Sistema de Expressão em Células Eucarióticas
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Expressão Recombinante em Células Eucarióticas 1-Introdução 2-Sistemas de expressão em leveduras Edmar Vaz de Andrade 1-introduçao Dificuldades em sistemas de expressão em Escherichia coli 1-Processamento pós-traducional da proteína (glicosilação) 2-Enovelamento da proteína na conformação nativa (corpos de inclusão) 3-Degradação da proteína recombinante pela E. coli. 2-Sistemas de expressão leveduras Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisae Fácil manipulação Cultivo relativamente rápido preservam as características favoráveis das bactérias Maior proximidade filogenética de animais do que as bactérias processamento pós-traducional comparável ao dos eucariotos pluricelulares 2-Sistemas de expressão leveduras Padrão de Glicosilação 2-Sistemas de expressão leveduras Pichia pastoris Alto rendimento de proteína recombinante Glicosilação comparável à realizada em células animais Maior eficiência de secreção 2-Sistemas de expressão leveduras Vetor de Expressão em Pichia pastoris Terminador de transcrição Promotor álcooloxidase Gene AmpR Peptídeo sinal Gene selvagem para biossíntese de histidina Origem de replicação em E. coli INVITROGEN 2-Sistemas de expressão leveduras Transformação de leveduras P. pastoris HIS4Recombinação Homóloga INVITROGEN 2-Sistemas de expressão leveduras Vetor de Expressão em Pichia pastoris Marca auxotrófica (nutricional) para biossíntese de histidina Cultivo em meio de cultura sem histidina Clones não transformados são inviáveis 2-Sistemas de expressão leveduras Vetor de Expressão em Pichia pastoris Indução da síntese de proteína recombinante com adição de metanol como fonte de carbono Para inibir o promotor: cultivo na presença de glicerol como fonte de carbono Obtenção da proteína solúvel no sobrenadante
