estudo da atividade antinociceptiva do polissacarídeo

ESTUDO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DO POLISSACARÍDEO ISOLADO
DO AUREOBASIDIUM PULLULANS
Bruno Cerqueira da Silva¹; Flávia Oliveira de Lima²; Gildomar Lima Valasques
Júnior³; Sandra Aparecida Assis4
1.
3.
Bolsista PIBIC/CNPq. Graduando em Ciências Farmacêuticas. Universidade Estadual de Feira de Santana, email:
[email protected]
2. Orientador, Departamento de Saúde, Universidade Estadual de Feira de Santana, email:
[email protected]
Colaborador, Departamento de Saúde, Universidade Estadual de Feira de Santana, email: [email protected]
4. Colaborador, Departamento de Saúde, Universidade Estadual de Feira de Santana, email:
[email protected]
PALAVRAS – CHAVE: polissacarídeo, antinocicepção, Aureobasidium pullulans
INTRODUÇÃO
Dor pode ser definida como sendo uma experiência sensorial e emocional
desagradável associada a dano tecidual real, potencial ou descrita em tais termos (IASP,
1979). Ou seja, tanto aspectos físicos ou emocionais podem estar envolvidos no
desenvolvimento da dor.
No contexto mundial, a dor reduz a qualidade de vida de milhões de pessoas, sendo
uma das razões mais comuns de procura por serviços médicos (Kipel, 2004). Devido a sua
prevalência, muitos estudos têm sido desenvolvidos em busca de novas opções terapêuticas
para o controle da dor. Atualmente, é grande a utilização de anti-inflamatórios e analgésicos
para o controle da dor, entretanto, nem todos os pacientes respondem de maneira positiva ao
tratamento, e estes medicamentos podem causar vários efeitos adversos (Chopade; Mulla,
2010).
Os fungos vêm sendo utilizados historicamente pela indústria farmacêutica para
produção de novos fármacos. Eles representam uma rica fonte de metabólitos secundários e
macromoléculas, apresentando uma grande diversidade de estruturas químicas. Dentre essas
estruturas, destacam-se os polissacarídeos por possuírem enorme variedade de efeitos
biológicos, como propriedade antitumoral, antimicrobiana, antioxidante, anti-inflamatória e
imunomodulatória. Deste modo, o presente trabalho tem como finalidade avaliar a atividade
antinociceptiva do polissacarídeo isolado do Aureobasidium pullulans.
MATERIAL E MÉTODO
Obtenção do polissacarídeo
O polissacarídeo isolado do Aureobasidium pullulans, adquirido a partir da coleção de
cultura de Microrganismos da Bahia (CCMB, Feira de Santana, Brasil), foi purificado e
caracterizado pelo grupo de pesquisa da Profa. Dra. Sandra Aparecida de Assis. Para
caracterizar o polissacarídeo produzido, foram utilizadas as técnicas Espectrometria de
Infravermelho (FT-IR) e a Ressonância Magnética Nuclear (RMN).
Animais
Os experimentos foram realizados com camundongos machos da linhagem Swiss
Webster (20-30g) criados no biotério da Universidade Estadual de Feira de Santana. Os
animais foram alocados em caixas apropriadas e mantidos nas dependências do biotério, sob
temperatura de 22-25ºC e ciclos claro-escuro de 12 horas, com livre acesso a ração e água. O
trabalho foi previamente submetido e aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação
Animal da UEFS 181/2012.
Modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético
Os animais foram tratados por via intraperitoneal (i.p.) do polissacarídeo, em
respectivas doses (3, 9 e 27mg/kg, i.p.; diluídos em salina), ou salina (grupo controle
negativo) 30 minutos antes da administração intraperitoneal de ácido acético (0,8%, v/v,
10mL/kg). A morfina administrada via subcutânea (s.c.) (5mg/kg, s.c.; diluída em salina), foi
utilizada como fármaco de referência, 40 minutos antes do estímulo nociceptivo. A reação
avaliada foi a rotação do corpo com extensão das patas traseiras, caracterizando a contorção
abdominal (Collier et al., 1968). A intensidade de nocicepção foi quantificada com número de
contorções abdominais durante os 30 minutos seguintes ao estímulo. Durante o tempo de
observação os animais foram mantidos em cilindros de vidro com diâmetro de 22 cm.
Teste da formalina
Os animais foram tratados por via intraperitoneal do polissacarídeo, em respectivas
doses (3, 9 e 27mg/kg; diluídos em salina) ou salina (grupo controle negativo) 30 minutos
antes da administração de formalina 2% (20uL) no lábio superior de camundongos. A morfina
(5mg/kg, s.c.; diluída em salina), foi utilizada como fármaco de referência 40 minutos antes
do estímulo nociceptivo. Os animais foram mantidos em cilindros de vidro e observados
durante 40 minutos. Os animais foram observados de 0 a 5 minutos (fase neurogênica) e 15 a
40 minutos (fase inflamatória), o tempo que o animal esfrega o local de administração da
formalina, foi registrado com um cronômetro e considerada como nocicepção (Chavelou et
al., 1995; Luccarani et al., 2006; Quintans Júnior et al., 2010).
Teste da retirada da cauda
O limiar nociceptivo térmico foi avaliado pelo teste de retirada da cauda descrito por
D'Amour (1941) modificado para camundongos, método amplamente utilizado para avaliar
analgésicos de ação central (Roman, 2004). Antes do início dos experimentos, os
camundongos foram habituados aos cilindros de contenção durante 5 dias consecutivos (20
minutos por dia). Para medir a latência de retirada da cauda, os camundongos foram
colocados nos cilindros de contenção e a ponta da cauda (2 cm da extremidade) ficou imersa
em um banho de água à 48ºC + 0,5ºC (estímulo térmico nociceptivo). Foi considerada
resposta positiva o movimento brusco de retirada da cauda. Um tempo de corte de 10
segundos foi estabelecido para minimizar a probabilidade de dano na pele. Antes do dia do
experimento, latências de retirada da cauda foram medidas para a estabilização e
determinação do basal. No dia do experimento, o limiar nociceptivo foi avaliado em
diferentes tempos (30min, 1h, 3h e 5h) após a administração do polissacarídeo nas respectivas
doses (9, 27 e 81mg/kg, i.p.; diluídos em salina). A morfina (5mg/kg, s.c.; diluída em salina),
foi utilizada como fármaco de referência.
Teste do campo aberto
O teste do campo aberto avalia respostas comportamentais como atividade
locomotora, hiperatividade e comportamento exploratório. O aparato consiste em uma caixa
de acrílico opaco (50 cm x 60 cm x 45 cm), com piso demarcado em 12 quadrados iguais. No
momento do teste, os animais foram alocados em um dos cantos do aparato e foi registrado o
número de vezes em que os animais cruzam os quadrados com as quatro patas durante o
período de três minutos. Os animais foram tratados com o polissacarídeo (27mg/kg, i.p.;
diluído em salina), ou salina (grupo controle negativo) 30 minutos antes de serem alocados no
aparato para registro. Os resultados foram expressos em média de quantidade de quadrados
percorridos. O fármaco de referência utilizado foi o diazepam (10mg/kg, i.p.; diluído em
salina) com pré-tratamento de 30 minutos (Machado et al., 2007).
Análise estatística
Os resultados estão representados como média ± EPM de 6-8 animais por grupo
experimental, sendo os grupos experimentais comparados pelo teste one-way ANOVA,
seguido do teste de Bonferroni. O nível de significância foi de p < 0,05.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A avaliação da atividade antinociceptiva do polissacarídeo foi inicialmente feita pelo
teste de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético. A administração intraperitoneal
do polissacarídeo nas doses de 9 e 27mg/kg produziu inibição significante (p<0,05) do
número de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético. Morfina (5mg/kg, s.c.), um
opióide padrão utilizado como referência também produziu inibição significativa no número
de contorções (p<0,005). O teste de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético é um
método de triagem para a avaliação das propriedades analgésicas de novas substâncias
(Collier et al., 1968). Apesar de apresentar uma boa sensibilidade, o teste de ácido acético
demonstra baixa especificidade porque contorções abdominais podem ser suprimidas pelos
relaxantes musculares e outros medicamentos. Assim, um resultado positivo pode acabar
deixando margem para a interpretação errônea dos resultados (Le bars et al., 2001). Portanto,
para prevenir possíveis erros de interpretação dos resultados e ratificar o efeito
antinociceptivo do polissacarídeo utilizamos o teste de formalina.
A administração orofacial de formalina promove duas fases da sensibilidade à dor, que
pode não só servir para avaliar substância antinociceptiva, mas também para a elucidação dos
mecanismos de antinocicepção (Chavelou et al., 1995; Luccarani et al., 2006; Quintans Júnior
et al., 2010). A fase precoce (dor neurogênica), que não foi afetada pelo tratamento com o
polissacarídeo (p>0,05), ocorre por meio da estimulação química direta promovida pela
formalina em nociceptores. Enquanto que a fase tardia (dor inflamatória) é causada por
inflamação local e é associada com a liberação de mediadores químicos tais como a
histamina, a serotonina, a bradicinina, prostaglandinas e aminoácidos excitatórios (Hunskaar
& Hole, 1987). No presente estudo, a dose de 27mg/kg do polissacarídeo administrado
induziu atividade antinociceptiva apenas na fase tardia da formalina, é possível que o seu
efeito antinociceptivo seja devido, pelo menos em parte, a uma atividade anti-inflamatória.
De acordo com essa ideia, o tratamento com polissacarídeo não reduziu a nocicepção
no teste de imersão da cauda. Este teste, que consiste de um estímulo térmico, é um teste
usado para avaliar analgésicos com efeitos centrais. A administração intraperitoneal do
polissacarídeo (9, 27 e 81mg/kg) não aumentou a latência do tempo de retirada da cauda
comparada ao grupo controle (p>0,005). A administração de morfina (5mg/kg), fármaco
utilizado como referência, apresentou aumento significante do limiar por até 1 hora após sua
administração (p<0,001). O fato de que o polissacarídeo não produz efeito antinociceptivo no
teste de imersão da cauda sugere que este não bloqueia a transmissão da dor neural, como a
morfina.
Para descartar a hipótese de que algum prejuízo na resposta motora ou
comprometimento neurológico seria responsável pela ausência de resposta nos testes
nociceptivos após a administração do polissacarídeo, seus efeitos sobre a função motora
foram avaliados no teste do campo aberto. A administração do polissacarídeo na dose
terapêutica testada (27mg/kg) não induziu o comprometimento na coordenação motora
(p>0,05). A administração do diazepam (10mg/kg) apresentou inibição significante (p<0,05).
Esses resultados validam a especificidade da antinocicepção sugerida pelos testes
nociceptivos.
Com base nos resultados, podemos sugerir que o polissacarídeo isolado do
Aureobasidium pullulans induz antinocicepção periférica, provavelmente pela inibição de
mediadores inflamatórios. Mais estudos são necessários para elucidar o mecanismo de ação.
CONCLUSÃO
O polissacarídeo isolado do Aureobasidium pullulans apresentou uma importante
atividade antinociceptiva nos modelos experimentais de dor. Possivelmente, o polissacarídeo
testado induz antinocicepção periférica, por meio da inibição de mediadores inflamatórios.
Sugerindo, portanto, a possibilidade do desenvolvimento deste composto para o tratamento de
condições dolorosas inflamatórias orofaciais.
REFERÊNCIAS
CHAVELOU, P.; DALLEL, R.; ORLIAGUEL, T.; WODA, A.; RABOISSON, P. The
orofacial formalina test in rats: effect of different formalin concentrations. Pain 62: 295-301,
1995.
CHOPADE, A. R.; MULLA, W. A. 2010. Novel strategies for the treatment of inflammatory
hyperalgesia. Eur J Clin Pharmacol 66(5):429-44.
COLLIER, H. O. et al. 1968. The abdominal constriction response and its suppression by
analgesic drugs in the mouse. Br J Pharmacol Chemother 32(2): 295-310.
D'AMOUR, F. E. S.; D. L. 1941. A method for determining loss of pain sensation. The
Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 72: 74-79.
HUNSKAAR, S.; K. HOLE. 1987. The formalin test in mice: dissociation between
inflammatory and non-inflammatory pain. Pain 30(1): 103-14.
KIPEL, A. G. B. 2004. Prevalência da dor: mitos, medos e desacertos relacionados ao uso de
analgésicos opiáceos. Texto e Contexto Enfermagem 13(002).
LE BARS, D.; M. GOZARIU, et al. 2001. Animal models of nociception. Pharmacol Rev
53(4): 597-652.
LUCCANARI, P.; CHILDERIC, A.; GAYDIER, A. M.; VOISIN, D.; DALLEL, R. The
orofacial formalin test in the mouse: a behavioral model of studying physiology and
modulation of trigeminal nociception. Pain 7: 908-914.
MACHADO, D. G; KASTER, M. P.; BINFARÉ, R. W.; DIAS, M.; SANTOS, A. R. S;
PIZZOLATTI, M. G.; BRIGHENTE, I. M. C.; RODRIGUES, A. L. S. Antidepressant-like
effect of the extract from leaves of Schinus molles L. in mice: Evidence for the involvement
of the monoaminergic system. Progress in neuro-psychopharmacology & Biological
Psychiatry, v. 31, p. 412 – 428, 2007.
QUINSTANS-JÚNIOR, L. J.; MELO, M. S.; DE SOUSA, D. P.; ARAÚJO, A. A. S.;
ONOFRE, A. C. S.; GELAIN, D. P.; GONÇALVES, J. C. R.; ARAÚJO D. A. M.
ALMEIDA, J. R. G. S.; BONJARDIM, L. R. Antinociceptive activity of citronellal in
formalin-, capsaicin- and glutamate- induced orofacial nociception in rodents ant its action on
nerve excitability. J. Orofac Pain, 24 (3): 305-312, 2010.
ROMAN, A. A. R. S. 2004. Participação do óxido nítrico no efeito sedativo e
antinociceptivos dos agonistas alfa2-adrenérgicos. 2004. 94f. Dissertação (Doutorado em
Patologia Experimental). Curso de Pós-graduação em Patologia Experimental do
Departamento de Patologia Experimental da Universidade Federal Fluminense, Niterói.