Efeitos da privação de sono na homeostase e metabolismo do

Lisandro Lungato
Efeitos da privação de sono na homeostase e
metabolismo do cálcio em esplenócitos de
camundongos
Dissertaçãox apresentada àx Universidade
Federal de São Paulo – Escola Paulista de
Medicina, xpara a obtençãox do Títulox de
Mestre em Ciências.
São Paulo
2011
Lisandro Lungato
Efeitos da privação de sono na homeostase e
metabolismo do cálcio em esplenócitos de
camundongos
Dissertaçãox apresentada xà Universidade
Federal de São Paulo – Escola Paulista de
Medicina, xpara x a obtenção do Títuloxde
Mestre em Psicobiologia.
Orientadora: Profª. Drª. Vânia D’Almeida
Co – orientador: Prof. Dr. Marcos Leoni Gazarini Dutra
São Paulo
2011
Lungato Lisandro
Efeitos da privação de sono na homeostase e metabolismo do
cálcio em esplenócitos de camundongos / Lisandro Lungato – São
Paulo, 2011.
xix, 87f.
Tese (mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola
Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia.
Título em inglês: Effects of the sleep deprivation in calcium
metabolism and homeostasis on splenocytes from mice.
1.
Sinalização do Ca2+. 2. Esplenócitos. 3. Privação de sono. 4.
Disfunção mitocondrial. 5. Estresse oxidativo. 6. Camundongos.
Universidade Federal de São Paulo
Escola Paulista de Medicina
Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia
Chefe do Departamento de Psicobiologia
Profª. Drª. Maria Lucia Oliveira de Souza Formigoni
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia
Prof. Dr. Marco Túlio de Mello
iii Universidade Federal de São Paulo
Escola Paulista de Medicina
Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia
Banca examinadora:
Prof. Dr. Jair Ribeiro Chagas
Prof. Dr. Emer Suavinho Ferro
Prof. Dr. Tiago Rodrigues
Suplente:
Profa. Dra. Beatriz Duarte Palma Xylaras
Aprovado em:___/___/___
iv “Aos meus queridos pais Florindo e Clarice
e aos meus irmãos que sempre me incentivaram
a seguir adiante na estrada da evolução, do trabalho e da justiça”
v AGRADECIMENTOS
É com imenso prazer que eu quero agradecer as maravilhosas pessoas que
fizeram parte deste trabalho. Não tenho palavras para expressar tanta gratidão,
carinho, amizade e alegria. Foram anos que marcaram um pedaço da minha
história, quem sabe até do meu destino. Meus sinceros agradecimentos:
À Profa Dra Vânia D’Almeida, minha orientadora, por ter acreditado em mim,
pela oportunidade única e por me dar chances de crescer, errar e recomeçar,
acertar e continuar. Foram sábios ensinamentos que serão a base da minha vida
de pesquisador, de profissional e de amigo.
Ao Prof Dr Marcos Leoni Gazarini Dutra, meu co-orientador, pela paciência e
dedicação, pelas palavras de conforto, de humildade e de sinceridade. Aprendi
muito com este homem, principalmente a operar um equipamento e ver vários
ângulos de uma resposta na pesquisa.
À Kênia, Joyce, Daniel, Suelen, Mônica, Tuka, Luciana e Tânia, pela ajuda direta
ou indireta, umas mais recentes e outras mais antigas, mas que muito ajudaram
na conclusão deste trabalho.
Aos amigos de pesquisa Bruno, Allan, Francine, Marina Marques, Leandro,
Vanessa C, Vanessa P, Karen, Sônia, Priscila, Ana Carolina, Michelle, Eduardo,
Guilherme, Letícia, Marina R, Larissa, Gustavo, Vaneisse, André, Daniela,
vi Rodolfo, Nicole e Cinthia que sempre colaboram com meu trabalho desde o
inglês até a montagem da tese.
Aos amigos de pesquisa que já não fazem mais parte do laboratório, Bruno
Grego, Letícia Brandão, Karina, Karin, Lara, Elaine, Paulo, Márcia e Mayra mas
que marcaram um pedacinho deste trabalho.
À Laurinha, Diva, Sueli, Ivan entre outros que ajudaram com a parte técnica.
À Bruna, Luciana e Renan, também companheiros de luta e pesquisas.
Aos professores:
Dr Ivarne L. Tersariol e Dr Edgar J. Paredes-Gamero pelas sugestões de
pesquisa, confecção de artigo e interpretação de resultados;
Dra Sônia Hix pela ajuda no protocolo de estresse oxidativo;
Dr Jair Ribeiro Chagas, pela sabedoria e conhecimentos que foram passados
sempre com boa vontade e dedicação.
Dr Sergio Tufik, pelo apoio, crédito para minha pesquisa entre outras
benevolências.
Meus agradecimentos a Capes (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal
de Nível Superior), pela bolsa recebida, ao Programa FAPESP/CEPID e à AFIP
(Associação Fundo de Incentivo à Pesquisa) pelo apoio financeiro.
vii Esta
dissertação
foi
realizada
no
Departamento
de
Psicobiologia
da
Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, com o apoio
financeiro da FAPESP/CEPID Processo 98/14303-3 à Associação Fundo de
Incentivo à Pesquisa (AFIP) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CAPES-CNPq).
viii SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO____________________________________________ 1
1.1
Sono e privação de sono____________________________________
1
1.1.1
Privação de sono e o sistema imunológico______________________
2
1.2
Sinalização celular_________________________________________
4
1.3
Homeostase doi cálcio______________________________________ 5
1.3.1
Sinalização celular do cálcio em células imunológicas_____________
1.3.2
Participação dai mitocôndria na homeostase do cálcio_____________ 10
1.4
Estresse ioxidativo_________________________________________ 14
1.4.1
Interrelação entre cálcio e espécies reativas do oxigênio___________ 17
2
OBJETIVO_______________________________________________ 19
3
MATERIAIS E MÉTODOS___________________________________ 20
3.1
Animais experimentais______________________________________ 20
3.2
Procedimentosi experimentais________________________________ 20
3.2.1
Privação de isono__________________________________________ 20
3.2.2
Isolamento dos iesplenócitos_________________________________ 22
3.2.3
Medidas e visualização de fluorescência em microscopiai confocal___ 23
9
3.2.3.1 Marcação da mitocôndria e lisossomos com inibidores fluorescentes__ 23
3.2.3.2 Estudo xxdos xmecanismos xxenvolvidos xnaxx manutençãox xdos
gradientes iônicos (cálcio e hidrogênio) nas organelas intracelulares__ 24
3.2.3.3 Integridadex xdosx canaisx dex cálcioxx operadosx porx estoquexx na
membranai plasmática______________________________________ 24
3.2.4
Acompanhamento xdax infecçãoxx porx maláriax emxx camundongos
submetidos a diferentes períodos de rebote_____________________ 25
ix 3.2.5
População de células esplênicas imunológicas___________________ 25
3.2.6
Determinação de expressão gênica____________________________ 26
3.2.6.1 Reação em cadeia da polimerase quantitativai (tempo real)_________ 26
3.2.7
Determinação dos marcadores de estresse oxidativo______________ 27
3.2.7.1 Determinação dei lipoperoxidação_____________________________ 27
3.2.7.2 Determinação da atividade da catalase_________________________ 28
3.2.7.3 Determinação da atividade da superóxido dismutase______________ 29
3.2.7.4 Determinação de proteínasi totais_____________________________ 30
3.3
Análise estatística_________________________________________
31
3.4
Comitê de ética em pesquisa________________________________
31
4
RESULTADOS____________________________________________ 32
4.1
Medidasxx dax fluorescência xdox cálcioxx intracelularxx realizadas
no espectrofluorímetro______________________________________ 32
4.2
Medidas da fluorescência da mobilização dox cálcio emx microscopia
confocal_________________________________________________ 36
4.2.1
Medidas da fluorescência da mobilização do cálcio nos lisossomos___ 37
4.2.2
Medidas da fluorescência das flutuações do cálcio mitocondrial______ 38
4.2.3
Medidas da fluorescência do cálcio mitocondrial basal_____________ 39
4.2.4
Visualização da morfologia e fisiologia dos lisossomos_____________ 40
4.2.5
Integridade dos canais de cálcio operados por estoquex (SOCE) na
membranai plasmática______________________________________ 41
4.2.6
Visualizaçãox daxx morfologiax ex fisiologiaix dax mitocôndriax ex do
potencial deii membrana xmitocondrial_________________________ 43
4.3
Curvas de sobrevivência de camundongos, sob privação de sono,
infectados com patógenos, em diferentes condições de rebote______ 46
x 4.4
Expressãox dex proteínasx envolvidasx nax sinalizaçãox dox cálcio
Intracelular_______________________________________________ 47
4.5
Populações das células do baço______________________________ 48
4.6
Determinaçãoxxx daxx lipoperoxidaçãoixxx tecidualxx exx xpotencial
lipoperoxidativoi___________________________________________ 51
4.6.1
Determinação da atividade da catalase_________________________ 53
4.6.2
Determinação da atividade da superóxido dismutase______________ 54
4.7
Determinação da expressão gênica das enzimas antioxidantes______ 57
5
DISCUSSÃO_____________________________________________ 59
6
CONCLUSÕES___________________________________________ 73
7
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS___________________________ 75
ABSTRACT______________________________________________ 85
xi LISTA DE ABREVIATURAS
AO = Acridina Orange
ATP = Adenosina Trifosfato
Baf = Bafilomicina A
Bcl-2 = Linfoma de celulas B
Ca2+ = Íon cálcio
cADP = Adenosina Difosfato cíclica
CAT = Catalase
CCE = Entrada capacitativa de cálcio
CRAC = Cálcio ativado por liberação de cálcio
CREB = cAMP response element binding
CT = controle
CuZnSOD = Cobre-zinco superóxido dismutase
EO = Estresse oxidativo
ERO = Espécies reativas do oxigênio
FCCP = p-trifluoromethoxi carbonil cianeto fenil hidrazona
F/F0 = Fluorescência/fluorescência basal
GADPH = Gliceraldeido-trifosfato-dehidrogenase
GSH = Glutationa
H+ = Íon hidrogênio
H2O2 = Peróxido de hidrogênio
HeLa = Câncer do epitélio cervical humano
IFNγ = Interferon - gama
IL-1,2 e 6 = Interleucinas 1, 2 e 6
xii ip = intra peritoneal
IP3 = Inositol trifosfato
K+ = Íon potássio
KCN = Cianeto de potássio
MDA = Malondialdeído
MnSOD = Manganês superóxido dismutase
MP = Membrana plasmática
Na+ = Íon sódio
NAADP = Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate
NAD/NADH = Nicotinamida adenina difosfato
NBT = Azul de nitro tetrazolio
NFAT = Fator nuclear de células T ativadas
NF-κB = Fator nuclear kappa B
Nig = Nigericina
NK = Natural Killer
O2 = Oxigênio
O2•− = Ânion superóxido
PLC = Fosfolipase C
PMCA = Ca2+ATPase de membrana plasmática
PMM = Potencial de membrana mitocondrial
PMS = Metilssulfato de fenazina
PS = Privação de sono
RAM = Modo de captação rápida
RE = Retículo endoplasmático
ROC = Canais controlados por receptores
xiii RT-PCR = Reação em cadeia da polimerase – tempo real
SCID = Imunodeficiência combinada severa
SERCA = Ca2+ATPase de retículo endoplasmático/sarcoplasmático
SI = Sistema imunológico
SMOC = Canais controlados por segundos mensageiros
SNC = Sistema nervosa central
SOC = Canais operados por estímulos
SOCE = entrada de cálcio operada por estoque
STIM1 = Molécula de interação estromal 1
TBA = Ácido tiobarbitúrico
TBARS = Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
Thg = tapsigargina
TMRE = Tetrametil-rodamina-etil-éster
TNFa = Fator de necrose tumoral - alfa
UN = Uniport
VOC = Canais operados por voltagem
xiv LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Modelo das estruturas envolvidas na homeostase de Ca2+.
FIGURA
2.
Esquema
representando
a
participação
mitocondrial
na
homeostasia do Ca2+.
FIGURA 3. Geração de radicais livres pela cadeia fosforilativa e vias de
enzimas antioxidantes na mitocôndria.
FIGURA 4. Ilustração mostrando a técnica de PS para camundongos pelo
método de plataforma múltipla modificada.
FIGURA 5. Representação esquemática da geração do ânion superóxido e
ação de um antioxidante (SOD total) presente no meio.
FIGURA 6. Efeito da PS sobre a mobilização do Ca2+ intracelular em
esplenócitos de camundongos, realizados em espectrofluorìmetro.
FIGURA 7. Histograma de mudanças da fluorescência de Ca2+ intracelular em
cada período da PS.
FIGURA 8. Resolução de Imagem de fluorescência de indicador de Ca2+ Fluo
3, nos esplenócitos de camundongos utilizando microscopia confocal.
FIGURA 9. Medida da fluorescência da mobilização do Ca2+ em microscopia
confocal.
FIGURA
10.
Flutuações
do
Ca2+
mitocondrial
em
esplenócitos
camundongos privados de sono incubados com X-Rhod-1 AM.
FIGURA 11. Fluorescência basal do Ca2+ mitocondrial durante a PS.
FIGURA 12. Morfologia e fisiologia dos lisossomos.
FIGURA 13. Atividade dos canais de Ca2+ de membrana (SOCE).
FIGURA 14. Morfologia e fisiologia das mitocôndrias.
xv de
FIGURA 15. Morfologia e fisiologia do PMM.
FIGURA 16. Curvas de sobrevivência de camundongos com infecção da
malária de murinos (Plasmodium chabaudi) após a PS e períodos de rebote.
FIGURA 17. Expressão de genes envolvidos no metabolismo do Ca2+ em
células do baço de camundongos.
FIGURA 18. População de células totais do baço.
FIGURA 19. População das principais células do sistema imunológico
localizadas no baço de camundongos.
FIGURA 20. Análise de citometria de fluxo e dupla marcação com Anexina VFITC/PI.
FIGURA 21. Determinação de lipoperoxidação em baços de camundongos. CT
vs privados de sono/72h.
FIGURA 22. Determinação do potencial lipoperoxidativo em baços de
camundongos.
FIGURA 23. Determinação da atividade da enzima antioxidante CAT em
esplenócitos do baço de camundongos.
FIGURA 24. Determinação da atividade da SOD total (mitocôndria e citosol)
em esplenócitos de camundongos.
FIGURA 25. Determinação da atividade da MnSOD em esplenócitos de
camundongos.
FIGURA 26. Determinação da atividade da CuZnSOD em esplenócitos de
camundongos.
FIGURA 27. Expressão do gene da enzima antioxidante CAT em células do
baço de camundongos.
xvi FIGURA 28. Expressão do gene da enzima antioxidante MnSOD em células do
baço de camundongos.
FIGURA 29. Expressão do gene da enzima antioxidante CuZnSOD em células
do baço de camundongos.
xvii RESUMO
O sono é um importante evento fisiológico que diretamente influencia a saúde e
está relacionado com o sistema imunológico no qual o cálcio age como um
importante mensageiro. Neste estudo, nós realizamos as medidas de
mobilização do cálcio citossólico em células vivas com o objetivo de
compreender as mudanças na sinalização deste íon em células imunológicas do
baço de camundongos após diferentes períodos de privação de sono.
Esplenócitos de camundongos privados de sono por diferentes períodos (12 à
72 horas) mostraram uma progressiva perda da manutenção do cálcio
intracelular proveniente do estoque do retículo endoplasmático e um
comprometimento do tamponamento de cálcio transiente pela mitocôndria. Estes
dados foram confirmados por mudanças no desempenho dos canais de cálcio
SOCE e STIM1 e na integridade da fisiologia mitocondrial e lisossomal. Estes
resultados foram corroborados pelo aumento na atividade de enzimas
antioxidantes como a Superóxido Dismutase mitocondrial e citossólica, o que
reforça que o rompimento na integridade da mitocôndria e lisossomos
possivelmente ocorreu pela geração descontrolada de estresse oxidativo. A
redução da atividade da Catalase sugere comprometimento na integridade
celular, uma vez que o excesso de cálcio e radicais livres provavelmente
danificaram o mecanismo de sinalização da célula. Ademais observamos
resposta imunológica deficiente quando um grupo de camundongos pode dormir
por 24 e por 48 horas após a privação de sono por 72 horas, seguido de
infecção com parasita de malária (Plasmodium chabaudi). O envolvimento das
células imunológicas foi confirmado pela redução na população de células totais
xviii do baço e, especificamente, na população de linfócitos B. Estes novos dados
sugerem que a privação de sono prejudica a sinalização do cálcio
provavelmente por um estresse no retículo endoplasmático, mitocôndria e
lisossomos levando a um suprimento insuficiente de cálcio para eventos de
sinalização com conseqüentes danos intracelulares. Estes dados confirmam
mecanismos descritos previamente de efeitos imunossupressores da perda de
sono.
xix 1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Sono e privação de sono
O ciclo vigília-sono é regulado por dois processos fundamentais: o
circadiano e o homeostático (Kim e cols., 2007). O circadiano é tido como uma
adaptação do organismo ao ciclo dia e noite ocorrendo mesmo na ausência de
pistas temporais (Aschoff, 1965). O homeostático regula a propensão para o
sono, baseado na quantidade de vigília anterior fazendo com que o organismo
recupere ou compense o recurso (sono) que foi insuficiente (Kim e cols., 2007).
A descoberta de que o sono é um fenômeno ativo e regulado a partir de
regiões específicas do sistema nervoso central (SNC) levou a uma
predominância dos estudos quanto às conseqüências da perda de sono nos
sistemas fisiológicos e nas funções cerebrais (Rots e cols., 1996). O sono é um
estágio de reconstrução e reparo dos organismos e sua duração se
correlaciona com o relógio molecular ou expressão rítmica dos genes relógio, e
a sua privação compromete a expressão de vários genes em diferentes
espécies,
entre
eles
genes
relacionados
ao
metabolismo
lipídico
e
transportadores de membrana (Mackiewicz e cols., 2009). Há também, durante
o sono, expressão aumentada de genes envolvidos no transporte intracelular,
nas vias de sinalização de segundos mensageiros e alguns genes envolvidos
na regulação de energia (Mackiewicz e cols., 2009). Neste contexto, o
entendimento do seu papel fisiológico, bem como da sua falta na saúde dos
indivíduos, ainda necessita de mais estudos.
2
1.1.1 Privação de sono e o sistema imunológico
A privação de sono (PS) é uma condição comumente presente na vida
moderna e resulta na predisposição a várias doenças. Estudos experimentais
recentes em humanos têm mostrado que, uma restrição parcial crônica de sono
de 2-3 horas por noite, leva a um prejuízo na estrutura cognitiva, função
cardiovascular, endócrina e imunológica (Kim e cols., 2007; Palma e cols.,
2007; Krueger e cols., 2001). O sistema imunológico (SI) é um aspecto
fisiológico que está intimamente ligado à qualidade do sono realizado. Os
trabalhos sobre esse tópico mostraram diferenças na produção de citocinas e
no número total de células brancas dependendo da duração da PS imposta ao
indivíduo (Zager e cols., 2008; Dimitrov e cols., 2007). Durante a vigília
prolongada, intensifica-se o aumento de glicocorticóides na corrente sanguínea
levando a uma redução da função imunológica por meio da supressão de
citocinas e fatores da inflamação (Johnson e cols., 2004).
Experimentos realizados em modelos animais envolvendo o processo
infeccioso mostraram que, o aumento na duração do sono durante a infecção
melhora o prognóstico de sobrevivência e recuperação desses animais (Toth e
cols., 1993). Foi observado também que a PS em ratos por 96 horas
desencadeou manifestações críticas, como lesões na pele, hipotermia e
diminuição da resistência a infecções, diminuindo dessa forma a manutenção
da integridade do SI (Bergmann e cols., 1989; Kushida e cols., 1989).
Palmblad e colaboradores em um experimento com humanos privados de
sono por 77 horas em um ambiente que simulava um campo de batalha
constataram redução na atividade fagocítica e aumento na produção de
3
interferons (IFN) linfocitários, e em outro experimento com 48 horas de PS
também em humanos, observaram uma diminuição na proliferação de linfócitos
após estimulação com mitógeno (Palmblad e cols, 1976, 1979).
Skurikhin e colaboradores em experimento realizado com culturas de
células da medula óssea de camundongos privados de sono por 48h
verificaram aumento de unidades formadoras de colônias de GranulócitosMacrófagos (Skurikhin e cols., 2006), sugerindo que a PS tem um papel
fundamental na ativação da resposta inflamatória.
As quantidades de algumas citocinas presentes na circulação estão
diretamente relacionadas com o ciclo sono-vigília, por exemplo, IL-1, IL-2, IL-6,
TNFα e IFNγ (Irwin, 2002) e apresentam flutuações na sua produção
dependendo do momento do período de sono.
A IL-1 e o TNFα são as
principais citocinas envolvidas na fisiologia do sono, pois além do seu papel na
regulação do sono, estão envolvidas na regulação térmica e resposta
imunológica (Krueger e cols., 2001). Estas citocinas interagem com os
principais sistemas de neurotransmissão ligados à regulação do sono,
constituindo uma resposta adaptativa do organismo num processo inflamatório,
e em situações adversas relacionam-se a mecanismos de preservação como,
por exemplo, redução do gasto energético durante a sonolência causada pela
febre (Zepelin, 2000; Krueger e cols., 2001; Toth e cols., 1993).
Kim e colaboradores, em estudos de restrição de sono repetida e outras
formas de PS desenvolvidas em ratos, mostraram alterações nos níveis de
corticosterona e de citocinas pró-inflamatórias, bem como aumento nos níveis
de marcadores de estresse oxidativo (EO) e processos neurodegenerativos no
hipocampo destes animais (Kim e cols., 2007). Quando há produção
4
descontrolada de radicais livres na membrana de organelas como a
mitocôndria, lisossomos e retículo endoplasmático (RE), ocorre vazamento de
cálcio (Ca2+) de seu lúmen e de enzimas antioxidantes para o citosol, o que
leva a citotoxicidade e disfunção enzimática respectivamente, (Stadman e
Berllet, 1997; Mitch e Goldberg, 1996) podendo provocar morte celular por
apoptose ou necrose. Estas organelas são cruciais para o bom desempenho da
resposta imunológica. Os lisossomos, por exemplo, são compartimentos
celulares essenciais para a manutenção do SI, uma vez que desempenham
função importante no controle do processamento e apresentação de antígenos
na membrana dos linfócitos, secreção de citocinas pelas células imunológicas e
fagocitose pelos macrófagos (Castaneda e cols., 2008).
1.2 Sinalização celular
As
células
reconhecem
estímulos
e
mudanças
fisiológicas
extracelulares, utilizando-se de um complexo conjunto de reações bioquímicas
que podem ter início na membrana plasmática (MP) (neurotransmissores,
hormônios e outras moléculas) e desencadeiam uma cascata de reações e de
mensageiros intracelulares de modo que a célula possa alterar seu
metabolismo resultando, por exemplo, em divisão, diferenciação ou morte
celular (Berridge e cols., 2003).
A grande variedade de estímulos que as células estão recebendo a todo
o momento depende da existência de inúmeros receptores protéicos que
podem ser transmembrânicos e intracelulares (Le Deist e cols., 1995). Os
receptores transmembrânicos podem ser subdivididos em ionotrópicos (canais
5
de membrana) e metabotrópicos (associados à proteína G e os enzimáticos –
ex: tirosina quinases) (Berridge e cols., 2003). Embora, centenas de hormônios,
neurotransmissores e outras moléculas possam estimular as células, o número
de sistemas de segundos mensageiros que elas ativam é consideravelmente
pequeno, sendo um dos mais importantes entre eles, o íon Ca2+ (Parekh,
2006). A quantidade de íons Ca2+ mantida em estoques intracelulares pode ser
regulada por diferentes vias de entrada de Ca2+, como por exemplo, CCE
(capacitative calcium entry), ativado somente pela depleção de estoques de
Ca2+, que pode induzir a Fosfolipase C (PLC), ou ainda, por canais SOC
(Stored Operated Calcium) induzidos pela proteína sensora de Ca2+, STIM1
(Stromal Interacting Molecule 1) (Morita e cols., 2008).
1.3 Homeostase do Ca2+
O Ca2+ é um íon importante para diversos eventos que ocorrem nas
células eucarióticas, e um dos grandes desafios é entender como os inúmeros
sinais de Ca2+ controlam os processos celulares tão heterogêneos em uma
grande variedade de sistemas. Sua ligação às proteínas e enzimas leva às
mudanças estruturais resultando, por exemplo, no controle da diferenciação
celular, organização do citoesqueleto e divisão celular (Berridge e Irvine, 1984;
Carafoli, 1987; Berridge e Irvine, 1989; Sambrook, 1990; Putney e Bird, 1993).
Uma maquinaria celular diversificada para sinalização do Ca2+ é usada como
um sistema de modulação com diferentes dinâmicas temporais e espaciais do
fluxo de Ca2+ intracelular. Respostas rápidas são reguladas por picos de Ca2+
localizados, enquanto respostas mais lentas são controladas por flutuações de
6
Ca2+ intracelular sustentada ou por repetidos pulsos transientes (Berridge e
cols., 2003).
Porém, apesar de ser importante para as células, a concentração de
Ca2+ deve ser bem regulada, devido ao seu efeito citotóxico quando em altas
concentrações (Berridge e cols., 2003). A alta concentração de Ca2+
extracelular livre (em torno de mM), comparado com o Ca2+ intracelular livre
(níveis de nM), resulta em um gradiente eletroquímico de Ca2+. Mudanças
mínimas nessas concentrações induzidas por estímulos fisiológicos na
permeabilidade da MP ao Ca2+ podem produzir flutuações significativas na
concentração citossólica. As células eucarióticas possuem mecanismos de
transporte de Ca2+ na MP, e no RE. A MP possui uma Ca2+ATPase específica
(PMCA) que exporta o Ca2+ intracelular ativamente para o meio extracelular
(Schatzmann, 1966; Scarpa e cols., 1993), e possui também diversas
categorias de canais de membrana (“VOC” – canais operados por voltagem;
“ROC” – canais operados por receptores; “SMOC” – canais controlados por
segundo mensageiros) (Berridge e cols., 2003), e um trocador Na+/Ca2+
(Reuter e Seitz, 1968; Blaustein e Hodgkin, 1968). (figura 1). A Ca2+ATPase de
membrana é uma bomba de Ca2+ regulada pela calmodulina (Gopinath e
Vincenzi, 1977; Jarrett e Penniston, 1977). Quando a calmodulina estimula a
Ca2+ATPase da membrana, essa bomba aumenta a afinidade pelo Ca2+, e
consequentemente ocorre um aumento no transporte de Ca2+ (Carafoli e cols.,
1996).
O RE forma uma rede de túbulos
e cisternas luminalmente
interconectados pelo citoplasma e possui distribuição heterogênea de sítios de
liberação e captação de Ca2+ (Spät e cols, 2008). Baseado nestas
7
propriedades, diferentes sinais citoplasmáticos podem convergir no RE para
formar padrões de liberação de Ca2+ espaço-temporalmente controlados
(Bootman e cols., 2002; Verkhrastsky, 2005). O RE possui uma Ca2+ATPase
específica para a captação de Ca2+, cuja estrutura primária difere da
Ca2+ATPase da membrana plasmática (Ebashi, 1958). Ambas transportam o
Ca2+ numa razão estequiométrica de 2 para cada ATP hidrolisado (MacLennan,
1970).
Figura 1. Modelo das estruturas envolvidas na homeostase de Ca2+. O sistema de transporte
de Ca2+ está representado por Ca2+-ATPases, presentes na MP e no RE; trocadores Na+/Ca2+
presentes na MP e na mitocôndria; um transportador uniporte na mitocôndria; mecanismos de
efluxo/influxo na mitocôndria, um canal de Ca2+ sensível a IP3 no RE; um canal de Ca2+ na MP
e poros nucleares (modificado de Brini e Carafoli, 2000).
Os conjuntos de mecanismos de regulação e sinalização do Ca2+
intracelular são freqüentemente distintos em diferentes modelos celulares, mas
apresentam um fator em comum, as flutuações de Ca2+ acontecem como
breves pulsos (Berridge e cols., 2003). O Ca2+ proveniente do meio
extracelular, que depende da abertura de canais de membrana, pode ocorrer
em
resposta
a
estímulos
como:
despolarização,
contato,
agonistas
8
extracelulares, mensageiros intracelulares e Ca2+ interno, enquanto a
mobilização dos estoques intracelulares (RE, lisossomos e complexo de Golgi)
em resposta a ação de uma série de segundos mensageiros (IP3, cADP-ribose,
NAADP, Ca2+).
Feske e colaboradores relataram que o peptídeo sinal do canal de Ca2+,
ORAI1 é um componente essencial na ativação do complexo canal CRAC que
se liga à proteína STIM1, esta interação é necessária para ativar o influxo de
Ca2+ operado pela depleção de seu estoque (Feske e cols., 2006). Estas
proteínas são responsáveis pela mobilização e manutenção de Ca2+ no RE
como o influxo operado por estoque (SOCE), uma vez que ativação de STIM1
pode ser um sensor na membrana do RE que promove a redução de Ca2+ na
organela (Korzeniowski e cols., 2009; Parekh, 2006; Feske e cols., 2006). A
depleção do estoque de Ca2+ do RE causa uma mudança na conformação do
domínio EF-hand luminal de STIM1, que leva a sua oligomerização. Esta
aumenta a afinidade da proteína por regiões alvo de junções RE-MP e causa
uma mudança conformacional da STIM1 para expor o domínio de ligação do
canal CRAC (Park e cols., 2009).
A capacidade de acumular Ca2+ intracelular é potencializada pela
presença de proteínas que tamponam o íon livre e também participam na
regulação de diversas funções celulares. As proteínas podem estar confinadas
em compartimentos celulares específicos, por exemplo, no citosol (calbindina,
calretinina, etc) e no lúmen do RE (calreticulina, calsequestrina, calnexina)
(Berridge e cols., 2003).
9
1.3.1 Sinalização celular do Ca2+ em células imunológicas
A participação do Ca2+ intracelular é essencial para a fisiologia de
diferentes células do SI (macrófagos, monócitos, células NK, linfócitos T e B) e
resulta na ativação celular e outros processos importantes, tais como,
expressão gênica ou diferenciação (Dimitrov e cols., 2007). No caso dos
linfócitos, a flutuação de Ca2+ intracelular em decorrência da ativação de
receptores de membrana (TCR) depende principalmente da liberação de Ca2+
pelo RE e a consequente indução da abertura de canais de Ca2+ na MP (CRAC
-“store operated”) (Gallo e cols., 2006). Estas etapas são ativadas pela proteína
sensor de Ca2+ STIM1 quando ocorre a depleção do íon do RE e pela proteína
ORAI1 (pertencente à família de canais CRAC), que ativada pela STIM1,
promove a abertura deste canal (Lioudyno e cols., 2007; Luik e cols., 2006;
Zhang e cols., 2005).
As respostas celulares induzidas por Ca2+ podem ser de curta duração,
como o controle da mobilidade celular e a exocitose de vesículas. Nessa
situação o aumento intracelular do mensageiro Ca2+ desencadeia a diminuição
da mobilidade celular dos linfócitos (Delon e cols. 1998), de modo a sustentar a
interação entre diferentes células (células T CD4+ e APCs - apresentadoras de
antígeno) pelo tempo suficiente para consolidar a sinapse imunológica (Bhakta
e cols., 2005). Porém este aumento precisa ser sustentado por horas para
permitir a indução de expressão gênica (Berridge e cols., 2003).
As
respostas
de
longa
duração
sustentada
pelo
aumento
da
concentração do Ca2+ intracelular promovem uma seqüência de eventos que
10
envolvem fatores de transcrição, tais como, CREB, NFAT, ou NF-κB, os quais
são responsáveis por ativar a produção de citocinas dos linfócitos T e B, e que
por sua vez, vão modular o perfil de suas funções celulares (Feske, 2007).
Os
elementos
apresentados
evidenciam
a
importância
desse
mensageiro celular, e as alterações nas vias em que o cálcio participa,
resultam em prejuízo na fisiologia do SI, sendo que algumas imunodeficiências
hereditárias são associadas a esta via de sinalização. Por exemplo, a perda da
atividade do canal de Ca2+ da MP de linfócitos T (pacientes “SCID” - severe
combined immunodeficiency), compromete a proliferação celular, a expressão
de citocinas e as respostas associadas à apresentação de antígenos (Partiseti
e cols., 1994 e Le Deist e cols., 1995). A concentração de Ca2+ intracelular é
determinada por um balanço entre a reação “on” e a reação “off”. Durante a
reação “on” ocorre o influxo do Ca2+ do meio extracelular para o citosol e da
formação de segundos mensageiros responsáveis pela liberação do Ca2+ de
seus estoques. Já na reação “off” a partir deste sinal (aumento da
concentração de Ca2+ intracelular), o Ca2+ é removido pela ação combinada de
trocadores, bombas e proteínas tampões (Berridge e cols., 2003). Além disso,
várias condições fisiológicas ou patológicas podem estimular a produção de
espécies reativas do oxigênio (ERO), que cujo alvo podem ser as chaperonas e
canais de Ca2+ no RE, levando a liberação de Ca2+ para o citosol (Zhang,
2010).
11
1.3.2 Participação da mitocôndria na homeostasia do Ca2+
A mitocôndria tem despertado grande interesse com relação a sua função
e fisiologia, particularmente relacionado com a mobilização de Ca2+ intracelular.
A respeito da mitocôndria acreditava-se que por apresentar uma alta
capacidade de armazenamento do íon Ca2+, porém com uma baixa afinidade,
somente responderia a mudanças de concentrações de Ca2+ muito elevadas,
ou seja, em situações pouco freqüentes no metabolismo celular. No entanto,
recentemente, verificou-se que a mitocôndria é uma organela muito dinâmica
que participa no metabolismo normal da célula, como também em situações
patológicas (Duchen, 2000). Experimentos realizados em microscopia confocal
mostraram que as mitocôndrias acompanham toda a interação na sinalização
da proteína STIM1 durante a ativação e abertura dos canais dependentes de
Ca2+ (SOCE), assim como a mitocôndria se transloca para a região da MP na
abertura do canal CRAC ativado pelo influxo de Ca2+ (Korzeniowski e cols.,
2009; Quintana e cols., 2006). A mitocôndria e o RE estão intimamente
envolvidos na modulação da sinalização do Ca2+ (Rimessi e cols., 2008).
Em condições fisiológicas a propagação do sinal de Ca2+ para a
mitocôndria, resulta na estimulação da produção de ATP através da ativação
de desidrogenases sensíveis ao Ca2+ e do efeito “feedback” na sinalização do
Ca2+ citoplasmático (Feissner e cols., 2009; Roy e Hajnóczky, 2008). Deste
modo é formado um gradiente eletroquímico de H+ na membrana interna, pela
atividade dos complexos da cadeia respiratória (I, III e IV) atuando como
bombas de H+ (figura 2). O potencial de membrana formado é fundamental
para a produção de ATP pela ATP sintase (Nicholls e Budd, 2000).
12
Figura 2. Esquema representando a participação mitocondrial na homeostasia do Ca2+.
Transporte de íons e metabólitos estão representados pelas setas finas passando por
transportadores de membrana, vias metabólicas pelas setas grossas, cadeia respiratória de
transporte de elétrons pelas setas pontilhadas, e enzimas do ciclo do ácido tricarboxílico pelos
balões sombreados. O mecanismo de influxo e efluxo do Ca2+ mitocondrial estão ilustrados em
amarelo. Enzimas e complexos estimulados pelo Ca2+ estão representados em verde, e a
cadeia respiratória em azul. (Extraída de Feissner e cols., 2009).
O potencial de membrana é também utilizado em outros processos,
como o transporte de Ca2+. A entrada de Ca2+ é controlada principalmente pelo
canal uniporte (UN), que pode ser desativado com a despolarização da
membrana interna (Satrústegui e cols., 2007; Igbavboa e Pfeiffer, 1988) e pelo
canal de captação rápida (RAM), que atua em ocasiões de pulsos de Ca2+ no
citoplasma (Sparagna e cols., 1994, 1995). A transferência de sobrecarga do
Ca2+ mitocondrial leva a abertura do poro de permeabilidade transitória, que se
trata de um poro inespecífico que pode, ainda assim, promover a entrada de
mais Ca2+, além de outros solutos (Roy e Hajnóczky, 2008; Bernardi, 1999). Na
13
situação de baixa condutância, ocorre uma abertura transitória do poro que
permite o fluxo de íons, mas quando em alta condutância, o poro é aberto
permanentemente, o que leva o direcionamento da célula para morte celular
por apoptose (Mannella e cols., 1997).
A homeostasia de Ca2+ mitocondrial é importante para a ativação de
desidrogenases
como
a
piruvato,
NAD-isocitrato
e
a
2-oxoglutarato
desidrogenases, (Denton e McCormack 1985), que por sua vez, catalisam a
redução do NAD para NADH, ativando o processo de fosforilação oxidativa
(Satrústegui e cols., 2007).
O aumento da disponibilidade de NADH nas células, estimuladas pela
alteração do Ca2+ intracelular, determina o aumento da atividade da cadeia
respiratória e a conseqüente síntese de ATP na célula (Jouaville e cols., 1999)
em resposta ao rápido aumento da demanda energética para promover
processos tais como: secreção, motilidade celular e a própria recaptação do
Ca2+ pelas ATPases.
Uma característica importante da mitocôndria é a capacidade de
tamponar o Ca2+ citoplasmático. Durante a estimulação por um agonista, há a
produção do segundo mensageiro IP3 e, conseqüentemente, a liberação de
Ca2+ dos estoques internos, como o RE. A mudança da concentração do Ca2+
citoplasmático deve ser rapidamente contida por mecanismos de recaptação de
Ca2+ pelas organelas ou extrusão pela MP. Nesta situação o trabalho de
Rizzuto e cols., 1998, utilizando-se de transfecções com a proteína
fluorescente aequorina (sensível ao Ca2+) em células HeLa (linhagem de
células cancerosas do epitélio cervical), mostrou que a mitocôndria pode
acumular Ca2+ transientemente na faixa de 60-80µM, sendo que o aumento
14
citossólico é de 1-2µM (Rizzuto e cols., 1998), indicando que a capacidade de
acumular Ca2+ pela mitocôndria tenha sido até então subestimada (Rizzuto e
cols., 2000). A Bcl-2, uma proteína antiapoptótica, que está presente na
membrana da mitocôndria e do RE pode modular potencialmente a sinalização
do Ca2+. Uma vez que há excesso de Ca2+ pela mitocôndria, a Bcl-2 poderá
sinalizar a ativação da Bax e do citocromo c e disparar o processo pró
apoptótico mitocondrial (Rimessi e cols., 2008).
1.4 Estresse oxidativo (EO)
A produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) foi amplamente
descrita em células fagocitárias, tais como, neutrófilos e macrófagos como
também nas vias de sinalização celular (Forman e Torres, 2002; Li e Shah,
2003). O papel das ERO no SI ficou conhecido por estudos de resposta a
agentes microbianos, o que possibilitou que fosse demonstrado que as ERO
servem como mediadores ou reguladores de transdução de sinal em várias
células do SI (Williams e Kwon, 2004).
Apesar de a ativação de ERO permitir o burst respiratório e
estabelecimento da defesa antimicrobiana, existem processos celulares em
que ocorre um desequilíbrio entre a produção e a degradação de ERO,
resultando em um processo de EO que pode levar à peroxidação lipídica da
membrana, oxidação de proteínas e lesão de ácidos nucléicos, culminando
inclusive com a morte celular (Halliwell e Gutteridge, 1999). Estudos também
demonstraram que o EO é um fator que intensifica a manifestação de muitas
condições
fisiopatológicas,
tais
como,
doenças
inflamatórias
crônicas,
15
vasculares e neurodegenerativas (Halliwell e Gutteridge, 1999; Nelson e cols.,
2006). A mitocôndria é considerada a organela chave na produção de ERO.
Durante a fosforilação oxidativa na membrana mitocondrial interna, elétrons
provenientes da redução de substratos são transferidos para o O2 a partir da
cadeia de transporte de elétrons formando o ânion superóxido (O2•-), que por
sua vez, quando em excesso leva ao EO (Feissner e cols., 2009). As duas
maiores vias de produção de O2•- na mitocôndria são: autoxidação ou oxidação
de ubesemiquinona catalizada no complexo III e redução catalizada do
complexo I a partir do reversível fluxo de elétrons na cadeia respiratória
(Goldsteins e cols., 2008).
Cabe lembrar que as células possuem mecanismos de defesa contra a
formação desses radicais livres, sendo que as ERO são neutralizadas por
enzimas antioxidantes como a catalase (CAT) e a superóxido dismutase
(MnSOD, CuZnSOD) entre outras (figura 3). Há três enzimas que catalizam a
reação de dismutação do O2•-. A CuZnSOD ou SOD1 localizada principalmente
no citossol, a MnSOD ou SOD2 encontrada na matriz mitocondrial e a SOD3
que é extracelular. Na matrix a SOD2 converte o O2•- em peróxido de
hidrogênio (H2O2), o qual é reduzido à água pelo sistema glutationa e
tireodoxina
oxirredutase/peroxidase.
Já
no
espaço
mitocondrial
intermembranas e no citossol a conversão do O2•- a H2O2 é realizada pela
CuZnSOD e pelo Citocromo C e, consequentemente, convertido em água pela
CAT.
16
Figura 3 O ânion superóxido (O2•-) gerado pela cadeia respiratória é em sua maioria liberado
para a matrix mitocondrial do complexo I e do complexo III para a membrana mitocondrial
interna (indicado pelas estrelas). O O2•- pode ser dismutado naturalmente para peróxido de
hidrogênio (H2O2) ou é enzimaticamente dismutado pela MnSOD na matrix ou pela CuZnSOD
na membrana mitocondrial interna ou citosol. O H2O2 é destoxificado na matrix pela CAT, ou
pelo sistema tireodoxina e glutationa oxirredutase/peroxidase. Alternativamente o H2O2 pode
reagir com íons metálicos para gerar radical hidroxila, que é altamente reativo via reação de
Fenton. (Extraída de Feissner e cols., 2009).
Gopalakrishnan e colaboradores observaram redução do metabolismo
cerebral durante a PS de 3 a 14 dias em ratos pela técnica do disco sobre a
água. Estes resultados sugerem também um mecanismo adaptativo de defesa
contra a produção de oxidantes durante a vigília prolongada (Gopalakrishnan e
cols., 2004). Além disso, durante o sono há uma super ativação de genes
codificadores de proteínas envolvidas no funcionamento de pools vesiculares
(ex: proteínas heme, flotilina, segundos mensageiros), bem como aumento da
atividade de todas as enzimas antioxidantes e componentes do transporte
intracelular (Mackiewicz e cols., 2009).
17
1.4.1 Interrelação entre Ca2+ e ERO
As células são protegidas por várias vias de detoxificação de ERO que
minimizam os danos oxidativos, porém, situações que levam a um excesso de
produção de ERO provocam mudanças na homeostase redox celular. Desse
modo, ocorrem alterações na mobilização do Ca2+ promovendo mudanças na
produção dessas ERO (Feissner e cols., 2009). Experimentos realizados in
vitro mostraram que o H2O2 induziu o aumento de peroxidação lipídica ativada
pelo acúmulo de Ca2+ na sinapse de células neuronais (Das e cols., 2008). O
principal papel do Ca2+ mitocondrial é estimular enzimas da fosforilação
oxidativa e para isso a mitocôndria atua para moldar e intermediar a sinalização
celular pelo Ca2+. Estudos sugerem que o Ca2+ pode regular sistemas de
defesas antioxidantes por estimulação das enzimas CAT e glutationa redutase,
que interagem com a calmodulina, que por sua vez, interage com enzimas
envolvidas na homeostase das ERO, ou via de liberação precoce de glutationa
(GSH) na abertura do poro mitocondrial induzido por Ca2+ (Feissner e cols.,
2009). Brand e Esteves sugerem que o alto fluxo de elétrons na mitocôndria
resulta do aumento da oxidação de ácidos graxos poliinsaturados produzidos
pelo potencial de membrana e pela produção de O2•− na mitocôndria (Brand e
Esteves, 2005).
Uma vez que a PS prejudica a integridade do SI e as células deste
sistema dependem de uma interação conjunta na atuação das organelas
chaves como RE, mitocôndria e lisossomos para desempenhar seus
mecanismos de defesa, nosso trabalho buscou avaliar o papel destes
18
mecanismos intracelulares em esplenócitos de camundongos após a PS
paradoxal por diferentes períodos (12 à 72h).
19
2 OBJETIVO
Uma vez que o sistema de sinalização intracelular é de fundamental
importância para as células do SI (sistema imunológico) e este é prejudicado
pela PS, o objetivo principal deste trabalho foi analisar as possíveis
modificações no controle da sinalização por Ca2+ e no metabolismo celular em
esplenócitos após a PS por diferentes períodos no modelo experimental de
camundongo.
Objetivos secundários:
1) Avaliar as possíveis alterações na homeostase iônica do Ca2+ e H+
intracelular de esplenócitos após a PS, promovendo a inibição específica
dos transportadores iônicos em cada organela intracelular;
2) Acompanhar modificações na a morfologia e fisiologia das organelas
intracelulares
(RE,
lisossomos
e
mitocôndria)
com
indicadores
fluorescentes específicos para cada organela que estão diretamente
envolvidas na homeostase dos íons Ca2+ e H+ em esplenócitos de
animais privados de sono;
3) Verificar as possíveis variações em parâmetros relacionados ao EO
(atividade das enzimas SOD e CAT) em esplenócitos de camundongos
privados de sono, e correlacioná-las com as flutuações de Ca2+
intracelular.
20
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais experimentais
Foram utilizados camundongos machos adultos (n = 8 por grupo
experimental) da mesma linhagem (suíços albinos) provenientes do Biotério do
Departamento de Psicobiologia da Universidade Federal de São Paulo
(UNIFESP). Os animais foram mantidos em uma sala com umidade e
temperatura controladas (22 ± 2ºC), em um ciclo de claro-escuro de 12 h (7:00
-19:00h). Água e comida foram fornecidas à vontade aos animais durante todo
o experimento. Os animais experimentais foram mantidos durante a fase de
desenvolvimento em grupos de 20 animais, em caixas de polipropileno brancas
(31 x 38 x 16,5cm) e tampas de aço inox com recuos para o fornecimento da
ração. Para a forração das caixas-moradias foi utilizado maravalha de pinus, a
qual era trocada 6 vezes por semana, no período da manhã, pelos técnicos de
laboratório.
3.2 Procedimentos Experimentais
3.2.1 Privação de Sono
A PS foi realizada a partir do método de plataforma múltipla adaptada
para camundongos por Silva e colaboradores (2004).
O método de PS paradoxal de camundongos é uma adaptação do
método de plataformas múltiplas, originariamente desenvolvido para ratos
21
(Nunes e cols., 1994). Grupos com 3 a 4 animais foram colocados em caixas
com água (41 × 34 × 16.5 cm), contendo 12 plataformas (3 cm de diâmetro)
cada, com o nível de água 1 cm abaixo da superfície, por períodos de 24, 48 e
72 horas. O princípio dessa metodologia para a PS apóia-se no fato de que
durante o sono paradoxal, há a ocorrência da atonia muscular, fazendo com
que os animais toquem a água e acordem (figura 4).
Figura 4. Ilustração mostrando a técnica de PS para camundongos pelo método de plataforma
múltipla modificada (Silva e cols., 2004).
Animais controle (CT) foram mantidos em suas gaiolas moradia sem
plataformas, no mesmo ambiente. Comida e água foram fornecidas ad libitum
através de uma grade colocada na parte superior da caixa com água (Silva e
cols., 2004).
22
3.2.2 Isolamento de esplenócitos
O protocolo de isolamento dos esplenócitos (Peres e Curi, 2005)
utilizando os camundongos suíços albinos (dos grupos CT e privado) iniciou-se
com o sacrifício por deslocamento cervical e os baços pinçados foram
colocados em tampão Hanks (NaCl 137mM; KCl 5,7mM; CaCl2 1mM; Na2HPO4
0,3mM; MgSO4 0,4mM; KH2PO4 0,6mM; NaHCO3 4mM; pH 7.4). Os baços
foram macerados gentilmente na peneira plástica contendo o mesmo tampão.
As células obtidas foram centrifugadas a 2000 rpm por 10 minutos,
seguidas por duas incubações em tampão de lise (hemólise) no gelo por 10
minutos com posterior centrifugação para isolamento dos esplenócitos. As
células isoladas foram mantidas no tampão Hanks para a realização das
incubações com os diferentes indicadores celulares específicos para
mobilização iônica ou localização intracelular:
• Indicador de Ca2+ citossólico Fluo 3 AM por 40 minutos à 37ºC;
• Indicador de Ca2+ mitocondrial X-Rhod1 AM por 40 minutos à
37ºC;
• Indicador de H+ lisossomal Acridina Orange (AO) por 10 minutos à
37ºC;
• Marcador de potencial de membrana mitocondrial (PMM) TMRE
por 30 minutos à 37ºC.
Acompanhamos as alterações iônicas intracelulares (CT vs privados de
sono), quando da inibição específica de transportadores iônicos no RE e
lisossomos:
23
• Tapsigargina (Thg) – inibidor de Ca2+ATPase de RE;
• Nigericina (Nig) – ionóforo trocador de K+/H+.
• Bafilomicina A (Baf) - inibidor da H+ ATPase lisossomal
3.2.3 Medidas e visualização da fluorescência no microscópio confocal
A visualização e as medidas de fluorescência com as amostras
incubadas com os indicadores foram realizadas em placas de microscopia préincubadas por 1 hora com poli-lisina, para aumentar a adesão das células e
depois analisadas no microscópio confocal (modelo Zeiss LSM-510).
3.2.3.1
Marcação
da
mitocôndria
e
lisossomos
com
indicadores
fluorescentes
A proximidade do RE e mitocôndria assim como a participação dos
lisossomos, foram analisadas com diferentes indicadores fluorescentes, de
modo a verificar o padrão de distribuição de fluorescência em diferentes células
e poder verificar as modificações que possam ocorrer decorrentes das
condições estudadas.
Indicadores fluorescentes:
• AO (Ex: 488nm Em: > 560 nm) 3µM (mobilização de H+ e
localização lisossomal);
• TMRE (Ex: 543nm Em: > 560nm) 0,5µM (PMM)
24
3.2.3.2
Estudo
dos
mecanismos
envolvidos
na
manutenção
dos
gradientes iônicos (Ca2+ e H+) nas organelas intracelulares
Para as medidas do Ca2+ presente nas organelas (RE, mitocôndria e
lisossomos) nas células, os indicadores foram colocados no tampão Hanks e
incubados por aproximadamente 40 minutos a 37oC e a fluorescência
registrada no espectrofluorímetro ou no microscópio confocal (Zeiss).
Parâmetros dos indicadores:
• Fluo 3 AM – Ex: 488nm Em: 505-550nm (Ca2+ citoplasmático);
• X-Rhod AM – Ex: 543nm Em: LP > 560nm (Ca2+ mitocondrial);
• AO – Ex: 488nm Em: > 560nm (H+ lisossomal/citoplasmático).
3.2.3.3 Integridade dos canais de Ca2+ operados por estoque na MP
(SOCE)
Para avaliar a atividade dos canais de membrana envolvidos na
manutenção do Ca2+ (SOCE), camundongos foram privados de sono por
diferentes períodos (12, 24, 36, 48, 60 e 72h). Após a PS, as células foram
isoladas e incubadas com o fluoróforo Fluo-4 (5mM) em tampão sem Ca2+. A
leitura foi realizada em um espectrofluorímetro com leitor de placas (96poços)
Flex Station. Após 20s de leitura foi adicionado a Thg (5µM) para possível
esvaziamento dos estoques de Ca2+ do RE e após 200s foi adicionado o CaCl2
(100 mM) para avaliar a integridade dos canais de membrana envolvidos nas
flutuações do Ca2+ e medir a fluorescência do influxo deste íon através dos
canais SOCE de membrana.
25
3.2.4 Acompanhamento da infecção por malaria em camundongos
submetidos a diferentes períodos de rebote
Camundongos suíços foram submetidos à PS por 72h seguido por 24 e
48h de rebote de sono. Após a recuperação dos períodos, cada grupo (rebotes
e CTs, n = 10 cada) foi inoculado intraperitonealmente (ip), com eritrócitos
infectados 1x106 com Plasmodium chabaudi (malária de murino) para
acompanhar a eficiência do SI. A infecção é acompanhada realizando a
contagem de células infectadas (parasitemia) de laminas com esfregaços de
sangue e corados com Giemsa (SIGMA).
3.2.5 População de células esplênicas imunológicas
Para verificar a marcação de morte celular e contagem das células, os
esplenócitos foram lavados com PBS e suspenso em tampão de ligação
(0,01 M Hepes, pH 7,4, 0,14 M NaCl e CaCl2 22,5 mM) na concentração de 1 x
106 células /ml. As suspensões foram transferidas para tubos e foram marcadas
com anti-B220-PE (1mg/ml) (linfócitos B), anti-CD3-APC (1,5 mg / ml) (linfócitos
T), anexina V-FITC (5ml) e 7AAD (5mg/ml). Os anticorpos usados foram: CD3FITC e CD4-PerCP para linfócitos Th; Anticorpos CD3- FITC e CD8-PE para
linfócitos Tc; Anticorpos CD19-APC para linfócitos B; Anticorpos CD11b-Alexa
flúor para macrófagos e Anticorpos NK 1.1 – PerCP – Cy 5.5 para células
Natural Killer (NK). As células foram incubadas a 25º C por 20 minutos e, após
a adição de 0,3 ml de tampão de ligação a análise foi realizada em um
citômetro de fluxo FACS Calibur (BD), utilizando o software CellQuest (50000
26
eventos foram coletados por amostra). Para acompanhar a porcentagem total
de células esplênicas, uma alícota do homogenato do baço foi separada e
contada em câmara de Neubauer, utilizando de um microscópio óptico Nikon
TS100 na objetiva de 400 vezes. Os resultados foram apresentados como
média ± D.P das triplicatas. Este experimento foi realizado no Departamento
de Biofísica da UNIFESP, sob a supervisão do Prof. Dr. Edgar J. ParedesGamero.
3.2.6 Determinação da expressão gênica
Os baços obtidos após sacrifício dos camundongos foram rapidamente
macerados e processados de forma a isolar os esplenócitos, sendo os
processos realizados em material estéril. Para extração do RNA total, os pellets
de esplenócitos foram homogeneizados no aparelho IKA® T10 basic. O RNA
total foi extraído com o reagente comercial TRIZOL®. Para avaliação da
integridade do RNA extraído, 2µL de RNA total de cada amostra foi submetido
à eletroforese em gel de agarose. Para quantificação do RNA total, 1µL de
cada amostra foi analisada no Nanodrop Thermo Scientific 8000.
3.2.6.1 Reação em cadeia da polimerase quantitativa (Tempo – Real) –
(Quantitative Polimerase Chain Reaction – qPCR)
A taxa de expressão relativa do RNA mensageiro dos genes: CAT,
CuZn-SOD, Mn-SOD, STIM1 e ORAI1, foram determinados usando o gene
Gliceraldeído-fosfato desidrogenase (GADPH) como gene de referência. Os
27
iniciadores das reações de qPCR foram desenhados no site da IDT (integrated
DNA technologies – www.idtdna.com) e os oligonucleotídeos foram sintetizados
pela Prodimol. As reações de qPCR foram realizadas usando o SYBR GREEN
PCR Master Mix (Fermentas) e o aparelho utilizado foi o CFX96 Real Time
System Bio Rad. As reações foram realizadas em placas clear de 96 poços
com capacidade para 200µL (ABgene® Thermo scientific). As placas foram
seladas com filmes de qualidade óptica (Platemax ultraclear sealing film).
Previamente
ao
ensaio
de
quantificação,
nós
otimizamos
e
determinamos à eficiência da reação de cada gene (entre 90 e 110). A
determinação das eficiências das reações foram realizadas a partir de uma
curva de diluição seriada de um “pool” de cDNA das amostras. A análise da
expressão relativa foi realizada usando o método 2-∆∆CT e confirmada pelo
método 2-∆CT.
3.2.7 Determinações dos marcadores de EO
3.2.7.1 Determinação da Lipoperoxidação
A medida dos níveis de lipoperoxidação do macerado do baço foi
realizada por meio da determinação das substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBARS). Para a quantificação do TBARS esplênico, as amostras
de tecido foram incubadas com uma solução de ácido tiobarbitúrico (TBA) a 1%
como reagente cromogênico (adaptado de Winterbourn e cols, 1985). O
princípio da reação baseia-se na reação do malondialdeído (MDA), o principal
28
produto da oxidação dos lipídios de membrana com o TBA. A quantificação foi
realizada a partir de uma curva padrão de MDA.
A determinação do potencial lipoperoxidativo esplênico foi realizada por
meio da avaliação da produção de substâncias reativas ao TBA durante a
incubação de homogenatos de baço a 37ºC por 1 hora. Para a quantificação do
TBARS esplênico, após a incubação das amostras de homogenato, estas
foram desproteinadas e novamente incubadas em uma solução de TBA
(0,67%) como reagente cromogênico (Ohkawa e cols., 1979). A quantificação
foi realizada a partir de uma curva padrão de MDA.
3.2.7.2 Determinação da atividade da CAT
Para a determinação da CAT dos esplenócitos, os baços foram
macerados em tampão Hanks e o homogenato passou por uma centrifugação e
duas incubações em tampão de lise no gelo por 10 minutos cada com posterior
centrifugação e por último, as células foram centrifugadas em tampão fosfato
de potássio (K2HPO4/KH2PO4) 100mM e pH 7,0. Após foi realizada a sonicação
das células com posterior centrifugação a 13000 rpm por 45 minutos a 4ºC. O
extrato celular resultante foi submetido ao meio de reação (Tris HCl 1M EDTA
5mM pH 8,0; H2O2 10mM) para as medidas da atividade da CAT.
A atividade da CAT foi determinada cinéticamente a 230nm a 30ºC por 3
minutos no espectrofotômetro Hitachi modelo U-2010, utilizando-se o H2O2
decompondo-o em oxigênio e água, o que por sua vez, está diretamente
relacionado com a alteração da absorbância do meio de reação (Beutler, 1975)
conforme esquema abaixo.
29
3.2.7.3 Determinação da atividade da SOD
A determinação da SOD dos esplenócitos, foi realizada em tampão
fosfato (K2HPO4/KH2PO4) 50mM EDTA 0,1mM pH 7,4. A atividade da SOD foi
determinada em espectrofotômetro a 560nm, 25ºC por 3 min. pelo método de
microplaca (Ewing and Janero, 1995), utilizando-se o Azul de Nitrotetrazólio
(NBT) como marcador da atividade da SOD. A reação baseia-se na oxidação
da Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo (NADH) pela Fenazina metil-sulfato
(PMS) reduzida, que no retorno da reação gera o O2•-. A partir disso o NBT é
reduzido pela acepção do elétron do O2•- com a formação de produto formazan
(azul) (figura 5). Na reação a SOD existente na amostra compete pelo O2•- e a
quantificação, por sua vez, é realizada a partir do grau de inibição da taxa de
redução do NBT (para cada 50% de NBT reduzido, utiliza-se 1 U de SOD)
(figura5). Para a determinação da atividade da MnSOD (SOD mitocondrial),
acrescenta-se 15mM de cianeto de potássio (KCN) ao meio de reação para
inibir a atividade da CuZnSOD.
30
Figura 5.
Representação esquemática da geração do ânion superóxido e ação de um
antioxidante (SOD total) presente no meio. (modificado de De Oliveira e cols., 2009).
3.2.7.4 Determinação de proteínas totais
A normalização da medida de lipoperoxidação foi realizada, pelo peso
seco presente em um dado volume da amostra (Por exemplo, se usou 200 µL
deve-se separar 200 µl dentro de um microtubo e deixa-la secando na estufa a
37ºC). Para a normalização do potencial lipoperoxidativo e da atividade das
enzimas antioxidantes esplênicas (CAT e SOD), o conteúdo de proteínas totais
foi medido a partir de uma alíquota adquirida dos respectivos homogenatos
pelo método de Kolodny e Munford a partir do kit Bio Rad (Kolodny e Munford,
1976).
31
3.3 Análise estatística
Para os experimentos realizados em microscopia confocal, um mínimo
de três diferentes preparações de células extraídas de três baços isolados dos
camundongos foi realizado para cada medida e expressa como a média ± EP.
Nos experimentos promovidos pela atividade enzimática e expressão de cDNA,
o n foi de aproximadamente 8 animais por grupo. As comparações foram
determinadas por teste t não pareado para análise de dois grupos
independentes, ANOVA de uma via para análise de três grupos independentes
seguido de teste a posteriori de Tukey, e ANOVA de duas vias para análise de
dois fatores diferentes (CT vs PS; presença e ausência de Ca2+), seguido de
análise de teste a posteriori de Tukey com nível de significância aceito p < 0,05.
A significância estatística de sobrevivência entre os grupos CT e experimental,
foi analisada com o teste Log-rank. Os cálculos foram realizados utilizando
PrismTM versão 4,03 para Windows (GraphPad, E.U.A.).
3.4 Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da
Universidade Federal de São Paulo, UNIFESP-EPM, sob o nº de protocolo
0183/08.
32
4 RESULTADOS
4.1 Medidas da fluorescência do Ca2+ intracelular realizadas no
espectrofluorímetro
Estudamos a influência de diferentes períodos de PS sobre a dinâmica
de manutenção e mobilização de Ca2+ no citosol de células esplênicas
isoladas. As células não apresentaram diferenças significantes entre os grupos
CT e privado de sono por 24h, na fluorescência do Ca2+ (Fluo3 AM 5µM)
proveniente dos estoques como o RE, quando estimuladas com Thg (10µM) e
dos lisossomos, pela adição da Nig (10µM) (figuras 6 A e B), o que foi
confirmado tanto na presença ou ausência de Ca2+ extracelular (figuras 7 A e
B). Ambas as análises foram verificadas em espectrofluorimetria.
Ao avaliarmos as flutuações da fluorescência do Ca2+ das organelas
estoques, tanto o RE (estimulado com Thg 10µM) quanto os lisossomos (com
adição da Nig 10µM) na situação de privação por 48h tiveram redução
significante da fluorescência (p < 0,05) comparada ao grupo CT (figura 6 C).
Este resultado também se repetiu, quando as flutuações da fluorescência do
Ca2+ proveniente de seus estoques (RE e lisossomos) foram avaliadas em
células de camundongos privados por 48h, foram incubadas em tampão com
Ca2+ e tampão sem Ca2+ (figura 7 C).
A fluorescência do Ca2+ proveniente do RE (p < 0,01) e dos lisossomos
(p < 0,05) também permaneceu menor (figura 6 D) após 72h de PS. Assim
como a redução da razão da fluorescência do Ca2+ proveniente dos estoques
33
intracelulares (RE e lisossomos) das células de camundongos privados por 72h
mantidas em tampão com e sem Ca2+ (p < 0,05) (figura 7 C).
Figura 6. Efeito da PS sobre a mobilização do Ca2+ intracelular em esplenócitos de
camundongos, realizados em espectrofluorìmetro. Medidas de fluorescência de Ca2+
intracelular de esplenócitos isolados de camundongos após a PS e marcados (107 células /
mL), com o indicador de Ca2+ Fluo 3 (5 µM por 40 min a 37ºC). A liberação de Ca2+ intracelular
foi promovida com 10 µM do Thg e do Nig (10µM). (A) células CT; (B) 24h de PS; (C) 48h de
PS; (D) 72h de PS.
Uma redução significativa na liberação de Ca2+ a partir do RE foi
observada após a adição da Thg e Nig nas células de animais privados de
sono por 48 e 72 h, em comparação com as células de animais do grupo CT
(Figuras 6 C e D). A PS em camundongos por 24h não resultou em qualquer
alteração significativa de liberação de Ca2+ a partir do RE após a adição de Thg
(10 µM), seguido pelo Nig (10 µM) (Figura 7 A). Observamos uma diminuição
34
significativa na mobilização de Ca2+ induzida pela adição de ambas às drogas
(Thg e Nig). Após 48 e 72h de PS, quando o Ca2+ foi retirado do tampão de
ensaio, a variação da fluorescência também foi significativa para a adição da
Thg e Nig (Figuras 7 B e C).
35
Figura 7. Histograma de mudanças da fluorescência de Ca2+ intracelular em cada período da
PS. As medidas no espectrofluorímetro foram realizadas após a adição de Thg (10µM), seguido
por Nig (10µM), em duas condições de tampão (com ou sem CaCl2 (1 µM)). (A) 24h de PS,
sem diferença significativa; (B) 48h (∗ANOVA em duas vias, p < 0,05 vs CT com teste a
posteriori de Tukey) e (C) 72h (∗ANOVA em duas vias, p < 0,01 vs CT com teste a posteriori de
Tukey). Os dados são: Média ± EP dos valores a partir de 3 experimentos.
36
4.2 Medidas da fluorescência da mobilização do Ca2+ em microscopia
confocal
Realizamos medidas de Ca2+ intracelular utilizando microscopia
confocal, acompanhando a cinética dos íons em células isoladas após
estimulação com baixas doses de Thg. Neste ensaio procuramos modificações
na homeostase do Ca2+ induzida pela PS usando células do baço aderidas em
uma placa de microscopia, comparando a manutenção e liberação de Ca2+
intracelular das organelas (Figura 8).
Figura 8. Resolução de Imagem de fluorescência de indicador de Ca2+ Fluo 3 AM, nos
esplenócitos de camundongos utilizando microscopia confocal. Os círculos vermelhos
representam a adição do inibidor Thg (10µM), em ambas as condições (CT e 72h de PS).
Escala de barra de 20um.
37
4.2.1 Medidas da fluorescência da mobilização do Ca2+ nos lisossomos em
microscopia confocal
A participação de organelas ácidas (por exemplo, lisossomos) na
mobilização de Ca2+ foi avaliada utilizando inibidores vesiculares específicos.
Medimos a razão da fluorescência do Ca2+ liberado dos lisossomos
adicionando a Nig (10µM) seguida da Thg (10µM). Observamos uma redução
significante na fluorescência do Ca2+ liberado para o meio (p < 0,05) após PS
por 72h. Para maior especificidade da liberação de Ca2+ e H+ dos lisossomos
adicionamos a Baf (1µM). Não verificamos diferença na emissão da
fluorescência do Ca2+ comparando o grupo privado 72h ao grupo CT (figura
9B). Para avaliarmos melhor esta organela, marcamos as células com AO
(5µM). As imagens foram analisadas em microscopia confocal. Como mostra a
figura 9B, houve uma ruptura no gradiente eletroquímico de H+ nas células dos
camundongos privados de sono por 72h.
38
Figura 9. Medida da fluorescência da mobilização do Ca2+ em microscopia confocal. Células
esplênicas de camundongos foram adicionadas em placas de microscopia com tampão CaCl2
(1mM), comparando a mobilização do Ca2+ entre CT e privado de sono por 72h. (A e B) Célula
típica mostrando o efeito de medição vesicular do inibidor Baf (1µM). (C) Aumentos na
fluorescência não revelam diferenças significativas entre os CTs e 72h de PS (média ± EP, n =
50 células). (D e E) Efeito do ionóforo Nig (10µM), seguido pelo inibidor Thg (10µM). (F)
histograma representando o aumento razão da Fluorescência (F / F0) efeito da Nig (média ±
EP, n = 50 células; ∗ teste t não pareado p < 0,05 vs CT).
4.2.2 Medidas da fluorescência das flutuações do Ca2+ mitocondrial
Medimos a razão da fluorescência da captação de Ca2+ pela mitocôndria
proveniente do RE e lisossomos usando o fluoróforo TMRE (0,5µM). Notamos
que houve uma redução significante da fluorescência da captação de Ca2+ pela
mitocôndria somente do Ca2+ liberado do RE (p < 0,05) em células de
39
camundongos privados por 72h. Não foi significante a captação do Ca2+
proveniente dos lisossomos (figura 10).
A flutuação do Ca2+ mitocondrial foi confirmada pela inibição completa
dos sinais fluorescentes com a adição de FCCP (p-trifluorometoxi-carbonilcianeto de fenil-hidrazona), um desacoplador da fosforilação oxidativa.
Figura. 10. Flutuações do Ca2+ mitocondrial em esplenócitos de camundongos privados de
sono por 72 h, incubados com TMRE. A recaptação de Ca2+ mitocondrial foi medida após
adição de drogas específicas para a mobilização do íon intracelular: Thg (1 µM), Nig (1 µM)
(F/F0; ∗ teste t, p < 0.05 vs CT).
4.2.3 Medidas da fluorescência do Ca2+ mitocondrial basal
Uma vez que observamos a redução do Ca2+ de seus estoques
intracelulares e sua baixa captação pela mitocôndria, realizamos então as
medidas da fluorescência do Ca2+ mitocondrial basal e observamos um
40
aumento de aproximadamente 30% na situação experimental de privação por
72h (Figura 11).
Figura 11. Fluorescência basal do Ca2+ mitocôndrial em esplenócitos de camundongos
privados de sono por 72 h . As células foram incubadas com X-Rhod1 AM e as medidas foram
sem adição de drogas (n = 6 por grupo; test t , p < 0.05 vs. CT).
4.2.4 Visualização da morfologia e fisiologia dos lisossomos realizados
em microscopia confocal
Para avaliarmos os lisossomos, marcamos as células com AO (5uM). As
imagens foram analisadas em microscopia confocal. Como mostra a figura 12,
houve alteração na manutenção do gradiente eletroquímico de H+ nas células
dos camundongos privados de sono por 72h.
41
Figura 12. Morfologia e fisiologia dos lisossomos. Os lisossomos foram incubados com
fluoróforo AO (3µM). Comprimentos de ondas analisados em verde e vermelho e controle
negativo para visualização das células (n = 50 cel/gpo, PS vs CT). Barra de escala 20um.
4.2.5 Integridade dos canais de Ca2+ de membrana (SOCE) e influxo do íon
Ca2+
Para avaliar a atividade dos canais de membrana (SOCE) envolvidos na
manutenção do Ca2+ intracelular, realizamos a PS dos animais em diferentes
períodos (12, 24, 36, 48, 60 e 72h). Após os períodos de PS, as células do
baço foram isoladas e marcadas com fluoróforo Fluo4 AM em tampão sem
Ca2+ e levadas para medidas da fluorescência em resposta a elevação de Ca2+
em um leitor de placas no espectrofluorímetro. Após 20s de leitura foi
adicionado Thg (5µM) e com 200s foi adicionado o CaCl2 (1,3mM). Nós
verificamos um aumento significante na fluorescência do Ca2+ transportado
pelos canais SOCE na situação de 12h de PS (p < 0.05) após a adição do
42
CaCl2 e uma significante redução desse influxo de Ca2+ nas células dos
animais privados de sono por 60 e 72h (p < 0.01) comparadas ao CT (figura
13). Não houve diferença na mobilização do Ca2+ durante os períodos de 24, 36
e 48h de PS.
2+
Figura 13 Atividade dos canais de Ca
fluorescência do Ca
2+
de membrana (SOCE). Gráfico mostrando a razão de
intracelular proveniente do meio extracelular em esplenócitos de
camundongos privados de sono durante 12, 24, 36, 48, 60 e 72h vs CT. As células foram
2+
incubadas com fluoróforo Fluo4 AM em tampão HBSS sem Ca . Foi adicionado Thg (1µM)
2+
após 20s de leitura para depletar os estoques de Ca
do RE e após 200s de leitura o CaCl2
(1,3mM) foi adicionado em leitor de placas de espectrofluorímetro Flex Station. Os resultados
foram expressos como média ± E.P da diferença entre a fluorescência basal e após a adição
6
do CaCl2 (n = 3 baços/grupo, 10 células; ANOVA de uma via com teste a posteriori de Tukey
*p < 0.05 vs. CT).
43
4.2.6 Integridade da morfologia e fisiologia da mitocôndria e do potencial
de membrana mitocondrial (PMM) analisados em microscopia confocal
Durante as primeiras 12h de PS, a observação da fluorescência da
mobilização do Ca2+ mitocondrial (células incubadas com fluoróforo X-Rhod1
AM (1µM), assim como do PMM (TMRE 0,5µM)), apresentaram valores
similares (figura 14 e 15). Durante 24 horas de PS, ocorreu um aumento
significante na fluorescência do Ca2+ mitocondrial analisada em microscopia
confocal. Este aumento permaneceu elevado até 72h de PS (figura 14). O
PMM permaneceu estável até 36h de PS. Após 48h de PS, observa-se o
rompimento do PMM, o qual permaneceu até 72h de PS (figura 15).
44
A
B
2+
Figura 14. Morfologia e fisiologia das mitocôndrias. (A) Fluorescência do Ca
mitocondrial em
esplenócitos de camundongos privados de sono por períodos de 12, 24, 36, 48, 60 e 72 h vs
CT incubados com fluoróforo X-Rhod1 AM (1µM) e analisadas em microscopia confocal. (B)
Controle negativo das células. Barra de escala 20um.
45
A
B
Figura 15. Morfologia e fisiologia do PMM. (A) Fluorescência do PMM em esplenócitos de
camundongos privados de sono por períodos de 12, 24, 36, 48, 60 e 72 hs vs CT incubados
com fluoróforo TMRE (0,5µM) analisados em microscopia confocal. (B) Controle negativo das
células. Barra de escala 20um.
46
4.3 Curvas de sobrevivência de camundongos infectados com patógenos
(Plasmodium chabaudi) sob PS em diferentes condições de rebote
O SI de camundongos foi testado pela infecção com patógenos após PS
em diferentes condições de rebote. O nosso ensaio de sobrevivência foi
realizado com camundongos (n = 20) submetidos a 72h de PS e permitidos
dormir durante 24 e 48h após a PS (Figura 16). Após a recuperação dos
períodos, cada grupo (rebotes e CTs, n = 10 cada) foi inoculado
intraperitonealmente (ip), com eritrócitos infectados 1x106 com Plasmodium
chabaudi. A sobrevivência dos camundongos foi acompanhada durante 20
dias, e o grupo com 24 horas de rebote de sono mostrou uma redução
significativa na sobrevivência (p < 0,05) (Figura 16 A), Por outro lado, o rebote
de 48h de sono foi suficiente para recuperar o nível de sobrevivência
comparado ao grupo CT (Figura 16 B), tal como analisados pela curva de
sobrevivência cumulativa de Kaplan-Meier e o teste log-rank.
47
Figura 16 Curvas de sobrevivência de camundongos com infecção da malária de murinos
(Plasmodium chabaudi) após a PS e períodos de rebote. Camundongos suíços foram
submetidos à PS por 72h seguido por 24 e 48h de rebote de sono antes da infecção com P.
chabaudi. Cada grupo (rebote e CT) constou de 10 camundongos suíços infectados intra
peritôneal com 106 iRBC após rebote de sono. (A) curva de sobrevivência de camundongos
infectados após 24h de rebote de sono (p < 0,05). (B) curva de sobrevivência de camundongos
infectados após 48h de rebote do sono (p > 0,05, ns). A significância estatística das diferenças
entre os grupos CT e experimental foi determinada com o teste Log-rank para experimentos da
sobrevivência cumulativa.
4.4 Expressão de proteínas envolvidas na sinalização do Ca2+ intracelular
Verificamos também a expressão da STIM1 e do canal de Ca2+ ORAI1
que é ativado pela STIM1. As análises realizadas em RT-PCR mostraram um
aumento significante da expressão da STIM1 (p < 0,05 vs CT), mas não houve
diferença na expressão do canal de Ca2+ ORAI1 (figura 17).
48
Expressão STIM1 e ORAI1/GADPH (u.a.)
STIM1/ORAI1
3
controle
privado de sono 72h
*
2
1
0
STIM1
ORAI1
Figura 17 Expressão de genes envolvidos no metabolismo do Ca2+ em células do baço de
camundongos. Expressão do gene STIM1 (n = 7/grupo, teste t de Student, p < 0:05 PS vs CT.
). Expressão do gene ORAI1 (n = 8 e 7 respectivamente. Teste t de Student, p > 0.05). O
GADPH foi usado como gene de referência. Os valores estão representados como Média ±
EP.
4.5 População das células do baço
Avaliamos também a contagem de células totais do baço e observamos
que a PS por 72 horas resultou na redução significativa da população dessas
células (figura 18) (p < 0,03 vs CT) de aproximadamente 42%.
49
Figura 18 População de células totais do baço. As células do baço foram isoladas em tampão
HBSS e uma alícota (20 µL) foi adicionada na câmara de Neubauer e a contagem das células
foi realizada em microscopia óptica (n = 4 baços/grupo, p < 0,03 vs CT). Os resultados foram
expressos em média ± DP).
Considerando que o baço é um órgão importante para o SI, nós
marcamos estas células com anticorpos fluorescentes específicos para medir
em citometria de fluxo o percentual das principais células esplênicas (linfócitos
Th; Tc e B; natural killer (NK) e macrófagos). Nós observamos uma redução
significativa de linfócitos B (p < 0,05) após a PS por 72h em relação ao CT
(figura 19).
50
Figura 19. População das principais células do sistema imunológico localizadas no baço de
camundongos. As células do baço foram marcadas com anticorpos fluorescentes específicos e
analizadas em citometria de fluxo. (CT n = 4, PS n = 7, Test – t de Student; para população de
linfocitos B p < 0.01 vs CT, ns para os outros grupos). Os valores estão representados como
Média ± DP.
Uma vez que os linfócitos B foram reduzidos, nós realizamos a
marcação de morte celular por apoptose e por necrose após a PS por 72h e
não observamos diferenças entre os grupos (figura 20).
51
A
C
B
D
Figura 20. Análise de citometria de fluxo e dupla marcação com Anexina V-FITC/PI. Os
esplenócitos foram marcados com anticorpos anti-B220-PE (linfócitos B), anexina V-FITC e
7AAD (apoptose/necrose) na concentração celular de 1 x 106 (A) Marcação da população de
linfócitos B grupo CT. (B) Percentual de necrose/apoptose e células viáveis do baço no grupo
CT. (C) Marcação da população de linfócitos B do grupo PS 72h. (D) Percentual de
necrose/apoptose e células viáveis do baço no grupo PS 72h. Os resultados foram
apresentados como média ± DP das triplicatas.
4.6 Determinação da lipoperoxidação tecidual e potencial lipoperoxidativo
Para a verificação de possíveis alterações relacionadas ao EO tecidual
em baço, determinamos as medidas de peroxidação lipídica entre os grupos
(CT vs PS por 72 horas) usando o TBA como reagente e o MDA como produto
52
da reação. Como mostra a figura 21, não houve diferença estatisticamente
significante entre os grupos. Uma vez que não houve aumento de peroxidação
lipídica em esplenócitos em decorrência da PS buscamos investigar se o tecido
esplênico estava mais predisposto a sofrer oxidação. Para isso determinarmos
o potencial lipoperoxidativo nos diferentes grupos e também não encontramos
diferenças significantes (figura 22).
Figura 21 Lipoperoxidação em baços de camundongos. CT vs privados de sono/72h (n =
16/grupo; teste-t, p = 0,72) não houve diferença estatística entre os grupos.
53
Figura 22. Potencial lipoperoxidativo em baços de camundongos. CT vs privado de sono/72h
(n = 7 e 8 respectivamente; test-t, p = 0,44) não houve diferença estatística.
4.6.1 Determinação da atividade da enzima antioxidante CAT
Com o intuito de verificar se a PS é capaz de induzir estresse oxidativo
em baço de camundongos avaliamos a atividade de algumas enzimas
antioxidantes. No caso da CAT, nós verificamos uma redução na atividade
após a PS por 72h (figura 23; *p < 0.05) comparado ao grupo CT.
54
Figura 23. Média dos valores de atividade da enzima antioxidante CAT em esplenócitos do
baço de camundongos. CT vs privado de sono por 72h (n = 8/grupo; teste-t, *p < 0,05).
4.6.2 Determinação da atividade da superóxido dismutase (SOD)
Realizamos a determinação da atividade da SOD total (mitocondrial e
citossólica) nos homogenatos do baço e verificamos que houve diferença
estatisticamente significante na atividade da SOD total, com aumento da
atividade enzimática total no grupo PS em relação ao CT (figura 24, teste-t, p <
0,05).
55
Figura 24. Determinação da atividade da SOD total (mitocôndria e citosol) em esplenócitos de
camundongos. CT vs PS (n = 7/grupo; teste-t, p < 0,01).
Para determinar a atividade da MnSOD, inibimos a ação da CuZnSOD
com KCN, uma vez que a mitocôndria é a principal geradora de O2•-. Como
mostra a figura 25, encontramos diferenças estatisticamente significante entre
os grupos PS vs CT usando o teste-t (p < 0,03).
56
Figura 25. Determinação da atividade da MnSOD em esplenócitos de camundongos. CT vs PS
(n = 6/grupo; teste-t, p < 0,05).
A partir destes resultados, nós então subtraímos a atividade da MnSOD
da atividade da SOD total e obtivemos dessa forma a atividade da CuZnSOD.
Verificamos então que houve um aumento significante na atividade da enzima
no grupo privado comparado ao CT (p < 0,01) (figura 26).
Figura 26. Determinação da atividade da CuZnSOD em esplenócitos de camundongos. CT vs
PS (n = 7/grupo; teste-t, p < 0,01).
57
4.7 Determinação da expressão gênica das enzimas antioxidantes
Também realizamos a expressão das enzimas antioxidantes CAT,
MnSOD e CuZnSOD para esclarecer melhor os parâmetros de geração de EO
nas células experimentais. Como mostra a figura 27, não observamos diferença
na expressão da CAT entre os grupos avaliados. Verificamos que houve
aumento significante na expressão da enzima MnSOD durante a PS (p < 0,05)
(figura 28). Não houve diferença significante na expressão da CuZnSOD (figura
29).
Figura 27. Expressão do gene da enzima antioxidante CAT em células do baço de
camundongos. Expressão do gene CAT (n = 8/grupo, teste t, p > 0,05 PS vs CT). O GADPH foi
usado como gene de referência. Os valores estão representados como Média ± EP.
58
Figura 28. Expressão do gene da enzima antioxidante MnSOD em células do baço de
camundongos. Expressão do gene MnSOD (n = 8/grupo, teste t, p < 0,05 PS vs CT). O
GADPH foi usado como gene de referência. Os valores estão representados como Média ±
EP.
Figura 29. Expressão do gene da enzima antioxidante CuZnSOD em células do baço de
camundongos. Expressão do gene CuZnSOD (n = 8/grupo, teste t, p > 0,05 PS vs CT). O
GADPH foi usado como gene de referência. Os valores estão representados como Média ±
EP.
59
5 DISCUSSÃO
O sono é um importante evento fisiológico que influencia diretamente a
saúde e é relacionado com o SI no qual o Ca2+ age como um importante
mensageiro. Neste trabalho, nós realizamos as medidas de mobilização do
Ca2+ citosólico em células vivas com o objetivo de compreender as mudanças
na sinalização do Ca2+ em células imunológicas do baço após diferentes
períodos de PS.
O ciclo sono-vigília está diretamente influenciado pelos níveis de várias
moléculas sinalizadoras, tais como citocinas produzidas pelas células do SI,
contribuindo para uma comunicação bidirecional com o SNC (Majde e Krueger,
2005). A hipótese de que o sono contribui para a manutenção do SI têm sido
discutidas por vários autores (Moldofsky, 1994; Dinges e cols., 1995; Bollinger
e cols., 2009). Assim, as citocinas parecem flutuar em suas concentrações
durante o ciclo sono-vigília (Irwin, 2002). O efeito do prejuízo de sono sobre o
SI é frequentemente estudado em animais (ex: ratos e camundongos) usando o
paradigma da PS (48 e 72h) e os resultados geralmente mostram uma redução
na contagem de linfócitos (CD3+, CD4+ e CD8+) (Zager e cols., 2007; Satoh e
Satoh, 2007; Bollinger e cols., 2009). Também uma infecção bacteriana no
intestino de ratos pode ser observada após 5-20 dias de PS pela técnica de
disco sobre água (Everson e Toth, 2000).
Neste trabalho, nós observamos uma interessante influência da PS na
homeostase do Ca2+ em esplenócitos de camundongos. A PS por períodos
maiores do que 48h promoveu uma significante redução da mobilização do
60
Ca2+ intracelular em esplenócitos após a adição do inibidor da SERCA, Thg
(figura 6).
A diminuição da manutenção do Ca2+ no RE leva a um estresse celular
devido ao envolvimento dinâmico do RE na síntese e processamento de
proteínas, o qual pode resultar no acúmulo de proteínas malformadas
(Mackiewicz e cols., 2007). Interessantemente, o rompimento na homeostasia
do Ca2+ levando a um estresse no RE após a PS, poderá comprometer a
maturação e ativação de células imunológicas, o que requer a síntese de
citocinas e imunoglobulinas seguidas da translocação para a MP (Naidoo,
2009), e, por sua vez, é uma explicação razoável para a redução da resposta
imunológica que ocorre após a PS em humanos e animais (Majde e Krueger,
2005; Everson, 1993; Irwin, 2002).
Como mencionado previamente, a liberação de Ca2+ dos estoques
intracelulares induz seu influxo da MP devido à abertura dos canais CRAC. Isto
pode ser observado comparando os resultados das células incubadas em
tampão com e sem Ca2+ extracelular (figuras 6 e 7), mostrando que a presença
de Ca2+ no meio é essencial para manter os altos níveis de Ca2+ necessários
para a sinalização intracelular.
O acúmulo de Ca2+ nas organelas ocorrem principalmente pela atividade
de ATPases (Ca2+ e H+) e, para organelas ácidas (lisossomos/endossomos,
Golgi) pelo influxo de Ca2+ via trocador de Ca2+/H+ que é um importante
contribuinte para a fusão de membranas entre endossomos e lisossomos ou
para a sinalização intracelular (Christensen, 2002). Ensaios realizando o
rompimento do gradiente de H+ nos lisossomos de células imunológicas
61
(macrófagos) em que foi usado o ionóforo Nig mostraram uma direta correlação
do pH luminal da organela e a manutenção de Ca2+ (Christensen, 2002).
Considerando que organelas usadas na manutenção do Ca2+ além do
RE, poderão ser afetadas pela PS, em nosso trabalho, ensaios realizados com
Nig, corroboraram com os achados de Penning e cols, que observaram em
organelas acídicas, rompimento do gradiente de pH pelo uso da Nig, levando à
extrusão do Ca2+ destas organelas e mudanças no potencial de K+ na MP
(Penning e cols., 2000).
Quando a Nig foi adicionada nos esplenócitos de camundongos sujeitos
a 72h de PS, o aumento da fluorescência do Ca2+ foi menor do que dos
animais CT (figura 9). Como pode ser visto, os animais privados de sono não
apresentaram o padrão normal de resposta para a concentração do gradiente,
indicando um possível rompimento nas flutuações do Ca2+ e H+ talvez por um
estresse celular nas organelas ácidas (figura 12). López e cols (2005) sugerem
que, após a depleção de estoques ácidos pelo rompimento do gradiente de H+,
estes estoques são repostos por um mecanismo parcialmente dependente da
atividade da SERCA. A existência de organelas que contem diferentes
concentrações de Ca2+ pode ser diferentemente regulada, dependendo do
estímulo celular. Por outro lado, o Ca2+ ou H+ATPases vacuolar, são essenciais
para uma grande variabilidade de sinais de Ca2+ espaço-temporal que
precisamente regulam uma variedade de funções celulares (López e cols.,
2005).
É conhecido que o pH ácido dos lisossomos é mantido principalmente
por uma H+ATPase vacuolar que bombeia H+ do citosol para o lumen da
organela (Luzio e cols., 2007). Desse modo, a distribuição alterada de H+ entre
62
os lisossomos e o citosol encontrada nos camundongos provavelmente tem
uma relação direta na resposta celular. O estresse no RE observado por
Mackiewicz e cols (2007), resultando na perturbação da homeostase do Ca2+,
estado redox, elevada síntese de proteínas secretórias, proteínas malformadas,
privação de glicose e glicosilação alterada (Mackiewicz e cols., 2007) podem
ser relacionados com as alterações observadas em nosso estudo.
A modulação da homeostase do sono e sua correlação com as funções
do SI são um corrente foco de pesquisas (Zager e cols., 2007; Dimitrov e cols.,
2007). Por sua vez, os modelos de PS são importantes para compreensão da
interrelação entre estes sistemas. Por exemplo, o aumento de corticosterona
plasmática associado com uma redução no peso do baço e na contagem de
leucócitos totais e linfócitos em ratos privados de sono foram recentemente
relatados (Zager e cols., 2007). Nossos dados esclarecem as mudanças
celulares envolvidas, demonstrando uma redução da sinalização do Ca2+ nos
esplenócitos que está relacionada a eventos como, desenvolvimento celular,
proliferação e mortalidade celular que são essenciais para o funcionamento do
SI.
Nossos resultados mostram uma redução na mobilização de Ca2+ do RE
e lisossomos dos camundongos privados de sono, demonstrado pela menor
liberação do íon sob exposição a drogas específicas como a Thg e a Nig (figura
6). Estes dados sugerem uma perda na regulação do conteúdo iônico nas
células estudadas, junto com a alteração de H+ dos compartimentos acídicos
(figura 12). A liberação diferencial do RE pode representar uma ação
compensatória da célula promovendo um maior acúmulo do íon, como
63
resultado do comprometimento dos lisossomos e consequente alteração iônica
citossólica.
Uma das organelas chave envolvida na homeostasia do Ca2+ é a
mitocôndria. Esta organela é crucial para a captação do Ca2+ liberado dos
estoques intracelulares quando a célula recebe um estímulo (Balaban, 2002;
Hansson e cols., 2008; Feissner e cols., 2009). Nós verificamos o envolvimento
da mitocôndria no rompimento da homeostase do Ca2+ em situações de PS,
observando uma redução significante na captação deste íon do RE (figura 10),
nas células dos animais privados de sono quando a Ca2+ATPase do RE foi
inibida com a adição de Thg. Nós também avaliamos a fluorescência do Ca2+
intracelular antes da adição da droga e vimos que na situação experimental
houve um aumento na concentração de Ca2+ mitocondrial (figura 11).
Nikonova e cols (2010) relataram que após 3 e 12h de PS em
camundongos, a atividade de proteínas e enzimas do complexo IV da
mitocôndria foi significantemente aumentada e a subunidade catalítica do
complexo V foi significantemente aumentada somente após 12h de PS.
Entretanto, níveis aumentados da proteína UCP2 após 12h de PS sugerem
que, possivelmente, houve alterações na razão ATP/AMP quando a vigília foi
extendida (Nikonova e cols., 2010). Após analisarmos a sequência temporal
das concentrações de Ca2+ mitocondrial, nós observamos que, depois de 24h
de PS houve um aumento exacerbado de Ca2+ nesta organela (figura 14) com
consequente rompimento do PMM após 48h de PS (figura 15). Yang e cols
(2008) verificaram que a PS paradoxal induziu a translocação da Bax para a
mitocôndria, enquanto o citocromo c foi liberado desta para o citoplasma e a
excitabilidade de neurônios piramidais da região CA1 cerebral de ratos foi
64
reduzida (Yang e cols., 2008). Estas mudanças induzidas pela PS são
fortemente relacionadas à homeostase do Ca2+ e é possível também que
mudanças observadas neste estudo contribuam para a disfunção mitocondrial.
A morfologia dos lisossomos (figura 12) mostra a disfunção desta
organela induzida pela PS. Houve um rompimento do gradiente de pH
lisossomal e disfunção ou perda da integridade mitocondrial (figura 14), que
pode ser devida ao rompimento do pH intracelular e homeostase do Ca2+ que,
por sua vez, comprometeram o PMM (figura 15). Se houve um aumento de
Ca2+ citossólico e uma redução de Ca2+ no RE, uma alteração nos mecanismos
envolvidos na sinalização do Ca2+ poderá ser esperada. A depleção dos
estoques de Ca2+ intracelular evoca a entrada de Ca2+ através da MP pela
indução de canais CRAC em vários tipos celulares (Hawkins e cols., 2010).
Recentemente, as proteínas ORAI1 e STIM1 foram identificadas como
uma subunidade de canais CRAC e uma proteína sensora de Ca2+ no RE,
respectivamente (Cai, 2007). A expressão de RNAm de ORAI1 e STIM1 foram
analisadas, e como mostra a figura 17, um aumento significante na expressão
da proteína STIM1 foi observado nos camundongos privados de sono por 72h,
porém não houve diferença na expressão do canal ORAI1.
Hawkins e cols (2010) demonstraram um relacionamento entre EO e a
proteína STIM1 que são mediados pela entrada de Ca2+. A contínua ativação
do canal CRAC facilita um aumento nos níveis de Ca2+ tanto na célula em
repouso, quanto após a ativação celular. Este aumento sustentado de Ca2+
aumenta a sobrecarga de Ca2+ na mitocôndria e influencia a função desta
organela, a qual por longo tempo pode disparar a morte celular (Hawkins e
cols., 2010).
65
Entre todas as diferentes funções do Ca2+ na fisiologia celular (Berridge
e cols., 2003; Luzio e cols., 2007), o papel deste íon nas vias endocíticas pode
ser de grande importância para a habilidade imunológica e/ou fagocitose.
Dessa forma, a supressão da homeostase do Ca2+ observada nos esplenócitos
de camundongos privados de sono poderá refletir a redução na resposta
imunológica, porém podem ocorrer resultados mais drásticos nestas células
como a desregulação do processo autofágico, o que por sua vez, leva à morte
celular (Naidoo, 2009). Entretanto, nossos resultados sugerem que alterações
secundárias, como mudanças na homeostase do Ca2+ e H+, podem ser fatores
importantes que contribuem para danos e morte celular entre os efeitos
deletérios da PS.
O trabalho mostra que pode haver uma correlação entre a PS e a perda
da viabilidade celular através de mecanismos envolvidos na homeostase iônica
(Ca2+ e H+), que pode ser evidenciada por uma baixa eficiência das células do
SI, uma vez que a expressão de citocinas, fatores inflamatórios e sinalização
celular são dependentes da homeostase do sono (Feske, 2007; Satoh e Satoh,
2007; Christensen e cols., 2002; Feske e cols., 2001; Bootman e cols., 2002).
Os dados apresentados na figura 13 mostram que durante as 12
primeiras horas de PS, houve um aumento significante na captação de Ca2+
pelos canais SOCE de membrana de animais privados de sono comparados
aos animais do grupo CT. Em períodos que vão de 24 a 48h, houve uma
similaridade com o grupo CT e o PS, porém, a partir de 60h de PS, ocorreu
uma redução significante (p < 0,01) na captação do Ca2+. Estes achados
sugerem que já nas primeiras horas de PS ocorreu a depleção dos estoques de
Ca2+ promovendo uma rápida mobilização dos mecanismos de influxo de Ca2+.
66
Estes dados corroboram com os nossos resultados de 24h de PS (figuras 6 e
7) mostrando que não houve diferença no aumento da liberação de Ca2+ das
organelas (RE e Lisossomos).
Há vários trabalhos mostrando a baixa eficiência do SI durante a PS
(Benca e Quintans, 1997; Majde e Krueger, 2005; Everson e Toth, 2000;
Everson, 1993; Zager e cols., 2007; Dinges e cols., 1995; Bollinger e cols.,
2009; Todd e cols., 2008). A razão para esta baixa eficiência é ainda
desconhecida, mas nossos dados sugerem fortemente que o comprometimento
da homeostase de Ca2+ no interior das organelas celulares dispara
mecanismos que, por sua vez, podem resultar na disfunção imunológica.
Uma importante correlação entre a deficiência no SI e prejuízo na
sinalização celular foi observada quando diferentes grupos de camundongos
privados de sono, que foram infectados com parasitas de malária no período
após a PS (rebotes de sono). Nós verificamos uma clara deficiência na
resposta à infecção por malária após 24h de rebote de sono (figura 16 A).
Entretanto, após 48h de rebote de sono, nós observamos uma recuperação da
resposta do SI (figura 16 B). Estes dados são muito interessantes, uma vez que
eles mostraram o tempo necessário para a restauração da função normal do SI
após a PS em camundongos sob condições experimentais.
Uma importante evidência já confirmada por diversos trabalhos na
literatura é a interrelação entre o segundo mensageiro Ca2+ e a geração de
espécies reativas de oxigênio, podendo acarretar em EO (Das e cols., 2008;
Feissner e cols., 2009; Peng e Jou, 2010). A sinalização pelas vias do Ca2+ e
também pelas vias das ERO são importantes para o metabolismo celular
quando ocorrem de forma natural e controlada pela célula (Feissner e cols.,
67
2009). Há uma interação recíproca entre o Ca2+ e as ERO, uma vez que, um
pode ativar a via de sinalização do outro (Peng e Jou, 2010). Porém, um
excesso de Ca2+ intracelular pode disparar a geração de radicais livres levando
a célula ao desequilíbrio, o que resultará na ativação de vias apoptóticas ou
mesmo necrose celular (Mammucari e Rizzuto, 2010).
Uma vez que nós detectamos elevados níveis de Ca2+ mitocondrial com
conseqüente rompimento do PMM nos esplenócitos de camundongos privados
de sono, nós também buscamos verificar como poderiam estar os parâmetros
de EO nestas células.
Em um primeiro momento, nós determinamos as medidas de
peroxidação lipídica em tecido do baço e não observamos diferença estatística
entre os grupos (figura 21), assim como após a estimulação tecidual à geração
de potencial lipoperoxidativo (figura 22).
A CAT é uma das enzimas antioxidantes responsáveis pela conversão
do H2O2 em água e oxigênio, peróxido este gerado pela dismutação do O2•−. O
H2O2 gerado naturalmente pela célula é um importante bactericida e age
também na eliminação de resíduos intracelulares (Miller e Britigan, 1997). Nós
determinamos a atividade da CAT após a PS por 72h e observamos uma
redução significante da atividade desta enzima no modelo experimental de PS
(figura 23). Estes dados corroboram com os achados de Everson e cols (2005)
que mostraram redução da atividade da CAT de 23 e 36% em fígados de ratos
privados de sono por 5 e 10 dias respectivamente, usando do método de disco
sobre água (Everson e cols., 2005).
Estes resultados sugerem que a PS causa um desequilíbrio nos
mecanismos antioxidantes com possível aumento nos níveis de H2O2 livres que
68
poderão romper membranas de organelas e danificar a estrutura de proteínas e
outros metabólitos. Ao fazermos a expressão de RNAm da CAT, não
observamos diferenças estatísticas entre os grupos (figura 27). Isso sugere que
o excesso de Ca2+ mitocondrial vazado para o citosol, possivelmente levou a
célula a citotoxidade e interferiu na atividade da enzima CAT. A CAT é uma
enzima que age principalmente no citosol, embora uma pequena quantia possa
ser ativa no espaço intermembranas mitocondrial (Feissner e cols., 2009). A
mitocôndria é considerada a organela chave na geração de O2•–, que é
aumentado pela ativação da cadeia fosforilativa na produção intensa de ATP e
pela consequente captação de Ca2+ (Cardoso e cols., 2010).
O excesso de Ca2+ é um dos fatores mais importantes para intensificar a
atividade dos complexos I, II, III, IV e V da cadeia fosforilativa (Hajnoczky e
cols., 1995). Dessa forma ocorre a intensa produção de O2•– que, quando livre e
em excesso leva a cadeia fosforilativa a colapso e, conseqüente, perda do
PMM (Kleszczynski e Sktadanowski, 2011), o que corrobora com nossos
achados (figuras 14 e 15).
As medidas da atividade da SOD total realizadas em nosso trabalho
mostraram um aumento significante após a PS. Por esse motivo, nós
verificamos a atividade da MnSOD e CuZnSOD (figuras 25 e 26). O aumento
significante da MnSOD observado na PS, confirmado também pela maior
expressão de RNAm desta enzima (figura 28), sugere que a mitocôndria está
tentando controlar o aumento na geração de O2•– livres nesta organela. Nichols
(2004) mostrou em culturas de células que o excesso de Ca2+ captado pela
mitocôndria constitui o passo essencial para a geração de ERO mitocondrial e,
conseqüente, excitotoxicidade celular (Nichols, 2004). Nós não encontramos
69
diferenças na expressão da CuZnSOD (figuras 29), porém, nós observamos
que a atividade dessa enzima foi aumentada no modelo de PS (p < 0,01; figura
26) sugerindo que houve vazamento de ERO para o citosol (O2•–). Estes
achados levantam a hipótese de que a PS leva os esplenócitos a um
desequilíbrio na sinalização celular (Ca2+, H+ e ERO) que por sua vez, pode
desencadear morte celular. Como mostrado em nossos resultados, a redução
da atividade da CAT e a não diferença da expressão da CuZnSOD na PS,
corrobora com os achados de Hansson e cols., (2008) que mostra que o
excesso de Ca2+ no citosol de células do cérebro de ratos induzido pela
abertura do poro mitocondrial levou a um aumento na geração de H2O2 por
abolir a capacidade endógena de destoxificação da célula pela GSH e NADPH
(Hansson e cols., 2008).
Jung e cols (2011) observaram que a PS em humanos leva a um
aumento no gasto energético comparado ao sono, à vigília e mesmo durante a
recuperação do sono (Jung e cols., 2011). Há aumento dos níveis de
adenosina em neurônios colinérgicos e córtex cerebral de camundongos,
seguido do aumento nos níveis de fosforilação do piruvato e lactato e aumento
da AMP quinase ativada durante a PS (Porkka-Heiskanen e Kalinchuk, 2010).
Nossos resultados sugerem que a necessidade da célula manter suas funções
durante a PS, requer uma grande quantidade de ATP. Dessa forma, a
mitocôndria possivelmente recebe este sinal já nas primeiras horas de PS. Este
sinal recebido pela mitocôndria, possivelmente ativa a liberação de Ca2+ de
seus estoques com conseqüente entrada de Ca2+ extracelular através de
canais de membrana (CRAC, SOCE). Sarsour e cols (2010) mostraram que
culturas de células expostas à concentração de 21% de O2 tiveram maior
70
geração de ERO mitocondrial com subseqüente aumento na atividade da
MnSOD comparadas a culturas expostas à apenas 4% de O2 (Sarsour e cols.,
2010). O acúmulo de Ca2+ citossólico observado em nossos resultados (figura
13), possivelmente foi captado pela mitocôndria (figura 14), o que acelerou o
seu metabolismo. A intensa atividade dos complexos da cadeia fosforilativa
eleva a geração de ERO que, por sua vez, leva a um aumento na expressão e
atividade da enzima antioxidade MnSOD. Foi demonstrado que a super
expressão da MnSOD em culturas de fibroblastos da pele de camundongos
reduz os níveis de ERO e preserva a morfologia da mitocôndria contra danos
associados ao envelhecimento e, consequente capacidade proliferativa
(Sarsour e cols., 2010). Estes dados sugerem que o aumento da atividade e
expressão da MnSOD observados em nosso trabalho possivelmente é uma
forma da mitocôndria tentar proteger a célula contra danos provocados por um
overload de Ca2+.
O aumento na sobrecarga de Ca2+ mitocondrial como resultado da
excitotocixidade celular tem sido associado com a geração de O2•– induzindo a
liberação de proteínas pró apoptóticas mitocondriais. Isto ocorre através do
processo de fragmentação/condensação do DNA, lipídios e proteínas, assim
como perda da integridade da membrana e desbalanço iônico culminando na
morte celular por apoptose ou necrose (Vanlangenakker e cols., 2008; Rego e
Oliveira, 2003). A partir de 48h de PS, o gasto energético possivelmente foi tão
intenso,
que
a
mitocôndria
provavelmente
entrou
em
exaustão,
em
consequência do aumento exacerbado de Ca2+ nesta organela, que com
elevados níveis de ERO, pode ter provocado a abertura do poro de transição
mitocondrial e o rompimento do PMM levando o vazamento de Ca2+, ERO e
71
enzimas mitocondriais (SOD, citocromo c etc). Este vazamento mitocondrial,
possivelmente provocou danos nos canais de membrana (MP e organelas) e
comprometeu a integridade de enzimas, proteínas e metabólitos citossólicos,
assim como a integridade de organelas como os lisossomos e o RE.
Esses achados estão de acordo com a significante redução na contagem
de células totais observadas no baço dos camundongos privados de sono por
72h (figura 18). A marcação com anticorpos específicos mostrou também uma
redução significante na população de linfócitos B e ainda, embora não
significativa, uma considerável diminuição na população de linfócitos Tc (20%)
e células NK (26%) (figura 19). Uma vez que populações de células
imunológicas estão baixas na PS, nós buscamos uma proximidade maior com
as vias de morte celular (apoptose e necrose) em camundongos privados por
72 horas de sono em experimento realizados em citômetro. A marcação com
anexina e 7AAD não mostraram diferenças entre os grupos (figura 20) tanto
para necrose e necrose secundária, bem como para apoptose. Porém, a
marcação com anticorpos para linfócitos, mostrou uma redução na população
de células B (figura 20) confirmando os resultados mostrados na figura 19.
Estes dados sugerem que a PS poderá levar os linfócitos B a uma migração
(para outros órgãos, como por exemplo, o sangue periférico), ou ainda, uma
disfunção na autofagia.
Para fornecer novos focos no tratamento para desordens do sono, uma
compreensão mais clara da regulação dos processos celulares na resposta
imunológica e o SNC são fundamentais. Nossos achados revelam que
mudanças na homeostase do Ca2+ após a PS é uma das alterações
72
responsáveis pela disfunção imunológica observada após os distúrbios do
sono.
73
6 CONCLUSÕES
1. A PS alterou a mobilização e homeostase do Ca2+ e do H+ intracelular
levando a disfunção nas mitocôndrias com possível efeito citotóxico e
conseqüente rompimento do PMM;
2. As concentrações de Ca2+ no RE e organelas acídicas foram
reduzidas nos esplenócitos de camundongos após a PS;
3. A PS por diferentes períodos possivelmente alterou a função dos
canais de membrana com consequente quebra nas flutuações do
Ca2+;
4. O rompimento do gradiente eletroquímico de organelas acídicas
como os lisossomos com possível mudança no pH citossólico e
dessas organelas foi observado após 72h de PS;
5. A resposta imunológica de camundongos infectados com parasitas
da malária foi prejudicada mesmo após rebote de 24h de sono;
6. Houve geração aumentada de espécies reativas de oxigênio
mitocondrial evidenciada pelo aumento da atividade e expressão da
MnSOD e aumento da atividade da CuZnSOD o que possivelmente
74
reforçou o desequilíbrio na homeostase iônica e conseqüente a
disfunção de vias de sinalização e metabólicas durante a PS;
7. A atividade da enzima CAT foi reduzida após a PS, sugerindo que a
célula entrou em colapso pelo efeito citotóxico dos elevados níveis de
Ca2+ mitocondrial e citossólico; e
8. A redução na população das células do baço após a PS, confirmada
pela redução de linfócitos B, sugere que o desequilíbrio iônico na
sinalização celular levou as células à morte celular com conseqüente
efeito imunossupressor.
75
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_____________________________________________________ABSTRACT
Sleep is an important physiological event that directly influences health and is
related to the immune system in which calcium acts as an important
messenger. In this study, we performed measurements of cytosolic calcium
mobilization in living cells in order to understand the changes in this ion
signaling in immune cells from mice after different periods of sleep
deprivation. Splenocytes of mice deprived of sleep for various periods (12 to 72
hours) showed a progressive loss of the intracellular calcium maintenance from
the endoplasmic reticulum store and a commitment of transient calcium
buffering by mitochondria. These data were confirmed by changes in the
performance of calcium channels SOCE and STIM1 and in the integrity of
lysosomal and mitochondrial physiology. These results were corroborated by
the increase in activity of antioxidant enzymes such as mitochondrial and
cytosolic superoxide dismutase, which reinforces the idea that the disruption in
the integrity of mitochondria and lysosomes possibly occurred by uncontrolled
generation of oxidative stress. The reduction of catalase activity suggests
involvement in cellular integrity, since excess of calcium and free radicals
probably compromise cell signaling. Moreover, deficient immune response was
observed when a group of mice was allowed to sleep for 24 and 48 hours of
sleep deprivation for 72 hours, followed by infection with malaria parasites
(Plasmodium chabaudi). The involvement of the immune cells was confirmed by
the reduction in the total population of cells in the spleen and, specifically, the
population of B lymphocytes. These new data suggest that sleep deprivation
86
affects calcium signaling probably by a stress in the endoplasmic reticulum,
mitochondria and lysosomes, leading to an insufficient supply of calcium to
signaling events and consequent intracellular damage. These data confirm
previously described mechanisms of immunosuppressive effects of sleep loss.
87