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TÍTULO: IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE VÍRUS DETECTADO EMAMOSTRAS FECAIS DE
CRIANÇAS DE GUARULHOS
CATEGORIA: CONCLUÍDO
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
SUBÁREA: BIOMEDICINA
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO
AUTOR(ES): LETICIA APARECIDA ALVES MOREIRA
ORIENTADOR(ES): MARIA CLARA DUARTE FREGOLENTE ALVES
UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO
NÚCLEO DE PESQUISA EM NEUROCIÊNCIAS
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC
2014-2015
PROJETO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE VÍRUS DETECTADO EM
AMOSTRAS FECAIS DE CRIANÇAS DE GUARULHOS
PROJETO DE PESQUISA
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DE ROTAVÍRUS
CIRCULANTES EM CRIANÇAS DE SÃO PAULO, SÃO PAULO.
Aluna:
Leticia Aparecida Alves Moreira
Curso: Biomedicina
Orientadora:
Profa. Maria Clara Duarte Fregolente Alves
São Paulo
2014
Introdução
A diarreia é a segunda doença que mais mata crianças com idade inferior a
cinco anos, no mundo todo (WHO, 2010). No Brasil, em 2008, estima-se que 3.453
crianças nessa faixa etária tenham morrido por doenças diarreicas (WHO, 2008). A
etiologia das diarreias pode envolver vários agentes, como vírus, bactérias e parasitas
(MORILLO & TIMENETSKY, 2011), dentre estes, a gastroenterite viral é a mais
comum (IDMED, 2012). A gastroenterite viral ocorre como duas formas
epidemiológicas distintas: doença esporádica, que geralmente afeta crianças,
causada principalmente por rotavírus do grupo C (JAWETZ, MELNICK & ADELBERG,
2012), calicevírus humanos e saporovírus; e doença epidêmica, que afeta tanto
criança como adultos, frequentemente causadas por norovírus (MEDICINANET,
2012), adenovírus entéricos e rotavírus do grupo A (JAWETZ, MELNICK &
ADELBERG, 2012).
Dos agentes virais que causam gastroenterite, cujo genoma é composto de
RNA fita dupla (RNAds), destacam-se os reovírus-like (ESPEJO, GONZALEZ et al.,
1977), os picobirnavírus (GANESH, KOBAYASH et al., 2012) e os rotavírus. Desses
agentes virais, os rotavírus são responsáveis por 20 a 60% dos casos de
hospitalização devido à diarreia (NESTI & GOLDBAUM, 2007) e no Brasil esses vírus
são encontrados principalmente em locais onde há grande contato humano, como
escolas, creches e hospitais (LINHARES, 2000).
Os Reovírus (REO) pertencem à família Reoviridae, e as partículas virais, não
envelopadas, possuem aproximadamente 70 a 85 nm de diâmetro e densidade de
1,36 a 1,37g/cm³ em gradiente de cloreto de césio. O capsídeo duplo, de simetria
icosaédrica, envolve o genoma composto por 10 segmentos, de RNAds. De acordo
com a distribuição das massas moleculares dos dez segmentos o genoma do REO
pode ser subdividido em três classes distintas. As classes denominadas L (large) M
(medium) e S (small) codificam as proteínas l (lambda) m (mu) e s (sigma),
respectivamente (WHITE & FANNER, 1994).
Os Picobirnavírus (PBV) pertencem à família Picobirnaviridae, gênero
Picobirnavírus e têm como espécies tipo o Human picobirnavirus e o Rabbit
picobirnavirus. Estes pequenos vírus não envelopados, de dois segmentos genômicos
de RNAds, são encontrados em amostras de fezes diarreicas ou não de diferentes
hospedeiros mamíferos, incluindo o homem, aves e répteis. (FREGOLENTE, 2010).
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Em humanos os PBV têm sido identificados em porcentagens menores que 10%,
associados ou não a quadros de diarreia (GROHMANN et al., 1993).
Rotavírus são membros da família Reoviridae, gênero Rotavírus, e
apresentam-se como partículas esféricas de simetria icosaédrica, não envelopadas,
com 100nm de diâmetro com três camadas proteicas concêntricas. A camada mais
interna - core viral- é constituída por quatro proteínas, que têm a elas associadas uma
proteína que constitui o capsídeo intermediário. Essa proteína, denominada VP6, é
bastante imunogênica e induz a formação de anticorpos diferentes conforme a espécie
de Rotavírus. A terceira camada, ou capsídeo externo, é constituída por duas
proteínas: VP7 e a VP4, que corresponde às espículas da partícula viral. O genoma
dos Rotavírus é constituído por 11 segmentos de RNAds, com tamanhos que variam
de 3302 a 663 pares de bases. Cada segmento genômico codifica para pelo menos
uma proteína, sendo seis estruturais e seis não estruturais (GREENBERG & ESTES,
2009).
Atualmente as cinco espécies de Rotavírus (A, B, C, D, E) são definidas em
função da VP6 (ICTV). De acordo com a proposta de nomenclatura binária para os
sorotipos de Rotavírus, a especificidade antigênica da VP7 é designada pela letra G,
de glicoproteína, e a especificidade antigênica da proteína VP4 é dada pela letra P,
dado esta proteína ser sensível a proteases. Segundo estudos realizados os
genótipos mais comuns de Rotavírus são: G1, G2, G3, G4 e P[4], P[6] e P[8]
(GREENBERG & ESTES, 2009).
Até o momento não existem vacinas de prevenção para reovírus e
picobirnavírus destinadas a humanos, porém em 2006 a imunização de crianças
contra os rotavírus foi incluída no Programa Nacional de Vacinação, sendo o Brasil o
primeiro país do mundo a adotar tal conduta. Para tanto, uma vacina atenuada de
genotipo G1P[8] (Rotarix) é utilizada (CORREIA et al., 2010) e como consequência
verifica-se um acentuado declínio no número de casos de gastroenterite e/ou de
hospitalizações ou mortalidade associadas a essa enfermidade, principalmente entre
crianças entre 1 a 4 anos de idade (GURGEL et al., 2009).
Apesar da quantidade de estudos epidemiológicos presentes na literatura,
estes se justificam pelas peculiaridades acerca das gastroenterites por Rotavírus,
ainda mais após o início do programa de vacinação. Dentro deste contexto, os estudos
de acompanhamento se justificam pela detecção de episódios diarreicos leves ou
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moderados, que não implicam em hospitalização, além da pesquisa de reinfecções
(LINHARES, 2000).
Dessa maneira, a existência de uma rede laboratorial que atue na vigilância
sistemática dos genótipos circulantes se faz necessária (LINHARES, 2000). Dada
essa importância, este projeto tem como objetivo principal a identificação de vírus
entéricos circulantes na população infantil da cidade de Guarulhos.
Objetivos
Identificação de vírus entéricos em amostras de fezes de crianças de 0 a 5 anos
da cidade de Guarulhos, através das técnicas de extração de RNAds e sua
visualização no Núcleo de Pesquisa em Neurociência (NUPEN).
Material e métodos
Serão utilizadas amostras de fezes de crianças, de 0 a 5 anos, da Unidade
Básica de Saúde Jardim Rosa de França, da cidade de Guarulhos. Amostras de
Rotavírus de símio (SA-11) obtidos a partir de cultura celular serão utilizadas como
controle positivo nas reações.
A partir das amostras de fezes, serão preparadas suspensões a 10% em
tampão fosfato salina (PBS) 0,01 M pH 7,4, após centrifugação a 2.000 rpm por 10
minutos. As amostras de fezes e suspensões serão armazenadas a 4°C durante todo
o período do estudo.
A extração do dsRNA viral será feita por fenol-clorofórmio segundo Herring e
colaboradores (1982) com modificações. Partindo de 500 μL da suspensão fecal,
serão adicionados 50 μL de SDS a 10% e seguir-se-á uma incubação a 37° C por 30
minutos. Serão então acrescidos 500 μL de fenol-clorofórmio (v/v) e a suspensão será
agitada em Vortex por 1 a 2 minutos. Após centrifugação a 12.000 rpm por 10 minutos,
a fase aquosa será removida e a ela serão adicionados 50 μL de NaCl a 20% e 1.000
μL de etanol a 4° C. A reação será incubada a -20° C por 18 horas e então se seguirá
com a centrifugação a 12.800 rpm por 10 minutos. O sobrenadante será descartado e
ao precitado serão adicionados 20 μL de mistura dissociante.
Antes da eletroforese os extratos serão incubados a 56°C por 15 minutos e
então serão aplicados em um gel de poliacrilamida a 7,5% (HERRING et al., 1982). A
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eletroforese será realizada a uma corrente constante de 145 V, amperagem de 25 mA
durante 1h45min, seguida por coloração por nitrato de prata (SAMMONS et al., 1981).
A caracterização molecular dos vírus identificados durante o período de
desenvolvimento do projeto será realizada em colaboração com o Laboratório de
Virologia Animal do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP). Esta caracterização contará com a técnica de Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR) específica para cada vírus detectado.
Cronograma de execução
Atividade
1º Trimestre
2º Trimestre
3º Trimestre
4º Trimestre
Coleta de amostras
XX
XX
XX
Extração do dsRNA
XX
XX
XX
Visualização em Gel de
Poliacrilamida
XX
XX
XX
Análise molecular
XX
XX
XX
Análise dos resultados
XX
XX
XX
Redação de relatórios
XX
XX
Redação de manuscritos
XX
XX
Referências
Correia, JB; Patel, MM; Nakagomi, O; Montenegro, FM; Germano, EM; Correia, NB;
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