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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS HERPESVÍRUS: O ATAQUE E A RESPOSTA DO HOSPEDEIRO Duanne Alves da Silva Orientador (a): Profa. Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis Goiânia 2011 ii DUANNE ALVES DA SILVA HERPESVÍRUS: O ATAQUE E A RESPOSTA DO HOSPEDEIRO Seminário apresentado à disciplina de Seminários Aplicados do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás Nível: Doutorado Área de Concentração: Sanidade Animal e Higiene e Tecnologia de Alimentos Orientador (a): Profa. Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis Comitê de Orientação: Profa. Dra. Wilia Marta Elsner Diederichsen de Brito – EV/UFG Profa. Dra Liliane Borges de Menezes – IPTSP/UFG Goiânia 2011 iii SUMÁRIO 1-INTRODUÇÃO ................................................................................................ 1 2-REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................... 4 2.1- Entrada do vírus na célula........................................................................... 4 2.1.1- Glicoproteínas .......................................................................................... 4 2.1.2- Diversidade de receptores de ligação e de entrada ................................. 5 2.1.3- Entrada de Alphaherpesvírus ................................................................... 7 2.2- Ataque; fusão; perfuração e penetração; desassociação.......................... 10 2.3- Resposta do hospedeiro ........................................................................... 15 3-CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................................... 19 REFERÊNCIAS ................................................................................................ 20 iv LISTA DE FIGURAS FIGURA 1- Desenho esquemático e micrografia eletrônica da partícula viral de herpesvírus..........................................................................................................1 FIGURA 2- Participantes na entrada dos herpesvírus e indução da fusão celular..................................................................................................................7 FIGURA 3- Desenho esquemático dos eventos de fusão do envelope viral com a membrana plasmática.....................................................................................11 FIGURA 4- Observação por microscopia eletrônica da entrada do BoHV-1 em células MDBK....................................................................................................13 FIGURA 5- Observação por microscopia eletrônica da entrada do BoHV-5 em células MDBK....................................................................................................14 FIGURA 6- Ações biológicas dos interferons tipo I...........................................18 1 1-INTRODUÇÃO Os herpesvírus são membros da ordem Herpesvirales (DAVISON et al., 2009), família Herpesviridae estando classificados em três subfamílias, de acordo com suas propriedades biológicas: Alphaherpesvirinae, Betaherpesvirinae e Gammaherpesvirinae. Os membros das respectivas subfamílias são agrupados em gêneros de acordo com a homologia das sequências de DNA, similaridades na estrutura e organização genômica e relação antigênica (FRANCO & ROEHE, 2007). Os vírus apresentam genoma de DNA envolto em um capsídeo icosaédrico, que por sua vez, é revestido com uma camada protéica chamada de tegumento e um envelope contendo de dez a doze proteínas e glicoproteínas virais inseridas na bicamada lipídica que formam essa estrutura (Figura 1). Pelo menos três, às vezes quatro, dessas glicoproteínas do envelope são essenciais para a entrada do vírus na célula (SPEAR & LONGNECKER, 2003). FIGURA 1: desenho esquemático e micrografia eletrônica da partícula viral de herpesvírus. Os herpesvírus são muito antigos, havendo indícios que eles coevoluiram com seus hospedeiros há quase um bilhão de anos. Estudos genéticos apontam esse elevado nível de adaptação observado entre os vírus e os seus hospedeiros naturais como uma possível explicação para essa evolução paralela. Várias semelhanças podem ser observadas na estrutura de diferentes herpesvírus, o que sugere que eles tenham surgido de um ancestral comum, dando origem a duas linhagens: uma representada pelos herpesvírus 2 alfa, beta e gama, que infectam aves e mamíferos; e a outra representada pelos herpesvírus de animais de sangue frio (FRANCO & ROEHE, 2007). A infecção aguda causada pelos herpesvírus, tanto em animais como em humanos, é capaz de gerar importantes quadros mórbidos podendo, inclusive, levar a morte do hospedeiro. Em muitos casos a infecção pode ser leve e muitas vezes inaparente. Entretanto, esses vírus têm como importante característica a capacidade de estabelecer infecção por toda a vida do hospedeiro, ou seja, uma vez infectado o indivíduo permanece portador do vírus na forma latente. A presença do vírus em latência implica no desenvolvimento ocasional de infecções recorrentes que acontecem na maioria dos casos, de forma inaparente (FRANCO & ROEHE, 2007). Estes agentes infecciosos estão amplamente distribuídos na natureza e a maioria das espécies animais serve de hospedeiro natural de pelo menos um membro da família. No entanto, até o momento, apenas um pequeno número de herpesvírus foi identificado, compreendendo aproximadamente 130 espécies. Destes, muitos são de importância veterinária, visto que cada espécie doméstica alberga pelo menos um desses agentes. Podem-se citar como exemplos: os herpesvírus bovino tipos 1, 2, 4 e 5 (BoHV1, BoHV-2, BoHV-4 e BoHV-5); os herpesvírus eqüino tipos 1, 3 e 4 (EHV-1, EHV-3 e EHV-4); o vírus da doença de Aujeszky ou da pseudoraiva- PRVherpesvírus suíno tipo 1 (SuHV-1); o herpesvírus caprino tipo 1 (CpHV-1); o herpesvírus canino tipo 1 (CaHV-1); o herpesvírus felino tipo 1 (FeHV-1); os herpesvírus de galídeos tipo 1 e tipo 2 (GaHV-1 e 2) (FRANCO & ROEHE, 2007). No que diz respeito a infecção em animais, os herpesvírus são incriminados mundialmente como causadores de grandes prejuízos econômicos, principalmente para a indústria bovina e suína (POMERANZ et al., 2005) pois geram perdas produtivas e reprodutivas significativas. Estima-se que os prejuízos causados por enfermidades relacionadas aos herpesvírus bovinos alcancem um bilhão de dólares por ano em todo o mundo (DEL MÉDICO ZAJAC, 2010). Dentre os herpesvírus que infectam humanos, podem-se citar o herpesvírus humano 1 (HHV-1 ou vírus do herpes simplex HSV-1), que é o protótipo da família; o herpesvírus humano 2 (HHV-2 ou HSV-2); o agente da 3 varicela zoster (VZV) herpesvírus humano 3 (HHV-3); o vírus Epstein-Barr (EBV ou HHV-4); o citomegalovírus humano (HCMV ou HHV-5) e os herpesvírus humano 6A, 6B, 7 e 8 (HHV-6A, HHV-6B, HHV-7 e HHV-8) (FRANCO & ROEHE, 2007). Embora a infecção natural com a maioria dos herpesvírus seja restrita a uma única espécie, alguns desses vírus podem infectar outras espécies experimentalmente ou acidentalmente. Em geral, os alphaherpesvírus são vistos como tendo a mais ampla gama de acometimento, com respeito a espécies (com exceção do VZV) e tipo de célula. Os betaherpesvírus podem infectar uma grande variedade de tipos de celulares, mas geralmente restringem-se a infecções de seus hospedeiros naturais e, os gamaherpesvírus são restritos em relação ao hospedeiro e tipo de célula (SPEAR & LONGNECKER, 2003). Por serem patógenos importantes, tanto para animais como para humanos, os herpesvírus têm sido alvo de constantes estudos que visam elucidar os mecanismos envolvidos no estabelecimento da infecção. Entretanto, ainda existem muitas dúvidas acerca das estratégias utilizadas por esses agentes para estabelecer uma infecção produtiva no organismo, desde a sua entrada na célula-alvo até o estabelecimento de uma resposta eficiente pelo hospedeiro que consiga combater o ataque. O modelo de estudo da família Herpesviridae é o HHV-1, contudo, algumas diferenças entre ele e os outros membros já foram observadas. Assim, objetiva-se com este seminário, abordar de uma forma geral os mecanismos de ataque dos herpesvírus e como o organismo do hospedeiro reage a infecção, tendo como base os conhecimentos já estabelecidos para a família Herpesviridae, apresentando os aspectos referentes aos herpesvírus de bovinos. 4 2-REVISÃO DE LITERATURA 2.1- Entrada do vírus na célula A entrada dos vírus na célula hospedeira envolve diversos mecanismos, a saber: adsorção, fusão e penetração. Para entrarem na célula os herpesvírus fazem uso de múltiplos receptores. A ligação inicial (adsorção) pode ser reversível, servindo para concentrar os vírus na superfície celular, entretanto não provoca as alterações necessárias para a fusão da membrana. A maioria dos herpesvírus, provavelmente, reconhece múltiplos receptores celulares, qualquer um dos quais pode ser suficiente para a entrada na célula (SPEAR & LONGNECKER, 2003). Acredita-se que os herpesvírus, geralmente, entram nas células por meio da fusão do envelope viral com a membrana plasmática celular, onde o nucleocapsídeo e as proteínas do tegumento ganham acesso ao citoplasma (LYCKE et al., 1988; FULLER & LEE, 1992; GRANZOW et al., 1997; SODEIK et al., 1997) ou por endocitose (GRANZOW et al., 1997). 2.1.1- Glicoproteínas A entrada dos herpesvírus nas células pode ser mediada por diferentes glicoproteínas do envelope (SPEAR, 1993; SCHWYZER & ACKERMANN, 1996), no entanto, não se sabe ao certo o número de glicoproteínas necessárias para mediar a adsorção (WUDUNN & SPEAR, 1989; LIANG et al., 1991; FLYNN & RYAN, 1995; LI et al., 1995; WHITBECK et al., 1997), a fusão (PEETERS et al., 1992; TURNER et al., 1998) e a penetração (FULLER et al., 1989; PEETERS et al., 1992). Foi demonstrado que algumas glicoproteínas do HHV-1 são necessárias e essenciais para fusão da membrana (TURNER et al., 1998). O envolvimento de mais de duas glicoproteínas sugere um mecanismo complicado de ligação, fusão e/ou penetração (WILD et al., 1998). 5 Três glicoproteínas parecem ser essenciais para a entrada de todos os herpesvírus, designadas gB, gH e gL. Os genes codificadores destas glicoproteínas são conservados, com a gB exibindo o maior grau de similaridade de sequência entre os diferentes membros da família Herpesviridade. Pelo menos para alguns herpesvírus, a gB é um homodímero ou homotrímero exibido como um ponto de destaque. A heterodimerização de gH e gL é uma característica conservada, com a adição de uma outra subunidade protéica de alguns vírus (SPEAR & LONGNECKER, 2003). 2.1.2- Diversidade de receptores de ligação e de entrada A maioria dos herpesvírus pode fazer o contato inicial com a célula ligando-se a glicosaminoglicanos, (normalmente, heparan sulfato), e em proteoglicanos de superfície celular (SHUKLA & SPEAR, 2001). A vinculação ao heparan sulfato nem sempre é fundamental para a infecção, pois glicoproteínas virais não essenciais para a entrada do vírus podem mediar esse contato inicial (adsorção viral). No entanto, a presença do heparan sulfato na superfície celular aumenta muito a eficiência da entrada viral, provavelmente por concentrar os vírus na superfície celular para que os receptores de entrada possam ser encontrados pelos ligantes virais apropriados (SPEAR & LONGENECKER, 2003). A ligação do HHV-1 e de outros alphaherpesvírus ao heparan sulfato é reversível e os vírus eluídos permanecem infecciosos, indicando que a atividade de fusão não foi desencadeada de forma irreversível. A interação com um receptor de entrada parece ser irreversível, talvez, por levar imediatamente a fusão da membrana. Essa definição operacional de receptores de ligação e de entrada também pode ser aplicada a outros herpesvírus (SPEAR & LONGNECKER, 2003). Após a adsorção, a entrada dos herpesvírus na célula ocorre por meio da fusão do envelope viral com a membrana plasmática (ou do endossoma). Para a entrada de alguns herpesvírus como o HHV-1 em alguns tipos celulares, é necessário ocorrer endocitose e acidificação do endossoma (NICOLA et al., 2003; WANG et al., 2003). 6 A via de entrada e os mecanismos de fusão de outros vírus envelopados, tais como o vírus da imunodeficiência humana (HIV), o vírus Sendai e os vírus influenza já estão bem descritos (NIR et al., 1990; WHITE, 1992; HERNANDEZ et al., 1996; HUGHSON, 1997). O HIV e os vírus influenza necessitam de apenas uma glicoproteína para mediar tanto a adsorção do vírus quanto a fusão na célula hospedeira. Já o vírus Sendai requer duas glicoproteínas para entrar na célula; uma para a ligação e outra para a fusão. Os vírus influenza entram nas células por endocitose e são liberados no citoplasma pela fusão do envelope viral com a membrana do vacúolo endocítico. Os vírus Sendai e HIV entram nas células por fusão do envelope viral com a membrana plasmática, assim como os Herpesvírus bovino tipos 1 e 5, que entram nas células por meio de uma fusão única do envelope com a membrana celular (WILD et al., 1998). As interações de uma ou mais glicoproteínas virais com os receptores celulares pode provocar a fusão do envelope com a membrana ou a fusão célula a célula. Presume-se que o mecanismo básico de fusão para a entrada dos herpesvírus inclua as glicoproteínas gB, gH e gL, embora receptores virais de ligação adicionais também possam ser necessários (Figura 2) (SPEAR & LONGNECKER, 2003). O HHV-1, por exemplo, requer a gD como um ligante para os receptores de entrada. Apenas os alphaherpesvirus (exceto VZV) codificam genes dos membros da família da gD. O EBV requer a gp42, um componente do complexo gH-gL-gp42, como um ligante para as moléculas de antígeno leucocitário humano de classe II (HLA ou MHC) nos linfócitos B. O citomegalovírus humano codifica a gO, que não está relacionada com a gp42, mas também forma complexo com gH-gL (HUBER & COMPTON, 1998). Similarmente, o HHV-6A codifica a gQ, que forma complexo com gH-gL (MORI et al., 2003). Ainda não está claro se gO ou gQ são necessárias para a entrada desses vírus. Os alphaherpesvirus não codificam homólogos de gp42, gO ou gQ. Assim, parece que o mecanismo básico de fusão da membrana é conservado entre os herpesvírus, enquanto que os ligantes virais que se conectam aos receptores da superfície celular diferem entre as subfamílias, o que explicaria, em partes, a diferença de tropismo por células e tecidos (SPEAR & LONGNECKER, 2003). 7 FIGURA 2: Participantes na entrada dos herpesvírus e indução da fusão celular. A ligação dos alphaherpesvirus como dos gamaherpesvirus às células, pode ser mediada por glicoproteínas virais que não são essenciais para a entrada. O heparan sulfato é o receptor para a gC do HHV-1 e para a gpK8.1A do HHV-8. Para a gp350 do EBV o receptor é o CD21 (em caso de células B). A entrada requer a interação dos ligantes virais com outros receptores celulares. Para o HHV-1, a gD é o ligante para muitos receptores celulares de superfície como, HVEM, nectinas e 3-O-sulfated heparan sulfato e qualquer um destes pode mediar a entrada. Para o EBV entrar nas células B, a gp42 se liga às moléculas HLA de classe II. Para a entrada do HHV-8, a gB pode se ligar às integrinas. É pensado que qualquer uma dessas interações de um ligante viral com um receptor de entrada pode acionar a atividade de fusão de gB e gH-gL. Fonte: SPEAR & LONGNECKER, 2003. 2.1.3- Entrada de Alphaherpesvírus Os alphaherpesvírus, incluindo HHV-1, HHV-2, PRV e BoHV-1 apresentam um número de glicoproteínas funcionalmente e estruturalmente homólogas. As três glicoproteínas principais (gB, gC e gD) são parcialmente homólogas as do HHV (CHOWDHURY, 1995). As glicoproteínas gB e/ou gC podem mediar a ligação dos vírus ao heparan sulfato das superfícies celulares. Apesar de a gC ser dispensável para a infecção de culturas celulares, sua presença pode aumentar a eficiência da ligação do HHV-1 em quase 10 vezes. Muitos autores já demonstraram que a gC é uma importante glicoproteína no processo de ataque do BoHV-1, pois 8 permite a adsorção do vírus na célula (COLLINS et al.,1984; VAN DRUNEN LITTLE-VAN DEN HURK et al., 1984; VAN DRUNEN LITTLE-VAN DEN HURK & BABIUK, 1986; MARSHALL et al., 1988). Acredita-se que as glicoproteínas essenciais, gB, gD, gH e gL agem em conjunto para induzir a fusão do envelope viral com a membrana. Receptores celulares de entrada são demandados para provocar essa fusão e o ligante viral para todos os receptores de HHV é a gD (COCCHI et al., 1998; SPEAR et al., 2000; CAMPADELLI-FIUME et al., 2007). Esses requisitos para a entrada dos vírus nas células se aplicam aos alphaherpesvírus de animais, bem como o PRV e o BoHV-1 (WARNER et al., 1998). Já foram identificadas três classes de receptores de entrada do HHV-1 (SPEAR et al., 2000) que também são utilizados pelo BoHV-1 e -5. Nestas classes encontram-se: o mediador de entrada de herpesvírus (HVEM), que é um membro da família (HveA) de receptores do fator de necrose tumoral (TNF); nectina-1 e nectina-2, que são dois membros da superfamília das imunoglobulinas (MONTGOMERY et al., 1996; GERAGHTY et al., 1998; WARNER et al., 1998); e sítios específicos no heparan sulfato. Qualquer uma dessas moléculas de superfície pode ligar-se a gD, com cada sorotipo viral apresentando diferenças na preferência pelo receptor (SPEAR et al., 2000; CONNOLLY et al., 2001; SPEAR, 2004). Além de a gD servir como glicoproteína de ligação aos receptores, ela provoca a fusão por meio de um domínio especializado denominado domínio de pró-fusão (PFD), localizado na região C-terminal da proteína (CAMPADELLI-FIUME et al., 2007). PERTEL et al. (2001), após transfectarem células deficientes de receptores endógenos para HHV-1 com plasmídeos expressando receptores de entrada, quantificaram a entrada viral usando vírus que expressavam genes imediatamente após a entrada. Neste estudo foi possível verificar que, enquanto o HVEM e a nectina-1 são excelentes receptores de entrada tanto para o HHV-1 quanto o HHV-2, a nectina-2 é mais ativa para o HHV-2 do que para o HHV-1. Já o heparan sulfato é, provavelmente, mais ativo para o HHV-1 do que para o HHV-2. Ainda não se sabe como a interação da gD com um receptor de entrada desencadeia a entrada viral ou a fusão celular. SPEAR & 9 LONGNECKER (2003) levantaram a hipótese de que, a ligação da gD com um dos receptores resultaria numa mudança conformacional desta glicoproteína, permitindo sua interação com gB ou gH-gL e o acionamento da atividade fusiogênica. De acordo com estes autores, a gD não seria um componente integral da maquinaria básica de fusão e, além disso, poderiam existir outros receptores para gB e/ou gH-gL. Logo, ligações a esses outros receptores, poderiam desencadear a atividade de fusão, não havendo necessidade da presença da gD. Essas idéias surgiram, em parte, de resultados obtidos com o vírus da pseudoraiva. O PRV pode usar como receptores de entrada, vários membros da família das nectinas de humanos e de animais (GERAGHTY et al., 1998; MILNE et al., 2001). KLUPP et al. (2000) afirmaram que, apesar de todas as quatro glicoproteínas do PRV, incluindo a gD, serem necessárias para a entrada viral, gB, gH e gL são suficientes para a fusão em células de coelhos (cujos receptores não foram identificados). Segundo os autores, este fato sugere a existência de receptores de superfície celular para gB ou gH-gL. Em 2007, CAMPADELLI-FIUME et al., confirmaram a hipótese levantada em 2003, de que a gD em sua forma livre (não ligada a receptor) apresentava a região C-terminal dobrada em torno da região N-terminal, de modo que a glicoproteína adotava uma conformação fechada (auto inibida). Quando ligada ao HVEM e a nectina-1, a região C-terminal é deslocada, deixando a gD com uma conformação aberta. Ainda segundo CAMPADELLI-FIUME et al. (2007), a estrutura trimérica da gB, que é similar a de outra glicoproteína de fusão, faria desta proteína uma ferramenta no mecanismo de fusão. Por outro lado, segundo os mesmos autores, gH apresenta elementos moleculares típicos das glicoproteínas de fusão, apresentando uma forte tendência a interagir com os lipídios. Ainda não foi determinado se a fusão é executada por gB ou gH-gL, complexadas ou em sequência. GABEV et al. (2010) construíram um BoHV-1 mutante que carreava a gD do BoHV-5 (gD5) e um BoHV-5 mutante que carreava a gD do BoHV-1 (gD1). Após infectarem camundongos com estes mutantes, verificaram que o BoHV-1 com a gD5 foi quase tão virulento quanto o BoHV-5 selvagem. No entanto, a mudança da gD5 pela gD1 no BoHV-5, não reduziu a habilidade 10 deste em invadir o cérebro, enquanto que a troca de gD1 por gD5 no BoHV-1 não desenvolveu a habilidade deste em infectar neurônios secundários. Contudo, o sucesso na inibição da infectividade de mutantes de gD5 com diferentes nectinas solúveis de origem humana, in vivo, sugeriu a hipótese desta glicoproteína se ligar a uma ampla variedade de receptores, quando comparada a gD de outros alphaherpesvírus, como o HHV-1 (GABEV et al., 2010) 2.2- Ataque; fusão; perfuração e penetração; desassociação Em 1998, WILD et al. realizaram um estudo com técnicas que utilizam baixas temperaturas, onde puderam monitorar a incubação de células com herpesvírus bovino tipos 1 e 5 na faixa de segundos, verificando o processo de entrada dos vírus nas células em milésimos de segundos a qualquer momento desejado. Após inocularem cepas de BoHV-1 e 5 em cultura de células MDBK (―Madin Darby bovine kidney‖) à temperatura de 37°C, os autores observaram que de 0 a 30 segundos após a incubação, algumas partículas virais localizavam-se no meio extracelular próximas a membrana citoplasmática das células. De 30 a 40 segundos após a incubação, o envelope de alguns vírus estava parcialmente fusionado com a camada externa da membrana; logo, apenas três camadas das duas bicamadas eram visíveis sugerindo que, apenas a camada externa do envelope viral foi fusionada a camada externa da membrana plasmática (Figura 3). A natureza hidrofílica e hidrofóbica dos fosfolipídios exige que, os que se encontram na camada exterior do envelope viral, sejam conduzidos para a camada exterior de fosfolipídios da membrana plasmática, um processo mediado por uma ou mais das glicoproteínas assumidas para atuarem como proteínas de fusão (FULLER & LEE, 1992; PEETERS et al., 1992). A separação das camadas de fosfolipídios para posterior fusão requer domínios específicos em ambos os sítios (membrana plasmática e envelope viral) e um mecanismo particular para desencadear a fusão. A fusão completa, ou seja, o momento em que a camada externa do envelope viral se une a camada interna da membrana plasmática e vice e versa, resultando no cruzamento (Figura 4D; 11 Figura 5C) das membranas no sítio de fusão e ao lado dele, ocorre antes de 45 segundos após a incubação (Figura 3) (WILD et al., 1998). FIGURA 3: Desenho esquemático dos eventos de fusão do envelope viral com a membrana plasmática. Os painéis mostram o ataque do vírus a membrana plasmática mediada pela gC e/ou gD (verde) (A); a fusão da camada externa do envelope com a camada externa da membrane (B); e a fusão da camada externa do envelope com a camada citoplasmática da membrana e vice e versa (C). Esse tipo de fusão implica no cruzamento das membranas. A fusão requer mecanismos regulatórios (representados pelos retângulos pretos) que indicam o provável envolvimento de glicoproteínas. cy = citoplasma; t = tegumento. Fonte: WILD et al., 1998. Quarenta segundos após a incubação, foi possível observar a presença de invaginações e/ou perfurações das membranas plasmáticas celulares próximo ao local de fusão e os vírions foram encontrados tanto nas bordas, como acima ou dentro das invaginações (Figura 4F e G; Figura 5D). O envelope foi visto, muitas vezes, associado à membrana plasmática. Acreditase que o envelope dos herpesvírus origine-se de um invólucro das membranas do Golgi, sendo formado pela inversão da membrana plasmática. Ele é capaz 12 de fundir-se com a membrana plasmática mantendo a assimetria da transmembrana (DEVAUX, 1992) como já foi demonstrado anteriormente para a fusão do vírus da gripe com lipossomas (KLOTZ et al., 1996). A fusão do envelope viral com a membrana plasmática resulta numa inserção parcial do mesmo dentro da membrana. Por razões geométricas, dobras na membrana plasmática devem surgir e/ou deve ser perdida a integridade da membrana e do envelope viral em uma área circunscrita. O significado deste tipo de fusão ainda não está claro. Certamente não permite que o vírus penetre a membrana plasmática. Em vez disso, o vírus ganha acesso ao citoplasma através de uma invaginação que se desenvolve nas proximidades da zona de fusão e que se abre para o citoplasma (WILD et al., 1998). Partículas virais envelopadas (Figura 5F) são encontradas dentro do citoplasma 50 segundos após a incubação. O envelope apresenta-se fusionado ou associado à membrana plasmática. Em seguida, é possível observar os vírions dentro da matriz citoplasmática podendo, ocasionalmente, estar próximos ao núcleo em frente a um poro nuclear (Figura 4N) (WILD et al., 1998). Após a fusão, já no citoplasma celular, o envelope dos herpesvírus, provavelmente neutraliza a partir da membrana plasmática, que por sua vez deve ser restaurada para que a integridade celular seja mantida. Algumas proteínas do tegumento se dissociam do nucleocapsídeo e permanecem no citoplasma, enquanto outras são transportadas até o núcleo. O nucleocapsídeo, ainda associado com algumas proteínas do tegumento, é transportado ao longo dos microtúbulos até o centro de organização dos mesmos (SODEIK et al., 1997), que está situado perto do núcleo. WILD et al. (1998) observaram vírus envelopados próximos ao núcleo após 15 minutos do início da incubação. Os nucleocapsídeos associam-se aos complexos de poros nucleares desintegrando-se e liberando o genoma no interior do núcleo para que ocorra a replicação. Os restos do capsídeo ficam na região externa da membrana nuclear (FRANCO & ROEHE, 2007). 13 FIGURA 4: observação por microscopia eletrônica da entrada do BoHV-1 em células MDBK. (A) ataque; (B) fusão da camada externa do envelope viral com a camada externa da membrana plasmática;(C a E) fusão da camada externa do envelope com a camada interna da membrana plasmática e vice e versa, resultando no cruzamento (setas) das membranas; (E a L) vários estágios da invaginação e perfuração da membrana plasmática, incluindo a perda da integridade da membrana, próximo ao local de fusão (E); partículas virais logo acima de uma pequena invaginação (F e G); envelope viral sendo conectado a membrana plasmática acima da invaginação (H), na borda da invaginação (I), acima de uma invaginação ampla complicada (K) e na entrada da invaginação (L); a integridade da membrana plasmática é perdida na ponta da invaginação, mas é atravessada (L- seta) ao lado da partícula viral. (M e N) os vírions estão dentro do citoplasma e o envelope está associado à membrana plasmática, onde mais de duas camadas são visíveis (seta), indicando dobras (M); uma localização perto de um poro nuclear é obervada (N) com as membranas nucleares, externa (o) e interna (i), e a membrana de Golgi (g) sendo indicadas. Fonte: WILD et al., 1998. 14 FIGURA 5: observação por microscopia eletrônica da entrada do BoHV-5 em células MDBK (Adireita) ataque das partículas virais a membrana plasmática, associadas a membrana (esquerda) e localizadas acima de uma pequena invaginação da membrana plasmática ao lado de uma microvilosidade (m). (B a D) fusão da camada externa do envelope viral com a camada externa da membrana plasmática (B); (C) fusão completa do envelope com a membrana formando um pequeno cruzamento (seta) e uma ―tricamada‖ (entre a flecha e a ponta da seta), perda da integridade da membrana e os primeiros sinais da perfuração na base da microvilosidade; (D) partículas virais acima de uma pequena invaginação e em associação com a ondulação da membrana plasmática (direita). (E) vírion no citoplasma; o envelope está fusionado (ponta da seta) com a membrana e, além do local de fusão, a matriz citoplasmática parece vazar através da membrana plasmática perfurada (setas). (F) partícula viral envelopada dentro do citoplasma. Fonte: WILD et al., 1998. 15 2.3- Resposta do hospedeiro Até o momento, poucos estudos foram desenvolvidos buscando elucidar os mecanismos de indução da resposta imune após a infecção pelos herpesvírus, principalmente os de animais. Com relação aos herpesvírus bovino tipos 1 e 5, devido as similaridades existentes entre eles, acredita-se que ambos possam provocar mecanismos semelhantes no hospedeiro durante a infecção (DEL MÉDICO ZAJAC et al., 2010). Alguns estudos com HHV-1 já revelaram os mecanismos imunológicos envolvidos na encefalite fatal causada por esse agente. LUNDBERG et al. (2008), sugeriram que a variação da resposta inflamatória desenvolvida pelos hospedeiros possa desempenhar um papel determinante na fatalidade da doença. SERGERIE & BOIVIN (2007), observaram intensa resposta inflamatória no sistema nervoso central de camundongos infectados experimentalmente com HHV-1, com expressão proeminente do fator de necrose tumoral. Além disso, alguns estudos in vivo e in vitro já demonstraram que a microglia de humanos e camundongos com infecção de HHV-1 não produtiva, expressam uma variedade de quimiocinas e citocinas pró-inflamatórias de acordo com o seu envolvimento no início da resposta inata contra o vírus. Porém, não se sabe se essa resposta inflamatória inata é protetora ou deletéria (LOKENSGARD et al., 2001; LOKENSGARD et al., 2002). Outras ferramentas importantes na resposta imunológica aos herpesvírus são as glicoproteínas, que além de mediarem a infecção das células-alvo influenciando o tropismo celular e tecidual, são os principais antígenos reconhecidos pelo sistema imune do hospedeiro infectado (LUPTON & REED, 1980; LITTLE et al., 1981; GLORIOSO et al., 1984; BABIUK et al., 1987; HEROLD et al., 1991). A gB é uma das principais glicoproteínas no envelope viral e na membrana plasmática das células infectadas (MISRA et al., 1981). Em bovinos infectados pelo BoHV-1, a resposta de anticorpos específicos para gB é detectada antes da resposta a outros antígenos (VAN DRUNEN LITTEL-VAN DEN HURK et al., 1990), e sua atividade neutralizante já foi mapeada para, pelo menos, seis epítopos diferentes (FITZPATRICK et al., 1990). Alguns autores já demonstraram a capacidade de uma vacina de 16 DNA de gB do BoHV-1 em induzir anticorpos e resposta de linfócitos T citotóxicos (CTLs) em bovinos e camundongos (LOEHR et al., 2001; HUANG et al., 2005). Em infecções pelo BoHV-1, a primeira resposta do hospedeiro constitui-se em inflamação e uma resposta imune inata. A resposta adaptativa começa a partir do quinto dia após a infecção, com a indução de linfócitos CD4+ e CD8+, apresentando sua maior atividade no décimo dia após a infecção (DENIS et al., 1994; BABIUK et al., 1996). A resposta imune humoral é verificada a partir do décimo dia após a infecção. Anticorpos contra o BoHV-1 participam na neutralização das partículas virais que se encontram no meio extracelular, bem como na indução de células anticorpo-dependentes mediante a citotoxicidade. A resposta de anticorpos é essencial na prevenção de infecções secundárias e na limitação das conseqüências da reativação (BABIUK et al., 1996). Em 2007, DEL MÉDICO ZAJAC et al., após infectarem bovinos experimentalmente com BoHV-5, verificaram a ocorrência de resposta linfoproliferativa entre sete e 14 dias após a infecção. Os animais apresentaram anticorpos totais no soro a partir do dia 12° após a infecção e IgA e IgG1 foram detectadas na secreção nasal. Anticorpos neutralizantes foram detectáveis no dia 14 após a infecção (MEYER et al., 2001; PEREZ et al., 2002; VOGEL et al., 2003; DEL MÉDICO ZAJAC et al., 2006). TIKOO et al. (1995) afirmam que os CTLs são componentes críticos no processo de eliminação de herpesvírus, uma vez que a disseminação viral célula a célula ocorre antes da disseminação hematógena. Nesse sentido, têmse buscado desenvolver vacinas recombinantes capazes de induzir CTLs contra os herpesvírus, pois as vacinas inativadas disponíveis apresentam uma boa atividade neutralizante, no entanto, não são boas indutoras da resposta mediada por células, além de a resposta de anticorpos induzida por elas ser curta (DESHPANDE et al., 2002). Outra ferramenta importante no combate as infecções virais são os sistemas interferon (IFN). Ao infectarem as células, os vírus induzem a expressão de moléculas de IFN, que são uma grande família de citocinas estruturalmente relacionadas. Os sistemas IFN-α e β influenciam a replicação do vírus, diretamente por meio de sua atividade antiviral em nível celular 17 (MULLER et al., 1994; GROB et al., 1999) e, indiretamente, pela modulação da resposta imune (Figura 6) (LANDOLFO, 1995; BOEHM et al., 1997; DE WAAL MALEFTY, 1997; BIRON, 1998 e 1999). Diferente dos humanos e camundongos, os bovinos apresentam três genes para IFN- β com promotores distintos (WILSON et al., 1983; VALARCHER et al., 2003). Todos os três isótipos de IFN- β apresentam atividade antiviral mas, ainda não está claro se a infecção induz os três subtipos de forma diferente. A regulação viral da resposta do IFN é crucial para a sobrevivência do patógeno na natureza e para a patogênese (JONES & SILVA, 2011). ABRIL et al. (2004) verificaram que camundongos que apresentavam receptores para IFN tipos I e II combinados com deleções de genes de ativação de recombinação (RAG-2) morreram em poucos dias após a infecção pelo BoHV-1. Reciprocamente, camundongos selvagens (sem deleções genéticas) infectados com BoHV-1 não desenvolveram sinais clínicos. O BoHV-1 induz a resposta de IFN devido ao seu elevado nível de CpG DNA não metilado. Assim como o HHV-1 ou HHV-2, o DNA do BoHV-1 contém elevados níveis de CpG DNA (LUNDBERG et al., 2003), que pode desencadear a resposta imune inata (via receptores Toll-like 9 – TLR9, por exemplo) (ADEREM & HUME, 2000; HACKER et al., 2000). Durante o curso da infecção produtiva, proteínas virais são codificadas, incluindo a bICP0 (proteína de células infectadas 0) interferindo na resposta imune inata. A bICP0 é uma importante proteína regulatória que estimula a infecção produtiva e também inibe a transcrição dependente de interferon, por meio da degradação do fator estimulatório 3 de IFN (IRF-3) (JONES, 2009). Embora pareça provável o envolvimento de outros produtos codificados pelo herpesvírus bovino na indução da resposta imune inata, eles ainda não foram identificados. Logo, o tipo de regulação da resposta imune inata estabelecido pelo HHV-1 é aceito também para o BoHV-1. A infecção pelo HHV-1 em cultura de células humanas leva a produção e secreção de interferon. A gD induz a produção de IFN-α em células mononucleares (KATZE et al., 2002), em parte, devido a ativação do IRF-3 em certos tipos celulares (PRESTON et al., 2001). A entrada do envelope viral nas células também pode induzir a resposta imune inata dependente de IFN (NOYCE et al., 2006). 18 FIGURA 6: ações biológicas dos interferons tipo I. Os IFNs tipo I (IFN-α e IFN-β) são produzidos por células infectadas por vírus em resposta a sinalização intracelular por TLR e outros sensores de RNA viral. Os IFNs tipo I se ligam a receptores nas células vizinhas não infectadas, e ativam vias de sinalização por Jak-STAT, as quais induzem expressão de genes cujos produtos interferem com a replicação viral. Os IFNs também se ligam a receptores nas células infectadas, e induzem a expressão de genes cujos produtos aumentam a suscetibilidade das células à destruição mediada por CTL. Fonte: ABBAS et al., 2008. 19 3-CONSIDERAÇÕES FINAIS O Brasil está em uma posição de destaque como um dos maiores produtores da indústria bovina mundial. Logo, para que a qualidade dos produtos oriundos desta atividade seja garantida, o controle sanitário dos rebanhos é imprescindível. No entanto, patógenos causadores de enfermidades importantes em bovinos, como os herpesvírus, ainda apresentam aspectos relacionados a sua biologia não muito bem esclarecidos. O grande prejuízo econômico gerado na pecuária mundial, devido as perdas produtivas e reprodutivas causadas pelos herpesvírus, é um sinal de alerta para produtores, pesquisadores e autoridades sanitárias que precisam unir forças no combate a esta infecção. Apesar de existirem muitos estudos sobre os herpesvírus de animais, o conhecimento acerca da patogenia e da resposta imune estabelecidas por eles ainda é incipiente. Os aspectos já estabelecidos sobre a biologia do agente referem-se, em sua maioria, aos herpesvírus de humanos. Assim, pesquisas que visam elucidar os mecanismos de indução da resposta imunológica, bem como a patogênese do agente são extremamente relevantes, pois podem auxiliar no desenvolvimento diagnósticas e métodos de controle e erradicação eficazes. de tecnologias 20 REFERÊNCIAS 1. ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S. Imunologia celular e molecular. Ed.Elsevier Brasil, 2008. 576 p. 2. ABRIL, C.; ENGELS, M.; LIMMAN, A.; HILBE, M.; ALBINI, S.; FRANCHINI, M.; SUTER, M.; ACKERMAN, M. Both viral and host factors contribute to neurovirulence of bovine herpesvirus 1 and 5 in interferon receptor-deficient mice. Journal of Virology, v. 78, n. 7, p. 3644–3653, 2004. 3. ADEREM, A.; HUME, D. A. How do you see CG? 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