Citometria de Fluxo

O QUE É:
Processo no qual células, ou outras partículas biológicas,
são forçadas a passar, num filete único, por sensores
que são capazes de analisar as características físicas ou
químicas das células ou partículas, e separar
subpopulações homogêneas de células de populações
maiores e heterogêneas.
Partículas sujeitas à análise:
• célula eucariótica;
• organelas citoplasmáticas;
• cromossomos;
• células agregadas (ex: células tumorais);
• bactérias;
• fungos;
• protozoários;
• complexos imunes, etc..
Parâmetros que podem ser analisados:
• tamanho e forma das células;
• granularidade;
• conteúdo de DNA e RNA;
• açúcares de superfície;
• síntese de DNA;
• integridade e permeabilidade da membrana
celular;
• atividades enzimáticas;
• receptores e superfície celular;
• morte celular programada, entre outros.
Citômetro (Facscalibur):
COMO FUNCIONA?
Fluorescência coletada,
filtrada e convertida a
valores digitais que são
armazenados no
computador
1) Uma parte da luz é espalhada (scatter) de acordo com as características
morfológicas e estruturais da célula. O Forward Scatter (FCS) se relaciona
com o tamanho e o Side Scatter (SSC) com a granularidade da célula ou
partícula.
2) As células previamente coradas com fluorocromos, uma vez excitadas
pelo laser, emitem luz de acordo com suas características fluorescentes.
Uma série de lentes colocadas próximas desta zona de interceptação
(célula-laser) coletam a luz dispersa e enviam-na para tubos
fotomultiplicadores (PMTs) que convertem o sinal luminosos em pulsos
elétricos, os quais são proporcionais à quantidade de luz dispersa ou
fluorescente captada pelos PMTs.
Para a seleção e captação destes sinais luminosos, filtros óticos são
usados para bloquear determinados comprimentos de onda da luz incidente
e deixar passar somente a luz de comprimento de onda desejado.
3) Os sinais elétricos gerados pelos PMTs são amplificados, convertidos
para a forma digital e enviados para um computador. A amostragem dos
dados, as análises e a interpretação podem, então, ser realizadas através
de softwares específicos.
Parâmetros considerados básicos (podem ser medidos
simultaneamente):
• tamanho celular (FCS);
• granularidade interna das células (SSC);
• parâmetros de fluorescência: verde (FL1); fluorescência amarela (FL2);
fluorescência laranja (FL3); Fluorescência vermelha (FL4).
Preparo da amostra:
Tubo com amostra contendo diferentes tipos celulares marcados ou não
com anticorpos conjugados à fluorocromos
Marcação direta e indireta:
Marcação dupla:
Linfócito
FITC
FITC
PE
Fluorocromos:
Substância
Alexa 488
FITC
X-TRITC
TR
R-PE
PercP
PE-Cy5
PE-Cy7
Cy5
Cy7
APC
Brometo de
etídeo
Iodeto de
propídeo (PI)
7-AAD
Acridine Orange
Excitação
(nm)
488
490-495
580
596
480-565
490
480-565-650
480-565-743
625-650
743
650
510
Emissão
(nm)
519
520
604
620
578
675
670
695-767
670
767
660
595
536
617-623
546
503
647
530-640
Análise multiparamétrica:
• Dot plot com tamanho (FCS) X granularidade (SSC), para definição de
subpopulação a ser analisada:
Linfócitos
Monócitos
• Histogramas de cores (fluorocromos) - Dados univariantes
(histogramas monoparamétricos):
• Dot plot com análise de duas cores - Dados bivariantes
(histogramas biparamétricos):
Com a Citometria de Fluxo é possível analisar se as células
que se encontrem em processo de morte programada
(apoptose) ou necrose.
Incorporação ao DNA foi feita pela a 7-AAD
Células necróticas
Células apoptóticas
Células viáveis
“Sorting” de células e partículas:
Separa as células e partículas baseadas nas propriedades
medidas durante o fluxo.
Geração de “gotas”
Placas defletoras
APLICAÇÕES DA CITOMETRIA DE FLUXO
• Na hematologia – contagem celular, formula leucocitária, análise da
medula óssea.
• Na farmacologia – estudos de cinética celular, resistência à drogas.
• Na imunologia – subpopulações de células T, tipagem tissular,
estimulação linfocitária, apoptose.
• Na oncologia – diagnóstico/prognóstico, monitorar tratamento.
• Na microbiologia – diagnóstico bacteriano e viral, sensibilidade a
antibióticos.
• Na genética – cariótipo, diagnóstico de portador, diagnóstico prenatal,
tipagem para transplantes.