1 efeitos renoprotetores da pentoxifilina em relação a clorpromazina

1
EFEITOS RENOPROTETORES DA PENTOXIFILINA EM RELAÇÃO A
CLORPROMAZINA E LOVASTATINA EM ISQUEMIA E REPERFUSÃO
RENAL DE RATOS WINSTAR (Rattusnovergicus).
MOREIRA, Brunna Silva (Medicina Veterinária, Correspondência:
[email protected])
PEREIRA, Daniel Peixoto ([email protected])
RESUMO
O rim possui diversas funções no organismo, dentre as quais, a
manutenção da homeostasia, produção de hormônios, filtração sanguínea e
eliminação de dejetos metabólicos. Devido às inúmeras consequências
fisiológicas e metabólicas no qual indivíduo está exposto quando a função renal
apresenta-se comprometida, a necessidade da utilização métodos terapêuticos
com afinalidade de evitar danos irreversíveis torna-se imprescindível. A
isquemia renal está presente em diferentes circunstâncias como em cirurgias
renais, vasculares e no transplante renal. A síndrome de isquemia e
reperfusãosão
reconhecidas
como
asprincipais
causas
de
danos
e
consequências deletérias para órgãos. O objetivo deste presente trabalho é de
avaliar a integridade e a função renal de ratos Winstar, submetidos à isquemia
e reperfusão com ou sem aplicação de pentoxifilina, clorpromazina e
lovastatina. Com qual serão utilizados 36 animais, machos, adultos,
distribuídos aleatoriamente em quatro grupos de nove indivíduos, todos
submetidos à isquemia e reperfusão: grupo CT sem tratamento, grupo PTX
tratados previamente com pentoxifilina, grupo CPZ tratados com clorpormazina,
e grupo LVT com lovastatina.Avaliações da integridade e funçãorenalsão
realizadas por exame físico, concentração sérica de uréia e creatinina, e
análise histopatológica. O trabalho está em andamento, com as cirurgias do
grupo CT concluídas.
Palavras-chave:transplante renal, nefropatia, cirurgia urológica.
2
INTRODUÇÃO
O rim possui diversas funções na manutenção da homeostase. Ambos os
rins filtram o sangue e, eliminam os dejetos metabólicos enquanto, retém as
substâncias filtradas essenciais ao organismo, como proteínas de baixo peso
molecular, água e eletrólitos (Cunninghan, 2008). Outras incumbências são as
secreções de hormônios e as hidrólises de pequenos peptídeos (Reece, 2008).
No rim, a lesão induzida por isquemia e reperfusão é o principal fator
etiológico da insuficiência renal aguda (IRA), que se caracteriza, entre outros
achados, por uma elevação transitória nas taxas séricas de creatinina. (Leal, et
al, 2001; Rhoden, et al, 1998; Rhoden et al, 1997). A geração de injúria renal
após isquemia e reperfusão, por sua vez, envolve três principais rotas
metabólicas: via da xantinaoxidase, via do óxido nítrico e a via do ácido
araquidônico. (Silva, 2002; Rhoden, et al 1998).
Isquemia é a falta de fluxo sanguíneo para um tecido devido à obstrução
do fluxo arterial, em que há decréscimo da oferta de substratos metabólicos,
inclusive a glicose (Cotran, 2000). A lesão decorrente da isquemia é um
fenômeno complexo que não envolve apenas processos intracelulares, mas
também desencadeiam resposta inflamatória que são interconectados (Grootet
al. 2007).
Segundo Molitoris (1993) e Goes (1995), a isquemia causa uma queda na
presença de oxigenação no órgão, promovendo mudanças no metabolismo dos
nucleotídeos, com redução de ATP, que provoca expressão de moléculas de
adesão epitelial, produção de citocinas e fator de necrose tumoral (TNF),
devido os leucócitos atacarem o epitélio do parênquima renal.
A síndrome de isquemia e reperfusãotem sido amplamente reconhecida
como uma fonte importante de danos e consequências deletérias para órgãos,
(Silva
et
al, 2002).Reperfusão
é
a
designação
para
caracterizar o
restabelecimento do fluxo arterial após um período de isquemia (Evoraet
al.1996).
3
Sabe-se que o dano celular na síndrome isquêmico-reperfusional é
decorrente de alterações da estrutura das membranas lipídicas da célula e de
suas organelas, que são consequência de processos iniciados já na fase de
isquemia, porém intensificados durante a reperfusão tecidual. (Silva, 2002;
Rhoden, et al, 1998; Rhoden et al, 1997)
De acordo com Land (1996) e Gill (2005), a lesão por isquemia e
reperfusão é uma das principais causas de insuficiência renal aguda que ocorre
após choque hemorrágico ou cirurgia cardiovascular maior, e a causa mais
comum da função retardada do enxerto ou falha do órgão.
Em transplantes, a perfusão com solução adequada é parcialmente
efetiva, novas pesquisas são indispensáveis para impedir a perda da função do
órgão doado devido a danos isquêmicos. O intermédio do uso de fármacos
nesses processos potencializa as condições de melhora nas condições clínicas
em cirurgias que incluam isquemia e reperfusão (Jaeschkeet, 2003).
A Síndrome da Isquemia e Reperfusão (SIR) é um fenômeno complexo,
que contribui para a mortalidade e morbidade dos transplantes clínicos de
órgãos sólidos. Embora a introdução de melhores soluções de preservação na
prática clínica tenha reduzido a severidade das lesões isquêmicas, a injúria da
isquemia-reperfusão ainda permanece como um dos maiores problemas dos
transplantes (Torras, et al, 1999).
Várias estratégias e recursos são utilizados pelas células para prevenir ou
diminuir a injúria celular causada pelo estresse oxidativo. Esses mecanismos
de defesa antioxidantes celulares têm por finalidade prevenir a formação de
radicais livres, converter espécies oxidantes tóxicas em menos tóxicas,
preservar a compartimentalização celular - que é vital para as estruturas
celulares - ou promover o reparo do dano causado pelos radicais livres (Shah,
1995).
De acordo com Araújo (2002) e Netto (2001), a clorpromazina tem-se a
capacidade de preservação confirmada, cuja ação protetora ainda não foi
totalmente esclarecida. Segundo Chien (1997), a proteção contra lesão
isquêmica só ocorre quando ministrada antecipadamente ao momento da
parada de aporte sanguíneo ao tecido. O efeito protetor pode estar associado à
4
alteração do metabolismo de cálcio, recuperação de ATP e perda de
fosfolipídeos.
A
lovastatina
apresenta
efeito
benéfico
na
circulação
renal,
caracterizando-se pelo aumento do fluxo sanguíneo renal, mesmo em animais
anormais (Harris et al. 1990; Jiang et al. 1997).
A isquemia do rim pode ocorrer em cirurgias urológicas e vasculares, o
que justifica o interesse na procura de drogas protetoras da função renal que
possam ser utilizadas por via intravenosa como a Lovastatina, permitindo maior
amplitude clínica na prevenção da lesão renal isquêmica(Leal,2001).
A pentoxifilina atua classicamente como agente redutor da viscosidade
sangüínea. O mecanismo de ação desta droga ainda não foi totalmente
esclarecido, porém sabe-se que ocorre uma diminuição da viscosidade
sangüínea, melhorando o fluxo de sangue através da alteração das células
vermelhas. Capaz de inibir a produção de TNF-α por monócitos e linfócitos T in
vitro (Loprinzi, 2004).
De acordo com Cooper (2004) e Sliwa (1998), esta droga tem sido
utilizada em outros estudos, baseada na hipótese de que a mesma é capaz de
inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias.
O objetivo geral do presente experimento é avaliar a capacidade de
proteção renal da Pentoxifilina no episódio da Síndrome da Isquemia e
Reperfusão (SIR) comparada a Lovastatina e a Clorpromazina.
O objetivo específico baseia-se em avaliar a capacidade renoprotetora
da Clorpromazina, Lovastatina, Pentoxifilina, e seus efeitos histopatológicos
sobre o rim pós-SIR medicado ou não com a Pentoxifilina, comparando-as
qualitativamente a sua capacidade renoprotetora.
METODOLOGIA
O protocolo experimental foi submetido ao Comitê de Ética no Uso
Animal, CEUA-UNITRI e aprovado pelo protocolo 849855, cuja pesquisa foi
realizada de acordo com as diretrizes do código Brasileiro de legislação para o
uso científico de animais (Lei 11.794 / 08).
5
Foram utilizados36 ratos Wistar machos fornecidos pelo Biotério do
Centro Universitário do Triângulo (UNITRI) de Uberlândia MG, com peso
corporal variando entre 200 a 250g.
Todos os animais ficaram por 15 dias no biotério climatizado sendo
manipulados pela equipe pesquisadora a fim de se adaptarem e reduzir o
estresse pela mudança ambiental. É fornecido água clorada e ração própria ad
libitum.Cada animal passa por exame clínico a fim de verificar o estado de
saúde. Os animais clinicamente saudáveis são utilizados na pesquisa divididos
em grupos. Os grupos foram definidos como grupo Controle (CT); grupo
Clorpromazina (CPZ); grupo Lovastatina (LVT) e grupo Pentoxifilina (PTX).
Cada grupo foi dividido em três subgrupos de três animais e cada
subgrupo está alocado em uma gaiola separada, sendo marcados como 24h
(24 horas), 72h (72 horas) e 5d (cinco dias).
Antes dos procedimentos anestésicos os animais passam por jejum
alimentar de 6 horas. Após a cirurgia, a ferida cirúrgica é limpa diariamente
com água sabão e PVPI tópico.
Para o grupo (CT): No momento zero, os animais foram anestesiados
com inalação de isoflurano puro vaporizado em oxigênio a 100%, foi realizada
uma laparotomia mediana, onde foi induzida uma isquemia normotérmica pelo
clampeamento da artéria renal esquerda utilizando pinça bulldogdieffenbach.
A incisão da laparotomiafoi suturada, os animais receberam uma dose
de fentanila na dose de 0,025 mg/kg por via intramuscular e foram colocados
em caixas individuais pelo período de 60 minutos. A seguir, foram novamente
anestesiados, a cavidade abdominal reaberta e restabelecido o fluxo sanguíneo
renal pela retirada da pinça vascular mantida na artéria renal.
Em continuidade, realizou-se a nefrectomia contralateral ao órgão
previamente isquêmico. A cavidade abdominal foi suturada com pontos simples
separados com fio mononylon 4-0 (Figura 1), e após a recuperação anestésica,
os animais foram mantidos em suas próprias gaiolas e realizada analgesia com
cloridrato de tramadol na dose de 5mg/kg por via intramuscular a cada 12
horas.
6
Figura 1 – Animal suturado após indução de isquemia e reperfusão esquerda e
nefrectomia direita. Anestesia realizada com Isoflurano em oxigênio a 100%
O subgrupo 24h foi anestesiado com o mesmo protocolo após 24 horas
da indução isquêmica e reaberto. Foi coletado três microlitros de sangue intracardiaco.Seria coletado urina por cistocentese.E o rim testado foi coletado por
nefrectomia padrão. Ainda em plano anestésico os animais forameutanasiados
com aplicação de cloreto de potássio 19,1% por via intra-cardíaca.
O subgrupo 72h foi anestesiado com o mesmo protocolo após 72 horas
da indução isquêmica e reaberto. Foi coletado três microlitros de sangue
intracardíaco, seria coletado o maior volume de urina possível da vesícula
urinária por cistocentese e o rim testado foi retirado por nefrectomia padrão.
Ainda em plano anestésico os animais forameutanasiados com aplicação de
cloreto de potássio 19,1% por via intracardíaca.
O subgrupo 5dfoi anestesiado com o mesmo protocolo após cinco dias
da indução isquêmica e reaberto. Foram coletados três microlitros de sangue
intracardíaco, seria coletado o maior volume de urina possível da vesícula
urinária por cistocentese e o rim testado foi coletado por nefrectomia padrão.
Ainda em plano anestésico os animais forameutanasiados com aplicação de
Cloreto de Potássio19,1% por via intracardíaca.
Os grupos (CPZ), (LVT) e (PTX) passarão pelo mesmo tipo de
procedimento que o grupo (CT), mas antes da indução de isquemia e
reperfusão, receberão o tratamento com os fármacos em teste. O grupo (CPZ)
7
receberá uma dose de 3mg/Kg de clorpromazina administrada por via
intravenosa (Veia Jugular externa), 15 minutos antes. O grupo (LVT) receberá
a Lovastatina na dose de 15mg/Kg/dia administrados por via oral no período de
10 dias que antecederão a realização da isquemia. O grupo (PTX) receberá a
Pentoxifilina na dose de 40mg/Kg/dia administrados por via intraperitoneal no
período de 10 dias que antecederão a realização da isquemia.
A análise sanguínea será realizada para aferição dos níveis de uréia e
creatinina séricas.
Os resultados obtidos com as análises serão submetidos a análise
estatística pelo teste U de Mann-Whitney considerando o índice de significância
de 5%.
Posteriormente os rins serão incluídos em formoldeído e cortes
micrométricos serão realizados para análise em microscopia ótica.Tanto para
os rins do grupo controle quanto os do grupo teste serão avaliados conforme
estrutura tecidual.
Serão avaliados quantidade de glomérulos normais por campo,
densidade do tecido cortical e medular. Além das características vasculares
parenquimais, espessura da capsula renal, presença de fibrina, fibrose e
necrose tecidual, além de presença ou não de infiltrado inflamatório.
Os resultados obtidos serão posteriormente submetidos a análise
estatística pelo testeKolmogorov-Smirnov para efeito comparativo entre os
grupos.
RESULTADOS
Até o presente momento foram realizados os procedimentos cirúrgicos
apenas no grupo controle (CT). Os subgrupos (24h, 72h, e 5d) comportaram-se
de maneira semelhante após 1 hora de isquemia,onde o rim apresentava-se
congesto e cianótico (Figura 2).Houve um grande incremento dos níveis séricos
de creatinina e ureia. Tanto as dosagens realizadas 24, 75 horas e cinco dias
apresentaram-se próximas (Tabela 1).
8
Figura 2 - Retirada da pinça vascular, e o início da reperfusão renal. Nota-se a
aparência macroscópica de coloração enegrecida em decorrência de
congestão e cianose.
Após o procedimento experimental, os animais mantiveram-se bem e
clinicamente estáveis, no entanto houve redução do consumo alimentar e perca
de peso corporal em alguns animais. Apesar da impossibilidade técnica de
coleta urinária, observou-se translucidez urinária no fundo das caixas em todos
os subgrupos.
Tabela 1 – Níveis de ureia e creatinina pré e pós isquemia e reperfusão renal
RESULTADOS ANÁLISE BIOQUÍMICA GRUPO CONTROLE
Animais
UREIA
Sub-grupo
Pré
Pós
CT1
24h
40.7mg/dl
282mg/dl
CT2
24h
44.1mg/dl
277mg/dl
CT3
24h
35.3mg/dl
270mg/dl
CT4
72h
58.3 mg/dl
302 mg/dl
CT5
72h
50.7 mg/dl
198 mg/dl
CT6
72h
38.4 mg/dl
308 mg/dl
CT7
5d
93.8 mg/dl
269 mg/dl
CT8
5d
40.6 mg/dl
285 mg/dl
9
CREATININA
CT9
5d
36.0 mg/dl
292 mg/dl
CT1
24h
0.48 mg/dl
5.32mg/dl
CT2
24h
0.45 mg/dl
5.54mg/dl
CT3
24h
0.38 mg/dl
5.81mg/dl
CT4
72h
0.32 mg/dl
12,0mg/dl
CT5
72h
0.47 mg/dl
1.85 mg/dl
CT6
72h
0.39 mg/dl
4.86 mg/dl
CT7
5d
0.42 mg/dl
5.42 mg/dl
CT8
5d
0.36 mg/dl
5.04 mg/dl
CT9
5d
0.41 mg/dl
4.92 mg/dl
Os rins esquerdos dos nove animais foram conservados em formaldeído
para envio a análise histopatológica.
DISCUSSÂO
Pode-se constatar que todos os animais foram induzidos a uma
insuficiência renal aguda (IRA), cujo grau de destruição glomerular será
comprovado e avaliado com o laudo histopatológico, com qual se aguarda os
resultados.
De acordo com os estudos realizado por Feitosa et al. (2005),
evidenciou-se alterações tubulares após 30 minutos de isquemia, que foram
agravadas após 30 minutos de reperfusão.
As alterações evidenciadas neste experimento foram gradativas de
acordo com o avanço da lesão, acentuando-se no período de reperfusão.Este
fato pode ser explicado porque a reperfusão, ainda que seja essencial para
prevenir a irreversibilidade da lesão celular, pode agravar as lesões produzidas
na fase isquêmica isolada.
Os níveis de ureia se tornaram aumentados em todos os tempos
avaliados (Tabela 1), no entanto não houve diferença significativa entre as
médias nos momentos 24 horas, 72 horas e 5 dias (Gráfico 1).O que pode ter
sido justificado por um estado de compensação realizada por uma função renal
mínima após as primeiras horas pós isquêmica.
10
Gráfico 1 – Níveis séricos de ureia (mg/dl) entre os tempos testados
300
250
200
150
Média dos níveis de
ureia (mg/dl)
100
50
0
Pré
24 horas
72 horas
5 dias
No entanto os níveis de creatinina subiram até nas primeiras 72 horas
pós-teste e no quinto dia, houve uma redução significativa (Gráfico 2). A
compensação renal pode ter sido a principal causa dessa redução após cinco
dias, já que uma parcela dos néfrons podem ter sido recuperados. O que será
confrontado com exames histopatológicos
Gráfico 2 – Níveis séricos de creatinina (mg/dl) entre os tempos testados
7
6
5
4
Média dos níveis de
creatinina (mg/dl)
3
2
1
0
Pré
24 horas
72 horas
5 dias
Conforme Jablonski et al. (1983) e Williams et al. (1997), rins submetidos
a isquemia durante 60 minutos, resultam em déficit funcional e em uremia
estrita. O estudo experimental com o uso clorpromazina, como um protetor
11
contra a isquemia renal, foram realizados por Junior et al. (2008), cujo grupo
controle apresentou os níveis de uréia e creatinina mantidos elevados até 7dia
pós-operatório,
embora
apresentando
uma
tendência
a
diminuição
e
estabilização dos valores séricos, como ocorrido neste projeto.
Öztürket al. (2001) estudaram o efeito renoprotetor da molsidomina em
ratos submetidos ao processo de isquemia/reperfusão renal. O molsidomina é
um potente vasodilatador que é amplamente utilizado como antianginoso,
relaxando a musculatura lisa, estimulando guanilatociclase, aumentando os
níveis de guanosina cíclico monofosfato (cGMP). Os animais sofreram
nefrectomização direita e isquemia do rim esquerdo, permanecendo isquêmico
durante 1 hora.
De acordo com a medição diária de uréia e creatinina por sete dias, e do
laudo do exame histopatológico, observaram-se que os ratos do grupo
molsidominaobtiveram um melhor índice de ureia e creatinina, melhor
sobrevida e menor grau de lesão renal, quando comparado ao grupo controle
(Ozturket al. 2001). A metodologia deste projeto experimental foi similar ao que
está sendo utilizado neste trabalho.
Com isso é possível ressaltar que a duração da isquemia/reperfusão foi
indicadora da presença de lesão renal, levado em consideração o modelo
experimental empregado. Além dos métodos de avaliação da função renal,
torna-se imprescindível à necessidade da avaliação do efeito protetor conferido
pelas medicações impostas neste presente trabalho.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Foi clara a indução da insuficiência renal aguda no grupo controle o que
permitirá uma plena avaliação dos efeitos renoprotetores dos fármacos
testados.
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