 μL. Amplificação foi realizada nos seguintes passos: 94oC/5 min em seguida por 35 ciclos em 95oC/30 s, 52oC/1:30 s, 72oC/4 min e a extensão final de 72oC/8 min. O oligonucleotídeo F1 anela-se na região 5' do gene cry2Ab (o códon de início do gene está escrito em itálico). O oligonucleotídeo R1 anela-se nos nucleotídeos a partir 22 nucleotídeos após o códon de parada do gene cry2Ab. O sitio de restrição Bam HI foi introduzido dentro da seqüência dos oligonucleotídeos (seqüência em negrito) para facilitar a purificação e futuras manipulações do gene. O fragmento amplificado foi, então, clonado dentro do plasmídeo pGEM-T easy (Promega) de acordo com o protocolo de instruções do fabricante e introduzido em células de Escherichia coli DH5-α(Invitrogen). O DNA do plasmídeo recombinante (denominado pGemcry2Ab) foi purificado utilizando o Kit de purificação de DNA Wizard®Plus SV Minipreps (Promega) e seqüenciado no seqüenciador automático MEGA BACE 1000 (Amersham Bioscience) no laboratório de Bioinformática da Embrapa Recursos Genéticos e biotecnologia com oligonucleotídeos (SP6 e T7) que se anelam em regiões flanqueadoras do plasmídeo pGEM-T easy (Promega) e oligonucleotídeos específicos (F-501nt, R1309nt) das regiões internas ao gene cry2Ab. As seqüências obtidas foram analisadas pelos programas ORF finder e Blast, disponíveis na página do National Center for Biotechnology Information (NCBI): www.nih.ncbi.gov. Construção do vetor de transferência O DNA do plasmídeo pGemcry2Ab foi digerido com a enzima de restrição Eco RI e o fragmento contendo o gene cry2Ab foi separado do vetor por eletroforese em gel de agarose 0,8%, seguindo instruções descritas em Sambrook et al. (1989). O fragmento contendo o gene cry2Ab foi purificado do gel usando o kit GFX Kit (Amersham) e clonado dentro do vetor de transferência pSynXIVVI+X3 previamente digerido com Eco RI. Após a clonagem do gene cry2Ab, dentro do vetor de transferência pSynXIVVI+X3, foi realizado uma PCR a fim de se verificar a orientação do gene dentro do vetor de transferência, utilizando oligonucleotídeos específicos do gene cry2Ab (F1-Bam HI e R1-Bam HI) e do pSynXIVVI+X3 com os oligonucleotídeos ORF 603 (5’-ACAGCCATTGTAATGAGACG-3’, que se anela entre os nucleotídeos +8 e -11do códon de início do gene da ORF 603) e polhR (5’CTAGATTCTGTGCGTTGTTG-3’, que se anela entre os nucleotídeos 34 e 54 após o códon de terminação do gene da poliedrina), o que permite verificar se o gene está na posição correta sob o comando dos promotores em tandem Psyn e PXIV (Wang et al., 1991). Células e vírus Células de Trichoplusia ni (BTI-Tn5B1-4) (Granados et al., 1994) foram mantidas a 27 oC em meio TC100 com 10 % de soro fetal bovino (Invitrogen). Esta linhagem de células seve como hospedeira para propagação in vitro do AcMNPV e o vírus recombinante vSyngalVI-, que contém o gene da β-galactosidase no lócus do gene da poliedrina (Wang et al., 1991), e foi usado para a construção do AcMNPV recombinante contendo o gene cry2Ab (deste trabalho). Construção e purificação do vírus recombinante vSyncry2Ab Um µg do DNA do plasmídeo recombinante (pSyncry2Ab) e 0.5 µg DNA do vírus vSyngalVI-, previamente linearizado com a enzima de restrição Bsu 36I, foram utilizado na co-transfecção em placas 60-mm com células BTI-TN5B1-4 (106 células), usando lipossomos e seguindo as instruções do fabricante (Cellfectin® from Invitrogen). A placa foi incubada por sete dias a 27 oC até que aparecessem corpos de oclusão viral (OB), o sobrenadante foi coletado e usado para purificação do vírus recombinante em diluições seriadas em placas de 96 poços (O’Reilly et al., 1992). O único sítio de Bsu 36I no vírus vSynGalVI- é localizado no gene β-galactosidase, e a linearização torna o vírus não infectivo (Kitts et al., 1990), facilitando a purificação do vírus recombinante. Além disso, o plasmídeo pSyncry2Ab possui, além do gene cry2Ab, o gene da poliedrina (ausente no vSyngalVI-). Após a recombinação homóloga entre o DNA do plasmídeo e o DNA viral, dentro das células de inseto, o vírus vSyngalVI- recupera a expressão do gene da poliedrina, que torna evidente a formação de OB pelo vírus recombinante (vSyncry2Ab). O mesmo foi purificado em três passagens de diluições seriadas em placas de 96 poços (O’Reilly et al., 1992) por observações das células que apresentava a presença de OB com auxílio de microscópico de luz invertido (Axiovert 100, Zeiss). Análise transcricional do gene cry2Ab em células de inseto infectadas pelo vírus vSyncry2Ab Uma placa de 100 mm em diâmetro (TPP) foi adicionada de 5 x 106 BTITn5B1-4 células e incubada por 1 h a temperatura ambiente. O meio foi removido e as células foram infectadas com o vírus recombinante vSyncry2Ab com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 20. Após 1 h, o inoculo do vírus foi removido e adicionado meio com soro fetal bovino a 10%. Após 96 h.p.i, as células foram coletadas e a extração do RNA total foi feita utilizando o reagente Trizol (invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. O RNA total purificado foi utilizado para a construção de cDNA usando um oligonucleotídeo especifico para calda de poly-A do RNA mensageiro (T1: 5’CCTGCAGGATCCTTAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3’) e a enzima transcriptase reversa Mu-MLV (Invitrogen), nos seguintes procedimentos: na primeira parte, foram colocados 2μ do RNA total em 9μl água milli-Q Rnase free e 1μl do oligonucleotídeo T1, fazendo um volume final de 12 μl. Posteriormente, foi incubada a 65 oC por cinco minutos em banho Maria e incubada no gelo. Logo em seguida, foi adicionada uma mistura para síntese de cDNA, consistindo de 1 μl da solução dos 4 dNTPs (10 mM cada). 1μl de DTT (0,1 M), 28 unidades do inibidor de Rnase (RNA guard, Gibco), 5 μl do tampão 5X, 1μl da enzima Transcriptase reversa M-MLV RT (Gibco BRL), E água milli-Q autoclavada completando o volume em 8μl. No segundo passo, o tubo contendo o RNA foi adicionado no conteúdo do segundo tubo contendo a enzima transcriptase reversa M-MLV RT (volume total de 20μl), sendo mantida a 37 oC por 50 minutos, para obter a síntese de cDNA. O cDNA obtido foi, então, usado em uma reação de PCR com os oligonucleotídeos T2 (5´ CCTGCAGGATCCTTAGGTT 3´) e o oligonucleotídeo F1 do gene cry2Ab. O oligonucleotídeo F1 anela na posição do ATG, códon de início do gene cry2Ab, e a seqüência do oligonucleotídeo T2, que é idêntica para os primeiros 17 nucleotídeos presente no oligonucleotídeo T1 usado na reação do cDNA (Rodrigues et al., 2001). Para confirmar o fragmento obtido da reação RT-PCR corresponde ao gene cry2Ab foi realizada uma PCR com oligonucleotídeos internos (F-501, 5’AGGATCCCAGTTGTTATT-3’, que se anela na posição +501 a +519, relativa ao códon de início do gene e R-1309, 5’-GCACAGATACCAAATAGG-3’, que se anela nas posições +1309 a +1327, relativas ao códon de início do gene) que permite uma amplificação de um fragmento de 900pb da região interna do gene cry2Ab. Análise dos cristais da proteína recombinante Cry2Ab expressa em larvas de terceiro instar de S. frugiperda Cem larvas de terceiro instar de S. frugiperda foram infectadas com recombinante e outras cem larvas com vírus selvagem AcMNPV para obter os poliedros. As larvas foram infectadas por injeção de BVs a 120 h.p.i. OBs e possíveis cristais da proteína recombinante foram purificados de acordo com protocolos descritos por O`Reilly et al. (1992). Após a purificação foi feita uma visualização dos cristais da proteína recombinante e dos poliedros virais em microscopia de luz (Axiophot 100, Zeiss), e fotografados, posteriormente armazenadas a -80 oC. Para análise em SDS-PAGE, tanto os poliedros do vírus selvagem, assim como, os cristais da proteína recombinante foram ressuspendidos em 100 μL de PBS (136 mM NaCl, 1,4 mM KH2PO4, 2,6 mM KCl, 8 mM Na2HPO4.2H2O, pH 7.4) e 10 µL foram analisados em SDS-PAGE a 12% (Laemmli, 1970) usando o aparato Mini-Protean II e de acordo com protocolo de instruções do fabricante (Bio-Rad). Análise ultraestrutural de OB e possíveis cristais da proteína recombinante Cry2Ab Larvas de terceiro instar de S. frugiperda foram infectadas com BVs do vírus recombinante vSyncry2Ab por injeção intra-hemocélica de 10 µl do sobrenadante de células BTI-TN5B1-4 infectadas pelo vírus recombinante (96 h p.i.), contendo aproximadamente 106 pfu de vírus, na hemocele e após 120 h.p.i., as lagartas mortas foram coletadas e maceradas para a purificação de OB e possíveis cristais da proteína recombinante Cry2Ab de acordo com o protocolo descrito por O`Reilly et al. (1992). A mistura de OB e cristais foram fixados por duas h com 2% glutaraldeido e 2% paraformaldeido em tampão cacodilato de sódio 1 M (pH 6.4), em seguida, lavados três vezes, com intervalo de 15 min, com tampão cacodilato de sódio 0.1 M e duas h pós-fixação em uma solução de tetróxido de ósmio (1:1) e ferricianato de potássio. As amostras foram desidratadas em acetona e secas ao ponto critico com CO2, em equipamento Balzer CPD30, coberto com ouro no equipamento sputter coater, Balzer SCD 050, como descrito em Benchimol et al. (1996). As amostras foram analisadas no microscópico eletrônico de varredura Jeol JSM 840 a 10 Kv. Bioensaio Amostras contendo os OB e possíveis cristais da proteína Cry2A foram analisadas por SDS-PAGE como descrito acima e a quantificação da proteína Cry2Ab foi realizada pela análise dos géis de poliacrilamida usando o Scanner storn 840 gel e um programa de análise de Imagem (Mol. Dynamics). Trinta µL de cada diluição da proteína recombinante (30 µL contendo 5.280 x 10-3, 528 x 10-3, 52,8 x 10-3, 5,28 x 10-3, 0,528 x 10-3, 0,0528x 10-3, 0,00528 x 10-3, 0,000528 x 10-3, 0,000528 x 10-3 e 0,0000528 x 10-3 mg/ml, respectivamente) foram colocados em um recipiente de plástico contendo dieta artificial (Monnerat et al., 2001), e 24 larvas de segundo instar de S. frugiperda foram colocadas separadas em cada recipientes. A mortalidade dos insetos foi analisada em 24 e 48 h pós-inoculação. A CL50 foi determinada pela análise de Probit (Finney, 1971). Resultados Clonagem e seqüenciamento do gene cry2Ab da cepa S447 de B. thuringiensis O gene cry2Ab foi amplificado por uma reação de PCR com oligonucleotídeos específicos e DNA da estirpe de Bacillus thuringiensis S-447 isolada de amostra de solo do Brasil, pertencente ao banco de Bacillus entomopatogênicas da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Monnerat et al., 2001). O fragmento de aproximadamente de 1.922 pares de quilobases (pkb) que correspondente a ORF do gene cry2Ab foi clonado no vetor pGem-T easy (Fig.3, poço 2), gerando um plasmídeo recombinante pGemCry2Ab de aproximadamente 4.922 pb. A digestão desse plasmídeo com a enzima Eco RI confirmou a clonagem do gene (Fig.3, poço 3). O plasmídeo pGemCry2Ab foi seqüenciado e a seqüência do gene cry2Ab mostrou a presença de uma ORF contendo 1.902 nucleotídeos. Análise de BLAST dessa seqüência obtida mostrou que o gene cry2Ab obtido da cepa S447 tem 100% de identidade com o gene cry2Ab descrito por Dankocsik, et al., (1990) (número de acesso no Genbank = CAA39075.1). Construção do vírus recombinante vSynCry2Ab O gene cry2Ab da linhagem de B. thuringiensis S447 (1901 bp) após clonado no plasmídeo pGemcry2Ab (Fig.3), foi digerido com a enzima de restrição Eco RI, separado por eletroforese de gel agarose e purificado pelo kit GFX (Amersham). Posteriormente, foi clonado dentro vetor de transferência pSynXIVVI+X3 gerando o plasmídeo recombinante pSyncry2Ab (Fig.3, poço 4), sendo confirmado com ensaio de restrição com a enzima Eco RI (Fig.3, poço 5). O plasmídeo recombinante pSyncry2Ab foi usado em uma co-transfecção com o DNA linear do vírus vSynGalVI(sem o gene da poliedrina). Após ocorrer a recombinação homóloga nas células cotransfectadas, o gene cry2Ab foi inserido no lugar do gene lac-Z do vírus vSynGalVI, conforme demonstrado no diagrama na fig. 1. O recombinante vSyncry2Ab foi isolado e purificado a partir do sobrenadante das células 7 dias após a cotransfecção. O vírus recombinante tem, juntamente com gene cry2Ab, o gene da poliedrina, o que facilita a purificação do recombinante pela presença de OB presente nos núcleos das células infectadas (fig.5B). Sendo também confirmada a inserção do gene cry2Ab dentro do genoma do AcMNPV por PCR. Análise transcricional do gene cry2Ab em células de inseto infectadas com o vírus recombinante. A transcrição do gene cry2Ab foi confirmada por uma reação de RT-PCR de mRNA de células TN5B infectadas com o vSyncry2Ab a 96 h p.i.Um único fragmento de aproximadamente 2.500 pb foi amplificado (fig 4, poço 2). Para confirmação da especificidade do fragmento amplificado foram realizadas reações de PCR como o fragmento obtido e oligonucleotídeos específicos para o gene cry2Ab (fig. 4B. poços 3 e 4). As reações de PCR confirmaram a presença do gene cry2Ab, demonstrando assim, que o fragmento transcrito corresponde ao gene cry2Ab. Análise dos cristais da proteína Cry2Ab purificada de larvas de S. frugiperda infectadas com o vírus vSyncry2Ab. Cem larvas foram infectadas com BVs do vírus recombinante VsynCry2Ab e outro grupo de cem larvas foram infectadas com vírus AcMNPV para obter tanto os poliedros assim como, o cristais da proteína recombinante (fig. 6). Um polipeptídeo de aproximadamente 70 kDa foi detectado dos cristais purificado das larvas infectadas com o vSyncry2Ab, enquanto a amostra dos poliedros do AcMNPV apresentou um peptídeo por volta de 30 kDa, que corresponde à proteína poliedrina, que foi confirmada no recombinante. Análise da ultra-estrutura de OB e possíveis cristais da proteína Cry2Ab Larvas de terceiro instar de S. frugiperda foram infectadas com o vírus vSyncry2Ab e após 96 h.p.i, cristais e OB foram purificados e processados para microscopia eletrônica de varredura. Verificamos a presença de cristais na forma de cubo que provavelmente corresponde à proteína recombinante Cry2Ab e OB do vírus vSyncry2Ab (Fig. 9). Toxicidade da proteína recombinante Cry2AB A mistura dos possíveis cristais da proteína recombinante Cry2Ab e OB do vírus recombinante vSyncry2Ab foi usada em bioensaios contra larvas de segundo instar de S. frugiperda, apresentando uma CL50 de 3,405 μg/mL com intervalo de confiança de (1,055-11,263) (Tabela 2). A quantidade da proteína Cry2Ab foi calculada a partir de análise de géis de poliacrilamida, contendo a mistura de OB e o possível cristal da proteína Cry2Ab. Resultados demonstram que as larvas de S. frugiperda apresentam susceptibilidade à proteína cry2Ab de B. thuringiensis. Tabela 2. Resultados de CL50 da proteína Cry2Ab contra larvas de segundo instar de S. frugiperda. Amostra N CL50 (μg/mL (repetições) 1a repetição 24 2,253 (0,158-68,164)a 2a repetição 24 2,989 (0,516- 22,923)a 3a repetição 24 2,450 (0,434-14,567)a a CL50 (μg /mL) (final) 3,405 (1,055-11,263)a _ amostras com p >0,05 e G >0,04 e n – número de insetos utilizados nos bioensaios Discussão O gene cry2Ab de B. thuringiensis foi primeiramente descrito por Widner & Whiteley, 1989, sendo encontrado em diferentes cepas de B. thuringiensis (Widner & Whiteley 1989, Dankocsik et al 1990, Crickmore et al., 1998, Jain et al., 2006, Chen et al 2003, Wang et al 2006, Zhang et al 2005 e Huang et al 2006). A proteína Cry2Ab apresenta toxicidade conhecida para diversos tipos de insetos-praga da ordem Lepidoptera, como por exemplo, Heliothis virescens (Lepidoptera: Noctuidae) (Greenplate et al., 2003; Gore et al., 2005), Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae) (Dankocsik et al., 1990) Pectinophora gossypiella (Lepidoptera: Gelechiidae) (Tabashnik et al., 2002), Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) (Chen et al., 2002), Helicoverpa armigera e Helicoverpa punctigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) (Lião et al., 2002). Para S. frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), a proteína Cry2Ab, quando expressa juntamente com a proteína Cry1Ac em algodão, reduziu os danos causados por esta praga nas maçãs de algodão, quando comparado com plantas que não expressavam proteínas Cry apresentando o controle efetivo dos insetos exposto a esta toxinas de B. thuringiensis (Greenplate et al., 2003; Chitkowski et al., 2003). A proteína Cry2Ab expressa em células de inseto durante a infecção do baculovírus recombinante vSyncry2Ab, apresentou toxicidade à larva de segundo instar S. frugiperda com uma CL50 de 3,405 µg/mL (p >0,05 e G >0,04) (Tabela 1). Chitkowski et al. (2003) também mostraram a atividade tóxica da proteína Cry2Ab para S. frugiperda com a construção de plantas de algodão transgênicas, contendo os genes cry2Ab e cry1Ac. Com relação a CL50 de 3,405 µg/mL para S frugiperda apresentar um valor superior na CL50 relacionados a outros insetos susceptíveis tais como: H. armigera e H. punctigera (Lião et al., 2002). A diferença na susceptibilidade pode esta associado com a mudança nos receptores da proteínas Cry entre os insetos-praga, uma vez que já foi demonstrado em alguns trabalho que a toxicidade das proteínas Cry varia em função da espécie de insetos-praga, assim como em relação à própria toxina de B. thuringiensis (Schnepf et al., 1998; de Maagd et al., 2003) O gene cry2Ab de B. thuringiensis subsp. Kurstaki codifica um polipeptídeo (633 aminoácidos) de 70.75 kDa. Essa proteína contém no N-terminal, 49 aminoácidos que são clivados no intestino de insetos susceptíveis para liberar a toxina na forma ativa. A proteína ativa, por sua vez, apresenta três domínios, que são similares a outras toxinas já estudadas tais como: a proteína Cry3Aa (Li et al., 1991) e Cry1Aa (Grochulski et al., 1995). O domínio I ou N-terminal (aminoácidos 1 a 272) é responsável pela formação de poros e formado por sete alfa-hélice, sendo Seis hélices anfipáticas (Schnepf et al., 1998). O segundo domínio (resíduos de 273 a 473) é responsável pela ligação com receptor do hospedeiro e formado por três folhas β-antiparalelas e o terceiro domínio ou C-terminal (resíduos 474 a 633) também esta relacionado com a ligação do receptor larval, consistem de duas folhas β-antiparalelas formando um β-sanduíche, (Lee, et al., 1995; de Maagd et al., 1996) e na formação do poro (Schwartz et al., 1997). A seqüência de aminoácidos da proteína recombinante Cry2Ab expressa pelo baculovírus recombinante vSyncry2Ab é idêntica à proteína Cry2Ab de B. thuringiensis kurstaki (Dankocsik, et al., 1990, acesso número CAA39075.1) e apresentou um peptídeo de 70 kDa em SDS-PAGE dos cristais purificados larvas de S. frugiperda infectadas com o vírus recombinante (Fig 5). O transcrito do gene cry2Ab foi detectado por RT-PCR a partir do mRNA de células de inseto infectadas com o vSyncry2Ab (96 h p.i.), confirmando a funcionalidade dos promotores virais (Fig. 4, A e B). A proteína recombinante Cry2Ab quando foi expressa em cultura de células de inseto (in vitro) não apresentou a formação de cristais no citoplasma das células infectadas com o recombinante vSyncry2Ab (Fig 5B), como demonstrado em algumas proteínas Cry expressas usando o sistema baculovírus-células de inseto (Ribeiro & Croock, 1993,1998; Pang et al., 1992; Martens et al., 1990). Porém, quando larvas de terceiro instar de S. frugiperda foram infectadas, via hemolinfa, com o vírus recombinante vSyncry2Ab, apresentou a formação de cristais cubóides, possivelmente derivados da proteína Cry2Ab, foram observados na hemolinfa após 96 h.p.i (Fig. 5C). De acordo com trabalhos desenvolvidos por Widner & Whitelely (1989), a proteína Cry2Aa e Cry2Ab quando expressa em B. thuringiensis apresenta cristais cubóides durante a fase de esporulação. A cristalização no inseto pode está associado ao maior nível de expressão da proteína nos diferentes tipos de células presentes no inseto, permitido assim a cristalização da proteína. Por outro lado, a cristalização da proteína Cry2Aa em B. thuringiensis é dependente da presença de proteínas auxiliares durante a esporulação (Staples et al., 2001). Quando a proteína Cry2Aa foi expressa em cloroplasto de tabaco, a sua cristalização só ocorreu com a expressão concomitante com a proteína ORF2 de B. thuringiensis. Na ausência dessa proteína (ORF2), não foi detectado a presença de cristais em cloroplastos (De Cosa, 2001; Kota et al., 1999). Dessa forma, outra possibilidade para a formação de cristais em células de S. frugiperda infectadas com o vSynCry2Aa, é a presença de proteínas celulares, possivelmente chaperonas que auxiliam na sua cristalização. Apesar de 87% de identidade com a proteína Cry2Aa, a proteína Cry2Ab possui toxicidade conhecida somente para insetos da ordem Lepidoptera. Já a proteína Cry2Aa apresenta toxicidade tanto para os insetos da ordem Lepidoptera quanto para a Diptera. Estudos realizados com híbridos entre as duas proteínas (Cry2Aa e Cry2Ab) demonstram que uma região de 76 aminoácidos esta relacionado com a especificidade para os insetos das ordens Diptera e Lepidoptera. No entanto, a proteína Cry2Ab apresenta diferença de somente 18 aminoácidos nesta região (Widner & Whitelely, 1990). Essa região pertencente à proteína Cry2Aa foi incorporada à proteína Cry2Ab, apresentando toxicidade para insetos das ordens Diptera e Lepidoptera (Widner & Whitelely, 1990). A introdução dos genes cry no genoma de baculovírus pode ser uma alternativa para a expressão individual destes genes para estudar o efeito de sinergismo e antagonismo destas proteínas, pois eles estão sob o comando de promotores fortes que permite uma alta expressão da proteína durante a infecção viral. Outras proteínas Cry expressas em células de inseto pela infecção com baculovírus recombinantes formam cristais grandes em insetos infectados e são imunologicamente e biologicamente similares às proteínas nativas mostrando toxicidade para os insetos susceptíveis (Pang et al., 1992; Ribeiro & croock, 1993,1998; Martens et al., 1990). A utilização de proteínas Cry expressas em insetos por baculovírus recombinantes pode ser um atrativo na fabricação de bioinseticidas com maior espectro de ação, pois a associação do baculovírus e os cristais das proteínas Cry podem agir em conjunto para o controle de insetos susceptíveis ou pouco susceptíveis a um dos bioinseticidas. Outra vantagem seria o retardo do aparecimento de resistência à proteína Cry mencionada em alguns trabalhos Schnepf et al. (1998) e Gould et al. (1995), pois insetos resistentes à proteína Cry poderão ser eliminados pela infecção viral. Outro fator importante da expressão da proteína Cry2Ab em baculovírus é o fato de se obter a proteína isolada, ou seja, sem a interação de outras proteínas Cry, como comumente são expressas em Bt, evitando assim, o efeito de competição entre as toxinas na ligação com receptores do intestino do inseto susceptível. A estabilidade das proteínas Cry no receptor pode ser influenciada diretamente pela competição entre as proteínas Cry diferentes, ou seja, duas proteínas Cry de famílias diferentes podem competir por um mesmo receptor, diminuindo assim, de maneira significativa a toxicidade contra os insetos susceptíveis, o que pode aumentar o nível de resistência cruzada entre as proteínas, como demonstrado em alguns trabalhos (Gould et al., 1992; Roush, 1997). A busca de novas alternativas para o controle de insetos-praga, principalmente na redução do uso de inseticidas convencionais, como a introdução de genes da toxina de B. thuringiensis no genoma das plantas de interesse econômico, tem sido alvo de inúmeras pesquisas e hoje em dia já foram construídas diversas plantas transgênicas contendo genes cry, tais como: tabaco (Barton et al., 1987; De cosa et al., 2001), Tomate (Fischhoff, 1987), algodão (Perlak et al., 1990), batata (Cheng et al., 1992; Cheng et al., 1998), arroz (Fujimoto et al., 1993; Nayak et al., 1997), milho (Koziel et al., 1993) e soja (Stewart et al., 1996). Porém, plantas transgênicas comercializadas com genes Cry, são as seguintes: milho algodão e batata (Betz et al., 2000). A proteína Cry2Ab foi altamente expressa quando o gene cry2Ab foi incorporado ao genoma do algodão apresentando um alto potencial no controle dos insetos da ordem Lepidoptera desta cultura (Tabashnik et al., 2002). No entanto, quando a proteína Cry2Ab foi expressa juntamente com a proteína Cry1Ac em plantas de algodão, o nível de expressão foi 10x maior do que a proteína Cry1Ac resultando assim, numa maior eficácia na proteção das plantas. A associação das proteínas Cry1Ac e Cry2Ab apresentaram uma maior toxicidade contra os insetos da ordem Lepidoptera. Além disso, insetos resistentes a uma toxina (Cry1Ac) não mostraram resistência cruzada à proteína Cry2Ab (Grenplate et al., 2003). Todavia, o estudo do sinergismo e/ou antagonismo entre as diferentes toxinas Cry permitirá o desenvolvimento de estratégias para a inserção de diferentes combinações de genes cry no genoma de culturas importantes para o desenvolvimento de plantas resistentes a insetos-praga. pSyn Ppol A Eco-RI Eco-RI Eco-RI Eco-RI pol cry2Ab cry2Ab pXIV pGemcry2Ab pSyncry2Ab Vetor de clonagem Vetor de transferência B pSy pSyn pXI pol cry2Ab pol cry2A Ppo Ppo Virus vBtcry2Ab LacpSy pXIV vSyngal VI- Figura 1- Diagrama mostra o procedimento utilizado para obtenção do vírus recombinante vBtcry2Ab e plasmídeos e utilizado neste trabalho. (A) Plasmídeo recombinante pGemcry2Ab e pSynCry2Ab, (B) Vírus vSyngalVI- e Vírus recombinante Btcry2Ab. Primer F cry10Aa 1.gggaggaatagatatgaatccatatcaaaataagaatgaatatgaaatattcaatgctccatccaatggttttag 75.caagtctaataactattctagatatccattagcaaataagccaaatcaaccactgaaaaacacgaattacaaag 149.attggctcaatgtgtgtcaagataatcaacaatatggcaataatgcggggaattttgctagttctgaaactat 222.tgttggagttagtgcaggtattattgtagtaggaactatgttaggagcttttgctgcccctgtcttagctgca 295.ggtataatatcttttgggactttgttgccgatcttttggcaaggatctgaccctgcaaatgtttggcaggatt 368.tgttaaacatcggaggaaggcctatacaagaaatagataaaaacataattaatgtactaacttctatcgtaac Primer F1 cry10Aa 441.acctataaaaaatcaacttgataaatatcaagaatttttcgataaatgggagccagcacgtacacacgctaat 514.gctaaagcagtacatgatctctttactaccttagaacctataatagataaagatttagatatgttaaaaaata 587.atgctagctatcgaataccaacactccctgcatatgcacaaatagctacttggcacttgaatttattaaaaca 660.tgctgctacctattacaatatatggctgcaaaatcaaggtataaatccaagtactttcaattcatctaattac 733.tatcagggctatttaaaacgtaaaatacaagaatatactgactattgtatacaaacgtacaatgcaggactaa 806.ctatgattagaactaatactaacgcaacatggaatatgtataatacttaccgtttagaaatgactctaactgt 879.gttagatcttattgctatttttccaaattatgacccagaaaaatatccaataggagttaaatctgaacttatc 952.agagaagtttatacgaatgttaattcagatacatttagaaccataacagaactagaaaatggattaactagaa 1025.atcctacattatttacttggataaaccaagggcgtttttacacaagaaattctcgagacattcttgatcctt 1097.atgatattttttcttttacaggtaaccagatggcctttacacatactaatgatgatcgcaacataatctggg 1169.gagcggttcatggaaatattatttctcaagacacatccaaagtatttcctttttatagaaacaaacctattg 1241.ataaggtcgaaattgtcagacatagagagtactcagatataatatatgaaatgatatttttttcgaatagca Primer R1 cry10Aa 1313.gtgaagtatttcgatattcatccaattcaacaatagaaaataattataaaagaactgattcttatatgattc 1385.caaaacaaacatggaaaaatgaagaatatggtcatactctatcgtatataaaaactgataattatatatttt 1457.cagtagttagagaaagaagaagagttgcatttagttggacacatactagtgttgatttccaaaatacaatag 1529.atttagataacatcacccaaatccacgctctaaaagctttgaaggtaagttctgattcgaaaattgtgaaag 1601.gtcctggtcacacaggtggagacttggtaattcttaaagatagtatggattttagagttagatttttaaaaa 1673.atgtttctcgacaatatcaagtacgtattcgttatgctactaatgctccaaagacaacagtattcttaaccg 1745.gaatagatactataagtgtggagctccctagtgccacttcccgccaaaacccaaatgctacagatttaacat 1817.atgcagattttggatatgtaacatttccaagaacagttccaaataaaacatttgaaggagaagacagtttat 1889.taatgaccttatatggtacaccaaatcattcatataatatatatattgacaaaatcgaatttattccaatca 1961.ctcaatctgtattagattatacagagaagcaaaatatagaaaaaacacagaaaatagtgaatgatttatttg 2033.ttaatttcc| Primer R cry10Aa Figura 2- Seqüência de nucleotídeos do gene cry2Ab. O códon ATG e TAA corresponde respectivamente para o início e o final do gene cry2Ab da Cepa 447. 1 2 3 4 5 pb 5 000 3 000 2 000 Figura 3 - Gel agarose 0,8%. 1- Marcador 1Kb ladder plus, 2 gene cry2Ab clonado no pGEM-T easy, 3- Digestão do pGemcry2Ab com enzima de restrição Eco RI, 4Gene cry2Ab clonado no vetor de transferência pSynXIVVI+X3, 5- Vetor de transferência digerido com Eco RI. A 1 1 B 1 2 3 4 2 pb pb 2500 3000 1000 2000 1000 Figura 4- Análise da transcrição do gene cry2Ab por RT-PCR de células TN5B infectadas com recombinante vSynBtcry2Ab. A -1 Marcador 1Kb ladder, 2 amplificação dos produtos a partir do cDNA com oligonucleotídeo T2 e F1-Bam HI. B – 1 Marcador 1 Kb Ladder, 2- Eluição da banda de 2.5 Kb obtidas do gel da amplificação por PCR a partir do cDNA, 3, 4- Confirmação do fragmento obtido do RT-PCR, se realmente pertence ao gene cry2Ab, por meio de PCR com oligonucleotídeos especifico do gene cry2Ab ( F1-Bam HI e R1-Bam HI), gerando um fragmento de aproximadamente 1920 pb e oligonucleotídeos especifico da região interna do gene cry2Ab (F-501nt e R-1309nt), com fragmentos de 900 pb. A BB P C C P P Figura 5 - Visualização pela microscopia de luz das células TN5B não infectada com baculovírus (A), e infectadas com o recombinante vBtcry2Ab (B) e cristais da proteína recombinante Cry2Ab obtidas da hemolinfa de larvas de Spodoptera frugiperda infectadas com BVs do vírus vBtcry2Ab (C) kD M 1 2 18 85 75 70 kDa 50 45 35 25 Figura 6- Analise da expressão da proteína recombinante. A. SDS-PAGE 12% contendo poliedros do vírus selvagem AcMNPV (1), e poliedros e a proteína recombinante Cry2Ab. P C C Figura.9- Análise Ultra-estrutural dos poliedros e cristais purificados. Microscopia eletrônica dos poliedros (P) e cristal (C) de larvas de S. frugiperda infectadas com o recombinante vSyncry2AB. Referencias Bibliográficas (Artigo 1) ARIF, B.M. The structure of the viral genomic.Curr Top Microbiol Immunol. v131, p21-29, 1986. BENCHIMOL, M., ATTIAS M., SILVA N.L.C., CARVALHO, T.M.U. Métodos de estudo da célula, Fenorte/UENF, Rio Janeiro, 1996. BIETLOT, H.P.L., VISHNUBHA, T.L.A, I., CAREY, P.R., POZSGAY, M., KAPLAN, H. Characterization of the cysteine residues and disulfide link ages in the protein crystal of Bacillus thuringiensis. J Biochem v267, p.309-315, 1990. BOBROWSKI, V.L, PASQUALI, G., ZANETTINI, M.H.B., FIUZA, L.M. Detection of cry1 genes in Bacillus thuringiensis isolates from south of Brazil and activity against Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae) in Brazil. J Microbiol. v32, p.105– 109, 2001. BOHOROVA, N., MACIEL, A.M., BRITO, R.M., AGUILART, L., IBARRA, J.E, HOISINGTON, D. Selection and characterization of Mexican strains of Bacillus thuringiensis active against four major lepidopteran maize pests. Entomophaga. v.41, p, 153–165, 1996. CHANG, J.H., CHOI, J.Y., JIN., B.R, ROH., J.Y., OLSZEWSKI, J.A., SEO, S.J., O’REILLY., D.R, JE, Y.H. Improved baculovírus insecticide producing occlusion bodies that contain Bacillus thuringiensis insect toxin. J Invertebr Pathol. v.84, p.3037, 2003. CHRISTOV, N.K., IMAISHI, H., OHKAWA, H. Green-tissue-specific expression of a reconstructed cry1C gene encoding the active fragment of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin in haploid tobacco plants conferring resistance to Spodoptera litura. Biosci Biotechnol Biochem. v.63, p.1433-1444, 1999. CRICKMORE, N., BONE, E.J., WILLIAMS, J.A., ELLAR, D.J. Contribution of the individual components of the δ-endotoxin crystal to the mosquitocidal activity of Bacillus thuringiensis subsp. Israelensis. FEMS Microbiol Lett. v.131, p.249–254, 1995. CRICKMORE, N., ZEIGLER, D.R., FEITELSON, J., SCHNEPF, E., VAN RIE, J., LERECLUS, D., BAUM, J., DEAN, D.H. Revision of the nomenclature of the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins. Microbiol Mol Bio Rev. v.62, p.807-813, 1998. DA SILVA, S.M.B., SILVA-WERNECK, J.O., FALCÃO, R., GOMES, A.C., FRAGOSO, R.R., QUEZADO, M.T., NETO, O.B.O., AGUIAR, J.B., DE-SÁ, M.F.G., BRAVO, A., MONNERAT, R.G. Characterization of novel Brazilian Bacillus thuringiensis strains active against Spodoptera frugiperda and other insect pests. J Appl Entomol. v.128, p.102–107, 2004. DE COSA, B., MOAR, W., LEE, S.B., MILLAR, M., DANIEL, H. Over expression of the Bt cry2Aa2 operon in chloroplasts leads to formation of insecticidal crystals. Nature Biotechnol. v.19, p.71-74, 2001. DE MAAGD, R.A., BRAVO, A., BERRY, C., CRICKMORE, N., SCHNEPF, E. Structure, diversity, and evolution of protein toxins from spore-forming entomopathogenic bacteria. Ann Rev Genet . v.37, p.409-433, 2003. DE MAAGD, R.A., BRAVO, A., BERRY, C., CRICKMORE, N. How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world. Trends Genet. v.17, p.193-199, 2001. DE MAAGD, R.A, KWA, M.S.G, VAN, D.E.R., KLEI, H., YAMAMOTO, T., SCHIPPER, B., VLAK, J.M., STIEKEMA, W.J., BOSCH D. Domain III substitution in Bacillus thuringiensis delta- endotoxin cry1A(b) results superior toxicity for Spodoptera exígua and altered membrane protein recognition. Appl Environ Microbiol. v.62, p.1537-1543, 1996. DEAN, H., RAJAMOHAN, F., LEE, M.K., WU, S.J, CHEN, X.J., ALCANTARA, E., HUSSAIN, S.R. Probing the mechanisms of action of Bacillus thuringiensis insecticidal protein by site directed mutagenesis- a minireview. Gene. v.179, p.111117, 1996. Embrapa-Centro Nacional de Pesquisa de Milho e Sorgo. Recomendações técnicas para o cultivo do milho, 2nd edn. Embrapa-SPI, Brasília(1997) FERRE, J., VAN RIE, J. Biochemistry and genetics of insect resistance to Bacillus thuringiensis. Ann Rev Entomol. v.47, p.501–533, 2002. FINNEY, D.J. Probit analysis, Cambridge University Press, Cambridge, 1971. GE, B., BIDESHI, D., MOAR, J.W., FEDERICI, B.A. Differential effects of helper proteins encoded by the cry2A and cry11A operons on the formation of Cry2A inclusions in Bacillus thuringiensis. FEMS Microbiol Lett. v.165, p.35-41, 1998. GRANADOS, R.R, GUOXUN, L., DERKSEN, C.G, MCKENNA, K.A.A. An insect cell line from Trichoplusia ni (BTI-Tn-5B1-4) susceptible to trichoplusia ni single enveloped nuclear polyhedrosis virus. J Invertebr Pathol. v.64, p.260-266, 1994. GROCHULSKI, P., MASSON, L., BORISOVA, S., PUSTAI-CAREY, M., SCHWARTZ, J.L., BROUSSEAU, R., CYGLER, M. Bacillus thuringiensis cry1A(a) insecticidal toxin crystal structure and channel formation. J. Mol Biol. v.254, p.447-464, 1990. HAMMOCK, B.D., BONNING, B.C., POSSEE, R.D, HANZLIK, T.N., MAEDA, S. Expression and effects of the juvenile hormone esterase in a baculovírus vector. Nature. v.344, p.458-461, 1990. HARLOW, E., LANE, D. Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1988. HOFMANN, C., VANDERBRUGGEN, H., HOFTE, H., VAN RIE, J., JANSENS, S., VAN MELLAERT, H. Specificity of Bacillus thuringiensis σ-endotoxin is correlated with the presence of high affinity binding sites in the border membrane of target insect midgets. Proc Natl Acad Sci. v.85, p7844-7848, 1998. HOFTE, H., WHITELEY, H.R. Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis. Microbiol Rev. v.53, p.242-255, 1989 HONÉE, G., VAN DE SALM, T., VISSER, B. Nucleotide sequence of crystal protein gene isolated from B. thuringiensis subspecies entomocidus 60.5 coding of toxin highly active Spodoptera specie. Nucleic Acids Res. v.16, p.6240, 1988. HUGHES, P.R., WOOD, H.A., BREEN, J.P., SIMPSON, S.F., DUGGAN, A.J., DYBAS, J.A. Enhanced bioactivity of recombinant baculovírus expressing insectspecific spider toxins in lepidopteran crop pest. J Invertebr Pathol. v.69, p.112-118, 1997. JARVIS, D.L. Baculovirus expression vectors, in: L.K. Miller (Ed.) The baculovírus, Plenum, New York, pp 389-341, 1997. JARVIS, D.L. Developing baculovirus-insect cell expression systems for humanized recombinant glycoprotein production. Virology. v.310, p.1-7, 2003. KITTS, P.A., AYRES, M.D., POSSEE, R.D. Linearization of baculovírus DNA enhances the recovery of recombinant virus expression vectors. Nucleic Acid Res. v.18, p.5667-5672, 1990. KOST, J.A, CONDREAY, J.P., JARVIS, D.L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnol. v.23, p.567575, 2005. LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriphage T4. Nature. v.227, p.680-685, 1970. LIN, C.H., CHEN, Y.Y., TZENG, C.C., TSAY, H.S., CHEN, L.J. Expression of a Bacillus thuringiensis cry1Ca gene in plastid confers high insecticidal efficacy against tobacco cutworm - a Spodoptera insect. Bot Bull Acad Sin. v.44, p.199-210, 2003 MARTENS, J.W., HONEE, G., ZUIDEMA, D., VAN LENT, JWM., VISSER, B., VLAK, J.M. Insecticidal activity of a bacterial crystal protein expressed by a recombinant baculovirus in insect cells. Appl Environ Microbiol. v.56, p.2764-2770, 1990. MARTENS, J.W., KNOESTER, M., WEIJTS, F., GROFFEN, S.J., HU, Z., BOSH, D., VLAK, J.M. Characterization of baculovirus insecticides expressing tailored Bacillus thuringiensis CryIA(b) crystal proteins. J Invertebr Pathol. v.66, p.249-257, 1995. Maruniak AG, Maruniak JE, Zanoto PM, Doumbouya AE, Liu JC, Merritt TM, Lanoie JS. Sequence analysis of the genome of the neodiprion sertifer nucleopolyhedrovirus. J Virol v.78, po.7036-7051, 2004. NYOUKI, F.F.R., FUXA, J.R., RICHTER, A.R. Spore toxin interactions and sub lethal e acts of Bacillus thuringiensis in Spodoptera frugiperda and Pseudoplusia includens (Lepidoptera: Noctuidae). J Entomol Sci. v.31, p.52–62, 1996. O’REILLY, D.R., MILLER, L.K. Improvement of a Baculovirus pesticide by deletion of the egt gene. Biotechnol. v.9, p.1086-1089, 1991. O’REILLY, D.R., MILLER, L.K., LUCKOW, V.A Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Freeman, New York, 1992. OBERFELDER R., Immunoblotting: Comparison of detection methods. Focus. v.11, p.1-5, 1998. OEDA, K., INOUYE, K., IBUCHI, Y., OSCHIE, K., SHIMIZU, M., NAKAMURA, K., NISHIOKA, R., TAKADA, Y., OHKAWA, H. Formation of crystals of the insecticidal proteins of Bacillus thuringiensis subsp. Aizawai IPL7 in Escherichia coli. J Bacteriol. v.171, p.3568-3571, 1988. PANG, Y., FRUTOS, R., FEDERICI, B.A. Synthesis and toxicity of full length and truncated bacterial CryIVD mosquitocidal proteins expressed in lepidopteran cells a baculovírus vector. J Gen Virol. v.73, p.89-101, 1992. PINEDO, J.F.R., MOSCARDI, F., LUQUE, T., OLSZEWSKI, J.A., RIBEIRO, B.M. Inactivation of the ecdysteroid UDP-glucosyltransferase egt) gene of Anticarsia gemmantalis nucleopolyhedrovirus AgMNPV) improves its virulence towards its insect host. Biol Control v.27, p.336-344, 2003. RIBEIRO, B.M., CROOK, N.E. Construction of occluded recombinant baculoviruses containing the full-length cry1Ab and cry1Ac genes from Bacillus thuringiensis. Braz J Med Biol Res v.31, p.763-769, 1998. RIBEIRO, B.R., CROOK, N.E. Expression of full length and truncated forms of crystal protein genes from Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki in baculovírus and pathogenicity of the recombinant viruses. J Invertebr Pathol, v.62, p.121-130, 1993. ROUSH, R.T., SHELTON, A.M. assessing the odds: The emergence of resistance to Bt transgenic plants. Nature Biotechnol, v.15, p.816-817, 1997. RUKMINI, V., REDDY, C.Y., VENKATESWERLU, G. Bacillus thuringiensis crystal δendotoxin: Role of proteases in the conversion of protoxin to toxin. Biochimie. v.82, p.109-116, 200. SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F., MANIATIS, T. Molecular cloning: a laboratory manual, 3 ed. Cold Spring Harbor, NewYork, 2001. SARFRAZ M. Interaction between diamondback moth and Bacillus thuringiensis. Outlooks Pest Manag. v.15, p.167–171, 2004. SCHNEPF, E., CRICKMORE, N., VAN RIE, J., LERECLUS, D., BAUM, J., FEITELSON, J., ZEIGLER, DR., DEAN, D.H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol Mol Biol Rev. v.62, p.775-806. 1998. SHIVAKUMAR, A.G., GUNDLING, G.J., BENSON, T.A., CASUTO, D., MILLER, M.F., SPEAR, B.B. Vegetative expression of the delta-endotoxin genes of Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki in Bacillus subtilis. J Bacteriol. v.166, p.194-204, 1986. SILVA-WERNECK, J.O., DE SOUZA, M.T., DIAS, J.M.C., RIBEIRO, M.B. Characterization of Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki strain S93 effective against the fall armyworm (Spodoptera frugiperda). J Microbiol. v.45, p.464-471, 1999. SOARES, J.S., RIBEIRO. B.M. Pathology of Anticarsia gemmatalis larvae infected by two recombinant A. gemmatalis multicapsid necleopolyhedrovirus. Res Microbiol. v.156, p.263-269, 2005. STRIZHOW, N., KELLER, M., MATHUR, J., KONEZ KALMAN, Z., BOSCH, D., PRUDOVSKY, E., SCHELL, J., SNEH, B., KONEX, C., ZIBERSTEIN, A. A synthetic cryIC gene, encoding a Bacillus thuringiensis δ-endotoxin, confers Spodoptera resistance in alfalfa and tobacco. Proc Natl Acad Sci USA. v.93, p.15012-15017, 1996. THOMAS WE, ELLAR DJ. Bacillus thuringiensis var. Israelensis crystal-endotoxin: Effects on insect and mammalian cells in vitro and in vivo. J Cell Sci. v.60, p.181197, 1983. VAECK, M., REYNAERTS, A., HOFTE, H., JANSENS, S., DE BEUKELEER, M., DEAN, M., ZABEAN, M., VAN MONTAGU, M., LEEMANS, J. Transgenic plants protected from insects attack. Nature. v.328, p.33-37, 1987. VAN REGENMORTEL, M.H.V., FAUQUET, C.M., BISHOP, D.H.L., CARSTENS, E.B., ESTES, M.K., LEMON, S.M., MANILOFF, J., MAYO, M.A, MCGEOCH, D.J, PRINGLE, C.R., WICKNER, R.B. Virus taxonomy classification and nomenclature of virus. Seventh report of the international committee on taxonomy of viruses. Academic Press, San diego, 2000. WANG, X., OOI, B.G., MILLER, L.K. Baculovirus vectors for multiple gene expression and for occluded virus production. Gene. v.100, p.131-137, 1991. WIRTH, M.C., DELE´CLUSE, A., WALTON, W.E. Cyt1Ab1 and Cyt2Ba1 from Bacillus thuringiensis subsp. medellin and B. thuringiensis subsp. israelensis synergize Bacillus sphaericus against Aedes aegypti and resistant Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Appl Environ Microbiol. v.67, p.3280–3284, 2001. WIRTH, M.C., FEDERICI, B.A., WALTON, W.E. Cyt1A from Bacillus thuringiensis synergizes activity of Bacillus sphaericus against Aedes aegypti. Appl Environ Microbiol. v.66, p.1093–1097, 2000. WIRTH, M.C., GEORGHIOU, G.P., FEDERICI, B.A. CytA enable endotoxins of Bacillus thuringiensis to overcome high levels of CryIVA resistance in mosquito, Culex quinquefasciatus. Proc Natl Acad Sci, v.94, p.10536–10540, 1997. WU, D., FEDERICI, B.A. Improved production of the insecticidal cryIV protein in Bacillus thuringiensis using (cryIAc) promoters to express the gene for an associated 20-kDa protein. Appl Microbiol Biotechnol. v.42, p.697-702, 1995. XUE, J.L., CAI, Q.X., ZHENG, D.S., YUAN, Z.M. The synergistic between Cry1Aa and Cry1C from Bacillus thuringiensis against Spodoptera exigua and Helicoverpa armigera. Lett Appl Microbiol, v.40, p.460-465, 2005. ZHAO, J.Z.., CAO, J., LI, Y., COLLINS, H.L., ROUSH, R.T., EARLE, E.D.,. SHELTON, A.M. Transgenic plants expressing two Bacillus thuringiensis toxins delay insect resistance evolution. Nature Biotechnol. V.21, p.1493-1497, 2003. ZHAO, J.Z, CAO, J., COLLINS, H.L., BATES, S.L., ROUSH, R.T., EARLE, E.D, SHELTON, A.M. Concurrent use of transgenic plants expressing a single and two Bacillus thuringiensis genes speeds insect adaptation to pyramided plants. Proc Natl Acad Sci USA. v.102, p.8426-8430, 2005. Referencias Bibliográficas (Artigo 2) BARTON, K.A., WHITELEY, H.R., YANG, N.S. Bacillus thuringiensis delta endotoxin expressed in transgenic Nicotiana tabacum provides resistance to lepidopteran insects. Plant Physiol. v.85, p.1103-1109, 1987. BENCHIMOL, M., ATTIAS, M., SILVA, N.L.C., CARVALHO, T.M.U. Métodos de estudo da célula, Fenorte/UENF, Rio Janeiro. 1996. BETZ, F.S., HAMMOND, B.G., FUCHS, R.L. Safety and advantages of Bacillus thuringiensis protecd plants to control insects pest. Regulatory, Toxicology and Pharmacology. v.32, p.156-173, 2000. CHANG, J.H., CHOI, J.Y., JIN, B.R., ROH, J.Y., OLSZEWSKI, J.A., SEO, S.J., O’REILLY D.R., JE, Y.H. Improved baculovírus insecticide producing occlusion bodies that contain Bacillus thuringiensis insect toxin. J. Invertebr. Pathol. v.84, p.30-37, 2003. CHEN, Z, LI, C, LIU, J, ZHANG, J, HUANG, D. Expression and insecticidal activities analysis of silent gene cry2Ab3 from Bacillus thuringiensis C002 strain. Weishengwu-Xuebao, 42, 561-566, 2002. CHEN, Z.Y., JIE, X.W., SONG, F.P., DA G.Y.,HUANG, F. Cloning of Bt cry Genes by Rapid Screening of DNA Libraries with PCR-RFLP. Agricultural Sciences in China. v.2, P.132-136, 2003. CHENG, J., BOLYARD, M.G., SAXENA, R.C., STICKLEN M.B. Production of insect resistant potato by genetic transformation with a delta-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis var. kurstaki. Plant Sci. v.81, p.83-92, 1992. CHENG, X., SARDANA, R., KAPLAN, H., ALTOSAAR, I. Agrobacteria-transformed rice plants expressing synthetic cryIA(b) and cryIA(c) genes are highly toxic to striped stem borer and yellow stem borer. Proc. Natl. Acad. Sci.v.95, p.2767-2772, 1998. CHITKOWSKI, R.L., TURNIPSEED, S.G., SULLIVAN, M.J., BRIDGES W.C. Field and laboratory evaluations of transgenic cottons expressing one or two Bacillus thuringiensis var. kurstaki Berliner proteins for management of noctuid (Lepidoptera) pests. J. Econ Entomol.v.96, p.755-762, 2003. CRICKMORE, N., ELLAR, D.J. Involvement of a possible chaperon in the efficient expression of cloned Cry11A δ-endotoxin gene in Bacillus thuringiensis. Mol. Microbiol. v.6, p.1533-1537, 1992. CRICKMORE, N., WHEELER, V.C., ELLAR, D.J. Use of an operon fusion to induce expression and crystallization of Bacillus thuringiensis δ-endotoxin encoded by a cryptic gene. Mol. Gen. Genet. v.242, p.365-368, 1994. CRICKMORE, N., ZEIGLER, D.R., FEITELSON, J., SCHNEPF, E., VAN RIE, J., LERECLUS, D., BAUM, J., DEAN, D.H. Revision of the nomenclature of the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins. Microbiol Mol Bio Rev. v.62, p.807-813, 1998. DANKOCSIK, C., DONOVAN, W.P., JANY, C.S. Activation of cryptic protein gene of Bacillus thuringiensis sybspecies kurstaki by gene fusion and determination of the crystal protein insecticidal specificity. Mol Microbiol. v.4, p.2087-2094, 1990. DE COSA, B, MOAR W, LEE, S.B, MILLAR, M, DANIEL, H. Over expression of the Bt cry2Aa2 operon in chloroplasts leads to formation of insecticidal crystals. Nature Biotechnology. v.19, p.71-74, 2001. DE MAAGD, R.A. M.S.G. KWA, H. VAN DER KLEI, T. Yamamoto, B. Schipper, J.M. Vlak, W.J. Stiekema, D. Bosch. Domain III substitution in Bacillus thuringiensis deltaendotoxin cry1A(b) results superior toxicity for Spodoptera exígua and altered membrane protein recognition. App. Environ. Microbiol. v.62, p.1537-1543, 1996. DE MAAGD, RA, BRAVO, A, BERRY, C, CRICKMORE, N, SCHNEPF, E Structure, diversity, and evolution of protein toxins from spore-forming entomopathogenic bacteria. Ann Rev Genet. v.37, p.409-433, 2003. DONOVAN, W.P., DANKOSCISK, C.C., GILBERT, M.P.,GAWRON-BURKE, M.C., GROAT, R.G., CARLTON, B.C. Amino acid sequence and entomocidal activity of the P2 crystal protein. J. Biol. Chem. 263, 561-567. 1988. EDWARDS, D.L., PAYNE, J., SOARES, G.G. Novel isolates of Bacillus thuringiensis having activity against nematodes. European Patent Application EP O. v.303, p.406 A2, 1998. FINNEY, D.J. Probit analysis, Cambridge University Press, Cambridge, 1971. FISCHHOFF, D.A. Insect tolerant tomato plants. Bio/Technology. v.5, p.807-813, 1987 FUJIMOTO, H., K. ITOH, M., YAMAMOTO, J., KYOZUKA, SHIMAMOTO, K. Insect resistant rice generated by introduction of a modified delta-endotoxin gene of Bacillus thuringiensis. Bio/technology. v.11, p.1151-1155, 1993. GORE, J., ADAMCZYK, J.J., BLANCO, C.A.. Selective Feeding of Tobacco Budworm and Bollworm (Lepidoptera: Noctuidae) on Meridic Diet with Different Concentrations of Bacillus thuringiensis Proteins. J. Econo. Entomo. v.98, p.88-94, 2005. GOULD, F., ANDERSON, A., REYNOLDS, A., BUMGGARNER, L., MOAR, W. Selection and genetic analysis of a Heliothis virescens (Lepidoptera: Noctuidae) strain with high levels of resistance to Bacillus thuringiensis toxins. J. Econ. Entomol. v.88, p.1545-1559, 1995. GOULD, F., MARTINEZ-RAMIREZ, A., ANDERSON, A., FERRE, J., SILVA, F.J., MOAR, W.J. Broad-spectrum resistance to Bacillus thuringiensis toxin in Heliothis virescens. Proc. Natl. Acac.Sci. USA. v.89, p.7986-7990, 1992. GRANADOS, R.R., GUOXUN, L., DERKSEN, C.G., MCKENNA, K.A.A.. An insect cell line from Trichoplusia ni (BTI-Tn-5B1-4) susceptible to trichoplusia ni single enveloped nuclear polyhedrosis virus. J. Invertebr. Pathol. v.64, p.260-266, 1994. GREENPLATE, J. T., MULLINS J. W., PENN S. R., DAHM A., REICH B. J., OSBORN J. A., RAHN P. R., RUSCHKE L., SHAPPLEY Z. W. Partial characterization of cotton plants expressing two toxin proteins from Bacillus thuringiensis: relative toxin contribution, toxin interaction, and resistance management. J. Appl. Ent. v.127, p.340–347, 2003. GROCHULSKI, P., ET A.L., CYGLER, M. Bacillus thuringiensis CryIA(a) insecticidal toxin: crystal structure and channel formation. J. Mol. Biol. v.254, p.447-464, 1995. HOFTE, H., WHITELEY, H.R. Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis. Microbiol. Rev. v.53, p.242-255,1989. JAIN, D., UDAYASURIVAN, V., ARULSELVI, P.I., DEV, S.S., SANGEETHA, P.Cloning characterization and expression of new Cry2Ab gene from Bacillus thuringiensis istrain 14-1. Appl. Biochem. Biotechnol. v.128, p.185-94, 2006 JARVIS, D.L. Developing baculovirus-insect cell expression systems for humanized recombinant glycoprotein production. Virology.v.310, p.1-7, 2003. Kitss, P.A, Ayres, M.D, Possee, R,D. 1990. Linearization of baculovirus DNA enhances the recorey recombinante virus expression vector. Nucleic Acid Res. 18:5667-5672 KNOWLES, B.H., KNIGHT, P.J.K., ELLAR, D.J. N-acetyl galactosamine is part of the receptor in insect gut epithelia that recognizes an insecticidal protein from Bacillus thuringiensis. Proc. R. Soc. Lond. v.245, p.31–35, 1991. KOST, A., CONDREAY, J.P., JARVIS, D.L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature biotechnology. v.23, p.567-575, 2005. Kota, M., Daniel, H., Sam Varma, Garczynski, S. F., Gould, F., Moar W.J. Overexpressaion of the Bacillus thuringiensis (Bt) Cry2Aa2 protein in chloroplast confers resistance to plants against susceptible and Bt-resistant insects. Proc. Natl. Acad. Sci. v.96 p. 1840-1845, 1999 KOZIEL, M.G., BELAND, G.L., BOWMAN, C., CAROZZI, C.. Field performance of elite transgenic maize plants expressing an insecticidal protein derived from Bacillus thuringiensis. Bio/Technology. v.11, p.194-200, 1993. LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriphage T4. Nature. v.227, p.680-685,1970. LEE, M.K., YOU, T.H., YOUNG, B.A., COTRILL, J.A., VALATIS, A.P., DEAN, D.H. Aminopeptidade N purified from Gypsy moth brush border membrane vesicles is a specific Cry1Ac toxin. Appl. Environ. Microbiol. v.62, p.2845-2849, 1996. LIANG, Y., DEAN, D.H. Location of a lepidopteran specificity region in insecticidal crystal protein cryIIa from Bacillus thuringiensis. Mol. Microbiol. v.13, p.569-575, 1994. LIÃO, C., HECKEL, D.G., AKHURST, R. Toxicity of Bacillus thuringiensis insecticidal proteins for Helicoverpa armigera and Helicoverpa punctigera (Lepidoptera: Noctuidae), major pests of cotton. J. Invertebrate Pathology. v.80, p.55-63, 2002. MARTENS, J.W., HONEE, G., ZUIDEMA D., VAN LENT J.W.M., VISSER B., VLAK J. M. Insecticidal activity of a bacterial crystal protein expressed by a recombinant baculovirus in insect cells. Appl. Environ. Microbiol, v.56, p.2764-2770, 1990. MONERRAT, R. G., SILVA S.F., SILVA-WERNECK, J.O. Catálogo do banco de germoplasma de bactéria do gênero Bacillus. Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 65p. 2001. NAYAK, P., BASU, S. DAS., BASU A., GROUSH, D., RAMAKRISHNAN, N.A., GROSH, M., SER, S.K. Transgenic elite indica rice plants expressing Cry1Ac deltaendotoxin of Bacillus thuringiensis are resistante against yellow sten borer (Scirpophaga incertulas). Proc. Nalt. Acad. Sci. USA. v.94, p.2111-2116, 1997. O’REILLY D.R., MILLER L.K., LUCKOW V.A. Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Freeman, New York, 1992. PANG, Y., FRUTOS, R., FEDERICI, B.A. Synthesis and toxicity of full length and truncated bacterial CryIVD mosquitocidal proteins expressed in lepidopteran cells a baculovírus vector. J Gen Virol. v.73, p.89-101, 1992. PERLAK, F.J., DEATON, R.W., ARMSTRONG T.A,. FUCHS, R.L,. SIMS, S.R,. GREENPLATE, J.T., FISCHHOFF, D.A. Insect resistant cotton plants. Bio/Technology. v.8, p.939-943, 1990. RIBEIRO, B.M., CROOK, N.E Construction of occluded recombinant baculoviruses containing the full-length cry1Ab and cry1Ac genes from Bacillus thuringiensis. Braz J Med Biol Res. v.31, p.763-769, 1998. RIBEIRO, B.R, CROOK, N.E. Expression of full length and truncated forms of crystal protein genes from Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki in baculovírus and pathogenicity of the recombinant viruses. J Invertebr Pathol. v.62, p.121-130, 1993. RODRIGUES J.C.M., DE SOUZA M.L., O`REILLY D.R., VELOSO L.M., PINEDO F.J.R., RAZUCK F.B., RIBEIRO B.M Characterization of the Ecdyteroid UDPglucosyltransferase (egt) gene of Anticarsia gemmantalis nucleopolyhedrovirus. Virus genes, v.22, p.103-113, 2001. ROUSH, R.T. Managing resistance to transgenic crops. In: Advances in insects Control: the Role of transgenic plants Eds: By Carozzi, N., Koziel, M., London:Taylon Francis, p.242-263, 1997. SAMBROOK J., FRITSCH E.F., MANIATIS T. Molecular cloning: a laboratory manual, 3 ed. Cold Spring Harbor, NewYork, 2001. SCHAWART, J.L., POTVIN, L., CHEN, X.J., BROUSSEAU, R., LAPRADE, R., DEAN, D.H. single-site mutations in the conserved alternating-arginine region affect ionic channels formed by Cry1Aa, a Bacillus thuringiensis toxin. App. Environ. Microbiol. v.63, p.3978-3984, 1997. SCHNEPF, E., CRICKMORE, N., VAN RIE, J., LERECLUS, D., BAUM J., FEITELSON, J., ZEIGLER, D.R., DEAN, D.H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbio. Mol. Biol. Rev. v.62, p.775-806, 1998. STAPLES, N., ELLAR, D., CRICKMORE, N. Cellular Localization and Characterization of the Bacillus thuringiensis Orf2 Crystallization Factor. Current Microbiology. v.42, p. 388–392, 2001. STEWART, C.N., ADANG, M.J., ALL, J.N., BOERMA, H.R., CARDINEAU, G., TUCKER, D., PARROTT, W.A.. Genetic transformation, recovery, and characterization of fertile soybean transgenic for a synthetic Bacillus thuringiensis cryIAc gene. Plant Physiol. v.112, p.121-129. 1996. TABASHINK, B.E., DENNEHY T.J., SIMS, M.A., LARKIN, K., HEAD G.P., MOAR W.J., CARRIERE, Y. Control of resistant pink bollworm (Pectinophora gossypiella) by transgenic cotton that produces Bacillus thuringiensis toxin Cry2Ab. Appied Environmental Microbiology. v.68. p.3790-3794, 2002. Wang G., Zhang, J., Song, F., Wu, J. Feng, S., Huang , D. Engineered Bacillus thuringiensis GO33A with broad insecticidal activity against lepidopteran and coleopteran pests. Appl Microbiol Biotechnol. 2006. WANG, X., OOI, B.G., MILLER, L.K. Baculovirus vectors for multiple gene expression and for occluded virus production. Gene 100:131-137, 1991. WEISER, J. Impact of Bacillus thuringiensis on applied entomology in Eastern Europe and in Ssovier Union. In: Krieg A. Huger, A.M. Mitteilungen aus der Biologischen Bundesanstalt für Land und Forstwirtschaft Berlin-Dahlen Heft. 233, 3750, Paul Parey, Berlin. 1986. WIDNER W.R.., WHITELEY H.R. Two highly related crystal proteins of Bacillus thuringiensis serovar kurstaki possess different host range specificities. J. Bacteriol. v.171, p.965-974, 1989. WU, D., CAO, X.L., BAI Y.Y., AROSON A.L Sequencing of an operon containing a novel δ-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis. FEMS Microbiol Lett. v.81, p.3136, 1991. YAMAMOTO, T., MCLAUGHLIN, R.E. Isolation of a protein from the parasporal crystal of Bacillus thuringiensis var. Kurstaki toxic to the mosquito larva, Aedes taeniorhynchus. Biochem. Biophys. Res. Commun. v.103, p.414-421, 1981
