universidade federal do ceará faculdade de medicina departamento

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
MONALISA RIBEIRO SILVA
AVALIAÇÃO DO EFEITO NEUROPROTETOR DO ÁCIDO VALPRÓICO
SOZINHO OU ASSOCIADO AO LÍTIO EM MODELO DE ISQUEMIA
GLOBAL TRANSITÓRIA EM RATOS
FORTALEZA
2016
MONALISA RIBEIRO SILVA
AVALIAÇÃO DO EFEITO NEUROPROTETOR DO ÁCIDO VALPRÓICO
SOZINHO OU ASSOCIADO AO LÍTIO EM MODELO DE ISQUEMIA GLOBAL
TRANSITÓRIA EM RATOS
Tese submetida à Coordenação do Curso de
Pós-Graduação em Farmacologia da
Faculdade de Medicina da Universidade
Federal do Ceará, como requisito para
obtenção do título de Doutor em
Farmacologia.
Orientador: Profª. Drª. Glauce Socorro
Barros Viana
FORTALEZA
2016
MONALISA RIBEIRO SILVA
AVALIAÇÃO DO EFEITO NEUROPROTETOR DO ÁCIDO VALPRÓICO
SOZINHO OU ASSOCIADO AO LÍTIO EM MODELO DE ISQUEMIA GLOBAL
TRANSITÓRIA EM RATOS
Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para
obtenção do título de Doutor em Farmacologia.
Aprovada em: ____/_____/_____
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________________________
Profa. PhD. Glauce Socorro Barros Viana (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará – UFC
______________________________________________________________________
Profa. Dra. Danielle Macêdo Gaspar
Universidade Federal do Ceará – UFC
______________________________________________________________________
Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa
Universidade Federal do Ceará – UFC
______________________________________________________________________
Prof. Dr. Giovany Michely Pinto da Cruz
Faculdade de Medicina Estácio de Juazeiro do Norte – ESTÁCIO FMJ
______________________________________________________________________
Prof. Dr. José Christian Machado Ximenes
Centro Universitário Christus - UNICHRISTUS
Jesus Cristo,
tu tens me cumulado de graça.
Eu reconheço e repito, é graça!
A ti a minha eterna gratidão.
AGRADECIMENTOS
Meus pais, Idelfonso e Zenaide, meus exemplos de luta e determinação. O sim de
vocês a Deus trouxe-me a vida. Obrigado pela educação e por acreditarem nos meus
planos. Painho, amo você! Mainha, amo você!
À minha estimada orientadora, Profª. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana,
agradeço pelo seu “sim” que abriu portas à minha carreira acadêmica e pela confiança
investida em mim. A senhora é especial! Agradeço pelos ensinamentos, paciência,
compreensão, atenção, dedicação, amizade, pela força e vitalidade do seu exemplo.
Às queridas Kelly Rose e Vilani, que mesmo de longe, deram-me o suporte
necessário para a realização de alguns experimentos e pela amizade sincera.
Ao casal de amigos Daniel Luna e Elaine Cristina pela contribuição no trabalho
e amizade sincera.
Aos meus alunos de iniciação científica da Estácio/FMJ: Keicinha, Danieli,
Gabriel, Lucas, Jonatas, Alyne, Luís, Jéssica, Steffany e Andréia. Agradeço pela
dedicação e compromisso na realização de alguns experimentos.
Aos técnicos do laboratório de Biofisiologia da Estácio/FMJ: Viviane, Auri e
Janice, pela contribuição no trabalho e amizade.
Às amigas, Natália Bitu, Camila Nobre, Ana Luiza, Elisabeth Nobre e ao amigo
Giovany cruz pela amizade sincera e apoio nos momentos mais difíceis.
À todos da Faculdade Estácio de Medicina de Juazeiro do Norte (Estácio-FMJ),
pelo apoio e parceria fundamentais para realização desta pesquisa.
Aos funcionários do departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC.
À todos que de uma forma direta ou indireta contribuíram para essa minha
conquista.
Meu muito obrigada!!!
‘‘A alegria está na luta, na tentativa, no sofrimento
envolvido e não na vitória propriamente dita.’’
Mahatma Gandhi
RESUMO
AVALIAÇÃO DO EFEITO NEUROPROTETOR DO ÁCIDO VALPRÓICO
SOZINHO OU ASSOCIADO AO LÍTIO EM MODELO DE ISQUEMIA
GLOBAL TRANSITÓRIA EM RATOS
Introdução/Objetivos: O acidente vascular cerebral é uma condição patológica
decorrente da oclusão ou rompimento de vasos sanguíneos precipitando uma cascata de
eventos que envolvem excitotoxicidade, inflamação, estresse oxidativo e morte celular.
O AV vem apresentando efeitos neuroprotetores em modelos animais e celulares de
doenças neurodegenerativas, incluindo acidente vascular cerebral. Com isso,
objetivamos estudar os efeitos neuroprotetores do AV associado e não ao lítio em
modelo experimental de isquemia cerebral global em ratos. Métodos: O tratamento
iniciou 1h antes da cirurgia e sete dias após com AV (25, 50 e 100 mg/kg/dia, v.o.) e
AV nas mesmas doses associando ao lítio (10 mg/kg, i.p.). Os animais foram
anestesiados com Ketamina (75 mg/kg, i.p.) e Xilazina 2% (10 m/kg, i.p.) e submetidos
à isquemia cerebral global durante 30 min e reperfusão. Após 7 dias foram realizados
os testes comportamentais, campo aberto e labirinto aquático. Em seguida, foram
eutanasiados e o corpo estriado, córtex e hipocampo foram dissecados. O corpo estriado
foi utilizado na preparação de homogenatos para dosagem de Dopamina e DOPAC em
HPLC. Homogenatos de estriado, hipocampo e córtex foram preparados para avaliar a
atividade antioxidante com dosagem de malondialdeído (MDA) e nitrito. Fatias de
hipocampo foram separadas para a imunohistoquímica (iNOS, COX-2, TNF-α, GSK-3 e
HDAC). Cortes coronais do cérebro foram utilizados para determinar o percentual da
área de dano isquêmico cerebral por disfunção mitocondrial (TTC). Resultados: O dano
isquêmico reduziu a atividade locomotora dos animais e o tratamento com AV
associado e não ao lítio reverteu este efeito; assim como a memória espacial que foi
recuperada após tratamento com AV e lítio em todas as doses utilizadas. A lesão no
corpo estriado refletiu em redução nos níveis de monoaminas e estes valores foram
aumentados com uso do AV associado e não ao lítio. Os níveis de MDA e nitrito foram
significativamente aumentados em estriado, córtex e hipocampo quando comparados ao
grupo controle. O tratamento com AV protegeu o estriado apenas na menor dose 25
mg/kg, mas no córtex e hipocampo a proteção foi efetiva em todas as doses utilizadas.
Além disso, houve uma diminuição nas células imunocoradas para iNOS, COX-2, TNFα, GSK-3 e HDAC nos grupos tratados com AV associado e não ao lítio em
comparação com o grupo isquemiado. O AV associado e não ao lítio reduziu a área de
infarto cerebral em todas as doses prevenindo os animais dos déficits neurológicos após
a isquemia cerebral. Conclusão: O tratamento dos animais com AV associado e não ao
lítio exerceu propriedades neuroprotetoras contra danos comportamentais e cognitivos,
neuroquímicos e histológicos, em modelo de isquemia cerebral global. Contudo, a
combinação de AV e lítio demonstrou aumentar os benefícios terapêuticos pós-dano
isquêmico. Com isso, levanta-se a possibilidade de que o co-tratamento de ácido
valpróico com lítio pode produzir efeitos sinérgicos ou mais fortes contra a morte de
células neuronais em condições neurodegenerativas.
Palavras-chave: Ácido valpróico, Lítio, Isquemia Cerebral
Neuroprotetores, Doenças Neurodegenerativas.
Global,
Efeitos
ABSTRACT
EVALUATION OF THE NEUROPROTECTIVE EFFECT OF VALPROIC
ACID ALONE OR ASSOCIATED WITH LITHIUM IN ISCHEMIA MODEL
GLOBAL TRANSIENT IN RATS
Introduction / Objectives: Stroke is a pathological condition resulting from occlusion
or rupture of blood vessels precipitating a cascade of events that involve excitotoxicity,
inflammation, oxidative stress and cell death. The VA has been presenting
neuroprotective effects in animal models and cell of neurodegenerative diseases,
including stroke. Thus, we aimed to study the neuroprotective effects associated VA
and not to lithium in an experimental model of global cerebral ischemia in rats.
Methods: The treatment started 1 hour before the surgery and 7 days with VA (25, 50
and 100 mg / kg / day , V.O.) and VA in the same doses associating to lithium (10 mg /
kg, i.p. ). The animals were anesthetized with ketamine (75 mg / kg, i.p.) and xylazine 2
% (10 m / kg, i.p.) and submitted to the global cerebral ischaemia and reperfusion for 30
min. After seven days were performed behavioral tests, open field and water maze.
Then, they were euthanized and striatum, cortex and hippocampus were dissected. The
striatum was used for the preparation of homogenates for dosage Dopamine and
DOPAC HPLC. Homogenates of striatum, hippocampus and cortex were prepared to
evaluate the antioxidant activity with malondialdehyde for dosage (MDA) and nitrite.
Coronal sections of the brain were used to determine the percentage of the area of
cerebral ischemic damage mitochondrial dysfunction (TTC). Hippocampal Slices were
separated for immunohistochemistry (iNOS, COX -2, TNF- α, GSK-3 e HDAC).
Results: The ischemic damage reduced the locomotor activity of animals and treatment
with associated VA and not to lithium reversed this effect; as well as memory space that
was recovered after treatment with lithium VA at all the doses used. The lesion in the
striatum reflected in a reduction in the levels of monoamines and these values were
increased with the use of associated and not to lithium VA. MDA and nitrite levels were
significantly increased in striatum, hippocampus and cortex compared with the control
group. Treatment with protected VA spline only at the lowest dose 25 mg / kg , but the
cortex and hippocampus protection was effective at all doses used. Furthermore, there
was a decrease in cells immunostained for iNOS, COX -2, TNF- α, GSK -3 and HDAC
the groups treated with associated AV and not to lithium compared to the ischemic
group. The VA and not associated with lithium reduced the cerebral infarct area at all
doses preventing the animals from neurological deficits after cerebral ischemia.
Conclusion: Treatment of animals with VA associated and not to lithium exerted
neuroprotective properties against behavioral and cognitive, neurochemical and
histological damage in global cerebral ischemia model. However, the combination of
VA and lithium show to increase post- ischemic damage therapeutic benefits. Thereby,
the possibility arises that co-treatment with lithium and valproic acid can produce
stronger or synergistic effects against neuronal cell death in neurodegenerative
conditions.
Keywords: Valproic Acid, Lithium, Cerebral Ischemia Global, Neuroprotective Effects,
Neurodegenerative Diseases.
LISTA DE FIGURAS
Figura 01. Diagrama sistemático da sinapse glutamatérgica em condições normais e em 26
condições isquêmicas (Adaptado de ALLEN et al., 2004).
Figura 2. Estrutura química do ácido valpróico. Fonte: USP 33, 2010.
29
Figura 03. Fonte: http://www.auladeanatomia.com/cardiovascular/arterias.htm
36
Figura 04: Procedimento cirúrgico, incisão medial na altura da traquéia com exposição da 41
carótida. Fonte: Estácio FMJ. SANTOS (2016).
Figura 05. Teste para avaliar a atividade locomotora no aparato do campo aberto. Aparato do 43
campo aberto do Laboratório de Biofisiologia e Farmacologia, Estácio FMJ. Fonte: SANTOS
(2015).
Figura 06. Labirinto aquático. Adaptado de Richard G. Morris (1981). Disponível em:
44
http://en.wikipedia.org. Acesso em: 20/01/2016.
Figura 07- Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li (10mg/kg, ip) 52
sobre a atividade locomotora de ratos no teste do campo aberto. Os valores representam a média
± EPM do número de cruzamentos durante 5 min.
Figura 08- Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li (10mg/kg, ip) 54
sobre a atividade rearing de ratos no teste do campo aberto. Os valores representam a média ±
EPM do número de rearing durante 5 min.
56
Figura 09- Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li (10mg/kg, ip)
sobre a atividade grooming de ratos no teste do campo aberto. Os valores representam a média
± EPM do número de grooming durante 5 min.
Figura 10- Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li (10mg/kg, ip) no 59
teste de labirinto aquático. Os valores representam a média ± EPM do número de grooming
durante 5 min.
Figura 11- Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) ou associado ao lítio sobre as concentrações 62
de DA em corpo estriado de ratos após serem submetidos à isquemia cerebral global através de
HPLC. Os valores representam a média ± EPM.
Figura 12- Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li (10mg/kg, ip) 63
sobre as concentrações de DOPAC em corpo estriado de ratos após serem submetidos à
isquemia cerebral global através de HPLC. Os valores representam a média ± EPM.
Figura 13- Efeitos da AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li (10 mg/kg ip) 66
sobre os níveis de malondialdeído (MDA), utilizado como índice de peroxidação lipídica, no
corpo estriado de ratos após serem submetidos à isquemia cerebral global. Os valores
representam a média ± EPM.
Figura 14 - Efeitos da AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao lítio (10 mg/kg ip) 68
sobre os níveis de malondialdeído (MDA), utilizado como índice de peroxidação lipídica, no
córtex pré-frontal de ratos após serem submetidos à isquemia cerebral global. Os valores
representam a média ± EPM.
Figura 15 - Efeitos da ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não ao lítio (10 71
mg/kg ip) sobre os níveis de malondialdeído (MDA), utilizado como índice de peroxidação
lipídica, no hipocampo de ratos após serem submetidos à isquemia cerebral global. Os valores
representam a média ± EPM.
Figura 16 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao lítio (10mg/kg, ip) 74
sobre a concentração de nitrito no corpo estriado de ratos 7 dias após serem submetidos à
isquemia cerebral global. Os valores representam a média ± EPM.
Figura 17 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao lítio (10mg/kg, ip) 76
sobre a concentração de nitrito no córtex pré-frontal de ratos 7 dias após serem submetidos à
isquemia cerebral global. Os valores representam a média ± EPM.
Figura 18 - Efeitos do ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não ao lítio 78
(10mg/kg, ip) sobre a concentração de nitrito no hipocampo de ratos 7 dias após serem
submetidos à isquemia cerebral global. Os valores representam a média ± EPM.
Figura 19 - Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para iNOS na área 81
CA1 hipocampal 7 dias após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100
mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade óptica obtida
através do programa Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste
post hoc.
Figura 20 - Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para iNOS na área 81
CA3 hipocampal 7 dias após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100
mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade óptica obtida
através do programa Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste
post hoc.
Figura 21 - Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para iNOS na área 82
do córtex (CT) após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100 mg/kg. Escala
200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através do
programa Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
Figura 22 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para iNOS na área 82
do giro dentado (GD) após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100 mg/kg.
Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através
do programa Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
Figura 23 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para COX-2 na área 84
CA1 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100 mg/kg.
Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através
do programa Image J®. ANOVA de duas vias seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
Figura 24 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para COX-2 na área 84
CA3 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100 mg/kg.
Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através
do programa Image J®. ANOVA de duas vias seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
Figura 25 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para COX-2 na área 85
CT hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100 mg/kg. Escala
200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através do
programa Image J®. ANOVA de duas vias seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
Figura 26 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para COX-2 no giro 85
dentado (GD) hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100
mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida
através do programa Image J®. ANOVA de duas vias seguido por Newman Keuls como teste
post hoc.
Figura 27 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para TNF-α na área 86
CA1 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100 mg/kg.
Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através
do programa Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
Figura 28 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para TNF-α na área 87
CA3 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100 mg/kg.
Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através
do programa Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
Figura 29 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para TNF-α no CT 87
hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100 mg/kg. Escala
200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através do
programa Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
Figura 30 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para TNF-α no GD 88
hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100 mg/kg. Escala
200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através do
programa Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
Figura 31 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para TNF-α na área 89
CA1 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100 mg/kg.
Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através
do programa Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
Figura 32 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para TNF-α na área 90
CA3 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100 mg/kg.
Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através
do programa Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
Figura 33 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para TNF-α no giro 91
dentado (GD) hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 50 e 100
mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida
através do programa Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste
post hoc.
Figura 34 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para GSK-3 na área 92
CA1 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses 100 mg/kg e lítio. Escala
200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através do
programa Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
Figura 35 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para GSK-3 no CT 93
hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 100 mg/kg e lítio. Escala
200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através do
programa Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
Figura 36 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para gsk-3 no GD 93
hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 100 mg/kg e lítio. Escala
200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através do
programa Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
Figura 37 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para HDAC na área 95
CA1 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 100 mg/kg sozinho e
associado ao lítio. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade
ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls
como teste post hoc.
Figura 38 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para HDAC no GD 96
hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de 100 mg/kg sozinho e
associado ao lítio. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade
ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls
como teste post hoc.
Figura 39 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não ao lítio (10mg/kg, ip) 97
sobre o dano cerebral de ratos submetidos à isquemia cerebral. Os valores representam a média
± EPM. Para análise estatística foi utilizado ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls
como teste post hoc. Valores significativos com p<0,05. a e b quando comparado ao grupo falso
operado (FO) e isquemiado (ISQ), respectivamente.
Figura 40 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não ao lítio (10mg/kg, ip) 98
sobre o dano cerebral de ratos submetidos à isquemia cerebral. Os valores representam a média
± EPM. Para análise estatística foi utilizado ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls
como teste post hoc. Valores significativos com p<0,05. a e b quando comparado ao grupo falso
operado (FO) e isquemiado (ISQ), respectivamente.
LISTA DE ABREVIATURAS
ACM Artéria cerebral média
ALE Atividade locomotora espontânea
ANOVA Análise de variância
ATP Adenosina trifosfato
AVE Acidente vascular encefálico
AVCi Acidente vascular encefálico isquêmico
AVP Ácido valpróico
BDNF Fator neurotrófico derivado do encéfalo
CA Corno Amon
CEPA Comissão de Ética em Pesquisa Animal
CONCEA Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal
COX-2 ciclooxigenase-2
CT Córtex cerebral
CTE Cadeia de transporte de elétrons
CXCR4 Receptor de quimioquina CXC4
DA Dopamina
DAB Diaminobenzidina
DAG Diacilglicerol
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico
DOPAC Ácido 3,4-diidroxifenilacético
EPM Erro padrão da média
ERK Proteína cinase regulada por sinal extracelular
EROs Espécies reativas de oxigênio
ERNs Espécies reativas de nitrogênio
FO Falso-operado
FDA Food and Drug Administration
GABA Ácido gaba-aminobutírico
GD Giro denteado
GRP78 Proteína de estresse do retículo endoplasmático
GSK-3 Glicogênio sintase quinase 3
HAT Histona acetil transferase
HDACs Histonas desacetilases
HPLC High Performance Liquid Chromatography
ICG Isquemia cerebral global
ICT Isquemia cerebral transitória
IMP Inositol monofosfatase
ISQ Isquemiados
IL-1β Interleucina-1 beta
LCR Líquido cefalorraquidiano
MDA Malondialdeído
MME Membrana mitocondrial externa
MMI Membrana mitocondrial interna
NF-kB Fator nuclear kappa b
NMDA N-Metil-D-Aspartato
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintase
iNOS Óxido nítrico sintase induzida
PIP2 Fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato
PKC Proteína cinase C
RLs Radicais livres
RNA Ácido ribonucleico
SDF-1α Fator derivado de célula estromal
SNC Sistema nervoso central
TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TNF-α Fator de necrose tumoral-alfa
LISTA DE QUADROS
Quadro 01. Principais modelos de isquemia cerebral.
34
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 – Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li 53
(10mg/kg, ip) sobre a atividade locomotora de ratos após serem submetidos à
isquemia cerebral global no teste do campo aberto.
Tabela 02 – Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li 55
(10mg/kg, ip) sobre a atividade de rearing de ratos após serem submetidos à
isquemia cerebral global no teste do campo aberto.
Tabela 03 – Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li 57
(10mg/kg, ip) sobre a atividade grooming de ratos após serem submetidos à
isquemia cerebral global no teste do campo aberto.
Tabela 04 – Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li 60
(10mg/kg, ip) no teste de labirinto aquático.
Tabela 05 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao lítio 64
sobre as concentrações de dopamina e DOPAC em corpo estriado de ratos após
serem submetidos à isquemia cerebral global através de HPLC.
Tabela 06 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li 67
(10 mg/kg ip) sobre os níveis de malondialdeído (MDA) utilizado como índice de
peroxidação lipídica, no estriado de ratos após serem submetidos à isquemia
cerebral global.
Tabela 07 - Efeitos do ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não 69
ao lítio (10 mg/kg ip) sobre os níveis de malondialdeído (MDA), utilizado como
índice de peroxidação lipídica, no córtex de ratos após serem submetidos à
isquemia cerebral global.
Tabela 08 - Efeitos do ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não 72
ao lítio (10 mg/kg ip) sobre os níveis de malondialdeído (MDA), utilizado como
índice de peroxidação lipídica, no hipocampo de ratos após serem submetidos à
isquemia cerebral global.
Tabela 09 - Efeitos do ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não 75
ao lítio (10mg/kg, ip) sobre os níveis de nitrito no estriado de ratos 7 dias após
serem submetidos à isquemia cerebral global.
Tabela 10 - Efeitos do ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não 77
ao lítio (10mg/kg, ip) sobre os níveis de nitrito no córtex pré-frontal de ratos 7 dias
após serem submetidos à isquemia cerebral global.
Tabela 11 - Efeitos do ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não 79
ao lítio (10mg/kg, ip) sobre os níveis de nitrito no hipocampo de ratos 7 dias após
serem submetidos à isquemia cerebral global.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
19
1.1 Acidente Vascular Cerebral (AVC)
19
1.1.1 Definição e Classificação
19
1.1.2 Epidemiologia
20
1.2 Aspectos Fisiopatológicos do Acidente Vascular Cerebral
Isquêmico
21
1.2.1 AVC Isquêmico e Neuroinflamação
21
1.2.2 Estresse oxidativo
23
1.2.3 Excitotoxicidade e Ca2+
25
1.2.4. A mitocôndria e o AVC
27
1.3 Ácido Valpróico
28
1.3.1. Farmacologia clínica
28
1.3.2 Histonas Desacetilases (HDACs) e o Ácido valpróico como inibidor de 30
HDACs
1.3.3 Ácido Valpróico e Lítio
32
1.4 Modelos experimentais do AVC isquêmico
34
2. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
38
3.OBJETIVOS
39
Geral
39
Específicos
39
4. METODOLOGIA
40
4.1 Animais
40
4.2 Drogas e reagentes
40
4.3 Modelo experimental de isquemia cerebral global
40
4.4 Estudo comportamental
43
4.4.1 Teste do Campo Aberto ou “Open Field”
43
4.4.2 Teste do Labirinto Aquático (Water Maze) - Memória Espacial
44
4.4.3 Avaliação de neurotransmissores, marcadores do estresse oxidativo e 45
mediadores inflamatórios
4.4.3.1 Dissecção das áreas cerebrais
45
4.4.3.2 Determinação dos níveis de monoaminas e metabólitos através de HPLC
45
4.4.3.3 Determinação da peroxidação lipídica através da dosagem de substâncias 47
reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)
4.4.3.4 Determinação do conteúdo de nitrito
47
4.4.3.5 Avaliação da Área de Infarto Cerebral Isquêmico - Cloreto de 2,3,5 48
Trifeniltetrazol (TTC)
4.4.3.6 Avaliação da expressão da iNOS, COX-2 e TNF-α.
49
4.5 Análise estatística
50
5. RESULTADOS
51
5.1 Testes comportamentais
51
5.1.1 Efeitos do ácido valpróico em associação e não com o lítio sobre a atividade 51
locomotora através do teste do campo aberto em ratos após serem submetidos à
isquemia cerebral global transitória
5.1.2 Efeitos do ácido valpróico em associação e não com o lítio sobre o 58
aprendizado e a memória espacial no teste do labirinto aquático em ratos após
serem submetidos à isquemia cerebral global
5.2 Resultados: Dosagem de Monoaminas através de HPLC
61
5.2.1 Efeitos do ácido valpróico associado e não ao lítio sobre os níveis de DA e 61
DOPAC no corpo estriado de ratos após serem submetidos à isquemia cerebral
global
5.3 Atividade antioxidante
65
5.3.1 Efeitos do ácido valpróico associado e não ao lítio sobre a peroxidação 65
lipídica (tbars) no estriado, córtex cerebral e hipocampo de ratos após serem
submetidos à isquemia cerebral global
5.3.2 Efeitos do ácido valpróico associado e não ao lítio sobre a concentração de 73
nitrito no estriado, córtex cerebral e hipocampo de ratos após serem submetidos à
isquemia cerebral global
5.4 Análise histológica e imunohistoquímica
80
5.4.1 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio na imunomarcação 80
para a enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) nas áreas CA1, CA3, CT e
GD do hipocampo de ratos jovens submetidos à isquemia cerebral global
5.4.2 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio na imunomarcação 83
para enzima ciclooxigenase – 2 (COX-2) nas áreas CA1, CA3, CT e GD do
hipocampo de ratos jovens submetidos à isquemia cerebral global
5.4.3 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio na imunomarcação 86
para fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) nas áreas CA1, CA3, CT e GD do
hipocampo de ratos jovens submetidos à isquemia cerebral global
5.4.4 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio na imunomarcação 92
para a glicogênio sintase cinase-3 (GSK-3) nas áreas CA1, CT e GD do
hipocampo de ratos jovens submetidos à isquemia cerebral global
5.4.5 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio na imunomarcação 94
para a histona desacetilase (HDAC) nas áreas CA1 e GD do hipocampo de ratos
jovens submetidos à isquemia cerebral global
5.4 Efeitos do ácido valpróico associado e não ao lítio sobre o dano cerebral de 97
ratos após serem submetidos à isquemia cerebral global.
6. DISCUSSÃO
99
7. CONCLUSÕES
110
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
111
P á g i n a | 24
1. INTRODUÇÃO
1.1 Acidente Vascular Cerebral (AVC)
1.1.1 Definição e Classificação
O acidente vascular cerebral (AVC) é uma condição patológica decorrente da
oclusão ou rompimento de vasos sanguíneos, sendo caracterizado pela redução
acentuada ou ausência de suplementos orgânicos ao cérebro como oxigênio e uma série
de substratos vitais. Em geral o acidente vascular encefálico induz morte ou disfunção
de células cerebrais, bem como prejuízos neurológicos que refletem na localização e no
tamanho da área cerebral atingida. O AVC é comumente dividido em duas categorias, a
primeira e mais frequente é o AVC isquêmico ou tromboembólico, o qual se deve a uma
interrupção do suprimento sanguíneo resultante da oclusão de um vaso, a segunda
categoria é o AVC hemorrágico, o qual envolve sangramento no parênquima cerebral
ou no espaço subaracnóideo (BROUNS; DE DEYN, 2009).
O AVC isquêmico representa cerca de 80% de todos os casos registrados no
mundo, sendo desencadeado a partir da oclusão das principais artérias que levam sangue
ao encéfalo, as artérias carótidas e as artérias vertebrais, em decorrência da formação de
um trombo, refletindo em uma menor mortalidade (15 a 20%), quando comparado ao
AVC hemorrágico (BROUNS; DE DEYN, 2009). Os mecanismos que conduzem a
morte celular durante a evolução do quadro são de extrema complexidade, incluindo
neuroinflamação, excitotoxicidade, desequilíbrio iônico e estresse oxidativo (LO et al.,
2003).
A integridade do cérebro depende do contínuo suprimento de sangue, de
oxigênio e glicose, de modo a atender às demandas energéticas do tecido. A cessação ou
redução intensa do fluxo sanguíneo cerebral resulta em déficits funcionais e
bioquímicos que se tornam rapidamente irreversíveis, caso o fluxo sanguíneo não seja
prontamente restaurado (BRUNO et a., 2009).
O AVC isquêmico promove uma lesão irreversível e subseqüente disfunção
neurofisiológica afetando principalmente a memória e a aprendizagem. Eventos como a
ativação de receptor de glutamato, o aumento no nível de cálcio intracelular e a
formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) são conhecidos na patogênese da
lesão neuronal decorrentes da isquemia cerebral. O edema e a resposta inflamatória
P á g i n a | 25
exacerbam a destruição do tecido. Assim, abordagens para melhorar a lesão cerebral
induzida pela isquemia têm sido investigadas, incluindo a interferência da ação
excitatória do glutamato, prevenção da sobrecarga de cálcio intracelular e remoção das
EROs (OKABE et al., 2011).
O diagnóstico do AVC é feito por meio de uma avaliação neurológica, onde a
observação da presença de sinais clínicos é fundamental, tais como, déficits motores,
alterações na marcha e na fala. No entanto, a tomografia computadorizada (TC) do
crânio é o principal exame para o desfecho do diagnóstico e a agilidade no atendimento
permite um prognóstico diferencial na reabilitação do paciente. Fármacos como,
anticoagulantes (heparina) e antiplaquetários (ácido acetil-salicílico) são os principais
medicamentos utilizados na clínica (PERSSON et al., 2014).
Com isso, a busca por terapias bem sucedidas ainda são objetos de estudos
experimentais e clínicos em modelos animais já estabelecidos, visto que alguns estudos
mostram que drogas como ácido valpróico e lítio exibem propriedades neuroprotetoras e
podem exercer efeitos benéficos sobre a isquemia cerebral e outras doenças cerebrais.
1.1.2 Epidemiologia
De acordo com dados da Organização Mundial de Saúde (OMS, 2013), entre os
anos de 2000 e 2011, o AVC representa a segunda causa de morte em todo o mundo,
sendo responsável por cerca de seis milhões de mortes por ano. Em muitos países
latino-americanos e caribenhos, o AVC já é a primeira ou segunda causa de morte,
embora na última década, as taxas estejam em declínio (LAVADOS et al., 2007). O
Ministério da Saúde revela que o AVC é a principal causa de morte no Brasil e os dados
são crescentes. No ano de 2000 foram notificadas 84.130 mortes e em 2010 esse
número aumentou para 99.726 (SCHIMIDT, 2014).
Segundo a Associação Brasileira de AVC, o acidente vascular encefálico é a
primeira causa de morte e incapacidade no Brasil, com grande impacto econômico e
social. É a segunda causa de morte no mundo segundo dados da OMS. Atinge
aproximadamente 16 milhões de pessoas por ano, e destas 6 milhões chegam à óbito.
No Brasil ocorrem cem de 100 mil óbitos por ano devido ao AVE (LOTUFO, 2005;
WHO, 2011).
De acordo com a Sociedade Beneficente Israelita Brasileira Albert Einstein
(2011), os sintomas mais comuns do AVC são enfraquecimento, adormecimento ou
P á g i n a | 26
paralisia da face, dificuldade de falar e deglutir, alteração na visão, tontura e fortes
dores de cabeça. É freqüente em adultos, sendo uma das maiores causas de morbimortalidade em todo o mundo (EINSTEIN, 2011; GILES; ROTHWELL, 2008).
No Brasil, apesar do declínio nas taxas de mortalidade, ainda é a principal causa
de morte. A incidência de AVC dobra a cada década após os 55 anos (RODGERS,
2004), ocupando posição de destaque entre a população idosa. A prevalência mundial na
população geral é estimada em 0,5% a 0,7%. Além de elevada mortalidade, a maioria
dos sobreviventes apresenta seqüelas, com limitação da atividade física e intelectual e
elevado custo social (NICOLETTI et al., 2000).
O AVC pode levar à incapacidade indivíduos em idade produtiva e isso tem um
impacto econômico relevante. Dados do Instituto Nacional de Seguridade Social
demonstram que o AVC é responsável por 40% das aposentadorias precoces no Brasil
(FALCÃO et al., 2004). Os principais fatores de risco para o AVC são dislipidemia,
hipertensão arterial, diabetes mellitus, sedentarismo, obesidade e tabagismo (ZHENG,
2014).
1.2 Aspectos Fisiopatológicos do Acidente Vascular Cerebral Isquêmico
1.2.1 AVC Isquêmico e Neuroinflamação
O AVC isquêmico, ou simplesmente, isquemia encefálica desencadeia um
evento multifatorial e de extrema complexidade em que a inflamação contribui para o
dano cerebral. Isto é evidente na circulação sistêmica como a neutrofilia, o
linfocitopenia e níveis aumentados dos monócitos. Ocorre um rápido acúmulo de
neutrófilos no cérebro e transmigração de moléculas de adesão que são associados com
a sinalização de citocinas (ROSS et al., 2007).
Muitas pesquisas têm mostrado que a inflamação se desenvolve dentro de
algumas horas após isquemia cerebral . Esta reação inflamatória envolve o acúmulo de
neutrófilos, monócitos e leucócitos no cérebro. O dano induz a produção e liberação de
citocinas, tais como TNF-α, IL-1ß, IL-6 e iNOS, por uma variedade de células, como
células endoteliais, microglia, neurônios, leucócitos, plaquetas, monócitos, macrófagos
e fibroblastos (FEUERSTEIN, 1994; HUANG, 2006; AIDA et al., 2011).
O padrão da resposta inflamatória de citocinas pode ser diferente dependendo do
tipo e da localização do dano cerebral. A região isquêmica consiste em duas partes: o
P á g i n a | 27
núcleo isquêmico e a penumbra, ambos são reconhecidos na prática clínica. Assim, a
neuroinflamação é em princípio um mecanismo de defesa destinado a neutralizar e
restaurar a estrutura e função do cérebro após o dano. A neuroinflamação pode ser vista
como um mecanismo protetor que isola o tecido cerebral danificado das áreas ilesas
destroem células afetadas e reparam a matriz extracelular (CORREALE et al., 2004).
Todas as células do cérebro participam destas respostas inflamatórias, além dos
neurônios, algumas células da neuroglia, incluindo microglia, macrófagos, astrócitos
(fibrosos e protoplasmáticos) e oligodentrócitos. Os mediadores principais da
neuroinflamação são as células gliais, constituindo 70% da população total das células
do sistema nervoso central. Assim, células da microglia mostram uma rápida resposta
que envolve a migração celular, proliferação e liberação de citocinas e fatores tróficos.
(DIAMOND et al., 1999).
Nos últimos anos as células gliais têm recebido uma atenção crescente pelo seu
papel nos eventos entre a atividade sináptica e o metabolismo da glicose
(MAGISTRETTI et al., 1999; HYDER et al., 2006). No núcleo, a ativação do NF-kB
promove a expressão gênica e media a transcrição de muitos genes envolvidos na
resposta inflamatória (por exemplo TNF-α, IL-1ß, IL-6, iNOS). De acordo com dados
de muitas revisões a neuroinflamação é um processo complexo e envolve numerosos
caminhos e moléculas bioativas que atuam no cérebro (YAMAMOTO et al., 2004).
Outra conseqüência significativa da isquemia encefálica é a inibição da
fosforilação oxidativa mitocondrial e a queda da produção de adenosina trifosfato
(ATP), ocasionando falência energética. A falta de energia celular provoca vários danos
na célula, dentre eles, a falência da bomba de sódio-potássio (Na+/ K+), o que leva a um
maior acúmulo de Na+ intracelular e perda de K+ para o meio extracelular, com
conseqüente edema celular e de suas respectivas organelas. Concomitantemente, ocorre
um aumento do influxo de Ca2+ e de Cl- para o meio intracelular. Além disso, são
observadas alterações como, massiva liberação de glutamato das vesículas sinápticas,
lipólise e acúmulo de lactato, tornando a célula acidótica (GALVÃO et al., 2005).
Modelos experimentais sugerem o envolvimento de diversas citocinas,
principalmente TNF- α e IL-6 no dano isquêmico cerebral (CARTER et al., 1993;
DIHNE et al., 2001). O TNF- α e a interleucina-1ß (IL-1ß) encontram-se elevados após
isquemia cerebral, podendo induzir uma reação inflamatória no SNC, juntamente com a
IL-6. Tais citocinas parecem modular diretamente o processo de apoptose das células no
SNC, promovendo diferenciação, proliferação e subseqüente infiltração leucocitária
P á g i n a | 28
(PULERA et al., 1998). Em adultos, tem sido demonstrada a correlação direta entre os
níveis de IL-6 e TNF-α no líquido cefalorraquidiano e o prognóstico neurológico após
isquemia cerebral aguda (VILA et al., 2000).
O TNF-α é uma citocina pleiotrópica produzida por muitos tipos de células, e
está envolvido na barreira hematoencefálica, na inflamação e em alterações vasculares
associadas à lesão cerebral (BARONE et al., 1997; AIDA et al., 2011) . O TNF-α tem
sido sugerido para estimular a angiogénese após isquemia através da expressão induzida
de genes relacionados a angiogênese (LIMB, 1996; GOUKASSIAN, 2007). É
conhecido como um forte immunomediador e citocina pró-inflamatória, a qual é
rapidamente regulado no cérebro após a lesão e está associada com necrose ou apoptose
(LIU et al., 1994). Os efeitos do TNF-α são mediados através de dois receptores, o
TNF-R1 (p55) e TNF-R2 (p75) na superfície da célula. TNF-R1 é expresso em todos os
tipos de células. Esta é uma importante sinalização para receptor de TNF-α. O TNF-R2
é expresso primariamente em células endoteliais e hematopoiéticas, responde às a forma
ligada à membrana do TNF-α, e medeia respostas biológicas limitados (WAJANT et al.,
2003). O NF-κB é um factor de transcrição essencial para controlar a expressão de
vários genes envolvidos na inflamação e a proliferação de células (BARNES et al.,
1997; GE et al., 2007).
1.2.2 Estresse oxidativo
Define-se estresse oxidativo como sendo um distúrbio no balanço entre
compostos oxidantes e antioxidantes em favor da geração excessiva de radicais livres
(RLs) ou em detrimento da velocidade de remoção desses, desencadeando reações
potencialmente deletérias em lipídeos, proteínas, RNAs e DNA. Essas reações podem
incluir: peroxidação dos ácidos graxos das membranas celulares; oxidação dos grupos
sulfidrila e inativação enzimática; inibição da síntese de ATP e consumo das reservas de
dinucleotídeos adenínicos da nicotinamida; inibição da bomba de Na+/K+ e alterações
do DNA que levam à mutagênese ou apoptose (LOH et al., 2010; SUN et al., 2009).
Os átomos e as moléculas possuem uma estrutura formada por elétrons que
normalmente ligam-se em pares. Os RLs são espécies extremamente reativas que
contêm um ou mais elétrons não pareados. Em sistemas biológicos os RLs gerados a
partir de oxigênio e nitrogênio são classificados como espécies reativas de oxigênio
(EROs) e espécies reativas de nitrogênio (ERNs) respectivamente. Tais radicais são
P á g i n a | 29
produzidos fisiologicamente devido ao metabolismo celular e são controlados por
sistemas antioxidantes enzimáticos e/ou não enzimáticos. Além disso, integram a
resposta fisiológica respondendo a estímulos nocivos como, por exemplo, agentes
infecciosos. Em concentrações baixas e moderadas participam de cascatas de
sinalização celular e, dessa maneira, modulam genes envolvidos no reparo de DNA, no
controle do ciclo celular, da resposta inflamatória e morte celular como, apoptose
(VALKO, 2007; LU et al., 2010).
A peroxidação lipídica é uma das consequências de aumento de EROs e referese à deteriorização oxidativa de lipídios que contenham carbono insaturados, tais como
ácidos graxos insaturados, glicolipídeos, ésteres de colesterol e colesterol. As EROs
atacam os ácidos graxos poliinsaturados e grupamentos metil com átomos de hidrogênio
reativos, ocorrendo reações em cadeia e como resultado ocorre a produção de
malonaldeído (MDA). A peroxidação lipídica altera estrutura e permeabilidade de
membranas celulares e pode culminar com a morte celular (LÜ et al., 2010).
O estresse oxidativo representa uma dos principais responsáveis pelo dano
tecidual promovido por isquemia. O cérebro apresenta elevado consumo de oxigênio,
auto-oxidação de alguns neurotransmissores (norepinefrina e dopamina), elevados
níveis de ácidos graxos poliinsaturados, capacidade antioxidante relativamente baixa e
um limitado sistema de reparo celular que o torna particularmente suscetível ao estresse
oxidativo (LOH et al., 2010; SUN et al., 2009). A reperfusão restaura a oferta de
nutrientes, porém, por fornecer oxigênio a região em desequilíbrio metabólico, resulta
na potencialização do estresse oxidativo.
O óxido nítrico é sintetizado pela enzima óxido nítrico sintetase (iNOS) a partir
do aminoácido L-arginina, no cérebro são detectadas três isoformas dessa enzima, a
nNOS que é produzida por neurônios, a eNOS, sintetizada por células endoteliais, essas
duas isoformas apresentam-se de forma constitutiva no citoplasma e a iNOS, uma
isoforma induzida por processos patológicos que é produzida por macrófagos e células
gliais, como astrócitos e microglia (MORO et al, 2005).
O óxido nítrico está envolvido em diversos processos fisiológicos incluindo
neurotransmissão, regulação da pressão arterial, mecanismos de defesa, relaxamento da
musculatura lisa e regulação da imunidade (BERGENDI et al., 1999). Durante eventos
isquêmicos o aumento de concentração de Ca2+ citoplasmático mediada pelo glutamato
leva ao aumento da síntese do NO. Este atua dilatando vasos e, dessa maneira,
aumentando a oferta de glicose e oxigênio, mas também é capaz de reagir com o radical
P á g i n a | 30
superóxido (O2 −•) levando a danos nitrosativos (ESPEY et al., 2000). O estresse
nitrosativo promovido pelo peroxinitrito danifica proteínas, lipídeos de membrana e
DNA.
Determinadas regiões do cerebrais, como o corpo estriado, córtex e
particularmente o hipocampo são mais susceptíveis ao dano isquémico (KINDY et al.,
1992). No hipocampo, os neurônios piramidais da região CA1 sofrem morte tardia após
a lesão (KIRINO, 1982; NITATORI et al., 1995; RAO et al., 2000). Várias evidências
indicam que o estress oxidativo contribui para a morte neuronal tardia depois de
isquemia global cerebral, sugerindo que a formação de EROs participa de uma série de
eventos moleculares que vinculam a lesão isquêmica à morte celular neuronal. Assim, a
elucidação do papel do estresse oxidativo no cérebro após isquemia-reperfusão é de
grande valia. Uma melhor compreensão dos fatores que influenciam a formação de
EROs é necessária para a intervenção antioxidante eficaz e para ampliar os
conhecimentos a respeito dos mecanismos fisiopatológicos da isquemia cerebral
(KITAGAWA et al., 1990; HALL et al., 1993; OOSTVEEN et al., 1998).
1.2.3 Excitotoxicidade e Ca2+
O conceito de excitotoxicidade introduzido por Olney em 1969, foi baseado em
um conjunto de observações que incluía lesão neuronal com aplicação local de
glutamato e outros aminoácidos, como aspartato, N-metil-D-aspartato (NMDA),
homocisteína e cisteína. Uma vez que esta descrição foi publicada, outros
mediadores excitotóxicos foram delineados, incluindo catecolaminas, óxido nítrico
(NO) e espécies afins. O glutamato é o aminoácido excitatório mais abundante do
cérebro, exerce uma variedade de funções importantes (metabólica, neurotrófico, e
neurotransmissor) e é compartimentado em neurônios (FONNUM, 1984; CHOI, 1988;
IZUMI, 2006).
O termo
“excitotoxidade” passou
a ser empregado para indicar a
neurodegeneração mediada por aminoácidos excitatórios (OLNEY, 1969). A partir de
então, investiga-se o papel do glutamato em uma série de desordens do sistema nervoso
central (SNC). Atualmente, sabe-se que a excitotoxidade contribui para a lesão neuronal
em diversas neuropatologias, incluindo a isquemia, a epilepsia, o traumatismo crânioencefálico e as doenças neurodegenerativas, como a esclerose lateral amiotrófica (ELA),
P á g i n a | 31
o Mal de Parkinson e a Doença de Alzheimer (ARUNDINE & TYMIANSKI, 2003;
MATUTE et al, 2002).
Figura 01. Diagrama sistemático da sinapse glutamatérgica em condições normais e em
condições isquêmicas (Adaptado de ALLEN et al., 2004).
Um cérebro saudável tem a capacidade de absorver rapidamente o glutamato
extracelular. No entanto, sob condições em que as reservas de energia estão esgotadas,
como em hipóxia induzida por isquemia devido à despolarização celular, a liberação de
glutamato
no
meio
extracelular,
juntamente
com
a
sua
deficiente
absorção, resulta em aumentos do Ca2+ intracelular. Além disso, a interferência na
captação de cisteína (causando depleção dos níveis de glutationa celular responsáveis
para proteger contra o estresse oxidativo) resulta em lesão neuronal (BENVENISTE,
1984; CHOI, 1992).
A excitotoxicidade é um processo que induz morte neuronal amplamente
estudado e está envolvida em diversas patologias do sistema nervoso central como o
AVE (SATTLER; TYMIANSKI, 2001; DOBREK; THOR, 2011). O principal
mediador do dano excitotóxico é o íon Ca+2, um importante sinalizador celular. Em
condições fisiológicas o Ca+2 está envolvido com diversos processos celulares, incluindo
a atividade sináptica, a exocitose, a excitabilidade da membrana e o crescimento e a
diferenciação celulares (ARUNDINE & TYMIANSKI, 2003). Durante o período
isquêmico e o início da reperfusão a intensa liberação de glutamato, o acúmulo de Ca 2+
citoplasmático e o aumento dos radicais livres são características da fase de
P á g i n a | 32
excitotoxicidade. O glutamato desempenha um importante papel no desenvolvimento
neuronal e em processos de aprendizagem e memória. Os níveis de glutamato nas
sinapses são regulados através de transportadores dependente de sódio localizados na
membrana plasmática de neurônios e células gliais. A concentração sináptica de
glutamato se encontra na faixa micromolar, enquanto a concentração citosólica é
aproximadamente 10 mM (LEE et al., 2000).
Diversas vias contribuem para lesão neuronal excitatória no AVC isquêmico,
com excesso de Ca2+ citosólico desempenhando um papel precipitador (HARDMAN;
LIMBIRD; GILMAN, 2012). Em decorrência da despolarização da membrana neuronal
os canais de Ca2+ dependendes de voltagem tornam-se ativos, levando à entrada desse
íon e à liberação de glutamato para o meio extracelular. Outra consequência da falência
energética decorrente da isquemia é o acúmulo citoplasmático de Na+ em astrócitos, que
promove a reversão dos transportadores de glutamato e que contribui para acúmulo
desse neurotransmissor no meio extracelular. Além disso, a diminuição da oferta de
oxigênio e glicose durante o episódio da isquemia impede a manutenção da baixa
concentração de Ca2+ intracelular pela Ca2+ ATPase (DOYLE; SIMON; STENZELPOORE, 2008).
1.2.4. A mitocôndria e o AVC
A mitocôndria corresponde a um compartimento intracelular essencial para
fornecer ATP através do ciclo de Krebs, cadeia de transporte de elétrons (fosforilação
oxidativa), síntese de moléculas chaves (metabolismo de aminoácidos, ácidos graxos e
esteróides) e homeostase de cálcio (CHAN, 2006; CAMPELLO E SCORRANO, 2010;
DIMAURO & SCHON, 2003).
Morfologicamente, ela é constituída por quatro compartimentos: a membrana
mitocondrial externa (MME), a membrana mitocondrial interna (MMI), o espaço
intermembranoso e a matriz mitocondrial. Na MMI está localizada a cadeia de
transporte de elétrons (CTE), a mesma dobra-se para dentro da matriz formando
invaginações denominadas, cristas mitocondriais, que aumentam significativamente a
superfície de contato da MMI e consequentemente a eficiência da CTE. As alterações
estruturais da MMI, em numerosas cristas dilatadas ou inchadas foram consistentemente
implicadas em processos associados a apoptose e como resposta ao estresse oxidativo,
em várias doenças neurodegenerativas (TRIMMER et al., 2000; MANNELLA, 2008).
P á g i n a | 33
É a única organela da célula eucariótica, além do núcleo, que possui seu
próprio DNA e maquinaria para sintetizar RNAs e proteínas. Cada mitocôndria contém
várias cópias do DNA circular na matriz, que codifica 13 proteínas que são
componentes do sistema de fosforilação oxidativa (LARSSON, 2010).
Nos neurônios, as mitocôndrias não só se distribuem no pericário, como
também migram para os longos processos neuronais, incluindo os terminais dendríticos
e axonal. Além disso, estes processos neuronais são altamente ativos na transdução da
sinalização intracelular pela liberação de neurotransmissores a partir de sinapses,
requerendo grandes quantidades de energia (CHEN & CHAN, 2006).
As mitocôndrias têm sido implicadas na patogênese de uma ampla variedade
de doenças neurológicas, onde as sinapses são conhecidas por serem o alvo principal,
incluindo a Doença de Huntington (REDDY & SHIRENDEB, 2012), a Doença de
Parkinson (FERRER et al., 2012), a Doença de Alzheimer (LEE ET al., 2012), a doença
de Batten (LUIRO et al., 2006) e várias desordens psiquiátricas (MANJI et al., 2012).
A integridade das mitocôndrias é fundamental para vida da célula. O
rompimento de tal integridade induzido por estresse celular provoca uma redução na
produção de adenosina trifosfato (ATP), danos oxidativos e liberação de várias
proteínas mitocondriais pró-apoptóticas, tais como o citocromo c e o factor de indução
de apoptose, todos os quais estão envolvidos na patogênese de numerosas disorders. A
disfunção mitocondrial também desempenha um papel fundamental na lesão isquêmica
neuronal, e manter a integridade mitocondrial contra isquemia cerebral é uma resposta
celular muito importante.
1.5 Ácido Valpróico
1.3.1. Farmacologia clínica
O ácido valproico (AV) é um fármaco empregado no tratamento de convulsões,
atuando também como estabilizador do humor no tratamento de distúrbios bipolares e
como moderador da enxaqueca. Sua descoberta deu-se em 1963 por acaso quando era
usado como veículo para outros compostos rastreados para atividade anticonvulsivante.
O uso como medicamento foi liberado nos Estados Unidos em 1978 com o nome
comercial Depakene®, sendo produzido pela Abbott Laboratories (ABBOTT, 2009).
P á g i n a | 34
Figura 2. Estrutura química do ácido valpróico. Fonte: USP 33, 2010.
No que se refere aos aspectos farmacocinéticos o ácido valpróico é um fármaco
administrado por via oral e rapidamente absorvido, visto que é transportado ligado a
proteínas plasmáticas, principalmente a albumina, restando um pequeno volume para
distribuição. Sua metabolização ocorre a princípio no fígado, mas uma pequena parcela
é excretada sem metabolização (NURGE et al., 1991).
O ácido valpróico é indicado como monoterápico em crises convulsivas de
ausência, mioclônica, parciais e tônico-clônicas. Em geral, a dose inicial é de 15 mg/Kg
sendo aumentada semanalmente até a dose máxima de 60 mg/Kg. Doses fracionadas
devem ser administradas quando ultrapassar 250 mg. Indicado na epilepsia juvenil
mioclônica, contudo alguns efeitos tóxicos sistêmicos são observados (LEVISOHN;
HOLLAND, 2007). O AV também é usado como alternativa ao lítio em pacientes
portadores de desordem bipolar; em casos de depressão; enxaqueca e convulsões febris.
(MARTINDALE, 2005). Além disso, pode ser utilizado sozinho ou combinado com
outros fármacos em convulsões causadas por tumor de cérebro (MÉLANIE et al.,
2009).
Sabe-se que o ácido valpróico exerce múltiplos efeitos farmacológicos,
incluindo a sua capacidade de aumentar a neurotransmissão do ácido gabaaminobutírico (GABA), seja por aumento da biossíntese do neurotransmissor ou pela
inibição da degradação, além de reduzir a neurotransmissão de glutamato no cérebro
(WINTERER, 2003; HADDAD et al, 2009). Outro mecanismo importante é a ativação
prolongada dos canais de Na+ voltagem dependente, o qual limita a deflagração de
correntes elétricas em neurônios específicos (GILMAN, 2012).
Mediante estudos experimentais o uso crônico do AV exerce efeito
neuroprotetor, inibindo o estresse oxidativo em culturas de células corticais de ratos. O
tratamento por sete dias, em ratos, inibiu a peroxidação lipídica e oxidação protéica
induzida por FeCl, sugerindo que o tratamento com AV pode proteger neurônios contra
P á g i n a | 35
o estresse oxidativo e que isto pode estar envolvido em seu mecanismo de ação (WANG
et al., 2003).
Estudos demonstraram que o AV aumenta a expressão do GRP78 (proteína de
estresse do retículo endoplasmático) e a expressão do fator Bcl-2 antiapoptótico, ambos
em córtex de ratos. O GRP78 liga cálcio e dobra proteínas lesadas, o Bcl-2 estabiliza o
potencial de membrana mitocondrial, inibe liberação de citocromo c e ambos inibem
acumulação de oxirradicais (GESSA et al., 1995; HAIM, 2006).
Em alguns casos, o AV também inibe a atividade da glicogênio sintase-quinase3 (GSK-3), reforçando a fosforilação de serina para ativar as vias de sinalização e
transcrição (KIM ET AL, 2005). Um estudo recente relatou que AV aumenta a
expressão de um receptor de quimiocina CXC4 (CXCR4) em células-tronco
hematopoéticas (GUL ET AL, 2009). O CXCR4 é um receptor específico de
quimiocina-a para o fator derivado de célula estromal (SDF-1α), uma molécula dotada
de uma atividade quimiotática potente evidenciado pela primeira vez em linfócitos
(RAZ, MAHABALESHWAR, 2009).
ALBRECHT 2005, mostra utilizações Off-Label do ácido valpróico como sendo
útil para diminuir a carga viral em portadores de HIV, porém a erradicação do vírus é
considerada impossível. Outras investigações evidenciaram a capacidade do AV em
inibir o crescimento de tumores por meio da indução da morte celular programada de
células tumorais e do estímulo à diferenciação celular. Todas estas características levam
a um interesse crescente na pesquisa deste fármaco (ROUTY, 2005). Existem três
medicamentos aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA) para a terapêutica
da dependência de álcool (Acamprosato, Dissulfiram e Naltrexona), o ácido valpróico
mostrou excelentes resultados para tratamento da síndrome de abstinência do álcool e
para prevenção de recaídas. Porém, seu uso para este fim não está aprovado pelo FDA
(CASTRO; COUZI, 2006). Pesquisas recentes também mostraram que o ácido
valpróico pode ser eficaz no tratamento do mal da retina pigmentosa. (KAUSHAL,
2010).
1.3.2 Histonas Desacetilases (HDACs) e o Ácido valpróico como inibidor de HDACs
A organização da cromatina é crucial para a regulação da expressão gênica. A
acetilação e desacetilação de histonas desempenham papel importante na regulação
transcricional de células eucarióticas e são catalisadas por famílias específicas de
P á g i n a | 36
enzimas,
as
histonas
acetil
transferases
(HATs)
e
desacetilases
(HDACs)
respectivamente (KOURAKLIS & THEOCHARIS, 2002). HDACs pertencem a uma
família de enzimas que removem o resíduo acetil do aminoácido lisina presente na
extensão N-terminal do núcleo das histonas.
O balanço entre acetilação e desacetilação de histonas é um importante fator na
regulação da expressão gênica e está, então, ligado ao controle do destino celular.
Perturbações da atividade das HDACs podem estar associadas com o desenvolvimento
de acidente vascular cerebral e nesses casos os processos moleculares envolvidos com
ativação ou repressão da transcrição são possíveis alvos para terapia antiisquêmica. O
silenciamento ou inibição de HDACs tem mostrado ter um impacto no ciclo celular,
descondesação da cromatina, diferenciação celular, apoptose e angiogênese em diversos
tipos celulares (TIMMERMAN et al., 2001).
Uma vez que a inibição da atividade das HDACs reverte o silenciamento
epigenético freqüentemente observado na isquemia, diversos inibidores de HDACs
(HDIs) têm sido desenvolvidos para fins terapêuticos. Estes incluem ácidos graxos de
cadeia curta como o ácido valpróico (CAREW et al., 2008).
O ácido valpróico vem mostrando atividade neuroprotetora em níveis
terapêuticos em modelos animais e celulares. Em cultura de neurônios, AV protege
contra a excitotoxicidade induzida por glutamato (KANAI et al., 2004) e morte
neuronal dopaminérgica (ACHARYA et al., 2000). A neuroproteção relatada contra
excitotoxicidade consiste da inibição de histonas desacetilases (HDACs), um alvo do
ácido valpróico recentemente identificado (PHIEL et al., 2001).
Estudos recentes mostraram que o AV apresenta efeitos neuroprotectores em
modelos animais e celulares de doenças neurodegenerativas, incluindo acidente vascular
cerebral (CHUANG et al, 2009). Os efeitos neuroprotectores do AV ocorrem
inicialmente pela inibição de uma família de enzimas, as histonas desacetilases
(HDACs) (GÖTTLICHER et al., 2001; PHIEL et al., 2001; YU-TING et al., 2014) que
têm um papel crucial na regulação transcricional. As HDACs estão ligadas aos
processos de transcrição do DNA para a expressão gênica. A acetilação que ocorre
normalmente em uma célula neutraliza as cargas positivas na histona por transformar
aminas em amidas e diminuir a habilidade das histonas em ligarem-se ao DNA
(GIANNINI et al., 2009). As propriedades inibidoras de HDACs interferem diretamente
no metabolismo de replicação celular apresentam um potencial farmacológico do AV
ainda pouco explorado (GRIF et al., 2011).
P á g i n a | 37
A atividade neuroprotetora do ácido valpróico provavelmente seja decorrente da
inibição de HDACs, que conduz uma hiperacetilação da cromatina e resulta em
alteração da expressão gênica (REN et al., 2004). Foi sugerido que AV age por inibir a
produção de diacilglicerol (DAG), também reduz níveis de inositol, mas o PIP 2
(fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato) é aumentado, sugerindo que a hidrólise de PIP 2
mediada por fosfolipase C e que forma DAG e IP3 é defeituosa na presença de AV.
Esses resultados levantam a hipótese de que o AV alivia os sintomas bipolares através
da via DAG, que regula a liberação de neurotransmissores, indicando que o AV age
neste sentido (ROBIN, 2002; SUZUMI et al., 2008).
1.3.3 Ácido Valpróico associado ao Lítio
O Ácido Valpróico e o Lítio são considerados os principais fármacos
estabilizadores do humor, utilizados para controlar as oscilações de humor
características do transtorno bipolar (RANG et al., 2012). Novas evidências sugerem
que estabilizadores de humor como AV e lítio apresentam amplas propriedades
neuroprotetoras e neurotróficas, e que isso ocorre através da inibição de histonas
desacetilases (HDACs) e da glicogénio sintase quinase 3 (GSK-3) respectivamente. A
inibição de tais enzimas provavelmente desencadeia uma cascata de eventos que leva à
neuroproteção.
O AV e o lítio apresentam ações semelhantes no que diz respeito à
neuroproteção. O lítio atua em uma série de sistemas de neurotransmissores e de
mecanismos de transmissão de sinais, tais como a hidrólise de fosfoinositol, adenilato
ciclase, proteínas G, a proteína glicogênio sintase cinase na sua isoforma 3β (GSK-3β) e
a proteína cinase C (PKC) (WANG et al., 2003). A GSK-3β está intimamente envolvida
no processo de disfunção colinérgica e morte celular na doença de Alzheimer (BIJUR et
al., 2000). Por meio de seus efeitos na GSK-3β e PKC, o lítio pode alterar também a
fosforilação
de
proteínas
do
citoesqueleto,
condunzindo
a
mudanças
de
neuroplasticidade (LENOX; HAHN, 2000).
Alguns estudos mostram os efeitos neuroprotetores característicos dos
estabilizadores do humor supracitados em diferentes situações, como no tratamento
agudo e crônico com anfetamina (FREY et al., 2006A,B), na excitotoxicidade
glutamatérgica (WANG et al., 2003; HASHIMOTO et al., 2002) e na neurotoxicidade
induzida por acúmulo do peptídeo β-amilóide (ALVAREZ ET AL., 1999). Além disso,
P á g i n a | 38
o AV e o lítio são capazes de atenuar determinadas ações neurodegenerativas, como a
peroxidação lipídica (JAKOPEC et al., 2008; SHAO et al., 2005) e o estresse oxidativo
induzido por cloreto de ferro (WANG et al., 2003).
O tratamento com lítio antagoniza a ativação de proteínas cinases ativadas por
mitógenos (MAPK), proteínas cinases ativadas por stresse (JNK) e a p38MAPK que
regula a expressão de muitas citocinas inflamatórias como o TNF-α (GARY, 2002;
CHUANG, 2004). Estudos mostram que há uma competição entre lítio e Mg2+ em
substratos que têm uma influência significativa sobre a atividade de várias enzimas e na
liberação de produtos metabólicos, em particular, são alvos importantes de lítio, da
glicogênio sintase cinase na sua isoforma 3β (GSK-3β), inositol monofosfatase (IMP), e
Akt/β-arrestina2 (Akt). Por isso, a modificação destas vias intracelulares através da
inibição enzimática é relevante para a compreensão da patogênese de determinados
distúrbios neuropsiquiátricos e neurodegenerativos (FORLENZA et al., 2014).
Alguns estudos indicam que a associação de AV e lítio têm a capacidade de
afetar a atividade transcricional, a expressão gênica, promover proliferação celular e
uma provável neurogênese no SNC (CHI-TSO CHIU, 2013). Clinicamente, a
combinação de AV e lítio tem sido utilizada para aumentar os benefícios terapêuticos ou
para o tratamento de pacientes bipolares insensíveis à monoterapia. Estes resultados
levantam a possibilidade de que o co-tratamento com AV e lítio pode produzir efeitos
sinérgicos ou mais fortes contra a morte de células neuronais em condições
neurodegenerativas (RUBINSZTEIN, 2002).
Foi demonstrado que o tratamento crônico com lítio induz a expressão de
neurotrofinas, como o BDNF (fator neurotrófico derivado do encéfalo) em cultura de
neurônios corticais de ratos (CHUANG; VAJDA, 2002). O AV apresenta ações
semelhantes as do lítio no que diz respeito à neuroproteção. Por exemplo, ambos
aumentam a atividade de ligação do DNA e a atividade dos fatores de transcrição da
família 1 de proteínas ativadoras por meio da proteína cinase regulada por sinal
extracelular (ERK). A ERK modula os efeitos de diversas neurotrofinas, incluindo a
diferenciação neuronal, sobrevivência neuronal, neuroplasticidade de longa duração e
aprendizado e memória (YUAN et al., 2001).
O ácido valpróico aumenta a expressão de genes relacionados à via da ERK
(cinases reguladas por sinais extracelulares) e de proteínas antiapoptóticas da família
das Bcl-2. Além disso, promove crescimento de neuritos, sobrevivência celular e
aumento de captação e liberação de noradrenalina (YUAN et al., 2001). Da mesma
P á g i n a | 39
forma que o lítio, o ácido valpróico, em doses terapêuticas, tem efeito inibitório sobre a
GSK-3β. A associação do ácido valpróico com o lítio tem efeitos somatórios nessa
inibição (CHEN et al., 1999; STAMBOLIC et al., 1996). Por fim, experimentos préclínicos com uso de células-tronco mesenquimais tratadas com AV e lítio apresentaram
uma capacidade migratória aumentada para os locais de lesão cerebral isquêmica (TSAI
et al., 2011).
1.4 Modelos experimentais do AVC isquêmico
O desenvolvimento de modelos animais para o estudo do AVC isquêmico
representa uma ferramenta indispensável na investigação de sua fisiopatologia e no
desenvolvimento de novos fármacos para seu tratamento. O primeiro pesquisador a
propor um modelo de isquemia cerebral através da combinação de hipóxia e oclusão
unilateral da artéria carótida e, em meados de 1960 foi Seymour Levine (1960), seu
trabalho foi adaptado por Brown, Brierly e colaboradores que assim estabeleceram as
bases para o estudo do dano isquêmico cerebral em roedores (LIPTON, 1999).
O quadro abaixo mostra os principais modelos de isquemia cerebral de acordo
com a localização e se trata de um evento com reperfusão (transitório) ou sem
reperfusão (permanente) (BRAEUNINGER; KLEINSCHNITZ, 2009).
Modelos de
isquemia cerebral
Isquemia Cerebral
Global
Etiologia
Intravascular
Permanente ou
com reperfusão
Modelos
Transitória ou
Parada cardíaca
permanente
Extravascular
Transitória ou permanente
Ligação das principais
artérias irrigadoras do
cérebro (carótidas e
vertebrais).
Intravascular
Transitória ou
Oclusão da artéria
Focal
permanente
cerebral média
Extravascular
Transitória ou permanente
Oclusão cirúrgica da artéria
cerebral média
Intravascular
Transitória ou
Embolização com
Multifocal
permanente
coágulos de sangue
ou microesferas
Quadro 01. Principais modelos de isquemia cerebral.
P á g i n a | 40
A fisiopatologia do AVC isquêmico tem sido bastante estudada em animais e os
mecanismos moleculares envolvidos na isquemia cerebral já estão bem estabelecidos
através de modelos in vivo que foram citados. As lesões isquêmicas podem sem globais
ou focais e para ambos os casos foram desenvolvidos modelos experimentais (COLLI,
NUNES, CARLOTTI, 1998; SHUAIB et al, 2011).
Os modelos de isquemia cerebral podem ser classificados como global ou focal,
dependendo da localização do dano. A isquemia global ocorre quando há falência
circulatória restringindo o suprimento sanguíneo para o cérebro e a isquemia focal
ocorre quando o fluxo de sangue é limitado em uma região cerebral específica,
geralmente causado pela oclusão de uma artéria cerebral (BRAEUNINGER;
KLEINSCHNITZ, 2009).
Os tipos de isquemia, temporária ou permanente, estão a depender de alguns
fatores importantes, como por exemplo, o tempo de duração, o tempo de reperfusão e as
artérias ocluídas no experimento (carótidas ou vertebrais) (TARDINI et al., 2003). A
presença ou ausência de reperfusão caracteriza o modelo como transitório ou
permanente (BRAEUNINGER; KLEINSCHNITZ, 2009).
A vascularização encefálica ocorre através de dois sistemas: o vértebro-basilar
(artérias vertebrais) e o carotídeo (artérias carótidas internas). Na base do crânio estas
artérias formam um polígono anastomótico, o Polígono de Willis, a partir do qual
aferem as principais artérias para vascularização cerebral. Os principais vasos de
irrigação do cérebro são as artérias carótidas e as artérias vertebrais, que se comunicam
por meio do Polígono de Willis. Trata-se de uma anastomose arterial que fornece o
suprimento sangüíneo para os hemisférios cerebrais, sendo formado pelas artérias
cerebrais anteriores e posteriores, artérias comunicantes anteriores e posteriores e pela
carótida interna (Figura 03).
P á g i n a | 41
Figura 03. Fonte: http://www.auladeanatomia.com/cardiovascular/arterias.htm
A isquemia global resulta em danos cerebrais mais comumente induzidos pela
oclusão das artérias cervicais do que pela interrupção total da circulação sanguínea. Os
principais modelos de oclusão de artérias são: oclusão de 4 vasos, onde é feita a
coagulação permanente das artérias vertebrais e posterior clampeamento das carótidas,
muito utilizado em ratos (PULSINELLI; BRIERLY; PLUM, 1982); a oclusão de 2
vasos, também realizado em ratos, em que somente as duas carótidas são clampeadas,
aliadas a redução da pressão arterial 50mmHg (SMITH; AUER; SIESJO, 1984); e a
oclusão das duas carótidas em gerbils sem redução da pressão arterial, visto que estes
animais são destituídos do polígono de Willis (KIRINO, 1982).
O modelo utilizado no presente trabalho foi o da oclusão bilateral das carótidas
com posterior reperfusão e sem redução da pressão arterial. Esse modelo pode causar
prejuízos como a morte de neurônios hipocampais com conseqüente prejuízo em testes
de memória e aprendizagem (LIPTON, 1999; MAROSI et al., 2008; WALKER;
ROSENBERG, 2009).
Atualmente os modelos mais utilizados de isquemia cerebral focal são os de
oclusão da artéria cerebral média (ACM) que pode ser realizada através do uso de um
fio intraluminal ou por meio de técnicas cirúrgicas como eletrocauterização,
clampeamento e ligadura da artéria. A eletrocauterização da ACM leva a interrupção
permanente do fluxo sanguíneo, enquanto que a ligadura e o campleamento permitem a
P á g i n a | 42
reperfusão. Existe ainda o modelo de fototrombose, no qual é induzida uma lesão
cortical do cérebro por injeção sistêmica de um corante fotossensível, como o rosa de
Bengala, e posterior irradiação focal do crânio (BACIGALUPPI et al., 2010).
P á g i n a | 43
2. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
A neurociência procura elucidar os mecanismos fisiológicos envolvidos nas
neuropatologias e suas pesquisas focam em agentes terapêuticos. Na isquemia cerebral,
a perfusão sanguínea ausenta-se, estimulando o cérebro a usar todo o estoque energético
que é limitado, tornando-se assim mais vulnerável a danos irreversíveis.
O Brasil encontra-se entre os dez países com maiores índices de mortalidade por
AVC. Estatísticas recentes mostram que o acidente vascular encefálico ainda é a
primeira causa de óbito. Em suas diversas formas de apresentação o AVC constitue uma
emergência neurológica. Quando o óbito não acontece, prejuízos fisiológicos são
gerados no organismo do paciente. Os acometidos costumam apresentar danos físicos,
como paresias ou plegias de um ou ambos os membros, deslizes sensoriais e da
memória, alterações visuais, na marcha e da fala, tanto na expressão, quanto na
compreensão (CAPLAN, 2000).
Embora o Brasil venha avançando na prevenção e diminuição da mortalidade
causada por AVC, as estatísticas ainda sobressaem quando comparadas aos demais
países da América Latina. Com isso, percebe-se a importância do estudo sistemático da
fisiopatologia dos mecanismos envolvidos na lesão neuronal isquêmica e de seu
tratamento com o objetivo de formular estratégias que reduzam tanto a mortalidade
como as diversas seqüelas neurológicas advindas de tal patologia (GARRITANO et al.,
2012).
O ácido valpróico é uma das mais importantes drogas utilizadas no tratamento
de epilepsia e alternativa no tratamento da doença bipolar, por isso vem sendo
explorado como importante candidato à terapia isquêmica. Na clínica, pacientes
bipolares insensíveis à monoterapia têm apresentado resposta à combinação de AV e
lítio que vêem aumentando os benefícios terapêuticos para o tratamento de patologias
relacionadas ao sistema nervoso. Estes resultados levantam a possibilidade de que o cotratamento com AV e lítio pode produzir efeitos sinérgicos ou mais fortes contra a
morte de células neuronais em condições neurodegenerativas (RUBINSZTEIN, 2002).
O interesse em estudar o ácido valpróico sozinho ou associado ao lótio em
modelo de isquemia global transitória é decorrente dos possíveis efeitos
antinflamatórios e neuroprotetor deste fármaco, o que nos leva a investigar o seu
mecanismo de ação como droga neuroprotetora e com potencial de utilização na clínica
com outras atividades além das que já são comprovadas.
P á g i n a | 44
3. OBJETIVOS
Geral
Avaliar o efeito neuroprotetor do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio,
em modelo de isquemia global transitória em ratos, através de avaliações
comportamentais, neuroquímicas e imunohistoquímicas.
Específicos
Avaliar os efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio em animais
isquemiados sobre:
- A atividade locomotora espontânea através do testes de campo aberto;
- A memória espacial através do teste do labirinto aquático de Morris;
- As alterações neuroquímicas no corpo estriado, através de determinações nas
concentrações de neurotransmissores, como dopamina (DA) e seu metabólito Ácido
3,4-diidroxifenilacético
(DOPAC)
por
HPLC
(High
Performance
Liquid
Chromatography);
- O estresse oxidativo no corpo estriado, córtex pré-frontal e hipocampo através da
dosagem de TBARS e nitrito;
- A neuroinflamação induzida pela ICG através da técnica de imunohistoquímica para
iNOS, COX-2, TNF-α, GSK-3 e HDAC no hipocampo;
- O percentual da área de dano isquêmico cerebral por disfunção mitocondrial (TTC).
P á g i n a | 45
4. METODOLOGIA
4.1 Animais:
Os experimentos foram realizados em ratos albinos da variedade Wistar (200250 g), provenientes do Biotério da Faculdade de Medicina de Juazeiro do Norte – FMJ
e alojados em gaiolas individuais em ambiente climatizado, à temperatura de 24±2°C,
sob condições de ciclo de claro/escuro 12h/12h com livre acesso a ração padrão (Purina
Chow) e água potável. Os animais foram tratados de acordo com a legislação vigente e
os princípios éticos da experimentação animal estabelecidos pelo CONCEA (Conselho
Nacional de Controle de Experimentação Animal). O projeto de pesquisa foi submetido
e aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da Universidade
Federal do Ceará (UFC) sob o número de registro 59/2011.
4.2 Drogas e reagentes
Nesse estudo foram utilizados o ácido valpróico (Valproato de sódio – Teuto
S/A) nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg (v.o.) e lítio (Sigma Aldrich-USA®) na dose de
10 mg/kg (i.p.), durante sete dias. Como anestésicos foram utilizados o Cloridrato de
Cetamina 5% (Vetanarcol®, Laboratórios König S.A, Argentina) e o Cloridrato de
Xilazina 2% (König, Argentina), nas doses de 75 e 10mg/kg, via intraperitoneal,
respectivamente. Todos os outros reagentes foram de grau analítico.
4.3 Modelo experimental de isquemia cerebral global
Os animais foram divididos em grupos (para avaliação comportamental n:10,
para avaliação neuroquímica e imunohistoquímica n:6) e anestesiados com Cetamina
(75 mg/kg) e Xilazina (10 mg/kg), administradas por via intraperitoneal (i.p.) e
imobilizados para serem submetidos ao modelo de isquemia cerebral global, por
oclusão bilateral das artérias carótidas comuns baseando-se no modelo proposto por
ULRICH et al., (1998).
P á g i n a | 46
Após antissepsia local e tricotomia foi feita uma incisão medial na altura da
traquéia para exposição das carótidas em ambos os lados. Com a identificação do nervo
vago e das carótidas, essas foram isoladas e clampeadas simultaneamente, utilizando
pinças buldogues e ocasionando a isquemia cerebral durante 30 minutos, seguida de
reperfusão. A incisão foi suturada e os animais alojados em gaiolas para recuperação.
Água e comida foram ofertadas ad libitum. O grupo falso-operado (FO) foi submetido
ao mesmo protocolo cirúrgico, porém não houve o clampeamento das carótidas, que
foram apenas separadas do nervo vago e isoladas.
Figura 04: Procedimento cirúrgico, incisão medial na altura da traquéia com exposição
da carótida. Fonte: Estácio FMJ. SANTOS (2016).
P á g i n a | 47
Os animais foram tratados por gavagem (vo) com ácido valpróico nas doses de
25, 50 e 100 mg / kg, sozinho ou associado ao lítio (10 mg/kg, ip) após a cirurgia
diariamente, durante 7 dias. Os animais foram distribuídos em 9 grupos:
No sétimo dia após o tratamento os ratos foram avaliados quanto à atividade
exploratória (campo aberto) e memória espacial (labirinto aquático). Realizados os
testes comportamentais os animais foram eutanasiados por decapitação em guilhotina
(Harvard, USA) e o corpo estriado, córtex pré-frontal e hipocampo foram dissecados
sob gelo. O corpo estriado foi utilizado na preparação de homogenatos para
determinação de monoaminas e metabólitos (DA e DOPAC) em HPLC (High
P á g i n a | 48
Performance Liquid Chromatography). Fatias de hipocampo foram processadas para os
testes de imunohistoquímica (TNF-α, COX-2, iNOS, GSK-3 e HDAC) e coloração com
fluoro jade. O corpo estriado, córtex pré-frontal e hipocampo foram utilizados na
preparação de homogenatos para determinação dos níveis de TBARS e nitrito; Cortes
coronais foram usados para determinar o percentual da área de dano isquêmico cerebral
por disfunção mitocondrial (TTC).
4.4 Estudo comportamental
4.4.1 Teste do Campo Aberto ou “Open Field”
O teste de campo aberto é utilizado para avaliar a atividade locomotora, déficits
motores e de ansiedade. A atividade locomotora é avaliada mediante alguns parâmetros,
como, a determinação da distância percorrida (número de cruzamentos) e
comportamentos
estereotipados,
rearing
(exploração
vertical)
e
grooming
(autolimpeza). O teste é sensível à disfunção motora, bem como a danos do hipocampo
e gânglios da base. Durante o teste se avalia a capacidade exploratória do animal,
durante 5 minutos, em uma arena. A arena é construída em acrílico ou madeira
(dimensões para rato: 50 x 50 cm) e possui 20 cm de altura, com piso dividido em
quatro quadrados iguais (Figura 05).
Figura 05. Teste para avaliar a atividade locomotora no aparato do campo
aberto. Aparato do campo aberto do Laboratório de Biofisiologia e Farmacologia,
Estácio FMJ. Fonte: SANTOS (2015).
P á g i n a | 49
Os animais foram avaliados no sétimo dia de tratamento pós-isquemia cerebral.
Os ratos foram gentilmente colocados na arena com as quatro patas no centro do campo
aberto e o seu comportamento foi observado por 5 minutos. Os parâmetros
comportamentais observados neste teste foram:
- Número de cruzamentos - contados todos os quadrantes cruzados pelo animal, quando
este se encontrava com as quatro patas dentro do mesmo quadrante;
- Número de rearing - postura na qual o animal fica na posição vertical, apoiado
somente pelas patas traseiras;
- Número de grooming - ato de auto-limpeza do animal.
4.4.2 Teste do Labirinto Aquático (Water Maze) - Memória Espacial
O teste do labirinto aquático avalia a memória espacial e qualquer alteração na
resposta (maior tempo para encontrar a plataforma submersa) é sugestiva de disfunção
hipocampal. Está correlacionado com a plasticidade sináptica do hipocampo e da função
do receptor NMDA. O teste utiliza uma piscina circular pintada com tinta preta (1,7m
de diâmetro e 1m altura), com água (0,59m de profundidade), à temperatura de
aproximadamente 25oC para ratos. A piscina é dividida em quatro quadrantes e contem
uma plataforma com 10 cm de diâmetro que se mantém imóvel e submersa a 0,5 cm
abaixo do nível da água. O local onde está a piscina é provido de pistas em quatro
localizações das paredes ao norte, sul, leste e oeste (figura 06).
Figura 06. Labirinto aquático. Adaptado de Richard G. Morris (1981).
Disponível em: http://en.wikipedia.org. Acesso em: 20/01/2016.
Os animais foram submetidos a dois dias de treinamento (pré-teste) e após 48
horas do último treino foi realizado o teste do labirinto aquático, correspondendo ao
P á g i n a | 50
sétimo dia de tratamento com AV. Nos treinos, cada animal foi colocado na piscina por
seis vezes em posições diferentes, tendo sido o primeiro ponto sempre a extremidade
oposta à plataforma. Os animais têm um tempo máximo de 54 segundos (“cut-off time”)
para encontrar a plataforma. Uma vez sobre a plataforma, esse permaneceu durante 10
segundos e depois foi retirado. Aquele animal que não encontrou a plataforma no tempo
máximo foi colocado na mesma por 10 segundos. Os animais permaneciam por 30
segundos fora da piscina para uma nova entrada até completado o treino. Após 48 horas
do último treino, o procedimento foi repetido com somente uma entrada para cada rato
(teste), quando então foi registrado o tempo de latência (em segundos) que cada animal
levou para encontrar a plataforma submersa.
4.4.3 Avaliação de neurotransmissores, marcadores do estresse oxidativo e mediadores
inflamatórios
4.4.3.1 Dissecção das áreas cerebrais
Os animais foram sacrificados através da decapitação com uma guilhotina
(Harvard, USA) 7 dias após a cirurgia, logo após os testes comportamentais. Os
encéfalos foram retirados rapidamente e colocados sobre papel alumínio em uma placa
de Petri com gelo. Acompanhando a fissura sagital mediana, a camada cortical cerebral
foi liberada das leptomeninges com uma pinça reta de microdissecação que divulsionou
o córtex delicadamente, expondo o corpo estriado, o córtex e o hipocampo. Todas as
áreas cerebrais citadas foram retiradas delicadamente. Após serem pesados foram
guardados no freezer a -20ºC até o preparo dos homogenatos que foram utilizados nas
análises neuroquímicas e bioquímicas. Um corte coronal na altura do hipocampo
também foi realizado para posterior análise imunohistoquímica e bioquímica.
4.4.3.2 Determinação dos níveis de monoaminas e metabólitos através de HPLC
Para determinação dos níveis de aminoácidos, foi utilizado o equipamento de
HPLC. Na cromatografia líquida clássica, um adsorvente (alumina ou sílica) é
empacotado em uma coluna e é eluído por um líquido ideal (fase móvel). Uma mistura
para ser separada é introduzida na coluna, e é carregada através da mesma por líquido
eluente. Se um composto da mistura (soluto) é adsorvido fracamente pela superfície da
fase sólida estacionária, ele atravessará a coluna mais rapidamente que um outro soluto
P á g i n a | 51
que seja mais rapidamente adsorvido. Então, a separação dos solutos é possível se
existem diferenças na adsorção pelo sólido. Os detectores eletroquímicos medem a
condutância de eluente, ou a corrente associada com a oxidação ou redução dos solutos.
Para ser capaz de detectar, no primeiro caso os solutos devem ser iônicos, e no segundo
caso os solutos devem ter a característica de serem relativamente fáceis de oxidar ou
reduzir.
Detectores eletroquímicos que medem corrente associada com a redução ou
oxidação de soluto são chamados detectores amperométricos ou colorimétricos. Neste
estudo, foi utilizado o tipo amperométrico que reage com uma quantidade muito menor
de soluto, em torno de 1 %. Todas as técnicas eletroquímicas envolvem a aplicação de
um potencial para um eletrodo (geralmente de carbono vítreo), oxidação da substância
que está sendo estudada próximo à superfície do eletrodo, seguindo a amplificação e
medida da corrente produzida. As catecolaminas são oxidadas nos grupos de anel
hidroxil para conduzir em derivado ortoquinona com a liberação de dois elétrons.
O estriado dos animais foi então utilizado para preparar os homogenatos a 10%
em ácido perclórico (HClO4). O estriado foi sonicado em 0,1 M HClO4, durante 30 s,
centrifugados a 4°C durante 30 min a 15.000 rpm, e os sobrenadantes foram filtrados
(0,2 um, Millipore). Trinta microlitros de amostra foram então injetados na coluna
(Shim-Pack CLC-ODS, 25cm) do HPLC (Shimadzu, modelo LCD-6A com detecção
eletroquímica) em fluxo de 0,6 mL/min. A fase móvel foi preparada com 0,163 M de
ácido cítrico, pH 3,0, contendo 0,02 mM de EDTA com 0,69 mM de ácido
octanossulfônico sódico (SOS), acetonitrila a 4% v/v e tetra-hidrofurano 1,7% v/v. A
Dopamina e o seu metabólito DOPAC foram eletroquimicamente detectados, utilizando
um detector amperométrico (Shimadzu, Japão), por oxidação de um eletrodo de carbono
vítreo a 0,85 V em relação ao eletrodo de referência de Ag-AgCl. As suas concentrações
foram determinadas por comparação com as médias dos padrões injetados na coluna do
HPLC. Foram utilizados padrões numa concentração final de 4 μg/ml e a partir da altura
ou área dos picos padrões as concetrações foram inseridas no programa Graphpad
Prism® 6.0 e os resultados expressos em ng/g de tecido.
P á g i n a | 52
4.4.3.3 Determinação da peroxidação lipídica através da dosagem de substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)
A peroxidação lipídica é uma das mais importantes expressões orgânicas do
estresse oxidativo induzido pela reatividade dos radicais livres de oxigênio. O método
mais empregado para a determinação do malonildialdeído (MDA) em amostras
biológicas é baseado na sua reação com o ácido tiobarbitúrico (TBARS). Nesta reação,
duas moléculas de TBARS reagem estequiometricamente com uma molécula de MDA
para formar uma solução de cor rosa, conforme o método de DRAPER; HADLEY
(1990).
Homogenatos das áreas cerebrais de interesse, corpo estriado, córtex e
hipocampo, foram preparados a 10% em solução de Cloreto de Potássio (KCl) 1,15%.
Uma alíquota de 250 μl do homogenetado foi misturado a 1 mL de solução de ácido
tricloroacético a 10% e acrescido de 1 mL de solução de ácido tiobarbitúrico 0,6%.
Após a agitação, essa mistura foi mantida em banho-maria fervente (95-100°C) durante
15 min. Em seguida foi resfriada em banho de gelo por alguns minutos e posteriormente
centrifugada (4000 rpm/5 min). O conteúdo de TBARS foi determinado em leitor de
Elisa a 540 nm. Os resultados foram expressos em micromol de MDA por g de tecido.
A curva padrão foi obtida mediante leitura de várias concentrações de MDA padrão
(0,6; 1,2; 2,4; 4,08; 8,16; 16,32 μmol).
4.4.3.4 Determinação do conteúdo de nitrito
Nesse protocolo o reagente de Griess [N-naftil-etilenodiamina (NEED) 0,1 %,
sulfanilamida 1 % em ácido fosfórico 5% e água destilada] revela a presença de nitrito
em uma amostra. Em condições ácidas, o nitrito reage com a sulfonilamida por uma
reação de diazotização formando um composto intermediário, o sal diazônico. Em
seguida este sal reage com o NEED 0,1 % formando um azo estável de coloração rósea
com um pico de absorbância em 560 nm. Para realização deste teste homogenatos de
corpo estriado, córtex e hipocampo (10% em tampão de Cloreto de Potássio) foram
centrifugados (12000 rpm por 10 min) e 100 μL dos sobrenadantes foram adicionados a
100 μL do reagente de Griess, permanecendo a temperatura ambiente durante 10
minutos. A curva padrão foi obtida pela pesagem de 7mg de NaNO2, dissolvidos em 10
mL de água destilada (solução-estoque-10mM) e foram realizadas as diluições em série
P á g i n a | 53
(100μM, 50μM, 25μM, 12,5μM, 6,25μM, 3,12μM, 1,56μM). Foi contruída uma
equação da reta para o cálculo das concentrações do teste e os resultados foram
expressos em μmol de nitrito/nitrato por g de tecido (GREEN et al., 1981).
4.4.3.5 Ensaios imunohistoquímicos para iNOS, COX-2, TNF-α, GSK-3 e HDAC.
A imunohistoquímica foi realizada no hipocampo para iNOS, COX-2, TNF-α,
GSK-3 e HDAC. Os animais foram sacrificados por decapitação 7 dias após a cirurgia
que promoveu a isquemia cerebral e foram feitos os cortes para confecção das lâminas.
O material selecionado foi inicialmente fixado em formol a 10% durante as primeiras
24h, seguido por uma solução alcoólica a 70% e, posteriormente, emblocado em
parafina. Cortes histológicos de 5 μm de espessura colocados sobre lâminas de vidro
próprias para imunohistoquímica. Foram feitas pelo menos duas lâminas de dois ou três
animais diferentes para cada grupo. Então, as lâminas contendo os cortes histológicos
foram deixadas em estufa histológica a 58º C por 10 minutos, em seguida o protocolo
seguiu as etapas abaixo:
1) Desparafinização em xilol e reidratação em uma série de banhos de álcool de
concentrações diferentes até a água e lavados duas vezes em água destilada por cinco
minutos cada;
2) Recuperação antigênica com tampão citrato pH 6.0 no microondas em potência
máxima por 5 minutos, com intervalos para evitar fervura; Resfriar à temperatura
ambiente e lavar 2 vezes com PBS – 5 min cada lavagem;
3) Bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio 0,3%;
4) Após circular as secções com caneta específica para imunohistoquímica, seguiu-se a
incubação com os respectivos anticorpos primários, diluídos em BSA overnight em
geladeira. Todas as diluições foram realizadas de 1:100;
5) No dia seguinte retirou-se as lâminas da geladeira para voltar à temperatura ambiente
e serem lavadas com PBS;
6) Os cortes foram incubados com o anticorpo secundário por 2 horas em temperatura
ambiente;
7) Em seguida foi feita a incubação com o Complexo Avidina-Biotina (kit DAKO) por
30 min para potencialização da reação, levando à melhora na visualização;
P á g i n a | 54
8) Para revelação foi utilizada a solução cromógena de diaminobenzidina (DAB) do
mesmo kit, por aproximadamente 1 minuto. As lâminas foram lavadas para parar a
reação;
9) Então fez-se a desidratação com álcool em concentrações diferentes e a diafanização
em xilol para montagem da lamínula com Enthelan e análise utilizando o Microscópio
Óptico BX-41 com câmera acoplada.
Os dados imunohistoquímicos (fotomicrografias) foram quantificados através do
software Image J (National Institute of Health, USA). Posteriormente, esses dados
foram analisados através do GraphPad Prism® 6.0.
4.4.3.6 Avaliação da Área de Infarto Cerebral Isquêmico - Cloreto de 2,3,5
Trifeniltetrazol (TTC)
O TTC é um sal que ganha um próton da succinato desidrogenase na membrana
interna da mitocôndria. Com isso, ele é reduzido para uma forma insolúvel, o formazam,
fornecendo uma coloração avermelhada ao tecido composto por células viáveis. As
células da região de infarto não possuem mitocôndrias viáveis, desta forma, o processo
de redução não acontece, a coloração avermelhada não é gerada, permitindo a área de
infarto ser caracteristicamente detectada por uma região esbranquiçada.
Após sete dias da indução isquêmica os animais foram eutanasiados e seus
cérebros foram removidos. Conservados em salina gelada até o momento dos cortes, os
cérebros foram fatiados na espessura de 2 mm e imersos em solução de 2% de TTC à
37°C por 30 minutos. Em seguida, as fatias foram digitalizadas. As imagens foram
analisadas a partir das áreas de infarto e das áreas totais das fatias, empregando-se
cálculos das respectivas porcentagens. As imagens foram quantificadas através do
software Image J (National Institute of Health, USA). Posteriormente, esses dados
foram analisados através do GraphPad Prism® 6.0.
P á g i n a | 55
4.5 Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M).
Para comparação múltipla dos parâmetros foi utilizado ANOVA de uma via e o teste de
Newman-Keuls como post hoc. Para comparação das médias entre dois grupos apenas,
foi utilizado o teste t não pareado. Em todas as análises, foi considerado estatisticamente
significante valores de p< 0,05. Para realização da análise estatística foi utilizado o
programa GraphPad Prism® 6.0.
P á g i n a | 56
5. RESULTADOS
5.1 Testes comportamentais
5.1.1 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio sobre a atividade
locomotora através do teste do campo aberto em ratos após serem submetidos à
isquemia cerebral global transitória
No teste de campo aberto os animais tratados com AV sozinho nas doses de 25,
50 e 100mg/kg tiveram um aumento significativo do número de travessias de um
quadrante para outro quando comparados ao grupo isquemiado (ISQ: 5,07±0,51; FO:
12,04±0,81a;
AV25:
10,24±1,12a;
AV50:
9,77±1,19b;
AV100:
12,33±1,96a).
Observamos que o tratamento com AV em todas as doses citadas acima reverteu o
déficit na atividade locomotora quando comparado ao grupo controle (Figura 07).
Com relação aos animais tratados com AV associado ao lítio, o grupo
isquemiado (ISQ) apresentou uma diminuição significativa do número de travessias de
um quadrante ao outro quando comparados ao grupo falso operado (ISQ: 5,07±0,51;
FO: 12,04±0,81a). O AV associado ao lítio em todas as doses (AV25: 8,92±0,95b;
AV50: 11,0±1,45a e AV100: 11,5±1,76a) reverteram o déficit na atividade locomotora
quando comparado ao grupo isquemiado de forma semelhante, assim como no grupo
tratado apenas com lítio (9,71±0,72b). Na figura 08 de maneira similar, o AV aumentou
o número de rearings, nos grupos que foram tratados apenas com ácido valpróico nas
doses de 25 e 50mg/kg (AV25: 12,37±1,32a; AV50: 10,63±1,31a) e nos grupos em
associação com o lítio (AV25: 7,07±1,31b; AV50: 10,18±0,97a; AV100: 10,45±1,31a;
Li: 9,85±1,04a) quando comparado com o grupo isquemiado (3,89±0,49 (28). Em
relação à atividade de autolimpeza (grooming) obtivemos resultados significativos
apenas na maior dose do AV associado ao lítio quando comparado ao grupo isquemiado
(ISQ: 3,61±0,24; FO: 6,66±0,66a; AV100: 7,93±1,27a).
P á g i n a | 57
Figura 07- Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li
(10mg/kg, ip) sobre a atividade locomotora de ratos no teste do campo aberto. Os
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a
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0
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A
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Número de cruzamentos/5 min
valores representam a média ± EPM do número de cruzamentos durante 5 min.
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a
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ISQ
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LI
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A
+
LI
T
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IS
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.
0
F.
O
Número de cruzamentos/5 min
ISQ
P á g i n a | 58
Tabela 01 – Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li
(10mg/kg, ip) sobre a atividade locomotora de ratos após serem submetidos à
isquemia cerebral global no teste do campo aberto.
Grupos
Falso operado (FO)
Isquemiado (ISQ)
Número de cruzamentos
12,04±0,81 a (23)
5,07±0,51 (27)
ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg (AV25)
10,24±1,12 a (18)
ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg (AV50)
9,77±1,19 b (18)
ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg (AV100)
12,33±1,96 a (18)
ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg + Li
8,92±0,95b (13)
ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg + Li
11,0±1,45 a (13)
ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg + Li
11,5±1,76 a (14)
ISQ + Lítio 10 mg/kg (Li)
9,71±0,72 b (15)
Os valores representam a média ± EPM do número de cruzamentos durante 5 min.
Para análise estatística foi utilizado ANOVA de uma via seguido por Newman
Keuls como teste post hoc. Valores significativos com p<0,01. a e p<0,05. b e
quando comparados ao grupo isquemiado (ISQ). Teste t não pareado * quando
comparados ao grupo isquemiado (ISQ).
P á g i n a | 59
Figura 08- Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li
(10mg/kg, ip) sobre a atividade rearing de ratos no teste do campo aberto. Os
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15
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A
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IS
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.
Número de rearing/5 min
valores representam a média ± EPM do número de rearing durante 5 min.
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A
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LI
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+
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T
+
LI
T
A
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0
+
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5
IS
Q
.
A
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0
F.
O
Número de rearing/5 min
ISQ
P á g i n a | 60
Tabela 02 – Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li
(10mg/kg, ip) sobre a atividade de rearing de ratos após serem submetidos à
isquemia cerebral global no teste do campo aberto.
Grupos
Número de rearing
Falso operado (FO)
14,04±1,19 (27)
Isquemiado (ISQ)
3,89±0,49 (28)
ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg (AV25)
12,37±1,32a (19)
ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg (AV50)
10,63±1,31a (19)
ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg
(AV100)
6,10±0,89 (20)
ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg + Li
7,07±1,31 b (14)
ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg + Li
10,18±0,97 a (11)
ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg + Li
10,45±1,31 a (11)
ISQ + Lítio 10 mg/kg (Li)
9,85±1,04 a (14)
Os valores representam a média ± EPM do número de rearing durante 5 min. Para
análise estatística foi utilizado ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls
como teste post hoc. Valores significativos com p<0,1. a, p<0,01. b e p<0,05. c
quando comparados ao grupo isquemiado (ISQ). Teste t não pareado * quando
comparados ao grupo isquemiado (ISQ).
P á g i n a | 61
Figura 09- Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li
(10mg/kg, ip) sobre a atividade grooming de ratos no teste do campo aberto. Os
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15
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5
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0
0
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0
A
A
A
.
IS
Q
F.
O
V2
5
0
.
Número de grooming/5 min
valores representam a média ± EPM do número de grooming durante 5 min.
20
15
a
10
a
5
0
ISQ
LI
T
LI
T
+
LI
T
V1
0
A
A
V5
0
+
V2
5
A
+
LI
T
.
IS
Q
.
0
F.
O
Número de grooming/5 min
ISQ
P á g i n a | 62
Tabela 03 – Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li
(10mg/kg, ip) sobre a atividade grooming de ratos após serem submetidos à
isquemia cerebral global no teste do campo aberto.
Grupos
Número de grooming
Falso operado (FO)
6,66±0,66a (27)
Isquemiado (ISQ)
3,61±0,24 (31)
ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg (AV25)
5,33±0,66 (18)
ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg (AV50)
4,66±0,69 (21)
ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg
(AV100)
3,38±0,49 (18)
ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg + Li
4,8±0,95 (15)
ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg + Li
4,66±1,12 (15)
ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg + Li
7,93±1,27a (15)
ISQ + Lítio 10 mg/kg (Li)
4,18±0,86 (18)
Os valores representam a média ± EPM do número de grooming durante 5 min.
Para análise estatística foi utilizado ANOVA de uma via seguido por Newman
Keuls como teste post hoc. Valores significativos com p<0,1. a, p<0,01. b e p<0,05. c
quando comparados ao grupo isquemiado (ISQ). Teste t não pareado * quando
comparados ao grupo isquemiado (ISQ).
P á g i n a | 63
5.1.2 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado com lítio sobre o aprendizado e a
memória espacial no teste do labirinto aquático em ratos após serem submetidos à
isquemia cerebral global
O teste do labirinto aquático avalia a memória espacial do animal. Durante a
avaliação da retenção da memória espacial observou-se que os animais tratados com
ácido valpróico nas doses de 50 e 100mg/kg apresentaram uma diminuição significativa
do tempo para encontrar a plataforma quando comparados ao grupo isquemiado (ISQ:
42,92±2,30; AV50: 23,71±3,48 a; AV100: 18,93±4,35 a) (Figura10).
Evidenciamos um aumento significativo no tempo que os animais do grupo
isquemiado levaram para encontrar a plataforma submersa (ISQ: 42,92±2,30) em
relação ao grupo controle falso operado (20,11±2,16a) indicando uma diminuição da
aprendizagem espacial e disfunção hipocampal. Por outro lado nos grupos tratados com
ácido valpróico e lítio em todas as doses durante sete dias (AV25: 27,13±5,13 a; AV50:
22,08±4,80a; AV100: 19,53±3,35a) inclusive os animais tratados apenas com lítio (Li:
18,94±4,25a) ocorreu uma reversão completa desse comportamento quando comparado
com o grupo ISQ (42,92±2,30), mostrando um efeito benéfico do tratamento das drogas
associadas que foram testadas sobre a memória espacial (Figura 10).
P á g i n a | 64
Figura 10- Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li
(10mg/kg, ip) no teste de labirinto aquático. Os valores representam a média ±
60
40
a
a
a
20
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0
0
V5
0
A
A
V2
5
A
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Q
.
.
0
F.
O
Tempo para encontrar a plataforma (s)
EPM do número de grooming durante 5 min.
60
40
a
a
a
a
a
20
0
V1
0
A
ISQ
LI
T
LI
T
+
LI
T
+
LI
T
V5
0
+
A
A
V2
5
IS
Q
.
0
F.
O
.
Tempo para encontrar a plataforma (s)
ISQ
P á g i n a | 65
Tabela 04 – Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li
(10mg/kg, ip) no teste de labirinto aquático.
Grupos
Tempo para encontrar a
plataforma
Falso operado (FO)
20,11±2,16 a (35)
Isquemiado (ISQ)
42,92±2,30 (36)
ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg (AV25)
34,38±4,66 (16)
ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg (AV50)
23,71±3,48 a (17)
ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg
(AV100)
18,93±4,35 a (14)
ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg + Li
27,13±5,13 a (15)
ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg + Li
22,08±4,80 a (13)
ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg + Li
19,53±3,35 a (15)
ISQ + Lítio 10 mg/kg (Li)
18,94±4,25 a (16)
Os valores representam a média ± EPM do número de grooming durante 5 min.
Para análise estatística foi utilizado ANOVA de uma via seguido por Newman
Keuls como teste post hoc. Valores significativos com p<0,1. a, p<0,01. b e p<0,05. c
quando comparados ao grupo isquemiado (ISQ).Teste t não pareado * quando
comparados ao grupo isquemiado (ISQ).
P á g i n a | 66
5.2 Dosagem de Monoaminas através de HPLC
5.2.1 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio sobre os níveis de DA e
DOPAC no corpo estriado de ratos após serem submetidos à isquemia cerebral global
O metabólito mais importante da dopamina (DA) no sistema nervoso central é o
ácido dihidroxifenilacético (DOPAC), o qual é indicativo da taxa de metabolização da
dopamina. Na dosagem de monoaminas através de HPLC, observou-se uma redução
significativa da dopamina no corpo estriado no grupo não tratado 7 dias após a isquemia
(1672±211,0) se comparado ao grupo falso operado (2779±221,6), assim como redução
do seu metabólito DOPAC (ISQ: 386,0±103,9; FO: 1245±157,8). Por outro lado, os
valores de DA retornaram a níveis semelhantes ao grupo FO após sete dias de
tratamento com ácido valpróico, nas doses de 50 e 100 mg/kg, visto que evidenciamos
um aumento na liberação de dopamina em relação ao grupo isquemiado (AV50:
3115±512,9; AV100: 4444±870,2; ISQ: 1672±211,0). Os níveis de DOPAC dos
animais tratados com as três doses aumentaram de forma significativa se comparado aos
animais isquemiados que não receberam tratamento (AV25: 818,4±125,8; AV50:
1084±172,3; AV100: 2177±354,8; ISQ: 386,0±103,9).
Ao analisarmos os níveis de DA e DOPAC nos grupos tratados com ácido
valpróico associado ao lítio observou-se um aumento significativo de ambos nas
dosagens utilizadas. Os valores de DA retornaram a níveis superiores ao grupo FO após
sete dias de tratamento com ácido valpróico e lítio, nas doses de 50 e 100 mg/kg em
relação ao grupo isquemiado (AV50: 5237±967,3; AV100: 6398±1234; Li:
3380±353,1; ISQ: 1484±223,0). Os níveis de DOPAC dos animais tratados com as
quatro doses também aumentaram de forma significativa quando comparados aos
animais isquemiados que não receberam tratamento (AV25: 3335±817,7; AV50:
3919±1221; AV100: 5963±1035; Li: 2925±230,8; ISQ: 618,9±95,66). Isto indica que
ocorreu recuperação da liberação da dopamina e DOPAC nos grupos tratados (tabela 05
e Figura 11).
P á g i n a | 67
Figura 11- Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) ou associado ao lítio sobre as
concentrações de DA em corpo estriado de ratos após serem submetidos à
isquemia cerebral global através de HPLC. Os valores representam a média ±
EPM.
DA (ng/g tecido)
8000
6000
a
4000
a
a
2000
V1
0
0
V5
0
A
A
V2
5
A
IS
Q
FO
0
ISQ
b,c
a
6000
4000
b
c
2000
ISQ
A
i
0+
L
V1
0
+L
i
V5
0
A
V2
5
+L
i
Li
A
IS
Q
0
FO
DA (ng/g tecido)
8000
P á g i n a | 68
Figura 12- Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li
(10mg/kg, ip) sobre as concentrações de DOPAC em corpo estriado de ratos após
serem submetidos à isquemia cerebral global através de HPLC. Os valores
representam a média ± EPM.
DOPAC (ng/g tecido)
10000
8000
6000
4000
2000
a
b
b
b
V1
0
0
V5
0
A
A
V2
5
A
IS
Q
FO
0
ISQ
a
8000
a,a,b
6000
b
4000
b
2000
A
i
0+
L
V1
0
+L
i
V5
0
A
A
V2
5
+L
i
Li
IS
Q
0
FO
DOPAC (ng/g tecido)
10000
ISQ
P á g i n a | 69
Tabela 05 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao lítio
sobre as concentrações de dopamina e DOPAC em corpo estriado de ratos após
serem submetidos à isquemia cerebral global através de HPLC.
Grupos
Dopamina
DOPAC
3309±408,3 a
(14)
1525±314,7 b
(11)
Isquemiado (ISQ)
1672±211,0 (9)
386±103,9 (5)
ISQ+Ác. Valpróico 25 mg/kg
2012±322,8 (8)
818,4±125,8 b (5)
ISQ+Ác. Valpróico 50 mg/kg
3155±497,1 a (6)
1721±354,6 b (7)
ISQ+Ác. Valpróico 100 mg/kg
3498±529,52 a
(7)
2476±311,6 a (7)
Falso operado (FO)
3285±457,6 c
(12)
2370±327,4 b (9)
Isquemiado (ISQ)
1732±314 (8)
825,2±159,9 (7)
ISQ + Ác. Valpróico 25 mg/kg + Li
3885±423,5 (9)
2925±230,8 (6)
ISQ + Ác. Valpróico 50 mg/kg + Li
3848±569,6 a
(10)
3747±830,5 a (9)
ISQ + Ác. Valpróico 100 mg/kg + Li
5529±867,9 a,b
(7)
6859±1144 a,a,b
(7)
5614±1007 b (7)
6494±998 b (6)
Falso operado (FO)
ISQ + Lítio 10 mg/kg (Li)
Os valores representam a média ± EPM. Para análise estatística foi utilizado
ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc. Valores
significativos com p<0,1. a e p<0,05. b quando comparado aos grupos falso
operado (FO); Test t não pareado * quando comparado ao grupo isquemiado
(ISQ).
P á g i n a | 70
5.3 Atividade antioxidante
5.3.1 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio sobre a peroxidação
lipídica (tbars) no corpo estriado, córtex pré-frontal e hipocampo de ratos após serem
submetidos à isquemia cerebral global
Os efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio sobre a lesão
oxidativa ocorrida na isquemia cerebral após oclusão bilateral das artérias carótidas
foram avaliados através do teste TBARS para a dosagem das concentrações de
malondialdeído (MDA) como índice de peroxidação lipídica, com o objetivo de
identificar a neurotoxicidade induzida pela isquemia com relação ao estresse oxidativo e
a geração de radicais livres.
As concentrações de MDA no corpo estriado e córtes pré-frontal sete dias após a
isquemia cerebral global estão representadas nas figuras 13 e 14 respectivamente. Na
avaliação dos grupos que foram tratados com AV a isquemia cerebral promoveu uma
alteração no índice de peroxidação lipídica no corpo estriado observando-se um
aumento significativo dos níveis de MDA (μmol/g de tecido) quando comparado ao
grupo falso operado (FO: 432,6±20,50 a; ISQ: 1029±88,69). O tratamento com AV nas
doses de 25, 50 e 100 mg/kg reverteu esse efeito. Resultado este estatisticamente
significativo quando comparado ao grupo isquemiado (AV25: 449,6±20,82 a; AV50:
493,6,±19,76 a; AV100: 536,2±32,93 a). Nos grupos tratados com ácido valpróico em
associação com lítio também houve redução destes índices em todas as doses utilizadas
quando comparadas ao grupo isquemiado (AV25: 694,1±45,14b; AV50: 646,1±27,51b;
AV100: 413,3±60,90 a; Li: 658,5±67,37 b).
O tratamento com ácido valpróico nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg reduziu,
significantemente, o grau de peroxidação lipídica no córtex 7 dias após a isquemia
cerebral global, quando comparado ao grupo isquemiado (FO: 352,5±34,81a; ISQ:
1164±105,2; AV25: 559,2±68,86a; AV50: 465,9±44,03a; AV100: 620,9±65,74a). De
maneira semelhante obteve-se resultados siginificativos em todas as doses, pelo qual o
ácido valpróico foi administrado em associação ao lítio quando comparado ao grupo
isquemiado (AV25: 479,6±43,6 a; AV50: 602,6±52,25a; AV100: 536,1±31,71a; Li:
462,5±52,92a).
P á g i n a | 71
Figura 13- Efeitos da AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li (10
mg/kg ip) sobre os níveis de malondialdeído (MDA), utilizado como índice de
peroxidação lipídica, no corpo estriado de ratos após serem submetidos à isquemia
1500
1000
a
a
a
a
500
V1
0
0
V5
0
A
A
A
IS
Q
V2
5
0
FO
TBARS (mol MDA/g de tecido)
cerebral global. Os valores representam a média ± EPM.
1500
1000
b
500
b
b
a
a
A
ISQ
Li
0+
Li
V1
0
+L
i
A
V5
0
+L
i
V2
5
A
IS
Q
0
FO
TBARS (mol MDA/g de tecido)
ISQ
P á g i n a | 72
Tabela 06- Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao Li (10
mg/kg ip) sobre os níveis de malondialdeído (MDA) utilizado como índice de
peroxidação lipídica, no estriado de ratos após serem submetidos à isquemia
cerebral global.
Grupos
Falso operado (FO)
Isquemiado (ISQ)
TBARS (μmol MDA/g tecido)
432,6±20,50 a (7)
1029±88,69 (5)
ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg (AV25)
449,6±20,82 a (6)
ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg (AV50)
493,6,±19,76 a (7)
ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg
(AV100)
536,2±32,93 a (6)
ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg + Li
694,1±45,14 b (6)
ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg + Li
646,1±27,51 b (5)
ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg + Li
413,3±60,90 a (6)
ISQ + Lítio 10 mg/kg (Li)
658,5±67,37 b (6)
Os valores representam a média ± EPM. Para análise estatística foi utilizado
ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc. Valores
significativos com p<0,1. a e p<0,01. b quando comparado ao isquemiado (ISQ).
P á g i n a | 73
Figura 14 - Efeitos da AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao lítio (10
mg/kg ip) sobre os níveis de malondialdeído (MDA), utilizado como índice de
peroxidação lipídica, no córtex pré-frontal de ratos após serem submetidos à
1500
1000
a
a
500
a
a
V1
0
0
V5
0
A
A
A
V2
5
IS
Q
0
FO
TBARS (mol MDA/g de tecido)
isquemia cerebral global. Os valores representam a média ± EPM.
1500
1000
a
Li
500
a
0+
Li
a
a
a
A
V1
0
+L
i
A
V5
0
+L
i
V2
5
A
IS
Q
0
FO
TBARS (mol MDA/g de tecido)
ISQ
ISQ
P á g i n a | 74
Tabela 07- Efeitos do ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não ao
lítio (10 mg/kg ip) sobre os níveis de malondialdeído (MDA), utilizado como índice
de peroxidação lipídica, no córtex de ratos após serem submetidos à isquemia
cerebral global.
Grupos
Falso operado (FO)
Isquemiado (ISQ)
TBARS (μmol MDA/g tecido)
352,5±34,81 a (7)
1164±105,2 (5)
ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg (AV25)
559,2±68,86 a (6)
ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg (AV50)
465,9±44,03 a (7)
ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg
(AV100)
620,9±65,74 a (6)
ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg + Li
479,6±43,61 a (6)
ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg + Li
602,6±52,25 a (5)
ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg + Li
536,1±31,71 a (6)
ISQ + Lítio 10 mg/kg (Li)
462,5±52,92 a (6)
Os valores representam a média ± EPM. Para análise estatística foi utilizado
ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc. Valores
significativos com p<0,1. a quando comparado ao grupo isquemiado (ISQ).
P á g i n a | 75
A figura 15 representa as concentrações de MDA no hipocampo sete dias após a
isquemia cerebral global. Observa-se que o tratamento apenas com ácido valpróico
reduziu os níveis de MDA em todas as doses utilizada quando comparado ao grupo
falso operado e isquemiado (FO: 358,7±35,61a; ISQ: 1106±49,25; AV25: 497,7±43,89
a,b
; AV50: 559,6±28,44a,b; AV100: 590,2±73,97a,b). Da mesma forma, nos grupos
tratados com AV em associação com o lítio observou-se redução significativa das
concentrações de MDA (μmol/g de tecido) quando comparado aos grupos controles
falso operado e isquemiado (AV25: 770,2±47,34a,b; AV50: 555,5±28,75
696,7±54,96 a,b; Li: 536,6±66,41a,b).
a,b
; AV100:
P á g i n a | 76
Figura 15 - Efeitos da ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não ao
lítio (10 mg/kg ip) sobre os níveis de malondialdeído (MDA), utilizado como índice
de peroxidação lipídica, no hipocampo de ratos após serem submetidos à isquemia
1500
1000
500
a,b
a,b
a,b
a
V1
0
0
V5
0
A
A
A
IS
Q
V2
5
0
FO
TBARS (mol MDA/g de tecido)
cerebral global. Os valores representam a média ± EPM.
1500
1000
a,b
a,b
a,b
a,b
500
a
A
ISQ
Li
i
0+
L
V1
0
+L
i
A
V5
0
+L
i
V2
5
A
IS
Q
0
FO
TBARS (mol MDA/g de tecido)
ISQ
P á g i n a | 77
Tabela 08- Efeitos do ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não ao
lítio (10 mg/kg ip) sobre os níveis de malondialdeído (MDA), utilizado como índice
de peroxidação lipídica, no hipocampo de ratos após serem submetidos à isquemia
cerebral global.
Grupos
Falso operado (FO)
Isquemiado (ISQ)
TBARS (μmol MDA/g tecido)
358,7±35,61 a (7)
1106±49,25 (5)
ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg (AV25)
497,7±43,89 a,b (6)
ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg (AV50)
559,6±28,44 a,b (7)
ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg
(AV100)
590,2±73,97 a,b (5)
ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg + Li
770,2±47,34 a,b (6)
ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg + Li
555,5±28,75 a,b (6)
ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg + Li
696,7±54,96 a,b (6)
ISQ + Lítio 10 mg/kg (Li)
536,6±66,41 a,b (6)
Os valores representam a média ± EPM. Para análise estatística foi utilizado
ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc. Valores
significativos com p<0,01. a e b quando comparado ao grupo falso operado (FO) e
isquemiado (ISQ), respectivamente.
P á g i n a | 78
5.3.2 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio sobre a concentração de
nitrito no corpo estriado, córtex pré-frontal e hipocampo de ratos após serem
submetidos à isquemia cerebral global
Por meio da dosagem de nitrito é possível avaliar a presença de óxido nítrico no
tecido, já que o nitrito é um de seus metabólitos, sendo assim utilizado como marcador
indireto da formação de radicais livres. A avaliação de nitrito no corpo estriado de ratos
mostrou que houve redução significativa dos níveis de nitrito nos grupos tratados com
ácido valpróico sozinho nas dos de 50 e 100 mg/kg quando comparado ao grupo
isquemiado (FO: 9,31±1,16a; ISQ: 15,98±1,33; AV25: 13,3±0,79; AV50: 10,14±0,56 b;
AV100: 10,63±0,68b). O tratamento de ácido valpróico associado ao lítio apresentou
uma redução significativa somente na dose de 100 mg/kg e no tratamento feito apenas
com o lítio quando comparado ao grupo isquemiado (AV100: 6,05±0,68a; Li:
7,25±1,14a).
Quando o tecido avaliado foi o córtex pré-frontal, nenhum dos grupos em
questão apresentou diferenças entre si quanto às concentrações de nitrito comparando-se
ao controle isquemiado.
A isquemia promoveu um aumento significativo nos níveis de nitrito no
hipocampo sete dias após serem submetidos à cirurgia quando comparados ao grupo
controle isquemiado, como pode ser observado na figura 20. O AV em todas as doses
reduziu o nível de nitrito das amostras em relação ao grupo controle isquemiado (FO:
8,42±0,48a; ISQ: 19,63±1,96; AV25: 11,40±1,02a; AV50: 8,76±0,48a; AV100:
12,12±0,88a).
Em se tratando da avaliação dos níveis de nitrito no hipocampo de ratos tratados
com ácido valpróico associado a lítio observou-se que o tratamento foi capaz de
restaurar os níveis de nitrito para valores significativos em todas as doses inclusive no
tratamento feito apenas com lítio (AV25: 12,48±1,43a; AV50: 9,37±1,26a; AV100:
10,03±0,79a; Li: 5,72±1,01a,b).
P á g i n a | 79
Figura 16 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao lítio
(10mg/kg, ip) sobre a concentração de nitrito no corpo estriado de ratos 7 dias após
serem submetidos à isquemia cerebral global. Os valores representam a média ±
20
15
10
b
b
a
5
V1
0
0
V5
0
A
A
A
V2
5
IS
Q
0
FO
Nitrito (mol/g de tecido)
EPM.
20
15
10
a
a
a
5
ISQ
Li
i
0+
L
V1
0
+L
i
A
A
V5
0
+L
i
V2
5
A
IS
Q
0
FO
Nitrito (mol/g de tecido)
ISQ
P á g i n a | 80
Tabela 09- Efeitos do ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado
ao lítio (10mg/kg, ip) sobre os níveis de nitrito no estriado de ratos 7 dias após
serem submetidos à isquemia cerebral global.
Grupos
Concentração de Nitrito
(μmol/g tecido)
Falso operado (FO)
9,31±1,16 a (7)
Isquemiado (ISQ)
15,98±1,33 (6)
ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg (AV25)
13,3±0,79 (6)
ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg (AV50)
10,14±0,56 b (6)
ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg
(AV100)
10,63±0,68 b (6)
ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg + Li
12,16±0,57 (7)
ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg + Li
14,14±1,34 (6)
ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg + Li
6,05±0,68 a (6)
ISQ + Lítio 10 mg/kg (Li)
7,25±1,14 a (7)
Os valores representam a média ± EPM. Para análise estatística foi utilizado
ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc. Valores
significativos com p<0,05. a e b quando comparado ao grupo falso operado (FO) e
isquemiado (ISQ), respectivamente. Teste t não pareado * quando comparado ao
grupo isquemiado (ISQ).
P á g i n a | 81
Figura 17 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado ao lítio
(10mg/kg, ip) sobre a concentração de nitrito no córtex pré-frontal de ratos 7 dias
após serem submetidos à isquemia cerebral global. Os valores representam a
20
15
10
a
5
V1
0
0
V5
0
A
A
A
V2
5
IS
Q
0
FO
Nitrito (mol/g de tecido)
média ± EPM.
20
15
10
b
5
ISQ
Li
i
0+
L
V1
0
+L
i
A
A
V5
0
+L
i
V2
5
A
IS
Q
0
FO
Nitrito (mol/g de tecido)
ISQ
P á g i n a | 82
Tabela 10 - Efeitos do ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado
ao lítio (10mg/kg, ip) sobre os níveis de nitrito no córtex pré-frontal de ratos 7 dias
após serem submetidos à isquemia cerebral global.
Grupos
Concentração de Nitrito
(μmol/g tecido)
Falso operado (FO)
7,32±1,07 (7)
Isquemiado (ISQ)
13,51±1,39 (6)
ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg (AV25)
13,63±1,73 (6)
ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg (AV50)
11,42±0,64 (7)
ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg
(AV100)
14,07±1,41 (6)
ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg + Li
16,06±0,99 (6)
ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg + Li
12,14±0,65 (5)
ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg + Li
10,81±1,32 (5)
ISQ + Lítio 10 mg/kg (Li)
10,99±0,74 (7)
Os valores representam a média ± EPM. Para análise estatística foi utilizado
ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc. Valores
significativos com p<0,05. a e b quando comparado ao grupo falso operado (FO) e
isquemiado (ISQ), respectivamente. Teste t não pareado * quando comparado ao
grupo isquemiado (ISQ).
P á g i n a | 83
Figura 18 - Efeitos do ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não ao
lítio (10mg/kg, ip) sobre a concentração de nitrito no hipocampo de ratos 7 dias
após serem submetidos à isquemia cerebral global. Os valores representam a
25
20
15
a
a
a
a
10
5
V1
0
0
V5
0
A
A
A
IS
Q
V2
5
0
FO
Nitrito (mol/g de tecido)
média ± EPM.
25
20
a
15
10
a
a
a
a,b
5
ISQ
Li
i
0+
L
V1
0
+L
i
A
A
V5
0
+L
i
V2
5
A
IS
Q
0
FO
Nitrito (mol/g de tecido)
ISQ
P á g i n a | 84
Tabela 11 - Efeitos do ácido valpróico (25, 50 e 100mg/kg, vo) sozinho ou associado
ao lítio (10mg/kg, ip) sobre os níveis de nitrito no hipocampo de ratos 7 dias após
serem submetidos à isquemia cerebral global.
Grupos
Concentração de Nitrito
(μmol/g tecido)
Falso operado (FO)
8,42±0,48 a (7)
Isquemiado (ISQ)
19,63±1,96 (5)
ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg (AV25)
11,40±1,02 a (6)
ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg (AV50)
8,76±0,48 a (6)
ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg
(AV100)
12,12±0,88 a (6)
ISQ + Ácido Valpróico 25 mg/kg + Li
12,48±1,43 a (7)
ISQ + Ácido Valpróico 50 mg/kg + Li
9,37±1,26 a (6)
ISQ + Ácido Valpróico 100 mg/kg + Li
10,03±0,79 a (6)
ISQ + Lítio 10 mg/kg (Li)
5,72±1,01 a,b (6)
Os valores representam a média ± EPM. Para análise estatística foi utilizado
ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc. Valores
significativos com p<0,05. a e b quando comparado ao grupo falso operado (FO) e
isquemiado (ISQ), respectivamente. Teste t não pareado * quando comparado ao
grupo isquemiado (ISQ).
P á g i n a | 85
5.4 Análise histológica e imunohistoquímica
5.4.1 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio na imunomarcação
para a enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) nas áreas CA1, CA3, CT e GD do
hipocampo de ratos jovens submetidos à isquemia cerebral global
A lesão ocasionada pela isquemia cerebral global conduz a eventos inflamatórios
com aumento da expressão da enzima iNOS em áreas cerebrais sensíveis a este dano,
como é o caso do hipocampo. Com isso, foi avaliada de maneira qualitativa e
quantitativa a imunorreatividade para iNOS em algumas áreas hipocampais, como CA1,
CA3, CT e GD.
Observou-se através da análise quantitativa das imagens a imunohistoquímica
para iNOS em que os ratos do grupo isquemiado tiveram aumento na imunomarcação
em todas as áreas hipocampais. O tratamento com ácido valpróico nas doses de 50 e 100
mg/kg reduziu significativamente esta imunomarcação (figuras 21 a 24).
P á g i n a | 86
Figura 19 - Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para
iNOS na área CA1 hipocampal 7 dias após a isquemia em ratos tratados com AV
nas doses de 50 e 100 mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a
quantificação da densidade óptica obtida através do programa Image J®. ANOVA
de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
Figura 20 - Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para
iNOS na área CA3 hipocampal 7 dias após a isquemia em ratos tratados com AV
nas doses de 50 e 100 mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a
quantificação da densidade óptica obtida através do programa Image J®. ANOVA
de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
P á g i n a | 87
Figura 21 - Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para
iNOS na área do córtex (CT) após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses
de 50 e 100 mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da
densidade ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA de uma via
seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
Figura 22 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para
iNOS na área do giro dentado (GD) após a isquemia em ratos tratados com AV nas
doses de 50 e 100 mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a
quantificação da densidade ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA
de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
P á g i n a | 88
5.4.2 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio na imunomarcação
para enzima ciclooxigenase – 2 (COX-2) nas áreas CA1, CA3, CT e GD do
hipocampo de ratos jovens submetidos à isquemia cerebral global
A COX é uma enzima que catalisa a síntese de prostanóides, no atual estudo a
isoforma analisada foi a forma induzível, a COX-2. Esta é rapidamente expressa em
vários tipos de células em resposta a citocinas, fatores de crescimento e moléculas próinflamatórias.
Os resultados da imunohistoquímica para COX-2 em hipocampo de ratos
isquemiados sete dias após a isquemia, mostraram que o processo isquêmico aumenta o
número de células COX-2 positivas, considerando que a marcação está mais intensa
neste grupo em relação aos grupos FO. Das figuras 25 a 28, pode-se observar aumento
na imunomarcação nas áreas CA1, CA3, CT e GD em relação ao grupo ISQ. O ácido
valpróico reduziu de maneira significativa esta imunomarcação nas doses de 50 e 100
mg/kg.
P á g i n a | 89
Figura 23 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para
COX-2 na área CA1 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas
doses de 50 e 100 mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a
quantificação da densidade ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA
de duas vias seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
Figura 24 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para
COX-2 na área CA3 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas
doses de 50 e 100 mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a
quantificação da densidade ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA
de duas vias seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
P á g i n a | 90
Figura 25 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para
COX-2 na área CT hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas
doses de 50 e 100 mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a
quantificação da densidade ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA
de duas vias seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
Figura 26 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para
COX-2 no giro dentado (GD) hipocampal após a isquemia em ratos tratados com
AV nas doses de 50 e 100 mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a
quantificação da densidade ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA
de duas vias seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
P á g i n a | 91
5.4.3 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio na imunomarcação
para fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) nas áreas CA1, CA3, CT e GD do
hipocampo de ratos jovens submetidos à isquemia cerebral global
Os resultados da imunohistoquímica para TNF-α em hipocampo de ratos
isquemiados sete dias após a cirurgia, mostraram que o processo isquêmico reduz o
número de células TNF-α positivas em todas as áreas, considerando que a marcação está
mais intensa no grupo isquemiado.
É possível observar este efeito nas figuras 29 e 32, onde houve aumento na
imunomarcação, quando comparado ao grupo FO. A administração de ácido valpróico
reduziu de maneira significativa esta imunomarcação nas doses de 50 e 100 mg/kg,
como pode ser observado abaixo.
Figura 27 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para
TNF-α na área CA1 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas
doses de 50 e 100 mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a
quantificação da densidade ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA
de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
P á g i n a | 92
Figura 28 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para
TNF-α na área CA3 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas
doses de 50 e 100 mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a
quantificação da densidade ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA
de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
Figura 29 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para
TNF-α no CT hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de
50 e 100 mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da
densidade ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA de uma via
seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
P á g i n a | 93
Figura 30 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para
TNF-α no GD hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de
50 e 100 mg/kg. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da
densidade ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA de uma via
seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
P á g i n a | 94
Nossos resultados mostraram que a imunomarcação para TNF-α no hipocampo
foi mais intensa no grupo isquemiado, por outro lado quase nenhuma marcação é
encontrada no grupo falso-operado (FO). A coadministração de ácido valpróico e lítio
reduziu de maneira significativa esta imunomarcação nas doses de 50 e 100 mg/kg em
todas a áreas hipocamapais como pode ser observado abaixo, com destaque para a dose
de 50 mg/kg associada ao lítio. Esta marcação reduzida pra células que expressam TNFα nos grupos isquemiados tratados com AV e lítio sugere que a coadministração
melhore o processo isquêmico atuando em citocinas como o TNF-α (Figuras 33 a 36).
Figura 31 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para
TNF-α na área CA1 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas
doses de 25, 50 e 100 mg/kg associados ao lítio. Escala 200 μm e aumento de 400x.
Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através do programa Image J®.
ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
P á g i n a | 95
Figura 32 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para
TNF-α na área CA3 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas
doses de 25, 50 e 100 mg/kg associados ao lítio. Escala 200 μm e aumento de 400x.
Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através do programa Image J®.
ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
P á g i n a | 96
Figura 33 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para
TNF-α no giro dentado (GD) hipocampal após a isquemia em ratos tratados com
AV nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg associados ao lítio. Escala 200 μm e aumento
de 400x. Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através do programa
Image J®. ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
P á g i n a | 97
5.4.4 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio na imunomarcação
para a glicogênio sintase cinase-3 (GSK-3) nas áreas CA1, CT e GD do hipocampo de
ratos jovens submetidos à isquemia cerebral global
A atividade da GSK-3 modula diversos processos neuronais, incluindo a
sobrevivência, a apoptose e a dinâmica do citoesqueleto. A participação desta enzima
nos potenciais eventos neuroprotetores induzidos pelo acidente vascular encefálico
sobre células neuronais foi demonstrada uma vez que os níveis de GSK-3 apresentaramse aumentados em hipocampo de ratos isquemiados.
No entanto, através da análise quantitativa das imagens a imunohistoquímica
para GSK-3 o tratamento com ácido valpróico na dose de 100mg/kg e o lítio na dose de
10 mg/kg reduziu significativamente esta imunomarcação (figuras 34 a 36).
Figura 34 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para
GSK-3 na área CA1 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas
doses 100 mg/kg e lítio. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação
da densidade ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA de uma via
seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
P á g i n a | 98
Figura 35 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para
GSK-3 no CT hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de
100 mg/kg e lítio. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da
densidade ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA de uma via
seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
Figura 36 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para
gsk-3 no GD hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de
100 mg/kg e lítio. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado, a quantificação da
densidade ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA de uma via
seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
P á g i n a | 99
5.4.5 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio na
imunomarcação para a histona desacetilase (HDAC) nas áreas CA1 e GD do
hipocampo de ratos jovens submetidos à isquemia cerebral global
A organização da cromatina é crucial para regulação da expressão gênica. Em
particular as proprieades e o posicionamento do nucleossomo influenciam na transcrição
em resposta a sinais intra e extracelulares. As HDACs são uma família de enzimas que
removem o resíduo acetil do aminoácido lisina presente na extensão N-terminal do
núcleo das histonas. Uma vez que a inibição da atividade de HDAC reverte o
silenciamento epigenético frequentemnte obervado em várias neuropatologias, divesos
inibidores de HDACs têm sido desenvolvidos para fins terapêuticos.
Nossos resultados mostraram que a imunomarcação para HDAC no hipocampo
foi intensa no grupo isquemiado, enquanto que quase nenhuma marcação é encontrada
no grupo falso-operado (FO). O tratamento com ácido valpróico na dose de 100 mg/kg,
assim como o lítio sozinho reduziu de maneira significativa esta imunomarcação em
ambas as áreas hipocampais. Esta marcação reduzida pra células que expressam HDAC
nos grupos tratados com AV e lítio sugere a inibição desta enzima resultando numa
melhora do processo (Figuras 37 e 38).
P á g i n a | 100
Figura 37 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para
HDAC na área CA1 hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas
doses de 100 mg/kg sozinho e associado ao lítio. Escala 200 μm e aumento de 400x.
Ao lado, a quantificação da densidade ótica obtida através do programa Image J®.
ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
P á g i n a | 101
Figura 38 – Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para
HDAC no GD hipocampal após a isquemia em ratos tratados com AV nas doses de
100 mg/kg sozinho e associado ao lítio. Escala 200 μm e aumento de 400x. Ao lado,
a quantificação da densidade ótica obtida através do programa Image J®. ANOVA
de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc.
P á g i n a | 102
5.5 Efeitos do ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio sobre o dano cerebral de
ratos após serem submetidos à isquemia cerebral global
Os animais submetidos à isquemia cerebral apresentaram um aumento
significativo da área de infarto cerebral (dano cerebral isquêmico) analisado sete dias
após a isquemia em relação aos animais falso-operados (FO: 159542±5826; ISQ:
52420±11636). Os animais tratados com ácido valpróico nas doses de 25, 50 e 100
mg/kg apresentaram uma redução significativa nesse dano cerebral (AV25:
169773±4161; AV50: 159631±7625; AV100: 191358±3946). Semelhantemente os
animais tratados com ácido valpróico associado a lítio em todas as doses também
mostraram uma relevante diminuição do dano isquêmico quando comparados ao grupo
controle isquemiado (FO: 170418±4607; ISQ: 93910±14778; AV25: 176404±5360;
AV50: 182678±6589; AV100: 182914±8774; Li: 161446±3615).
Figura 39 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não ao lítio
(10mg/kg, ip) sobre o dano cerebral de ratos submetidos à isquemia cerebral. Os
valores representam a média ± EPM. Para análise estatística foi utilizado ANOVA
de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos
com p<0,05. a e b quando comparado ao grupo falso operado (FO) e isquemiado
(ISQ), respectivamente.
P á g i n a | 103
Figura 40 - Efeitos do AV (25, 50 e 100mg/kg, vo) associado ou não ao lítio
(10mg/kg, ip) sobre o dano cerebral de ratos submetidos à isquemia cerebral. Os
valores representam a média ± EPM. Para análise estatística foi utilizado ANOVA
de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos
com p<0,05. a e b quando comparado ao grupo falso operado (FO) e isquemiado
(ISQ), respectivamente.
P á g i n a | 104
6. DISCUSSÃO
O Acidente Vascular Cerebral é a segunda causa mais comum de morte e a
principal causa de incapacidade física em adultos (BALAMI et al., 2011). Cerca de 30 a
60% dos pacientes acometidos apresentam algum grau de inaptidão física após o evento
agudo (MALMANN, 2012). Assim, torna-se cada vez mais necessário estudos que
busquem novas terapias capazes de melhorar a qualidade de vida desses pacientes.
O animal de experimentação escolhido para o estudo foi o rato Wistar albino,
macho, com peso variando entre 200 e 250g. É um mamífero que apresenta um custo
acessível para aquisição e manutenção, de fácil manuseio, elevada resistência à infecção
e ao trauma cirúrgico e com um sistema de homeostasia admirável, além de grande
semelhança, do ponto de vista da anatomia e fisiologia cerebrovasculares, com as outras
espécies inclusive a humana (TORRES, 2003).
O modelo escolhido no estudo para mimetizar a isquemia cerebral foi o da
oclusão bilateral das carótidas, que é caracterizado pela redução crítica do fluxo
sanguíneo cerebral, seguido por lesão neuronal. Esse modelo é utilizado para reproduzir
a isquemia cerebral global em humanos, visto que é uma das principais características
da parada cardíaca, o que leva a críticas alterações neurológicas ao paciente (LIM et al.,
2004).
A isquemia cerebral global em roedores é caracterizada morfologicamente por
um dano neuronal particularmente em áreas como o hipocampo, mas também no corpo
estriado e no córtex (BLOCK, 1999). O dano resultante ocorre nas células vulneráveis,
notavelmente da região CA1 e região hilar hipocampal estando freqüentemente
associada com déficits de memória (HODGES et al., 1997).
O modelo de oclusão das artérias carótidas comuns sem a indução da hipotensão
sistêmica não causa redução crítica da circulação sanguínea cerebral e de uma maneira
geral não compromete o estado energético do cérebro (GINSBERG; BUSTO, 1989).
Por conseguinte, o modelo proposto por ULRICH et al., (1998) foi escolhido e
modificado, no qual o tempo de clampeamento de ambas as artérias carótidas foi de 30
minutos, para garantir a sobrevivência dos animais, com baixa taxa de mortalidade
aguda, sendo adequado para protocolo de tratamento subcrônico.
A disfunção do sistema nervoso central e os déficits cognitivos são
consequências consistentes da isquemia/hipóxia em humanos e outros mamíferos
(HATTORI et al., 2000; MAUD, 2006) e, sendo o principal objetivo das pesquisas
P á g i n a | 105
experimentais sobre isquemia, a melhora do resultado funcional da recuperação em
humanos, o presente trabalho avaliou o efeito do ácido valpróico sobre a extensão da
lesão neuronal, disfunções neurológicas, os déficits sensório-motor bem como as
alterações na memória dos animais submetidos à isquemia cerebral global transitória
por oclusão bilateral das artérias carótidas.
Estudos in vitro apontam que o ácido valpróico, uma droga anticonvulsivante e
estabilizadora do humor, tem efeitos neuroprotetores. Ming Ren (2004) relatou que o
AV usado na dose de 300 mg/kg reduziu danos cerebrais de ratos submetidos a
isquemia cerebral focal transitória por oclusão da artéria cerebral média. O tratamento
com AV suprimiu a ativação da enzima caspase-3 no córtex cerebral, bem como
aumentou os níveis de histona H3 no córtex e no estriado de ambos os hemisférios
ipsilateral e contralateral do cérebro observados 24 e 48h após a isquemia. O aumento
observado em níveis de histonas acetiladas no córtex e no corpo estriado de ratos
isquêmicos tratados com AV sugerem que a HDAC é efetivamente inibida pela presente
droga, confirmando em estudos in vitro que o AV é um inibidor direto da HDAC
(PHIEL et al., 2001).
Ximenes (2015) relatou o efeito neuroprotetor do AV em modelo de Parkinson
induzido por 6-OHDA. O ácido valproico reverteu parcialmente as alterações
comportametais e neuroquímicas induzidas no protocolo por 6-OHDA. Estes efeitos
estão provavelmente relacionados com a atividade antiinflamatória do AV sugerindo-o
fortemente como potencial candidato para ser incluso em estudos translacionais no
tratamento de doenças neurodegenerativas como Parkinson.
O lítio é muito utilizado na psiquiatria para o tratamento de desordens mentais
graves. Atualmente, as principais indicações médicas de lítio são para curto e longo
prazo no tratamento de transtorno bipolar e como coadjuvante no tratamento de quadros
depressivos. Mais recentemente, crescentes evidências vêm indicando que os benefícios
neurobiológicos do lítio pode ir além da estabilização do humor. Em modelos
experimentias, o tratamento com lítio tem sido associado à neuroprotecção, devido aos
seus efeitos sobre os vários mecanismos de homeostase neuronal envolvidos na ativação
de respostas neurotróficas, autofagia, estresse oxidativo, inflamação, regulação da
função mitocondrial e efeitos biológicos específicos implicados na patogênese de
doenças neurodegenerativas tais como, a doença de Alzheimer e a esclerose lateral
amiotrófica (FORLENZA, 2014).
P á g i n a | 106
Nas duas últimas décadas, muitos estudos têm mostrado que o lítio tem vários
efeitos neuroprotectores. Vários mecanismos têm sido propostos para justificar tais
efeitos clínicos. Evidências de estudos pré-clínicos sugerem que a neuroproteção
induzida pelo lítio está relacionado principalmente à sua potente inibição da enzima
glicogênio sintase-quinase-3β (GSK-3β). O Lítio é conhecido por inibir diretamente
atividade da glicogénio sintase quinase-3 (GSK-3) (KLEIN E MELTON, 1996;
STAMBOLIC et al., 1996). A GSK-3 é geralmente considerada como tendo uma
função pró-apoptótica e a sua inibição resulta em uma eficaz citoproteção (BIJUR E
JOPE, 2000).
O ácido valpróico e o lítio são duas drogas essenciais usadas para o tratamento
do transtorno bipolar, atuando como estabilizadores do humor e têm sido
frequentemente utilizados em combinação para o tratamento de pacientes bipolares
resistentes a monoterapia com qualquer um dos fármacos. O AV, um inibidor da
histona-desacetilase (HDAC) e lítio, um inibidor de glicogénio-sintase-quinase-3 (GSK3) apresentam efeitos neuroprotectores. Estudos demonstram efeitos neuroprotetores
sinérgicos quando ambas as drogas são coadministradas. O pré-tratamento de células
granulares do cerebelo com AV ou lítio sozinhos fornece pouca ou nenhuma
neuroprotecção contra a morte celular induzida pelo glutamato. No entanto, a coatuação de ambas as drogas resultou no completo bloqueio de excitotoxicidade do
glutamato (YAN LENG, 2008).
LENG (2008) demonstraram efeitos neuroprotetores sinérgicos robustos
contra a excitotoxicidade do glutamato, quando o estabilizadores de humor AV e lítio
foram usados em combinação. Tais evidências mostram que a neuroproteção induzida
pelo sinergismo dos fármacos citados está correlacionada com a inibição de GSK-3
sugerindo ainda mais o potencial uso na combinação de lítio e inibidores de HDAC por
intervir na neurodegeneração induzida por glutamato.
CROCE (2014) avaliaram os efeitos neuroprotectores do cotratamento de AV
e Lítio contra a neurotoxicidade induzida por glutamato em células de neuroblastoma
SH-SY5Y e demonstraram que a neuroproteção está associada ao aumento da síntese e
expressão de RNAm do BDNF . Estes dados elucidam o mecanismo de ação dessas
duas drogas quando utilizadas em combinação no tratamento de distúrbios bipolares e
reforçam a idéia de que eles podem ser usados para a prevenção e/ou tratamento de
outras perturbações neurodegenerativas relacionadas com o glutamato .
P á g i n a | 107
No atual estudo os testes comportamentais foram iniciados sete dias após a
cirurgia de indução do AVC isquêmico, tempo para os animais recuperarem-se do
trauma cirúrgico e do estresse da oclusão bilateral das carótidas que perdurou por 30
minutos. No teste de campo aberto, mostrou-se que, após a isquemia cerebral global os
animais apresentaram não só um aumento da atividade locomotora, mas também no
comportamento de rearing em relação aos animais isquemiados que não receberam
tratamento. Estes parâmetros representam a principal resposta motora durante a
organização do comportamento exploratório horizontal e vertical (CRUSIO, 2001).
Estudos realizados por KANHERE (2013) utilizando protocolo experimental
semelhante ao nosso, mas com tempo de isquemia transitória menor (10 minutos)
mostraram resultados semelhantes no que se refere à atividade locomotora no teste de
campo aberto.
As funções neurológicas comprometidas e demonstradas no teste do campo
aberto, foram restauradas de forma significativa no grupo de animais que recebeu ácido
valpróico nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg, (v.o.) em relação ao grupo de animais
isquemiados que não receberam tratamento. Os animais que foram tratados com ácido
valpróico associado a lítio também apresentaram um aumento significativo em tais
parâmetros nas doses de 50 e 100 mg/kg, v.o., assim como o próprio lítio administrado
sozinho. Bian 2007 mostrou que e a hiperatividade e o défict de aprendizagem/memória
foram restaurados em estudos com gerbilos submetidos à isquemia global e pré-tratados
com Lítio.
Yan (2007) mostrou que o tratamento com lítio diminuiu o déficit
comportamental e funcional em ratos submentidos a isquemia cerebral global transitória
ao aumentar a atividade exploratória no teste de campo aberto em todos os parâmetros
analisados (travessias, rearing e grooming) tais dados sugerem que o lítio pode
melhorar a aprendizagem e a capacidade de memória por reduzir a morte celular por
apoptose na região CA1 do hipocampo. Além disso, Laura 2014, mostra em modelo de
mania que o AV e o lítio usados em doses superiores as nossas, revertem parcialmente a
hiperatividade induzida por D-anfetamina associando esse efeito com o aumento da
atividade HDAC em córtex pré-frontal.
As alterações na função sensoriomotora, particularmente a atividade locomotora,
são fatores que comumente podem confundir os resultados nos testes cognitivos
(HATTORI et al., 2000). Assim no teste de campo aberto objetiva também analisar se o
animal não adquiriu nenhuma disfunção motora grave como consequência da cirurgia o
P á g i n a | 108
que prejudicaria a realização dos testes de memória. Dessa forma, como obtivemos
resultados significativos da atividade exploratória vertical (rearing) do animal, os
animais não apresentaram um déficit motor severo, o que não prejudicou a realização
dos testes cognitivos.
Para avaliar as alterações na memória espacial foi utilizado o teste do labirinto
aquático previamente descrito por Morris (1984), que mostrou a necessidade de
referências externas à piscina para formar uma percepção global de localização,
dependente principalmente do hipocampo. Contudo, além do hipocampo, a memória
espacial avaliada no labirinto aquático também depende de outras regiões cerebrais
como o corpo estriado, demonstrado por Block (1999), onde a injeção de ácido
quinolínico no estriado induziu alterações no desempenho de ratos no labirinto aquático
de plataforma submersa (D’HOOGE, DE DEYNN, 2001).
Algumas evidências mostram que a isquemia cerebral global transitória em
ratos adultos é capaz de levar a graves deficiências de aprendizagem e memória
(HARTMAN et al, 2005; LANGDON et al, 2008). A memória de trabalho pode ser
definida como uma memória de curta duração para estímulos ou localizações espaciais,
sendo armazenada temporariamente, pois será utilizada para o planejamento de uma
ação futura (DUDCHENKO, 2004).
Para avaliar a memória espacial dos ratos submetidos à isquemia cerebral
global, foi realizado neste trabalho o teste do labirinto aquático 7 dias após a cirurgia. O
quadro isquêmico prejudicou significativamente a memória espacial dos animais
isquemiados, observada no teste, e este efeito foi completamente revertido após o
tratamento com ácido valpróico na dose de 25 mg/kg e em todas as doses em que foi
associado ao lítio, inclusive quanto o lítio foi administrado sozinho. Yan (2007)
mostrou que o tratamento com lítio melhora a aprendizagem e a capacidade de memória
no teste de labirinto aquático 8 dias após a isquemia cerebral. Corroborando com os
nossos resultados, Ayca (2014) evidencia que o lítio diminui os déficits de memória e
aprendizagem espaciais em ratos submentidos a isquemia cerebral global.
Aiguo (2013) avaliou a correlação entre os neurônios sobreviventes em CA1 e
o estado funcional do cérebro utilizando o labirinto de aquático para examinar a
aprendizagem envolvida entre hipocampo e memória de ratos tratados com AV (300
mg/kg) mostrando que o AV melhora graves deficiências no desempenho cognitivo
espacial induzidas por isquemia global transitória. Também existem relatos da
neuroproteção do ácido cafeico melhorando a aprendizagem e memória de ratos
P á g i n a | 109
submetidos ao teste do labirinto aquático 8 dias após sofrerem um dano cerebral
semelhante ao que este estudo relata.
Déficits cognitivos promovidos por isquemia não ocorrem apenas quando há
morte neuronal. Yamamoto et al. (2009) demonstraram que 20 minutos de isquemia por
oclusão das artérias carótidas promoveu morte neuronal em CA1 e déficit de memória e,
que ao diminuir o tempo de isquemia para 5 minutos, a morte neuronal não ocorria, mas
o déficit de memória persistia. Esse déficit foi correlacionado com a diminuição da
expressão de CaMK-II, MAP-2 e o receptor GluR1.
É sabido que condições associadas a eventos isquêmicos conduzem a uma
intensa liberação de neurotransmissores no cérebro e alterações isquêmicas no corpo
estriado, córtex e hipocampo de animais submetidos a modelos experimentais de
isquemia cerebral (PULSINELLI; DUFFY, 2004).
A dopamina regula inúmeras funções não só no cérebro, mas também fora dele.
Com isso, este neurotransmissor influencia no comportamento e na atividade motora,
contribui na aprendizagem e funções cognitivas, modula hábitos alimentares, além de
auxiliar a regulação do fluxo sanguíneo em vasos como artérias. O corpo estriado
representa o principal input dos gânglios da base e os neurônios do corpo estriado
recebem uma grande convergência de aferentes de todas as áreas do córtex, que tem um
papel integrativo e computacional crucial, levando a aquisição de ações cognitivas e
motoras (GRAYBIEL et al., 1994; WICKENS et al., 2003).
A nossa observação no sétimo dia após a isquemia cerebral mostrou níveis
restaurados de DA a valores considerados normais ao serem comparados com o grupo
falso operado em todas as doses estudadas, com exceção da menor dose que foi
utilizada de ácido valpróico. De forma semelhante, os níveis de DOPAC foram
aumentados em todas as doses analisadas após o evento isquêmico. Nossos resultados
corroboram com dados da literatura que demonstram que, em modelo de isquemia
cerebral transitória ratos pré-tratados com pentoxifilina tiveram os níveis de DA
preservados no estriado (VIANA, 2009).
Processos fisiológicos no corpo estriado sofrem influência da dopamina por
meio de vários mecanismos, incluindo a modulação de vários canais iônicos voltagemdependentes. Assim a DA através de sua interação com receptores D1 pode induzir
inibição reversível do potencial de ação mediado por Na+ em neurônios estriatais e
reduz a transmissão excitatória no estriado de maneira voltagem-dependente
(CALABRESI et al., 1987; SURMEIER et al., 1992). Além disso, a DA modula
P á g i n a | 110
correntes de Ca2+ ativadas por voltagem, reduzindo de modo reversível as correntes de
Ca2+ do tipo P e N e aumentando correntes do tipo L em neurônios estriatais, através de
um mecanismo mediado pela proteína quinase A (PKA). De modo oposto, a ativação de
receptores D2 suprime correntes de Ca2+ através de canais de Ca2+ do tipo L e modula
correntes de K+ (SURMEIER et al., 1995; HERNANDEZ-LOPEZ et al., 2000; LIN et
al., 1996). Algumas evidências sustentam a hipótese de que a dopamina provavelmente
exerce múltiplas ações sobre a atividade fisiológica de neurônios estriatais, tanto
inibindo quanto aumentando a atividade neuronal dependendo do grau de
despolarização da membrana e do estado fisiológico do neurônio (CALABRESI et al.,
2007).
Normalmente, diversas reações do nosso organismo envolvem a síntese de
radicais livres, principalmente espécies reativas de oxigênio, porém mecanismos
endógenos conseguem impedir danos celulares. Mas, em condições em que a produção
destas substâncias torna-se descontrolada, isso representa uma ameaça à homeostase e
pode causar danos celulares irreversíveis. Tal desequilíbrio leva a um processo
denominado estresse oxidativo (KOPPULA et al., 2012).
A lesão decorrente da isquemia cerebral permanente ou transitória desenvolve-se
a partir de uma série de eventos fisiopatológicos que progridem com o tempo e em
regiões cerebrais específicas. A redução do fluxo sanguíneo cerebral em 20% a 30%
abaixo do normal é suficiente para iniciar esses eventos (OHTAKI et al., 2005). Além
disso, as consequências da isquemia, em diferentes tecidos, dependem de sua duração e
das lesões que se desenvolvem durante o estágio de reperfusão tecidual (SILVA JR et
al., 2002).
EROs e ERNs são produzidos fisiologicamente através do metabolismo celular,
em concentrações moderadas e desempenham importantes papéis nos processos de
sinalização celular, apoptose, expressão gênica e transporte iônico. Essas moléculas são
rigidamente controladas por antioxidantes que podem agir de maneira direta, atuando
como “scavenger” (seqüestradores), ou de maneira indireta através do aumento da
expressão de enzimas antioxidantes (LU et al., 2010). Porém, o excesso desses radicais
resulta em estresse oxidativo, um processo deletério capaz de mediar danos a estruturas
celulares, como lipídeos, proteínas e DNA (VALKO et al., 2007).
Por isso investigamos os efeitos do ácido valpróico sobre o estresse oxidativo
nas seguintes áreas, corpo estriado, córtex pré-frontal e hipocampo. No presente
trabalho, a peroxidação lipídica, através da quantificação dos níveis de TBARS, foi
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aumentada de modo significativo em cérebros de ratos que sofreram isquemia cerebral
global com relação ao grupo controle (falso operado). Esse efeito foi revertido após o
tratamento com ácido valpróico em todas as doses 7 dias pós-isquemia, no corpo
estriado. Assim como, os níveis de TBARS no córtex e no hipocampo foram
restaurados de maneira significativa em todas as doses analisadas apresentando
resultados significativos.
Um estudo conduzido por Chandrashekhar (2013) em que o protocolo
experimental de isquemia/reperfusão usado foi semelhante ao nosso, avaliou-se a
atividade neuroprotetora de Hibiscus vitifolius e mostrou que os níveis de TBARS
também reduziram quando comparados ao grupo controle. Estudos realizados com
modelo de indução de mania por administração de ketamina, tanto o ácido valpróico
como o lítio foram eficazes no controle dos níveis de TBARs, revertendo a
hiperatividade induzida (GHEDIM, 2012).
O óxido nítrico apresenta efeitos protetores durante a isquemia/reperfusão,
dilatando vasos e com isso aumentando a oferta de glicose e oxigênio, mas ao reagir
com o radical superóxido forma o íon peroxinitrito, conduzindo a efeitos deletérios no
tecido neuronal. Essa molécula é extremamente tóxica e danifica proteínas, lipídeos de
membrana e DNA. De maneira indireta podemos quantificar a produção do NO através
da dosagem de seu metabólito nitrito.
Com relação às concentrações de nitrito, indicador indireto de estresse oxidativo,
mostramos um aumento nos níveis de nitrito tanto no corpo estriado, como no
hipocampo. Estes efeitos foram revertidos pelo ácido valpróico neste protocolo
experimental O tratamento com ácido valpróico preveniu o aumento dos níveis de
nitrito no corpo estriado na dose maior e no hipocampo quando associado ao lítio nas
doses de 50 e 100 mg/kg.
Nossos resultados mostram que a isquemia cerebral global transitória induziu de
maneira significante a produção de marcadores de estresse oxidativo, com aumento da
liberação de MDA e nitrito, de maneira semelhante ao obtido no estudo de MARGAILL
et al., (2005). A morte neuronal tardia após isquemia transitória ocorre principalmente
devido à liberação de EROs e um aumento na peroxidação pode ser detectado
precocemente, logo após um quadro de isquemia/reperfusão (CHAN, 2001).
A imunomarcação para iNOS foi realizada em hipocampo sete dias após o
evento isquêmico. As áreas CA1, CA3, CT e GD foram analisadas, nas quais
observamos aumento da imunomarcação no grupo isquemiado quando comparado ao
P á g i n a | 112
controle, e este aumento foi totalmente revertido nos grupos tratados com ácido
valpróico nas doses de 50 e 100 mg/kg.
As reações inflamatórias envolvidas no processo isquêmico são intensificadas
durante a reperfusão e são devidas ao grande influxo de leucócitos e neutrófilos para a
região infartada resultado da interferência de moléculas de adesão específicas e
citocinas. Estas agravam o dano tecidual pela liberação de radicais livres e produtos
citotóxicos. Entre estes o NO e prostaglandinas são dois tipos de mediadores
pleiotrópicos produzidos no local da inflamação por enzimas como a sintase do óxido
nítrico induzida (iNOS) e pelas ciclooxigenases (COX-1 e COX-2). Evidências
mostraram que tanto a COX-2, quanto a iNOS são expressas durante a isquemia
cerebral e contribuem para o dano isquêmico induzido pós-isquemia. Células
inflamatórias cerebrais residentes também se tornam ativadas na isquemia cerebral e
liberam vários mediadores inflamatórios como NO, TNF-α, IL-1β e glutamato
(CANDELARIO-JALIL; FIEBICH, 2008).
Nas áreas CA1, CA3, CT e GD foram realizadas as imunomarcações para COX2, 7 dias após a isquemia. No grupo isquemiado houve um aumento significativo da
coloração nas áreas analisadas, quando comparadas ao grupo falso operado. Nestas
áreas, após tratamento com ácido valpróico nas doses de 50 e 100 mg/kg, tiveram essa
imunomarcação consideravelmente reduzida.
Sabe-se que a expressão de COX-2 aumenta de modo persistente após isquemia
cerebral em vários modelos experimentais. Com isso, evidências mostraram que a
expressão para COX-2 está aumentada em neurônios na área hipocampal CA1 após a
isquemia cerebral antes da morte celular em modelo de isquemia global transitória em
ratos. Valores máximos na expressão de COX-2 foram observados 12 a 24 h pósisquemia em várias regiões hipocampais, mas na região CA1 a expressão de COX-2 em
neurônios foi observado até no 3º dia pós-isquemia (CANDELARIO-JALIL; FIEBICH,
2008).
Os mecanismos por trás da morte celular neuronal envolvem neuroinflamação,
excitotoxicidade, apoptose, mecanismos antioxidantes modificados e necrose. Estes
mecanismos podem ser explorados como potenciais alvos para novas potencialidades
terapêuticas. A inflamação após isquemia afeta o tecido por um período de dias a
semanas (SCHILLING et al., 2003). TNF-α é uma potente citocina pró-inflamatória que
causa dano inflamatório proeminente (IADECOLA; ANRATHER, 2011).
P á g i n a | 113
Neste estudo, também foi realizada a imunohistoquímica para TNF-α 7 dias após
a isquemia. As áreas CA1, CA3, CT e GD de animais isquemiados foram
significativamente marcadas em relação ao grupo controle. O ácido valpróico nas doses
de 50 e 100 mg/kg reduziram esta imunomarcação. De maneira semelhante bservou-se
resultados significativos na imunomarcação para TNF-α nos grupos coadministrados
com AV e lítio em todas as doses, com destaque para a maior dose (100 mg/kg + Li).
Estudos mostram que o AV reduziu a degeneração neuronal observada no corpo
estriado de ratos lesionados em protocolo de indução de Parkinson por 6-OHDA. Além
disso, o tratamento com AV diminuiu a reatividade e expressão de células do tecido
nervoso como, microglia e astrócitos, bem como imunomarcação de TNF-alfa e HDAC
(XIMENES et al., 2015).
Estudos conduzidos por SINGH (2013) mostram que ratos adultos submetidos à
oclusão bilateral das artérias carótidas comuns por um período de 15 minutos seguida de
reperfusão contínua, apresentaram um aumento significativo dos níveis de TNF-α em
homogenato cerebral. Este resultado corrobora com os do nosso estudo, no qual a
imunomarcação para TNF-α foi significativamente aumentada nos animais isquemiados
por modelo experimental semelhante. É possível que os efeitos neuroprotetores do ácido
valpróico envolvam inibições nas induções de iNOS, COX-2 e TNF-α no cérebro
isquêmico.
De maneira semelhante aos nossos resultados, XUAN (2012) demonstrou em
modelo de isquemia transitória global que o AV administrado duas vezes diariamente
na dose de 300 mg/kg preveniu a morte de neurônios em CA1 pós-isquemia, assim
como evidenciou um melhor desempenho na aprendizagem e tarefas de memória. A
neuroproteção induzida por AV, provavelmente envolve múltiplos mecanismos de ação,
incluindo a capacidade de inibir significativamente a inflamação cerebral induzida pela
isquemia a atividade de HDAC e superindução de HSP70.
A GSK-3 é altamente expressa no SNC, em neurônios as principais vias de
sinalização regulatórias da GSK-3 são a via Wnt/beta-catenina e a via PI3K/Akt
estimulando a sobrevivência e o crescimento celular. Com isso, a atividade da GSK-3
influencia diretamente ou não em diversas vias de sinalização intracelular que
controlam aspectos essenciais do funcionamento neuronal como neuroplasticidade,
neurotransmissão, metabolismo celular, crescimento neuronal, polarização e morte
neuronal além da neurogênese hipocampal (DINIZ; 2011; ALBERTS et al., 2010).
P á g i n a | 114
Evidências também apontam o envolvimento da GSK-3 em doenças
neurodegenerativas, como Alzheimer e doença de Huntingtion e em doenças
psiquiátricas, como esquizofrenia e transtorno bipolar. Portanto, a atividade da GSK-3
parece estar inversamente relacionada à viabilidade neuronal (MOLZ et al., 2011).
Nossos resultados demonstraram que os animais tratados com ácido vlapróico e lítio
tiveram níveis reduzidos de GSK-3β em relação aos controles.
Recentes estudos têm demonstrado que diversos agentes, alguns já utilizados na
terapêutica, como o ácido valpróico, atuam sobre o complexo enzimático que está
envolvido nas modificações das histonas, revertendo a alteração epigenética e
permitindo a reativação de genes supressores do tumor e/ou outros genes que são
cruciais para o funcionamento normal das células (YOO et al., 2006). O uso dos
inibidores de HDAC tem produzido resultados preliminares bastante promissores,
porém, ainda existe a necessidade de maiores estudos quanto aos seus mecanismos e
efeitos em longo prazo, visto que, somente com um completo entendimento desses
modificadores epigenéticos, será possível o desenvolvimento de terapias mais efetivas.
Nossos resultados mostraram que a imunomarcação para HDAC no
hipocampo reduziu de maneira significativa nas áreas CA1 e GD inicando que houve a
inibição desta enzima, o que resulta numa melhora do processo isquêmico. XIMENES
(2015) demonstrou em seus estudos com modelo de Parkinson induzido por 6-OHDA
que o AV reduziu a imunoreatividade para HDAC em áreas como CA1, CA3 e no
córtex temporal, sugerindo fortemente o ácido valpróico como um potencial candidato
para ser incluso em estudos translacionais para o tratamento de doenças
neurodegenerativas como Parkinson.
A extensão do dano cerebral foi determinada neste trabalho utilizando-se a técnica
de coloração com TTC, que se baseia na deposição de um complexo vermelho insolúvel
resultante da metabolização do TTC pela mitocôndria. O TTC é um sal que é reduzido
pela succinato desidrogenase na membrana interna da mitocôndria, formando um
composto denominado, formazan, pelo qual dá uma coloração avermelhada ao tecido
com células viáveis. Portanto nas regiões onde há dano mitocondrial não ocorre o
depósito de corante nas células, deixando a região pálida, sem coloração vermelha
(GOLDLUST, 1996; TUREYEN, 2005).
P á g i n a | 115
7. CONCLUSÕES
Neste estudo, mostramos que o ácido valpróico sozinho ou associado ao lítio
protegeu os animais contra danos comportamentais e cognitivos, neuroquímicos e
histológicos, em modelo de isquemia cerebral global transitória. Em alguns parâmetros
analisados o AV quando administrado sozinho mostrou um efeito dose-dependente.
Contudo, os efeitos deste fármaco foram potencializados quando coadministrado com o
lítio. Vale salientar que o lítio quando utilidado sozinho também mostrou uma atividade
relevante diante de alguns parâmetros. Os efeitos benéficos das drogas supracitadas
manifestaram-se como:
1. Reversão parcial das alterações comportamentais e cognitivas pós-isquemia,
avaliadas nos testes do campo aberto e labirinto aquático;
2. Restabelecimento das concentrações de monoaminas, observadas pós-isquemia;
3. Reversão do aumento nos níveis de peroxidação lipídica e de nitrito, demonstrados no
corpo estriado, córtex e hipocampo dos animais isquêmicos;
4. Diminuição do processo neuroinflamatório determinado pela menor imunomarcação
para iNOS, COX-2, TNF-alfa, GSK-3 e HDAC.
5. Redução do percentual da área de dano isquêmico cerebral por disfunção
mitocondrial (TTC).
Considerando que o ácido valpróico é um fármaco seguro, bem tolerado e
apresenta um largo espectro de ações neuroprotectoras, parece promissor para investigar
seus efeitos benéficos no modelo de isquemia encefálica em animais e nos ensaios
clínicos usando esta droga para tratar pacientes com AV. Concluímos que os efeitos
neuroprotetores do ácido valpróico sozinho e principalmente na co-administração com o
lítio como observados no presente trabalho no modelo de isquemia global transitória em
ratos são possivelmente resultantes de alguns fatores como uma ação antioxidante,
antiiflamatória e neuroprotora. A combinação de ácido valpróico e lítio demonstrou
aumentar os benefícios terapêuticos pós-dano isquêmico. Com isso, levanta-se a
possibilidade de que o co-tratamento do ácido valpróico com lítio pode produzir efeitos
sinérgicos ou mais fortes contra a morte de células neuronais em condições
neurodegenerativas como no acidente vascular encefálico isquêmco.
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