rotavírus como causa de diarréia em leitões giselda matos

ROTAVÍRUS COMO CAUSA DE DIARRÉIA EM LEITÕES
GISELDA MATOS XAVIER
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY
RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES- RJ
MARÇO – 2003
ROTAVÍRUS COMO CAUSA DE DIARRÉIA EM LEITÕES
GISELDA MATOS XAVIER
Tese apresentada ao Centro de Ciências e
Tecnologias Agropecuárias da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,
como parte das exigências para obtenção do
título de Mestre em Produção Animal
Orientador: Prof. Carlos Eurico Pires Ferreira Travassos
CAMPOS DOS GOYTACAZES- RJ
MARÇO – 2003
ROTAVÍRUS COMO CAUSA DE DIARRÉIA EM LEITÕES
GISELDA MATOS XAVIER
Tese apresentada ao Centro de Ciências e
Tecnologias Agropecuárias da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,
como parte das exigências para obtenção do
título de Mestre em Produção Animal
Aprovada em 24 de março de 2003
Comissão examinadora:
Prof a. Vera de Souza Gouvea (PhD - Epidemiologia/Virologia) - UFRJ
Prof a. Sílvia Regina Ferreira Gonçalves Pereira (Doutora-Microbiologia) - UENF
Prof a. Rita Trindade Ribeiro Nobre Soares (Doutora-Zootecnia) - UENF
Prof. Carlos Eurico Pires Ferreira Travassos (Doutor, Microbiologia) – UENF
(Orientador)
"Todo mundo é um cientista maluco e a vida é o Laboratório. A gente está sempre
experimentando, tentando achar um jeito de viver, de resolver os problemas, de se
livrar da loucura do caos”.
-- David Cronenberg
ii
A
Lucila Matos, Gisele Matos e familiares
Dedico
iii
AGRADECIMENTO
Agradeço a Deus pelas vitórias e, principalmente, pelas dificuldades
enfrentadas durante a realização deste trabalho, pois, com certeza, foram estes os
momentos em que mais precisei e notei Sua presença.
À minha mãe Lucila amada que, mesmo sem entender quase nada do que
eu fazia, sempre esteve disponível para ajudar-me.
À Gisele Matos e minha “dinda” Jô, sempre prontas a ouvir explicações
sobre Mestrado, Teses, etc.
Ao Prof. Carlos Eurico Travassos, pelo exemplo de ética e profissionalismo
que me incentivam a continuar trilhando o caminho da Pesquisa.
À Profa. Sílvia Regina Pereira, pelas inestimáveis orientações, aulas
ministradas e conselhos.
À equipe de Virologia, que, mesmo tão pequena, mostra-se tão unida.
A toda equipe do Laboratório de Virologia Molecular e Tropical da UFRJ, que
muito me ajudou nestes momentos finais: profa. Vera Gouvea, André Domingues,
Alexsandra Mendonça, Felipe Naveca e João.
A Jamile dos Santos e Lucíula Kfuri, que, mesmo de longe, torceram por
mim.
A Iliani Bianchi, por “sofrer” junto comigo os desafios deste trabalho.
A Isabel Bonna, Francimar Gomes e André Fernandes, pelos momentos de
descontração muitas vezes vindos na forma de pizzas, crepes e churrascos.
Aos professores Olney Motta, Francisco Carlos, Marcos Matta e Rita
Trindade, pelas dicas de como desenvolver este e outros trabalhos.
iv
A Gina Nunes pela paciência e atenção em ouvir meus problemas.
A Luciana Lemos, Rodrigo Crespo e Alessa Santos, pelo auxílio na
Anatomia Patológica e pelo cafezinho.
A Helaíne Haddad, que, mesmo em tão pouco tempo, já demonstrou ser
uma boa amiga.
A Etiene Ambrósio, que resolve quase tudo relacionado à pós-graduação,
sempre com muita paciência e bom humor.
A todos os suinocultores que permitiram o desenvolvimento deste trabalho.
À FENORTE, pelo auxílio financeiro.
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a concretização
deste trabalho.
v
BIOGRAFIA
Giselda Matos Xavier, filha de Lucila Cruz Matos e Antonio Oliveira Xavier,
nasceu em 26 de julho de 1972, na cidade do Rio de Janeiro – RJ.
Desde 1992, desenvolve pesquisa na área de Microbiologia, iniciando-se em
Microbiologia de Alimentos e estendendo-se à Microbiologia Parasitária.
Em 1995, foi admitida no curso de Medicina Veterinária pela então
Universidade Estadual do Norte Fluminense, onde continuou a dedicar-se à
pesquisa na área de Microbiologia.
Foi admitida, em março de 2001, no Curso de Pós-graduação em Produção
Animal, Mestrado, Sanidade Animal, da Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro (UENF), em Campos dos Goytacazes – RJ, submetendo-se à defesa
de tese para conclusão do referido curso em março de 2003.
vi
CONTEÚDO
RESUMO................................................................................................................ ix
ABSTRACT............................................................................................................. x
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 4
2.1. Caracterização dos rotavírus............................................................................ 4
2.2. Epidemiologia................................................................................................... 7
2.3. Patogênese e Patologia ................................................................................... 8
2.4. Imunidade contra a infecção ............................................................................ 9
2.5. Manifestações clínicas ..................................................................................... 9
2.6. Diagnóstico....................................................................................................... 9
2.7. Rotavirose em crianças .................................................................................. 10
2.8.1. Rotavírus em suínos................................................................................... 11
2.9. Tratamento, prevenção e controle.................................................................. 11
3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 12
3.1. Colheita das amostras.................................................................................... 12
3.2. Análise das fezes por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) contendo
duodecil sulfato de sódio (SDS) ............................................................................ 14
3.2.1. Preparo das amostras fecais....................................................................... 14
3.2.2. Preparo dos géis e aplicação das amostras................................................ 14
vii
3.2.3. Corrida eletroforética ................................................................................... 15
3.2.4. Coloração do gel ......................................................................................... 15
3.3. Extração de RNA viral das fezes e RT-PCR .................................................. 16
3.3.1. Extração de RNA viral ................................................................................. 16
3.3.2. Preparo das amostras e RT-PCR (1a.amplificação) .................................... 18
3.3.2.1. RT-PCR baseada na especificidade de VP7 (genotipo G) ....................... 18
3.3.2.2. RT-PCR baseada na especificidade de VP4 (genotipo P) ....................... 18
3.3.3.Tipagem através de PCR a partir de cDNA (2a amplificação) ...................... 19
3.3.3.1. Tipagem através de PCR para VP7 ......................................................... 19
3.3.3.2. Tipagem através de PCR para VP4 ......................................................... 19
3.3.3.3. Adição de cDNA e PCR............................................................................ 19
3.3.4. Eletroforese em gel de agarose .................................................................. 20
3.4. Isolamento de rotavírus em células MA-104 .................................................. 20
3.4.1. Cultura de células........................................................................................ 20
3.4.2. Tratamento das fezes.................................................................................. 21
3.4.3. Inoculação ................................................................................................... 21
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................ 23
4.1. SDS - PAGE................................................................................................... 23
4.2. Caracterização através de PCR ..................................................................... 26
4.3. Cultivo celular................................................................................................. 28
5. CONCLUSÕES ................................................................................................. 29
6. RECOMENDAÇÕES......................................................................................... 30
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 31
viii
RESUMO
XAVIER, Giselda, M., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro;
março de 2003; Rotavírus como causa de diarréia em leitões; Professor Orientador:
Prof. Carlos Eurico Pires Ferreira Travassos. Professoras Conselheiras: Sílvia
Regina Ferreira Gonçalves Pereira, Rita da Trindade R.N. Soares e Vera de Souza
Gouvea.
O crescimento da produção interna e da exportação de carne suína depende da
sanidade das granjas brasileiras. Leitões com rotavírus podem sobreviver à infecção,
mas o número de refugos e os gastos com medicamentos geram prejuízos aos
produtores. De 226 amostras de fezes de leitões testadas através de PAGE, quatro
foram positivas para rotavírus e caracterizadas através de RT-PCR em G3P[7]; G1G5P[7]; G5P[7] e G5P[5]. Uma das amostras caracterizou-se por mistura de duas
espécies diferentes de rotavírus.
Palavras-chave: diarréia, leitões, PAGE, RT-PCR.
ix
ABSTRACT
XAVIER, Giselda M., M.S., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro; março de 2003; Rotavirus causing diarrhea in piglets; Adviser: Carlos Eurico
Pires Ferreira Travassos. Counselor: Sílvia Regina Ferreira Gonçalves Pereira, Rita
da Trindade R.N. Soares e Vera de Souza Gouvea
The growth of internal produce and of pork meat exportation depend on the health
conditions of Brazilian farm animals. Piglets contaminated by rotavirus could survive
but the number of refusals and the costs on veterinary drugs is considered. Of two
hundred and twenty-six fecal specimens from piglets were positive to group A
rotavirus and characterized by RT-PCR in G3P[7]; G1-G5P[7], G5P[7] and G5P[1].
One of fecal samples presented a case of mixed infection involving two different
strains of rotavirus.
Key words: diarrhea, piglets, RT-PCR, PAGE.
x
vii
1
1. INTRODUÇÃO
O Brasil ocupa a quarta colocação em exportação de carne suína, sendo
superado apenas pelos Estados Unidos, Canadá e União Européia. Somente no ano
de 2002, o país contribuiu com cerca de 320 mil toneladas de carne suína
exportada. Apesar da considerável participação brasileira no mercado exterior, o
consumo de carne suína no país ainda é baixo. A título de ilustração, enquanto nos
EUA e na Europa o consumo desta carne por habitante/ano é de 24,00 e 42,00 kg,
respectivamente, no Brasil, este consumo só atinge 10,09 kg/habitante/ano
(DESOUZART, 2003).
Dentro do mercado brasileiro, a região Sul ainda responde pela maior
representação numérica, econômica e tecnológica dentro da suinocultura,
contribuindo com 34,53% de todo o rebanho suíno brasileiro. As regiões Sudeste e
Centro Oeste também têm recebido destaque em relação à produção de suínos,
respectivamente, com 18,93% e 15,87% de toda a produção (IBGE, 2001).
O manejo apropriado em granjas suinícolas pode aumentar o desempenho
reprodutivo, reduzir a mortalidade entre os animais (SOBESTIANSKY et al., 1998) e,
conseqüentemente, favorecer o crescimento da produção interna e do volume de
exportação.
O manejo sanitário de uma granja suinícola pode ser dividido em dois
grupos:
2
a) Manejo sanitário dirigido aos animais – consiste no monitoramento clínico
e laboratorial dos animais, visando não somente à prevenção, mas também ao
tratamento e controle de doenças.
b) Manejo sanitário dirigido ao ambiente – inclui desde controle da qualidade
do ar, temperatura e ventilação da granja até controle de moscas, roedores e outros
agentes potencialmente transmissores de doenças (SOBESTIANSKY et al., 1998).
Um manejo inadequado, bem como alterações ambientais, fatores
nutricionais e fisiológicos e uma grande gama de agentes etiológicos contribuem
para a síndrome de diarréias em suínos (GREGORI et al., 2000).
Em criações de sistema intensivo da região Sul do Brasil, por exemplo, a
taxa de mortalidade média de leitões lactentes varia de 15 a 20%, sendo o
esmagamento, a inanição e as diarréias as principais causas dessas perdas
(TAGLIARI e BRITO, 1998).
A diarréia é uma das principais enfermidades que afetam leitões lactentes
(BRITO et al., 1999). Sua etiologia é complexa, sendo primariamente um quadro
induzido pelo estresse do desmame, onde vários agentes infecciosos como
bactérias, protozoários e vírus podem estar envolvidos (SILVA et al., 1999).
Os rotavírus têm sido reconhecidos como os principais agentes causadores
de gastroenterite aguda em humanos e animais (SANDERS, 1985). São
encontrados isolados ou associados a outros agentes patogênicos (KAMINJOLO e
ADESIYUN, 1994), o que agrava em muito a sua manifestação, como ocorre em
infecções mistas entre rotavírus e Cryptosporidium (BARBOSA et al., 1998).
A importância econômica das diarréias causadas por rotavírus, isolados ou
associados a outros agentes infecciosos não se deve somente à morte dos leitões,
mas, principalmente, ao comprometimento de seu desenvolvimento até o momento
do abate (TAGLIARI e BRITO, 1998). Um exemplo disto é que Svensmark et al.
(1989), citados por BRITTO et al. (1999), observaram que leitegadas com diarréia
pré-desmame apresentavam menor uniformidade e pesavam, em média, 400g a
menos aos 30 dias em comparação com leitegadas sem diarréia.
Ainda que leitões infectados por rotavírus possam sobreviver, o número de
refugos e os gastos com medicamentos aumentam consideravelmente, gerando
prejuízos significativos aos suinocultores (TAGLIARI e BRITO, 1998).
Diante da importância que as diarréias assumem em relação à produtividade
das granjas suinícolas, o presente estudo teve por objetivo principal avaliar a
3
presença de rotavírus em suínos através da técnica de eletroforese em gel de
poliacrilamida com duodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE).
A partir das amostras positivas, foram traçados os seguintes objetivos:
•
Caracterizar os eletroferotipos por PAGE.
•
Isolar e adaptar o vírus em culturas de células.
•
Caracterizar os genotipos utilizando a técnica de reação
em cadeia de polimerase RT-PCR (reverse transcriptase – polymerase
chain reaction).
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Caracterização dos rotavírus
Estes vírus são classificados como um gênero pertencente à família
Reoviridae (RAMIG, 1994), que contém ainda outros oito gêneros distintos
(KAPIKIAN e CHANOCK, 1996). Os rotavírus não são envelopados e possuem
simetria icosaédrica (RAMIG, 1994). A partícula viral completa mede cerca de 70 nm
de diâmetro e é constituída de dois capsídeos, conhecidos como capsídeo externo e
interno. No interior do capsídeo interno existe uma terceira camada, o core (ou
cerne), que contém o genoma viral consistindo de 11 segmentos de RNA fita dupla
(dsRNA). O termo rotavÍrus é derivado da palavra em Latim “rota”, que significa
“roda”,e foi sugerido devido ao formato definido do capsídeo externo quando
observado por microscopia eletrônica de transmissão (KAPIKIAN e CHANOCK,
1996).
Os segmentos de RNA podem ser divididos em quatro classes com pesos
moleculares diferentes. Esta distribuição pode ser evidenciada através de PAGESDS (RAMIG, 1994). Os segmentos de RNA de 1 a 4 são denominados como grupo
I, os segmentos 5 e 6 como grupo II, os segmentos 7 a 9 como grupo III e os
segmentos 10 e 11 como grupo IV (ESTES et al., 1984), formando, ao final da
análise, uma migração característica denominada eletroferotipo (SILVA et al., 2001),
que, no caso do rotavírus do grupo A, assume o padrão IV-II-III-II (4-2-3-2). Cada
5
segmento de RNA codifica, pelo menos, uma proteína específica, sendo seis delas
estruturais e cinco não-estruturais (PRASAD e CHIU, 1994).
Com base nas características antigênicas presentes na proteína VP6,
codificada pelo segmento 6 do RNA e presente no capsídeo interno do vírus, os
rotavírus podem ser classificados em grupos (ou sorogrupos). Rotavírus do grupo A
já estão bem estabelecidos como agentes causadores de diarréia em animais e
humanos jovens. Os vírus pertencentes ao grupo B têm sido associados a epidemias
de diarréia aguda em adultos na China (ESTES, 1996). De acordo com trabalhos de
Saif & Jiang, 1994; Morin et al., 1990; Saif, 1980; Saif et al., 1980 citados por KIM et
al. (1999), os rotavírus do grupo C têm sido relatados como causa de diarréia
esporádica em leitões nas fases de amamentação e creche.
A propriedade antigênica de VP6 permite ainda a classificação dos rotavírus
do Grupo A em subgrupos, representados por algarismos romanos, que indicam
uma migração eletroforética no gel de poliacrilamida curta (subgrupo I) ou longa
(subgrupo II), conforme descrito por KAPIKIAN e CHANOCK, 1996.
A caracterização sorotípica do grupo A de rotavírus é baseada nos
determinantes de neutralização, localizados nas proteínas do capsídeo externo, VP4
e VP7, que são segregadas independentemente. A VP4 é uma proteína não
glicosilada, sensível à ação de proteases (tripsina, por exemplo), que é codificada
pelo segmento quatro do genoma viral e determina o sorotipo P (protease). A VP7,
por sua vez, é uma glicoproteína codificada pelo segmento 7, 8 ou 9, dependendo
da linhagem viral,que determina o sorotipo G (glicoproteína) (ROSEN et al., 1994).
Ensaios de neutralização com soro hiperimune permitem a identificação de
14 sorotipos G (G1 a G14), sendo seis (G1 a G5 e G9) descritos tanto em porcinos
como em humanos (Ciarlet et al, 1995 citados por PONGSUWAANA et al.,1996) e
um (G11) descrito exclusivamente em porcinos (KAPIKIAN e CHANOCK, 1996).
Dentre os sorotipos encontrados em suínos, G5 tem sido o mais prevalente
(SANTOS et al., 1999).
Uma classificação, baseada em ensaios de neutralização, permite também a
identificação de 11 sorotipos P, sendo dois específicos de porcinos (P9 e P2B)
(KAPIKIAN e CHANOCK, 1996). Entretanto, a classificação sorológica dos sorotipos
P tem sido dificultada pela indisponibilidade de soro hiperimune que distinga os tipos
P individuais (GOUVEA et al., 1994 b).
6
Através de técnicas de seqüenciamento, hibridização e amplificação de
ácidos nucléicos, é possível, ainda, classificar os rotavírus em, pelo menos, 15 tipos
P diferentes de acordo com a especificidade de VP4 (GOUVEA et al., 1994 b), e 11
tipos G distintos em relação à VP7 (KAPIKIAN e CHANOCK, 1996). Dentre os tipos
P, dois têm sido identificados em linhagens porcinas OSU e Gottfried (Estes e
Cohen, 1989, Negesha et al., 1993, Rosen et al., 1992, citados por GOUVEA et al.,
1994 b).
Desde 1985, a técnica de amplificação de DNA utilizando a reação em
cadeia de polimerase (PCR) tem sido uma ferramenta muito valiosa em biologia
molecular (KAWASAKI, 1990). O método simula o fenômeno de replicação do DNA
in vivo, onde, a partir de uma fita molde de DNA, é produzida uma nova fita
complementar ao molde (ROLFS et al., 1992). A partir de 1987, quando o PCR foi
utilizado para amplificar seqüências de mRNA a partir de cDNA, aumentou em muito
a sensibilidade de detecção do ácido nucléico, além de ter possibilitado a análise de
RNA a partir de amostras contendo poucas quantidades de RNA molde (KAWASAKI,
1990). Neste caso, o RNA deve ser transcrito a cDNA antes da amplificação. A partir
daí, o DNA é amplificado enzimaticamente através de vários ciclos de PCR, cada
ciclo envolvendo três etapas:
a) Desnaturação da fita molde de DNA, resultando na separação das fitas.
b) Anelamento dos primers à seqüência de DNA.
c) Duplicação e extensão do DNA (ROLFS et al., 1992).
A técnica de tipagem de produtos de PCR (PCR-Typing) para classificar
tipos G humanos de rotavírus foi desenvolvida por GOUVEA et al.(1990) e estendida
para incluir a classificação de tipos P humanos por GENTSCH et al. (1992), e G e P
animal por GOUVEA et al. (1994 a e b, respectivamente), contribuindo,
sobremaneira, para a caracterização genômica do vírus.
Uma das vantagens do PCR no diagnóstico molecular de rotavírus é sua
aplicabilidade para caracterizar linhagens virais difíceis de serem adaptadas em
cultura de células (SANTOS et al., 2002). Entretanto, a presença do RNA viral na
amostra não prova que a mesma seja infecciosa (GRATACAP-CAVALLIER et al.,
2000). Por esta razão, a adaptação e propagação de rotavírus em cultivos celulares
devem ser sempre requeridas para: facilitar o preparo de grandes quantidades de
vírus para uma caracterização adicional (incluindo PCR); estudos comparativos;
7
encontrar linhagens virais candidatas à produção de vacinas; e desenvolver novos
sorotestes adequados (THEIL et al., 1978).
Células de rim de macaco Rhesus (Linhagem MA-104) têm sido empregadas
na propagação de rotavírus de origem humana e animal (KITAMOTO et al., 1991). O
sucesso do isolamento de rotavírus humanos (WARD et al., 1984) e animais (RÁCZ
et al., 1993) tem sido relativamente alcançado com meio de cultura contendo tripsina
e estando livre de soro (WARD et al., 1984). Entretanto, em alguns casos são
necessárias várias passagens cegas em culturas de células, objetivando o
isolamento do vírus (RAMOS, 1996, THEIL et al., 1978). Isto porque não é raro o
vírus produzir um efeito citopático (CPE) moderado (THEIL et al. 1977) ou até
mesmo não se adaptar à cultura (SESTÁK e MUSILOVÁ, 1994).
2.2. Epidemiologia
A transmissão do vírus ocorre intraespécies e interespécies através,
principalmente, da via fecal-oral (MASCARENHAS, 1999), com um período de
incubação que pode variar de 1 a 4 dias, sendo que, em geral, a doença ocorre em
menos de 48 horas (KAPIKIAN e CHANOCK, 1996) caracterizando-se por febre,
vômito e diarréia. Vale ressaltar que o período de incubação pode chegar a 10 dias,
conforme observado no surto de diarréia aguda de camundongos lactentes da
Universidade de Harvard em 1944, que tornou conhecido o vírus como EDIM (vírus
da epizootia da diarréia em ratos infantis) (FLEWETT e WOODE , 1978).
Um dado interessante referente à epidemiologia de rotavírus é o fato da
possibilidade de reassortment (reagrupamento), que pode ocorrer quando células
são infectadas por dois ou mais vírus de diferentes linhagens, de modo que a
progênie decorrente dessa infecção poderá ter segmentos genômicos originados
dos dois vírus progenitores, formando uma nova constelação genômica (GOMBOLD
e RAMIG, 1994). Tal reagrupamento pode amplificar a transmissão interespécies,
além de aumentar a capacidade infecciosa do rotavírus a partir da emergência de
novas linhagens de rotavírus (SANTOS et al.,1999).
Os rotavírus mostram um padrão sazonal de infecção em países
desenvolvidos de picos epidêmicos ocorrendo nos meses mais frios do ano
(KAPIKIAN e CHANOCK, 1996), podendo, inclusive, variar muito em diferentes anos
(PARASHAR et al., 1998). No Brasil, a maior incidência de diarréias provocadas por
8
rotavírus, segundo observações de Cardoso et al., 1992, citados por LINHARES
(2000), ocorre nos meses mais secos do ano nas regiões Centro-Oeste, Sudeste e
Sul e nas demais regiões se mantém em torno de 20% durante todo o ano
(PEREIRA et al., 1993).
2.3. Patogênese e Patologia
Os vírus liberados nas fezes podem chegar à ordem de 109-1011 partículas
infecciosas por mililitro de fezes (FLEWETT e WOODE, 1978), sendo que a
excreção máxima ocorre entre o 3º e 4º dia após o início dos sinais clínicos
(MASCARENHAS, 1999). Água, alimentos e fômites contaminados funcionam como
fontes de infecção (MURPHY, 1995) tanto para o homem como para os animais. A
alta taxa de liberação viral nas fezes, associada à estabilidade que os rotavírus
possuem frente a diversos fatores ambientais, garante a grande transmissibilidade
deste vírus, o que, de um modo geral, dificulta em muito o seu controle. Por
exemplo, rotavírus presentes em fezes de bovinos conservam sua infecciosidade por
sete meses quando mantidos à temperatura ambiente (KAPIKIAN e CHANOCK,
1996) e rotavírus suínos mantidos nas fezes originais por 32 meses a 10oC ainda
são infecciosos (RAMOS et al., 2000).
Uma vez no hospedeiro, os vírus resistem ao pH ácido do estômago e
alcançam o trato intestinal, onde replicam nos enterócitos de revestimento das
vilosidades do intestino delgado (RAMIG, 1994), no duodeno e porção anterior do
jejuno (FLEWETT e WOODE , 1978). A partir da replicação, são liberadas novas
partículas virais que irão infectar outras células ou serão eliminadas através das
fezes, contaminando outros animais. Em pouco tempo, as lesões determinam a
atrofia e fusão das vilosidades intestinais, infiltração da lâmina própria por células
mononucleares, distensão das cisternas do retículo endoplasmático, turgidez e
diminuição de mitocôndrias, dentre outras lesões. Como conseqüência, ocorrerá
redução da área de absorção, impedindo a digestão de lactose e o transporte celular
de nutrientes e sais minerais, culminando com o quadro de diarréia (MARECO e
KROEFF, 2000).
9
2.4. Imunidade contra a infecção
Os mecanismos imunológicos de proteção contra a diarréia provocada pelos
rotavírus
envolvem
a
participação
de
anticorpos
presentes
no
intestino,
principalmente imunoglobulinas das classes A e G (IgA e IgG) (MASCARENHAS,
1999). Os anticorpos produzidos protegem, parcialmente, contra reinfecções futuras,
de modo que estas tenderão a se tornarem não muito severas (OFFIT, 1994).
Além disso, a imunidade adquirida contra rotavírus parece ser sorotipoespecífica. Assim, em infecções onde o sorotipo envolvido seja G5 (protótipo OSUOhio State University), por exemplo, a proteção alcançada para futuras infecções
será para G5, mas não para G4 (protótipo Gottfried) (SOLARTE et al., 1999).
2.5. Manifestações clínicas
A infecção por rotavírus produz vários tipos de respostas, que variam de
infecções subclínicas a doença severa e ocasionalmente fatal (KAPIKIAN e
CHANOCK, 1996). Inicialmente, observa-se febre e, em seguida, diarréia, podendo
ocorrer com ou sem vômito
microorganismos
(FLEWETT
e agravar-se quando associada a outros
e
WOODE,
1978)
.
A
desidratação
está
freqüentemente presente e o óbito ocorre de modo ocasional (KAPIKIAN e
CHANOCK, 1996).
2.6. Diagnóstico
O diagnóstico de rotavirose não pode ser fundamentado apenas na
observação dos sinais clínicos, uma vez que muitas patologias provocam sinais
semelhantes. Dessa forma, torna-se necessária a detecção do vírus ou do antígeno
viral e/ou a manifestação da resposta sorológica (KAPIKIAN e CHANOCK, 1996),
através
de
provas
tais
como:
SDS-PAGE,
microscopia
eletrônica,
PCR,
imunofluorescência, ELISA e aglutinação em látex. Dentre elas, a microscopia
eletrônica e o SDS-PAGE são as mais utilizadas, sendo a última freqüentemente
empregada em estudos epidemiológicos de infecções por rotavírus em humanos e
animais, com o objetivo de identificar as diferentes espécies do vírus envolvidas na
infecção (DANIEL et al., 1996).
10
2.7. Rotavirose em crianças
Em países desenvolvidos, tais como EUA, Austrália e Japão, estima-se que
entre 39 e 63% das hospitalizações de crianças com diarréia aguda deve-se à
infecção por RV (SANDERS, 1985). Em países em desenvolvimento, este vírus
também representa a causa mais isolada de diarréia aguda (NETO, 1987), sendo
responsável pela morte de 600.000 a 870.000 crianças por ano, o que corresponde
a 20-25% do total de óbitos por doença diarréica (LINHARES, 2000).
No Brasil, em particular, vários estudos foram realizados objetivando
determinar a prevalência das diarréias causadas por rotavírus entre crianças com
menos de seis anos de idade. Os índices de positividade variaram de 11,6% no Rio
de Janeiro a 42% no Rio Grande do Sul (LINHARES, 2000).
Estudos mostram uma alta prevalência de diarréias causadas por rotavírus
nos meses mais frios do ano (NETO, 1987). De acordo com Pereira et al., (1983),
citado por LINHARES (2000), nas regiões Centro-Oeste e Sudeste/Sul, observa-se
maior incidência de diarréia por RV nos meses mais frios e mais secos: cerca de
20% nos meses de maio a setembro, com picos de aproximadamente, 40% entre
junho e julho. Em contrapartida, nas regiões Norte e Nordeste tal sazonalidade não
foi observada, tendo sido encontrada prevalência em torno de 15% durante todo o
ano. Apesar do possível perfil sazonal das infecções por rotavírus, não se exclui a
ocorrência de surtos por este agente viral em meses do ano que não são
caracteristicamente frios e/ou secos.
2.8. Rotavirose em animais
Enterites em animais são freqüentemente multifatoriais e a interação de
outros agentes infecciosos com fatores imunológicos, ambientais e nutricionais pode
exacerbar a doença (MURPHY, 1995).
Rotavírus já foram descritos em bovinos, ovinos, suínos, eqüinos, caninos,
felinos, lagomorfos, roedores, símios e espécies aviárias (MURPHY et al., 1995).
Em aves, já foram relatados em frangos, pombos e patos (GARCIA et al., 1999).
11
2.8.1. Rotavírus em suínos
Devido ao fato da infecção por rotavírus ser restrita tipicamente à célula do
intestino delgado, tanto a imunidade passiva como a ativa é mediada por anticorpos
locais. Entretanto, os leitões nascem sem anticorpos maternos, pois não há
transferência transplacentária de anticorpos em suínos, apesar de serem
imunocompetentes. A proteção alcançada pela ingestão de colostro tão logo o leitão
nasça pode abreviar ou prevenir a doença em recém-natos, principalmente se a
ingestão ocorrer durante o período de absorção máxima do colostro pelo intestino,
nas primeiras 24-36 horas de vida do leitão (WARD et al., 1996).
2.9. Tratamento, prevenção e controle
O tratamento baseia-se na reposição imediata das perdas hidroeletrolíticas,
preferencialmente por via oral (NETO, 1987), através da administração de soluções
contendo glicose. A aplicação de antibióticos para controle de infecções bacterianas
secundárias pode auxiliar na recuperação do animal, além da melhoria das
condições de higiene da maternidade, através, por exemplo, de limpeza das celas
duas vezes ao dia, desinfecção semanal e colocação de uma espessa camada de
maravalha para proteger os leitões da umidade e do frio (EMBRAPA, 1987) e
contribuir bastante para a diminuição da incidência de infecções por rotavírus.
Uma vacina eficiente é a principal meta a ser alcançada para controlar e
prevenir
a
doença,
tanto
em
países
desenvolvidos
como
naqueles
em
desenvolvimento, uma vez que medidas sanitárias resultam em impacto inexpressivo
em relação à morbidade causada pelo vírus (LINHARES, 2000).
12
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Colheita das amostras
A baixa representatividade do Estado do Rio de Janeiro como produtor de
suínos dificultou a localização de granjas nas regiões Norte e Noroeste fluminense;
principalmente granjas onde algum tipo de manejo fosse empregado visando a um
maior aumento da produtividade e prevenção de doenças. Sendo assim, outras
granjas foram rastreadas, além do estado do Rio de Janeiro, em diferentes
localizações.
Foram colhidas 226 amostras de fezes entre o período de março de 2001 e
janeiro de 2003, a partir de leitões com idade variando de dois a 60 dias. Os locais
de colheita são mostrados na Tabela 1.
As amostras de fezes foram colhidas diretamente da ampola retal dos
animais, através de massagem abdominal ou estímulo com “swabs” e em condições
que inviabilizaram estes procedimentos foram colhidas das superfícies das
instalações, desde que as fezes fossem, evidentemente, recentes.
13
Tabela 1: Locais de colheita das amostras fecais
Municípios (Estado)
Número de amostras colhidas
Campos (RJ)
16
Itaocara (RJ)
10
Carapebus (RJ)
14
Itaperuna (RJ)
29
Quissamã (RJ)
01
São João da Barra (RJ)
06
Magé (RJ)
06
Rio das Ostras (RJ)
07
Macaé (RJ)
01
São Francisco de Itabapoana (RJ)
01
Amparo do serra (MG)
39
Muriaé (MG)
50
Limeira (MG)
07
Guarapari (ES)
13
Castelo (ES)
19
Cachoeiro de Itapemirim (ES)
03
Venda Nova do Imigrante (ES)
04
Total
226
As fezes foram classificadas de acordo com sua consistência, em líquidas
(53 amostras), pastosas (101 amostras) e firmes (72 amostras).
Após a colheita e identificação, as amostras foram transportadas em isopor
contendo gelo até o Setor de Virologia Veterinária do Laboratório de Sanidade
Animal da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, onde foram
armazenadas em freezer a –20oC, até o processamento.
14
3.2. Análise das fezes por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)
contendo duodecil sulfato de sódio (SDS)
3.2.1. Preparo das amostras fecais
Cada amostra de fezes estocada a –20oC foi parcialmente descongelada,
de modo que uma alíquota pudesse ser retirada e homogeneizada em uma
concentração aproximada de 10% (p/v) em 600 µL de tampão fosfato salina (PBS)
pH 7,4. A mistura foi, então, centrifugada (Centrifuge 5402 Eppendorf) a 8.000 x g
durante 4 minutos e à temperatura de 4o C.
Após a centrifugação, 15µL de sobrenadante foram transferidos para um
tubo tipo “eppendorf” contendo 5µL de tampão de tratamento da amostra (TA: 4 mL
de H2O destilada; 1 mL de Tris-HCL pH 6,8; 800 µL de glicerol; 1,6 mL de SDS a
10%; 400 µL de 2-β-mercaptoetanol; 400 µL de azul de bromofenol a 1%). A amostra
foi, então, incubada em banho-maria a 56o C durante 30 minutos.
3.2.2. Preparo dos géis e aplicação das amostras
Os géis foram preparados conforme descrito por LAEMMLI (1970), com
modificações.
Para a corrida eletroforética foram utilizadas concentrações diferentes de
poliacrilamida para formação dos géis (4% para o gel de concentração e 10% ou
7,5% para o de resolução) (Tabela 2), que foram mantidos em repouso por, pelo
menos, 30 minutos para completa polimerização.
Tabela 2: Preparo de um gel de poliacrilamida para mini-cuba 10 X 10 cm
com espaçadores de 0,5 mm de espessura
Soluções
Concentração do gel
Água destilada (dH2O)
Tris-HCl
SDS 10%
Persulfato de Amônia
Acrilamida/Bis
TEMED
Volume total
Volumes para cada concentração do gel
4,0
4,5%
10%
1,5 mL
2,4 mL
2,0 mL
(0,5 M-pH 6,8)
(1,5 M-pH 8,8)
(1,5 M-pH 8,8)
1,25 mL
1,25 mL
625 µL
25 µL
50 µL
50 µL
25 µL
50 µL
50 µL
1,25 mL
1,65 mL
325 µL
5 µL
10 µL
10 µL
2,5 mL
5 mL
5 mL
15
As amostras previamente incubadas a 56 oC/10-15 min. com TA foram
aplicadas individualmente no volume de 20 µL. Em cada gel foi aplicado um controle
positivo com rotavírus Wa, obtido a partir de cultivo celular e cedido pelo Laboratório
de Virologia Molecular e Tropical da Universidade Federal do Rio de Janeiro. O
controle aplicado foi adicionado a TA e incubado juntamente com as amostras.
3.2.3. Corrida eletroforética
As amostras processadas foram analisadas em cuba vertical (Mini-Protean
3, Bio-Rad) contendo solução tampão de corrida 1x (tampão concentrado 10x: 30g
Tris-Base; 144,1g glicina; 10g SDS) e utilizando-se uma fonte elétrica (modelo FB
300, Fisher Scientific).
A corrida eletroforética foi realizada obedecendo-se às condições descritas
abaixo:
•
Gel com 10% de poliacrilamida ⇒ a corrida foi realizada a
100v, durante 30 minutos e, após este tempo, a voltagem foi elevada
para 150v. Depois da saída do corante azul, a corrida ainda prosseguiu
por mais 2 horas.
•
Gel com 7,5% de poliacrilamida ⇒ a corrida foi realizada a
100v, durante 30 minutos e, após este tempo, a voltagem foi elevada
para 150v. Depois da saída do corante azul, a corrida ainda prosseguiu
por mais 1 hora.
3.2.4. Coloração do gel
Depois da corrida eletroforética, o gel foi impregnado com nitrato de prata
para observação das bandas de RNA viral (HERRING, 1982).
Inicialmente, o gel foi agitado em solução fixadora (10mL de etanol; 0,5mL
de ácido acético glacial; 100mL de água destilada - dH2O) durante 30 minutos e,
após este período, foi rapidamente lavado com água destilada, sendo em seguida
mantido sob agitação em uma solução de nitrato de prata (0,16g de AgNo3; 100mL
de dH2O) durante 30 minutos. Novamente, o gel foi rapidamente lavado com água
destilada e mantido sob agitação em solução reveladora (10mL de NaOH 7,5M;
16
750µL de formaldeído; 100mL de dH2O) até o aparecimento das bandas de dsRNA.
O aparecimento destas foi possível através do monitoramento do controle positivo.
Quando o gel apresentou a coloração desejada, foi rapidamente lavado em
água destilada e colocado sob solução de parada (5mL de ácido acético glacial;
10mL de etanol; 1mL de Glicerol; 100mL de dH2O), permanecendo nesta solução
por, no máximo, 24 horas. Em seguida, o gel foi dessecado entre duas folhas de
papel celofane em suporte de vidro.
3.3. Extração de RNA viral das fezes e RT-PCR
3.3.1. Extração de RNA viral
A maior dificuldade no processo de extração de RNA é evitar a ação de
ribonucleases (RNases). Estas enzimas são muito estáveis e não requerem
cofatores para suas atividades. Por isso, todo material usado deve ser esterilizado e
livre de RNases, bem como o uso de luvas é imprescindível para que a
contaminação por microrganismos (que podem funcionar como fontes de RNases)
seja evitada (ROLFS et al.,1992).
Em tubo eppendorf contendo 400µL de isotiocianato de guanidina (GITC) 4M
foram adicionados cerca de 10% de fezes (p/v), sendo a mistura homogeneizada em
agitador de tubos (modelo AAP 56- Phoenix) por pelo menos dois minutos e em
seguida centrifugada (Biofuge Haemo- Heraeus Instruments) a 9000 x g durante 15
minutos.
O sobrenadante clarificado foi transferido para outro tubo e igual volume de
fenol-clorofórmio foi adicionado, sendo a mistura homogeneizada e centrifugada a
10000 x g durante 5 minutos.
O sobrenadante foi transferido para outro tubo e igual volume de Clorofórmio
foi adicionado, sendo a mistura homogeneizada e centrifugada a 10000 x g durante
1 minuto.
A fase aquosa foi separada em outro tubo e NaCl 5M foi adicionado, de
modo que a concentração final alcançada fosse de 0,2M. Feito isto, dois volumes de
etanol P.A., previamente estocado a –20oC, foram adicionados e a mistura
homogeneizada e incubada “overnight” a –20oC.
17
Após a incubação, a mistura foi centrifugada (Micro Table Top Refrigerated
Centrifuge CR 15T- Hitachi) a 6500 x g durante 20 minutos a 4oC e o sobrenadante
desprezado.
Ao sedimento foi adicionado 1mL de etanol a 75%, previamente
acondicionado a –20oC, sendo a mistura homogeneizada e centrifugada a 6500 x g e
4oC durante 20 minutos.
O sobrenadante foi desprezado e o sedimento seco em forno de hibridização
(Fisher Scientific Isotemp) a 37oC. Em seguida 400 µL de água de milliQ estéril
foram adicionados ao sedimento e a mistura homogeneizada.
Um volume de 50 µL de hidroxiapatita foi adicionado ao tubo e a mistura
homogeneizada durante 30 minutos em homogeneizador de sangue Phoenix,
modelo AP22. Em seguida, a mistura foi centrifugada a 6000 x g durante 1 minuto e
1mL de solução KP 10 mM foi adicionado. A mistura foi, então, homogeneizada,
durante, pelo menos, um minuto e centrifugada, em seguida, a 6000 x g rapidamente
(1 minuto). Em seguida, o sobrenadante foi descartado e 200 µL de solução KP 200
mM adicionados. Esta mistura foi então homogeneizada, incubada em forno de
hibridização a 37OC durante 10 minutos e centrifugada rapidamente a 6000 x g (1
minuto), sendo o sobrenadante transferido para outro tubo (tubo1).
Ao tubo contendo a hidroxiapatita precipitada foram adicionados 200µL de
solução KP 200 mM e a mistura homogeneizada, incubada a 37oC durante 10
minutos e rapidamente centrifugada, sendo o sobrenadante adicionado ao tubo que
já continha igual volume de sobrenadante (tubo1), perfazendo um volume final de
400 µL de solução.
Ao volume final de 400µL foram adicionados 65µL de hexadeciltrimetilbrometo de amônio (CTAB) 5%, 40 µL de NaCl 5 M e 40 µL de EDTA 0,5 M. A
mistura foi homogeneizada, incubada em banho-maria a 56oC durante 30 minutos e
centrifugada a 10000 x g durante 5 minutos, sendo o sobrenadante desprezado em
seguida.
Ao sedimento foram adicionados 400 µL de água de milliQ estéril e a mistura
foi homogeneizada por pelo menos 2 minutos. O volume de 40 µL de NaCl 5M e 1
mL de Etanol P.A. gelado foi adicionado à suspensão, sendo a mesma incubada a –
20oC “overnight”.
Após incubação, a suspensão foi centrifugada a 10000 x g, durante 10
minutos e o sobrenadante desprezado. Este procedimento foi realizado novamente,
18
sendo, por fim, o sedimento seco em forno de hibridização a 37oC e adicionado de
40 µL de água de milliQ estéril, sob forte agitação.
3.3.2. Preparo das amostras e RT-PCR (1a.amplificação)
Em fluxo laminar (modelo FLV-Trox), eppendorfs foram adicionados de 1,5
µL de dimetilsulfóxido (DMSO) e 4 µL de cada amostra de dsRNA, previamente
extraídas. Cada tubo foi incubado em banho-seco a 94OC durante 3 minutos e
imediatamente repousado em banho de gelo.
3.3.2.1. RT-PCR baseada na especificidade de VP7 (genotipo G)
Em tubo eppendorf foi preparada uma mistura de reação padrão
(Mastermix), conforme preconizado por GOUVEA et al. (1990), com as seguintes
modificações: 17 µL de água de milliQ estéril; 0,75 µL de MgCl2 50 mM (Gibco-BRL);
2,5 µL de 10X PCR Buffer sem Mg
++
(Gibco-BRL); 0,5 µL dNTP 10 mM; Primer G
(gene 9, Beg9-End9); 0,1 µL de RT-AMV (Promega) e 0,25 µL de Platinum-Taq
Polimerase (Gibco-BRL).
O volume de 20,5 µL da reação padrão foi adicionado a cada tubo mantido
em banho de gelo, sendo a mistura homogeneizada e colocada em termociclador
(Gene Amp PCR System 2400- Applied Biosystems). A amplificação em PCR a partir
de dsRNA (primeira amplificação) foi realizada segundo a metodologia descrita por
Gouvea et al. (1990) com modificações: incubação inicial durante 50 minutos a 45oC;
ativação de PT-Taq durante 2 minutos a 94oC, seguida por 35 ciclos de PCR com
temperatura
e
tempo
de
desnaturação,
anelamento
e
extensão
iguais,
respectivamente a 94oC por 30 segundos, 45oC por 60 segundos e 70oC durante 90
segundos, seguida de uma incubação final de 70oC durante 7 minutos e outra de
25oC.
3.3.2.2. RT-PCR baseada na especificidade de VP4 (genotipo P)
O procedimento realizado foi o mesmo descrito anteriormente, exceto pelo
primer que, neste caso, correspondeu ao segmento do gene 4 (Con2-Con3).
19
3.3.3.Tipagem através de PCR a partir de cDNA (2a amplificação)
A tipagem (PCR-Typing) foi realizada a partir do dsDNA obtido com a 1a
amplificação, conforme descrito por GOUVEA et al. (1990), com algumas
modificações.
3.3.3.1. Tipagem através de PCR para VP7
Duas soluções foram preparadas do mesmo modo, variando apenas no
conjunto de primers empregados. Um conjunto continha primers tipo-específico para
tipos G humanos (G/H), enquanto que o outro era composto de primers G animal
(G/A). Nos dois casos foram adicionados 18,38 µL de H2O de milliQ estéril; 1,75 µL
de DMSO (Sigma); 2,5µL de Thermophilic DNA Polymerase 10XPCR Buffer minus
Mg++ (Gibco-BRL); 7,5 µL de MgCl2 25 mM (Promega); 0,5 µL de dNTP; 0,125 µL de
Taq DNA Polymerase Storage in Buffer A (Promega). Em seguida, 0,25 µL do pool
de G/H foram adicionados em um dos tubos e a mesma quantidade de pool de G/A
adicionada ao outro tubo.
3.3.3.2. Tipagem através de PCR para VP4
Para genotipar os produtos da RT-PCR com base na especificidade de VP4,
foi realizado o mesmo procedimento descrito anteriormente, sendo utilizados pool de
primers P humano (P/H) e animal (P/A).
3.3.3.3. Adição de cDNA e PCR
O produto da primeira amplificação foi adicionado aos tubos contendo as
reações com misturas de primers específicos para os tipos G predominantemente
encontrado em humanos (G/H) e em animais (G/A), ou para os tipos P encontrados
em humanos (P/H) e em animais (P/A). Em seguida, as amostras foram submetidas
ao termociclador para 30 ciclos de 94oC durante 30 segundos, 50oC durante 50
segundos e 72oC durante 60 segundos, com períodos de incubação inicial de 94oC
durante 60 segundos e final de 72oC durante 7 minutos e 25oC.
20
3.3.4. Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de PCR podem ser visualizados em gel de agarose corado com
Brometo de Etídio (EtBr) em baixas concentrações. O EtBr é um corante que se
intercala entre as fitas de dupla hélice de DNA e, como é altamente mutagênico,
deve ser manuseado com luvas e extremo cuidado (SAMBROOK et al.,1989).
Um volume de 8µL de cada amostra amplificada anteriormente foi
adicionado de 2 µL de tampão “loading” concentrado 6x (0,25% de azul de
bromofenol e 40% de sacarose (p/v) diluída em dH2O) e aplicado no gel de agarose
0,6% contendo EtBr (5µL/100mL). Em poços adjacentes foram aplicados 8 µL de
marcador de peso molecular (100bp) como controle.
A corrida eletroforética foi realizada em meio contendo solução tampão TrisAcetato-EDTA (TAE: 48,4 g Tris-Base; 11,42 mL Ácido Acético; 20 mL EDTA; pH8,0)
e com voltagem de 100 volts até que o azul de bromofenol tivesse percorrido 2/3 do
gel.
Depois da eletroforese, o gel foi observado em transiluminador com luz
ultravioleta e posterior à leitura das bandas fluorescentes, o gel foi fotografado com
câmera digital e filtro especial, sendo congelado em seguida.
3.4. Isolamento de rotavírus em células MA-104
3.4.1. Cultura de células
As monocamadas de células foram preparadas conforme descrito por RÁCZ
et al. (1993), com modificações.
Células de rim de macaco rhesus (linhagem Ma-104) foram cultivadas em
tubos de ensaios (13 x 100mm) na presença de meio mínimo essencial de Eagle
(MEM-Eagle) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) penicilina,
estreptomicina, fungizona e glutamina. O meio de manutenção das células foi o
mesmo, exceto pela ausência de SFB.
21
3.4.2. Tratamento das fezes
Foram adicionados 100 µL de MEM em eppendorfs e quantidade de fezes
suficientes para obtenção de uma suspensão a 10%. A mistura foi homogeneizada
em agitador de tubos e centrifugada a 10000 x g durante 15 minutos a uma
temperatura de 4oC.
O líquido clarificado (sobrenadante) foi transferido para um novo tubo e
adicionado de 100 µL de Freon, sendo homogeneizado e centrifugado a 10000 x g,
durante 3 minutos a 4oC.
A fase aquosa foi, então, transferida para novo tubo e adicionada de 150 µL
de MEM contendo uma quantidade cinco vezes maior que o normal de Penicilina,
Estreptomicina, Fungizona e Tripsina, sendo a mistura incubada em banho-maria a
37oC, durante no mínimo uma hora. Um tubo contendo apenas MEM concentrado e
suplementado foi incubado juntamente com as amostras, servindo de controle de
tripsina (CT).
3.4.3. Inoculação
Antes de receberem o inóculo (rotavírus), as células foram lavadas duas
vezes com solução de Hank’s e incubadas em estufa a 37oC durante, no mínimo,
uma hora entre cada lavagem.
A solução de Hank’s da segunda lavagem deve ser desprezada antes da
adição de 1 mL de MEM.
Cada inóculo (200µL de solução total) foi dividido para dois tubos contendo
as monocamadas celulares previamente lavadas e incubadas,
Um dos tubos de cada amostra foi submetido à incubação em estufa a 37oC,
enquanto que o outro foi incubado à mesma temperatura, entretanto em “roller”.
As culturas foram diariamente observadas em microscópio invertido, quanto
à presença ou não de efeito citopático (CPE).
Uma semana
após
a
inoculação,
os
tubos
foram
congelados
e
descongelados por duas vezes, com a finalidade de otimizar a liberação viral através
da lise celular.
22
Tripsina T-USO foi diluída em 1:10 em meio MEM, sendo 20 µL desta
solução transferidos para tubos que receberam 200 µL de inóculos e foram
incubados a 37oC durante 30 minutos, para promover a ativação do vírus.
Novos tubos contendo monocamadas celulares foram lavados como descrito
anteriormente e adicionados de 1 mL de MEM, sendo o vírus ativado inoculado
nestes tubos e novamente incubados a 37oC em estufa e em “roller”. Esta etapa
consiste na primeira passagem (P1).
Pretende-se, ao final da 5a passagem (P5), testar as amostras quanto à
presença de RV através de PAGE.
23
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
As granjas visitadas caracterizaram-se por apresentarem diferentes padrões
tecnológicos, variando da produção rústica (38 granjas) à tecnificada (11 granjas),
estas últimas com restrição de entrada de pessoas estranhas.
Das 38 granjas de produção rústica, 17 não possuíam qualquer tipo de
manejo voltado a um aumento de produtividade ou prevenção de doenças. Nestas
granjas as condições de criação foram consideradas extremamente precárias,
inclusive pelo fato dos animais não receberem qualquer tipo de tratamento contra
bacterioses, parasitoses ou viroses. Conseqüentemente, o índice de produtividade e
sanidade eram baixos.
4.1. SDS - PAGE
Para verificar a presença de rotavírus em fezes de leitões criados nas
microrregiões citadas na Tabela 1, foi utilizado o PAGE, considerado um método
sensível e amplamente utilizado em estudos epidemiológicos de rotavírus (DANIEL
et al., 1996).
Das 226 amostras de fezes de leitões examinadas, quatro (1,77%) foram
positivas para rotavírus. Do total de amostras testadas, 53 (23,45%) foram
classificadas como diarréicas, 101 (44,69%) como pastosas e 72 (31,86%) foram
classificadas como firmes.
24
Durante o período de colheita, foram visitadas 49 propriedades, sendo que
em 27 propriedades não foram observados casos de diarréias entre leitões no dia da
visita.
Das amostras positivas para rotavírus (n=4), duas eram diarréicas (amostras
204 e 211) e duas eram pastosas (amostras 79 e 179) no momento da colheita.
Com exceção da amostra de número 79 (colhida no mês de junho de 2002),
as demais amostras foram colhidas durante o mês de janeiro de 2003, após longos
períodos de chuva. Este resultado difere do padrão sazonal de distribuição que o
vírus assume na região Sudeste do Brasil, segundo dados de Cardoso et al. (1992)
citados por LINHARES, 2000 e os achados de PEREIRA et al. (1993), onde
infecções causadas por rotavírus podem ocorrer de modo endêmico em todo o país.
Na faixa etária de 0 a 15 dias, foram testadas 94 amostras, sendo duas
positivas para rotavírus (amostras 79 e 204), enquanto que entre as 88 amostras
testadas de animais com idade entre 16 e 30 dias, duas foram positivas para
rotavírus (amostras 179 e 211). A Figura 1 mostra a distribuição total das amostras
colhidas de acordo com a faixa etária dos animais e a ocorrência de diarréia
segundo o mesmo parâmetro.
25
Figura 1: Distribuição das amostras colhidas de acordo com a faixa etária
dos animais (A) e da ocorrência de diarréia entre as faixas
representadas (B).
Ainda que o número de amostras positivas tenha sido baixo em relação a
dados da literatura, o fato de duas amostras positivas terem apresentado
consistência pastosa (amostras 79 e 179) e não diarréica reforça a importância de se
pesquisar a presença de rotavírus, também neste tipo de fezes.
As amostras positivas para rotavírus, de acordo com PAGE, apresentaram
os 11 segmentos de dsRNA, distribuídos de acordo com o padrão 4-2-3-2,
característico do grupo A. Entretanto, a amostra de número 179 apresentou uma
banda extra entre os segmentos 3 e 4 após coloração do gel (Figura 2).
26
79
179
204
211
K8
Figura 2: Análise de PAGE das amostras fecais de suínos sendo K8 o
controle positivo.
4.2. Caracterização através de PCR
Após identificação através do PAGE, as amostras positivas foram
submetidas à caracterização genotípica através de RT-PCR. O resultado é mostrado
na Tabela 3.
Tabela 3: Caracterização dos rotavírus através de PCR das amostras positivas por
PAGE.
Amostra
de fezes
79
179
204
211
Consistência
das fezes
pastosas
pastosas
líquidas
líquidas
Idade dos
animais
9 dias
21 dias
9 dias
21 dias
Caracterização
por PCR
G3P[7]
G1-G5P[7]
G5P[7]
G5P[1]
A amostra caracterizada como G1-G5 foi a mesma que apresentou uma
banda extra de dsRNA revelada através do PAGE.
O tipo G5 de rotavírus em sido descrito em vários países, tais como,
Colômbia (SOLARTE et al., 1999), Estados Unidos (ROSEN et al., 1994), Venezuela
e Argentina (Ciarlet et al., 1995 citados por PONGSUWAANA et al.,1996), sendo
27
predominantemente de suínos. No Brasil, G5 aparece relacionado a infecções em
humanos e suínos, reforçando a hipótese de que o reagrupamento
genômico
interespécies ocorra naturalmente (GOUVEA e BRANDTLY, 1995).
O sorotipo G1 é caracteristicamente humano, apresentando-se amplamente
distribuído em todo o mundo, mas também já foi descrito em suínos no Brasil
(SANTOS et al., 1999).
A mistura G1-G5 foi também observada por SANTOS et al. (1999) em um
estudo desenvolvido no Brasil com amostras provenientes do Paraná, onde, de 10
amostras analisadas, uma demonstrou o caso de infecção mista em suínos,
entretanto, não foi possível relacionar o surgimento de banda extra a um padrão
eletroforético diferente de 4-2-3-2 observado no grupo A de rotavírus.
O sorotipo G3 também foi descrito para rotavírus suínos, sendo
antigenicamente relacionado ao mesmo sorotipo humano.
O tipo P[7], encontrado em três das quatro amostras positivas (79, 204 e
211), já havia sido identificado na linhagem OSU de rotavírus suíno, bem como o
tipo P[1], identificado em linhagens NCDV (Neonatal Calf Diarrhoea Vírus) de
bovinos (Estes e Cohen, 1989, Negesha et al., 1993, Rosen et al., 1992, citados por
GOUVEA et al., 1994 b).
Informações relacionadas à diversidade sorotípica e prevalência de rotavírus
em suínos têm relação direta com a eficiência no desenvolvimento de novas vacinas
(ROSEN et al., 1994), já que linhagens distintas do vírus comportam-se de diferentes
maneiras em vários locais do mundo, induzindo, assim, diferentes respostas no
sistema imune do hospedeiro.
O fato de apenas quatro amostras de 226 terem sido positivas para RV,
sendo duas diarréicas, pode ser explicado por três motivos básicos:
o Provavelmente, no momento da colheita, em casos onde os rotavírus
pudessem estar presentes, a excreção viral máxima não tenha sido
alcançada, ou seja, o animal poderia ter eliminado o vírus antes ou vir
a eliminá-lo depois da obtenção das amostras. Como o pico de
liberação viral máxima ocorre 3 a 4 dias após o início dos sinais
clínicos (MASCARENHAS, 1999), o momento da colheita torna-se um
fator importante para detecção dos rotavírus.
o O fato de diarréias serem relativamente comuns entre leitões faz com
que muitos produtores não notifiquem seu aparecimento, a menos que
28
muitos animais venham a óbito, os gastos com tratamento veterinário
sejam altos ou que o retardo no crescimento do animal seja acentuado
(SOLARTE et al., 1999), o que termina por comprometer os estudos
relacionados à ecobiologia do vírus.
4.3. Cultivo celular
O efeito citopático (CPE) do vírus sobre as células MA-104 não foi
observado, entretanto, passagens cegas têm sido realizadas objetivando este fim.
A dificuldade observada neste trabalho, em relação à propagação dos
rotavírus em cultura de células, encontra-se em acordo com resultados de alguns
autores que relatam o sucesso na adaptação e propagação do vírus após, pelo
menos, três passagens cegas (SESTÁK e MUSILOVÁ, 1994; THEIL et al., 1978;
RAMOS, 1996).
29
5. CONCLUSÕES
O pequeno número de amostras positivas para rotavírus não diminui a
importância de se estudar a presença deste agente como causador de gastroenterite
entre animais de produção.
A aplicação de técnicas de Biologia Molecular como diagnóstico para
rotavírus provou ser de grande utilidade, pois viabilizou a determinação de diferentes
genotipos G e P circulantes entre a população estudada.
30
6. RECOMENDAÇÕES
A continuidade dos estudos, não somente nas microrregiões citadas neste
trabalho, é essencial para o conhecimento da epidemiologia dos rotavírus entre
suínos e outras espécies, de modo a identificar os sorotipos circulantes e detectar a
introdução de novos sorotipos.
A faixa etária compreendida até 30 dias é a de eleição para a colheita de
espécime fecal visando à detecção de rotavírus.
A colheita de fezes consideradas normais (sejam de consistência pastosa ou
firme) não deve ser descartada, uma vez que, de acordo com resultados
encontrados neste trabalho, das quatro amostras positivas para rotavírus, duas
apresentavam consistência pastosa (que pode ser considerada normal de acordo
com a alimentação do animal).
31
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BARBOSA, E.F., FIGUEIREDO, H.C.P., GARCIA, A.M., LOBATO, Z.I.P., LAGE, A.P.
(1998) Rotavírus do grupo A em bezerros lactentes no Estado de Minas Gerais.
Ciência Rural, Santa Maria, 28 (3): 435-439.
BRITO, B.G., MORES, N., AMARAL, A.L., TAGLIARI, K.C. (1999) Fatores de risco
no desencadeamento de diarréias pré-desmame em granjas suinícolas do
Sudeste do Paraná. Pesquisa Agropecuária Gaúcha, 5 (1): 127-132.
DANIEL, I.M., WINIARCZYK, S., GRADZKI, Z., PEJSAK, Z. (1996) Evaluation of
different methods (ELISA, IF, EM, PAGE) for the diagnosis of rotavirus infection
in piglets. Comparative Immunology, Microbiology And Infectious Diseases, 19
(3): 219-232.
DESOUZART, O. (2002) Maiores exportadores mundiais de carne suína.
http://www.porkworld.com.br em 07/02/2003.
EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA (1987) Rotavirose suína:
descrição de um surto. Comunicado Técnico 128, Concórdia, SC.
32
ESTES, M. (1996) Rotaviruses and their replication. In: Bernard, N.F., David, M.K.,
Peter, M.H. (eds.), Fields Virology. 3. ed., Philadelphia, p. 1625-1648.
ESTES, M.K., GRAHAM, D.Y., DIMITROV, D.H. (1984) The molecular epidemiology
of rotavirus gastroenteritis. Prog. Méd. Virol., 29: 1-22.
FLEWETT, T.H., WOODE, G.N. (1978) The rotaviruses. Archieves of Virology, 57: 123.
GARCIA, A., COELHO, H.E., RISTOW, L.E., MANZAN, R.M. (1999) Infecção
experimental com rotavírus em frangos de corte. Veterinária Notícias, 5 (1): 4750.
GENTSCH, J.R., GLASS, R.I., WOODS, P., GOUVEA, V., GORZIGLIA, M.,
FLORES, J., DAS, B.K., BHAN, M.K. (1992) Identification of group A rotavirus
gene 4 types by polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology, 30
(6): 1365-1373.
GOMBOLD, J.L., RAMIG, R.F. (1994) Genetics of rotaviruses. In: Ramig, R.F. (ed.),
Rotaviruses. Houston, p. 129-179.
GOUVEA, V., SANTOS, N., TIMENETSKY, M.C. (1994a) Identification of bovine and
porcine rotavirus G types by PCR. Journal of Clinical Microbiology, 32 (5): 13381340.
GOUVEA, V., SANTOS, N., TIMENETSKY, M.C. (1994b) VP4 typing of bovine and
porcine group A rotaviruses by PCR. Journal of Clinical Microbiology, 32 (5):
1333-1337.
GOUVEA, V, GLASS, R. WOODS, P., TANIGUCHI, K., CLARCK, H.F.,
FORRESTER, B., FANG, Z.Y. (1990) Polymerase chain reaction amplification
and typing of rotavirus nucleic acid from stool specimens. Journal of Clinical
Microbiology, 28 (2): 276-282.
33
GRATACAP-CAVALLIER, B., GENOULAZ, O., BRENGEL-PESCE, K., SOULE, H.,
INNOCENTI-FRANCILLARD,
P.,BOST,
M.,
GOFTI,
L.,
ZMIROU,
D.,
SEGNEURIN, J.M (2000) Detection of human and animal rotavirus sequences in
drinking water. Applied and Environmental Microbiology, 66 (6): 2690-2692.
GREGORI, F., BRANDÃO, P.E., ROSALES, C.A.R. , CORTEZ, A., HEINEMANN,
M.B., RICHTZENHAIN, L.J., JEREZ, J.A. (2000) Desenvolvimento de um método
de ELISA para a detecção de rotavírus a partir de material fecal. Arquivos do
Instituto Biologico, 67 (2): 191-194.
HERRING, A.J.J.D. (1982) Rapid diagnosis of rotavirus infection by direct detection
of viral nucleic acid in silver-stained polyacrilamide gels. Journal of Clinical
Microbiology, 16: 473-477.
IBGE (2002) Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. http:/www.ibge.com.br em
07/02/2003.
IBGE (2001) Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. http:/www.ibge.com.br em
07/02/2003.
KAMINJOLO, J.S., ADESIYUN, A.A. (1994) Rotavirus infection in calves, piglets,
lambs and goat kids in Trinidad. British Veterinary Journal, 150: 293-299.
KAPIKIAN, A.Z., CHANOCK, R.M. (1996) Rotaviruses. In: Bernard, N.F., David,
M.K., Peter, M.H. (eds.), Fields Virology. 3. ed., Philadelphia, p. 1657-1708.
KAWASAKI, E.S. (1990) Amplification of RNA. In: INNIS, M.A., GELFAND,
D.H.,SNINSKY, J.J.; WHITE, T.J. (eds.) PCR protocols: a guide to methods and
applications. San Diego: Academic Press, p. 21-27.
KIM, Y., CHANG, K.O., STRAW, B., SAIF, L.J. (1999) Characterization of group C
rotaviruses associated with diarrhea outbreaks in feeder pigs. Journal of Clinical
Microbiology, 37 (5): 1484-1488.
34
KITAMOTO, N., RAMIG, R.F., MATSON, D.O., ESTES, M.K. (1991) Comparative
growth of different rotavirus strains in differentiated cell (MA-104, HepG2 and
CaCo-2). Virology, 184: 729-737.
LAEMMLI, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of head
of bacteriophage T4. Nature, 227:679-685.
LINHARES, A.C. (2000) Epidemiologia das infecções por rotavírus no Brasil e os
desafios para o seu controle. Cadernos De Saude Publica, 16 (3): 629-646.
MARECO,
N.B.C.,
KROEFF,
S.S.
(2000)
Rotavírus.
http://icb.usp.br/~mlracz/virus/rota/rotavirus.html em 07/11/2002.
MASCARENHAS, J.D.A. (1999) Caracterização dos eletroferotipos, sorotipos e
genótipos de rotavírus provenientes de crianças participantes de um estudo com
a vacina tetravalente anti-rotavirus (TV-RRV) em Belém, Pará. Dissertação de
Mestrado – Rio de Janeiro –RJ, Fundação Oswaldo Cruz – Fiocruz.
MURPHY, F.A., GIBBS, E.P.J., HORZINEK, M.C., STUDDERT, M.J. (1995)
Veterinary Virology, 3 ed Academic Press, California, p. 402-404.
NETO, U.F. (1987) Infecção por rotavírus. In: Tonelli, E., Doenças infecciosas na
infância. MEDSI, p.621-625.
OFFIT, P.A. (1994) Immunologic determinants of protection against rotavirus
disease. In: Rotaviruses. Ramig, R.F. (Ed.). Current Topics in Microbiology and
Immunology, 185: 230-253.
PARASHAR U.D., BRESEE, J.S., GENTSCH, J.R., GLASS, R.I. (1998) Rotavirus.
Emerging Infectious Diseases, 4 (4): 561-570.
PEREIRA, H.G., LINHARES, A.C., CANDEIAS, J.A.N., GLASS, R.I. (1993) National
laboratory surveillance of viral agents of gastroenteritis in Brazil. Bulletin of the
Pan American Health Organization, 27:224-33.
35
PONGSUWANNA,
Y.,
TANIGUCHI,
K.,
CHIWAKUL,
M.,
URASAWA,
T.,
WAKASUGI, F., JAYAVASU, C., URUSAWA, S. (1996) Serological and genomic
characterization of porcine rotaviruses in Thailand: detection of a G10 porcine
rotavirus. . Journal of Clinical Microbiology, 34 (5):1050-1057.
PRASAD, B.V.V., CHIU, W. 1994 Structure of rotaviruses. In: Rotaviruses. Ramig,
R.F. (Ed.). Current Topics in Microbiology and Immunology, 185: 9-29.
RÁCZ, M.L., MUNFORD, V., FERNÁNDEZ, M.J.B., KOEFF, S.S., KOTAIT, I. (1993)
Identification, propagation and subgroup characterization of an equine rotavirus
isolated in São Paulo, Brazil. Revista de Microbiologia, 24 (3): 161-165.
RAMIG, R.F. (1994) Introduction and overview. In: Ramig, R.F. (ed.), Rotaviruses.
Houston, p. 1-9.
RAMOS, A.P.D., STEFANELLI, C.C., LINHARES, R.E.C., BRITO, B.G., SANTOS,
N., GOUVEA, V., LIMA, R.C., NOZAWA, C. (2000) The stability of porcine
rotavirus in feces. Veterinary Microbiology, 71, 1-8.
RAMOS, A.P.D. (1996) Estabilidade do rotavírus suíno em material fecal. Tese
(Mestrado em Microbiologia) – Londrina – PR, Universidade Estadual de
Londrina, 60 p.
ROLFS, A., SCHULLER, I., FINCKH, U., ROLFS, I.W. (1992) PCR: Clinical
diagnostics and research. Berlim, p. 271-273.
ROSEN, B.I., PARWANI, A.V., LOPEZ, S., FLORES, J., SAIF, L.J. (1994) Serotypic
differentiation of rotaviruses in field samples from diarrheic pigs by using nucleic
acids probes specific for porcine VP4 and human and porcine VP7 genes. .
Journal of Clinical Microbiology, 32 (2): 311-317.
SAMBROOK, J., FRITSCH, E., MANIATIS, T. (1989) Molecular cloning. 2.ed., Cols
Spring Harbor Laboratory Press, p.149-187.
36
SANDERS, R.C. (1985) Molecular epidemiolgy of human rotavirus infections.
European Journal of Epidemiology, 1, (1): 19-32.
SANTOS, C.S., RIGOTTO, C., SIMÕES, C.M.O., BARARDI, C.R.M. (2002) Detection
of viable rotaviruses in shelfish by means of cel culture and immunofluorescence
assay. JFS: Food Microbiology and Safety, 67 (5):1868-1871.
SANTOS, N. LIMA, R.C.C., NOZAWA, C.M., LINHARES, R.E., GOUVEA, V. (1999)
Detection of porcine rotavirus type G9 and of a mixture of types G1 and G5
associated with Wa-Like VP4 specificity: evidence for natural human-porcine
genetic reassortment. Journal of Clinical Microbiology, 37 (8): 2734-2736.
SESTÁK, K., MUSILOVÁ, J. (1994) Isolation of rotavirus strains from naturally
infected piglets. Acta Virologica, 38: 27-30.
SILVA, C.A., BRITO, B.G.,
MORES, N., AMARAL, A.L. (1999) Ecopatologia da
diarréia pós-desmame em granjas de suínos da região Norte do Paraná, Brasil.
Ciência Rural, Santa Maria, 29,(1): 39-43.
SILVA, M.L.R., NAVECA, F.G., CARVALHO, I.P. (2001) Epidemiological aspects of
rotavirus infections in Minas Gerais, Brazil. The Brazilian Journal of Infections
Diseases, 5, (4): 215-222.
SOBESTIANSKY, J., WENTZ, I., SILVEIRA, P.R.S., SESTI, L.A.C. (1998)
Suinocultura intensiva: produção, manejo e saúde do rebanho. Brasília:
EMBRAPA-SPI, 388p.
SOLARTE, Y., CORREA, A., BARRERA, J.M., JERABEK, L., GUTIERREZ, M.F.
(1999) Molecular characteization of porcine rotavirus strains in Colombia. Online
Journal of Veterinary Immunology, 1: 7-12.
37
TAGLIARI, K.C., BRITO, B.G. (1998) Redução do ganho de peso e ocorrência de
mortalidade por diarréia em leitões lactentes. Pesquisa Agropecuária Gaúcha,
4,(2): 211-213.
THEIL, K.W., BOHL, E.H., SAIF, L.J. (1978) Techniques for rotaviral propagation.
Journal of the American Veterinary Medical Association, 173: 548-551.
THEIL, K. W., BOHL, E. H., AGNES, A.G. (1977) Cell culture propagation of porcine
rotavirus (Reovirus-like agent). American Journal Of Veterinary Research, 38
(11): 1765-1768.
WARD, L.A., RICH, E.D., BESSER, T.E. (1996) Role of maternally derived circulating
antibodies in protection of neonatal swine against porcine group A rotavirus. The
Journal of Infection Diseases, 174: 276-82.
WARD, L.A., ROSEN, I., YUAN, L., SAIF, L.J. (1984) Efficiency of human rotavirus
propagation in cell culture. Journal of Clinical Microbiology, 19 (6): 748-753.