Nicollas Gabriel de Oliveira Apr¡gio - CB JOIC FINAL

IDENTIFAÇÃO MOLECULAR ENTRE ESPÉCIES SEMELHATES DO GÊNERO
Leporinus (CHARACIFORMES, ANOSTOMIDAE) NA BACIA DO ALTO RIOPARANÁ.
Nícollas Gabriel de Oliveira Aprígio, Dhiego Gomes Ferreira, Aline Paulino da Silva, Thais
Kotelok Diniz, Jéssica Fernanda Bernardes Roda, Bruno Ambrozio Galindo. E-mail:
[email protected]
Universidade Estadual do Norte do Paraná/Campus de Cornélio Procópio.
Genética/Genética animal
Palavras-chave: identificação, barcode, diversidade.
Resumo
O gênero Leporinus engloba um grande número de espécies de peixes da ictiofauna de água
doce Neotropical, sendo encontrado em várias bacias hidrográficas, a exemplo do alto rio Paraná.
Nesta bacia, muitas espécies deste gênero, tais como Leporinus friderici, Leporinus obtusidens e
Leporinus Piavussu, estão entre os principais migradores de longa distância nesta drenagem.
Contudo, em alguns casos, a identificação morfológica destas espécies se torna difícil, causando
muita confusão e problemas para ações de manejo e conservação direcionadas a alguma espécie em
especial. De fato, em casos como este, vários estudos têm buscado ferramentas moleculares que
facilitem a identificação de espécies morfologicamente semelhantes. A partir disto, o presente
estudo buscou testar a aplicabilidade da utilização do gene COI (DNA barcode) na identificação
molecular de peixes migradores do gênero Leporinus coletados na bacia do alto rio Paraná. Para
isso, foram analisados 51 exemplares, sendo 11 provenientes do reservatório de Porto Primavera
(rio Paraná), 20 da planície de inundação (rio Paraná), nove do rio Pardo e onze do rio Verde. O
estudo indicou a existência de duas espécies entre as amostras estudadas, com uma distância
genética interespecífica significativa (acima de 2%). A partir do banco de dados BOLD e da árvore
de Neighbor Joining, baseado nas distâncias genéticas K2P, foi revelada a existência de 16 dos
indivíduos da espécie Leporinus obtusidens e 22 da espécie Leporinus piavussu. Assim, nossos
resultados mostram que a metodologia tem boa aplicabilidade na identificação destas espécies.
Introdução
Classificações de peixes são tradicionalmente realizadas com base em caracteres
morfológicos. Contudo, algumas vezes, esta classificação pode ser falha em decorrência da
plasticidade fenotípica e/ou variabilidade genética dentro das espécies (Hebert et al. 2003). Em
peixes de água doce Neotropical, por exemplo, situações como esta podem ser observadas entre
algumas espécies do gênero Leporinus, tais como Leporinus obtusidens Valenciennes, 1837,
presente nas bacias dos rios da Prata, São Francisco e Parnaíba, e Leporinus enlongatus
Valenciennes,1850 , espécie endêmica dos rios Jequitinhonha e Pardo (Heraldo et al. 2012). Em
decorrência deste fato, estudos têm buscado metodologias moleculares, tais como a utilização da
sequência do gene mitocondrial Citocromo Oxidase I (COI), na tentativa de facilitar a identificação
de das espécies (Ward e Frantine, 2015). A partir disto o presente estudo buscou verificar a
aplicabilidade da utilização do gene COI (DNA barcode) na identificação molecular de espécies
muito similares morfologicamente do gênero Leporinus, com ocorrência confirmada na bacia do
Alto Rio Paraná.
Material e métodos
Um total de 51 amostras de duas espécies migradoras do gênero Leporinus, previamente
indefinidas para Leporinus obtusidens e Leporinus piavussu, foram obtidas de diferentes trechos da
bacia do rio Paraná,11 do reservatório de Porto Primavera, 20 da planície de inundação, nove do rio
Pardoe onze do rio Verde, e analisadas a partir do sequenciamento parcial do gene mitocondrial
Citocromo Oxidase I (COI), comumente utilizado como DNA Barcode em peixes. O DNA foi
extraído a partir de um protocolo baseado em lavagens com Cloreto de Sódio 5M (Lopera-Barrero
et al., 2008), quantificado a partir de fluorímetro Qubit (Invitrogen) e diluído para a concentração de
5ng/µl. A amplificação do gene mitocondrial COI foi conduzida a partir dos primers FishF1
(5’TCA ACC AAC CAC AAA GAC ATT GGC AC-3’) e FishR1 (5’-TAG ACT TCT GGG TGG
CCA AAG AAT CA-3’) (Ward et al., 2005). As concentrações de reagentes na PCR e as condições
de amplificação foram conduzidas segundo Frantine-Silva et al. (2015). Após a amplificação, os
produtos de PCR foram purificados pela enzima Illustra™ExoStar 1-Step (GE Healthcare) e
utilizados para o sequenciamento de ambas as fitas de DNA a partir do kit BigDye
Terminator™(v.3.1-Applied Biosystems), seguindo as recomendações do fabricante. A leitura das
sequências foi conduzida em sequenciador automático ABI 3500 XL, e após o sequenciamento,
todos os contigs foram alinhados e editados a partir do aplicativo Clustal W (Thompson, 1994) no
programa BioEdit 7.1.3.0 (Hall, 1999). Para a identificação das sequências e análises filogenéticas
foi utilizado o banco de dados do BOLD e a construção de uma árvore de Neighbor Joining, usando
outras espécies do gênero: Leporinus silvestrii, Leporinus amblyrhynchus, Leporinus conirostris,
Leporinus striatus, Leporinus piau, Leporinus paranensis, baseado nas distâncias genéticas K2P.
Após alinhamento, as sequências foram comparadas com amostras do GenBank e também do
Museu de História da Universidade Estadual de Londrina (UEL).
Resultados e Discussão
No total, foram analisados 634 nucleotídeos do gene COI. A análise do banco de dados
BOLD e da árvore de Neighbor Joining, empregando distâncias genéticas K2P, revelaram a
existência de duas espécies do gênero Leporinus entre as amostras estudadas, Leporinus obtusidens
e Leporinus piavussu (Figura 1).
.Figura 1-Árvore Neighbor Joining mostrando a separação entre os exemplares de Leporinus
obtusidens e Leporinus piavussu
Um total de oito haplótipos, sendo quatro para Leporinus obtusidens e quatro para Leporinus
piavussu. H1 foi o principal haplótipo da espécie Leporinus obtusidens, sendo obtido em 24
amostras, enquanto os haplótipos H2, H3 e H4 foram encontrados em apenas um indivíduo cada. Já
nas amostras de Leporinus piavussu, H5 foi o haplótipos mais freqüente, sendo encontrado em 17
indivíduos. Enquanto isto, H7 foi obtido em 3 indivíduos, H8 em 2 indivíduos e H6 em apenas um
indivíduo.
O dendrograma de Neighbor Joining (Figura 1) mostrou uma clara divergência entre os
grupos formados por Leporinus obtusidens e Leporinus Piavussu, suportado por 87% de bootstrap
no ramo que separa os grupos. Dentre as 51 amostras estudadas, 27 foram identificadas como
Leporinus obtusidens e 22 como Leporinus piavussu, apresentando distâncias genéticas (K2P) interespecíficas acima de 2%, valor comumente assumido como indicativo de espécies distintas (Hubert
et al., 2008; Carvalho et al., 2011). Também utilizando o limiar de 2%, Frantine-Silva et al (2015)
obteve uma eficiência de 99.25% para a identificação molecular de 779 amostras de peixes da bacia
do rio Paranapanema, revelando 37 espécies diferentes. De modo similar, Carvalho et al. (2011)
analisaram 431 amostras de peixes da bacia do rio São Francisco, exibindo uma eficiência de 100%
na identificação molecular de 100 espécies distintas.
As diferenças intra-específicas não ultrapassaram 0,5%, o que também corrobora diferença
genética entre as duas espécies do presente. Segundo Pereira et al. (2013), 1,3% é o máximo de
diferença intra-específica obtido para espécies da ictiofauna Neotropical.
Conclusões
A identificação a partir da análise da sequência do gene COI mostrou-se muito eficaz, pois
conseguiu confirmar e, em alguns casos, corrigir identificações realizadas utilizando características
morfológicas. Esses dados são de grande importância e podem contribuir para a implementação de
planos de manejo e conservação que incluem espécies crípticas.
Agradecimentos
À Universidade Estadual do Norte do Paraná – UENP, Campus de Cornélio Procópio.
À Fundação Araucaria
À Fundação Boticário
À equipe do GECON (Laboratório de Genética e Conservação): Profº Dr. Bruno Ambrozio
Galindo, Profº Me. Dhiego Gomes Ferreira, Aline Paulino da Silva, Thais Kotelok Diniz, Jéssica
Fernanda Bernardes Roda, Caroline Apolinário da Silva, Jéssica da Silva Meschini, Mariana Costa
Terra, Jhonata Fragozo, Moema Cristina Costa de Lima e José Tavares.
Referências
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