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50º Congresso Brasileiro de Genética Resumos do 50º Congresso Brasileiro de Genética • 7 a 10 de setembro de 2004 Costão do Santinho • Florianópolis • Santa Catarina • Brasil www.sbg.org.br - ISBN 85-89109-04-6 [email protected] Palavras-chave: Ubiquitinação, Ligase E3, SmRbx, Schistosoma mansoni, Levedura Santos, DN; Tambor, JHM; Nóbrega, FG; Machado, CR; Franco, GR Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Bioquímica e Imunologia, UFMG Participação da proteína SmRbx de Schistosoma mansoni na formação do complexo de ubiquitinação de proteínas A ubiquitinação é parte do processo que leva à proteólise, onde a proteína poliubiquitinada é direcionada para a degradação pelo proteassomo 26S. A transferência da ubiquitina para a proteína alvo é feita por uma enzima ligase E3. Um dos membros da classe E3 é o complexo SCF. Este complexo é composto pelas proteínas Cul1, Skp1, um membro da família F-box e um membro da família RING box. Em humanos, esta última é denominada Rbx1 e seu homólogo em leveduras HRT1. Foi verificado que a proteína humana é capaz de complementar a letalidade de HRT1 em leveduras “knockout” para este gene, desempenhando ambas a mesma função bioquímica. Recentemente, isolamos em nosso laboratório o cDNA codificador da proteína SmRbx, o homólogo de Schistosoma mansoni a Rbx1 e HRT1. Para verificar se SmRbx está envolvida no processo de ubiquitinação, foi feito um estudo de complementação funcional heteróloga em leveduras. Para a obtenção de uma linhagem de levedura “knockout” para o gene codificador da proteína HRT1, leveduras Saccharomyces cerevisae diplóides foram utilizadas para a disrupção de um dos alelos do gene de interesse. A necessidade do uso de leveduras diplóides é devido ao fato do “knockout” haplóide de HRT1 ser letal. A disrupção do gene HRT1 de leveduras diplóides foi feita por recombinação homóloga, acrescentando-se o gene HIS3 no seu lugar. Leveduras diplóides “knockout” para um alelo de HRT1 e contendo o cDNA de SmRbx, clonado em plasmídio, foram esporuladas. Através de micromanipulação foram obtidas leveduras haplóides. A complementação funcional foi confirmada pela restituição do crescimento de leveduras haplóides “knockout” para HRT1, contendo o cDNA de SmRbx. Foi verificado que leveduras “knockout” contendo o gene de S. mansoni apresentam uma morfologia alongada e não são capazes de crescer nas temperaturas de 23°C e 37°C, mas possuem um crescimento normal a 30°C quando comparadas com a levedura selvagem. Estes resultados indicam que a complementação com o gene do parasita não é perfeita. Para identificar regiões da proteína SmRbx essenciais para sua função, mutantes do gene foram produzidos por várias deleções nas regiões N-terminal e C-terminal por PCR. Regiões envolvidas na interação com culina são essenciais para a função da proteína. Portanto, a interação de SmRbx e culina de leveduras foi testada pelo sistema do duplo-híbrido. Para esse ensaio, foi utilizada a porção da proteína Cul1 de S. cerevisiae que interage com Rbx1 e SmRbx completa e SmRbx∆24 (deletada de 24 resíduos N-terminal). Leveduras onde foi detectada a ativação dos genes repórteres HIS3 e β-galactosidase demonstraram que SmRbx, mas não SmRbx∆24, é capaz de interagir com Cul1. Estes resultados sugerem que a proteína SmRbx provavelmente está envolvida no processo de ubiquitinação, assim como suas homólogas de humanos e leveduras. Apoio financeiro: CAPES, CNPq e FAPEMIG 281
