PROTEÍNAS DE FASE AGUDA, cont Nós vimos que os testes de

PROTEÍNAS DE FASE AGUDA, cont
Nós vimos que os testes de detecção da inflamação são todos muito sentsíveis, mas pouco específicos, sendo o
VHS<mucoproteínas<PCR. Nenhuma delas tem o poder mágico de dizer: isso é isso e não isso. Então, CUIDADO! Há
poucas indicações para o diagnóstico e mais para o acompanhamento de tto, em dosagens seriadas. Uma queda
inicial com um pico posterior pode indicar que não está respondendo mais, ou reincidivou, ou tá passando de uma
infecção bacteriana para uma infecção fúngica, por exemplo, ou o tumor está voltando... ou seja, múltiplas
interpretações.
DETECÇÃO DE AUTO-ANTICORPOS
Vou falar agora sobre doenças auto-imunes, cujos métodos sorológicos que detectam a presença dos autoanticorpos indica não só o diagnóstico, mas a titulação desses anticorpos pode se correlacionar com a progressão e
atividade inflamatória da doença. É muito comum depois que vc tem o resultado positivo de um FAN, num padrão
que se correlaciona com o Lúpus eritematoso sistêmico (LES), na medida que vc estabelece o tto, pode haver uma
queda dos títulos em resposta ao tto. Assim como numa reativação da doença, esses títulos podem subir. Essa
flutuação dos títulos pode acontecer reproduzindo períodos de acalmia e períodos de atv da doença.
Várias doenças inflamatórias tem como substrato a produção de anticorpos contra estruturas próprias numa perda
da auto-regulação imunológica. São conhecidas genericamente como colagenoses e vasculites e são elas: Artrite
reumatóide, LES, vasculites, hepatites auto-imunes, etc. E algumas delas já tem hj como critérios diagnósticos esses
exames que vamos estudar hj. Caracterizadas pelo aumento de consumo do sistema complemento.
- Artrite Reumatoide (AR)
A artrite reumatoide é uma doença relativamente comum, acomete mais mulheres e o acometimento de
articulações respeita aquela máxima de rigidez matinal que melhora ao longo do dia, com algumas articulações mais
acometidas que outras e uma associação com os outros sinais inflamatórios. Nessa doença a produção de autoanticorpos já foi muito bem caracterizada. Esses auto-anticorpos podem ser de qualquer classe, mas é mais comum
eles serem IgM que se ligam à porção Fc de uma IgG, ativando-a que por sua vez, ativa o sistema complemento,
levando à destruição inflamatória levando a mobilização de várias céls citotóxicas e macrófagos para diversas células
de diversos tecidos. Um dos tecidos mais comumente acometido é a sinóvia. O que a gente já sabe sobre a
fisiopatologia da AR: Há a liberação de proteínas de fase aguda; Produção de Ac (IgM principalmente) contra a IgG e
contra a proteína filagrina (qualquer cel que a expresse); Expressão deficiente de CD4/CD28 em células T; Formação
de tecido linfóide ectópico na membrana sinovial; Formação de granuloma e de lesões inflamatórias destruidoras
teciduais (principalmente na sinóvia).
. Anticorpos anticitrulina (Anti-CCP): Em 1964, foi descrito novo marcador sorológico em pacientes com AR: antifator
perinuclear (APF). Esses autoanticorpos ligam-se a grânulos ceratohialinos localizados ao redor do núcleo de células
humanas da mucosa das bochechas e da pele. Em 1979, outro anticorpo foi identificado, o antiqueratina (AKA), com
alta especificidade (88 a 99%), com sensibilidade de 36 a 59%. No início do anos 90, os investigadores detectaram
que reagem com a proteína filagrina e a pró-filagrina através do aminoácido citrulina. A filagrina é uma proteína
produzida durante as fases tardias da diferenciação das células epiteliais de mamíferos. No final dos anos 90, foi
elucidado que os epitopos reconhecidos pelo APF e AKA eram ricos em aminoácido citrulina. Foram desenvolvidos
testes de ELISA contendo um painel de peptídeos citrulinados cíclicos como substrato antigênico: substituiu o APF e
AKA. Anti-CCP têm especificidade 96-100% e sensibilidade de 70-75% para diagnóstico de AR. Significa que
considerando o FR que já tinha uma boa especificidade para o diagnostico de AR, alguns desses Ac se mostraram
ainda mais específicos que o FR. AKA tem menor sensibilidade e a maior especificidade dos três e a prevalância dos
Ac aumenta com a idade, mas ainda é menor do que a do FR. O problema do FR é o aparecimento dos auto-Ac não
só na AR, como tb na gravidez e com o avançar da idade. Principais vantagens dos Anti-CCP é a alta especificidade e
precocidade do aparecimento, sem dar tantos falsos positivos. Nem todos os laboratórios tem disponível os antiCCP. Muitas vezes os pequenos lab captam o soro e mandam para os grandes lab como apoio.
FAN (Fator anti-nuclear)
Na minha opinião já deveria ter sido trocado o nome: FANC (Fator anti-nuclear e citoplasmático). Essa amplificação
do exame se deveu à troca do substrato do exame. Antigamente se usava células de fígado de rato. Por ser
mamífero teremos uma série de Ag compartilhados, mas tb Ag não compartilhados. Com a troca para utilização de
cels humanas (carcinoma de laringe Humano – HEp-2) nós passamos a detectar diversos novos Ac. Como toda célula
cancerígena, expressa células de mitose, logo alguns padrões foram identificados inclusive quando os cromossomos
estão pareados na hora da divisão celular (padrão centromérico – contra ptns do centrômero dos cromossomos
condensados). Tais Auto-Ac poderão identificar as células, ativar o sistema complemento e promever a destruição
dessas células, através de fenômenos inflamatórios, culminando, por exemplo, em fibose, como na esclerodermia.
Esse teste é feito por imunofluorescência indireta, técnica barata, boa, me permite titulação e a definição de qual Ac
formado e qual ligação que ele é responsável, seja ela reconhecendo Ag nuclear ou citoplasmático. Alguns desses
padrões de reconhecimento são comuns a um grande número de doenças auto-imunes, já outros são específicos de
uma. A gente utiliza o FAN para triagem de doenças auto-imunes que podem apresentar poli-artralgia e a partir de
um resultado positivo associado ao padrão de articulação acometida, você pode, junto com outros sinais maiores,
definir se se trata de LES ou de outra colagenose. Mas atenção! Pode ocorrer FAN positivo sem correlação com
alguma doença, pois muitas coisas podem interferir no exame (uso de medicamentos, idade, sífilis, gravidez).
Doenças auto-imunes com FAN positivo: LES, Artrite reumatoide, Esclerodermia ou Esclerose Sistêmica (tem um
subtipo que a gente chama de CREST síndrome), Síndrome de Sjögren, Polimiosite, Hepatite auto-imune e Doença
mista do colágeno. O padrão é muito importante (nuclear, nucleolar, citoplasmático, ceentromérico, fibras do fuso
mitótico...), o subtipo (reticular fino, pontilhado esparso, homogêneo...) e o título (quando mais próximo de 1/80,
maior a chance de falso-reativo).
LES:
Você pensa em LES quando o paciente tem uma série de sintomas meio que desconectados um com os outros. Mas
é característico o eritema em borboleta, que fica fácil demais pensar em LES qd o paciente o tem.
Fenômeno de Raynaud: um dos sintomas associados com muitas dessas doenças. Se caracteriza por uma súbita
diminuição do suprimento sanguíneo, normalmente por uma vasoconstrição (palidez-cianose-eritema rebote) e
dependendo da intensidade da duração, vc pode até ter lesões necróticas. Vc tem muito fenômeno de Raynaud
associado à esclerose sistêmica (esclerodermia). A associação entre essas doenças auto-imunes tem caráter familiar.
Esclerose sistêmica (ES)
Tipo 1: com participação simétrica e difusa da pele (sorriso congelado, pele fibrosada e endurecida), além do esôfago
(com disfagia progressiva, que necessita do uso de balões para tentar aumentar o diâmetro do esôfago), intestino,
pulmão, rim, coração.
Tipo 2: CREST síndrome: Calcinose, fenômeno de Raynaud, disfunção Esofágica, eSclerodactilia, Telangiectasia, HAP
e cirrose biliar
Tipo 3: superposição (ES + DMTC (Doença Mista do Tecido Conjuntivo))
Síndrome de Sjögren
Doença inflamatória com acometimento de várias glândulas. Associação de secura ocular, bucal, das vias aéreas
superiores aumento das glândulas parótidas e artrite. O indivíduo fica conhecido como bochecha do Fofão, devido
ao alargamento da parótida em função desse processo inflamatório, mas é de natureza auto-imune. Não é raro a
associação com AR, LES, tireoidite de Hashimoto, cirrose biliar primária, esclerose sistêmica, CREST síndrome,
polimiosite. Ele tem uma e ao longo da vida desenvolve outra.
FAN
Exame de triagem: pesquisa de anticorpos contra estruturas celulares: nucleares, envoltório nuclear, proteínas
nucleolares, histonas, citoplasmáticas e de estruturas de divisão celular. Muito sensível e pouco específico, exceto
em alguns poucos padrões, em que existe 99,999% de especificidade. A partir do padrão inicial vc vai correlacionar
com algumas ptns e vai pedir o subfracionamento do FAN.
Padrão de
fluorescência
nuclear
Nuclear
homogêneo
Auto antígeno(s) Associado(s)
Correlação Clínica
DNA nativo; DNA de hélice simples; Histona (H1, H2A,
H2B, H3 e H4)
Nuclear
pontilhado fino
Nucleossomo; La/SS-B; Ro/SS-A
Nuclear
pontilhado grosso
Nuclear
pontilhado grosso
reticulado
Membrana
nuclear
Sm; U1-RNP (22, 34 e 70kDa)
LES; Artrite juvenil idiopática, LES
induzido por drogas e LES idiopático;
AR, síndrome de Felty, esclerose
sistêmica, cirrose biliar primária
(CBP), hepatite auto imune
LES; SSj, LES neonatal, LES cutâneo;
AR, miosite, polimiosite e esclerose
sistêmica
LES; DMTC, esclerose sistêmica
Raros pontos
nucleares
Múltiplos pontos
nucleares
Nuclear
pleomórfico
Centromérico
p80 coilina (80 kDa)
Nucleolar
Citoplasmático
pontilhado fino
denso
Citoplasmático
pontilhado
reticulado
Ribonucleoproteínas heterogêneas (hnRNP)
Lamins, Lamin B, gp210
Sp100
LES, DMTC, outras doenças
reumáticas, inflamatórias crônicas e
mesmo indivíduos hígidos
Doenças reumáticas auto imunes,
hepatopatias, doenças virais e
também indivíduos hígidos
SSj, doenças inflamatórias, indivíduos
hígidos
CBP
Antígenos de célula em proliferação PCNA (34kDa),
CENP-F (340 kDa)
Proteínas associadas ao centrômero (CEN-A de 17kDa,
CENP-B de 80kDa e CENP-C de 140kDa)
Fibrilarina (34kDa) (nucleolar grumoso puro); PMScl
(20-110kDa) (nucleolar homogêneo e nuclear
pontilhado fino); RNA polimerase I (10-220kDa)
(nuclear pontilhado e pontos isolados nna placa
metafásica); Scl-70 (70-86kDa) (nuclear e nucleolar
pontilhado fino)
Proteína P ribossomal
LES, condições neoplásicas
Antígenos mitocondriais
CPB
Esclerose sistêmica, CBP,
esclerodermia
Esclerose sistêmica; Polimiosite, ES,
dermatomiosite; esclerodermia
limitada ou difusa.
LES
Vantagens da HEp-2
Primeira: possuem muito mais antígenos humanos não-encontrados em tecidos de roedores, e os antígenos
semelhantes estão em maior concentração. Diminuiu a reação cruzada que existia na utilização nas céls dos
roedores.
Segunda: apresentam todas as fases de divisão celular (células cancerígenas), interfase/prófase, metáfase, anáfase
e telófase, cada uma delas sendo a expressão fenotípica da atuação de uma série de genes, que codificam uma
miríade de proteínas que surgem, reagem, atuam e desaparecem, de acordo com as fases do ciclo de vida celular, e
que funcionam como auto-antígenos que possibilitam a identificação de inúmeros auto-anticorpos.
Terceira: possuem uma relação núcleo/citoplasma em favor do núcleo, característica neoplásica, que facilita o
reconhecimento de vários rearranjos fluorescentes.
Quarta: possuem vários nucléolos, permitindo avaliar sua forma de apresentação nos padrões nucleolares.
Por último, têm um citoplasma rico em fibrilas e organelas, fundamentais no reconhecimento dos padrões
citoplasmáticos.
Se em 1957 eram reconhecidos apenas quatro padrões de FAN, atualmente as células HEp-2 permitem o
reconhecimento de mais de 30 diferentes padrões nucleares, nucleolares, da membrana nuclear, do aparelho
mitótico e citoplasmáticos, que são dados por diferentes auto-anticorpos. A vantagem do método é a sua grande
sensibilidade, que permite a triagem de uma gama imensa de anticorpos, fornece uma ideia da concentração dos
mesmos e uma informação qualitativa importante que pode ser usada como um passo inicial para uma identificação
específica. É um exame de triagem, a partir de um FAN positivo, vc tem que subespecificar o exame diagnóstico. A
identificação de anticorpos anticelulares exerce um papel importante na clínica médica e na imunologia clínica. A
detecção de anticorpos anticelulares para diagnóstico de doenças sistêmicas, intermediárias ou órgão-específicas
tem aumentado progressivamente desde que a técnica de imunofluorescência foi utilizada como triagem de autoanticorpos.
Reação de IFI para FAN: padrões
Nuclear (membrana nuclear, homogêneo, pontilhado fino, pontilhado grosso, etc.)
Nucleolar
Citoplasmático (fibrilar reticular, fibrilar pontilhado etc)
Aparelho mitótico
Normalmente, quando os exames são liberados, é utilizado uma tabela do comitê internacional de padronização de
FAN, na qual eu comparo a imagem visualizada no exame com a imagem da tabela para eu liberar o resultado.
Alguns padrões de fluorescência são relativamente inespecíficos, podendo ser evocados por vários auto-anticorpos
distintos (pontilhado grosso associado a antígenos Sm e U1RNP). Outros padrões de fluorescência, entretanto, são
ocasionados por uma gama restrita de auto-anticorpos (PCNA), ou seja, mais específico, e outros, ainda,
exclusivamente por um único auto-anticorpo (centromérico). Nestas circunstâncias, o padrão de fluorescência per se
pode ser suficiente para a definição da especificidade do auto-anticorpo. Na maior parte das vezes, entretanto, o
padrão de fluorescência não pode identificar qual o auto-anticorpo presente, mas sua definição é de vital
importância, pois pode sugerir ao clínico ou patologista clínico qual o próximo passo na investigação de sua
especificidade.
Auto-anticorpo
DNA nativo
Sm
PCNA
Proteína P ribossomal
Nucleossomo
U1-RNP
SS-A/Ro
SS-B/La
Jo-1
Scl-70
Centrômero
Fibrilarina
RNA polimerase
Ku
PM/Scl
Filagrina/Citrulina
Profilagrina
Associação Principal
LES
LES
LES
LES
LES
DMTC
SSj
SSj
Polimiosite
ES
ES
ES
ES
Superposição polimiosite/ES
Superposição polimiosite/ES
AR
AR
Associação Secundária
LES, ES, AR
LES, LE neonatal, ES, polimiosite, CBP
LES, LE neonatal
Superposição polimiosite/ES
CBP
LES
LES, osteoartrose, hepatite auto imune
Assim, o FAN-HEp-2 apresenta-se como importante método de triagem, pois possibilita o conhecimento do(s)
anticorpo(s) provavelmente envolvido(s), restringindo assim os pedidos laboratoriais e colaborando com a
viabilidade econômica do processo.
Suspeita clínica de LES
FAN-HEp-2
Positivo
•
•
•
•
Padrões nucleares de FAN e fracionamento
PCNA
Homogêneo: antiDsDNA, histonas, cromatina
Pontilhado grosso: anti-Sm, UI-RNP
Pontilhado fino: anti-SSA/Ro, SSB/La
Negativo
Diagnóstico de LES improvável Pesquisar anti-SSA/Ro
diante de forte suspeita clínica
Pesquisa de anticorpos antifosfolípides
• VDRL
• Anticardiolipina
• Anticoagulante lúpico
Monitorização laboratorial
• C100, C3 e C4
• AntidsDNA quantitativo
• Hemograma
• Urina rotina
• Ureia e creatinina
• VHS e PCR
Cada padrão positivo eu correlaciono com uma proteína específica para eu identificar a atividade da doença. Além
disso, num segundo momento, uma porcentagem grande dos pacientes com LES, vai desenvolver aquilo que a gente
chama de Síndrome dos Ac antifosfolípides, inclusive com quadro de trombose venosa profunda, associada a
presença de anticoagulante lúpico e anticardiolipina positivos. Então, pacientes com HP de trombose, não deixar de
pesquisar LES.Em terceiro lugar, lembrar que na atividade da doença vc tem consumo do sistema complemento, o
AntiDsDNA avalia o estado de atv da doença, o hemograma mostrará a plaquetopenia ou leucopenia por anticorpos
antiplaquetários ou antileucócitos, a UR, pois a maior parte desses pacientes desenvolve glomerulopatia com
proteinúria que com o tempo pode levar a necrose tubular aguda, levando à insuficiência renal (por isso devemos
monitorar níveis de ureia e creatinina) e lembrar tb que o VHS e PCR podem ser os marcadores de atv da doença e
resposta terapêutica.
Quanto mais eu vou aumentando os títulos do FAN, mais eu vou caminhando a favor das colagenoses (maior VPP),
qt menores os títulos, posso estar diante de quadros de endocardite bacteriana, mulheres sadias menores que 20
anos, gravidez, doença pelo HIV. Quando o FAN dá negativo, exclui mt a possibilidade do paciente ter LES (alto VPN),
mas em resultados positivos, apenas 12% se relacionam com LES (baixo VPP).
Pesquisa de anticorpos antifosfolípides
Os Ac antifosfolípides foram associados primariamente com pacientes com LES, inclusive o Anticoagulante lúpico foi
denominado assim pq era pensado ser uma coisa específica do LES, entretanto nós temos outras síndromes q
apresentam os Ac antifosfolípides positivos. Lembrar que eles podem ser a primeira manifestação do LES. Abrangem
um grupo heterogêneo de anticorpos que reconhecem combinações variadas de fosfolípides e estão presentes nos
pacientes com síndrome anti-fosfolípides (SAF). No LES, independente da presença de SAF, são encontradas em 3040% dos pacientes, geralmente em baixos títulos. E possuem Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa)
aumentado.
Na SAF vc tem uma forte associação com o VDRL, então a gente vai solicitar o VDRL primeiro. O VDRL é uma mistura
de lecitina, colesterol e fosfolípides, então eu posso usá-lo, primeiro, como triagem, pois é um exame mt barato. Se
ele vier negativo eu solicito Anticardiolipina e Anticoagulante lúpico em pacientes com clínica (eventos
tromboembólicos, aborto de repetição...).
Padrões nucleares
Padrões nucleolares
Padrões citoplasmáticos
Padrões mistos