Baixar - Programa de Pós-Graduação em Parasitologia

Adriana Fernandes
Participação das citocinas ILIL-4, ILIL-13 e ILIL-33 na
resposta imunológica induzida pela infecção
experimental por Strongyloides venezuelensis em
camundongos
Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Biológicas
Programa de Pós-Graduação em Parasitologia
Belo Horizonte, MG- Brasil
2012
Adriana Fernandes
Participação das citocinas IL-4, IL-13 e IL-33 na resposta
imunológica induzida pela infecção experimental por
Strongyloides venezuelensis em camundongos
Tese apresentada ao programa de PósGraduação
em
Parasitologia
da
Universidade Federal de Minas Gerais
como requisito parcial para obtenção do
grau de Doutora em Parasitologia.
Área de concentração: Imunoparasitologia
Orientação: Dra. Deborah Negrão-Corrêa.
Depto. de Parasitologia ICB/UFMG.
Belo Horizonte, MG - Brasil
2012
2
LABORATÓRIOS ENVOLVIDOS
Imunologia de Helmintos - ICB/UFMG - Profa. Dra. Deborah Negrão-Corrêa;
Imunofarmacologia - ICB/UFMG - Prof. Dr. Mauro Martins Teixeira;
Mecanismos gerais de infecções fúngicas - ICB/UFMG - Prof. Dr. Ary Corrêa
Júnior.
Apoio: CAPES e FAPEMIG
3
Este trabalho é dedicado a minha mãe,
Rute Fernandes Silva, exemplo de
personalidade, caráter e vida.
4
AGRADECIMENTOS
À Deus, por me guiar e estar ao meu lado sempre.
Aos meus pais Milton Pereira Silva e Rute Fernandes Silva, pelo exemplo, amor e
suporte em todas as áreas da minha vida.
Ao William, pelo amor, carinho e apoio incondicional.
Ao Jú e a Bruna por todos os momentos felizes juntos e por estarem sempre
presentes.
À Cláudia, pela amizade, carinho e apoio.
Ao meu namorado Celso Soares Santos, pelo incentivo, pelo apoio e por ter
compreendido tão bem os momentos de ausência em função deste trabalho.
À Profa. Dra. Deborah Negrão-Corrêa, pela orientação, ensinamentos e por ter
tornado possível a realização deste trabalho.
Ao prof. Dr. Mauro Martins Teixeira pela colaboração.
À Sumara e à Sibele por todo apoio carinho e disponibilidade.
Às amigas Paula e Jaílza por estarem sempre presentes, pelos momentos alegres
e por dividirem comigo as minhas histórias.
Aos colegas do laboratório, Michele, Emília, Cíntia e Vinícius pela convivência
diária.
Ao José Carlos, por ter cuidado dos meus animais com imenso carinho e
competência, este trabalho não teria sido o mesmo sem a sua colaboração.
À CAPES pela concessão da Bolsa.
À todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.
5
A satisfação está no esforço e não apenas na
realização final. (Mahatma Gandhi)
6
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Ciclo de vida de S. stercoralis ............................................................... 30
Figura 2 - Delineamento experimental da participação de IL-4 na carga parasitária
e na resposta imune frente a infecção primária e secundária por S. venezuelensis
em camundongos C57BL/6. .................................................................................. 66
Figura 3 - Delineamento experimental da participação de IL-4 na carga parasitária,
na indução de células TCD4+ e na produção de citocinas frente a infecção primária
e secundária por S. venezuelensis em camundongos BALB/c. ............................ 67
Figura 4 - Delineamento experimental da participação de IL-13 na carga
parasitária e na resposta imunológica frente a infecção primária por S.
venezuelensis........................................................................................................ 69
Figura 5 – Delineamento experimental da participação de IL-33 na carga
parasitária e na resposta imunológica frente a infecção primária por S.
venezuelensis........................................................................................................ 71
Figura 6- Número de larvas recuperadas do lobo esquerdo do pulmão de
camundongos C57BL/6 não deficientes (WT) ou geneticamente deficientes na
produção de IL-4 (IL-4-/-) após 2 dias da infecção por S. venezuelensis.. ............. 84
Figura 7 - Avaliação cinética da carga parasitária no intestino de camundongos
C57BL/6 não deficientes (WT) ou geneticamente deficientes na produção de IL-4
(IL-4-/-) infectados com 700 L3 de S. venezuelensis aos 7, 10, 14, 18 e 24 dias
após a infecção primária. ...................................................................................... 87
Figura 8 – Avaliação da eliminação de ovos no intestino de camundongos BALB/c
não deficientes (WT) ou geneticamente deficientes na produção de IL-4 (IL-4-/-)
infectados com 700 L3 de S. venezuelensis aos 7, 10, 14, 18 e 21 dias após a
infecção primária.. ................................................................................................. 89
Figura 9 - Número de larvas recuperadas do lobo esquerdo do pulmão de
camundongos C57BL/6 não deficientes (WT) ou geneticamente deficientes na
produção de IL-4 (IL-4-/-) após 2 dias da re-infecção por S. venezuelensis. ......... 91
Figura 10 – Avaliação da carga parasitária no intestino de camundongos C57BL/6
não deficientes (WT) ou geneticamente deficientes na produção de IL-4 (IL-4-/-) reinfectados com 700 L3 de S. venezuelensis aos 7 dias após a re-infecção.. ........ 93
Figura 11 – Avaliação da carga parasitária no intestino de camundongos C57BL/6
não deficientes (WT) ou geneticamente deficientes da produção de IL-4 (IL-4-/-)
aos 14 dias após a infecção com 700 L3 de S. venezuelensis frente o tratamento
com anti-IL-13. ...................................................................................................... 95
7
Figura 12 – Avaliação da carga parasitária no intestino de camundongos BALB/c
não deficientes (WT) ou geneticamente deficientes na produção de IL-4 (IL-4-/-)
tratados ou não com IL-33 recombinante e infectados com 700 L3 de S.
venezuelensis aos 10 dias após a infecção.. ........................................................ 97
Figura 13 - Concentração de IgE total no soro de camundongos C57BL/6
deficientes ou não na produção de IL-4 aos 2, 7 e 14 dias após a infecção primária
e secundária com 700 L3 de Strongyloides venezuelensis. ................................ 100
Figura 14 – Concentração de IgE sérica em camundongos C57BL/6 não
deficientes (WT) ou geneticamente deficientes na produção de IL-4 (IL-4-/-)
submetidos ou não ao tratamento com anticorpo ainti IL-13 e infectados por 14
dias com 700 L3 de Strongyloides venezuelensis. .............................................. 101
Figura 15 – Concentração de IgE sérica em camundongos BALB/c não deficientes
(WT) ou geneticamente deficientes da produção de IL-4 (IL-4-/-) submetidos ou não
ao tratamento com IL-33 e infectados por 10 dias com 700 L3 de S.
venezuelensis...................................................................................................... 103
Figura 16 - Níveis de IgM no soro de camundongos C57BL/6 não deficientes (WT)
e deficientes da produção de IL-4 (IL-4-/-) aos 2, 7 e 14 dias após a infecção
primária e secundária com 700 L3 de Strongyloides venezuelensis. .................. 105
Figura 17 - Níveis de IgM parasito-reativa no soro de camundongos C57BL/6 não
deficientes (WT) e deficientes da produção de IL-4 (IL-4-/-) submetidos ou não ao
tratamento com anticorpo anti-IL13 e infectados por 14 dias com 700 L3 de
Strongyloides venezuelensis.. ............................................................................. 107
Figura 18 - Níveis de IgG1 parasito-reativa no soro de camundongos C57BL/6
deficientes (IL-4-/-) ou não de IL-4 (WT) aos 2 e 14 dias após a infecção primária e
secundária com 700 L3 de Strongyloides venezuelensis. ................................... 109
Figura 19 – Atividade de peroxidase de eosinófilo (EPO) no homogenato intestinal
de camundongos C57BL/6 selvagens (WT) e deficientes na produção da citocina
IL-4 (IL-4-/-) durante a infecção e re-infecção com 700 L3 de S. venezuelensis. . 112
Figura 20 - Atividade de peroxidase de eosinófilo (EPO) no homogenato intestinal
de camundongos C57Bl/6 selvagens (WT) ou deficientes na produção da citocina
IL-4 (IL-4-/-) e tratados ou não com anticorpo neutralizante anti-IL-13 aos 14 dias
após a infecção por S. venezuelensis. anti-IL13. ................................................ 114
Figura 21 – Atividade de mieloperoxidase (MPO) no homogenato intestinal de
camundongos C57BL/6 selvagens (WT) e deficientes na produção da citocina IL-4
(IL-4-/-) durante a infecção e re-infecção com 700 L3 de S. venezuelensis.. ....... 116
8
Figura 22 - Atividade de mieloperoxidase (MPO) no homogenato intestinal de
camundongos C57BL/6 selvagens (WT) ou deficientes na produção da citocina IL4 (IL-4-/-), tratados ou não com anticorpo neutralizante anti-IL-13 aos 14 dias após
a infecção por S. venezuelensis. . ....................................................................... 118
Figura 23 - Proporção de células CD4+ na suspensão celular derivada de linfonodo
mesentérico ou lâmina própria intestinal de camundongos BALB/c geneticamente
deficientes (IL-4-/-) ou não (WT) da produção da citocina IL-4 durante a infecção
primária ou re-infecção por S. venezuelensis...................................................... 121
Figura 24 - Proporção de células CD4/CD25+ na suspensão celular derivada de
linfonodo mesentérico ou lâmina própria intestinal de camundongos BALB/c
geneticamente deficientes ou não na produção da citocina IL-4 durante a infecção
primária ou re-infecção por S. venezuelensis...................................................... 123
Figura 25 – Avaliação da produção de IL-10 e IFN-γ por células derivadas de
linfonodo mesentérico ou lâmina própria intestinal de camundongos BALB/c
geneticamente deficientes (IL-4-/-) ou não (WT) da produção da citocina IL-4
durante a infecção primária ou re-infecção por S. venezuelensis. ...................... 127
Figura 26 - Proporção de células CD25/foxp3+ na suspensão celular derivada de
linfonodo mesentérico ou lâmina própria intestinal de camundongos BALB/c
geneticamente deficientes (IL-4-/-) ou não (WT) da produção da citocina IL-4
durante a infecção primária ou re-infecção por S. venezuelensis. . .................... 130
Figura 27 - Níveis de IL-10 e IFN-γγ no homogenato intestinal de camundongos
C57BL/6 geneticamente deficientes na produção da citocina IL-4 (IL-4-/-) ou não
(WT) durante a infecção primária e re-infecção com S. venezuelensis. ............. 133
Figura 28 - Níveis de IL-5 e IFN-γγ no homogenato intestinal de camundongos
BALB/c geneticamente deficientes (IL-4-/-) ou não (WT) da produção da citocina IL4 durante a infecção primária e a re-infecção com S. venezuelensis. ................ 135
9
LISTA DE ABREVIATURAS
AAMs
ADCC
Ag
ANOVA
APC
ARG-1
BAL
BSA
CAM-1
CCR
CD
CEBIO
CETEA
ConA
CXCR
DCs
DPI
ELISA
EPM
EPO
FIZZ
HTAB
HTLV-1
ICB
IFN-γ
Ig
IL
IL-4 R
iNOS
KO
L3
LPS
MHC II
MO
MPO
NK
NO
OPD
OVA
PBMC
PBS
RPMI
SNC
STAT 6
TGF-β
Th0
Macrófagos Alternativamente Ativados
Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpo
Antígeno
Análise de variância
Célula Apresentadora de Antígeno
Arginase 1
Lavado Broncoalveolar
Albumina de soro bovino
Molécula de adesão intercelular
Receptor de quimiocina do tipo CC
Cluster de diferenciação
Centro de Bioterismo
Comitê de Ética em Experimentação Animal
Concavalina A
Receptor de quimiocina do tipo CXC
Células dendríticas
Dias pós-infecção
Ensaio imuno-sorvente por enzima ligada (“enzime linked immunobsorbent assay”)
Erro padrão da média
Peroxidase de Eosinófilos
Proteína expressa em macrófagos alternativamente ativados
Hexadeciltrimetilamônio
Vírus Linfotrópico para Células T Humanas tipo 1
Instituto de Ciências Biológicas
Interferon gama
Imunoglobulina
Interleucina
Receptor de Interleucina do tipo 4
Óxido nítrico sintetase
Knock-out
Larvas filarióides de terceiro estágio infectantes
Lipofosfossacarídeo de bactéria Gram negativa
Complexo de histocompatibilidade do tipo II
Microscópio ótico
Mieloperoxidase de neutrófilos
Células Natural Killer
Óxido nítrico
O-fenilenodiamina Dihidroclorido
Ovoalbumina
Células mononucleares do sangue periférico (“Peripheral Blood Mononuclear Cells”)
Salina tamponada (“phosphate buffered saline”)
Meio de cultura cuja fórmula foi criada no Roswell Park Memorial Institute, NY
Sistema Nervoso Central
Sinal transdutor e ativador de transcrição 6
Fator de Crescimento Transformador-β
Células T CD4+ auxiliadoras que liberam citocinas do tipo 1 e do tipo 2
10
Th1
Th17
Th2
TNF-α
Treg
UFMG
WT
YM1
Células T CD4+ auxiliadoras do tipo 1
Células T CD4+ auxiliadoras do tipo 17
Células T CD4+ auxiliadoras do tipo 2
Fator de necrose tumoral
Células T CD4+ designadas Regulatórias
Universidade Federal de Minas Gerais
“ Wild Tipe” Selvagens
Membro da família da quitinase e expresso em macrófagos alternativamente
11
SUMÁRIO
12
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 19
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................. 25
2.1 Aspectos gerais .......................................................................................................................................... 26
2.2 Desenvolvimento do parasito ................................................................................................................... 29
2.3 Manifestações clínicas .............................................................................................................................. 32
2.4 Infecções por nematódeos e desenvolvimento de resposta imune......................................................... 36
2.5 Participação das citocinas IL-33, IL-4 e IL-13 na resposta imune induzida por nematódeos. .......... 48
3. JUSTIFICATIVA................................................................................................ 57
4. OBJETIVOS ...................................................................................................... 59
4.1 Objetivo geral ........................................................................................................................................... 60
4.2 Objetivos específicos ................................................................................................................................. 60
5. METODOLOGIA ............................................................................................... 61
5.1 Animais ...................................................................................................................................................... 62
5.2 Parasito e infecção .................................................................................................................................... 62
5.3 Obtenção de antígeno solúvel de larva.................................................................................................... 63
5.4 Delineamento Experimental: ................................................................................................................... 64
5.4.1 Participação de IL-4 na resposta protetora contra S. venezuelensis. .................................................. 64
5.4.2 Participação de IL-13 no mecanismo de proteção promovido pela infecção por S. venezuelensis. .... 68
5.4.3 Participação de IL-33 no mecanismo de proteção promovido pela infecção por S. venezuelensis. .... 70
5.5 Avaliação parasitológica da infecção ...................................................................................................... 72
5.6 Obtenção do homogenato tecidual intestinal ......................................................................................... 73
5.7 Avaliação indireta da infiltração de Eosinófilos e Neutrófilos no tecido ............................................. 73
5.8 Avaliação da produção de citocinas no homogenato intestinal............................................................. 75
5.9 Avaliação da resposta humoral. .............................................................................................................. 76
5.10 Obtenção de células de linfonodos mesentéricos e lâmina própria intestinal.................................... 78
5.11 Avaliação da marcação celular na lâmina própria e no linfonodo mesentérico................................ 79
5.12 Análise estatística.................................................................................................................................... 80
13
6. RESULTADOS .................................................................................................. 82
6.1 Avaliação parasitológica .......................................................................................................................... 83
6.1.1 Participação da citocina IL-4 na carga parasitária de camundongos infectados por Strongyloides
venezuelensis ............................................................................................................................................... 83
6.1.2 Avaliação da participação da citocina IL-4 na infecção secundária por S. venezuelensis .................. 90
6.1.3 Avaliação do tratamento com anticorpo neutralizante anti-IL-13 durante a infecção por S.
venezuelensis em camundongos selvagens ou deficientes da produção de IL-4 ......................................... 94
6.1.4 Avaliação do tratamento com IL-33 exógena durante a infecção por S. venezuelensis em
camundongos selvagens ou deficientes na produção de IL-4. ..................................................................... 96
6.2 Avaliação da resposta imune ................................................................................................................... 98
6.2.1 Efeito de IL-4, IL-13 e IL-33 na ativação da resposta humoral durante a infecção experimental por S.
venezuelensis em camundongos. ................................................................................................................. 98
- Produção de IgE ........................................................................................................................................ 98
- Indução de IgM, IgG1 e IgG2a reativas à antígeno solúvel de L3 .......................................................... 104
6.2.2 Efeito de IL-4 e IL-13 na infiltração/ativação de eosinófilos e neutrófilos no intestino de
camundongos infectados por S. venezuelensis ........................................................................................... 110
6.2.3 Efeito de IL-4 na ativação de células T CD4+ efetoras e reguladoras durante a infecção e re-infecção
experimental por S. venezuelensis em camundongos. ............................................................................... 119
6.2.4 Avaliação da produção de citocinas IL-10 e IFN-γ por células CD4+ frente a infecção experimental
por S. venezuelensis .................................................................................................................................. 124
6.2.5 Avaliação da participação de células T regulatórias frente a infecção experimental por S.
venezuelensis ............................................................................................................................................. 128
6.2.6 Avaliação da produção de citocinas .................................................................................................. 131
7. DISCUSSÃO ................................................................................................... 136
8. CONCLUSÕES ............................................................................................... 149
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 152
14
RESUMO
Embora seja conhecido o papel fundamental da resposta Th2 na proteção
contra nematódeos, sabe-se que os mecanismos responsáveis pelo controle do
parasito são diferentes para cada espécie. Em camundongos infectados por
Strongyloides venezuelensis foi demonstrado a importância da sinalização via IL4R/Stat 6 na indução de resposta protetora, entretanto a participação das citocinas
IL-4, IL-13 e IL-33 neste mecanismo ainda não foi estabelecida, sendo foco
principal deste trabalho. Para esta finalidade, foram utilizados camundongos
deficientes da produção de IL-4 (IL-4-/-) infectados primariamente ou re-infectados
por S. venezuelensis. Após a infecção, camundongos IL-4-/- e selvagens foram
tratados com anticorpo neutralizante de IL-13 ou com IL-33 exógena. Em
comparação com os camundongos não deficientes, camundongos IL-4-/apresentaram aumento significativo de carga parasitária e atraso na eliminação do
parasito sem alterações nos mecanismos de fecundidade. Em infecções primárias,
a deficiência da produção de IL-4 acarretou em uma menor proporção de células
CD4+ no linfonodo mesentérico e em diminuição de produção de IL-10, IL-5 e IFNγ na mucosa intestinal. Além disso, a ausência de IL-4 impediu a produção de IgE,
e diminuiu os níveis de produção de EPO e MPO. Em animais re-infectados a
deficiência da produção de IL-4 acarretou em aumento da proporção de células
CD4+ no linfonodo mesentérico e também em maior detecção de IL-10 em células
CD4+ e na mucosa intestinal. Junto a isso, a deficiência de produção de IL-4
acarretou na ausência de produção de IgE em menor produção de IgG1 e menor
desgranulação de neutrófilos no intestino. A neutralização de IL-13 durante a
15
infecção por S. venezuelensis não interferiu na carga parasitária mas diminuiu a
fecundidade dos parasitos e acarretou em uma menor produção de IgM por
camundongos IL-4-/-. e em um aumento de peroxidase de eosinófilos frente a
infecção. A administração de IL-33 não interferiu na carga parasitária e na
fecundidade de S. venezuelensis, entretanto aumentou a produção de IgE por
camundongos IL-4-/- frente a infecção. Os resultados indicam que o controle da
infecção por S. venezuelensis é mediado por mecanismos dependente de IL-4 e
não dependentes de IL-13 ou IL-33, sendo que IL-13 participa de mecanismos
anti-fecundidade.
Palavras chave: Strongyloides venezuelensis, IL-4, IL-13 e IL-33.
16
ABSTRACT
Even though the importance of Th2 response in protection against
nematodes is well established, the effector mechanism controlling the parasite can
be different in each species. It was demonstrated in mice infected with
Strongyloides venezuelensis the importance of IL-4R/Stat 6 activation in the
induction of a protective response, however the involvement of IL-4, IL-13 and IL33 in this mechanism has not yet been established, being the main focus of this
work. For this purpose, we used mice deficient in the production of IL-4 (IL-4-/ -)
primarily infected or re-infected with S. venezuelensis. After infection, IL-4-/ - and
wild type mice were treated with neutralizing antibody against IL-13 or exogenous
IL-33. Comparing to wildtype mice, IL-4 deficient mice showed a significant
increase in parasite burden and a delay in parasite elimination without changes in
the fecundity. During primary infection, the IL-4 deficiency resulted in a smaller
proportion of CD4+ cells in the mesenteric lymph nodes and decreased the
production of IL-10, IL-5 and IFN-γ at the site of the lamina propria. Furthermore,
the absence of IL-4 prevented IgE production, and reduced EPO and MPO levels
in the host intestine. In re-infected animals, the deficiency of IL-4 resulted in an
increase in the proportion of CD4+ cells in mesenteric lymph nodes and also in the
intracellular detection of IL-10 in CD4+ cells in the intestinal mucosa. Along with
this, the IL-4 deficiency resulted in ablation of IgE production, in a lower production
of IgG1 and in a reduced degranulation of neutrophils in the intestine. The
neutralization of IL-13 did not affect S. venezuelensis parasite burden but
decreased the fecundity of the parasites and resulted in a lower production of
17
parasite-specific IgM in IL-4-/- mice and an increase in eosinophil peroxidase during
the infection. IL-33 administration did not affect the worm burden and fecundity but
increased the IgE production by IL-4-/- mice. The results indicate that the control of
S. venezuelensis infection is dependent on mechanisms mediated by IL-4 and not
by IL-13 or IL-33. Moreover, the data suggests that IL-13 participates in antifecundity mechanisms during S. venezuelensis infection.
Keywords: Strongyloides venezuelensis, IL-4, IL-13 and IL-33.
18
1. INTRODUÇÃO
19
Infecções por nematódeos intestinais são altamente prevalentes na
população humana e em animais, especialmente em criações intensivas. Na
população humana, estudos estimam que aproximadamente um quarto da
população mundial possa estar infectado por nematódeos parasitos intestinais,
sendo que a maioria das pessoas infectadas vive em países em desenvolvimento
localizados em regiões tropicais e subtropicais (Hotez et al. 2008, Stepek et al.
2006, Chan, 1997, Khan & Collins, 2004). A infecção crônica por estes
nematódeos, especialmente em crianças expostas a altas cargas parasitárias,
pode acarretar em diversos problemas de saúde, por diferentes mecanismos, que
em muitos casos resultam em deficiência no desenvolvimento físico e cognitivo do
indivíduo (Stephenson et al. 2000).
A infecção pelo nematódeo Strongyloides stercoralis afeta 30 a 100 milhões
de pessoas em todo mundo, sendo mais prevalente em áreas onde as condições
sanitárias são precárias e onde o clima é quente e úmido (Siddiqui & Berk 2003,
Berthony et al. 2006). O hospedeiro se infecta através da penetração percutânea
de larvas filarióides do parasito, entretanto, uma vez estabelecida a infecção por
S. stercoralis, parte das larvas pode evoluir até a forma infectante ocorrendo autoinfecção do hospedeiro. Desta maneira, a infecção por S. stercoralis pode resultar
em infecções persistentes com uma larga variação de manifestações clínicas. O
aumento da carga parasitária e a potencial ameaça de disseminação das larvas
para todos os órgãos internos são frequentemente relatadas em indivíduos com
função comprometida do sistema imune.
A resposta imune protetora contra infecção por nematódeos intestinais,
tanto em infecções experimentais como em humanos, é dependente de células T,
20
e predominantemente, caracterizada por resposta tipo 2, resultando em aumento e
ativação de eosinófilos e mastócitos, aumento nos níveis de IgE e IgG4 (ou IgG1
em camundongos), aumento da produção de muco pelas células caliciformes
localizadas no epitélio superficial da mucosa (revisto por Finkelman et al.1997,
Patel et al. 2009). Mais recentemente também ficou estabelecido a importância da
resposta imune do tipo 2 na indução de macrófagos alternativamente ativados, no
aumento da renovação das células do epitélio intestinal e aumento da
contratilidade muscular do órgão (Jenkins & Allen 2009). Estas alterações podem
mediar a resistência de nematódeos intestinais.
Interleucina 33 (IL-33) é uma citocina produzida por células T CD4+, T
CD8+, NK-T, basófilos, eosinófilos e mastócitos (Barner et al.1998, Emson et
al.1998, Gessner at al. 2005, Anthony et al. 2007) e foi recentemente classificada
como uma citocina quimioatratora e indutora de células Th2 (Komai-Koma et al.
2007) devido particularmente a propriedade de aumentar a produção de IL-4, IL-13
e IL-5. IL-33 tem sido relatada como um ligante importante entre a imunidade inata
e adaptativa frente a infecção por diferentes nematódeos intestinais (Humphreys
et al, 2008).
Interleucina - 4 (IL-4) é produzida por células T do tipo 2, basófilos,
mastócitos e eosinófilos (Grünig et al. 1998, Wills-Karp et al. 1998) sendo o
principal estímulo para o desenvolvimento de células Th2 a partir de células T
CD4+ virgens. Os efeitos biológicos da produção de IL-4 são exercidos através de
sua ligação aos seus receptores (IL-4R), expressos na superfície de várias
células. Trabalhos realizados pelo nosso grupo de pesquisa, utilizando infecções
experimentais por S. venezuelensis, demonstraram que a eliminação dos vermes
21
adultos do intestino de camundongos é precedida por aumento de produção de
citocinas do tipo 2 e que o processo de eliminação dos vermes é muito retardado
em animais geneticamente deficientes em elementos da via de ativação IL4R/Stat6 (Negrão-Corrêa et al. 2004, Negrão-Corrêa et al., 2006).
O receptor de IL-4 do tipo I é um heterodimero composto pela cadeia alfa
do receptor de IL-4 (IL-4Rα), que é responsável pela ligação de IL-4, associada
com uma segunda cadeia polipeptídica, a cadeia gama que é comum ao receptor
de IL-2 (IL-2Rγ). O IL-4R tipo I é ativado apenas pela ligação por IL-4, sendo
expresso principalmente em células hematopoiéticas e é componente essencial
para a indução do fenótipo Th2. Entretanto, IL-4Rα pode se associar a cadeia α1
do receptor de IL-13 (IL-13Rα1), formando IL-4R tipo II, que é expresso
primariamente em células não hematopoiéticas, sendo capaz de ligar-se tanto a
IL-4 como IL-13 (Finkelman et al., 2004; Ramalingam et al., 2008; Anthony et al.,
2008). As regiões carbóxi-terminais de IL-4Rα e de IL-13Rα1 iniciam a cascata de
sinalização, no estado dimerizado ou isoladamente, via quinases de tirosina da
família Janus (JAK), as quais promovem interações com o fator de transcrição
STAT6, que, por sua vez, se liga às seqüências consenso nas regiões promotoras
dos genes regulados pela IL-4 e/ou IL-13 (Nelms et al. 1999, Kelly-Welch et al.
2003, Thirumalai et al. 2008). Um segundo receptor para IL-13 foi identificado,
sendo composto por IL-13Rα2, uma proteína que se liga com alta afinidade e
exclusivamente a IL-13 (Mentink-Kane et al. 2004). Este segundo receptor de IL13 existe na forma solúvel, identificável no soro e na urina, e também expresso em
células como fibroblastos (Shirakawa et al. 2000). IL-13Rα2 é considerado um
regulador negativo da atividade de IL-13 in vivo, pois a região citoplasmática de IL22
13Rα2 não apresenta seqüência de sinalização intracelular, e a sua expressão é
aumentada pela presença da própria IL-13 e também é dependente de IL-10 e
STAT6 (Chiamaronte et al. 2003, Mentink-Kane et al. 2004).
Assim, considerando que IL-4 e IL-13 compartilham muitas propriedades
biológicas, a existência de receptores específicos de cada citocina expressos em
diferentes tipos celulares pode resultar na indução de propriedades especificas
que podem estar diferentemente associadas à imunidade protetora e/ou
imunopatologia promovida por diferentes espécies de nematódeos intestinais.
Para exemplificar podemos citar que infecções experimentais utilizando-se
camundongos geneticamente deficientes demonstraram que IL-4, mas não IL-13
foi requerido para eliminação de Heligmosomoides polygyrus (Lawrence et al.
1998), uma espécie de nematódeo que habita a mucosa do intestino delgado
durante o seu desenvolvimento. Ao contrário, IL-13 e não IL-4 foi crucial para
eliminação de Nippostrongylus brasiliensis (Urban et al. 1998), nematódeo com
ciclo pulmonar que posteriormente se estabelece na luz do intestino delgado. Por
outro lado, tanto IL-13 como IL-4 são necessários para eliminação de Trichuris
muris, que vivem na camada epitelial do ceco (Bancroft et al. 1998) e Trichinella
spiralis, que habita o epitélio do intestino delgado (Finkelman et al. 2004).
Desta forma, é necessário entendermos os possíveis mecanismos
imunológicos induzidos pela atividade de IL-4, IL-13 e IL-33 que possam ser
responsáveis pela proteção do hospedeiro contra infecções por Strongyloides,
levando-se em consideração que alguns mecanismos podem atuar de maneira
protetora para algumas espécies e não para outras. Por isso, neste estudo,
utilizamos camundongos geneticamente deficientes na produção da citocina IL-4,
23
bem como a neutralização de IL-13 e a administração de IL-33 exógena para
investigar o papel destas citocinas no processo de eliminação deste parasito e de
alterações patológicas induzidas pela infecção primária ou pela re-infecção por
S.venezuelensis em camundongos.
24
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
BIBLIOGRÁFICA
25
2.1 Aspectos gerais
Atualmente no mundo, mais de três bilhões de pessoas encontram-se
infectadas com helmintos parasitos (Hotez et al. 2008). Apesar de infecções por
estes parasitos geralmente não serem fatais, elas estão associadas a altas taxas
de morbidade e a infecções crônicas, geralmente levando a anemia e desnutrição
(WHO 1999). Países desenvolvidos têm conseguido controlar estas infecções
através da implantação de programas eficientes de saúde pública e de um sistema
efetivo de engenharia sanitária. Entretanto, doenças causadas por helmintos
continuam sendo um grave problema de saúde pública em países em
desenvolvimento principalmente em países tropicais e subtropicais (Ziegelbauer et
al. 2012).
Os parasitos do gênero Strongyloides são nematódeos que pertencem ao
Filo Nematoda, Classe Secernentea, Ordem Rhabditida e Família Strongyloididae
(Adamsom 1987). Recentemente foi proposta uma reclassificação do filo
Nematoda baseada no seqüenciamento de bases de DNA ribossomal onde
Blaxter e colaboradores concluíram que a ordem Rhabidita, a qual Strongyloides
está inserido, é parafilética e seus membros foram rearranjados em três
subordens (Blaxter et al. 2008). Neste contexto, o gênero Strongyloides foi
reclassificado como membro da na Classe Chromadorea, Ordem Rhabditida (=
Secernenta), Sub-Ordem Tylenchina e Família Strongyloididae (Schmidt & Roberts
2009). A diferenciação morfológica das espécies de Strongyloides baseia-se,
principalmente em caracteres da fêmea parasita, como tamanho do corpo,
morfologia do ovário, formato da cauda e da abertura bucal. Yamagutti (1961)
26
catalogou 43 espécies no gênero Strongyloides, sendo 34 descritas como
parasitos do intestino delgado de mamíferos, 5 de aves, 4 de anfíbios e 2 de
répteis. Atualmente, estão descritas 52 espécies deste gênero (Speare 1989),
entretanto, devido a grande semelhança morfológica existente entre estas
diferentes espécies, muitas vezes a descrição foi baseada na espécie do
hospedeiro em que foram encontradas.
Dentre as espécies do gênero Strongyloides, S. stercoralis parasita o
intestino delgado do homem, sendo o agente causador da estrongiloidose
humana. A prevalência da estrongiloidose está associada a condições climáticas
da região e ao nível sócio-econômico em que vive a população, estimando-se que
30 a 100 milhões de pessoas apresentam-se infectadas em 70 diferentes países
do mundo, sendo que no Sudeste Asiático, África e América Latina estão
localizadas as regiões com maiores índices de prevalência desta parasitose
(Genta 1989, Siddiqui & Berk 2003).
No Brasil, a importância deste parasito como agente etiológico da
estrongiloidose foi salientada primeiramente por Ribeiro da Luz em 1880, como
uma doença de grande importância para saúde pública, com taxa de infecção
atingindo 41,5% sendo encontrada em todos os estados brasileiros (Morais 1948).
Levantamentos bibliográficos indicam que a prevalência da infecção por S.
stercoralis ainda encontra-se elevada na população brasileira, sendo verificado
que dos 1.133 indivíduos examinados na Amazônia, 221 estavam infectados
(Egido et al. 2001). Em Porto Alegre, no hospital das clínicas, 8,3% dos pacientes
internados estavam infectados com S. stercoralis (Teixeira 1997) e no Hospital de
Uberlândia, Minas Gerais, entre 300 crianças de 1- 4 anos, a prevalência da
27
infecção por S. stercoralis foi de 13% (Machado & Costa Cruz 1998). A
estrongiloidose tornou-se um importante problema médico e social devido à
facilidade de transmissão, a presença da auto-infecção, ao potencial de
cronicidade e a possibilidade de re-agudização em indivíduos imunodeprimidos,
podendo originar as formas graves de hiper-infecção e disseminação, onde a
infecção evolui muitas vezes para óbito. (Siddiqui & Berk 2001).
Além da infecção humana, outras espécies do gênero Strongyloides são
importantes parasitos de animais domésticos, sendo responsável por prejuízos na
atividade pecuária; entre eles S. ransoni, parasito do intestino de suínos, S.
westeri que parasita equídeos, S. avium parasito de aves e S. papillosus, parasito
de ovinos e bovinos. Strongyloides fuelleborni é parasito habitual de macacos,
entretanto, tem sido responsável pela infecção em humanos, em algumas regiões
da África, como no Zimbaboe e nas Filipinas (Beaver et al. 1984, Speare 1989,
Ashford & Barnish 1987).
Segundo Levine (1980), o departamento de agricultura dos Estados Unidos
estimou que a estrongiloidose em suíno foi responsável por perda anual de 2.7
milhões de dólares no país. No Brasil, não existe um estudo do prejuízo provocado
pela infecção promovida por espécie do gênero Strongyloides em rebanhos,
entretanto, a infecção por S. papillosus, é responsável pelo curso branco (diarréia
catarral) que pode resultar na morte de bezerros em fase de lactação (de 6-8
meses) por desidratação. Esta infecção atinge, principalmente, animais jovens de
rebanhos estabulados, sendo que o animal adulto desenvolve imunidade protetora
(Freitas, 1977). Strongyloides venezuelensis e S. ratti, são parasitos de roedores,
utilizados como modelos experimentais em estudo de interação parasito–
28
hospedeiro (Negrão-Corrêa et al. 2003), ensaios terapêuticos (Satou et al. 2001) e
como fonte de antígeno heterólogo para padronização de novas técnicas no
imunodiagnóstico da estrongiloidose humana (Costa-Cruz et al. 1999).
2.2 Desenvolvimento do parasito
O ciclo de vida das espécies do gênero Strongyloides é caracterizado por
uma alternância de gerações de vida livre e vida parasitária. Segundo Genta
(1986), esta característica confere ao parasito uma relação bem sucedida com
dois ecossistemas - o hospedeiro e o meio ambiente. As larvas de 3º estádio (L3)
de S. stercoralis, denominadas larvas filarióides, penetram ativamente pela pele
ou pela mucosa oral, esofágica ou gástrica do hospedeiro. Estas larvas secretam
proteases, que auxiliam na penetração e na migração através dos tecidos
podendo atingir a circulação sangüínea (McKerrow et al. 1990). Ao chegar aos
capilares pulmonares, atingem o pico de concentração de larvas por volta do
segundo dia após a infecção, posteriormente, as larvas do parasito atravessam o
endotélio do capilar e a membrana alveolar, migram pela árvore brônquica e
chegam à faringe, onde podem ser expelidas pela expectoração, ou deglutidas,
atingindo o intestino delgado do hospedeiro. Após penetrarem na mucosa do
intestino delgado do hospedeiro, as larvas de Strongyloides sofrem duas mudas
para completar o seu desenvolvimento, e diferenciam-se em fêmeas (Werthein &
Lengy 1965, Schad 1989). Estas fêmeas amadurecem sexualmente e produzem
seus ovos por partenogênese mitótica (Triantaphyllou & Moncol 1977). O pico da
infecção no intestino ocorre por volta dos sete dias após a infecção. Os ovos
29
larvados são eliminados na luz intestinal e as larvas rabditoides
rabditoides de 1º estádio (L1)
eclodem, sendo a maioria destas larvas eliminadas nas fezes do hospedeiro
infectado. O período pré - patente da infecção no homem é de aproximadamente
15 a 25 dias (Vadlamudi
Vadlamudi et al. 2006).
Figura 1 - Ciclo de vida de S. stercoralis (Disponível em:
http://www.cdc.gov/parasites/strongyloides/biology.html) modificado por Fernandes, A.
http://www.cdc.gov/parasites/strongyloides/biology.html)
No caso da estrongiloidose humana, algumas larvas rabditóides de S.
stercoralis,, ainda na luz intestinal de indivíduos infecta
infectados,
dos, transformam-se
transformam
em
larvas filarióides e penetram na mucosa intestinal (íleo ou cólon), re-infectando
re
o
hospedeiro,
processo
conhecido
por
auto-infecção
auto
cção
interna,
com
graves
consequências
ências patológicas. No mecanismo de auto-infecção
auto infecção externa, as larvas
filarióides
rióides presentes na região perianal podem também re-infectar
re infectar o hospedeiro
30
contribuindo para um agravamento do quadro clínico do paciente (Grove 1996,
Vadlamudi et al. 2006).
A maioria das larvas rabditóides L1 eliminadas no meio externo, caso
encontrem condições adequadas de temperatura e umidade, evoluem para larvas
filarióides
capazes
de
infectar
o
hospedeiro
vertebrado.
Este
tipo
de
desenvolvimento é denominado ciclo direto ou homogônico. Entretanto, parte das
larvas rabditóides eliminadas pelas fezes do hospedeiro podem evoluir, através de
4 mudas, para machos e fêmeas de vida livre, que se reproduzem originando uma
ou mais gerações de vida livre (Schad 1989).
Os fatores que determinam este tipo de desenvolvimento, denominado de
ciclo indireto ou heterogônico, não estão completamente esclarecidos. Alguns
autores acreditam que a diferenciação é geneticamente determinada na formação
do ovo. Inicialmente, Chang & Graham (1957) descreveram diferenças no número
de cromossomos das formas de vida parasitária e de vida livre, sugerindo que as
fêmeas parasitas seriam triplóides (3n) podendo produzir simultaneamente três
tipos de ovos, triplóides (3n), diplóides (2n) e haplóides (n). As larvas rabditóides
triplóides (3n) originariam em larvas filarióides triplóides infectantes completando o
ciclo direto, enquanto que as diplóides se transformariam em fêmeas de vida livre
e as haplóides em machos. Entretanto, alguns estudos não confirmam a diferença
de ploidia e indicam que todas as formas evolutivas do ciclo de Strongyloides são
diplóides (Harvey & Viney 2001). Estes autores confirmam que a determinação
sexual é genética; sendo que as fêmeas, tanto de vida livre como parasitas,
contém 6 cromossomos sendo 2 cromossomos sexuais (2n=6, XX) e machos
somente 5 cromossomos, pois recebem apenas um cromossomo sexual X (2n=5,
31
XO). A diferenciação entre fêmeas parasitas e de vida livre aconteceria
posteriormente devido à diferenciação na expressão gênica, que poderia ser
influenciada pela resposta imune do hospedeiro, disponibilidade de nutrientes e
temperatura ambiental entre outros fatores (Viney 1999, Harvey et al. 2000).
Para facilitar o esclarecimento de vários aspectos da interação parasitohospedeiro as espécies que parasitam roedores, como S. venezuelensis, têm sido
utilizadas devido à facilidade de manutenção e manipulação no laboratório.
Entretanto, é importante ressaltar algumas diferenças entre o desenvolvimento
desta espécie e o descrito para S. stercoralis: as larvas infectantes de S.
venezuelensis migram preferencialmente pela musculatura e tecidos subcutâneos
até atingir o pulmão (Takamure 1995, Negrão-Corrêa 1990), apenas ovos larvados
do parasito são eliminados nas fezes, não sendo observado o fenômeno de auto
infecção, e finalmente ratos e camundongos infectados com S. venezuelensis
apresentam auto-cura por volta do 12º ao 14º dia após a infecção (Galliard 1938,
Taira et al. 1995, Nakai & Amarante 2001; Marra et al. 2010) e ficam protegidos
contra re-infecções por um curto período de tempo (Murrell,1980, Fernandes et al.,
2008).
2.3 Manifestações clínicas
A interação entre S. stercoralis e o homem pode resultar na erradicação do
parasito ou na evolução para uma infecção crônica e assintomática, que pode se
prolongar por mais de 65 anos devido ao processo de auto-infecção (Grove 1996;
Schad et al. 1989). Ocasionalmente, também pode ocorrer aumento de carga e
disseminação do parasito, quadro geralmente associada a um estado de
32
imunossupressão do hospedeiro, podendo levá-lo a morte (Bradley et al. 1978;
Genta 1986, Siddiqui & Berk 2003).
Nas populações em que a estrongiloidose é endêmica, observam-se
pessoas não infectadas com altos níveis de anticorpos específicos contra S.
stercoralis, sugerindo que algumas pessoas que foram infectadas desenvolveram
uma resposta protetora capaz de controlar o parasito (Genta et al. 1986). Entre as
pessoas com infecção ativa, a maioria apresenta-se assintomática ou com
sintomatologia pouco específica, como dores abdominais, problemas digestivos,
diarréias e má absorção alimentar. A sintomatologia pode ser intermitente ou
intercalada com longos períodos assintomáticos.
Existem casos onde o paciente pode evoluir para a hiper-infecção ou para a
forma disseminada da doença, onde o parasito pode ser documentado em vários
órgãos como no fígado, pulmão, coração e sistema nervoso central (SNC).
Complicações, como infecções bacterianas secundárias (principalmente por
germes gram negativos), podem levar a um quadro de septicemia e meningite
bacteriana, sendo relacionadas com altas taxas de mortalidade. Nestes casos, há
disseminação sanguínea de bactérias intestinais que acompanham as larvas
durante o processo de auto-infecção. Concomitantemente, lesões da mucosa e do
cólon podem facilitar a penetração das bactérias (Carvalho 1988, Vadlamudi
2006).
As
formas
graves
da
estrongiloidose
têm
sido
associadas
com
imunossupressão do hospedeiro, especialmente quando há comprometimento da
imunidade mediada por células, como ocorre em linfomas, leucemias, carcinoma,
síndromes nefróticas, glomerulonefrites crônicas e subnutrição. As formas graves
33
de estrongiloidose também têm sido associadas ao uso continuado de drogas
imunossupressoras (Grove, 1989). Os corticosteróides e seus metabólitos também
exercem um efeito estimulante direto sob as larvas do parasito, acelerando sua
evolução de rabditóide para filarióide favorecendo a auto-infecção, ou ainda esta
droga pode ter efeito sobre a fêmea parasita, levando ao aumento da ovipostura
(Nagalotimanth et al. 1974). Assim, associado ao efeito imunossupressor
produzido pelo corticóide, um grande número de larvas re-infectam o hospedeiro e
disseminam pelo organismo originando casos graves da parasitose, podendo
causar hemorragias intestinais e pulmonares, septicemias e meningites (Genta et
al. 1986). Blatt & Cantos (2003) demonstraram em seu estudo a elevada
prevalência do parasitismo por S. stercoralis em pacientes HIV positivo. No
entanto, poucos casos de estrongiloidose disseminada têm sido relatados em
pacientes portadores da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida, apesar de mais
raro do que inicialmente se esperava, a hiper-infecção com mau prognóstico tem
sido relatada nestes pacientes (Blatt & Cantos, 2003; Silva 2005, Gasparini et al.
2004). Recentemente, têm sido demonstrada a associação da estrongiloidose com
o vírus linfotrópico para células T humanas tipo 1 (HTLV-1), com apresentação de
formas graves e recorrência após o tratamento. A associação entre HTLV-1 e
estrongiloidose tem sido demonstrada em regiões onde ambas as infecções são
endêmicas. Porto & colaboradores (2002) verificaram que a infecção humana pelo
vírus HTLV-1 está relacionado com uma alta produção de IFN-γ e desvio da
resposta imune para Th1. Nos pacientes co-infectados pelo vírus e por S.
stercoralis, o aumento da resposta imune Th1, promovido pelo vírus HTLV-1,
34
resulta em uma redução significativa na produção de Interleucina-4 (IL-4), IL-5, IL13 e IgE, componentes participantes dos mecanismos de defesa contra S.
stercoralis, explicando assim, a maior ocorrência de formas graves da
estrongiloidose em pacientes infectados pelo HTLV-1. Trabalho recente sugere a
participação de células T regulatórias na indução de maior suscetibilidade ao
parasito em pacientes hiper-infectados por Strongyloides e co-infectados com
HTLV-1, neste trabalho, os autores relataram um aumento de células T
regulatórias associado a uma diminuição de eosinofilia e diminuição de produção
de IL-5 (Montes et al. 2009).
Desta forma, é evidente que a evolução dos diferentes quadros clínicos
observados na estrongiloidose está relacionada com a resposta do hospedeiro ao
parasito, sendo essencial o conhecimento detalhado da interação do Strongyloides
sp. - hospedeiro para se propor alternativas de diagnóstico e terapia mais eficiente
para o controle desta parasitose.
35
2.4 Infecções por nematódeos e desenvolvimento de resposta
imune
Infecções por nematódeos e a consequente resposta imune estabelecida
pelo hospedeiro são produtos de uma prolongada e dinâmica co-evolução, sendo
selecionadas estratégias que levam a uma resposta imune modulada que permite
a sobrevivência do parasito e uma menor lesão do hospedeiro. Independente da
extensa complexidade antigênica dos nematódeos, na maioria dos casos, a
resposta imune induzida por estes parasitos são predominantemente de perfil Th2,
caracterizada pela produção de IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13 (Urban et al. 1992,
Finkelman et al. 1997). Outros estudos indicam que citocinas produzidas por
células da resposta imune inata, como IL-21, IL-33 e IL-25, também contribuem
para o estabelecimento da resposta do tipo 2 (revisto por Anthony et al. 2007). A
produção das citocinas do perfil Th2 estimulam a diferenciação de células B em
plasmócitos produtores de IgE e IgG4 e a diferenciação e ativação de eosinófilos,
mastócitos e basófilos (Gause et al. 2003, Anthony et al, 2007, Finkelman et al.
1999, Finkelman et al. 2004, Urban et al. 1991, Urban et al. 1998, Zhao et al.
2003, Patel et al. 2009, Iriemenam et al. 2010). Outros estudos têm demonstrado
também a participação de macrófagos alternativamente ativados em infecções
helmínticas, sendo que ativação deste tipo celular é promovida por citocinas Th2,
especialmente IL-4 e IL-13 (Gordon 2003). Finalmente, existem relatos da atuação
direta de IL-4 e/ou IL-13 na mucosa intestinal, alterando a contração muscular
(Zhao et al. 2003), a proliferação das células epiteliais intestinais (Cliffe et al.
2005) e a diferenciação de células caliciformes produtoras de RELM-β (Artis et al.
36
2004). Diferentes autores têm demonstrado uma associação entre a resposta de
células Th2 e a proteção contra diversos nematódeos parasitos, em modelo
experimental murino (revisto por Anthohy et al. 2007, Finkelman et al. 2004, Patel
et al. 2009). No caso específico da infecção por espécies do gênero Strongyloides,
a associação da resposta Th2 com proteção tem sido verificada tanto na infecção
humana como em modelos experimentais. Na estrongiloidose humana, pacientes
co-infectados por HTLV-1, vírus que promove uma alta produção de IFN-γ e
desvio da resposta imune para o tipo Th1, apresentam aumento da carga
parasitária e disseminação do nematódeo que coincide com a redução na
produção de IL-4, IL-5, IL-13 e IgE, componentes participantes do mecanismo de
defesa contra S. stercoralis (Porto et al. 2002, Porto et al. 2001). A participação da
resposta imune do tipo 2 no mecanismo de controle da infecção por nematódeos
do gênero Strongyloides foi confirmada por estudos de infecção experimental
utilizando S. venezuelensis em camundongos geneticamente deficientes no
receptor de IL-4 e no fator de transcrição induzido por esta via (IL-4Rα-/- ou
STAT6-/-), sendo que, nestes camundongos, observou-se um retardo no período
de
eliminação dos vermes quando comparado ao período de eliminação da
infecção em camundongos selvagens (Negrão-Corrêa et al. 2006, Sasaki et al.
2005).
Apesar da associação da resposta do tipo-2 com o controle da infecção por
nematódeos, os possíveis mecanismos de ação ainda não estão completamente
esclarecidos. O aumento de citocinas do tipo2 frente à infecção por nematódeos
estimula a produção de algumas classes e subclasses de anticorpos, como IgG1 e
IgE. A imunoglobulina E (IgE) tem um papel central em respostas alérgicas e
37
também participa da resposta imune contra nematódeos devido a sua capacidade
de se ligar especificamente a receptores IgE de alta afinidade em mastócitos ou
basófilos pela cadeia alfa do receptor FC épsilon tipo I (Fcε R-I) (Turner & Kinet
1999). A partir da ligação do antígeno ao IgE ligado a estas células, segue-se a
desgranulação e conseqüente liberação de mediadores solúveis como histamina,
heparina, citocinas e proteases. Por outro lado, IgE também pode se ligar ao
receptor FcεR-I presente em eosinófilos de alguns mamíferos, como o caso do
homem, levando a uma reação de citotoxicidade celular dependente de
anticorpos, envolvida também na eliminação de helmintos (Gounni et al. 1994).
Além de sua capacidade de ativar mastócitos, basófilos e eosinófilos, IgE pode se
ligar ao receptor IgE de baixa afinidade (CD23, ou Fc-ɛ RII) nas células B para
ampliar as respostas imunes celulares e humorais (Delespesse et al. 1992).
Embora seja conhecido que IgE tem sido fortemente associada a infecções por
helmintos e doenças alérgicas, o papel da IgE na imunidade protetora contra
infecção por helmintos tem sido difícil de estabelecer. Durante uma infecção
helmíntica os níveis séricos de IgE podem aumentar até 100 vezes (Jarrett &
Bazin 1974), o que é proporcionalmente maior do que a resposta de qualquer
outro isotipo de imunoglobulinas. No entanto, a concentração absoluta de IgE no
soro é ainda muito baixa quando comparada com subclasses de IgG. Embora os
níveis de IgE se mostrem elevadas durante a infecção, apenas uma pequena
porção de IgE presente no soro é parasito específica (Turner et al. 1979). Para
hipersensibilidade tipo I e ADCC, dois mecanismos que têm sido relacionados à
proteção contra helmintos, um excesso de IgE não-específica poderia bloquear o
desenvolvimento do mecanismo de proteção pelo hospedeiro, saturando os
38
receptores de IgE em células efetoras com imunoglobulina não específica e
impedindo a ativação dos mecanismos efetores (Pritchard 1993). Entretanto,
evidências experimentais não confirmam a possibilidade de bloqueio de
mecanismos efetores e vários estudos demonstram a participação de anticorpo,
principalmente do isotipo IgE na eliminação de diferentes nematódeos como T.
spiralis e S. venezuelensis (revisado por Bell 1996 e Negrão-Correa 2001) .
Alguns estudos revelam que a produção de IgE específica contra antígenos do
parasito ocorre principalmente no local da infecção, como mucosa intestinal e
pulmonar ou órgãos linfáticos associados, podendo afetar o controle de
nematódeos parasitos como T. spiralis, Heligmosomoides polygyrus e S.
venezuelensis (Negrão-Corrêa et al. 1996, Negrão-Corrêa et al. 1999, Silveira et
al. 2002). É interessante salientar que em camundongos deficientes da produção
de eosinófilos (∆dblGATA) e infectados por S. venezuelensis foi verificado a uma
maior concentração de IgE total, sugerindo a importância deste tipo celular no
seqüestro desta imunoglobulina (Eschenazi 2008).
Além da participação de IgE, outros isotipos de imunoglobulinas
estimuladas na presença da resposta imune do tipo 2 também podem participar da
resposta protetora contra a infecção por nematódeos. Dixon et al. (2010)
demonstraram altos níveis de IgG1 no soro e também de IgG1 ligada a células do
cólon de camundongos protegidos pela vacinação com antígeno secretadoexcretado de T. muris associado a adjuvante incompleto de Freund. Os autores
sugeriram nesse caso, que os anticorpos poderiam estar envolvidos na expulsão
dos vermes induzida pela vacinação. No caso do S. venezuelensis, Fernandes et
al. (2008) também demonstraram altos níveis de IgG1 produzidos frente a
39
imunização prévia com larvas L3 do parasito. A produção de imunoglobulina M
(IgM) parasito-específica também tem sido associada com o controle precoce de
larvas de S. stercoralis principalmente através da ativação do complemento
(Brigandi et al. 1996). Corroborando com esta hipótese Ligas et al. (2003)
transferiram soro completo e IgM purificados de camundongos previamente
imunizados contra S. stercoralis para camundongos virgens antes da infecção
experimental. Os autores relataram que a transferência passiva destes anticorpos
levou a uma redução de 80% do número de larvas vivas recuperadas nesses
camundongos. A infecção experimental com S. stercoralis em camundongos
deficientes na produção de células B sugere que linfócitos B têm papel no controle
da re-infecção, mas não durante a infecção primária (Herbert et al. 2002).
Além da resposta humoral, existem evidências experimentais associando
mastocitose intestinal e aumento de células caliciformes com a eliminação de
algumas espécies de nematódeos, tais como H. polygyrus (Hashimoto et al. 2009)
e T. spiralis (Knight et al. 2008). Na infecção Strongyloides Sp., a participação de
mastócitos no processo de eliminação dos vermes foi inicialmente demonstrada
em camundongos W/W V, uma linhagem de camundongos que apresenta uma
mutação no gene c-kit responsável pela deficiência na diferenciação de
mastócitos. A infecção experimental por S. ratti (Nawa et al. 1985; Abe & Nawa
1987) ou S. venezuelensis (Khan et al. 1993) em camundongos W/W V resultou em
retardo na eliminação dos vermes comparado ao observado em camundongos
não deficientes. Além disto, em camundongos atímicos a resposta protetora contra
S. ratti foi restaurada após tratamento prolongado com IL-3, tratamento este capaz
de restaurar a mastocitose intestinal (Abe & Nawa 1988, Abe et al. 1993). A
40
importância da mastocitose intestinal no processo de eliminação de S.
venezuelensis foi novamente confirmada em infecções experimentais com o
nematódeo em camundongos geneticamente deficientes em IL-3 (Lantz et al.
1998) e em camundongos deficientes na produção da subunidade p85alfa do
complexo phosphatidylinositol-3 quinase (PI3K), que resulta em ausência de
mastócitos no intestino e no peritôneo, tornando os animais altamente
susceptíveis a infecção por S. venezuelensis (Fukao 2002).
A desgranulação de mastócitos, através da ligação do antígeno à IgE
ligadas ao receptor de alta afinidade expresso na membrana celular, promove a
liberação de enzimas proteolícas, citocinas e mediadores inflamatórios, que além
de atuar diretamente sobre o verme, induz modificações fisiológicas, tais como
aumento de permeabilidade e de motilidade da mucosa intestinal, e infiltração de
células que podem atuar na eliminação deste parasito. Outra hipótese pela qual a
mastocitose
intestinal
atuaria
na
eliminação
dos
vermes
do
intestino,
experimentalmente verificada em infecções experimentais com S. venezuelensis,
sugere que proteoglicanas fortemente sulfatadas presentes em grânulos de
mastócitos e secretadas no intestino dificultariam a fixação dos vermes no epitélio
da mucosa intestinal e, consequentemente facilitariam a eliminação dos mesmos
(Maruyama et al. 2000). Mecanismo semelhante também pode ocorrer com a
secreção de mucinas sulfatadas produzidas por células caliciformes durante a
infecção (Ishikawa et al. 1995, Maruyama et al. 2002).
A resposta imune do tipo-2 também acarreta na diferenciação e ativação de
eosinófilos. A elevação destas células está frequentemente associada com
aumento da produção de quimiocinas, como eotaxina (CCL11) e citocinas, como
41
IL-5. Uma vez ativadas estas células produzem e estocam proteínas citotóxicas
em grânulos citoplasmáticos, como proteína básica principal (MBP), proteína
catiônica eosinofílica (ECP), peroxidase eosinofílica (EPO), neurotoxina derivada
do eosinófilo (EDN), além de mediadores lipídicos, como PAF e LTB4, e
esteróides,
como
estrógenos
e
glicocorticóides
(Cara
et
al.
2000).
A
desgranulação do eosinófilo é induzida por complemento e/ou, em uma fase mais
tardia da infecção ou na re-infecção, mediada por anticorpos específicos, processo
denominado de citotoxidase mediada por anticorpos (ADCC). Eosinófilos ativados
também podem realizar desgranulação gradativa mediada pelo reconhecimento do
complexo antígeno-anticorpo e por várias citocinas incluindo IL-3, IL-5, fator
estimulador da colônia de macrófagos (GM-CSF) (Carlson et al. 1993). A ativação
por citocinas, imunoglobulinas e complemento leva estas células a secretarem
uma variedade de citocinas como IL-2, IL-4, IL-6 e IL-10. Tais moléculas regulam a
permeabilidade vascular, modulam o tráfego celular, a secreção de muco e a
contração do músculo liso (Anthony et al. 2007, Rothenberg & Hogan 2006). Em
infecções por S. stercoralis, os eosinófilos podem ainda iniciar a resposta
imunológica específica agindo como células apresentadoras de antígenos (Padigel
et al. 2006).
A eosinofilia sanguínea e aumento no número de eosinófilos na mucosa
gastrointestinal (Rothwell 1989) são alterações características de infecções por
nematódeos, entretanto, seu envolvimento na imunidade protetora permanece
controverso. Estudos realizados in vitro indicam que os eosinófilos e anticorpos
específicos podem destruir larvas de uma variedade de helmintos parasitos
(Butterworth et al. 1975, Kazura & Grove 1978, Butterworth 1984, Gransmuller et
42
al. 1987). Em estudos in vivo, onde a eosinofilia induzida pela infecção por
helmintos foi reduzida ou eliminada através do tratamento com anticorpos
neutralizantes anti-IL-5 ou anti-IL-5R, ou ainda através da manipulação genética
de IL-5 ou IL-5Rα, o papel dos eosinófilos como células efetoras da imunidade
protetora foi bastante conflitante. Desta forma, a redução significativa da
eosinofilia não alterou a carga parasitária e/ou cinética da infecção promovida por
T. spiralis (Herndon & kayes 1992, Hokibara et al. 1997) e Nippostrongylus
brasiliensis (Coffman et al. 1989). Por outro lado, eosinófilos produzindo IL-4 foram
ativamente recrutados para o local de migração da larva no pulmão (Voehringer et
al. 2004) durante a infecção por N. brasiliensis.
A infecção experimental por S. stercoralis em camundongos tem
demonstrado que a destruição de larvas do parasito é dependente da produção de
IL-5 e consequentemente de eosinofilia (Rotman et al. 1996). Outros trabalhos
confirmam a participação do eosinófilo como a principal célula efetora responsável
pela morte de larvas de S. stercoralis do pulmão de camundongos (Herbert et al.
2000). A possível participação de eosinófilos no mecanismo de controle de
Strongyloides também foi sugerida em ratos ou em camundongos previamente
expostos ao S. ratti e ao S. venezuelensis que apresentaram eosinofilia precoce e
redução da carga parasitária de vermes adultos, redução de ovos eliminados nas
fezes e diminuição do tempo necessário para a eliminação do parasito (Dawkins et
al. 1980; Sato & Toma 1990; Fernandes et al. 2008).
Apesar da ampla utilização de camundongos geneticamente deficientes na
produção de IL-5 ou protocolos de neutralização desta citocina em modelos
experimentais, a associação ou não de eosinófilos com proteção ou patologia
43
nestes modelos é definitiva, pois a manipulação desta citocina pode interferir em
outros elementos da resposta imunológica além da diferenciação de eosinófilos
propriamente dita. Por exemplo, camundongos geneticamente deficientes na
produção de IL-5 apresentam menos linfócitos B1 (CD5+) na cavidade peritoneal e
na mucosa intestinal (Kopf et al. 1996). Outra consideração importante é que na
ausência de IL-5, apesar da significativa redução na diferenciação de eosinófilos,
outras citocinas e quimiocinas, como GM-CSF, IL-3 e eotaxina, podem atuar na
diferenciação e migração destas células. Além disso, ha uma pequena população
de eosinófilos que se desenvolvem e funcionam na ausência de receptores
funcionais para IL-5, GM-CSF e IL-3 (Nishinakamura et al.1996). Devido a estes
questionamentos, Yu et al. (2002) desenvolveram a linhagem de camundongos
BALB/c com deficiência completa e seletiva na diferenciação de eosinófilos,
denominados ∆dblGATA. O fator de transcrição GATA-1 expresso em quatro
linhagens hematopoiéticas (eritrócitos, megacariócitos, mastócitos e eosinófilos)
reprograma
células
mielóides
para
3
diferentes
linhagens:
eritrócitos,
megacariócitos e eosinófilos. A atividade especifica de GATA-1 para eosinófilos
parece ser mediada por um sitio duplo de alta afinidade, sendo que a deleção
deste sítio de ligação no promotor GATA-1 leva a perda seletiva de eosinófilos in
vivo (Du et al. 2002). Trabalhos preliminares do nosso grupo de pesquisa
utilizando esses camundongos ∆dblGATA demonstram que os camundongos
seletivamente deficientes na maturação de eosinófilos apresentam carga
parasitária elevada e atraso na expulsão de S. venezuelensis quando comparados
com os controles selvagens, o que sugere que o eosinófilo é uma importante
44
célula na resposta inata ao S. venezuelensis (Pereira 2008). Ainda no nosso grupo
de pesquisa, utilizando-se camundongos ∆dblGATA, foi demonstrado que no caso
de re-infecções por S. venezuelensis, os eosinófilos não possuem papel essencial
no estabelecimento de uma resposta imunológica protetora do tipo Th-2
(Eschenazi 2008).
Atualmente ficou estabelecida a importância da resposta imune do tipo 2 na
indução de macrófagos alternativamente ativados - AAMs (Jenkins et al. 2010;
Herbert et al. 2009; Smith et al. 2007; Siracusa et al. 2008). Até recentemente,
macrófagos estavam associados quase que exclusivamente a resposta imune do
tipo-1 promovida principalmente por parasitos intra-celulares, tendo papel
secundário em comparação ao papel de eosinófilos, basófilos e mastócitos
durante a infecção por nematódeos. No entanto, estudos têm demonstrado que na
presença de IL-4 e IL-13 os macrófagos são ativados de maneira alternativa em
comparação à ativação de macrófagos mediada por IFN-γ em um ambiente de
citocinas Th1. Originalmente descritos como macrófagos alternativamente
ativados por IL-4/IL-13 como oposição a clássica combinação de IFN-γ e LPS, os
AAMs são também referidos como células M2 (Martinez, et al. 2008). Podem ser
distinguidos pela alta expressão de ARG1, Ym-1, RELM-α ou (Fizz1), IL-4 receptor
α (IL-4R α), receptor de manose (CD206) e pela ausência da expressão de óxido
nítrico sintase indutível (iNOS) (Anthony et al. 2007). Os macrófagos M1 e M2
também apresentam diferenças funcionais e efetoras, sendo que nos macrófagos
M1 a presença de IFN-γ induz a expressão da enzima iNOS que metaboliza
arginina resultando na produção de NO e citrulina. Entretanto, a estimulação de
45
macrófagos na presença de IL-4 leva a expressão de arginase 1, que metaboliza
arginina formando prolina que é utilizada para produção de colágeno (Bogdan
1991; Mosser 2003; Bronte et al. 2003).
Como a ativação de AAMs é dependente da estimulação da via IL-4RαSTAT6 e como a produção de IL-4 e IL-13 são induzidas durante a infecção por
nematódeos intestinais, trabalhos vêm sendo realizados para se investigar o papel
de AAMs na proteção ou na patologia promovida pela infecção por diferentes
nematódeos. Zhao et al. (2008), investigaram o papel de macrófagos no
mecanismo de controle da infecção por N. brasiliensis em camundongos. Os
autores verificaram que a infecção pelo nematódeo acarreta em aumento de
AAMs, e a depleção destas células, através do tratamento de camundongos com
lipossomas contendo clodronato, resulta em bloqueio da hiper-contratilidade do
músculo liso intestinal com consequente prejuízo da eliminação do parasito.
Outros autores, como Anthony et al. (2006), também demonstraram que a indução
da produção de IL-4 pela infecção experimental por H. polygyrus resultou em
diferenciação localizada de AAMs, que prejudicaram a sobrevivência das larvas do
parasito através de uma via dependente de arginase. Macrófagos alternativamente
ativados também produzem uma família de proteínas rica em cisteína denominada
de RELM (resistin-like molecules) ou FIZZ (Found in Inflammatory Zone). Entre
elas RELM-α/Fizz-1 e RELM-β/FIZZ2 tem sido melhor estudada, sendo
evidenciado que estas proteínas potencializam a resposta Th-2 e podem participar
de mecanismos protetores induzidos durante a infecção por T. spiralis, N.
brasiliensis e T. muris (Knight et al. 2004; Nair et al. 2005; Wang et al. 2005).
46
Trabalhos (Artis et al. 2004) demonstraram indução de RELM-β/FIZZ2 por
células
caliciformes
após
a exposição
do hospedeiro a
três
espécies
filogeneticamente distintas de nematódeos (T. spiralis, T. muris, e N. brasiliensis) a
expressão de RELM-β foi coincidente com a produção de citocinas Th2 e
imunidade protetora pelo hospedeiro, enquanto a produção de citocina Th1 (IFN)
inibiu a expressão de RELM-β e favoreceu a cronicidade da infecção. Artis et al.
(2004) observaram que a indução de RELM-β foi equivalente entre camundongos
selvagens e camundongos geneticamente deficientes da produção de IL-4 (IL-4-/-)
infectados pelos nematódeos e que, diferentemente, camundongos deficientes do
receptor de IL-4 (IL-4Rα-/-) apresentaram mínima indução de RELM-β e
desenvolveram infecções persistentes, demonstrando um papel direto de IL-13 na
expressão ótima de RELM-β. Os autores também demonstraram que RELM-β se
liga a sensores químicos de nematódeos e inibe a função quimiotática do parasito
in vitro, sugerindo que proteínas RELM-β derivadas de células caliciformes podem
ser consideradas como uma nova molécula efetora imune indutora de citocinas
Th2 na infecção por diferentes nematódeos (Artis et al. 2004). Mais recentemente,
Herbert e colaboradores (2009) verificaram que a imunidade conferida por RELMβ acontece independente da participação de células T ou B, da ativação
alternativa de macrófagos e de aumento da permeabilidade intestinal. Finalmente,
também tem sido demonstrado que AAMs e células epiteliais estimuladas por IL13 podem produzir quitinases, que poderiam afetar a remodelação tecidual, mas
também podem hidrolizar quitina constituinte da cutícula de nematódeos (Nair et
al. 2006). Desta forma, os dados até então presentes na literatura, sugerem um
47
papel relevante de AAMs na resposta imune protetora promovida contra diferentes
espécies de nematódeos. Entretanto, as atenções ainda não foram voltadas no
sentido de ressaltar o papel de AAMs frente à infecção por Strongyloides ssp.
2.5 Participação das citocinas IL-33, IL-4 e IL-13 na resposta
imune induzida por nematódeos.
A indução das alterações envolvidas no controle das infecções provocadas
por nematódeos parasitos, como mastocitose, eosinofilia, produção de anticorpos,
e ativação de macrófagos M2 são controladas por citocinas. As citocinas são
polipeptídeos de baixo peso molecular, secretadas pelos leucócitos e por uma
variedade de outras células. As citocinas apresentam ações pleiotrópicas e
redundantes, características estas que lhes permite atuarem em diferentes tipos
celulares produzindo diferentes efeitos. Quando se faz o bloqueio de uma citocina
em particular, raramente ocorre um efeito biológico exacerbado, pois diferentes
citocinas apresentam ações semelhantes. As citocinas atuam por meio de uma
rede bastante complexa, que envolve a interação com seus receptores específicos
os quais podem apresentar alta afinidade pelo seu ligante.
A família de citocinas IL-1 compreende citocinas pró-inflamatórias
extremamente potentes, capazes de influenciarem uma grande variedade de tipos
celulares. Esta família inclui as citocinas IL-1α, IL-1β , IL-18 que desempenham
papéis fundamentais na resposta inicial imediata frente a invasão de patógenos.
Na verdade, a desregulação dessas citocinas e a cascata inflamatória resultante
podem ter diversos efeitos patológicos (Dinarello, 2000; Dinarello, 1996).
48
Recentemente, esta família de citocinas tem sido estendida, principalmente pela
descoberta de uma nova citocina, Interleucina 33 (IL-33), identificada por Schmitz
e colaboradores, em 2005, como uma citocina produzida por diversos tipos
celulares, como fibroblastos, células epiteliais, células endoteliais e células
dendríticas (Schmitz et al. 2005; Gadina et al. 2007; Liew et al. 2010). O receptor
de IL-33 (IL-33R) é formado por um complexo heterodimérico composto de
proteínas ST2 e proteínas acessórias de IL-1R (IL-1RAcP) (Chackerian et al.
2007; Ali et al. 2007). IL-1RAcP é um componente do receptor compartilhado para
as citocinas IL-1α, IL-1β, IL-1F6, IL-1F8 e IL-1F9 (O`neill 2008; Arend et al. 2008;
Dinarello et al. 2008). O receptor ST2 é expresso em mastócitos, em células T do
tipo 2 (Xu et al. 1998; Lohning et al. 1998), em nuócitos, em células auxiliares
naturais (Coffman 2011) e tem sido associado à resposta imune Th2 (Coyle et al.
1999; Townsend 2000). IL-33 estimula a produção de IL-13 em nuócitos (Allen &
Maizels 2011) e em mastócitos provenientes de populações humanas e murinas
independente da sinalização pelo receptor de IgE (FcεRI) (Likura et al. 2007; Ho et
al. 2007) e pode operar em colaboração com Linfopoietina estromal tímica (TSLP),
citocina produzida por células epiteliais intestinais, sobre mastócitos para
maximizar a produção citocinas e quimiocinas Th2 (Allakhverdi et al. 2007). Da
mesma forma, IL-33 tem sido descrita como uma citocina quimioatrativa para
células Th2 (Komai-Koma et al. 2007), nuócitos e como indutora destas células,
aumentando a produção de IL-4, IL-13 e IL-5.
A indução precoce e eficiente da resposta imune do tipo-2 é essencial para
o controle de helmintos intestinais. Uma vez estabelecida, esta resposta imune
49
polarizada ativa uma série de mediadores anti-parasitários que alteram
radicalmente o nicho da mucosa, permitindo a expulsão de uma variedade de
parasitos que habitam o intestino (Cliffe & Grencis 2004). Entretanto, a ponte entre
a invasão do parasito extracelular e a conseqüente geração de uma resposta
polarizada Th2 adaptativa é pouco definida. Trabalhos recentes (Yasuda et al.
2012; Bartemes et al. 2012) têm demonstrado IL-33 como uma possível ligação
entre a imunidade inata e adaptativa frente à infecção por nematódeos intestinais.
Humphreys e colaboradores (2008) demonstraram que IL-33 é produzida muito
precocemente durante a infecção por T. muris e que um excesso desta citocina é
um componente indutor da imunidade adaptativa para este parasito. Mais ainda,
os autores constataram que IL-33 está envolvida no aumento da patologia
promovida pelo parasito independentemente de células T. Em conjunto, estes
dados ilustram que IL-33 desempenha duas funções independentes no contexto
da infecção por T. muris, proporcionando primeiramente um impulso inicial para o
desenvolvimento de uma resposta Th2 polarizada frente à infecção e,
posteriormente, agindo no local da infecção como uma citocina pró-inflamatória
independente de linfócitos T influenciando a resposta inflamatória tecidual
intestinal. Estas observações sugerem que IL-33 via ativação de ST2 contribui
para a indução de eosinofilia frente a infecção por N. brasiliensis mas não contribui
para a proteção contra o nematódeo. Apesar das crescentes investigações do
papel de IL-33 em infecções por nematódeos, até o momento não foram
registrados dados sobre o envolvimento de IL-33 frente a infecção por
Strongyloides ssp.
50
A IL-4 é principalmente produzida por células T do tipo 2, basófilos,
mastócitos e eosinófilos. IL-4 tem sido descrita como o principal estímulo para o
desenvolvimento de células Th2 a partir de células TCD4+ virgens e também,
como o principal estímulo para a produção de anticorpos IgE (Grünig et al. 1998;
Wills-Karp et al. 1998). IL-13 é uma citocina de 17 kDa que desempenha um papel
fundamental na patogênese da asma, em respostas alérgicas e em infecções
helmínticas. Esta citocina é secretada principalmente por células TCD4+ do tipo
Th2 e também por células NK, células do músculo liso, eosinófilos, mastócitos e
basófilos (Barner et al. 1998; Emson et al. 1998; Gessner at al. 2005; Anthony et
al. 2007).
Recentemente foi descoberto um novo tipo celular que devido à intensa
expressão de IL-13, recebeu o nome de nuócitos em referência à 13ª letra do
alfabeto grego, nu. Neste trabalho Neill e colaboradores (2010) isolaram
definitivamente essa população e a caracterizaram fenotipicamente, definido-a
como uma população de células não T não B (NTNB), CD45+; MHCII+; ICOS+; IL17BR+; IL-7Rα+; IL-33R+; IL25R+. Além disso, a análise do transcriptoma feita por
“microarrays” permitiu diferenciá-la de outras populações celulares da linhagem
leucocitária. Dessa forma, os nuócitos foram classificados como uma nova
população efetora inata, primeira produtora de citocinas da resposta imunológica T
do tipo 2 e, portanto, chave para a polarização das células TCD4+ (Neill et al.
2010).
Sendo assim, os nuócitos além de representarem um elo entre a resposta
imune inata e adaptativa, no momento da invasão do intestino pelo nematódeo,
quando as células epiteliais sensibilizadas secretam IL-25 e IL-33, os nuócitos
51
respondem rapidamente, secretam citocinas e propiciam uma geração de resposta
imunológica rápida e eficiente, que acarreta na eliminação do verme. Dessa forma,
a coordenação da resposta imunológica tipo 2 pelos nuócitos também pode
prevenir danos e patologias causadas por respostas inflamatórias exacerbadas
(Allen & Maizels 2011; Neill & McKenzie 2011). Trabalhos recentes demonstraram
que na ausência combinada de IL-25 e IL-33 os nuócitos falham em proliferar
frente a infecção experimental por N. brasiliensis, prejudicando a eliminação do
parasito (Neill et al. 2010). A participação de nuócitos em infecções por
nematódeos até o momento só foi investigada para N. brasiliensis, desta forma,
ainda é desconhecido o mecanismo de ação desta célula frente a infecção por S.
venezuelensis.
IL-13 foi primeiramente reconhecida pelos seus efeitos sobre células B e
monócitos, e também pelo aumento da expressão de MHC de classe II, pela
mudança de isotipo de células B para IgE e pela inibição da produção de citocinas
inflamatórias. Inicialmente, pensou-se que IL-13 era uma citocina com efeitos
redundante aos de IL-4, no entanto, estudos demonstraram que IL-13 possui
várias funções efetoras únicas que a distingue de IL-4 (Wynn 2001). No pulmão,
IL-13 é o mediador central da asma alérgica, onde regula a inflamação
eosinofílica, a secreção de muco e a hiperresponsividade das vias aéreas (Mitchell
et al. 2010). IL-13 também possui grande relevância na participação de
mecanismos de defesa contra helmintos e tem sido considerada como um potente
mediador de fibrose tecidual principalmente na esquistossomose e na asma, o que
indica que IL-13 é um regulador chave da matriz extracelular. Dentre os
mecanismos que regulam a produção de IL-13 e/ou função, sabe-se que IL-4, IL52
12, IL-18, IFN-γ, IL-10, TGF-β, TNF-α, e o complexo de receptores de IL-4 e IL-13
desempenham papéis importantes (Wynn 2001; Mitchell et al. 2010).
Os efeitos biológicos de IL-4 e/ou IL-13 são exercidos através de sua
ligação aos receptores expressos na superfície de várias células. Há três tipos de
receptores que se ligam a IL-4 e/ou a IL-13. O receptor tipo 1 é composto pela
cadeia α do receptor de IL-4 (IL-4Rα1) e pela cadeia gama (γ). Este receptor,
expresso em células hematopoéticas, é ativado exclusivamente pela ligação com
IL-4, induzindo a produção do fator de transcrição STAT6, estando relacionado
com a diferenciação e expansão da população de células Th2 CD4+. Já o receptor
tipo 2 é composto das cadeias IL-4Rα e IL-13 Rα1. O receptor do tipo 2 é
expresso principalmente em células não hematopoéticas, mas também em
algumas células de origem hematópoéticas, sendo capaz de ligar-se tanto a IL-4
quanto a IL-13 (Finkelman et al. 2004; Ramalingam et al. 2008; Anthony et al.
2007). A ligação da IL-4 ao receptor tipo1 ou tipo 2, e da IL-13 ao receptor tipo 2,
leva à fosforilação da IL-4 α1 e à ativação do fator de transcrição nuclear STAT6
(Morimoto et al. 2006). Entretanto, a fosforilação de Jak2 (proteína pertencente à
família das Janus quinase) tem sido associada ao receptor IL-4α1 e a fosforilação
de Tyk2 (Tirosina quinase 2) ao receptor IL-13α-1. Embora STAT6 seja uma
tirosina importante na cascata de sinalização de IL-13, trabalhos mostram a
participação de outras tirosinas que também são fosforiladas e ativadas em
resposta a IL-13 como, por exemplo, STAT1, STAT3 e STAT5 (Bhattacharjee et al.
2006; Roy et al. 2002). Assim, a estimulação do receptor do tipo 2 por diferentes
citocinas, IL-4 ou IL-13, pode resultar em resposta funcional diferenciada. Outro
53
receptor, formado por IL-13Rα2, liga-se a IL-13 com alta afinidade, mas atua
independentemente de STAT6; a ação deste receptor permanece incerta. Há
alguns trabalhos mostrando que ele inibe a ação da IL-13 in vivo (Wood et al.
2003; Chiaramonte et al. 2003) pois a região citoplasmática de IL-13Rα2 não
apresenta seqüência de sinalização intracelular.
Com os dados apresentados fica evidente que, apesar de IL-4 e IL-13
compartilharem muitas propriedades biológicas, a existência de receptores
comuns e específicos de cada citocina resulta na indução de propriedades
específicas de IL-4 e outras de IL-13, que podem estar diferentemente associadas
à imunidade protetora e/ou a imunopatologia promovida por diferentes espécies de
parasitos. Nesse sentido, trabalhos têm demonstrado que IL-4 estimulando o
receptor tipo II foi essencial para a eliminação de N. brasiliensis do intestino
enquanto, o desenvolvimento de fibrose, secreção de muco e hiper-reatividade
brônquica induzida por alérgenos tem sido associado com mecanismos
dependentes da ativação de IL-13Rα1(Ramalingam et al. 2008). Associado a
estes dados, sabe-se que embora nematódeos possam promover uma resposta
predominantemente tipo Th2, o mecanismo responsável pela eliminação dos
vermes pode ser diferente para cada espécie, possivelmente refletindo o micro
ambiente do hospedeiro ocupado pelo parasito, sua fonte alimentar e possíveis
mecanismos de evasão desenvolvidos por cada espécie de nematódeo
(Finkelman et al. 1997; Negrão-Corrêa 2001; Finkelman & Urban 2001; Onah &
Nawa 2000; Lawrence 2003). Especificamente, na infecção por H. polygyrus, uma
espécie de nematódeo que habita a mucosa do intestino delgado durante o seu
54
desenvolvimento foi demonstrado que IL-4, mas não IL-13 foi requerido para a
eliminação do parasito (Lawrence et al. 1998). Neste hospedeiro, IL-4 promove
formação de granuloma e ativação alternativa de macrófagos com conseqüente
produção de arginase (Anthony et al. 2006). Ao contrário, IL-13 e não IL-4 foi
crucial para eliminação de N. brasiliensis (Urban et al. 1998), nematódeo com ciclo
pulmonar que posteriormente se estabelece na luz do intestino delgado. Neste
hospedeiro, a expulsão de vermes adultos é dependente da ativação do receptor
de IL-4 do tipo 2 presente em células do epitélio intestinal através da ligação de IL13, induzindo a secreção de moléculas resistina-like (RELM) β por células
caliciformes prejudicando a nutrição dos parasitos (Herbert et al. 2009). Por outro
lado, tanto IL-13 como IL-4 são necessários para eliminação de Trichuris muris,
que vivem na camada epitelial do ceco (Bancroft et al. 1998) e Trichinella spiralis,
que habita o epitélio do intestino delgado (Finkelman et al. 2004). Em T. muris, a
renovação de células epiteliais estimulada por IL-4 e IL-13 favorece o
desalojamento do parasito (Cliffe et al. 2005). Já na infecção por T. spiralis IL-4 e
IL-13 aumentam a sensibilidade celular local aos mediadores de mastócitos
interferindo na sobrevivência dos parasitos (Urban et al. 2000).
A infecção por S. venezuelensis em camundongos geneticamente
deficientes na produção de IL-12 resultou em aumento na indução de IL-13 bem
como de IL-10 e não alterou o perfil de migração e eliminação dos vermes. Em
contraste, animais geneticamente deficientes na produção da cadeia α do receptor
de IL-4 (IL-4Rα-/-) ou no fator STAT6-/- não são capazes de eliminar a infecção por
S. venezuelensis no mesmo período que camundongos não deficientes, apesar de
55
produzirem IL-4 localmente (Negrão-Corrêa & Teixeira 2006; Negrão-Corrêa et al.
2006). Um grande retardo na eliminação de S. venezuelensis também foi relatado
por Sasaki et al. (2005) em camundongos STAT6-/-, sendo associado a um atraso
na ativação de mastócitos intestinais.
Visto que as citocinas não atuam diretamente nos parasitos, é necessário
entendermos os possíveis mecanismos imunológicos induzidos pela produção de
IL-4 e/ou IL-13 e IL-33 responsáveis pela proteção do hospedeiro contra infecções
por nematódeos, levando-se em consideração que alguns mecanismos possam
atuar de maneira protetora para algumas espécies e não para outras. Considerando
que os mecanismos imunológicos que regem a participação de IL-4, IL-13 e IL-33
na interação do Strongyloides com o hospedeiro ainda não estão perfeitamente
esclarecidos, pretende-se, neste estudo, utilizar camundongos geneticamente
deficientes de IL-4, neutralização de IL-13 e administração exógena de IL-33 para
investigar o papel destas citocinas no processo de eliminação do parasito e de
alterações imunológicas promovidas pela infecção e re-infecção.
56
3. JUSTIFICATIVA
57
Na estrongiloidose, alguns hospedeiros desenvolvem infecção assintomática e
crônica, enquanto outros apresentam sintomas leves com cura espontânea, e
outros ainda, a hiper-infecção com doença disseminada. Um dos principais fatores
associados à variação do quadro clínico na estrongilodose humana esta
relacionado com o tipo e intensidade da resposta imunológica induzida pelo
parasito em seu hospedeiro (Grove 1996; Shedding & Johmson1998; Fardet et al.
2007; Said et al. 2007). Apesar da importância da resposta imunológica na
evolução da estrongiloidose, os mecanismos efetores e moduladores que atuam
no controle deste nematódeo ainda não estão esclarecidos e seu conhecimento
poderia ser de grande valia para o desenvolvimento de novas estratégias
terapêuticas. Trabalhos anteriores utilizando infecção experimental de S.
venezuelensis em camundongos geneticamente deficientes na produção da
cadeia α do receptor de IL-4, que impede a expressão do receptor do tipo 1 e do
tipo 2, mostrou que na ausência da ativação via IL-4R-STAT6 há aumento de
carga parasitária, aumento de fecundidade dos vermes e grande atraso na
eliminação dos parasitos (Negrão-Corrêa et al. 2006). Nesta etapa do trabalho,
nosso principal foco foi avaliar os efeitos biológicos exercidos por IL-33, IL-4 e IL13 no desenvolvimento da resposta imune protetora promovida durante a infecção
primária e secundária por S. venezuelensis.
58
4. OBJETIVOS
59
4.1 Objetivo geral
Avaliar a participação das citocinas IL-4, IL-13 e IL-33 na resposta imune
protetora promovida pela infecção por S. venezuelensis.
4.2 Objetivos específicos
I)
Verificar comparativamente o curso da infecção primária e da reinfecção por S. venezuelensis em camundongos IL-4-/-.
II)
Verificar comparativamente o curso da infecção primária por S.
venezuelensis em camundongos tratados com anticorpo neutralizante
de IL-13 ou com IL-33 exógena.
III)
Avaliar a participação da citocina IL-4, IL-13 e IL-33 nos níveis de IgM e
IgG1 parasitos reativos e na produção de IgE total induzida pela
infecção por S. venezuelensis.
IV)
Avaliar a participação da citocina IL-4 e IL-13 na infiltração de
eosinófilos e neutrófilos induzida pela infecção por S. venezuelensis.
V)
Avaliar a o papel de IL-4 na indução de células T CD4+ com perfil efetor
e regulador e na produção intracitoplasmática de citocinas IL-10 e IFN-γ
no linfonodo mesentérico e na lâmina própria de camundongos
infectados e re-infectados por S. venezuelensis.
VI)
Avaliar o papel de IL-4 na produção de citocinas IL-5, IL-10 e IFN-γ no
tecido intestinal de camundongos infectados e re-infectados por S.
venezuelensis.
60
5. METODOLOGIA
61
5.1 Animais
Camundongos C57BL/6 deficientes da produção de IL-4 (IL-4-/-) foram
gentilmente cedidos pelo Dr. João Santana da Silva da USP de Ribeirão Preto
Camundongos BALB/c-IL4tm2Nnt/J (deficientes da produção de IL-4), aqui
referenciados como IL-4-/-, foram obtidos do biotério Cecal - Fiocruz do Rio de
Janeiro. As linhagens de camundongos geneticamente deficientes foram
originalmente obtidas dos biotérios do laboratório Jackson Immuno Research.
Estes animais estão sendo mantidos no biotério do laboratório de Imunologia de
Helmintos do ICB – UFMG. Os respectivos controles, camundongos não
deficientes da mesma linhagem, sexo e idade, foram fornecidos pelo Centro de
Bioterismo (CEBIO) do Instituto de Ciências Biológicas – UFMG. Os animais foram
mantidos em estantes ventiladas contendo gaiolas apropriadas (Alesco série nº
01138) e alimentados com ração granulada para camundongo Nuvilab® (Nuvital
nutrientes Ltda., Paraná, Brasil) e água potável. Foram utilizados animais machos
com cerca de 8 semanas de idade. Os experimentos aqui descritos foram
previamente aprovados pelo Comitê de Ética Animal – UFMG protocolo Nº. 104/7.
5.2 Parasito e infecção
O nematódeo utilizado nos experimentos foi Strongyloides venezuelensis,
parasito isolado inicialmente de Rattus norvegicus (Brener & Chaia 1960) e
mantido no Departamento de Parasitologia, ICB-UFMG, através de infecções
sucessivas em ratos da linhagem Wistar. As larvas filarióides infectantes (L3) de
S. venezuelensis foram obtidas a partir de cultura de fezes de ratos Wistar
62
infectados (entre 10 e 20 dias da infecção). A coprocultura foi realizada
misturando-se as fezes contendo ovos do parasito e vermiculita na proporção de
1:2 e, posteriormente, umedecendo a mistura com água para promover umidade
adequada para a eclosão das larvas. Apos incubação em estufa a 28°C por 72h,
as larvas filarióides foram concentradas pela técnica de Baermann-Morais (Morais
1948) lavadas em solução fisiológica (0,85% NaCl), quantificadas e usadas para
infecção. Esta foi realizada pela inoculação subcutânea, na região abdominal do
hospedeiro, de 100 µl de solução fisiológica contendo 700 L3.
5.3 Obtenção de antígeno solúvel de larva
Larvas infectantes (L3) de S. venezuelensis também foram utilizadas para a
produção de antígeno total de L3. As larvas infectantes foram lavadas com tampão
fosfato – PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 4.3 mM de Na2HPO4 (7 H2O) e
1.4 mM de KH2PO4) e ressuspendidas em PBS contendo um coquetel de inibidor
de protease (1 tablete em 25ml de PBS; Boehringer Mannheim, Indianapolis,
USA). As larvas foram inicialmente rompidas em agitação em vórtex (212-300
microns, Sigma Chemical co., St. Louis, USA) com pérolas de vidro por 15 min. e
posteriormente, foram levadas a um sonicador (PGC Scientific, Gaithersburg Md)
à uma alta potência, onde foram submetidas a 5 ciclos de 30 s. com intervalo de 1
min. entre cada ciclo. Durante todo este processamento, os tubos contendo as
larvas foram mantidos em banho de gelo. O homogenato final foi centrifugado a
7200 x g por 60 min., as proteínas solúveis de larvas filarióides foram recuperadas
63
com o sobrenadante e a concentração de proteínas foi determinada pelo método
de Lowry (1951) antes de serem alíquotas e estocadas à - 20ºC.
5.4 Delineamento Experimental:
5.4.1 Participação de IL-4 na resposta protetora contra S. venezuelensis.
Camundongos C57BL/6 selvagens (WT) e deficientes na produção da
citocinas
IL-4
(IL-4-/-)
foram
separados
aleatoriamente
em
seis
grupos
experimentais (WT e IL-4-/- re-infectados, WT e IL-4-/- infectados e WT e IL-4-/controles). Os grupos de animais re-infectados eram compostos por 24
camundongos, sendo 12 WT e 12 IL-4-/-, os grupos de animais infectados eram
compostos por 72 camundongos, sendo 36 WT e 36 IL-4-/- e os grupos de animais
controles eram compostos por 12 camundongos, sendo 6 WT e 6 IL-4-/-. Os
animais dos grupos re-infectados sofreram a primeira infecção com 700 larvas
infectantes por animal 15 dias antes da re-infecção (designado como dia -15).
Para garantir que a infecção primária por S. venezuelensis havia sido eliminada
pelo hospedeiro, cada animal infectado foi individualmente tratado com
Cambendazol (Cambem, Uci-farma, São Paulo), na dose de 1,2 mg/camundongo
administrado por via oral após 12 e 13 dias da infecção primária, conforme
anteriormente padronizado (Grove & Northern 1989). Após 15 dias da infecção
estes animais foram re-infectados, juntamente com o grupo de infecção primária,
com 700 larvas infectantes do parasito (designado como dia zero). Aos 2, 7,
10,14,18 e 24 dias após a infecção primária e aos 2 e 7 dias após a re-infecção
seis camundongos de cada grupo experimental (WT e IL-4-/-) foram sacrificados
64
para avaliação da carga parasitária e quantificação de aspectos da resposta
imunológica (Fig. 1). Os controles não-infectados foram sacrificados ao final do
procedimento experimental. Os animais foram sacrificados com inoculação intraperitoneal de dose letal de anestésico e analgésico, contendo ketamina (Dopalen,
Sespo Indústria e Comércio LTDA/ Divisão Saúde Animal - Vetbrands) na dose de
80mg/Kg e xilazina (Kensol, Laboratórios Köing S.A.) na dose de 16 mg/Kg. Para
cada animal experimental necropsiado foi coletado sangue para avaliação da
resposta imune humoral, o pulmão, a metade proximal do intestino delgado e as
fezes para a quantificação da carga parasitária. Amostras da metade distal do
intestino delgado de cada animal foram separadas e imediatamente congeladas
para a quantificação da atividade de peroxidase de eosinófilo e mieloperoxidase
(EPO e MPO) e da concentração de citocinas conforme detalhado na figura 1.
A avaliação parasitológica também foi realizada em camundongos BALB/c
deficientes na produção de IL-4 (BALB/c IL-4-/-) e seus controles não deficientes
através de exame parasitológico de fezes em diferentes períodos após infecção e
re-infecção. Estes animais também foram utilizados para fenotipagem de linfócitos
recolhidos da lâmina própria e do linfonodo mesentérico e para a avaliação de
citocinas em camundongos infectados e controles aos 7 dias após infecção e reinfecção por S. venezuelensis (fig. 2).
65
Figura 2 - Delineamento
experimenta
experimental da participação de IL-4
4 na carga parasitária e
na resposta imune frente a infecção primária e secundária por S. venezuelensis
em camundongos C57BL/6.
66
- Delineamento experimental da participaç
participação de IL-4
4 na carga parasitária,
na indução de células TCD4+ e na produção de citocinas frente a infecção primária
e secundária por S. venezuelensis em camundongos BALB/c.
Figura 3
67
5.4.2 Participação de IL-13 no mecanismo de proteção promovido pela
infecção por S. venezuelensis.
A participação de IL-13 no mecanismo de proteção induzida por S.
venezuelensis foi avaliada através da neutralização, in vivo, desta citocina pela
inoculação de anticorpo neutralizante produzido em coelhos imunizados com IL-13
(R & D Systems) recombinante murino (Matsukawa et al. 2000). O reagente foi
gentilmente cedido pelo Dr. Cory M. Hogaboam da Universidade de Michigan e foi
utilizado na dosagem padronizada em trabalhos anteriores para neutralização de
IL-13 in vivo (Blease et al. 2001). Para os experimentos foram utilizados
camundongos C57BL/6 machos separados aleatoriamente em seis grupos
experimentais com seis camundongos: WT infectado e tratado com anti-IL13, IL-4/-
infectado e tratado com anti-IL13, WT infectado e submetido ao tratamento
controle, IL-4-/- infectado e com tratamento controle e os animais WT e IL-4-/- não
infectado e não tratados. Os quatro primeiros grupos experimentais foram
infectados por via subcutânea com 700 L3 de S. venezuelensis no dia zero. Aos 4,
6, 8, 10 e 12 dias após a infecção, os animais tratados receberam uma inoculação
intra-peritoneal de 0,2 ml de anti-IL-13 e os submetidos ao tratamento controle
foram inoculados com soro de coelho normal. No 14° dia após a infecção, os
animais de todos os grupos experimentais (incluindo os não-infectados) foram
anestesiados e sacrificados para coleta de sangue (utilizado na avaliação da
resposta imune humoral), do intestino delgado e das fezes (utilizado para a
avaliação da carga parasitária e atividade de EPO e MPO) semelhante ao descrito
no experimento anterior (figura 3).
68
- Delineamento experimental da participação de IL-13
IL
na carga parasitária
e na resposta imunológica frente a infecção primária por S. venezuelensis.
venezuelensis
Figura 4
69
5.4.3 Participação de IL-33 no mecanismo de proteção promovido pela
infecção por S. venezuelensis.
A participação de IL-33 na resposta imune induzida pela infecção por S.
venezuelensis foi avaliada a partir da inoculação de IL-33 recombinante in vivo. O
reagente foi produzido conforme previamente descrito por Komai-Koma e
colaboradores (2007) e gentilmente cedido pelo Dr. Foo Y. Liew da Universidade
de Glasgow. Para os experimentos foram utilizados camundongos BALB/c machos
deficientes e não deficientes na produção de IL-4. Os camundongos foram
separados aleatoriamente em cinco grupos experimentais com seis camundongos:
WT infectado e tratado com rIL-33, BALB/c IL-4-/- infectado e tratado com rIL-33,
WT infectado e não tratado, BALB/c IL-4-/- infectado e não tratado e os animais
não infectado e não tratados. Os quatro primeiros grupos experimentais foram
infectados por via subcutânea com 700 L3 de S. venezuelensis no dia zero. Aos 5,
7 e 9 dia após a infecção, os animais a serem tratados receberam uma inoculação
intraperitoneal de 100 µl de PBS contendo 0,8 µg de IL-33 e os controles não
tratados receberam somente PBS. No 10o dia após a infecção, os animais de
todos os grupos experimentais (incluindo os não-infectados) foram anestesiados e
eutanasiados para coleta de sangue (utilizado na avaliação da resposta imune
humoral), do intestino delgado e de fezes (utilizados para a avaliação da carga
parasitária) conforme detalhado na figura 4.
70
– Delineamento experimental da participação de IL-33
IL 33 na carga parasitária
e na resposta imunológica frente a infecção primária por S. venezuelensis.
venezuelensis
Figura 5
71
5.5 Avaliação parasitológica da infecção
A avaliação da infecção por S. venezuelensis foi realizada conforme
descrito anteriormente (Silveira et al. 2002; Negrão-Corrêa et al. 2004; Fernandes
et al. 2008). As larvas foram recuperadas do pulmão aos 2 dias após a infecção ou
re-infecção, e os vermes adultos e ovos foram recuperados e quantificados do
intestino delgado e das fezes de camundongos respectivamente aos 7, 10, 14 e 24
dias após a infecção primária e aos 7 dias após a re-infecção. Para a recuperação
de larvas, o lobo direito do pulmão foi picotado e incubado em solução salina por
4h a 37ºC. Para recuperação de vermes adultos de S. venezuelensis, a metade
anterior do intestino delgado dos animais foi aberta longitudinalmente e incubada
em solução salina por 4h a 37ºC. Os vermes foram quantificados com auxilio de
microscópio estereoscópico. O número de ovos foi quantificado após pesagem
das fezes e posterior diluição em volume conhecido de solução fisiológica
contendo 10% de formalina. O número de ovos por grama de fezes dividido pelo
total de fêmeas adultas recuperadas deste mesmo animal forneceu o valor da
fecundidade destes vermes. A metade posterior do intestino delgado foi
armazenada a -70ºC para realização dos procedimentos imunológicos, como
dosagem de citocinas e atividade enzimática - peroxidase de eosinófilo (EPO) e
mieloperoxidase de neutrófilo (MPO).
72
5.6 Obtenção do homogenato tecidual intestinal
O homogenato intestinal foi obtido pela maceração de 100 mg de tecido em
um homogeniazador de tecidos (Power General 125; Fisher Scientific, Pittsburgh,
PA) na presença de 1 mL de PBS contendo 0,05% de Tween 20, 0,5% de
albumina de soro bovino e inibidores de proteases (0,1 mM de fluoreto de
fenilmetilsulfonila; 0,1mM de cloreto benzetônico; 10 mM de EDTA e 20 Ul de
aprotinina). O homogenato resultante foi centrifugado (3000 x g a 4°C), o
sobrenadante foi recolhido e estocado a -70ºC para a posterior dosagem de
citocinas. O sedimento obtido foi dividido e processado para quantificação de EPO
e MPO.
5.7 Avaliação indireta da infiltração de Eosinófilos e Neutrófilos
no tecido
A infiltração e/ou ativação de eosinófilos e neutrófilos no parênquima
intestinal foi indiretamente estimada através da atividade enzimática destas
células. Para eosinófilos, foi quantificado a atividade de peroxidase de eosinófilo
(EPO) nos tecidos dos animais infectados e não infectados, conforme
padronização de Strath (1985) detalhadamente descrita com modificações por
Silveira et aI. (2002). Para isso, as hemácias presentes no sedimento obtido do
homogenato tecidual foram lisadas através da adição de solução hipotônica (1,5
ml de solução de NaCI a 0,2 %) e, após 30s, a osmolaridade foi restabelecida pela
adição de igual volume (1,5 ml) de solução 1,6 % de cloreto de sódio contendo 5
73
% de glicose. Após nova centrifugação e descarte do sobrenadante o material foi
ressuspendido
em
tampão
fosfato
contendo
0,5
%
de
brometo
de
hexadeciltrimetilamônio (HTAB), pH 7,4 para Iise das membranas celulares. O
material
foi
então
homogeneizado
e
submetido
a
congelamento
e
descongelamento em nitrogênio líquido por três vezes, com o objetivo de romper
as vesículas que contêm peroxidase. Posteriormente, as amostras foram
centrifugadas a 3000 x g a 4ºC por 10 min. O sobrenadante foi utilizado no ensaio
enzimático, que foi feito da seguinte maneira: 75 µl de cada amostra ou somente
diluente (branco) foram adicionados a placas de 96 poços (Plate Flat Bottom –
SARSTEDT, Inc. USA) juntamente com 75 µl da solução do substrato (tampão trisHCL pH 8,0 contendo 1,5 mM o-fenilenodiamina (OPD) e 6,6 mM de H2O2). Após
30 min. em temperatura ambiente a reação foi interrompida pela adição de 50 µl
de H2SO4 4N. Sequencialmente, a absorbância foi estimada a 492 nm em leitor
para microplacas (Status-Labsystems Multiskan RC, Helsinki, Finland).
A quantificação da atividade de mieloperoxidase foi utilizada como medida
indireta da infiltração e/ou ativação de neutrófilos no intestino. O ensaio foi
conduzido conforme descrito por BAILEY (1988) e detalhado por Barcelos et al.
(2005). O tecido foi processado como descrito anteriormente. Após a lise das
hemácias, as amostras destinadas ao ensaio de MPO foram centrifugadas (3000 x
g a 4°C por 10 min.), o sobrenadante foi desprezado e o sedimento foi
ressuspendido em 200 µl de tampão fosfato (0,1 M NaCl, 0,02 M Na3PO4, 0,015 M
EDTA, pH 4,7). A solução foi homogeneizada e centrifugada (3000 x g por 10 min.
a 4ºC). O pellet foi homogeneizado novamente em tampão de extração (0,05 M
NaPO4 pH 5,4) acrescido de 0,5 % HTAB, seguido de três ciclos de congelamento
74
e descongelamento em nitrogênio líquido. Após tal procedimento, a solução foi
centrifugada por 15 min. a 3000 x g e a 4ºC e o sobrenadante utilizado para
realização do método colorimétrico da seguinte maneira: 25 µL da amostra foram
acrescentados a placas de 96 poços (Plate Flat Bottom – SARSTEDT, Inc. USA)
contendo 25 µL de substrato (3,3’- 5,5’ – tetramethylbenzina – TMB diluído em
dimetilsulfóxido – DMSO na concentração final de 1,6 mM). Em seguida foi feita
uma incubação a 37ºC por 5 min. Após esse período foram adicionados 100µl de
solução contendo 0,5 mM de H2O2 diluído em tampão fosfato (0,05 M de Na3PO4,
pH 5,4 contendo 0,5% de HTAB) seguida por nova incubação a 37ºC por 5 min. A
reação foi interrompida pela adição de 50 µl de H2SO4 1M e quantificada através
da absorbância em leitor para microplacas (Status-Labsystems Multiskan RC,
Helsinki, Finland) em comprimento de onda 450nm.
5.8 Avaliação da produção de citocinas no homogenato intestinal.
O nível das citocinas IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 e IFN-γ presentes no
homogenato intestinal foi quantificado pela técnica de ELISA como anteriormente
descrita (Negrão-Corrêa et al. 2004). Para a quantificação, foram utilizados Kits
para ELISA murino (R & D Systems, Minneapolis, MN, E.U.A.) segundo instruções
do fabricante. As concentrações conhecidas de proteínas recombinantes foram
utilizadas para gerar uma curva padrão para a conversão de leituras de densidade
óptica das amostras para pg/ml.
75
5.9 Avaliação da resposta humoral.
A amostra de sangue dos animais dos diferentes grupos experimentais e
nos diversos dias após infecção ou re-infecção foi recolhida através do plexo
braquial
e
permaneceu
a
temperatura
ambiente
para
coagular,
sendo
posteriormente transferida para 4ºC por aproximadamente 2h para uma maior
retração do coágulo. Posteriormente, as amostras foram centrifugadas a 200 g a
4ºC por 10 min. O soro obtido foi então estocado para posterior avaliação da
resposta humoral.
Para medir a concentração de IgE total no soro dos animais infectados por
S. venezuelensis e dos animais não infectados, foi utilizado um kit comercialmente
disponível (Bethyl Laboratories Inc, Montgomery, TX). De acordo com as
instruções do fabricante, placas de 96 poços (Nunc Maxisorp, Nagle Nunc
International, Rochester, NY, USA) foram sensibilizadas com anticorpo purificado
anti-IgE de camundongo. Entre cada etapa de incubação as placas foram lavadas
5 vezes com tampão Tris-NaCl (Tris 50 mM, NaCl 0,14M). Após bloqueio da placa
com tampão Tris-NaCl acrescido de 1% de albumina bovina (BSA- Sigma), as
amostras de soro diluídas 1:200 (tampão Tris-NaCl contendo 0,1% BSA) ou
amostras com concentrações conhecidas de IgE purificada para curva padrão
foram aplicadas à placa e incubadas por 1 h. a temperatura ambiente. Após a
aplicação das amostras e da curva padrão foi adicionado à placa o anticorpo de
detecção (anti-IgE de camundongos, obtida de cabra, conjugada a HRP) e em
seguida foi feita a aplicação de solução reveladora (4mM OPD, contendo peróxido
de hidrogênio em 0,05 M de tampão citrato, pH 5). A reação foi interrompida com
76
4N H2SO4 e a leitura da reação foi realizada em leitor de micro-placas (StatusLabsystems Multiskan RC, Helsinki, Finland) no comprimento de onda de 492 nm.
A concentração de IgE nas amostras foi calculada pela interpolação do resultado
da leitura de absorbância das amostras na curva padrão, sendo a sensibilidade do
teste de 3,9 ng/mL.
A presença de subtipos de IgG (IgG1 e IgG2a) e IgM reativas à antígeno
solúvel de larvas filarióides de S. venezuelensis também foram estimada nos
soros coletados dos animais experimentais. Utilizando-se placas de 96 poços
(Nunc Maxisorp, Nagle Nunc International, Rochester, NY, USA) sensibilizadas
com 100 µL antígeno solúvel de L3 (10 µg/mL) diluído em tampão 0,1M de
Carbonato-Bicarbonato (0,5 M Na2CO3, 0,5M NaHCO3, pH 9,6). Após a
sensibilização da placa e entre cada etapa de incubação as placas foram lavadas
5 vezes com tampão fosfato (PBS – 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 1,4 mM de
KH2PO4 e 4,3 mM de Na2HPO4. 7H2O) contendo 0,5 % de Tween 20.
Posteriormente foi feito o bloqueio das placas com tampão fosfato contendo 1% de
BSA por 1 h a temperatura ambiente seguido da aplicação das amostras de soro
diluídas em PBS contendo Tween 20 (0,5%) acrescido de 0,1% BSA. Para
detecção de IgG1, IgG2a e IgM as amostras de soro foram diluídas na proporção
de 1:100. Após a aplicação do soro, foi adicionado o anticorpo de detecção antiIgG1 (Goat anti Mouse IgG1 affinity purified, Bethyl, Lot. A90-105A-14), anti-IgG2a
(Goat anti Mouse IgG2a affinity purified, Bethyl, Lot. A90-107A-18) ou anti-IgM
(Goat anti-Mouse IgM (µ-chain-specific) - Peroxidase, Sigma. Lot.125K6055)
diluídos em PBS na proporção 1:10000 para IgM e na proporção de 1:1000 para
77
IgG1 e IgG2a. Para detecção de IgG1 e IgG2a foi adicionado anticorpo anti-Ig de
cabra conjugado à peroxidase (1:5000). A revelação das placas foram realizadas
pela adição de substrato (4mM OPD, contendo peróxido de hidrogênio em 0,05 m
Tampão Citrato pH 5) e a reação foi posteriormente interrompida após 30 min.
com 4N H2SO4, a leitura foi realizada em leitor de micro-placas (StatusLabsystems Multiskan RC, Helsinki, Finland) a 492 nm.
5.10 Obtenção de células de linfonodos mesentéricos e lâmina
própria intestinal
Em alguns experimentos (especificado no delineamento experimental), os
camundongos foram sacrificados sob condições estéreis, para retirada de
linfonodos mesentéricos (LNM) e células da lamina própria intestinal (LPMC) que
foram utilizadas para cultura e fenotipagem. Após a retirada, os linfonodos
mesentéricos de cada animal foram macerados através de uma tela de 70 µm com
meio RPMI para se obter uma suspensão celular. A suspensão celular foi
centrifugada (200 x g, 4ºC por 10 min.) e o sedimento de células foi ressuspendido
em meio RPMI 1640 (Sigma, St. Louis MO, USA) contendo 15 mM de Hepes e 24
mM NaHCO3, suplementado com 10% de soro fetal bovino e 60 mg/L de
gentamicina.
Para a obtenção de células da Lâmina Própria (LPMC), a metade anterior
do intestino delgado foi aberta longitudinalmente e lavado com meio RPMI,
conforme metodologia anteriormente descrita por Setiawan e colaboradores
(2007). As placas de Peyer visíveis foram removidas com uma tesoura e o
78
intestino de cada camundongo foi cortado em pedaços de 1 cm e incubado com
35 ml de meio Hank´s livre de cálcio e magnésio contendo 0,5 mM de EDTA por
20 min. Após este período de incubação, o tecido foi lavado com meio RPMI por
duas vezes. Em seguida, o tecido foi incubado por 20 min. a 37°C em 20 mL de
RPMI contendo 10% de soro fetal bovino, 25 mM de Hepes, 2mM de L-glutamina,
5 x 10-5 M de β-mercaptoetanol, 1mM de piruvato de sódio, 100 U/mL de
penicilina, 5 mg/mL de gentamicina, 100 mg/mL streptomicina e 1mg/mL de
colagenase IA (Sigma). Ao final da incubação, o tecido foi submetido a uma
desintegração mecânica usando uma seringa de 1 mL para remover os debris. A
solução celular foi então filtrada em uma gaze pré-umidecida com RPMI dobrada
em um funil e em seguida foi novamente filtrada em recipiente contendo fibra de
vidro. As células foram então coletadas, lavadas em RPMI e mantidas no gelo até
o momento do uso.
5.11 Avaliação da marcação celular na lâmina própria e no
linfonodo mesentérico
As células obtidas da lamina própria e de linfonodos mesentéricos foram
utilizadas para a avaliação da expressão de antígenos de superfície e produção de
citocinas intracelular por citometria de fluxo conforme detalhado na metodologia
previamente descrita por (Lehmann et al, 2002). As células na concentração de
(1x107 células/ml) foram cultivadas na presença de 25 µg/ml de antígeno L3 por
12 horas em estufa a 37°C e 5% de CO2. Posteriormente, as células foram
incubadas novamente por 4 horas na presença de 1mg/ml de Brefeldina A. Após
79
incubação, as células foram marcadas superficialmente com 0,5 µl de anti-CD4FITC (RM 4-5) (BD Pharmingen) e anti-CD25-PerCP (PC 61) (BD Pharmingen).
Após a marcação de superfície, as células foram fixadas em solução contendo 1:1
de
formaldeído
(4%)
e
PBS
(1x).
Posteriormente,
as
células
foram
permeabilizadas com tampão fosfato (PBS) contendo 0,5% de BSA, 2mM de
Azida e 0,5% Saponina, por 10 min em temperatura ambiente. A marcação
intracelular foi realizada com 0,5 µl de anti-IL10-Alexa 647 (JES5-16E3) (BD
Pharmingen), anti-IL4-PE (11B11) (BD Pharmingen), anti-IFN-γ-PE (XMG1.2) (BD
Pharmingen) e com 0,5 µl de Foxp3 anti-mouse-PE (MF23) (BD Pharmingen)
conforme instruções do fabricante. Após as marcações intracelulares, as células
foram novamente fixadas em solução contendo 1:1 de formaldeído (4%) e PBS
(1x), coletadas e avaliadas por citometria de (BD FACScan™) e posteriormente
analisadas com auxilio do programa Flow Jo (V.7.6.3).
5.12 Análise estatística
Foi realizado o teste de dispersão de dados Bartlett`s (Snedecor & Cochran
1983) para verificar a adequabilidade do uso de um teste paramétrico. Os dados
foram analisados no programa Prisma 4.0 por meio do teste T quando a
comparação era feita somente entre dois grupos experimentais e da análise de
variância (ANOVA) para mais de dois grupos experimentais, seguida pelo teste de
Newman-Keuls, que realiza a comparação entre todos os grupos entre si. Os
resultados foram expressos como média e erro padrão da média (EPM). O
intervalo de confiança foi fixado em 95% e as diferenças foram consideradas
80
significativas para P < 0,05. As diferenças expressas por três asteriscos mostram
p<0.001, as expressas por dois asteriscos p<0.01 e as expressas por somente um
asterisco p<0.05, nas comparações assinaladas.
81
6. RESULTADOS
82
6.1 Avaliação parasitológica
6.1.1 Participação da citocina IL-4 na carga parasitária de camundongos
infectados por Strongyloides venezuelensis
A contagem de larvas do parasito recuperadas do lobo esquerdo pulmonar
dos camundongos no 2° dia após a infecção revelou que a infecção primária por
S. venezuelensis resultou na recuperação de 31,7 ± 2,4 larvas/ lobo pulmonar em
camundongos C57BL/6 não deficientes (WT) e de 50,8 ± 6,2 larvas em
camundongos geneticamente deficientes na produção de IL-4 (IL-4-/-). A análise
dos dados mostra que o número de larvas recuperados do pulmão dos
camundongos IL-4-/- foi estatisticamente maior (p< 0,01) quando comparado com
os camundongos não deficientes (Fig. 5).
83
Larvas/pulmão
90
**
WT
IL-4 -/-
72
54
36
18
0
2 dias após Infecção
Figura 6- Número de larvas recuperadas do lobo esquerdo do pulmão de camundongos
-/C57BL/6 não deficientes (WT) ou geneticamente deficientes na produção de IL-4 (IL-4 ) após
2 dias da infecção por S. venezuelensis. ** P<0,01 na comparação entre camundongos
deficientes e não deficientes no mesmo período. Cada barra representa média ± erro padrão,
n = 6 camundongos por grupo. (Resultados representativos de 2 experimentos).
84
Além do número de lavas recuperadas do pulmão dos animais infectados
também foi quantificado o número de vermes adultos recuperados da metade
anterior do intestino delgado e o número de ovos eliminados nas fezes durante a
infecção dos camundongos. Os dados mostram que em camundongos WT a
infecção primária por S. venezuelensis resultou na recuperação de 191,3 ± 23
vermes sétimo dia da infecção, este número reduz significativamente aos 10 dias
e aos 14 dias de infecção já haviam sido completamente eliminados. Em
camundongos IL-4-/- o número de vermes recuperados no intestino delgado foi
estatisticamente maior que o observado nos animais não deficientes durante todo
o período avaliado, sendo que a partir dos 14 dias de infecção (dpi), período em
que os camundongos WT já haviam eliminado o parasito, os animais deficientes
ainda apresentavam uma média de 193.3 ± 12 vermes e aos 18 dpi foram
recuperados 153 ± 25 vermes no intestino, caindo para 76.25 ± 25 no 24° dia após
a mesma (Fig. 6A).
O perfil de eliminação de ovos nas fezes dos camundongos destes dois
grupos experimentais (IL-4-/- e WT) acompanhou o perfil da eliminação de vermes
no intestino, ou seja, a recuperação de ovos do parasito nos camundongos
deficientes foi estatisticamente mais elevada quando comparada a média de ovos
por grama de fezes obtida nos camundongos selvagens em todos os períodos
examinados (Fig. 6B). A partir dos 14 dias após a infecção primária os
camundongos não deficientes já haviam eliminado completamente o parasito e,
portanto não apresentavam ovos do parasito nas fezes, mas os camundongos
85
deficientes ainda apresentavam uma média de OPG de 33.547 ± 8.450, caindo
para 14.965 ± 4.993 no 18° dpi e para 5.389 ± 3.677 no 24° dpi (Fig. 6B).
A fecundidade das fêmeas foi avaliada através da razão do número de ovos
por grama de fezes pelo número de fêmeas recuperadas do intestino de cada
camundongo. Conforme mostrado na figura 6C, não houve diferença significativa
na fecundidade das fêmeas do parasito provenientes de camundongos selvagens
ou deficientes em cada período avaliado, sugerindo que a elevação no número
total de ovos eliminados nas fezes dos animais IL-4-/- foi conseqüência do
aumento no número de vermes recuperados destes animais.
86
A
*
vermes/intestino
300
***
240
***
*
180
120
WT
60
IL-4 -/-
0
7
ND
ND
ND
14
18
24
10
Dias após infecção primária
B
80000
C
***
350
**
48000
Ovos/fêmea/g
OPG
64000
*
32000
16000
0
7
10
ND
ND
ND
14
18
24
Dias após infecção primária
280
210
140
70
0
7
10
ND
ND
14
18
ND
24
Dias após infecção primária
Figura 7 - Avaliação cinética da carga parasitária no intestino de camundongos C57BL/6 não
-/deficientes (WT) ou geneticamente deficientes na produção de IL-4 (IL-4 ) infectados com 700 L3
de S. venezuelensis aos 7, 10, 14, 18 e 24 dias após a infecção primária. (A) Recuperação de
vermes do intestino em camundongos não deficientes de IL-4 (WT) e em camundongos
-/deficientes IL-4 . (B) Recuperação de ovos por gramas de fezes em camundongos WT e IL4-/-. (C) Fecundidade das fêmeas de S. venezuelensis em camundongos selvagens e
geneticamente deficientes da produção de IL-4. * P<0,05, ** P< 0,01, *** P< 0,001 na
comparação entre camundongos deficientes e não deficientes no mesmo dia da avaliação.
ND = (ausência de detecção). Cada barra representa média ± erro padrão, n = 6
camundongos/grupo. (Dados referentes a média de 2 experimentos).
87
Visto que em determinados procedimentos experimentais também foram
utilizados camundongos BALB/c, avaliamos a cinética da infecção primária nestes
camundongos para verificar se o background do animal experimental utilizado
influencia no perfil de eliminação do parasito. Conforme ilustrado na figura 7,
verificamos que similarmente ao observado para camundongos C57BL/6,
camundongos BALB/c deficientes da produção de IL-4 apresentam níveis
estatisticamente mais elevados de ovos por grama de fezes (OPG) em relação a
camundongos selvagens tanto no sétimo (P<0,05) quanto no décimo (P<0,001)
dia após a infecção e que a partir 14° dia, camundongos selvagens já haviam sido
capazes de eliminarem completamente o parasito, ao passo que camundongos
IL-4-/- ainda continuaram apresentando ovos nas fezes até o 21° dia após a
infecção. Estes resultados demonstram que, apesar do número absoluto de ovos
eliminados ser bastante diferente nas diferentes linhagens de camundongos
examinadas, BALB/c e C57BL/6, a cinética de eliminação dos ovos do parasito em
camundongos BALB/c foi similar ao observado em camundongos C57BL/6.
88
120000
*
OPG
90000
WT
IL-4 _/_
***
60000
30000
**
ND
0
7
10
14
ND
18
21
Dias após infecção primária
Figura 8 – Avaliação da eliminação de ovos no intestino de camundongos BALB/c não deficientes
-/(WT) ou geneticamente deficientes na produção de IL-4 (IL-4 ) infectados com 700 L3 de S.
venezuelensis aos 7, 10, 14, 18 e 21 dias após a infecção primária. Recuperação de ovos por
-/gramas de fezes em camundongos WT e IL-4 . * P<0,05, ** P<0,01, *** P< 0,001 na
comparação entre camundongos deficientes e não deficientes no mesmo dia da avaliação.
ND = (ausência de detecção). Cada barra representa média ± erro padrão, n = 6
camundongos/grupo. (Dados referentes a média de 2 experimentos).
89
6.1.2 Avaliação da participação da citocina IL-4 na infecção secundária por S.
venezuelensis
Após a re-infecção com S. venezuelensis em animais C57BL/6 foi verificado
uma redução estatisticamente significativa (p<0,001) no número de larvas
recuperadas do pulmão. A redução no número de larvas recuperadas do pulmão
durante a re-infecção em relação à infecção primária ocorreu tanto em
camundongos não deficientes como em deficientes na produção de IL-4 (WT reinfectado 7,4 ± 5,9 versus WT infectado 46,8 ± 12,7; IL-4-/- re-infectado 23,8 ± 8,3
versus IL-4-/- infectado 79,8 ± 5,7). Entretanto, animais IL-4-/- apresentaram uma
média de 23,8 ± 8,3 larvas/lobo pulmonar, recuperação estatisticamente maior
(P<0,01) que a observada no grupo de animais selvagem, onde foram
recuperadas 7,4 ± 5,9 larvas por lobo pulmonar (Fig. 8).
90
WT
Larvas/pulmão
40
**
IL-4 -/-
30
20
10
0
2 dias após Re-infecção
Figura 9 - Número de larvas recuperadas do lobo esquerdo do pulmão de camundongos C57BL/6
-/não deficientes (WT) ou geneticamente deficientes na produção de IL-4 (IL-4 ) após 2 dias da reinfecção por S. venezuelensis. ** P < 0,01 na comparação entre camundongos deficientes e
não deficientes no mesmo período. Cada barra representa média ± erro padrão, n = 6
camundongos por grupo. (Dados referentes a média de 2 experimentos).
91
A recuperação de vermes intestinais e ovos eliminados nas fezes de
camundongos C57BL/6 re-infectados por S. venezuelensis revelou ausência de
vermes na mucosa intestinal do hospedeiro não deficiente após 7 dias da reinfecção (dpr), ou seja, neste período os camundongos selvagens que foram reinfectados já tinham sido capazes de eliminar completamente o parasito.
Entretanto, foi possível observar que camundongos IL-4-/- re-infectados pelo
parasito ainda apresentavam uma média de 123 ± 28.62 vermes no intestino aos 7
dpr (Fig. 9A). O número de ovos do parasito eliminados nas fezes dos hospedeiros
e a fecundidade dos vermes durante a re-infecção acompanhou o perfil de
eliminação de vermes no intestino (Fig. 9B e C). Estes dados sugerem que a
produção de IL-4 também participa do controle das larvas de S. venezuelensis na
re-infecção.
92
Vermes/intestino
A 200
WT
***
150
IL-4
-/-
100
50
ND
0
7 dias após Re-infecção
C 300
40000
***
OPG
30000
20000
10000
0
ND
7 dias após Re-infecção
Ovos/fêmea/g
B
240
***
180
120
60
0
ND
7 dias após Re-infecção
Figura 10 – Avaliação da carga parasitária no intestino de camundongos C57BL/6 não deficientes
(WT) ou geneticamente deficientes na produção de IL-4 (IL-4-/-) re-infectados com 700 L3 de S.
venezuelensis aos 7 dias após a re-infecção. (A) Recuperação de vermes do intestino em
camundongos não deficientes de IL-4 (WT) e em camundongos deficientes IL-4-/-. (B)
-/Recuperação de ovos por gramas de fezes em camundongos WT e IL-4 . (C) Fecundidade
das fêmeas de S. venezuelensis em camundongos selvagens e deficientes de IL-4. ***
P<0,001, na comparação entre camundongos deficientes e não deficientes. ND = (ausência
de detecção). Cada barra representa média ± erro padrão, n = 6 camundongos/grupo. (Dados
referentes a 02 experimentos).
93
6.1.3 Avaliação do tratamento com anticorpo neutralizante anti-IL-13 durante
a infecção por S. venezuelensis em camundongos selvagens ou deficientes
da produção de IL-4
A avaliação da carga parasitária no intestino de camundongos tratados ou
não com anticorpo neutralizante anti-IL13 foi realizada aos 14 dias após a
infecção. Nesse momento, foi possível observar que camundongos WT infectados
por S. venezuelensis já haviam eliminado os parasitos intestinais e a eliminação
dos vermes ocorreu mesmo nos camundongos submetidos à neutralização da
produção de IL-13 (Fig. 10A). Quando a neutralização de IL-13 foi realizada em
camundongos geneticamente deficientes em IL-4, o grupo tratado com anti-IL13
sempre apresentou recuperação de vermes do intestino numericamente superior
em relação aos não tratados, mas a diferença não se mostrou estatisticamente
significante (Fig. 10A)
Entretanto, foi possível observar que o tratamento com anti-IL13 alterou
significativamente o número de ovos do parasito eliminado nas fezes dos
camundongos IL-4-/- quando comparado ao grupo de camundongos geneticamente
deficientes que não recebeu o anticorpo neutralizante (P<0,05). Posteriormente,
avaliando-se a fecundidade dos vermes recuperados destes dois grupos
experimentais, ficou demonstrado que a diferença na recuperação de ovos nas
fezes foi principalmente devido a uma maior fecundidade dos vermes recuperados
de animais IL-4-/- que foram submetidos à neutralização da produção de IL-13 (Fig.
10B e C).
94
Vermes/intestino
A 80
60
WT
40
WTT
IL-4 -/-
20
0
ND
ND
WT
WTT
IL-4 -/- T
IL-4 -/-
IL-4 -/- T
14 dias após infecção
B
C
25000
800
#
#
Fecundidade
OPG
20000
15000
10000
5000
0
ND
ND
WT
WTT
IL-4 -/-
IL-4 -/- T
14 dias após infecção
600
400
200
0
ND
ND
WT
WTT
IL-4 -/-
IL-4 -/- T
14 dias após infecção
Figura 11 – Avaliação da carga parasitária no intestino de camundongos C57BL/6 não deficientes
-/(WT) ou geneticamente deficientes da produção de IL-4 (IL-4 ) aos 14 dias após a infecção com
700 L3 de S. venezuelensis frente o tratamento com anti-IL-13. (A) Recuperação de vermes do
intestino em camundongos não deficientes de IL-4 e em camundongos deficientes. (B)
-/Recuperação de ovos por gramas de fezes em camundongos WT e IL-4 . (C) Avaliação da
fecundidade das fêmeas de S. venezuelensis em camundongos selvagens e deficientes de
-/IL-4. WTT = camundongos selvagens tratados com anti-IL-13, IL-4 T = camundongos
geneticamente deficientes da produção de IL-4 tratados com anti-IL-13, # P<0,05 na
comparação entre camundongos tratados e não tratados. ND = (ausência de detecção).
Cada barra representa média ± erro padrão, n = 6 camundongos/grupo.
95
6.1.4 Avaliação do tratamento com IL-33 exógena durante a infecção por S.
venezuelensis em camundongos selvagens ou deficientes na produção de
IL-4.
A avaliação da carga parasitária de S. venezuelensis em camundongos
tratados ou não com IL-33 recombinante foi realizada aos 10 dias após a infecção.
Neste período, camundongos selvagens infectados não tratados com IL-33
apresentaram uma média de 71 ± 28 vermes recuperados do intestino delgado,
enquanto que os camundongos selvagens infectados que receberam inoculação
de IL-33 apresentaram 53 ± 24 vermes no intestino, confirmando que a
administração de IL-33 não alterou significativamente a recuperação de vermes
intestinais nos animais não deficientes. Confirmando os dados anteriores,
camundongos IL-4-/- apresentaram uma recuperação de vermes intestinais
estatisticamente mais elevada em relação aos não deficientes apos 10 dias de
infecção (392 ± 22 vermes no intestino P<0,001), mas o tratamento com IL-33
também não alterou este perfil de infecção nos animais deficientes para IL-4 (Fig.
11A). O tratamento com IL-33 durante a infecção por S. venezuelensis também
não alterou a eliminação de ovos do parasito nas fezes (Fig. 11B) e a fecundidade
dos vermes (Fig. 11C), sugerindo que a administração exógena de IL-33 não
influenciou na carga parasitaria obtida para camundongos WT ou IL-4 -/-.
96
A
***
Vermes/intestino
450
WT
WT/IL-33
***
360
IL-4_/_
IL-4_/_/IL-33
270
180
90
0
10 Dias após infecção
B 40000
**
**
20000
10000
0
Ovos/fêmea/g
OPG
30000
C 100
80
60
40
20
0
10 Dias após infecção
10 Dias após infecção
Figura 12 – Avaliação da carga parasitária no intestino de camundongos BALB/c não deficientes
-/(WT) ou geneticamente deficientes na produção de IL-4 (IL-4 ) tratados ou não com IL-33
recombinante e infectados com 700 L3 de S. venezuelensis aos 10 dias após a infecção. (A)
Recuperação de vermes do intestino de camundongos não deficientes e deficientes de IL-4.
-/(B) Recuperação de ovos por gramas de fezes em camundongos WT e IL-4 . (C) Avaliação
da fecundidade das fêmeas de S. venezuelensis em camundongos selvagens e
geneticamente deficientes. *** = P<0,001, ** = P<0,01 na comparação entre camundongos
selvagens e geneticamente deficientes da produção de IL-4. Cada barra representa média ±
erro padrão, n = 6 camundongos/grupo.
97
6.2 Avaliação da resposta imune
6.2.1 Efeito de IL-4, IL-13 e IL-33 na ativação da resposta humoral durante a
infecção experimental por S. venezuelensis em camundongos.
- Produção de IgE
A quantificação de IgE total foi realizada no soro de camundongos em
diferentes dias após a infecção e re-infecção por S. venezuelensis. Aos 14 dias
após infecção primária, foi detectado 4398 ± 593 ng/ml de IgE no soro dos
camundongos não deficientes, níveis estatisticamente mais elevados (P<0,001)
que o detectado em camundongos não infectados (204 ± 77,5 ng/ml de IgE). Em
contraste, camundongos deficientes de produção da citocina IL-4 não foram
capazes de produzirem níveis detectáveis de IgE em nenhum dos períodos
avaliados. (Fig. 12A). De maneira semelhante, camundongos selvagens que foram
re-infectados apresentaram níveis estatisticamente mais elevados de IgE em
relação a camundongos não infectados desde o 2° dia após a re-infecção até o
14° dia (P<0,001), enquanto que na ausência de IL-4 a re-infecção por S.
venezuelensis não induziu níveis detectáveis de produção de IgE (Fig. 12B).
Para confirmar um possível papel de IL-13 na produção de IgE, a
concentração desta imunoglobulina também foi quantificada no soro dos
camundongos tratados com anticorpo neutralizante de IL-13. Conforme descrito
anteriormente, a infecção primária por S. venezuelensis induziu aumento
significativo da concentração sérica de IgE aos 14 dpi, e o tratamento com
anticorpo neutralizante de IL-13 não modificou significativamente a indução de IgE
98
nestes animais. Mais uma vez a infecção por S. venezuelensis não induziu níveis
detectáveis de IgE no soro de camundongos deficientes para IL-4, e o tratamento
com anti-IL13 não modificou este perfil (Fig. 13)
99
A
IgE Total [ng/mL]
9000
7200
WT
###
5400
***
IL-4 -/-
3600
1800
0
0
5
10
Dias após a infecção
B
9000
IgE Total [ng/mL]
15
WT
###
***
7200
-/-
###
###
***
***
5400
IL-4
3600
1800
0
0
5
10
15
Dias após a re-infecção
Figura 13 - Concentração de IgE total no soro de camundongos C57BL/6 deficientes ou não na
produção de IL-4 aos 2, 7 e 14 dias após a infecção primária e secundária com 700 L3 de
Strongyloides venezuelensis. A linha pontilhada representa níveis de imunoglobulinas de
camundongos não infectados. (A) Níveis de IgE total em camundongos primariamente
infectados por S. venezuelensis, (B) Níveis de IgE total em camundongos re-infectados por
S. venezuelensis, *** P < 0,001 em relação a camundongos não infectados, ### P< 0,001 em
relação a camundongos selvagens e geneticamente deficientes da produção de Il-4. Cada
ponto representa média ± erro padrão do grupo composto de 06 camundongos. (Dados
referentes a dois experimentos).
100
IgE Total [ng/mL]
10000
8000
***
***
WT
WTT
IL-4 -/IL-4 -/- T
6000
4000
2000
0
14 dias após Infecção
Figura 14 – Concentração de IgE sérica em camundongos C57BL/6 não deficientes (WT) ou
-/geneticamente deficientes na produção de IL-4 (IL-4 ) submetidos ou não ao tratamento com
anticorpo ainti IL-13 e infectados por 14 dias com 700 L3 de Strongyloides venezuelensis. WTT =
-/camundongos selvagens tratados com anti-IL-13, IL-4 T = camundongos geneticamente
deficientes na produção de IL-4 tratados com anti-IL-13, A linha pontilhada representa níveis
de imunoglobulinas de camundongos não infectados.*** = P < 0,001 em relação a
camundongos não infectados. Cada barra representa média ± erro padrão do grupo
composto de 05 camundongos.
101
Níveis de IgE no soro de camundongos também foram avaliados em
camundongos que receberam a administração exógena de IL-33 recombinante
durante a infecção por S. venezuelensis. Foi possível
detectar níveis
estatisticamente aumentados de produção de IgE frente a infecção por S.
venezuelensis em comparação a camundongos não infectados em ambos os
grupos de camundongos selvagens tratados ou não com rIL-33 (P<0,01 e P<0,05
respectivamente). Os dados obtidos também revelaram que a administração de
rIL-33 durante a infecção por S. venezuelensis não alterou significativamente a
produção de IgE de camundongos selvagens. Não foi possível detectar a
produção de IgE em camundongos IL-4-/- infectados pelo parasito, entretanto, foi
possível constatar que a administração de IL-33 aumentou a produção de IgE
nestes animais. (Fig. 14).
102
WT
WT/IL-33
IgE Total [ng/mL]
7000
5600
**
IL-4
*
-/-
IL-4 -/- /IL-33
4200
2800
1400
0
ND
10 dias pós infecção
Figura 15 – Concentração de IgE sérica em camundongos BALB/c não deficientes (WT) ou
-/geneticamente deficientes da produção de IL-4 (IL-4 ) submetidos ou não ao tratamento com IL-33
e infectados por 10 dias com 700 L3 de S. venezuelensis. A linha pontilhada representa níveis
de imunoglobulinas de camundongos não infectados. * = P < 0,05 e ** = P < 0,01 em relação
a camundongos não infectados ND = (ausência de detecção). Cada barra representa média ±
erro padrão do grupo composto de 05 camundongos.
103
- Indução de IgM, IgG1 e IgG2a reativas à antígeno solúvel de L3
Foi possível detectar um aumento significativo da produção de IgM parasito
especifica
tanto
em
camundongos
selvagens
quanto
em
camundongos
geneticamente deficientes da produção de IL-4 a partir do 7° dia após a infecção.
Este aumento de produção de IgM parasito-reativa se acentuou no 14° dia da
infecção, sendo estatisticamente diferente do nível detectado em animais não
infectados
(P<0,001),
entretanto,
não
houve
diferenças
estatisticamente
significativas na produção de IgM parasito-reativa entre camundongos selvagens e
camundongos IL-4-/- em nenhum dos períodos avaliados (Fig. 15A).
Os níveis de IgM parasito especifico também foi avaliados no soro de
camundongos re-infectados por S. venezuelensis. Foram constatados elevados
níveis de IgM parasito-reativa tanto em camundongos selvagens quanto em
camundongos IL-4-/- desde o 2° dia após a re-infecção até o 14° dia da avaliação
(P<0,001). Entretanto, apesar desta diferença de produção de IgM em relação
aos
camundongo
não
infectados,
não
foi
possível
detectar
alterações
estatisticamente significativas na produção de IgM entre camundongos WT e IL-4-/(Fig. 15B).
104
A
WT
IgM
(Unidades arbitrárias)
1.0
IL-4 -/-
0.8
***
0.6
***
0.4
***
**
0.2
0.0
0
5
10
15
Dias após a infecção
B
WT
IgM
(Unidades arbitrárias)
1.0
IL-4 -/-
0.8
***
***
0.6
0.4
***
***
***
*
0.2
0.0
0
5
10
15
Dias após a re-infecção
Figura 16 - Níveis de IgM no soro de camundongos C57BL/6 não deficientes (WT) e deficientes da
-/produção de IL-4 (IL-4 ) aos 2, 7 e 14 dias após a infecção primária e secundária com 700 L3 de
Strongyloides venezuelensis. A linha pontilhada representa níveis de imunoglobulinas de
camundongos não infectados. (A) níveis de IgM no soro de camundongos primariamente
infectados, (B) níveis de IgM no soro de camundongos re-infectados por S. venezuelensis, *
= P < 0,05 ** = P < 0,01 e *** = P < 0,001 em relação aos camundongos não infectados. Cada
ponto representa média ± erro padrão do grupo composto de 06 camundongos. (Dados
referentes a dois experimentos).
105
Níveis de IgM também foram avaliados em camundongos WT e IL-4-/infectados por S. venezuelensis e tratados com anticorpo neutralizante anti-IL-13.
Aos 14 dias após a infecção por S. venezuelensis foram observados níveis
significativamente elevados de IgM reativa à antígenos de larva em camundongos
selvagens (P<0,001) e em camundongos geneticamente deficientes da produção
de IL-4 (P<0,001) em relação a camundongos não infectados pelo parasito. O
tratamento com anticorpo neutralizante de IL-13 não alterou significativamente os
níveis de produção de IgM em camundongos selvagens frente a infecção.
Entretanto, o grupo de camundongos IL-4-/- que foi tratado com anticorpo
neutralizante de IL-13 apresentou nível significativamente menor de IgM reativa
em relação ao grupo IL-4-/- que não recebeu o tratamento (P<0,01) (Fig. 16).
106
IgM
(Unidades arbitrárias)
0.8
0.6
***
***
##
WT
WT T
***
0.4
IL-4 -/-
**
IL-4 -/- T
0.2
0.0
14 dias após Infecção
Figura 17 - Níveis de IgM parasito-reativa no soro de camundongos C57BL/6 não deficientes (WT)
-/e deficientes da produção de IL-4 (IL-4 ) submetidos ou não ao tratamento com anticorpo anti-IL13
e infectados por 14 dias com 700 L3 de Strongyloides venezuelensis. WTT = camundongos
-/selvagens tratados com anti IL-13, IL-4 T = camundongos geneticamente deficientes da
produção de IL-4 tratados com anti IL-13, a linha pontilhada representa níveis de
imunoglobulinas de camundongos não infectados, *** = P<0,001, ** = P<0,01 em relação a
-/camundongos não infectados e # # = P<0,01 em relação a camundongos Il-4 tratados e não
tratados com anti-IL13. Cada barra representa média ± erro padrão do grupo composto de 05
camundongos.
107
A reatividade de IgG1 e IgG2a contra antígenos solúveis de larva L3 do
parasito foi avaliada no soro de camundongos no 2° e no 14° dia após a infecção
e re-infecção. Camundongos selvagens e geneticamente deficientes da produção
de IL-4 apresentaram níveis basais de IgG1 tanto no segundo quanto no 14° dia
após a infecção primária por S. venezuelensis (Fig. 17A). Nos camundongos WT
re-infectados foi verificado aumento significativo (P<0,01) de IgG1 aos 14 dias da
re-infecção, enquanto que aumento significativo de reatividade de IgG1 não foi
detectado nos camundongos geneticamente deficientes na produção de IL-4,
indicando a importância de IL-4 na indução da produção de IgG1 (Fig. 17B).
Durante a infecção primária e a re-infeção por S. venezuelensis em
camundongos não houve aumento significativo de reatividade de IgG2a contra
antígenos do parasito e esta não foi estatisticamente diferente entre camundongos
selvagens e IL-4-/- (dados não mostrados).
108
A
WT
IL-4 -/-
IgG1
(unidades arbitrárias)
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
0
5
10
15
Dias após a infecção
WT
B
IL-4 -/-
IgG1
(unidades arbitrárias)
0.20
#
**
0.15
0.10
0.05
0.00
0
5
10
15
Dias após a re-infecção
Figura 18 - Níveis de IgG1 parasito-reativa no soro de camundongos C57BL/6 deficientes (IL-/4 ) ou não de IL-4 (WT) aos 2 e 14 dias após a infecção primária e secundária com 700 L3 de
Strongyloides venezuelensis. A linha pontilhada representa níveis de imunoglobulinas de
camundongos não infectados. (A) níveis de IgG1 em camundongos primariamente infectados, (B)
níveis de IgG1 em camundongos re-infectados, ** P 0,01 em relação a camundongos não
infectados. # P<0,05 em relação a camundongos deficientes de IL-4. Cada ponto representa média
± erro padrão do grupo composto de 06 camundongos. (Dados referentes a dois experimentos).
109
6.2.2 Efeito de IL-4 e IL-13 na infiltração/ativação de eosinófilos e neutrófilos
no intestino de camundongos infectados por S. venezuelensis
A quantificação da atividade de peroxidase de eosinófilos (EPO) no
homogenato intestinal foi utilizada como uma medida indireta da infiltração e/ou
ativação de eosinófilos no tecido em resposta à infecção e re-infecção por S.
venezuelensis em camundongos selvagens e deficientes em IL-4, tratados ou não
com anti-IL-13 (Fig.18 e 19). A infecção por S. venezuelensis promove aumento
dos níveis de EPO no homogenato intestinal de camundongos não deficientes,
atingindo valores máximos aos 14 dias apos a infecção. Aumento significativo dos
níveis de EPO não foi detectado no homogenato intestinal dos camundongos IL-4/-
durante a infecção primária por S. venezuelensis, sendo que aos 14 dpi
camundongos IL-4-/- apresentaram níveis estatisticamente inferiores de EPO em
relação aos animais WT (P<0,001), confirmando a participação da citocina IL-4 na
ativação e no recrutamento de eosinófilos para o intestino durante a infecção
primária por S. venezuelensis (Fig. 18A).
Nos camundongos re-infectados foi possível detectar um aumento
significativo de EPO no homogenato intestinal de camundongos selvagens e
camundongos geneticamente deficientes da produção de IL-4 a partir do 7° dia
após a re-infecção em relação a camundongos não infectados (P< 0,01). Este
aumento de produção de EPO em relação a camundongos não infectados se
acentuou no 14° dia após a re-infecção (P<0,001), entretanto, não houve
diferenças estatisticamente significativas na detecção de níveis de EPO entre
110
camundongos selvagens e camundongos IL-4-/- re-infectados pelo parasito em
nenhum dos períodos avaliados (Fig. 18B).
111
A
WT
EPO
(unidades arbitrárias)
1.5
IL-4-/1.0
***
###
**
0.5
0.0
0
B
5
10
15
Dias após a infeção
WT
EPO
(unidades arbitrárias)
3
IL-4-/**
2
**
1
**
**
0
0
5
10
15
Dias após a re-infeção
Figura 19 – Atividade de peroxidase de eosinófilo (EPO) no homogenato intestinal de
-/camundongos C57BL/6 selvagens (WT) e deficientes na produção da citocina IL-4 (IL-4 ) durante
a infecção e re-infecção com 700 L3 de S. venezuelensis. (A) níveis de EPO em camundongos
primariamente infectados, (B) níveis de EPO em camundongos re-infectados por S.
venezuelensis, ** = P < 0,01, *** = P < 0,001 em relação ao nível de atividade de peroxidase de
eosinófilos detectados em camundongos não infectados (representados pela linha
-/pontilhada) e # # # = P < 0,001 entre camundongos selvagens e IL-4 no mesmo período.
Cada ponto representa média ± erro padrão obtidos de 6 camundongos por grupo. (Dados
referentes a dois experimentos).
112
A análise indireta da eosinofilia intestinal através dos níveis de EPO
também foi avaliada em camundongos tratados com anticorpo neutralizante de IL13 durante a infecção por S. venezuelensis. Como já apresentado anteriormente,
os níveis de EPO no homogenato intestinal de camundongos WT após 14 dpi
foram significativamente superiores ao detectado em animais não infectados e
este aumento não foi detectado em camundongos IL-4
-/-
infectados. Entretanto,
camundongos selvagens ou camundongos IL-4-/- que foram tratados com o
anticorpo neutralizante anti IL-13 durante a infecção por S. venezuelensis
apresentaram níveis estatisticamente mais elevados de EPO do que os
apresentados pelos camundongos infectados que não receberam o tratamento
(P<0,001). Desta forma, foi possível observar que a neutralização da citocina IL-13
contribui para um aumento da detecção de peroxidase de eosinófilos tanto em
camundongos selvagens quanto em camundongos geneticamente deficientes da
produção de IL-4 (Fig. 19).
113
EPO
(Unidades arbitrárias)
4
##
WT
***
WTT
3
2
IL-4 -/IL-4 -/- T
**
#
*
1
0
Tratamento
Figura 20 - Atividade de peroxidase de eosinófilo (EPO) no homogenato intestinal de
-/-)
camundongos C57Bl/6 selvagens (WT) ou deficientes na produção da citocina IL-4 (IL-4 e
tratados ou não com anticorpo neutralizante anti-IL-13 aos 14 dias após a infecção por S.
venezuelensis. A linha pontilhada representa o nível de EPO em camundongos não
-/infectados. WTT = camundongos selvagens que receberam o tratamento, IL-4 T =
camundongos geneticamente deficientes de IL-4 tratados com anti-IL-13, * P < 0,05, ** P <
0,01, *** P < 0,001 em relação a atividade de EPO detectada em camundongos não
infectados. # = nível de significância estatística entre grupos de camundongos com e sem
tratamento com anti-IL13. Cada barra representa média ± erro padrão obtidos de 6
camundongos por grupo.
114
Para a avaliação do infiltrado celular no intestino delgado em resposta à
infecção por S. venezuelensis também foi realizada a quantificação dos níveis de
da atividade de mieloperoxidase (MPO) como medida indireta da presença de
neutrófilos no homogenato de tecido intestinal. Camundongos selvagens
infectados por S. venezuelensis apresentaram níveis estatisticamente mais
elevados de MPO em relação a camundongos não infectados no 2° (P<0,05) e no
14° dia após a infecção primária. Camundongos geneticamente deficientes da
produção de IL-4 não apresentaram alterações significativas nos níveis de MPO
quando comparados aos níveis apresentados por camundongos não infectados
pelo parasito. Desta forma, a ausência de IL-4 resultou em níveis estatisticamente
inferiores (P<0,001) de MPO em relação a camundongos selvagens aos 14 dias
após a infecção primária (Fig. 20A)
Durante a re-infecção, camundongos WT e IL-4-/- apresentaram uma
elevação significativa (P<0,001) da atividade de MPO após 14 dias em relação a
camundongos não infectados pelo parasito, entretanto, a atividade de MPO no
homogenato
intestinal
dos
camundongos
deficientes
de
IL-4
foram
estatisticamente menor que o detectado nos camundongos não deficientes no
mesmo período de infecção (P<0,001 (Fig. 20B).
115
A
WT
MPO
(unidades arbitrárias)
2.5
IL-4-/-
1.3
###
***
0.2
*
0.1
0.0
0
5
10
15
Dias após a infecção
B
WT
MPO
(unidades arbitrárias)
2.5
IL-4-/-
2.0
###
***
1.5
1.0
**
0.5
0.0
0
5
10
15
Dias após a re-infecção
Figura 21 – Atividade de mieloperoxidase (MPO) no homogenato intestinal de camundongos
-/C57BL/6 selvagens (WT) e deficientes na produção da citocina IL-4 (IL-4 ) durante a
infecção e re-infecção com 700 L3 de S. venezuelensis. (A) Níveis de MPO em camundongos
primariamente infectados, (B) níveis de MPO em camundongos re-infectados por S. venezuelensis,
** = P < 0,01, *** = P < 0,001 em relação a atividade de MPO detectada em camundongos não
infectados (representados pela linha pontilhada) e ### = P < 0,001 entre camundongos selvagens
-/e IL-4 no mesmo período. Cada ponto representa média ± erro padrão obtidos de 6 camundongos
por grupo. (Dados referentes a dois experimentos).
116
A análise dos níveis de MPO no homogenato intestinal também foi avaliada
em camundongos tratados com anticorpo neutralizante de IL-13. Camundongos
selvagens infectados por S. venezuelensis tratados ou não com anti-IL13
apresentaram níveis estatisticamente mais elevados de MPO (P<0,001) em
comparação ao grupo de camundongos controles não infectados. O tratamento
com anti-IL-13 não alterou significativamente os níveis de MPO apresentados por
camundongos
selvagens
frente à infecção pelo parasito. Camundongos
geneticamente deficientes da produção de IL-4 apresentaram níveis basais de
MPO após a infecção pelo parasito e o tratamento com anti-IL-13 nestes animais
não alterou a atividade de mieloperoxidase frente a infecção por S. venezuelensis,
indicando que IL-13 não interfere na indução de neutrofilia intestinal em resposta a
infecção por S. venezuelensis (Fig. 21).
117
MPO
(Unidades arbitrárias)
0.3
***
0.2
***
WT
WTT
IL-4 -/IL-4 -/- T
0.1
0.0
Tratamento
Figura 22 - Atividade de mieloperoxidase (MPO) no homogenato intestinal de camundongos
-/C57BL/6 selvagens (WT) ou deficientes na produção da citocina IL-4 (IL-4 ), tratados ou não
com anticorpo neutralizante anti-IL-13 aos 14 dias após a infecção por S. venezuelensis. A
linha pontilhada representa a atividade de MPO em camundongos não infectados. WTT =
-/camundongos selvagens tratados com anti-IL-13, IL-4 T = Camundongos deficientes de IL-4
tratados com anti-IL-13, * P<0,05, ** P<0,01, *** P<0,001 em relação a atividade de MPO
detectada em camundongos não infectados. # = nível de significância estatística entre grupos de
camundongos com e sem tratamento. Cada barra representa média ± erro padrão obtidos de 6
camundongos por grupo.
118
6.2.3 Efeito de IL-4 na ativação de células T CD4+ efetoras e reguladoras
durante a infecção e re-infecção experimental por S. venezuelensis em
camundongos.
A avaliação da proporção de células CD4+, CD25+ e da expressão de
CD25+/Foxp3+ foi estimada através de citometria de fluxo em células provenientes
de linfonodo mesentérico e em suspensão celular derivada da lamina própria
intestinal de camundongos aos 7 dias após a infecção e re-infecção por S.
venezuelensis.
Camundongos
selvagens
e
camundongos
geneticamente
deficientes na produção de IL-4 apresentaram uma proporção semelhante de
células CD4+ no linfonodo mesentérico na ausência de infecção por S.
venezuelensis (Fig. 22 A e B). Entretanto, na lâmina própria, camundongos
deficientes da produção de IL-4 não infectados apresentaram uma menor
proporção de células CD4+ quando comparados a camundongos selvagens
(P<0,05) (Fig. 22 C e D). Após a infecção primária por S. venezuelensis a
proporção de células CD4+ no linfonodo mesentérico de camundongos WT se
manteve, enquanto que em camundongos deficientes da produção de IL-4 foi
detectada uma diminuição significativa (P<0,001) da proporção destas células,
resultando em uma diferença estatística (P<0,001) na proporção de células CD4+
do linfonodo mesentérico de camundongos WT e IL-4
-/-
(Fig. 22A). Na lâmina
própria, a infecção primária por S. venezuelensis (Fig. 22C) aumentou
significativamente (P<0,05) a proporção de células CD4+ em camundongos
selvagens (WT) e em camundongos IL-4-/- (P<0.01). Camundongos IL-4-/- não
119
apresentaram diferenças estatísticas na proporção de células CD4+ em relação a
camundongos WT frente a infecção ao parasito (Fig. 22C).
Durante a re-infecção por S. venezuelensis foi detectado diminuição da
proporção de células TCD4+ do linfonodo mesentérico de camundongos WT em
comparação com os não infectados (P<0,01), entretanto, a re-infecção não induziu
alterações significativas na proporção de células CD4+ de camundongos
geneticamente deficientes na produção de IL-4. Assim, camundongos IL-4-/apresentaram uma maior proporção de células CD4+ no linfonodo mesentérico que
camundongos WT (P<0,05) aos 7 dias de re-infecção (Fig. 22B). Na lâmina
própria, a re-infecção aumentou significativamente a proporção de células CD4+
obtidas por camundongos WT e IL-4-/- (Fig. 22D). A ausência de IL-4 em
camundongos geneticamente deficientes (IL-4-/-) não promoveu diferenças na
proporção de células CD4+ frente a re-infecção em relação a camundongos WT
(Fig. 22D).
120
Figura 23 - Proporção de células CD4+ na suspensão celular derivada de linfonodo
mesentérico ou lâmina própria intestinal de camundongos BALB/c geneticamente
-/deficientes (IL-4 ) ou não (WT) da produção da citocina IL-4 durante a infecção primária ou
+
re-infecção por S. venezuelensis. (A) proporção de células CD4 no linfonodo mesentérico frente
+
infecção primária por S. venezuelensis, (B) proporção de células CD4 no linfonodo mesentérico de
+
camundongos re-infectados, (C) proporção de células CD4 na lâmina própria de camundongos
+
infectados primariamente por S. venezuelensis, (D) proporção de células CD4 na lâmina própria
de camundongos re-infectados por S. venezuelensis. NI = camundongos não infectados, dpi = dias
após a infecção, dpr = dias após a re-infecção.* P<0,05, *** P<0,001 entre animais WT e IL-4
deficientes, # P<0,05, ## P<0,01, ### P<0,001 entre camundongos controles e infectados por S.
venezuelensis. Cada barra representa média ± erro padrão obtido no grupo de 6 animais.
121
Camundongos deficientes da produção de IL-4 apresentaram uma maior
proporção de células CD4/CD25+ na ausência de infecção por S. Venezuelensis
no linfonodo mesentérico (Fig. 23 A e B). Entretanto, na lâmina própria intestinal
(Fig. 23 C e D) Camundongos WT e IL-4-/- apresentaram a mesma proporção de
células CD4/CD25+ na ausência da infecção pelo parasito.
A infecção primária elevou significativamente a proporção de células
CD4/CD25+ presente em linfonodos mesentéricos de camundongos selvagens
(P<0,05), entretanto, não promoveu alterações significativas na proporção de
células CD4/CD25+ obtidas de camundongos IL-4-/- (Fig. 23A). Na lamina própria,
a infecção primária por S. venezuelensis não alterou significativamente as
proporções de células CD4/CD25+ presentes em camundongos selvagens e em
camundongos geneticamente deficientes da produção de IL-4 e a proporção de
células CD4/CD25+ nos animais infectados de ambos os grupos experimentais foi
semelhante (Fig. 23C).
A re-infecção por S. venezuelensis não interferiu estatisticamente na
proporção de células CD4/CD25+ recuperadas de linfonodo mesentérico e na
lâmina própria intestinal tanto em animais selvagens quanto em animais
geneticamente deficientes da produção de IL-4. Camundongos selvagens e
geneticamente deficientes da produção de IL-4 apresentaram a mesma proporção
de células CD4/CD25+ frente a infecção tanto no linfonodo mesentérico quanto na
lâmina própria.(Fig. 23 B e D)
.
122
+
Figura 24 - Proporção de células CD4/CD25 na suspensão celular derivada de linfonodo
mesentérico ou lâmina própria intestinal de camundongos BALB/c geneticamente deficientes ou
não na produção da citocina IL-4 durante a infecção primária ou re-infecção por S. venezuelensis.
(A e B referem-se a proporção de células obtidas de linfonodo mesentérico, C e D referemse a proporção de células obtidas da lâmina própria intestinal). NI = camundongos não
infectados, dpi = dias após a infecção, dpr = dias após a re-infecção.* P<0,05, ** P<0,01 entre
animais WT e IL-4 deficientes, # P<0,05, ## P<0,01, ### P<0,001 entre camundongos
controles e infectados por S. venezuelensis. Cada barra representa média ± erro padrão
obtido no grupo de 6 animais.
123
6.2.4 Avaliação da produção de citocinas IL-10 e IFN-γ por células CD4+
frente a infecção experimental por S. venezuelensis
A avaliação intracelular da expressão de citocinas IL-10 e IFN-γ foi
estimada através de citometria de fluxo em homogenato de células provenientes
de linfonodo mesentérico e em células derivadas da lâmina própria intestinal de
camundongos infectados e re-infectados por S. venezuelensis.
Dados referentes a avaliação no linfonodo mesentérico revelaram que
camundongos geneticamente deficientes da produção de IL-4 apresentam uma
maior proporção de células CD4+/IL-10 na ausência de infecção pelo parasito
quando comparados com camundongos selvagens não infectados (P<0.001) (Fig.
24 A e B).
Entretanto, nas células recuperadas da lâmina própria de
camundongos não infectados, não foi detectado diferenças na proporção de
células CD4+/IL-10 entre os dois grupos experimentais (Fig. 24 E e F). Aos 7 dias
da infecção primária por S. venezuelensis não foram detectadas alterações
significativas da proporção de células CD4+/IL-10 recuperadas de linfonodo
mesentérico de camundongos. A proporção de células CD4+ da lâmina própria
intestinal que produzem IL-10 é elevada, atingindo cerca de 20% do total
recuperado e não alterou significativamente após a infecção nos animais não
deficientes. Entretanto, a proporção de células CD4+/IL-10 obtidas lâmina própria
de camundongos geneticamente deficientes de IL-4 foi estatisticamente menor
(P<0,05) nos infectados em comparação aos não infectados (Fig. 24E).
Ao contrario do observado na infecção primária, aos 7 dias da re-infecção
por S. venezuelensis foi detectado aumento significativo a proporção de células
124
CD4+/IL-10 do linfonodo mesentérico de camundongos selvagens (P<0,001),
entretanto não induziu alterações estatisticamente significativas na proporção de
células CD4+/IL-10 de camundongos IL-4-/- (Fig. 24B), sendo que camundongos
geneticamente deficientes da produção de IL-4 apresentaram uma maior
proporção (P<0,05) de células CD4+/IL-10 após a re-infecção quando comparados
com aos controles selvagens (Fig. 24B). Na lâmina própria, a re-infecção não
alterou significativamente a proporção
de células
CD4+/IL-10 tanto
em
camundongos selvagens quanto em camundongos geneticamente deficientes da
produção de IL-4 (Fig. 24F). Camundongos IL-4-/- não apresentaram diferenças
significativas na proporção de células CD4+/IL-10 frente a re-infecção quando
comparados aos controles geneticamente competentes (Fig. 24F).
Não houve diferenças estatisticamente significativas entre a proporção de
células CD4+/IFN-γ obtidas do linfonodo mesentérico de camundongos selvagens
e IL-4-/- não infectados, assim como não foi detectado difirenças na proporção
destas células na lamina própria dos animais não infectados de ambos os grupos
experimentais (Fig. 24C, D, G e H). A infecção primária por S. venezuelensis
diminuiu significativamente a proporção de células CD4+/IFN-γ do linfonodo
mesentérico de camundongos selvagens (P<0,05), entretanto não alterou a
proporção de células CD4+/IFN-γ do linfonodo de camundongos IL-4-/- (Fig. 24C).
Na lâmina própria, a infecção primária promoveu aumento da proporção de células
CD4+/IFN-γ tanto em camundongos selvagens (P<0,05) quanto em camundongos
geneticamente deficiente da produção de IL-4 (P<0,05), mas não houve diferença
estatística da produção de CD4+/IFN-γ entre os grupos experimentais (Fig. 24G).
125
Aos 7 dias da re-infecção por S. venezuelensis foi detectado um aumento
na proporção de células CD4+/IFN-γ obtidas do linfonodo mesentérico de
camundongos selvagens em relação aos animais não infectados (P<0,05),
entretanto, nos camundongos IL-4-/- a re-infecção não promoveu alterações
significativas na proporção de células CD4+/IFN-γ obtidas do linfonodo
mesentérico (Fig. 24D). Apesar da diferença em relação aos animais não
infectados, a proporção de células CD4+/IFN-γ do linfonodo mesentérico de
camundongos re-infectados pelo parasito não apresentaram diferenças estatística
entre os dois grupos experimentais (Fig. 24D). Na lâmina própria, a re-infecção
pelo parasito não alterou as proporção de células CD4+/IFN-γ tanto em
camundongos selvagens quanto em camundongos geneticamente deficientes da
produção de IL-4, sendo que a proporção de células CD4+/IFN-γ foi semelhante
nos dois grupos experimentais (Fig. 24H).
126
WT
WT
IL4
A
-/-
IL4-/-
B
1.5
1.5
% CD4/IL-10
% CD4/IL-10
###
1.0
***
0.5
0.0
#
0.5
NI
1.5
NI
E
#
0.5
NI
Dias após a infecção
60
F
80
7dpr
Dias após a re-infecção
60
#
40
% CD4/IL-10
% CD4/IL-10
1.0
7dpi
80
20
1.5
1.0
0.5
40
20
1.5
1.0
0.5
0.0
0.0
NI
G
NI
7dpi
Dias após a infecção
H
80
#
7dpr
Dias após a re-infecção
60
#
40
% CD4/IFN
40
% CD4/IFN
7dpr
Dias após a re-infecção
0.0
0.0
60
0.5
D
Dias após a infecção
1.0
80
*
7dpi
% CD4/IFN
% CD4/IFN
1.5
*
0.0
NI
C
1.0
20
1.5
1.0
0.5
20
1.5
1.0
0.5
0.0
0.0
NI
7dpi
Dias após a infecção
NI
7dpr
Dias após a re-infecção
Figura 25 – Avaliação da produção de IL-10 e IFN-γ por células derivadas de linfonodo
mesentérico ou lâmina própria intestinal de camundongos BALB/c geneticamente
-/deficientes (IL-4 ) ou não (WT) da produção da citocina IL-4 durante a infecção primária ou
re-infecção por S. venezuelensis. (A, B, C e D referem-se a proporção de células obtidas de
linfonodo mesentérico, E, F, G e H referem-se a proporção de células obtidas da lâmina própria
intestinal). NI = camundongos não infectados, dpi = dias após a infecção, dpr = dias após a reinfecção.* P<0,05, *** P<0,001 entre animais WT e IL-4 deficientes, # P<0,05, ### P<0,001 entre
camundongos controles e infectados por S. venezuelensis. Cada barra representa média ± erro
padrão obtido no grupo de 6 animais.
127
6.2.5 Avaliação da participação de células T regulatórias frente a infecção
experimental por S. venezuelensis
Camundongos geneticamente deficientes da produção de IL-4 e não
infectados apresentaram (Fig. 25 A e B) uma maior proporção de células T
CD4+/CD25+/Foxp3+ (T-reg) no linfonodo mesentérico em relação a camundongos
selvagens (P<0,05), entretanto na lâmina própria intestinal, camundongos
geneticamente deficientes na produção de IL-4 e não deficientes na ausência de
infecção pelo parasito apresentaram proporções semelhantes de células T-reg
(Fig. 25 C e D). Aos 7 dias da infecção primária por S. venezuelensis, a proporção
de células T-reg no linfonodo mesentérico de camundongos selvagens, apesar de
aumentada, não foi significativamente diferente da proporção observada nos
animais não infectados. Entretanto, em IL-4-/-, a infecção pelo parasito resultou em
diminuição na proporção de células T-regs do linfonodo mesentérico em relação
aos não infectados (Fig. 25A). A redução na proporção de células T-regs do
linfonodo mesentérico detectada nos camundongos IL-4-/- infectados resultou no
desaparecimento da diferença na proporção de T-reg entre camudongos
deficientes e não deficientes anteriormente observado nos animais não infectados.
(Fig. 25A). A infecção por S. venezuelensis aumentou significativamente a
proporção de células T reg na lâmina própria intestinal de camundongos
selvagens (P<0,01), mas não promoveu diferenças estatisticamente significativas
na proporção destas células obtidas de camundongos deficientes da produção de
IL-4 (Fig. 25. C). Durante a re-infecção pelo parasito foi detectado elevação
significativa (P<0,05) na proporção de células T-reg do linfonodo mesentérico de
128
camundongos selvagens (P<0,001)
e de camundongos IL-4-/- em relação aos
controles não infectados (Fig. 25B), mas a proporção de células T-reg foi
semelhante entre camundongos re-infectados selvagens e IL-4-/-(Fig. 25B). Na
lâmina própria, a proporção de células T reg aumentam significativamente durante
a re-infecção atingindo mais que 20 % do total de células CD4+ recuperadas do
tecido, mas não ocorre diferença estatística entre os grupos experimentais (Fig.
25D).
129
+
Figura 26 - Proporção de células CD25/foxp3 na suspensão celular derivada de linfonodo
mesentérico ou lâmina própria intestinal de camundongos BALB/c geneticamente
-/deficientes (IL-4 ) ou não (WT) da produção da citocina IL-4 durante a infecção primária ou
re-infecção por S. venezuelensis. (A e B referem-se a células derivadas de linfonodo
mesentérico, C e D refere-se a células derivadas da lâmina própria intestinal) NI = camundongos
não infectados, dpi = dias após a infecção, dpr = dias após a re-infecção. * representa nível de
significância entre animais WT e IL-4 deficientes. .* P<0,05 entre animais WT e IL-4 deficientes, #
P<0,05, ## P<0,01 entre camundongos controles e infectados por S. venezuelensis. Cada barra
representa média ± erro padrão obtido no grupo de 6 animais.
130
6.2.6 Avaliação da produção de citocinas
Foram estimadas as concentrações das citocinas IL-4, IL-10 e IFN-γ no
homogenato intestinal de camundongos C547BL/6 infectados primariamente aos
7, 14 e 18 dias após a infecção primária. Como esperado, a produção de IL-4 foi
detectada somente no grupo de camundongos selvagens primariamente
infectados aos 7 dias após a infecção apresentando cerca de 278.3 ± 39.18 pg/ml.
Em relação aos animais não infectados, a infecção por S. venezuelensis em
camundongos selvagens (WT) promoveu aumento significativo dos níveis de IL-10
em todos os dias avaliados, enquanto nos camundongos deficientes de IL-4
apresentaram níveis basais de IL-10 durante todo o período avaliado da infecção
primária, sendo estatisticamente diferente do nível detectado nos animais não
deficientes (Fig. 26A). O grupo de animais WT infectado também apresentou
níveis estatisticamente mais elevados de IFN-γ do que os níveis apresentados
pelos animais IL-4-/- (P<0.01) aos 7 dpi. Com a evolução da infecção, os níveis de
IFN-γ diminuíram em camundongos selvagens e o grupo passou a apresentar
níveis basais desta citocina. Camundongos geneticamente deficientes da
produção de IL-4 apresentaram níveis basais de IFN-γ em todo o período avaliado
(Fig. 26 B).
Níveis IL-10 e IFN-γ também foram avaliados em camundongos C547BL/6
aos 7 dias após a re-infecção pelo parasito. Ao contrário do observado durante a
infecção primária, camundongos geneticamente deficientes na produção de IL-4
apresentaram níveis de IL-10 estatisticamente mais elevados que camundongos
selvagens (P<0,01) aos 7 dias após a re-infecção por S. venezuelensis (Fig. 26C).
131
Níveis de IFN-γ permaneceram basais aos 7 dias após a re-infecção tanto em
camundongos selvagens quanto em camundongos geneticamente deficientes da
produção de IL-4 (Fig. 26D).
132
WT
WT
IL-4
A
-/-
C
IL-4
-/-
400
300
IL-10[pg/ml]
IL-10[pg/ml]
400
200
100
0
7
14
300
200
100
*
***
ND
**
0
18
7 dias após re-infecção
Dias após infecção
B
D
400
300
300
200
100
0
*
**
7
14
18
IFN [pg/ml]
IFN [pg/ml]
400
200
100
0
7 dias após re-infecção
Dias após infecção
Figura 27 - Níveis de IL-10 e IFN-γ no homogenato intestinal de camundongos C57BL/6
-/geneticamente deficientes na produção da citocina IL-4 (IL-4 ) ou não (WT) durante a infecção
primária e re-infecção com S. venezuelensis. (A e B representam níveis de citocinas frete a
infecção primária, C e D representam níveis de citocinas frente a re-infecção ao parasito) A
linha pontilhada representa níveis de citocinas detectadas em camundongos não infectados.
* P<0,05, ** P<0,01 ***P<0,001 entre animais WT e IL-4 deficientes. Cada barra representa
média ± erro padrão obtido no grupo de 6 animais.
133
Como os experimentos de fenotipagem celular só foram realizados em
camundongos com background BALB/c, níveis de IL-5, IL-10, e IFN-γ também
foram investigados aos 7 dias da infecção primária e re-infecção por S.
venezuelensis nestes animais. Camundongos geneticamente deficientes da
produção de IL-4 apresentaram níveis significativamente inferiores (P<0,05) de
produção de IL-5 (Fig. 27A) e de IFN-γ (Fig 27 X) aos 7 dias da infecção primária
quando
comparado
aos
camundongos
geneticamente
competentes.
Nos
camundongos re-infectados pelo parasito, os níveis de IL-5 (Fig. 27B) e de IFN-γ
(Fig. 27D) não foram estatisticamente diferente entre os grupos experimentais. Os
camundongos selvagens e deficientes da produção de IL-4 apresentaram níveis
de IL-10 abaixo do limite de detecção no homogenato intestinal.
134
WT
WT
IL-4-/-
IL-4-/-
A
B
150
100
50
*
IL-5[pg/mL]
IL-5[pg/mL]
150
0
100
50
0
7 dias após infecção
7 dias após re-infecção
D
1000
800
800
IFN[pg/mL]
IFN[pg/mL]
C
1000
600
400
200
**
0
600
400
200
0
7 dias após infecção
7 dias após re-infecção
Figura 28 - Níveis de IL-5 e IFN-γ no homogenato intestinal de camundongos BALB/c
-/geneticamente deficientes (IL-4 ) ou não (WT) da produção da citocina IL-4 durante a infecção
primária e a re-infecção com S. venezuelensis. (A e C) representam níveis de citocinas obtidos
frente a infecção primária, (B e D) representam níveis de citocinas obtidos frente a reinfecção. A linha pontilhada representa níveis de citocinas detectadas em camundongos
não infectados. * P<0,05, ** P<0,01 entre animais WT e IL-4 deficientes. Cada barra
representa média ± erro padrão obtido no grupo de 6 animais.
135
7. DISCUSSÃO
136
Trabalhos anteriores do nosso grupo de pesquisa demonstraram que a
migração das larvas de Strongyloides venezuelensis pelo pulmão do hospedeiro
induz inflamação eosinofílica pulmonar, produção de muco e hiper-reatividade de
vias aéreas (Silveira et al. 2002; Pereira 2008). Ao se estabelecer no intestino
delgado,
a
presença
de
S.
venezuelensis
promove
resposta
imune
predominantemente do tipo 2 com elevação dos níveis de IL-4 e IL-13 na mucosa
intestinal (Negrão-Corrêa et al. 2004, Fernandes et al. 2008; Schilter et al. 2010),
migração e ativação de eosinófilos e neutrófilos (Negrão-Corrêa et al. 2004;
Pereira, 2008) e aumento da contratilidade intestinal (Araújo 2010) que acarreta
em eliminação do verme. Em trabalho anterior (Negrão-Corrêa et al. 2006) foi
demonstrado que camundongos geneticamente deficientes na cadeia alfa do
receptor de IL-4, que resulta na ausência de expressão do receptor do tipo I e do
tipo II, ou deficientes na produção de STAT-6 não são capazes de controlar
eficientemente a infecção por S. venezuelensis. No entanto, apesar dos avanços
obtidos no conhecimento da resposta imune promovida pela infecção por
Strongyloides, a participação de IL-4, IL-13 e IL-33 na indução do mecanismo
protetor responsável pela eliminação da infecção ou pelo controle das larvas
infectantes ainda não foram estabelecidos. Neste trabalho experimental foram
utilizados camundongos geneticamente deficientes na produção de IL-4 (IL-4-/-),
tratamento com anticorpos neutralizante de IL-13 e administração exógena de IL33 com o objetivo de estabelecer o papel destas citocinas na infecção primária e
re-infecção por S. venezuelensis.
As alterações descritas durante a interação de S. venezuelensis com o
hospedeiro foi extremamente diferente quando investigamos a infecção em
137
camundongos geneticamente deficientes da produção de IL-4 (IL-4-/-). Esta
diferença inicia-se na avaliação da carga parasitária onde observamos um
aumento significativo de recuperação de larvas no pulmão de camundongos
geneticamente deficientes. Este resultado indica que o mecanismo responsável
pelo controle das larvas de S. venezuelensis que migram pelo pulmão é
dependente de IL-4, como previamente reportado para N. brasiliensis (Anthony et
al, 2006). Também foi verificado que, durante a fase intestinal da infecção,
camundongos IL-4-/- apresentam uma carga parasitária significativamente mais
elevada em relação aos camundongos não deficientes. Os animais IL-4-/- também
apresentam um atraso na eliminação do parasito, visto que camundongos não
deficientes foram capazes de eliminarem completamente o parasito aos 14 dias
após a infecção primária, enquanto que camundongos IL-4-/- continuaram
apresentando vermes no intestino até o 24° dia de infecção. Estes resultados
constituem uma evidência direta que o mecanismo responsável pela eliminação do
verme intestinal de S. venezuelensis em camundongo é dependente de IL-4. A
cinética de infecção por S. venezuelensis em camundongos IL-4-/-, com
significante aumento de carga parasitária e atraso na eliminação do parasito, foi
muito semelhante ao observado em camundongos deficientes na cadeia alfa do
receptor de IL-4 (Negrão-Corrêa et al. 2006), sugerindo que esta citocina seja a
principal envolvida na indução da resposta protetora. Através da utilização de
camundongos geneticamente deficientes trabalhos anteriores demonstraram que a
produção de IL-4 também foi essencial para a eliminação de H. polygyrus
(Lawrence et al. 1998), uma espécie de nematódeo que habita a mucosa do
intestino delgado, enquanto, para eliminação de T. muris, parasito que vive na
138
camada epitelial do ceco (Bancroft et al. 1998) e T. spiralis, parasito que habita o
epitélio do intestino delgado (Finkelman et al. 2004) tanto IL-4 quanto IL-13
participaram da eliminação dos parasitos.
Apesar de termos verificado uma maior recuperação de vermes adultos no
intestino de camundongos geneticamente deficientes da produção de IL-4, no
nosso modelo experimental, a ausência de IL-4 não altera a fecundidade do
parasito. Diferentemente do observado no nosso modelo, trabalhos anteriores
verificaram a importância de IL-4 em mecanismos de fecundidade de H. polygyrus,
onde a administração exógena da citocina reduziu a fecundidade do verme (Urban
et al. 1995).
Na infecção primária por S. venezuelensis, a ausência de IL-4 resultou em
redução da produção de outras citocinas Th-2, como IL-5, e também na redução
da produção de IL-10 e IFN-γ. Este dado claramente demonstra que a
permanência de S. venezuelensis em camundongos IL-4-/- não foi consequência
de uma mudança no perfil da resposta imune de predominantemente Th-2 para
Th-1 ou T-reg. Tendo em vista esta redução de produção de citocinas na ausência
de IL-4, investigamos o efeito de IL-4 na indução e ativação de células TCD4+ e
constatamos que a ausência de IL-4 diminuiu a proporção destas células frente a
estimulação antigênica promovida pela infecção por S. venezuelensis. Esta menor
proporção de células TCD4+ detectada no linfonodo mesentérico de camundongos
IL-4-/- aliada a ausência de detecção de diferenças significativas na lâmina própria
intestinal provavelmente reflete a ocorrência de um processo de migração celular
do linfonodo mesentérico para o sítio de infecção do parasito e uma provável
participação destas células no mecanismo de eliminação tardia de S.
139
venezuelensis mesmo na ausência de IL-4. Trabalhos anteriores amplamente
estabelecem IL-4 como uma citocina fundamental para promover a diferenciação
de células TCD4+ naive em células Th2 efetoras (Gros et al. 1990; Swain et al.
1990;
Murphy
et
al.
2002).
Entretanto,
estudos
têm
demonstrado
o
desenvolvimento de células Th2 em camundongos deficientes de IL-4, deficientes
de IL-4Rα e deficientes de IL-4/Stat6 (Mohrs et al. 2000; Mohrs et al. 2001;
Jankovic et al. 2000; Noben-Trauth 1997; Van Panhuys 2008).
Apesar de termos verificado uma maior proporção de células CD4/CD25+
em camundongos IL-4-/- frente a infecção, este dado provavelmente não reflete
uma maior ativação frente a exposição ao parasito, visto que esta maior proporção
já era detectada mesmo antes da infecção dos animais e que camundongos IL-4-/apresentaram diminuição de produção de IL-10, IL-5 e IFN-γ durante a infecção,
sugerindo que o processo de ativação destas células não foi completamente
estabelecido.
Trabalhos anteriores sugerem que a destruição de larvas de Strongyloides
sp é em grande parte dependente da produção de anticorpos específicos como
IgM e IgG1 (Herbert et al. 2000; Herbert et al. 2002; Ligas et al. 2003). Neste
trabalho, verificamos que a indução de IgM durante a infecção por S.
venezuelensis não foi controlada por IL-4, visto que a camundongos IL-4-/infectados não apresentaram diferenças significativas nos níveis de IgM parasitoreativa em relação a camundongos selvagens. A maioria das infecções por
nematódeos, como é o caso de S. venezuelensis, induz a produção de IgE. Sabese que a mudança de isotipo de células B para IgE requer a participação de CD40
e CD40R e pode ser regulada tanto por IL-4 quanto por IL-13 (Vercelli 1993;
140
Oettgen et al. 2001). Neste trabalho, verificamos que a ausência de IL-4 na fase
de migração sistêmica e intestinal da infecção por S. venezuelensis impede a
produção de IgE por camundongos IL-4-/-. Em outro modelo experimental, Urban e
colaboradores (1991) reportaram que o tratamento exógeno com anti-IL-4 bloqueia
a resposta imune mediada por IgE na infecção por H. polygyrus e impede o
desenvolvimento de imunidade protetora frente a infecção. Associando a maior
detecção de vermes na carga parasitária ao bloqueio de produção de IgE,
verificamos que a ausência de IL-4 também diminuiu a migração e/ou ativação de
eosinófilos e neutrófilos no intestino de camundongos, verificados através da
redução dos níveis de EPO e MPO frente a infecção por S. venezuelensis.
Sabe-se que IgE participa da resposta imune desenvolvida pelo hospedeiro
em diferentes infecções por nematódeos, principalmente através da sua ligação
em
diferentes
granulócitos
como
mastócitos
e
basófilos
promovendo
desgranulação celular e liberação de mediadores solúveis originando lesões no
tegumento do parasito (Turner & Kinet 1999; Negrão-Corrêa et al. 2001).
Verificamos neste trabalho que a ausência de IL-4 impede a atuação deste
mecanismo durante a infecção por S. venezuelensis, visto que camundongos
deficiente da produção de IL-4 não foram capazes de produzir IgE. Os eosinófilos
são células amplamente encontradas no sítio de infecção de diferentes
nematódeos. Estas células contêm grânulos de proteínas catiônicas como
Peroxidase de Eosinófilo (EPO) enzima responsável pela degradação de paredes
celulares de diferentes nematódeos e Proteína Básica Principal (MBP) proteína
tóxica para diferentes parasitos e bactérias (Rothenberg & Hogan 2005). Além
destas proteínas, eosinófilos podem liberar citocinas, quimiocinas e mediadores
141
lipídicos constituindo-se desta forma como células efetoras potentes (De veer et
al. 2007). A atuação de eosinófilos no sítio inflamatório intestinal depende de
ações coordenadas de algumas citocinas (IL-4, IL-5 e IL-13), moléculas de adesão
e quimiocinas (Löscher & Saathoff, 2008). Verificamos neste trabalho que a
ausência de IL-4 diminui significativamente os níveis de EPO intestinal durante a
infecção por S. venezuelensis, evidenciando a deficiência da participação de
eosinófilos na eliminação do parasito. Outro mecanismo atribuído a IgE e
eosinófilos na eliminação de diferentes nematódeos é conhecido como
citotoxicidade celular dependente de anticorpos, neste trabalho, a ausência de IgE
aliada a diminuição dos níveis de EPO intestinal em resposta a ausência de IL-4
impede o estabelecimento ADCC por estes elementos frente a infecção por S.
venezuelensis. Os neutrófilos também são reconhecidos como importantes
componentes de resposta protetora durante a infecção por nematódeos. Após a
infecção os neutrófilos são rapidamente recrutados para o sítio de infecção do
parasito. Essas células trabalham em coordenação com outras populações de
celulares, incluindo eosinófilos e macrófagos (Anthony et al. 2007). Estudos
realizados in vitro têm demonstrado que neutrófilos pode promover a eliminação
de diferentes nematódeos principalmente em conjunto com anticorpos e
complemento (Venturiello et al. 1995; de Messias et al. 1994). Outros trabalhos
demonstram a participação de neutrófilos na resposta imune protetora promovida
pela infecção por S. venezuelensis (Galioto et al. 2006). Verificamos que a
ausência de IL-4 diminui significativamente a participação de neutrófilos no
mecanismo de eliminação de S. venezuelensis do intestino do hospedeiro. Desta
forma, verificamos através da execução deste trabalho que IL-4 regula a
142
participação de diferentes elementos na eliminação de S. venezuelensis, como
principalmente IgE, eosinófilos e neutrófilos. Entretanto, sabe-se que IL-4 também
participa de outros mecanismos efetores na eliminação de nematódeos aqui não
investigados. Diferentes trabalhos evidenciam a participação direta de IL-4 e/ou IL13 na mucosa intestinal promovendo alteração de contração muscular em
infecções por T. spiralis e N. brasiliensis (Zhao et al. 2003), proliferação de células
epiteliais em infecções por T. muris (Cliffe et al. 2005) e diferenciação de células
caliciformes produtoras de RELM-β.(Artis et al. 2004). Diferentes autores
correlacionam IL-4 na ativação alternativa de macrófagos (Gordon et al. 2003;
Anthony et al. 2007) e na consequente indução de RELM-α, RELM-β e arginase,
moléculas que participam de mecanismos protetores em diferentes espécies de
parasitos (knigh et al. 2004; Nair et al. 2005; Wang et al. 2005; Anthony et al.
2006). Adicionalmente, IL-4 também tem sido implicado no aumento da
sensibilidade celular a mediadores de mastócitos em infecções por T. spiralis,
acarretando em morte parasitária (Urban et al. 2000).
Trabalhos utilizando animais previamente expostos a infecção por S.
venezuelensis demonstraram redução de carga parasitária durante a infecção
desafio e relataram que o controle do parasito inicia-se precocemente ocorrendo
redução de larvas no pulmão e eliminação do parasito antes da maturidade sexual
(Fernandes et al. 2008, Eschenazi 2009; Schilter et al. 2010). No segundo dia
após a infecção desafio por S. venezuelensis é possível detectar altos níveis de
IL-4 (Schilter et al. 2010) e altos níveis de IL-10 em sobrenadante de cultura de
células de baço (Fernandes et al. 2008) sendo este aumento de produção de
citocinas frente a re-infecção foi acompanhado por aumento de IgE total, IgG1
143
específica, EPO e MPO na pele e no pulmão e por aumento de EPO intestinal
(Fernandes et al. 2008).
Neste trabalho, confirmamos mais uma vez a indução destes elementos na
re-infecção em camundongos WT. Entretanto, a utilização de camundongos IL-4-/promoveu alterações relevantes neste quadro e algumas delas foram diferentes da
observada em camundongos primariamente infectados. Durante a re-infecção por
S. venezuelensis, os camundongos IL-4-/- apresentaram carga parasitária
significativamente mais elevada, tanto no pulmão quanto no intestino, em relação
a camundongos WT. Camundongos IL-4-/- re-infectados também apresentaram
atraso na eliminação do parasito, pois aos 7 dias após a infecção desafio os
camundongos WT já haviam sido capazes de eliminar completamente o verme
intestinal enquanto que os deficientes ainda apresentaram muitos vermes. O papel
da produção de IL-4 na re-infecção por nematódeos ainda encontra-se pouco
investigado, sendo que os dado aqui apresentados constituem a primeira
evidência direta da participação de IL-4 no mecanismo de eliminação de S.
venezuelensis na re-infecção. Camundongos C57BL/6 deficientes de IL-4 e reinfectados pelo nematódeo apresentaram elevação significativamente os níveis de
IL-10 no intestino enquanto os camundongos BALB/c deficientes de IL-4
mostraram aumento da proporção de células CD4+ no linfonodo mesentérico e
aumento de produção de IL-10 por células CD4+ no linfonodo mesentérico durante
a re-infecção. Entretanto, apesar de termos constatado aumento de IL-10 frente a
re-infecção na ausência de IL-4, não evidenciamos a participação de células Tregs
na eliminação do parasito. Conforme apresentado na infecção primária,
verificamos que a ausência de IL-4 impede a produção de IgE e não acarreta em
144
alterações na produção de IgM pelo hospedeiro previamente exposto a infecção .
Entretanto, verificamos que frente a re-infecção, a ausência de IL-4 diminui os
níveis de produção de IgG1 parasito específica. Diferentemente do apresentado
pela infecção primária, a ausência de IL-4 não promove diferenças na atividade de
EPO frente a re-infecção por S. venezuelensis, entretanto diminui a participação
de MPO na re-infecção. Desta forma, podemos evidenciar que IL-4 regula
diferentes parâmetros da re-infecção por S. venezuelensis como, por exemplo:
indução de células TCD4+, produção de IL-10, produção de IgG1 e neutrofilia
intestinal.
A participação de IL-13 na carga parasitária intestinal e na indução de
resposta imune também foi verificada na infecção por S. venezuelensis. A
neutralização de IL-13 não alterou o perfil de eliminação do parasito intestinal
apresentado por camundongos WT e IL-4-/-. Em concordância com os dados de
Ferreira et al. (2010), nossos dados fornecem evidências diretas que IL-13 não é
essencial para indução da resposta protetora responsável pela eliminação de S.
venezuelensis do intestino de seu hospedeiro. Além de não modificar a carga
parasitária, a neutralização de IL-13 durante a infecção por S. venezuelensis não
alterou a indução de IgE mas favoreceu a ativação de eosinófilos na mucosa
intestinal tanto em camundongos competentes quanto deficientes da produção de
IL-4. Nossos dados revelam ainda que a ausência simultânea de IL-4 e IL-13
reduz a produção de IgM parasito-especifica. Desta forma, estes dados fornecem
evidências diretas que IL-13 não regula a produção de IgE, que um mecanismo
independente de IL-4 e de IL-13rα-1 esteja envolvido na indução de eosinofilia
frente a infecção por S. venezuelensis e que a produção de IgM frente a infecção
145
ao parasito acontece mais eficazmente através da ativação do receptor de IL-4 do
tipo II por IL-13. Entretanto, apesar de IL-13 não atuar em mecanismos de
eliminação do parasito, no nosso modelo experimental, foi possível verificar que
vermes intestinais apresentaram maior fecundidade quando desenvolvem em
hospedeiros geneticamente deficientes em IL-4 e com a produção de IL-13
neutralizada, demonstrando que o controle da fecundidade de S. venezuelensis
na ausência de IL-4 é exercido por IL-13Rα-1.
Uma provável hipótese para justificar maior detecção de EPO nos
camundongos que tiveram a produção de IL-13 neutralizada pelo tratamento com
anticorpo seria a possível participação de imuno-complexos na ativação do
sistema do complemento e consequente ativação de eosinófilos existentes
(Abdelnor et al. 2004). Durante o processo de ativação do complemento são
produzidos fatores intermediários, como C5a, que atraem eosinófilos e outras
células inflamatórias para o sítio de infecção e induzem a expressão de receptores
do complemento na superfície destas células (Janeway 2002), fato que pode
resultar em ligações suficientes para promover desgranulação eosinofílica e morte
do parasito (Meeusen & Balic 2000). Cabe ressaltar que o anticorpo anti-IL-13
utilizado no nosso procedimento experimental foi produzido em coelhos,
reforçando a hipótese de ativação do complemento na desgranulação eosinofílica,
tendo em vista a presença de anticorpos não específicos no soro do coelho. De
forma diferente da apresentada neste trabalho, onde verificamos que IL-13 não
interfere na eliminação de S. venezuelensis, em outro modelo experimental,
Bancroft e colaboradores (2000), comprovaram a participação de IL-13 na
eliminação de T. muris da mucosa intestinal do hospedeiro. Em outro trabalho, foi
146
constatado a importância de IL-13 na ativação de IL-13Rα1 (Ramalingam et al.
2008) para promover a eliminação de N. brasiliensis. Estes diferentes dados em
relação ao nosso demonstram claramente a participação de diferentes citocinas na
eliminação de diferentes espécies de nematódeos e este trabalho esclarece o
papel de IL-4 e IL-13 na eliminação S. venezuelensis. Diferentes modelos
experimentais salientam o papel de IL-13 na indução de mecanismos de
eliminação do parasito. Cliffe et al. (2004) confirmaram a participação de IL-13 na
estimulação do “turnover” de células epiteliais do intestino delgado fazendo com
que houvesse a expulsão de T. muris seu habitat natural. MARILLIER e
colaboradores (2008) demonstraram que a eliminação de N. brasiliensis do
intestino de camundongos está associada a hiperplasia de células caliciformes
dependentes de IL-4, IL-13 e IL-4Rα.
Além de verificarmos o papel de IL-4 e IL-13 no controle da carga
parasitária e na indução da resposta imunológica durante a exposição ao S.
venezuelensis, este trabalho experimental também avaliou a influência da
administração exógena de IL-33 no desenvolvimento do nematódeo. Verificou-se
que o tratamento com IL-33 exógena contribui para a expulsão de T. muris da
mucosa intestinal de camundongos e também contribui para o aumento da
patologia associada a infecção (Humphreys et al. 2008). Apesar disto, nossos
dados demonstraram que IL-33 não é essencial para indução do mecanismo de
eliminação de S. venezuelensis e também não altera o mecanismo de fecundidade
do
parasito,
Entretanto,
a
administração
exógena
de
IL-33
aumentou
significativamente os níveis de produção de IgE por camundongos geneticamente
deficientes da produção de IL-4. Trabalhos anteriores, Schmitz e colaboradores
147
(2005) demonstraram que a administração diária intraperitoneal de IL-33 para
camundongos
C57BL/6 selvagens
promove esplenomegalia,
aumento da
produção de IL-5 e IL-13 e consequente eosinofilia e aumento de IgE no soro.
Desta forma, baseado nos dados obtidos neste trabalho, verificamos que na
infecção por S. venezuelensis a ausência de IL-4 é prejudicial ao hospedeiro, pois
aumenta a carga parasitária e promove atraso da eliminação do parasito tanto em
infecções primárias quanto em re-infecções. Verificamos ainda que IL-13 e IL-33
não são elementos essenciais para a eliminação do parasito, apesar de IL-13 ser
importante para a indução de mecanismos de anti-fecundidade.
148
8. CONCLUSÕES
149
•
A ausência da produção de IL-4 acarreta em maior carga parasitária no
pulmão e no intestino frente a infecção primária e re-infecção por S.
venezuelensis.
•
A deficiência de produção de IL-4 acarreta em atraso na eliminação de S.
venezuelensis do intestino de camundongos.
•
A ausência da produção de IL-4 não altera a fecundidade de S.
venezuelensis.
•
Em infecções primárias por S. venezuelensis, a deficiência de produção de
IL-4 acarreta na diminuição de células CD4+ no linfonodo mesentérico, de
IL-5 e IFN-γ no intestino de camundongos BALB/c e na diminuição da
produção de IL-10 no intestino de camundongos C57BL/6.
•
Em infecções primárias por S. venezuelensis, a ausência de IL-4 acarreta
na ausência de produção de IgE total e diminuição dos níveis de EPO e
MPO intestinais em camundongos C57BL/6.
•
Em infecções secundárias a ausência de IL-4 acarreta em uma maior
proporção de células CD4+ no linfonodo mesentérico, em aumento da
proporção de células CD4+ produtoras de IL-10 em camundongos BALB/c e
em aumento de IL-10 no tecido intestinal de camundongos C57BL/6.
150
•
Em infecções secundárias, a deficiência da produção de IL-4 acarreta na
ausência de produção de IgE total, na diminuição da produção de IgG1
parasito reativa e na diminuição de mieloperoxidase de neutrófilos no
intestino de camundongos C57BL/6.
•
A neutralização de IL-13 não altera a eliminação de S. venezuelensis do
intestino de camundongos C57BL/6, entretanto aumenta a fecundidade do
parasito.
•
A neutralização de IL-13 diminui a produção de IgM em camundongos
C57BL/6 geneticamente deficientes da produção de IL-4 e aumenta a
atividade de EPO em camundongos C57BL/6 selvagens e geneticamente
deficientes da produção de IL-4.
•
A administração de IL-33 não promove alterações na carga parasitária
intestinal e na fecundidade de S. venezuelensis em camundongos BALB/c.
•
A administração de IL-33 induz aumento de produção de IgE total em
camundongos BALB/c geneticamente deficientes da produção de IL-4.
151
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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