MAYRA XIOMARA HERNÁNDEZ SANABRIA FISIOPATOLOGIA DA

MAYRA XIOMARA HERNÁNDEZ SANABRIA
FISIOPATOLOGIA DA Babesia bovis: MOLÉCULAS DE
ADESÃO EXPRESSADAS EM CÉLULAS ENDOTELIAIS
(ICAM-1, VCAM, PECAM-1, E-SELECTINA E
TROMBOSPONDINA)
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa de Pós-Graduação
em Medicina Veterinária, para obtenção do
título de “Magister Scientiae”.
VIÇOSA
MINAS GERAIS - BRASIL
2002
A Dios, a mi familia y a mis amigos.
Todos los que ayudaron en mi camino.
Dedico este trabajo.
iii
AGRADECIMENTO
A Deus, pelas infinitas graças recebidas.
A meus pais, Ofélia e Gustavo, minhas irmãs Johanna e Diana e
minhas avós Rosita e Mita, pelo amor, o imenso apoio e o incentivo.
Aos meus professores Marlene Isabel Vargas Viloria e Joaquim
Hernán Patarroyo Salcedo, pela valiosa orientação, pelo carinho e amizade
em todo este tempo e por ser mais que meus professores, uma família para
mim.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais
(FAPEMIG) e à Universidade Federal de Viçosa pelo suporte financeiro e
estrutural indispensáveis para a realização deste trabalho.
Ao Departamento de Medicina Veterinária e ao Instituto de Biologia
Aplicado à Agricultura (BIOAGRO) por contribuírem na formação cientifica.
À Universidad Del Tolima, pela formação dada.
A Leandro pelo grande carinho e o apoio que foi mais além das
fronteiras.
Aos meus queridos amigos da Colômbia que ainda estão aqui Alba,
Ximena, Irma, Gloria, Maria Fernanda, Claudia Carmen, Catalina, Luis,
Ramon e Fabio e aos que já foram embora Leonardo, Claudia, Juan Carlos,
Teresa e Fernando, pelo companheirismo e a amizade.
Aos meus colegas de mestrado Daniela, Policarpo, Marcelo, pela
amizade e a ajuda em todo momento.
iv
A Sidimar pela colaboração e participação na coleta de material no
inicio do experimento e a Marcinho pela paciência para coletar o sangue no
transcurso.
Aline e a Marcinho pela assessória técnica, nos momentos de
dificuldade.
A meus colegas de laboratório, Ana Paula e Bruno pela ajuda e a
convivência agradável.
A Bráulia e a Ricardo pela amizade e grande colaboração.
A minhas companheiras de república Mayra, Márcia, Thais e Luciana
que fizeram mais agradável minha estadia nesta cidade.
A Olinto pelo auxilio imprescindível na realização dos cortes por
congelamento.
Aos funcionários Cláudio e Adão, do Laboratório de Histopatologia
Veterinária, pelo preparo dos cortes histológicos.
A todo o pessoal do estábulo pela ajuda.
A José Carlos e Cauzinho por toda a colaboração e cuidados no trato
com os animais no isolamento.
A todos que direta ou indiretamente colaboraram para a execução
deste trabalho, muito obrigada!
v
BIOGRAFIA
MAYRA XIOMARA HERNÁNDEZ SANABRIA, filha de Gustavo
Hernández Ávila e Ofélia Sanabria de Hernández, nascida em 4 de março de
1978, na cidade de Ibagué-Tolima-Colômbia.
Ingressou no curso de Medicina Veterinária da Universidad del Tolima
em 1994, concluindo sua graduação no ano 2000.
Iniciou o curso de Mestrado em Medicina Veterinária na Universidade
Federal de Viçosa em agosto de 2000.
vi
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS.......................................................................
RESUMO....................................................................................................
ABSTRACT................................................................................................
1. INTRODUÇÃO.......................................................................................
2. REVISÃO DE LITERATURA..................................................................
2.1 Fisiopatologia da babesiose bovina...........................................
2.2 Moléculas envolvidas na adesão...............................................
2.2.1 Moléculas expressas na superfície das hemácias
parasitadas.................................................................
2.2.2 Moléculas de adesão das células endoteliais.............
2.2.2.1 Moléculas de adesão estudadas
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnneste trabalho.....................................
2.2.3 Citoaderência..............................................................
2.2.4 Estudos de citoaderência in vitro..............................
3. OBJETIVOS...........................................................................................
3.1 Objetivo geral.............................................................................
3.2 Objetivos específicos.................................................................
4. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................
4.1 Animais......................................................................................
4.2 Amostra de Babesia bovis.........................................................
4.3 Inoculação dos animais ............................................................
4.4 Obtenção das células endoteliais ............................................
4.5 Confirmação das características de célula endotelial ..............
4.6 Anticorpos usados.....................................................................
4.7 Estimulo da adesão...................................................................
4.8 Delineamento experimental.......................................................
4.9 Testes de adesão de eritrócitos em células endoteliais............
4.9.1 Cinética de adesão......................................................
4.9.2 Testes de adesão em células estimuladas.................
4.10 Imunohistoquímica em cultura de células endoteliais para
identificação de moléculas de adesão in vitro...........................
4.11 Imunohistoquímica para identificação de moléculas de
adesão in situ............................................................................
4.12 Imunohistoquímica para identificação de antígenos de
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Babesia bovis............................................................................
5. RESULTADOS.......................................................................................
5.1 Estabelecimento dos cultivos de células endoteliais.................
5.2 Comprovação da natureza endotelial das BUVECs..................
5.3 Cinética de adesão de eritrócitos em células não
................estimuladas ...............................................................................
5.3.1 Avaliação clínica
5.4 Testes de adesão de eritrócitos em BUVECS estimuladas.....
5.5 Imunohistoquímica para identificação de moléculas de
nnnnnnnnadesão in vitro............................................................................
5.6 Expressão de moléculas de adesão in situ...............................
5.7 Imunohistoquímica para detecção de antígenos de B. bovis....
6. DISCUSSÃO..........................................................................................
7. CONCLUSÕES......................................................................................
7.1 Perspectivas futuras..................................................................
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................
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LISTA DE ABREVIATURAS
ARDS – Síndrome similar à síndrome respiratória aguda
BAECs – Células Endoteliais de Aorta Bovina
BUVECs – Células Endoteliais de Veia Umbilical Bovina
BbovUFV1 – amostra de Babesia bovis UFV1
CAMs – Moléculas de adesão
CSA – Sulfato A de Condroitina
CD – “Cluster of Differentiation”
Dil-Ac-LDL–1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine
perchlorate
DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle’s Médium
EDTA – Acido Etileno diamino tetracetico
ELAM-1– Molécula-1 de adesão endotelial leucocitária ou CD62-E
GPI – Glicosilfosfatidilinositol
HPR – Proteína Rica em Histidina
ICAM-1 – Molécula de Adesão Intercelular 1
IFN-γ – Interferon Gamma
IgG – Imunoglobulina G
IL-1 – Interleucina 1
LFA-1 – Antígeno de Função Leucocitária 1
LPS – Lipopolissacarídeos
MHC – Complexo de Histocompatibilidade Principal
ON – Óxido Nítrico
ix
PAP – Peroxidase anti-peroxidase
PBMC – Células Mononucleares Periféricas Bovinas
PECAM-1 – Molécula de Adesão Plaqueta- Célula Endotelial 1
PfEMP1 – Proteína de Membrana Eritrocitária 1 do Plasmodium falciparum
PMNN – Polimorfonucleares neutrófilos
rbTNF-α – TNF-α recombinante
TNF-α – Fator de Necrose Tumoral alfa
TSP – Trombospondina
VCAM – Molécula Vascular de Adesão Celular
VESA 1 – Antígeno Variável de Superfície Eritrocitária 1 da Babesia bovis
VLA-4 – Antígeno Leucocitário Tardio 4
x
RESUMO
HERNÁNDEZ SANABRIA, Mayra M.S., Universidade Federal de Viçosa,
setembro de 2002. Fisiopatologia da Babesia bovis: moléculas
de adesão expressadas em células endoteliais (ICAM-1, VCAM,
PECAM-1, E-selectina e trombospondina). Orientadora: Marlene
Isabel Vargas Vilória. Conselheiros: Joaquín Hernán Patarroyo Salcedo e
João Carlos Pereira da Silva.
Foram isoladas células endoteliais de veia umbilical bovina (BUVECs)
com a finalidade de determinar a expressão de moléculas de adesão como
ICAM-1, VCAM, PECAM-1, E-selectina e trombospondina na fisiopatologia
de B. bovis num estudo in vitro. Posteriormente esta expressão foi
confirmada, num estudo in situ, em tecidos (cérebro, pulmão e rim) de
animais que morreram após inoculação com amostra patogênica de Babesia
bovis (BbovUFV1 7a passagem). Eritrócitos dos animais infectados foram
testados quanto à capacidade de aderir em BUVECs determinando a
cinética de adesão. Os mesmos testes de adesão foram realizados em
BUVECs estimuladas com plasma de animais infectados com B. bovis e
sobrenadante de cultura de PBMC bovino estimulado com peptídeo sintético
proveniente da RAP-1 de B. bovis contendo citocinas quantificadas (IFN-γ,
TNF-α e IL-12). Houve aumento significativo na adesão de eritrócitos de
animais inoculados em BUVECs estimuladas com plasma e sobrenadante
de PBMC. Entretanto, adesão foi observada somente para eritrócitos não
parasitados, sugerindo que antígenos livres de B. bovis no soro marcam
eritrócitos não parasitados, ou ainda uma possível expressão de uma
isoforma de VESA-1 não aderente. Aderência não foi observada nos testes
xi
com amostras dos animais negativos. As células estimuladas com plasma de
animais
infectados
e
com
sobrenadante
de
PBMC
mostraram
imunomarcação positiva muito mais intensa de ICAM-1, VCAM, PECAM-1,
E-selectina e trombospondina que as células que não receberam estímulo.
Igualmente no estudo in situ foi observado aumento na expressão de ICAM1, VCAM, PECAM-1, E-selectina e trombospondina em tecidos como
cérebro, pulmão e rim dos bovinos infectados com B. bovis em comparação
ao grupo controle. Estes resultados sugerem que as interleucinas, liberadas
na fase aguda da babesiose, estimulam a expressão das moléculas de
adesão relacionadas à fisiopatologia da babesiose causada por B. bovis,
fato demonstrado in vitro pela expressão das moléculas em BUVECs e a
citoaderência de eritrócitos. Estes achados demonstram similaridades na
fisiopatologia de B. bovis e do Plasmodium falciparum.
xii
ABSTRACT
HERNÁNDEZ SANABRIA, Mayra M.S., Universidade Federal de Viçosa,
September of 2002. Physiopathology of Babesia bovis: adhesion
molecules expressed on endothelial cells (ICAM-1, VCAM, PECAM-1,
E-selectin and thrombospondin). Adviser: Marlene Isabel Vargas
Vilória. Counselors: Joaquín Hernán Patarroyo Salcedo and João Carlos
Pereira da Silva.
Endothelial cells from bovine umbilical vein (BUVECs) were isolated
with the purpose of determining the expression of ICAM-1, VCAM, PECAM1, E-selectin and thrombospondin in the physiopathology of Babesiosis
caused by B. bovis. Later, this expression was confirmed by in situ study,
using tissue samples (brain, lung and kidney) of animals that died after
inoculation with a pathogenic strain of B. bovis (BbovUFV1 7th passage).
Erythrocytes of infected animals were tested in order to observer capacity of
binding to BUVECs and its adhesion kinetics. The same adhesion tests were
made on BUVECs stimulated with plasma of animals infected with B. bovis
and culture supernatant of bovine PBMC, stimulated with the synthetic
peptide RAP-1 of B. bovis containing quantified cytokines (IFN-γ, TNF-α and
IL-12). There was a significant increase in the adhesion of erythrocytes of
animals inoculated in BUVECs stimulated with plasma and supernatant of
PBMC.
However,
adhesion
was
observed
only
on
non-parasitised
erythrocytes, suggesting that free antigens of B. bovis in the serum can prime
erythrocytes non-parasitised, or still a possible expression of an isoform of
VESA-1 non adherent. Adherence was not observed in the tests with
samples of the negative animals. Cells stimulated with infected animals
xiii
plasma and with supernatant of PBMC showed stronger expression of ICAM1, VCAM, PECAM-1, E-selectine and thrombospondin, them cells that didn't
receive stimuli. In the same way, it was observed strong expression of ICAM1, VCAM, PECAM-1, E-selectine and thrombospondin in tissue samples of
brain, lung and kidney in bovines infected with B. bovis, when comparing to
the control group. These results suggest that Interleukins, liberated in the
acute phase the Babesiosis, stimulate the expression of adhesion molecules
related to the physiopathology of Babesiosis caused by B. bovis, as
demonstrated by the expression of molecules in BUVECs and erythrocytes
cytoadhesion. These date demonstrate physiopathologycal similarities
between B. bovis and Plasmodium falciparum.
xiv
1. INTRODUÇÃO
A babesiose bovina, também conhecida como piroplasmose, é causada
nas Américas por duas espécies de hematozoários, Babesia bovis e Babesia
bigemina que estão amplamente distribuídas entre 40oN e 32oS do Equador.
Em condições naturais, estes hematozoários são transmitidos pelo carrapato
Boophilus microplus. Em oito países de América Latina esta doença causa
perdas econômicas anuais estimadas em 1,5 bilhões de dólares (REY
VALEIRÓN, 1998).
Nos países de clima tropical e subtropical a babesiose constitui fator
limitante para o desenvolvimento da pecuária, devido aos sérios problemas que
produz, tais como: alta taxa de mortalidade e morbidade, perdas na produção
de carne e leite, elevados custos de medidas profiláticas e de controle da
doença.
Ocasionalmente, Babesia bovis pode também ser transmitida ao homem
por meio dos carrapatos infectados e produzir a morte, principalmente em
pessoas esplenectomizadas (RISTIC & LEWIS, 1977)
Dentro das diferentes alterações fisiopatológicas causadas por B. bovis,
estão as modificações na membrana dos eritrócitos, expressão de proteínas de
superfície que medeiam a adesão dos eritrócitos nas células endoteliais dos
1
capilares seguidos de seqüestro de hemácias parasitadas e não parasitadas,
nos capilares dos órgãos internos, obstrução vascular, anoxia tecidual e lesões
graves com perda de função dos órgãos.
A inter-relação hospedeiro-parasita de Babesia bovis e Plasmodium
falciparum é provavelmente regulada por mecanismos semelhantes. Nos dois
tipos de infecção, ocorre desordem circulatória generalizada com ativação do
sistema de coagulação, liberação de peptídeos vaso-ativos, consumo de
fatores do complemento, hipotensão, vasodilatação e hemólise terminal. As
duas doenças estão caracterizadas por baixa parasitemia, usualmente um por
cento ou menos, e febre alta. A lesão mais característica é o seqüestro de
eritrócitos nos leitos capilares, especialmente no cérebro (WRIGHT et al., 1989;
REY VALEIRÓN, 1998).
O estudo da dinâmica do processo de citoaderência, bem como a
caracterização das moléculas expressas pelo parasita e seus ligantes, abrem
uma nova perspectiva para o desenvolvimento de formas de controle e
prevenção da babesiose bovina. Pode-se produzir peptídeos baseados na
estrutura dos antígenos responsáveis pela adesão, que competem pelos
receptores endoteliais, evitem a adesão de eritrócitos e impeçam o
desenvolvimento de lesões associadas à adesão. Alternativamente, existe a
possibilidade de identificar epítopos imunogênicos conservados entre as
isoformas de uma proteína ligante às moléculas de adesão e, a partir daí,
desenvolver vacinas capazes de induzir anticorpos bloqueadores eficazes.
Estudos
realizados no Laboratório de Biologia e Controle de
Hematozoários/ DVT – BIOAGRO/UFV, demonstraram a adesão ex vivo de
eritrócitos de animais inoculados com amostras virulentas de B. bovis,
provenientes de diferentes regiões geográficas do país, em células endoteliais
de aorta bovina.
Estudos sobre a expressão de moléculas de adesão tais como ICAM-1,
PECAM-1, VCAM, E-selectina e trombospondina em bovinos infectados
experimentalmente com B. bovis, é um passo para estabelecer as bases de
futuras pesquisas sobre o papel destas moléculas em outras doenças
específicas.
2
Por outro lado, é necessário conhecer o papel das moléculas de adesão
na fisiopatologia da babesiose bovina causada por B. bovis, com o intuito de se
obter alternativas de controle e tratamento.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
A babesiose é uma doença infecciosa produzida por um parasita
intraeritrocitário do gênero Babesia, que pode afetar mamíferos domésticos e
silvestres. A gravidade do quadro clínico e os níveis de mortalidade dependem
da espécie, da amostra do parasita e do grau de imunidade dos hospedeiros
(RISTIC & KREIER, 1981). Ocorre em países tropicais e subtropicais
localizados em regiões a 32oS e 40oN de latitude. Essa distribuição é definida
pela
ecologia
dos
vetores,
que
encontram
plenas
condições
de
desenvolvimento neste tipo de clima. Assim, a babesiose pode ser identificada
em grande parte da África, sul da Europa, sul da Ásia, América Central e do
Sul e ilhas do Caribe (KUTTLER, 1988).
Os agentes causadores da babesiose são classificados dentro do
subreino
Protozoa,
filo
Apicomplexa,
classe
Aconoidasida,
ordem
Piroplasmorida, família Babesiidae e gênero Babesia. As espécies de babesia
que afetam bovinos são B. bovis, B. bigemina, B. divergens, B. ovata, B.
jakimovi, B. occultans e B. major (KUTTLER, 1988). No Brasil, foram
identificadas apenas as duas primeiras, sendo a mais patogênica a B. bovis
(PATARROYO et al., 1982).
4
A B. bigemina é uma espécie considerada menos patogênica,
normalmente associada à anemia não complicada. Já a B. bovis é altamente
patogênica, capaz de causar complicações inflamatórias generalizadas e
obstrução da microcirculação por eritrócitos parasitados em órgãos como
cérebro e pulmões, levando à disfunção dos mesmos (MAHONEY, 1977).
As perdas econômicas causadas pela babesiose são difíceis de calcular.
Elas são determinadas por muitos fatores, alguns dos quais são facilmente
quantificáveis, enquanto outros passam despercebidos pelo produtor (RISTIC &
KREIER, 1981). A mortalidade de animais é a conseqüência mais evidente da
doença. Os maiores índices ocorrem entre animais Bos taurus, principalmente
entre os não imunes recém introduzidos em áreas endêmicas. A produção de
cruzamentos entre zebuínos e taurinos não tem gerado resultados satisfatórios,
pois os híbridos não guardam características de resistência e produtividade que
tornem sua utilização vantajosa perante os animais puros (BOCK et al., 1999).
Os prejuízos econômicos causados pelo complexo carrapato e doenças por ele
transmitidas, no Brasil, foram avaliados em mais de um bilhão de dólares por
ano (HORN & ARTECHE, 1985).
A transmissão da B. bovis aos bovinos se dá pela picada de carrapatos
da família Ixodidae. Em geral, a transmissão de B. bovis em uma área está
associada a um único vetor, mas a associação pode mudar de uma região para
outra. Assim, na Austrália e na América do Sul a B. bovis é transmitida pelo
Boophilus microplus, na África pelo Boophilus annulatus e na Europa pelo
Rhipicephalus bursa (FRIEDHOFF, 1988).
O ciclo de vida da B. bovis começa com a inoculação na corrente
sangüínea das formas infectantes: os esporozoítos, presentes na saliva dos
carrapatos infectados. Os esporozoítos penetram nas hemácias e se
diferenciam em trofozoítos, que se multiplicam assexuadamente pelo processo
de divisão binária simples ou múltipla. A divisão dos trofozoítos dá origem a
dois merozoítos que saem para infectar outras hemácias. O ciclo se repete,
com a diferenciação dos merozoítos em trofozoítos e divisão, a cada oito horas.
Após alguns ciclos de replicação, parte dos merozoítos pode se desenvolver a
gametócitos masculinos ou femininos que continuarão o ciclo da B. bovis no
carrapato (MELHORN & SCHEIN, 1984).
5
Os merozoítos podem ser arredondados ou piriformes, com 1 a 2,5µm
de diâmetro e se apresentam únicos ou em pares dentro da hemácia. A análise
da ultraestrutura mostra que o merozoíto é circundado por uma película
formada de duas membranas e uma camada de microtúbulos. Numa das
extremidades da célula encontra-se o complexo apical formado de diversas
organelas especializadas: as roptrias, micronemas e anel polar (RUDZINSKA,
1981). Os merozoítos livres apresentam ainda uma capa formada de fibrilas
protéicas perpendiculares à membrana plasmática. Essa capa e as organelas
do complexo apical são importantes no processo de invasão da célula
hospedeira (IGARASHI et al., 1988).
A penetração do merozoíto no eritrócito se dá inicialmente com a fixação
do mesmo sobre a hemácia. Esta é uma interação extremamente específica e
a B. bovis não invade outro tipo celular. Isto implica que existe(m) receptor(es)
no eritrócito que reconhece(m) molécula(s) complementar(es) no parasita,
provavelmente presentes na capa externa do merozoíto (BUSHELL et al.,
1991).
Logo após a ligação, há uma reorientação do merozoíto sobre a
superfície do eritrócito, de maneira que o complexo apical entra em contato
com a membrana plasmática. O conteúdo das roptrias e micronemas é liberado
sobre a membrana eritrocitária, induzindo à formação de um vacúolo e
internalização do merozoíto. No interior da hemácia hospedeira, a membrana
do vacúolo é destruída e o merozoíto fica em contato com o citoplasma (JACK
& WARD, 1981).
2.1 Fisiopatologia da babesiose bovina
A fisiopatologia da babesiose produzida pela B. bovis é muito similar à
da malária provocada pelo P. falciparum. Em ambas infecções, a proliferação
dos patógenos no organismo é acompanhada de três eventos responsáveis
pelo desenvolvimento de lesões: a) destruição de hemácias; b) liberação de
mediadores químicos farmacologicamente ativos que produzem alterações
circulatórias e c) seqüestro de eritrócitos parasitados na microcirculação
(WRIGHT, et al., 1988). O grau de lesão provocada depende da amostra de B.
6
bovis e P. falciparum e da susceptibilidade do hospedeiro (WRIGHT &
GOODGER, 1988).
A anemia manifestada na babesiose e na malária é resultado direto da
ruptura dos eritrócitos pela saída de merozoítos. Na babesiose, o aumento da
atividade fagocitária do sistema monocítico-fagocitário do baço e do fígado,
para retirada de células parasitadas da circulação, também eleva a taxa de
retirada de eritrócitos normais e contribui para a anemia (MAHONEY, 1977).
A B. bovis produz esterases capazes de converter a pré calicreína
plasmática em calicreína ativada (WRIGTH & GOODGER, 1973). Esta última
desencadeia a cascata de produção de bradicinina. A calicreína e a bradicinina
são potentes vasodilatadores e causam estase sangüínea e hipotensão
(WRIGHT & KERR, 1977). Além disto, elas atuam em conjunto na ativação da
coagulação pela via do fator de Hageman. Ao contrário do que inicialmente se
pensava, a ativação da coagulação não leva à formação de trombos, mas a um
profundo distúrbio no metabolismo do fibrinogênio, representado pelo acúmulo
de intermediários solúveis da conversão de fibrinogênio em fibrina. Os mais
importantes são monômeros de fibrina ou fibrina complexada com fibrinogênio
(WRIGTH, 1981). No sangue, estes complexos podem aumentar a viscosidade
do
plasma
e
agravar
os
problemas
de
circulação
iniciados
pela
calicreína/bradicinina (WRIGHT & GOODGER, 1988).
Outros mediadores também citados como causadores de distúrbios
circulatórios na babesiose são as aminas biogênicas: histamina e 5hidroxitriptamina (WRIGHT, 1978) e as anafilotoxinas C5a e C3a. As duas
últimas são liberadas na via alternativa do complemento, desencadeada por
proteases da B. bovis (WRIGHT & GOODGER, 1988).
A vasodilatação provocada por mediadores liberados na fase aguda da
malária e da babesiose e as alterações de membrana, com redução na
deformabilidade dos eritrócitos parasitados, favorecem a adesão na medida em
que diminuem a velocidade do fluxo sangüíneo nos leitos vasculares e
aumentam a interação entre a superfície dos eritrócitos parasitados e células
endoteliais (SCHETTERS & EILING, 2000).
A conseqüência patológica da adesão é a obstrução da microcirculação
por eritrócitos parasitados. Segundo WRIGHT et al. (1989) a anoxia tecidual
resultante da obstrução vascular leva a necrose e liberação local de fatores
7
pró-inflamatórios que induzem a quimiotaxia e diapedese de leucócitos. Os
neutrófilos infiltrados desgranulam enzimas proteolíticas, intensificando as
lesões iniciadas pela anoxia. Macrófagos também são atraídos aos sítios
inflamatórios e secretam fator de necrose tumoral - α (TNFα), interferon gama
(IFNγ) e interleucina 1 (IL-1), que estimulam o endotélio a expressar moléculas
de adesão envolvidas na infiltração leucocitária, potencializando o processo de
infiltração destas células.
Na malária, foi identificado um mediador – o glicofosfatidilinositol (GPI) –
que tem sido apontado como responsável pela ativação da resposta
inflamatória sistêmica (SCHOFIELD et al., 1996). O GPI atua sobre macrófagos
e células endoteliais induzindo a síntese de IL-1, IFN-γ e TNF-α. Estas
substâncias são responsáveis pela febre, desequilíbrios metabólicos e
caquexia associada à malária. Elas também induzem a liberação de óxido
nítrico que leva a vasodilatação periférica, estase sangüínea e lesão tecidual
(CLARK & SCHOFIELD, 2000). Acredita-se que as severas anormalidades
orgânicas que acontecem durante a infecção aguda com B. bovis, similares às
observadas durante a malária experimental, são mediadas em parte por
citocinas inflamatórias, incluindo INFγ, TNF-α e óxido nítrico (ON). Clones de
linfócitos T CD4+ estimulados com sobrenadante de cultura de B. bovis que
continha IFN-γ e TNF-α, induziram a produção de ON em macrófagos bovinos.
Também foi relatado que macrófagos bovinos produziram ON depois da
exposição in vitro a merozoítos ou membrana de merozoítos de B. bovis e a
uma fração lipídica de eritrócitos infectados com B. bovis, mas não
completamente dependente de IFN-γ (STICH et al., 1998; SHODA et al., 2000).
Pesquisas realizadas por SHODA et al. (2000) relataram que
macrófagos ativados derivados de monócitos estimulados com B. bovis,
expressam níveis elevados de citocinas inflamatórias, como a IL-1β, IL-12 e
TNF-α, que são importantes para o estimulo da imunidade inata e adaptativa
contra protozoários. Foi demonstrado in vitro que a produção do ON por
macrófagos bovinos em resposta a eritrócitos infectados com B. bovis reduz a
viabilidade do parasita. Porém, esta produção de ON pelos macrófagos foi só
parcialmente responsável pela inibição do crescimento da B. bovis, sugerindo
que fatores adicionais contribuem para a inibição da replicação do parasita.
8
Estes achados demonstram que B. bovis induz uma resposta imune inata
capaz de controlar a replicação do parasita e que poderia resultar na
sobrevivência do hospedeiro e na persistência do parasita. GOFF et al. (2002)
encontraram que INF-γ e TNF-α são co-estimulantes da expressão de ON
induzido em monócitos bovinos estimulados com merozoítos de B. bovis, e
esta expressão pode ser inibida por IL-4 e IL-10.
Um evento muito importante na fisiopatologia da babesiose e da malária
é o seqüestro de eritrócitos parasitados no interior dos capilares e vênulas póscapilares, que resulta da adesão entre a membrana dos eritrócitos parasitados
e das células endoteliais. Isto ocorre porque os parasitas produzem
modificações estruturais e antigênicas na superfície eritrocitária que se
constituem em sítios de ligação para receptores expressos em células
endoteliais (AIKAWA, 1988; AIKAWA et al., 1990 e 1992; PONGPONRATN et
al., 1991; MACPHERSON et al., 1985; SCHETTERS & ELING, 2000). No
entanto, os mecanismos usados pela B. bovis para induzir o seqüestro de
eritrócitos parasitados e não parasitados, não tem sido bem esclarecido
(ALLRED et al., 2000).
Na malária causada por P. falciparum, o desenvolvimento do trofozoíto
induz a reorganização de partículas protéicas dentro da bicamada lipídica da
membrana eritrocitária e a formação de projeções superficiais cônicas
denominadas de “knobs” eritrocitários. Estruturas correspondentes foram
observadas em hemácias parasitadas com trofozoítos de B. bovis, tendo porém
um formato de projeções espiculares. Estas protrusões constituem os pontos
onde a membrana do eritrócito entra em contato com a superfície da célula
endotelial e onde provavelmente ocorre a interação entre as moléculas de
adesão (AIKAWA et al., 1985). Proteínas do P. falciparum, como a Proteína de
Membrana Eritrocitária 1 (PfEMP1), são inseridas na superfície dos “knobs”
eritrocitários e se ligam a receptores endoteliais como ICAM-1 (Molécula de
Adesão Intercelular 1), VCAM-1 (Molécula Vascular de Adesão Celular 1) e
CD36 (HOWARD et al., 1988; SCHRAVENDIJK et al., 1991). Nas projeções
espiculares dos eritrócitos parasitados com B. bovis foi identificada a proteína
VESA 1 (Antígeno Variável de Superfície Eritrocitária 1) que se acredita ser
responsável pela adesão, apesar de ainda não serem conhecidos seus ligantes
endoteliais (O’CONNOR & ALLRED, 2000).
9
Alterações na composição lipídica da membrana do eritrócito também
podem favorecer a adesão. Hemácias parasitadas com B. bovis e P. falciparum
apresentam aumento da concentração total de lipídeos, especialmente
fosfatidilcolina, e exposição de fosfatidilserina na superfície externa da
membrana plasmática (FLORIN-CHRISTENSEN et al., 2000). A peroxidação
destes lipídeos torna a superfície da hemácia susceptível à ligação de
proteínas, inclusive antígenos livres de B. bovis e P. falciparum, que por sua
vez poderiam se ligar a receptores endoteliais (WRIGHT et al., 1989).
Testes de adesão ex vivo desenvolvidos por CAETANO (2001)
demonstraram o aumento da adesão de eritrócitos não parasitados,
provenientes de animais inoculados com amostra patogênica de B. bovis
(BbovUFV1, 7a passagem), em células endoteliais de aorta bovina. A adesão
pode ter resultado de modificação da superfície dos eritrócitos por antígenos de
B. bovis adsorvidos do plasma que se ligaram a receptores específicos
presentes na superfície das células endoteliais.
Na malária, além da adesão ao endotélio dos eritrócitos parasitados,
também se observa a agregação de eritrócitos não parasitados em torno de
eritrócitos parasitados. A agregação de eritrócitos forma estruturas chamadas
de rosetas, que pelo seu tamanho, ficam retidas nos pequenos vasos. Na
roseta, a proximidade dos eritrócitos permite que os merozoítos passem
diretamente de uma hemácia a outra, facilitando a proliferação destes parasitas
(WAHLGREN et al., 1989). Esta adesão é mediada pela mesma proteína
(PfEMP1) que provoca a adesão dos eritrócitos parasitados em células
endoteliais (HANDUNNETTI et al., 1992; ROWE et al., 1997). Na babesiose,
WRIGHT (1972) observou que a ligação de fibrina à superfície das hemácias e
à superfície endotelial pode levar ao estabelecimento de “pontes” de fibrina,
proporcionando a adesão de eritrócitos parasitados e não parasitados. Já,
trabalhos realizados por SCHETTERS & EILING (2000), indicam que a
liberação em grande quantidade de monômeros de fibrina pode levar à mesma
agregação, visto que a fibrina tem afinidade pela superfície dos eritrócitos.
O seqüestro de eritrócitos na malária e na babesiose é mais acentuado
nas vênulas e capilares do sistema nervoso central - especialmente do
encéfalo -. As lesões resultantes levam ao desenvolvimento de sinais e
sintomas nervosos, caracterizando os quadros de babesiose e malária
10
cerebral, fatais na maioria dos casos (AIKAWA et al., 1992). A participação de
leucócitos no desenvolvimento das lesões neurológicas parece ter menor
importância, visto que estas células são raramente observadas em estudos
histopatológicos de cérebros de pacientes afetados de babesiose ou malária
cerebral (AIKAWA, 1988; MACPHERSON et al., 1985).
Outros
órgãos
que
apresentam
acúmulo
de
eritrócitos
na
microcirculação são coração, rim, pulmão e mucosa intestinal. Nestes órgãos, a
porcentagem de vasos obstruídos é menor que no cérebro, porém a infiltração
leucocitária é mais extensa. Na malária e na babesiose, ocorre uma síndrome
similar à síndrome respiratória aguda (ARDS), na qual há seqüestro de
eritrócitos e neutrófilos nos capilares pulmonares e edema alveolar, trazendo
sérias alterações respiratórias, que são possivelmente as maiores causas de
morte na babesiose bovina (WRIGHT et al., 1989).
2. 2 Moléculas envolvidas na adesão
2. 2. 1 Moléculas expressas na superfície das hemácias parasitadas
O P. falciparum expressa um grupo de proteínas de alto peso molecular
(200-350 kDa) que são inseridas nos “knobs” da membrana eritrocitária. Quatro
proteínas já foram identificadas: as Proteínas Ricas em Histidina 1 e 2 (HRP1 e
HRP2) e as Proteínas de Membrana Eritrocitária 1 e 2 (PfEMP1 e PfEMP2). As
HRP e PfEMP2 participam da formação dos “knobs” e a PfEMP1 é a
responsável pelo processo de citoaderência (AIKAWA, 1988).
Existe pouca informação a respeito das proteínas envolvidas no
processo de adesão causada por B. bovis. ALLRED et al. (1993 e 1994)
apontaram a presença de proteínas produzidas por merozoítos de B. bovis e
expressas na superfície de eritrócitos parasitados, levantando a possibilidade
das mesmas estarem envolvidas no processo de adesão eritrocitária. Em 1997,
O’COONOR et al. descreveram características de tais proteínas, denominandoas VESA 1 (Antígenos Variáveis de Superfície Eritrocitária). Essas moléculas
são funcionalmente relacionadas com as proteínas PfEMP1 do P. falciparum.
A molécula VESA 1 constitui um conjunto de proteínas diméricas, cuja
estrutura apresenta regiões de variabilidade. As duas cadeias (VESA 1a e
11
VESA 1b) têm pesos diferentes e estão ligadas covalentemente entre si, mas
não se definiu ainda como elas ficam ancoradas na membrana do eritrócito
(O’CONNOR et al., 1997). Estudos de imunoeletronmicroscopia mostraram que
os antígenos VESA 1 estão localizados na superfície das protrusões
espiculares da membrana (O’CONNOR & ALLRED, 2000). Esta localização é
consistente com o possível envolvimento de VESA 1 na adesão e seqüestro de
hemácias, porém não existe evidência direta deste papel.
Em 1999, O’CONNOR et al., mostraram que clones de B. bovis
positivos para VESA 1 são capazes de produzir adesão de eritrócitos em
células endoteliais de capilares de cérebro de bovino in vitro. Usando uma
variação deste mesmo modelo experimental, O’CONNOR & ALLRED (2000)
conseguiram demonstrar que vários soros capazes de bloquear e reverter a
adesão também podem ser usados para precipitar VESA 1 da superfície de
eritrócitos parasitados. Todos esses achados abrem a possibilidade de VESA 1
ser uma molécula de adesão.
A B. bovis produz exoantígenos solúveis que se ligam à membrana de
hemácias. Estes exoantígenos também foram identificados, por meio de
imunofluorescência, nas células endoteliais de cortes histológicos de cérebro
de animais acometidos de babesiose cerebral. A afinidade pela superfície tanto
de eritrócitos como de células endoteliais indica que os exoantígenos podem
servir de “ponte” entre os eritrócitos e o endotélio e provocar adesão (RISTIC &
KAKOMA, 1988)
CAETANO (2001) demonstrou com testes de hemaglutinação, a
presença de antígenos livres de B. bovis 12
dias após a inoculação dos
animais com amostra patogênica BbovUFV1 7a passagem, coincidindo com o
desenvolvimento
de
parasitemia.
Os
antígenos
livres
também
foram
demonstrados por imunofluorescência indireta em esfregaços de sangue
periférico dos animais inoculados, detectando a presencia de eritrócitos não
parasitados reativos a anticorpos anti-BbovUFV1, indicando que antígenos
livres de B. bovis podem se ligar à superfície eritrocitária.
12
2. 2. 2 Moléculas de adesão das células endoteliais
As moléculas de adesão são membros de uma família de proteínas
associadas à membrana que participam na interação célula - célula e migração
celular
em condições fisiológicas e patológicas, incluindo desenvolvimento
normal, doenças inflamatórias, desordens autoimunes e tumores malignos
(YAMAMOTO et al., 2002).
Diversas
moléculas
presentes
em
células
endoteliais
foram
demonstradas como capazes de sustentar a adesão de eritrócitos parasitados
por
P.
falciparum
em
experimentos
in
vitro.
As
principais
são
a
Trombospondina (TSP), CD36, E-selectina, Sulfato A de condroitina (CSA),
CD31, ICAM-1 e P-selectina. Algumas linhagens de P. falciparum também são
capazes de se ligar a VCAM-1 (XIAO et al., 1996; ALLRED, 1995; FUSAI et
al., 2000; VALIYAVEETTIL et al., 2001). As moléculas de adesão CD36, ICAM
e E-selectina têm sido encontradas em pacientes que morreram de malária
cerebral (OCKENHOUSE et al., 1992; GARETH et al., 1994).
As moléculas de adesão também têm um papel importante na
fisiopatologia de outras doenças como no caso da gastrite induzida pelo
Helicobacter pylori, onde foi demonstrada a participação destas moléculas na
saída de leucócitos ao espaço extravascular. Na seqüência de eventos do
extravasamento de leucócitos, E-selectina participa no rolamento dos
leucócitos; VCAM-1 e ICAM-1, na adesão e transmigração. Quando os
neutrófilos são ativados por um estrato líquido de H. pylori, a molécula CD11b/
CD18 (Mac-1) é expressa sobre a membrana celular dos neutrófilos por vários
minutos, conferindo aos neutrófilos a capacidade de se aderir fortemente nas
células endoteliais humanas com expressão de ICAM-1. Foi também
demonstrado que H. pylori estimula diretamente a expressão de ICAM-1 sobre
células epiteliais gástricas, produzindo injúria da mucosa gástrica óxido
mediada (NAITO & YOSHICAWA, 2002).
Em lesões arterioscleróticas já foi demonstrada a expressão de
moléculas de adesão como ICAM-1, VCAM e E-selectina sobre as células
endoteliais afetadas nestas patologias. As moléculas de adesão (CAMs) são
mediadores inflamatórios vasculares específicos expressas pelo endotélio
ativado,
podendo-se
fazer
predição
13
prematura
de
doenças
arteriais
coronarianas ou síndromes coronarianos agudos no caso do enfarte agudo do
miocárdio, com a medição dos níveis de CAMs solúveis, pois após a expressão
da molécula de adesão a porção extracelular das CAMs é clivada
enzimaticamente,
ficando
no
soro
e
fazendo
possível
sua
medição
(YAMAMOTO et al., 2002; MURPHY et al., 2002). CAMs também têm sido
demonstradas em placas arterioscleróticas e implicadas na iniciação e
desenvolvimento da arteriosclerose em pacientes com diabetes mellitus. Nesse
estudo foi indicado o envolvimento de ICAM-1 solúvel em pacientes diabéticos
que desenvolveram doenças macro-vasculares, convertendo a avaliação dos
CAMs numa potencial forma de prevenir doenças macro-vasculares neste tipo
de pacientes (JUDE et al., 2002).
Em neoplasias, a função molecular e celular das moléculas de adesão
tem um impacto clínico no desenvolvimento de metástase das células
neoplásicas. No câncer de próstata, um dos fatos de maior relevância no
desenvolvimento e progressão desta patologia é o aparecimento de
anormalidades na adesão celular no epitélio da próstata e nas células
cancerígenas. Estas anormalidades se estendem até as estruturas de adesão
intercelular e as moléculas de adesão - principalmente da E-caderina e a
catenina - da matriz extracelular. Também se tem encontrado formas solúveis
de muitas outras moléculas de adesão como a β1-integrina, VCAM-1, Eselectina e ICAM-1 e CD-44 envolvidas nesta patologia (MASON et al., 2002).
Estudos em animais domésticos demonstraram que em cães, o TNF-α
pode induzir in vivo a expressão de P e E-selectina na pele, indicando que
estas selectinas estão envolvidas na transmigração de leucócitos na dermatite
canina (TREMBLAY et al., 2002).
Os ovinos têm sido empregados como modelos experimentais para
facilitar os estudos in vivo do papel das moléculas de adesão na regulação e no
desenvolvimento pré-timico e intra-timico de linfócitos T (SHAO et al., 2001).
Estudos recentes em bovinos têm demonstrado o papel das moléculas
de adesão em algumas patologias como no caso das doenças respiratórias, em
que as moléculas de adesão participam na migração de neutrófilos ao tecido
pulmonar.
Em
infecções
experimentais
com
Mannheimia
haemolytica,
apresentou-se um marcado e rápido influxo de neutrófilos no lúmen broncoalveolar, embora, em doenças induzidas por Herpesvirus bovino apresentou-se
14
um retardado influxo de neutrófilos. Pesquisas indicam que na cascata
inflamatória destas doenças a L, P e E-selectinas atuam na fase de rolamento
dos neutrófilos na parede vascular, ICAM-1 medeia a fase de adesão e
PECAM-1 a diapedese (SOETHOUT et al., 2002). Pesquisas com mamite,
experimentalmente induzida com polissacarídeos, indicaram que a molécula
de adesão CD33 pode estar envolvida no processo de extravasamento para o
leite de células polimorfonucleares neutrófilos (PMNN) e que as enzimas
contidas nos PMNN podem ser parcialmente usadas neste processo (PRINMATIEU et al., 2002).
2.2.2.1 Moléculas de adesão estudadas neste trabalho
E-selectina – também chamada molécula-1 de adesão endotelial
leucocitária ou ELAM-1 (CD62-E) – é uma proteína N-glicosilada de ~100 kDa,
e é uma das principais moléculas de adesão responsável pela regulação dos
primeiros processos na cascata de adesão, ligação e rolamento (VAN
KAMPEN & MALLARD, 2001). E-selectina é uma glicoproteína induzível, da
família das selectinas, que tem na sua estrutura um domínio tipo C que liga
carboidratos, o qual usa para mediar adesão de leucócitos no endotélio. Esta
molécula de adesão é a primeira a ser expressa sobre células endoteliais que
têm sido estimuladas com diferentes tipos de imunomoduladores como
lipopolissacarídeos (LPS) e TNF-α (VAN KAMPEN & MALLARD, 2001),
mediando a ligação de PMNs e algumas sub-populações de linfócitos no
endotélio in vitro (GRABER et al., 1990). JUTILA (1996) e WALCHECK et al.
(1993), relataram o papel da E-selectina bovina na regulação da adesão de
células γδ em modelos in vitro utilizando células endoteliais humanas e bovinas.
Outra forma de E-selectina que pode ter uma função em certas doenças é a
forma solúvel, detectada no plasma de pacientes com certos tipos de câncer
(BENEKLI et al., 1998), em infecções severas (KAYAL et al., 1998) e em
desordens como na doença de Graves (WENISCH et al., 1994), assim como no
sobrenadante de células endoteliais humanas estimuladas (OHNO et al., 1997).
Em animais domésticos a E-selectina solúvel tem sido pouco descrita (VAN
KAMPEN & MALLARD, 2001).
15
A trombospondina (TSP) é uma família de glicoproteínas formada por
cinco membros geneticamente distintos: TSP1-4 e TSP5/COMP (Cartilagem
Oligomeric Matrix Protein). In vitro, as células endoteliais expressam somente
TSP-1 de 450 kDa, que está composta de três subunidades ligadas entre si por
enlaces dissulfeto, cada uma possuindo muitos sítios de ligação celular com
diferentes
afinidades
para
receptores
de
superfície
celular
como
proteoglicanos, sulfatideos, integrinas ou CD36. Pode-se associar, por
exemplo, à glicoproteína de superfície das plaquetas, células endoteliais, ao
colágeno, à heparina e à fibronectina. TSP está presente na matriz extracelular
de uma grande variedade de tecidos e também é produzida e secretada no
plasma por plaquetas, macrófagos e células endoteliais (LAHAV, 1993). TPS1
é uma proteína multifuncional, que também interage com diferentes proteínas
plasmáticas (fibrinogênio e plasminogênio) e matriz protéica (colágeno,
fibronectina, laminina e proteoglicanos). Uma das funções da TSP é mediar
aglutinação e adesão plaquetária na ativação da coagulação e inflamação.
Representa aproximadamente 25% da proteína contida nas plaquetas e é
liberada em lugares de agregação e ativação plaquetária, sugerindo que esta
proteína tem um papel importante na hemostase. A TSP da matriz participa na
regulação da adesão celular, migração, proliferação e diferenciação e está
envolvida em processos fisiopatológicos como a inflamação, rolamento,
cicatrização, angiogênese e metástase. In vitro, TSP1 é requerida para a
adesão
ao
substrato
de
células
endoteliais
em
culturas
primárias
(LOGANADANE et al., 1997). Na malária, a ligação da TSP com a PfEMP1 é
capaz de provocar imobilização de eritrócitos parasitados, porém esta interação
tem baixa afinidade e pouca duração (COOKE et al., 1994). Tem sido
encontrado em parasitas apicomplexos proteínas contendo uma ou mais cópias
de TSP1 humana, as quais são componentes importantes da maquinaria de
locomoção e invasão deste filo de parasitas. Proteínas deste tipo têm sido
identificadas
em
Eimeria
tenella,
E.
máxima,
Toxoplasma
gondii,
Cryptosporidium parvum e em todas as espécies de plasmodium analisadas
(NAITZA et al., 1998).
A Molécula de Adesão Intercelular 1 (ICAM-1) ou CD54, é uma
glicoproteína de 76 – 115 kDa, com cinco domínios extracelulares, que faz
parte da superfamília das imunoglobulinas (DIETRICH, 2002). Esta molécula
16
está expressa constitutivamente em células endoteliais e monócitos e pode ser
induzida ou sobre-regulada em linfócitos B e T, células endoteliais, células
epiteliais e timócitos (VAN KAMPEN & MALLARD, 2001). Estudos in vitro
revelaram que ICAM-1 foi induzida com 1L-1α, 1L-1β, TNF-α, TNF-β, IFN-γ,
sobre múltiplos tipos de células incluindo células hematopoiéticas e fibroblastos
(ROTHLEIN et al., 1991). Esta molécula tem uma função importante no começo
da cascata de adesão ligando neutrófilos ao endotélio. ICAM-1 se liga à
integrina LFA-1 (Antígeno de função Leucocitária 1), Mac-1 ou CD43, da
superfície de leucócitos, para permitir a infiltração dos mesmos através do
endotélio em sítios de inflamação e de resposta imune (DIETRICH, 2002.,
CARLOS & HARLAN, 1994). ICAM-1 também é conhecida como uma das rotas
trans-celulares de entrada de patógenos específicos dentro do sistema nervoso
central (DIETRICH, 2002). A detecção de altos níveis de ICAM-1 solúvel tem
sido relatada e associada com metástase no fígado em câncer da vesícula
biliar, pâncreas, gastrintestinal e de colo uterino (MASON et al., 2002). Baixos
níveis de expressão desta molécula foram descritos sobre células secretoras
em pacientes com endometriose e associada com o aparecimento desta
patologia (PREFUMO et al., 2002).
Tem sido demonstrada a ligação entre a proteína PfEMP1 de P.
falciparum e ICAM-1, CD36, Sulfato A de condroitina (CSA) e P-selectina
(SENEZUK et al., 2001). A molécula PfEMP1 se liga no primeiro domínio Nterminal IgG-like de ICAM-1. Foi descrita em ICAM-1 uma mutação na região
que codifica este primeiro domínio, a qual está presente em alta freqüência
dentro da população africana (CRAIG et al., 2000) e tem sido associada com
susceptibilidade à malária cerebral no Kênia (DIETRICH, 2002). A afinidade de
ICAM-1 pela PfEMP1 é menor que a de CD36 e TSP. Sob condições de fluxo nas quais existem forças contrárias às de fixação de hemácias - tal ligação de
baixa afinidade promove adesão com rolamento. ICAM-1 diminui a velocidade
de passagem das hemácias, facilitando a interação de CD36 e TSP com seus
ligantes (COOKE et al., 1994).
A molécula vascular de adesão celular (VCAM) é uma proteína de 110
kDa, identificada como CD106. Pertence à superfamília das imunoglobulinas e
é uma molécula de adesão induzível, expressa em altos níveis sobre células
endoteliais vasculares estimuladas com citocinas, em sítios de inflamação e
17
infecção (VAN KAMPEN & MALLARD, 2001; VERMONT-DESROCHES, 1995).
Está constitutivamente expressa também sobre as células dendríticas
foliculares e interfoliculares dos linfonodos, mioblastos e alguns macrófagos em
tecido normal (LOBB et al., 1991). É uma molécula importante na migração
leucocitária, servindo como ligante para a integrina leucocitária α4β1 (VLA-4 ou
CD49d/CD29), mediando adesão de monócitos e linfócitos circulantes em
endotélio ativado. Alguns estudos indicam que esta molécula pode compensar
a adesão na falta de interação entre ICAM/LFA-1. VCAM está presente numa
grande variedade de eventos inflamatórios e também sobre a cápsula sinovial e
mesotélio durante inflamação crônica (VAN KAMPEN & MALLARD, 2001;
BEVILACQUA, 1993).
Foram encontradas altas concentrações de VCAM-1 solúvel no soro de
pacientes com endometriose em fase IV, podendo ser usado este achado para
o desenvolvimento de marcadores bioquímicos para serem utilizados no
diagnóstico da fase da doença (BARRIER & SHARPE-TIMMS, 2002). Elevados
níveis de VCAM-1 solúvel também têm sido reportados em pacientes com
câncer gástrico e foram associados com baixa sobrevivência em comparação
com pacientes com níveis sorológicos normais. Além disto, níveis elevados de
VCAM-1 e ICAM-1 solúveis foram encontrados em pacientes com câncer de
colon e associados ao desenvolvimento desta doença da forma local e
metastásica (MASON et al., 2002).
Nos animais domésticos, no caso dos suínos, VCAM é induzida por LPS,
TNF-α e IL-1α in vitro, existindo diferenças na expressão comparada com a
VCAM humana. Em células endoteliais de cordão umbilical ovino, a cinética de
expressão de VCAM foi similar à humana (GROOBY et al., 1997), no entanto, a
cinética de expressão de VCAM em bovinos tem sido pouco estudada.
A molécula de adesão plaqueta-célula endotelial 1 (PECAM-1), também
conhecida como CD31, é uma glicoproteína de transmembrana de 130 a 140kDA que pertence à superfamília das imunoglobulinas, é expressa sobre a
superfície de plaquetas, monócitos, neutrófilos e linfócitos T. CD31 é
constituinte das junções intercelulares endoteliais (SENEZUK et al., 2001;
MÜLLER et al., 2002). Esta molécula é encontrada em grande quantidade em
células endoteliais e é pouco expressa em plaquetas e leucócitos. Em
18
processos inflamatórios, tem um papel importante na cascata de adesão entre
células endoteliais e polimorfonucleares, monócitos e linfócitos. Num modelo
de injúria por complexos imunes, a aplicação de anti PECAM-1 representou a
diminuição de 75% do seqüestro de neutrófilos no pulmão (VALPORCIYAN et
al., 1993). O polimorfismo genético, ligado à raça, apresentado no domínio
extracelular de PECAM-1 pode estar implicado na susceptibilidade à malária
cerebral (KIKUCHI et al., 2001).
2.2.3 Citoaderência em B. bovis
A literatura é restrita quanto à indicação de moléculas endoteliais que
poderiam atuar como mediadores de adesão de eritrócitos parasitados com B.
bovis. Experimentos de adesão in vitro mostraram que hemácias infectadas por
B. bovis aderem a superfícies tratadas com trombospondina, laminina
(PARRODI et al., 1989) e heparina (GOODGER et al., 1987). Os autores não
indicam qual a natureza do antígeno eritrocitário que atua como ligante.
WRIGHT et al. (1989) também apontam a trombospondina, em conjunto
com a fibronectina, como mediador de adesão. Segundo estes autores, a
trombospondina e fibronectina se ligam a monômeros de fibrina, os quais são
formados em grande quantidade durante a fase aguda da babesiose. Estes
monômeros têm afinidade pela superfície dos eritrócitos e assim podem mediar
a ligação com a fibronectina e trombospondina presentes na membrana da
célula endotelial.
Não existem relatos de que CD36, trombospondina ou ICAM-1 possam
servir como ligantes de VESA-1. No entanto, ALLRED et al. (2000)
identificaram, em uma das cadeias de VESA-1 (VESA 1a), uma seqüência de
aminoácidos muito similar ao sítio de ligação da PfEMP1 em CD36.
No trabalho desenvolvido por CAETANO (2001), ficou demonstrada a
presença de antígenos livres de B. bovis em amostras de soro coletadas dos
animais a partir de 12 dias após a inoculação com BbovUFV1 patogênica,
coincidindo com o desenvolvimento de parasitemia. É possível que as células
endoteliais de aorta bovina expressem algum receptor que possa reconhecer
tais antígenos nos eritrócitos sensibilizados e mediar a adesão. A ocorrência de
adesão de eritrócitos não parasitados, provenientes de animais inoculados, em
19
células endoteliais de aorta bovina é indicativo de que antígenos de B. bovis,
presentes
nos
eritrócitos,
estabeleceriam
interações
específicas
com
receptores presentes apenas em células endoteliais bovinas. A natureza do(s)
exoantígeno(s) e do(s) receptor(es) que possa(m) ter participado da adesão
das hemácias não parasitadas permanece sem esclarecimento.
A citoaderência se constitui numa vantagem adaptativa para B. bovis e
para o P. falciparum, sendo um dos mecanismos que permitem aos parasitas
escapar do reconhecimento pelo sistema imune do hospedeiro (ALLRED, 1995
e 1998).
Entre as vias de controle da infecção por B. bovis e P. falciparum está a
eliminação de eritrócitos parasitados feita normalmente pelas células NK. A
hemácia, porém, é destituída de MHC (complexo de histocompatibilidade
principal) e por isso não apresenta antígenos a linfócitos T (ALLRED, 1995).
Foi proposto também que os eritrócitos parasitados poderiam ser
eliminados por fagocitose pelos macrófagos. Neste caso, as células infectadas
seriam opsonizadas por anticorpos específicos (IgG1 e IgG2) contra antígenos
de B. bovis (BROWN & PALMER, 1999).
O bloqueio dos sítios de interação das moléculas de adesão na
superfície eritrocitária por meio de anticorpos específicos poderia inibir a
citoaderência, diminuindo o desenvolvimento de lesões e sinais clínicos da
malária e babesiose (ALLRED, 1998). Isto é confirmado por estudos que
mostram que humanos imunes, vivendo em áreas endêmicas de malária,
possuem anticorpos capazes de reconhecer a superfície de eritrócitos
parasitados e que a ocorrência de tais anticorpos está relacionada à proteção
contra a doença (MARSH et al., 1989). Além do mais, a proteção contra a
doença pode ser transferida passivamente de um indivíduo imune para um não
imune
através
do
soro
ou
imunoglobulina
de
um
indivíduo
imune
(SABCHAREON et al., 1991). A presença de anticorpos contra eritrócitos
parasitados também está correlacionada com a proteção contra babesiose
bovina (MAHONEY et al., 1979). Trabalhos realizados por O’CONNOR &
ALLRED (2000) demonstraram que no soro de animais inoculados com o clone
MO7 de uma amostra patogênica de B. bovis, existem anticorpos (IgG)
específicos para VESA 1 capazes de bloquear e até mesmo reverter a adesão
de eritrócitos parasitados in vitro.
20
No entanto, a presença de tais anticorpos não impede que animais
infectados com B. bovis ou humanos parasitados com P. falciparum
desenvolvam infecções crônicas, o que indica que existem mecanismos que
permitem aos dois hemoparasitas escaparem da resposta mediada por
anticorpos. Dentre eles, a variação antigênica clonal é o principal (ALLRED,
1998).
Foi demonstrado que a proteína dimérica VESA 1 é a responsável pela
variação antigênica clonal em populações de B. bovis (ALLRED et al., 1994).
Recentemente o gene ves1α, que codifica o peptídeo VESA 1a, foi
caracterizado, inúmeras cópias do mesmo gene estão presentes em todos os
cromossomos da B. bovis, mas apenas uma cópia é expressa por vez dentro
de uma população clonada (derivada de um único indivíduo). Há indícios que a
variação na expressão de VESA 1a ocorre devido ao aparecimento, na
população, de indivíduos que sofreram modificações da cópia de ves1α
expressada, talvez por meio de conversão gênica. Isto difere muito da
regulação dos genes var do P. falciparum, no qual o maior mecanismo é a
troca in situ dos genes expressos (ALLRED et al., 2000).
Com a variação antigênica, a resposta de anticorpos contra uma
estrutura de membrana e todos os mecanismos dela dependentes apresenta
eficácia limitada. A cada mudança nos antígenos de superfície expressos pela
população, uma nova resposta imune deve ser ativada. Dessa maneira, a B.
bovis e o P. falciparum escapam da eliminação completa (ALLRED, 1998).
O fato da variação antigênica e capacidade de adesão estarem ligadas
às mesmas moléculas cria um paradoxo. A variação antigênica pode aumentar
a diversidade das moléculas de adesão e permitir a evasão à resposta imune
humoral. Por outro lado, a mesma variação é limitada pelo fato de que
alterações na seqüência de aminoácidos das proteínas mediadoras de adesão,
não podem alterar sua capacidade de se ligar aos receptores endoteliais
(BIGGS et al., 1992). Assim, as seqüências de aminoácidos das proteínas
envolvidas na ligação com os receptores e manutenção da estrutura espacial
dos sítios de ligação devem ser conservadas (BARUCH et al., 1997).
21
2.2.4 Estudos de citoaderência in vitro
O principal interesse no estudo da adesão é criar mecanismos que
possam bloquear a citoaderência e impedir as lesões por ela causadas. Para
isso, uma das estratégias traçadas é a imunização dos indivíduos contra as
moléculas responsáveis pela citoaderência, de maneira a induzir a produção de
anticorpos bloqueadores. O desenvolvimento de vacinas, no entanto, deparase com o problema da diversidade antigênica das moléculas de adesão entre
os diferentes isolados dos parasitas e na variação antigênica clonal destas
proteínas dentro de um mesmo isolado. A obtenção de uma vacina eficiente
depende da identificação de epítopos funcionais (envolvidos na adesão)
conservados e que tenham capacidade imunogênica (PASLOSKE & HOWARD,
1994).
Os modelos in vitro, usados para elucidar as interações entre eritrócitos
infectados e células endoteliais, envolvem o uso de linhagens de células
endoteliais isoladas de diversos órgãos ou células transfectadas com genes de
receptores de superfície de células endoteliais. Os eritrócitos provenientes de
cultivos in vitro dos parasitas são colocados sobre as células para indução da
adesão. Modificações na metodologia, como bloqueio de moléculas de
superfície conhecidas antes da adição de células parasitadas, permitem
caracterizar as interações ao nível molecular e definir ligantes que medeiam a
adesão (GAY et al., 1995).
No estudo com P. falciparum foram identificadas várias linhagens
celulares capazes de sustentar a adesão in vitro, incluindo células endoteliais
de veia umbilical humana, com alta expressão de ICAM-1 (UDEINYA et al.,
1981); de capilares cerebrais e microvasculatura dérmica humana (JOHNSON
et al., 1993., PRUDHOMME et al., 1999); células endoteliais de pulmão
humano (MUANZA et al., 1996); células de melanoma amelanótico CD32r, com
alta expressão de CD36 (SCHIMIDT et al., 1982); células CHO transfectadas
com genes de ICAM-1 e CD36 (HASLER et al., 1993; MUANZA et al., 1996) e
células endoteliais de microvasculatura cerebral de macacos Saimiri (GAY et
al., 1995; FUSAI et al., 2000). Foi o uso destes modelos que permitiu identificar
a TSP, ICAM-1 e CD36 como mediadores de adesão de eritrócitos parasitados
(PASLOSKE & HOWARD, 1994).
22
VAN KAMPEN & MALLARD (2001) tem estudado a regulação da
expressão de moléculas de adesão como a E-selectina em células endoteliais
de aorta bovina (BAEC), estimuladas com TNF-α recombinante (rbTNF-α) e
LPS. Outros trabalhos realizados pelos mesmos autores têm estudado a
expressão de ICAM-1 e VCAM-1 em BAECs, utilizando anticorpos humanos
anti VCAM-1, ICAM-1 e E-selectina demonstrando reatividade cruzada para as
mesmas moléculas de adesão em bovinos.
Para estudos com B. bovis não há uma quantidade comparável de
modelos. O’CONNOR et al. (1999) demonstraram que células endoteliais de
microvasculatura cerebral de bovinos são capazes de promover a adesão de
eritrócitos parasitados in vitro. No entanto, a aplicação desta linhagem é
recente e ainda não foram definidos os receptores que promovem a interação.
KILGER (1999) desenvolveu um modelo de adesão em que se utilizam
células endoteliais de aorta bovina. Neste estudo, o autor observou maior
número de eritrócitos aderidos provenientes de sangue de animais inoculados
com amostras de B. bovis em comparação com eritrócitos de animais não
inoculados.
CAETANO (2001) avaliou o desenvolvimento de adesão de eritrócitos de
bovinos em BAEC, mediante a inoculação dos animais com várias amostras
patogênicas de B. bovis, encontrando adesão de eritrócitos não parasitados
reativos a anticorpos anti-B. bovis, indicando que antígenos livres de B. bovis
podem se ligar à superfície de eritrócitos não parasitados.
23
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Avaliar o envolvimento das moléculas de adesão (ICAM-1, VCAM,
PECAM-1 E-selectina e trombospondina) na fisiopatologia de Babesia bovis
através da expressão em células endoteliais in vitro e in situ.
3.2 Objetivos específicos
•
Cultivar células endoteliais a partir de veia umbilical bovina para estabelecer
um modelo experimental in vitro.
•
Identificar as moléculas de adesão ICAM-1, PECAM-1, VCAM, E-selectina e
Trombospondina, expressas pelas células endoteliais de veia umbilical que
mediam o seqüestro dos eritrócitos infectados com Babesia bovis.
•
Identificar por métodos imunohistoquímicos as moléculas de adesão em
células endoteliais de capilares de tecidos, coletados de animais infectados
com Babesia bovis.
24
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Animais
Foram empregados oito animais Bos taurus da raça Jérsei, machos com
24 meses de idade, negativos sorológica e parasitologicamente para
hematozoários. Todos os animais foram mantidos em condições de isolamento
a prova de artrópodes e outros vetores de hemoparasitas, no Departamento de
Medicina Veterinária da UFV.
4.2 Amostra de Babesia bovis
Foi utilizada a amostra de Babesia bovis (BbovUFV1 7a passagem),
patogênica. Esta amostra foi isolada na Zona da Mata, na microrregião de
Viçosa – MG, reproduzida por passagens em bezerros esplenectomizados,
congelada em sangue total diluído v/v em PBS (Na2HPO4 6,4mM, KH2PO4
10mM, NaCl 73mM) pH 7,6 acrescida de 22% de DMSO e mantida em
nitrogênio líquida, no Laboratório de Biologia e Controle de Hematozoários do
DVT – BIOAGRO/UFV.
25
4.3 Inoculação dos animais
Sete animais foram inoculados por via intravenosa com a amostra
patogênica de B. bovis (BbovUFV1 7a passagem) em uma dose de
6,6x107 parasitas e um animal foi mantido como controle negativo. Cinco
destes animais inoculados foram utilizados no experimento da cinética de
adesão, e dois na identificação das moléculas de adesão in situ, os quais
morreram 14 e 15 dias pós-inoculação respectivamente. Após necropsia,
foram coletadas amostras de tecido (cérebro, rim e pulmão), para
processamento imunohistoquímico. Os animais utilizados no experimento
da cinética de adesão, foram farmacologicamente tratados contra a
infecção 17 dias após inoculação.
4.4 Obtenção das células endoteliais
A obtenção das células endoteliais a partir da veia umbilical bovina
denominadas BUVECs, foi realizada de acordo com protocolo descrito por
FRESHNEY (1994), e modificado por KILGER (1999), onde foi substituída a
solução salina tamponada contendo 0,5% de soro-albumina bovina (PBSA), por
Solução de Sais Balanceados de Hank (HBSS): (KCl 5.4mM, KH2PO4 0.44mM,
NaCl 137mM, NaHCO3 4.2mM, Na2HPO4, 0.34mM e D-Glucose 5,6mM) para
lavagem da luz da veia umbilical e das células recém extraídas.
Um segmento de cordão umbilical bovino, de aproximadamente 40
centímetros, foi obtido imediatamente após o parto, sendo suas extremidades
ligadas com fio de algodão estéril. Após lavagem externa com álcool a 70%, o
fio de algodão foi substituído por pinças hemostáticas estéreis e a veia
umbilical foi preenchida com solução HBSS estéril. O material foi transportado
ao laboratório – num tempo máximo de 15 minutos – submerso em solução de
HBSS e mantido em banho de gelo. O isolamento das células foi feito em
capela de fluxo laminar vertical. O lume da veia umbilical foi lavado por meio de
injeções repetidas de HBSS aquecido a 37oC. Após a lavagem, a veia umbilical
foi preenchida com 10 ml de uma solução de Colagenase Tipo II (Gibco®) a
0,25% em PBS contendo 0,5% de soro albumina bovina. Após 10 minutos de
26
digestão a temperatura ambiente, retirou-se a solução de colagenase contendo
células endoteliais e novamente lavou-se o lume do vaso com HBSS sendo
novamente preenchido com a mesma quantidade de colagenase 0,25%. Este
procedimento foi repetido três vezes. As alíquotas foram imediatamente
centrifugadas a 300g durante 5 minutos a 4°C e o sedimento obtido era lavado
duas vez por centrifugação em DMEM completo (com 10% de soro fetal bovino,
2mM de glutamina, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 1% antibiótico/antimicótico), a
300g durante 5 minutos. Em seguida, as células foram ressuspendidas em
DMEM completo com 1% de fator de crescimento endotelial (PAESEL +
LOREI®) e semeadas em garrafa para cultura de 75 cm e colocadas em estufa
a 37oC e 5% CO2.
O meio de cultura foi trocado a cada 48 horas e novas subculturas foram
realizadas quando as células endoteliais formavam uma monocamada
confluente. Após a retirada do sobrenadante, a monocamada foi lavada com
PBS pH 7.2 (Na2HPO4 x 7H2O 2,9mM, NaCl 154mM, KH2PO4 1mM) e em
seguida colocou-se 1 ml de solução de PBS contendo 0,2% de EDTA e 0,5%
de tripsina, durante 30 segundos a 37oC. Após o desprendimento das células, a
tripsina foi inativada com 10 ml de uma solução de PBS ph 7.2 acrescido com
5% de soro fetal bovino, e centrifugadas, durante 5 minutos a 300g e 4o C.
Logo em seguida o sedimento foi ressuspendido em meio DMEM completo. As
células foram semeadas em garrafas de cultura de 25cm3 numa concentração
de 3,5x104/ml de DMEM completo.
4.5 Confirmação das características de célula endotelial
Para confirmar que as células isoladas eram endoteliais e que não havia
contaminação com outros tipos celulares, monocamadas de BUVECs foram
incubadas com 10 µg/ml de lipoproteína acetilada de baixa densidade marcada
com 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (Dil-AcLDL; Biomedical Technologies, Stoughton, Mass) por 4 horas. Depois, as
células foram lavadas durante 5 minutos com PBS pH 7,2 (Na2HPO4 x 7H2O
2,9mM, NaCl 154mM, KH2PO4 1mM) , fixadas com PBS pH 7,2 contendo 3%
de formaldeído por 20 minutos a temperatura ambiente, secadas e montadas
27
em lâmina. As células foram examinadas em microscópio de fluorescência com
excitação de 545nm e observadas as emissões em >590 nm.
4.6 Anticorpos usados
Os anticorpos antimoléculas de adesão usados neste experimento são
mostrados no Quadro 1. Todos os anticorpos foram diluídos numa
concentração de 1:80 em solução de PBS pH 7,2 (Na2HPO4 x 7H2O 2,9mM,
NaCl 154mM, KH2PO4 1mM). Os antígenos de B. bovis foram identificados
usando anticorpo de coelho policlonal monoespecífico (IgG de coelho anti-B.
bovis) produzido no Laboratório de Biologia e Controle de Hematozoários
(LBCH) BIOAGRO-UFV.
Quadro 1 – Painel de anticorpos monoclonais utilizados*
Anticorpos
Clone
Origem
Espécies
com
reatividade
conhecida
Anti ICAM-1
(CD54)
Anticorpo
monoclonal de
camundongo
IgG1/κ
15.2
Hibridoma de
esplenócitos BALB/c e
células de mieloma de
camundongo p3-NS1/Ag4-1 (NS1)
Humano
Anti VCAM
(CD106)
Anticorpo
monoclonal de
camundongo
IgG1/κ
B-K9
Hibridoma de
esplenócitos BALB/c e
células de mieloma
X63/Ag. 8-653
Humano
Anti PECAM-1
(CD31)
Anticorpo
monoclonal de
camundongo
IgG1/κ
JC/70A
Hibridoma de
esplenócitos BALB/c e
células de mieloma p3NS-1/Ag4-1 (NS1)
Humano
Anti E-selectina Anticorpo
(CD62E)
policlonal de
coelho
Anti
Anticorpo
Trombospondin monoclonal de
a (TSP)
camundongo
IgG1
Humano,
bovino,
ovino
A6.1
Hibridoma de
esplenócitos BALB/c e
células de mieloma
SP2/Ag14
* Neo Markers 
28
Humano,
ovino
4.7 Estimulo da adesão
Foram empregados plasma e sobrenadante de cultura de células
mononucleares periféricas bovinas (PBMC) para estimular a expressão de
moléculas de adesão nas células endoteliais. O plasma utilizado era
procedente dos animais infectados com amostra patogênica BbovUFV1 7a
passagem, 14 dias após a inoculação e o sobrenadante era proveniente de
cultura de PBMC coletado em pesquisas anteriores e armazenado a -70o C no
LBCH / BIOAGRO-UFV. As culturas de PBMC foram estimuladas com 2µg/ml
do peptídeo sintético 23290, o qual é baseado na estrutura da proteína RAP-1
da B. bovis com o intuito de avaliar a capacidade imunogênica do mesmo
através da produção e secreção de IFN-γ, TNF-α e IL-12. Dosaram-se no
sobrenadante os níveis de citocinas produzidas e secretadas através de teste
de ELISA (AFONSO & SCOTT, 1993). Os sobrenadantes continham: 500 pg/ml
de IFNγ, 2200 pg/ml de TNFα e 875 pg/ml de IL-12 (BATISTA, 2001).
4.8 Delineamento experimental
O trabalho foi dividido em quatro experimentos: a) cinética de adesão em
BUVECs de eritrócitos de animais inoculados b) testes de adesão de eritrócitos
dos animais inoculados em BUVECs estimuladas com plasma
e com
sobrenadante de cultura de PBMC; c) identificação das moléculas de adesão
expressas em BUVECs estimuladas com plasma de animais inoculados e com
sobrenadante de cultura de PBMC; d) identificação das moléculas de adesão
expressas em tecidos (cérebro, pulmão e rim) de animais que morreram após a
infecção com amostra patogênica.
Para o primeiro experimento se utilizaram cinco animais (B1, B2, B3, B4,
B5), os quais foram inoculados com a amostra patogênica de B. bovis, e um
animal (denominado B6) foi mantido como controle negativo. Os animais foram
monitorados para detecção do desenvolvimento de sinais de babesiose aguda.
A partir de um dia antes da inoculação e a cada 48 horas, durante 16 dias pósinoculação, procedia-se à medição da temperatura retal e coletas de sangue
venoso para fazer os teste de adesão, mensuração do hematócrito e confecção
de esfregaços destinados aos exames parasitológicos e obtenção do plasma
29
que era posteriormente estocado a –20oC até o momento do uso. Os exames
para mensuração da parasitemia foram realizados por FIGUEIREDO (2002)
usando a técnica de hidroetidina. As amostras de sangue foram colhidas em
sistema de coleta a vácuo com EDTA (VacumII®, Labnew Indústria e Comércio,
LTDA).
4.9 Testes de adesão de eritrócitos em células endoteliais
Os testes de adesão foram realizados segundo o protocolo de UDEINYA
et al. (1981). Esta técnica foi desenvolvida para observar adesão de eritrócitos
parasitados por P. falciparum, com as seguintes modificações introduzidas por
KILGER (1999) e CAETANO (2001): uso de eritrócitos coletados a partir de
sangue venoso dos bovinos infectados em lugar de eritrócitos mantidos em
cultura in vitro; modificações na composição do tampão de adesão, com
acréscimo de HEPES a 25mM, acréscimo de cálcio e magnésio a 1mM e
substituição de soro fetal bovino a 20% por soroalbumina bovina fração V
(Sigma) a 1%; uso de solução salina tamponada pH 7,2 (PBS) no lugar de
Solução de Sais Balanceados de Hank (HBSS) para lavagem das lamínulas na
etapa final do teste.
4.9.1 Cinética de adesão
Para realizar a cinética de adesão semearam-se células endoteliais
sobre lamínulas de vidro redondas, com 14mm de diâmetro, em placa de 24
poços utilizando DMEM completo (com 10% de soro fetal bovino, 2mM de
glutamina, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 1% antibiótico/antimicótico). Após
formação da monocamada, o DMEM era trocado por tampão de adesão pH 7,2
(RPMI 1640, HEPES 25mM, Soroalbumina bovina 1%, CaCl2 1mM e MgCl2
1mM) e as células incubadas durante 60 minutos a 37oC e 5%CO2. Sangue
total dos animais inoculados e do controle era centrifugado a 300g durante 5
minutos. O plasma e a camada de leucócitos eram descartados e os eritrócitos
lavados uma vez em PBS pH 7,2 (Na2HPO4 x 7H2O 2,9mM, NaCl 154mM,
KH2PO4 1mM) acrescido de CaCl2 e MgCl2 1mM, a 300g durante 5 minutos,
ressuspendidos em tampão de adesão a uma concentração de 1% e colocados
30
sobre a monocamada de células endoteliais. Seguia-se incubação em estufa a
37oC e 5% de CO2 durante 90 minutos. As lamínulas eram lavadas sob
agitação por três vezes, durante 5 minutos cada vez, em PBS pH 7,2 sem Ca+2
e Mg+2, coradas com corante panóptico (Instant Prov®, Newprov, Produtos para
Laboratório, LTDA) de acordo com instrução do fabricante e fixadas sobre
lâminas com resina (Entellan, MERCK). Em microscópio óptico, num aumento
de 1000x, contou-se o número de eritrócitos aderidos em 1000 células
endoteliais em cada lamínula. As amostras de sangue dos animais inoculados
e do controle coletadas por vez, eram testadas em duplicata. O resultado dos
testes foi expresso como média de eritrócitos aderidos em 1000 células
endoteliais. As médias de adesão eritrocitária obtidas nos ensaios foram
comparadas, entre os animais inoculados e o controle por meio de teste “t” de
Student.
4.9.2 Testes de adesão em células estimuladas
Neste experimento cultivaram-se células endoteliais em meio DMEM
completo (com 10% de soro fetal bovino, 2mM de glutamina, 1mM CaCl2, 1mM
MgCl2, 1% antibiótico/antimicótico), sobre lamínulas redondas, 14mm de
diâmetro, em placas de 24 poços. Após a formação da monocamada, o DMEM
era trocado pelo meio contendo a substância estimulante dependendo do
tratamento (Quadro 2).
31
Quadro 2 – Tratamentos utilizados no estímulo de BUVECs
Tratamento
Tempo de
Quantidade
estimulo (h)
1
Plasma de animal
2
infectado com B. bovis +
10 µl de plasma / 1.5 ml
de Tampão
Tampão de adesão sem
Ca+2 e Mg+2
2
Plasma de animal
2
infectado com B. bovis +
10 µl de plasma / 1.5 ml
de tampão
Tampão de adesão com
Ca+2 e Mg+2
3
Sobrenadante de PBMC
2
(citocinas) + DMEM
4
200 µl de sobrenadante
/ 1.5 ml de DMEM
Tampão de adesão com
2
1.5 ml
2
1.5 ml
2
1.5 ml
Ca+2 e Mg+2
5
Tampão de adesão sem
Ca+2 e Mg+2
6
*
DMEM
BUVECs, células endoteliais de veia umbilical bovina
32
Após o estimulo das células endoteliais se colocavam os eritrócitos dos
animais inoculados e do controle e continuava-se com o mesmo protocolo
descrito na cinética de adesão no item 4.9.1. Eritrócitos de animais não
infectados com B. bovis foram utilizados como controle negativo. Em
microscópio óptico, num aumento de 1000x, contou-se o número de eritrócitos
aderidos em 1000 células endoteliais em cada lamínula. As amostras de
sangue de animais inoculados e do controle eram testadas em duplicata. O
resultado dos testes foi expresso em média de eritrócitos aderidos em 1000
células endoteliais. Para saber a significância dos tratamentos, as medias dos
valores de adesão para cada tratamento foram comparadas entre tratamentos
por meio de uma regressão linear múltipla utilizando o software estatístico
Bioestat 2.0.
4.10
Imunohistoquímica
em
cultura
de
células
endoteliais
para
identificação de moléculas de adesão in vitro.
Monocamadas confluentes de BUVECs cultivadas sobre lamínulas de vidro
redondas, 14mm de diâmetro, em placa de 24 poços eram estimuladas com
plasma de animais infectados com B. bovis e sobrenadante de PBMC
correspondendo aos tratamentos 1 e 3 (Quadro 2). Células sem estímulo foram
usadas como controle negativo, tratamento 6. A identificação das moléculas de
adesão foi realizada segundo o protocolo de PRUDHOMME (1996), com
algumas modificações feitas no presente trabalho, tais como: mudança da
solução PBS-0,1% BSA por PBS pH 7,2 (Na2HPO4 x 7H2O 2,9 mM, NaCl
154mM, KH2PO4 1mM), uso de anti-IgG de camundongo biotinilada por IgG de
coelho anti-IgG de camundongo ou IgG de cabra anti-IgG de coelho conjugada
com peroxidase e utilização do DAB como revelador.
As células endoteliais, após estímulo, foram lavadas com PBS pH 7,2
durante 5 minutos, fixadas com solução de paraformaldeído ao 4% durante 20
minutos e lavadas duas vezes com PBS pH 7,2 durante 5 minutos cada vez. As
células eram incubadas com PBS-glicina 0,1 M durante 10 minutos para
bloquear os radicais aldeídos e lavadas duas vezes com PBS pH 7,2 durante 5
minutos cada vez. A monocamada era incubada em solução de H2O2 30 V a
3,5% em PBS pH 7,2 durante 20 minutos para bloquear a peroxidase
33
endógena e após 3 lavagens com PBS pH 7,2 durante 5 minutos cada vez, se
bloquearam as ligações inespecíficas das células usando PBS com 10% de
soro eqüino durante 30 minutos seguido de 2 lavagens de 5 minutos com PBS
pH 7,5. As células eram incubadas durante toda a noite a 4o C em câmara
úmida, com os anticorpos monoclonais antimoléculas
de adesão ICAM-1
(CD54), VCAM (CD106), PECAM-1 (CD-31), E-selectina (CD 62-E) e
trombospondina (TSP) diluídos 1:80 em PBS pH 7,2. Após 3 lavagens de 5
minutos com PBS pH 7,2 a monocamada era incubada durante 50 minutos a
37o C em câmara úmida com 150 µl de IgG de coelho anti-IgG de camundongo
conjugada com peroxidase (Sigma) diluída 1:200 em PBS para os anticorpos
monoclonais anti ICAM-1, VCAM, PECAM-1 e trombospondina; IgG de cabra
anti-IgG de coelho conjugada com peroxidase (Sigma) diluída 1:300 para a Eselectina. Depois de 2 lavagens de 5 minutos com PBS pH 7,2 realizava-se a
revelação com 150 µl de cromógeno (diaminobenzidina DAB, Sigma 0,025%
e 0,2% de H2O2 30 V em PBS), durante 7 minutos no escuro seguida de 2
lavagens de 5 minutos com PBS pH 7,2 e contra-coloração com Hematoxilina
de Harris 1:3 por 3 minutos. Finalmente, as células eram lavadas com água
destilada deionizada durante 5 minutos, secadas, montadas com Entellam
sobre lâmina de vidro e observadas no microscópio óptico.
A intensidade de expressão das moléculas de adesão nas células
endoteliais foi avaliada da seguinte maneira: (-) ausência de expressão, (+)
expressão pouco intensa, (+ +) expressão medianamente intensa, (+ + +)
expressão intensa e (+ + + +) expressão muito intensa.
4.11 Imunohistoquímica para identificação de moléculas de adesão in situ
A identificação das moléculas de adesão foi realizada utilizando a técnica
de imunoperoxidase indireta (Ipx) segundo o protocolo de PRUDHOMME
(1996) com algumas modificações como descrito no item 4.10.
Foram tomadas amostras de tecido (cérebro, pulmão e rim) dos animais
inoculados que vieram a óbito (item 4.3). A coleta das amostras foi realizada
de acordo com protocolo descrito por GARETH et al. (1994). Onde o material
coletado e até 20 minutos após a morte do animal era embebido em nitrogênio
34
líquido durante 30 minutos e estocado a –70o C até o momento do uso.
Amostras de tecidos para controle negativo foram coletados de animais
abatidos para consumo na região de Viçosa - MG. As amostras eram incluídas
em Tissu Freezing Medium (Leica Instruments GmbH) cortadas em criostato a
–31o C, em secções de 6 µm e colocadas em lamina de vidro tratada com
Polipep de alta viscosidade (Sigma) 0,1%. As lâminas eram deixadas para
secar a –31o C durante toda a noite e estocadas a –20o C até o momento do
uso.
As secções de tecido foram fixadas com solução de paraformaldeído ao
4% durante 20 minutos e lavadas duas vezes com PBS pH 7,2 durante 5
minutos cada vez. As lâminas eram incubadas com PBS-glicina 0,1 M durante
10 minutos para bloquear os radicais aldeídos e lavadas duas vezes com PBS
pH 7,2 durante 5 minutos cada vez. As amostras de tecido eram incubadas em
solução de H2O2 30V a 3,5% em PBS pH 7,2 durante 20 minutos para bloquear
a peroxidase endógena e após 3 lavagens com PBS pH 7,2 durante 5 minutos
cada vez, eram bloqueadas as ligações inespecíficas das amostras com PBS
10% de soro eqüino durante 30 minutos e lavadas 2 vezes com PBS pH 7,2
durante 5 minutos cada vez. As lâminas eram incubadas com os anticorpos
monoclonais antimoléculas de adesão ICAM-1 (CD54), VCAM (CD106),
PECAM-1 (CD-31), E-selectina (CD 62-E) e trombospondina (TSP) diluídos
1:80 em PBS durante 2 horas a temperatura ambiente. Após 3 lavagens com
PBS de 5 minutos cada vez, o material era incubado com IgG de coelho antiIgG de camundongo conjugada com peroxidase (Sigma) diluída 1:200 em
PBS pH 7,2 para os anticorpos monoclonais anti ICAM-1, VCAM, PECAM-1 e
trombospondina; IgG de cabra anti-IgG de coelho conjugada com peroxidase
(Sigma) diluída 1:300 para a E-selectina, durante 50 minutos a 37o C em
câmara úmida. Depois de 2 lavagens de 5 minutos com PBS pH 7,2 realizavase a revelação com cromógeno (diaminobenzidina DAB, Sigma 0,025% e
0,2% de H2O2 30V em PBS pH 7,2) durante 7 minutos no escuro, seguindo-se
2 lavagens de 5 minutos com PBS pH 7,2 e contra-coloração com Hematoxilina
de Harris 1:3 por 3 minutos. Finalmente, as lâminas eram lavadas com água
destilada deionizada durante 5 minutos, secadas, montadas com Entellam e
35
lamínula de vidro e observadas no microscópio óptico binocular (Nikon
ECLIPSE E600).
A intensidade de expressão das moléculas de adesão nas células
endoteliais foi avaliada da seguinte maneira: (-) ausência de expressão, (+)
expressão pouco intensa, (+ +) expressão medianamente intensa, (+ + +)
expressão intensa e (+ + + +) expressão muito intensa.
4.12 Imunohistoquímica para detecção de antígenos de Babesia bovis
Os fragmentos de tecido fixaram-se em formol tamponado pH 7,2 durante
48 horas. Após fixação, os fragmentos foram desidratados em soluções
crescentes de álcool (70%, 80%, 90% e 100% I e II), permanecendo durante 24
horas em cada solução. Posteriormente, foram diafanizados em xilol e incluídos
em Paraplast Plus  (Sigma ).
Cortes histológicos seriados de 5µm de espessura foram feitos em
micrótomo de rotação SPENCER (American Optical Company).
Para detecção de antígenos de B. bovis utilizou-se a técnica de Peroxidaseanti-Peroxidase – PAP (PROPHET et al., 1992). O meio de inclusão foi retirado
por duas passagens em xilol de 30 minutos cada, sendo hidratados em
soluções alcoólicas decrescentes (100% I e II, 90%, 80% e 70%) trocando-se
de solução a cada 5 minutos.
A peroxidase endógena foi bloqueada com
peróxido de hidrogênio metanólico 3% durante 30 minutos a temperatura
ambiente. Os cortes foram lavados duas vezes, durante 5 minutos cada, com
PBS pH 7,4 (1,48g de fosfato de sódio dibásico anidro, 0,43g de fosfato de
sódio monobásico anidro, 7,2g de cloreto de sódio e água deionizada q.s.p.
1000ml). Em seguida, cobriram-se os cortes com soro normal caprino diluído
1:10 em PBS pH 7,4 e incubou-se em câmara úmida durante 45 minutos a
temperatura ambiente. Após a incubação, enxugou-se o excesso de soro e
sem deixar secar os cortes colocou-se anticorpo primário específico (IgG de
coelho anti-Babesia bovis), diluído 1:20 em PBS pH 7,4; os cortes foram
incubados durante 18 horas em câmara úmida a 4ºC. Posteriormente, os cortes
foram lavados três vezes com PBS pH 7,4 durante cinco minutos cada e em
seguida
cobertos com o anticorpo secundário (IgG de cabra anti-IgG de
coelho) produzido pelo LBCH / BIOAGRO-UFV, diluído 1:10 em PBS 7,4. Após
36
incubação em câmara úmida, durante 45 minutos a 37ºC, os cortes foram
lavados três vezes, 5 minutos cada,
com PBS pH 7,4 e posteriormente
cobertos com o complexo PAP produzido em coelho (SIGMA), diluído 1:200
de acordo com especificação do fabricante e imediatamente incubados em
câmara úmida, durante 45 minutos a 37ºC. Os cortes foram lavados novamente
em PBS pH 7,4 durante 10 minutos e foram imediatamente colocados em
solução reveladora recém preparada [25mg de diaminobenzidina (DAB), 200µl
de H2O2 (30V) em 100ml de PBS pH 7,4] durante 5 minutos. Finalmente os
cortes foram lavados durante 5 minutos em PBS pH 7,4 e contracorados com
Hematoxilina de Harris 1:10 em PBS pH 7,4 durante 20 segundos, sendo em
seguida desidratados em álcool, diafanizados em xilol e montados com
Entellan entre lâmina e lamínula.
37
5. RESULTADOS
5.1 Estabelecimento dos cultivos primários de células endoteliais
A metodologia utilizada para extração de células endoteliais a partir de
veia umbilical bovina, permitiu cultivos formados por células poligonais
pavimentosas,
que
proliferaram
ativamente
confluentes (Figura 1).
38
formando
monocamadas
Figura 1 – Monocamada de células endoteliais de veia umbilical bovina
(BUVECs), Instant Prov®, 1000x.
39
5.2 Comprovação da natureza endotelial das BUVECs
A natureza endotelial das BUVECs foi confirmada pela capacidade de
degradar e acumular a lipoproteína acetilada de baixa densidade marcada com
1, 1’- dioctadecyl - 3,3,3’,3’ - tetramethylindocarbocyanine perchlorate (Dil-AcLDL) que atua como marcador específico de células endoteliais. Depois de
cinco passagens, as culturas apresentaram-se essencialmente livres de células
contaminantes, indicado pela uniforme habilidade para reter o Dil-Ac-LDL. O
resultado foi típico de células endoteliais, mostrando fluorescência localizada
no citoplasma e na parede celular, mas não no núcleo (Figura 2 A e B).
40
A
B
Figura 2 – Células endoteliais de veia umbilical bovina marcadas com Dil-AcLDL. 200 x (A) e 400x (B).
41
5.3 Cinética de adesão de eritrócitos em células endoteliais não
estimuladas
Conforme mostrado no Quadro 3, observa-se que os valores das médias
de eritrócitos aderidos são muito variáveis em todos os animais a partir do
segundo dia pós-inoculação até o fim do experimento. Ainda, constatou-se que
embora houve aumento das médias de adesão de eritrócitos, a partir do 60 dia
pós-inoculação em todos os animais, não houve diferença significativa entre as
médias de adesão nos diversos dias da amostragem de cada animal.
A figura 3 (A e B) mostra a cinética de adesão no decorrer do
experimento. Observa-se que a partir do dia 2 pós-inoculação aumentam os
níveis de adesão até chegar ao fastígio no dia 8, a partir do qual começam a
diminuir os níveis
até o dia 12, quando se inicia uma nova elevação da
adesão, permanecendo constante até o último dia do estúdio.
Somente eritrócitos não parasitados foram detectados como aderentes
às BUVECs (Figura 4 A e B).
Nos testes com sangue do animal controle (B6) não houve aumento da
média de eritrócitos aderidos em BUVECs, entretanto observa-se adesão de
polimorfonucleares principalmente de neutrófilos (Figura 5).
42
Quadro 3 – Cinética de adesão de eritrócitos provenientes de animais
inoculados com B. bovis (amostra BbovUFV1 7a passagem) aderidos
em células endoteliais de veia umbilical bovina (BUVECs).
Médias de eritrócitos aderidos em 1000 BUVECs
Dia pósinoculação
B1
B2
B3
B4
B5
B6
0
0
0
1.5
0
1
0
2
27.5
15.5
32
20.5
1.5
0
4
49
30.5
40
40
36.5
1.5
a
68
a
64
a
80.5
a
65
a
0a
6
90.5
8
114.5 a
89 a
81 a
89 a
40.5 a
2a
10
81 a
89.5 a
83 a
68.5 a
44 a
0a
12
66.5 a
75.5 a
87 a
69.5 a
46 a
1a
14
97 a
89.5 a
71 a
70.5 a
59.5 a
0a
16
94 a
89.5 a
78 a
72 a
63 a
1.5 a
B1, B2, B3, B4 e B5, animais inoculados com amostra BbovUFV1 7a.passagem
B6, animal controle.
As médias foram calculadas entre duplicatas de um mesmo teste.
a,
Indica médias estatisticamente iguais entre os dias pelo teste t com P<0,01
43
Hemacias aderidas em 100 BUVECs
140
120
100
B1
B2
80
B3
B4
60
B5
B6
40
20
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Dias pós-inoculação
A
Hemacias aderidas em 1000 BUVECs
110
100
90
80
70
60
50
Positivo
40
Controle
30
20
10
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Dias pós-inoculação
B
Figura 3 – A. Cinética de adesão de eritrócitos de animais inoculados com B.
bovis (amostra BbovUFV1 7a passagem) aderidos em células endoteliais
de veia umbilical bovina (BUVECs); B. Cinética de adesão expressada
em médias de eritrócitos de animais inoculados com B. bovis (amostra
BbovUFV1 7a passagem) aderidos em células endoteliais de veia
umbilical bovina (BUVECs).
44
A
B
Figura 4 – Adesão de eritrócitos provenientes de animais inoculados com
amostra de B. bovis (BbovUFV1 7a passagem) em BUVECs (A e B).
Instant Prov®, 1000x. A seta indica a ligação entre eritrócito e célula
endotelial.
45
D
A
B
Figura 5 – Adesão de leucócitos em BUVECs (A e B), Instant Prov , 1000x .
46
5.3.1 Avaliação clínica
Aos 10 dias pós-inoculação, observaram-se eritrócitos parasitados com
merozoítos de B. bovis nos animais B1, B2, B3, B4 e B5 (Quadro 4).
O aparecimento de sinais clínicos de babesiose aguda, caracterizados
por aumento de temperatura retal (igual ou superior a 39oC), redução do
volume globular (igual ou superior a 30%), ocorreu aos 10 dias pós-inoculação
no animal B3, e aos 12 dias pós-inoculação nos animais B1, B2, B4 e B5. O
animal controle B6 não apresentou alterações nos parâmetros clínicos
avaliados.
47
Quadro 4 – Parâmetros clínicos e laboratoriais de animais inoculados com B.
bovis (amostra BbovUFV1 7a passagem).
DIAS PÓS-INOCULAÇÃO
Animal
Parâmetro
0
2
4
6
8
10
12
14
16
PCV%
24
-
24
-
23
-
23
-
22
-
20
+
20
+
15
+
15
+
T( C)
37.5
38.7
38.6
38.4
38.6
38.8
40.5
40.6
41.0
PCV%
30
31
30
28
27
27
26
20
12
P
o
T( C)
37.6
37.6
38.9
38.6
38.3
+
38.2
+
39,7
40.8
+
41.2
PCV%
P
o
T( C)
31
38
31
38.9
30
38.9
28
38.4
25
38.3
20
+
39.3
22
+
40,1
20
+
40.4
20
+
40.1
B4
PCV%
P
o
T( C)
26
37.9
26
38.4
25
38.6
24
38.7
23
38.4
22
+
38.8
24
+
40.2
16
+
40.5
10
+
40.7
B5
PCV%
P
o
T( C)
28
37.5
27
37.9
26
38.7
26
38.3
27
38.2
27
+
37.9
27
+
39.2
24
+
39.2
14
+
39.9
B6
PCV%
P
o
T( C)
30
37.7
28
38
29
38.5
30
37.9
27
38
29
37.5
27
38
28
38.5
28
38
B1
o
B2
B3
B1, B2, B3, B4, B5, animais inoculados com amostra BbovUFV1 7a passagem
B6, animal controle.
PCV, volume globular; P, parasitemia; T, temperatura em graus Celsius
48
5.4 Testes de adesão de eritrócitos em BUVECs estimuladas
Os testes de adesão de eritrócitos em monocamadas de BUVECs,
previamente tratadas conforme descrito no Quadro 2 (Item 4.9.2), mostraram
uma maior adesão de eritrócitos procedentes de animais infectados quando as
BUVECs foram estimuladas com os tratamentos que empregavam plasma e
sobrenadante de PBMC (tratamentos 1, 2 e 3), do que aquela observada nas
células que não receberam estímulo (tratamentos 4, 5 e 6) onde, além da
adesão de eritrócitos, também houve adesão de leucócitos, principalmente
polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos) e alguns linfócitos.
A análise estatística mostra que há diferença significativa (P < 0,05) na
adesão mediada pelo tratamento 3, enquanto que os tratamentos 4, 5 e 6 não
induziram adesão estatisticamente significativa. Já os tratamentos 1 e 2
apresentaram diferença significativa (P < 0,10) (Quadro 5, Figura 6, A, B, C).
Os testes de adesão realizados com eritrócitos do controle negativo,
mostraram adesão somente de leucócitos, principalmente neutrófilos (Figura 5).
49
Quadro 5. Testes de adesão de eritrócitos provenientes de animais inoculados
com B. bovis em BUVECs estimuladas com diferentes tratamentos.
Média de eritrócitos aderidos em
1000 BUVECs
Animal infectado
controle
com B. bovis
Tratamento
1
Plasma de animal infectado
com B. bovis + Tampão de
adesão sem Ca+2 e Mg+2
410*
0
2
Plasma de animal infectado
com B. bovis + Tampão de
adesão com Ca+2 e Mg+2
408*
0
3
Sobrenadante de PBMC
(citocinas) + DMEM
489**
0
4
Tampão de adesão com
Ca+2 e Mg+2
140 N.S
0
5
Tampão de adesão sem
Ca+2 e Mg+2
113 N.S
0
6
DMEM
244 N.S
0
BUVECs, células endoteliais de veia umbilical bovina.
* Diferença significativa (P < 0,10)
** Diferença significativo (P < 0,05)
N.S
Difernça não significativo
As médias foram calculadas entre duplicatas de um mesmo teste.
50
A
B
C
Figura 6 – Adesão de eritrócitos de animais inoculados com B. bovis em
BUVECs estimuladas. A. Estímulo com sobrenadante de cultura de
PBMC; B. Estímulo com plasma; C. Sem estimulo. As setas indicam
adesão de PMN. Instant Prov®. 1000x.
51
5.5 Imunohistoquímica para identificação de moléculas de adesão in vitro
Os resultados da imunoperoxidase indireta utilizando anticorpos
monoclonais contra ICAM-1, VCAM, PECAM-1 e trombospondina, e policlonal
contra E-selectina apresentados no Quadro 6, mostram que a maioria das
BUVECs tem imunomarcação positiva para estas moléculas de adesão,
observadas uniformemente na superfície celular. Entretanto, a imunomarcação
é mais intensa nas células estimuladas com plasma de animal infectado com
B.bovis e com sobrenadante de cultura de PBMC contendo citocinas quando
comparada à observada nas células não estimuladas.
Assim, ICAM-1 apresentou uma expressão intensa em BUVECs
estimuladas com plasma e sobrenadante de PBMC. A expressão desta
molécula em células endoteliais que receberam o tratamento controle foi pouco
intensa (Figura 7 A, B, C).
Nas células endoteliais estimuladas com plasma e sobrenadante, VCAM
teve uma expressão intensa. Nas células endoteliais do tratamento controle
não houve expressão desta molécula (Figura 8 A, B e C).
PECAM-1 teve uma expressão intensa nas células endoteliais
estimuladas com plasma de animal inoculado com B. bovis e apresentou uma
expressão medianamente intensa nas BUVECs estimuladas com sobrenadante
de PBMC. As células endoteliais do tratamento controle mostraram uma
expressão pouco intensa (Figura 9 A, B e C).
A expressão de E-selectina, em células endoteliais estimuladas com
plasma, foi muito intensa. Em células estimuladas com sobrenadante de cultura
de PBMC, esta molécula mostrou expressão intensa se comparada com a
expressão pouco intensa das células do tratamento controle (Figura 10 A, B e
C).
A trombospondina teve uma expressão intensa na superfície das células
estimuladas com plasma e uma expressão pouco intensa nas BUVECs
estimuladas com sobrenadante de PBMC. As células do tratamento controle
não apresentaram expressão desta molécula (Figura 11 A, B e C).
52
Quadro 6 - Intensidade da expressão de moléculas de adesão em BUVECs
Tratamentos
Antígeno
Plasma
Sobrenadante PBMC
DEMEN
ICAM-1
+++
+++
+
VCAM
+++
+++
-
PECAM-1
+++
++
+
+++
+
+
-
E-selectina + + + +
TSP
+++
+ + + +, expressão muito intensa
+ + +, expressão intensa
+ +, expressão medianamente intensa
+, expressão pouco intensa
- , ausência de expressão
53
A
B
C
Figura 7 – Expressão de ICAM-1 em BUVECs. A. Células estimuladas com
plasma; B. Células estimuladas com sobrenadante de PBMC; C. Células
sem estímulo (DMEM). Peroxidase indireta, 400x.
54
A
B
C
Figura 8 - Expressão de VCAM (CD106) em BUVECs. A. Células
estimuladas com plasma; B. Células estimuladas com sobrenadante de
PBMC; C. Células sem estímulo (DMEM). Peroxidase indireta, 400x.o
55
A
B
C
Figura 9 – Expressão de PECAM-1 (CD31) em BUVECs. A. Células
estimuladas com plasma; B. Células estimuladas com sobrenadante de
PBMC; C. Células sem estímulo (DMEM). Peroxidase indireta, 400x.
56
A
B
C
Figura 10 – Expressão de E- selectina (CD62 E) em BUVECs. A. Células
estimuladas com plasma; B. Células estimuladas com sobrenadante de
PBMC; C. Células sem estímulo (DMEM). Peroxidase indireta, 400x.
57
A
B
C
Figura 11 - Expressão de Trombospondina (TSP) em BUVECs. A. Células
estimuladas com plasma; B. Células estimuladas com sobrenadante
de PBMC; C. Células sem estímulo (DMEM). Peroxidase indireta, 400x.
58
5.6 Expressão de moléculas de adesão in situ
Os resultados da imunoperoxidase indireta realizada nas amostras de
cérebro, pulmão e rim dos animais infectados, mostraram heterogeneidade na
expressão das moléculas de adesão pesquisadas, variando apenas na
intensidade de expressão (Quadro 7).
No cérebro dos animais inoculados com B. bovis, ICAM-1 teve uma
expressão muito intensa no endotélio dos capilares cerebrais quando
comparada a observada no endotélio cerebral do animal controle, em que não
se observou expressão de esta molécula (Figura 12 A e B). No tecido pulmonar
dos animais inoculados, esta molécula apresentou uma expressão intensa, em
contraposição da ausência de expressão observada no pulmão controle
(Figura 12 C e D). No tecido renal dos animais que morreram de babesiose,
houve
expressão
intensa
de
ICAM-1,
principalmente
nos
capilares
glomerulares e intertubulares. O rim do animal controle não teve expressão
desta molécula (Figura 12 E e F).
No cérebro dos animais positivos, houve expressão muito intensa de
VCAM, distribuída nas células endoteliais dos vasos; não houve expressão
desta molécula no cérebro controle (Figura 13 A e B). No tecido pulmonar dos
animais positivos, VCAM teve uma expressão medianamente intensa com
pouca expressão no pulmão controle (Figura 13 C e D). No rim dos animais
positivos, VCAM foi expressa intensamente nos capilares glomerulares e
intertubulares; no tecido renal usado como controle, esta molécula não teve
expressão (Figura 13 E e F).
A expressão de PECAM-1 foi muito intensa nas células endoteliais do
cérebro dos animais positivos, e houve ausência de expressão nos endotélios
do cérebro controle (Figura 14 A e B). No pulmão, a expressão de PECAM-1 foi
medianamente intensa, e pouco intensa no tecido pulmonar do animal controle
(Figura 14 C e D). No rim, esta molécula teve expressão pouco intensa e houve
ausência de expressão no rim do animal controle (Figura 14 E e F).
A E-selectina no cérebro dos animais positivos teve expressão muito
intensa principalmente no endotélio vascular e no tecido ao redor dos vasos
(Figura 15 A). No cérebro controle, a expressão foi pouco intensa (Figura 15 B).
No pulmão dos animais inoculados, esta molécula expressou-se muito
59
intensamente em todo o tecido pulmonar, com expressão intensa no pulmão
controle (Figura 15 C e D). No rim dos animais que morreram de babesiose, a
E-selectina teve uma expressão medianamente intensa (Figura 15 E). E o rim
controle, não teve expressão desta molécula (Figura 15 F).
A expressão de trombospondina no cérebro foi muito intensa nas células
endoteliais que fazem parte da microcirculação cerebral. No endotélio dos
vasos cerebrais do controle não se observou expressão de esta molécula
(Figura 16 A e B). No pulmão dos animais infectados a TSP se expressou
muito intensamente nos endotélios dos vasos deste tecido; e no pulmão do
animal controle houve uma expressão medianamente intensa desta molécula
(Figura 16 C e D). No rim dos animais inoculados observou-se uma expressão
muito intensa de TSP nos capilares glomerulares e intertubulares; e no tecido
renal do animal controle não se observou expressão desta molécula (Figura 16
E e F).
Quadro 7 – Intensidade da expressão de moléculas de adesão em diferentes
tecidos
Antígeno
Tecidos
Pulmão
Cérebro
Rim
Infectado
controle
Infectado
controle
com B. bovis
com B. bovis
Infectado
controle
com B. bovis
ICAM-1
+ + ++
-
+++
++
+++
-
VCAM
+ + ++
-
++
+
+++
-
PECAM-1
++++
-
++
+
+
-
E-selectina + + + +
+
++++
+++
++
-
-
++++
++
++++
+
TSP
++++
+ + + +, expressão muito intensa
+ + +, expressão intensa
+ +, expressão medianamente intensa
+, expressão pouco intensa
- , ausência de expressão
60
A
B
C
D
E
F
Figura 12 – Imunoperoxidase indireta. Expressão de ICAM-1 (CD54) em
tecidos de animais infectados com B. bovis. A. forte reação positiva em
vaso do cérebro, 200x; B, vaso controle, 200x; C, reação positiva em
pulmão, 400x; D, pulmão controle, 400x; E, reação positiva em rim,
400x; F, rim controle, 400x. As setas indicam imunomarcação positiva..
61
A
B
C
D
F
E
Figura 13 - Expressão de VCAM (CD106) em tecidos de animais infectados
com B. bovis. A, forte reação positiva em vaso cerebral, 400x; B, vaso
do cérebro controle, 400x; C, reação positiva em pulmão, 400x; D,
pulmão controle, 400x; E, reação positiva em rim, 200x; F, rim controle,
200x. Imunoperoxidase indireta.
62
A
B
C
D
E
F
Figura 14 – Expressão de PECAM-1 (CD31) em tecidos de animais infectados
com B. bovis. A, reação positiva em vaso do cérebro, 400x; B, vaso
do cérebro controle, 400x; C, reação em pulmão positivo, 400x; D,
pulmão controle, 400x; E, reação positiva em rim, 200x; F, rim controle,
200x. Imunoperoxidase indireta. A seta indica imunomarcação positiva..
63
A
B
C
D
E
F
Figura 15 – Expressão de E-selectina (CD62E) em tecidos de animais
infectados com B. bovis. A, reação positiva em vaso do cérebro, 400x; B,
vaso do cérebro controle, 400x; C, reação em pulmão positivo, 400x; D,
pulmão controle, 400x; E, reação positiva em rim, 200x; F, rim controle,
200x. Imunoperoxidase indireta. As setas indicam imunomarcação
positiva.
64
A
B
C
D
E
F
Figura 16 – Expressão de Trombospondina (TSP) em tecidos de animais
infectados com B. bovis. A, reação positiva em vaso do cérebro, 400x;
B, vaso do cérebro controle, 400x; C, reação positiva em pulmão,
400x; D, pulmão controle, 400x; E, reação positiva em rim, 200x; F, rim
controle, 200x. Imunoperoxidase indireta.
65
5.7 Imunohistoquímica para detecção de antígenos de B. bovis
Ao exame dos fragmentos de tecidos, corados pelo método de PAP, dos
animais que morreram 14 e 15 dias pós-inoculação com B. bovis, foi possível
detectar, em cérebro e pulmão, reatividade positiva nas hemácias que ficaram
aglutinadas na luz dos vasos e do tecido ao redor deles, o mesmo não foi
observado no animal negativo (Figuras 17 e 18). Já no tecido renal observouse reatividade positiva principalmente nos capilares glomerulares (Figura 19).
66
A
B
Figura 17 – Teste de PAP para detecção de antígenos de Babesia bovis em
microcirculação cerebral bovina. A. reatividade positiva em eritrócitos
aderidos a células endoteliais (setas) de animal inoculado com B. bovis,
1000x; B. Ausência de reatividade positiva em vaso pulmonar do bovino
negativo,1000x.
67
A
B
Figura 18 - Teste de PAP para detecção de antígenos de Babesia bovis em
microcirculação pulmonar bovina. A. reatividade positiva em eritrócitos
aderidos a células endoteliais (setas) de animal inoculado com B. bovis,
1000x; B. Ausência de reatividade positiva em vaso pulmonar do bovino
negativo, 1000x.
68
A
B
Figura 19 - Teste de PAP para detecção de antígenos de Babesia bovis em
microcirculação renal. A, reatividade positiva em capilar glomerular de
animal inoculado com B. bovis (setas), 1000x; B, Ausência de
reatividade positiva em rim do bovino negativo, 1000x.
69
6. DISCUSSÃO
A citoaderência em Babesia bovis tem sido estudada usando vários tipos
de células, tais como: células endoteliais de capilar cerebral bovino
(O’CONNOR et al., 1999) e células endoteliais de aorta bovina (CAETANO,
2001). As células endoteliais utilizadas neste estudo para aplicação em testes
de adesão eritrocitária e identificação de moléculas de adesão, durante as
varias passagens, sempre mantiveram as características morfológicas
descritas por SPANEL-BOROWSKI & FENYVES (1994), isto é, formação de
uma monocamada epitelial pavimentosa, com células poligonais. Ainda,
segundo VOYTA et al. (1984), uma das características importantes das células
endoteliais mantidas em cultura é a capacidade de degradar e acumular a
lipoproteína acetilada de baixa densidade DIL-Ac-LDL, assim, tendo em conta
os resultados apresentados e o anteriormente descrito pode-se afirmar que as
células utilizadas na presente pesquisa são do tipo endotelial.
Os resultados dos testes de adesão in vitro, usados para determinar a
cinética de adesão e a adesão em células endoteliais estimuladas, indicam que
a ademsão observada é resultante da interação entre antígenos de B. bovis na
superfície dos eritrócitos e receptores endoteliais complementares. Apesar das
variações na composição de aminoácidos possam alterar a afinidade de
ligação com receptores expressos nas células endoteliais, os resultados
70
obtidos mostram evidências de que os antígenos da BbovUFV1 patogênica
apresentam afinidade pelos receptores das células endoteliais de veia umbilical
bovina utilizadas nesta pesquisa.
A adesão observada neste trabalho foi só de eritrócitos não parasitados.
Resultados semelhantes também foram observados por KILGER (1999) e
PATARROYO et al. (1999) utilizando o mesmo modelo de adesão de
eritrócitos, em células endoteliais de aorta bovina, embora, tenham observado
que uma pequena porcentagem de eritrócitos (<10%) estava parasitada. Isto
contrasta com os trabalhos de O’CONNOR et al. (1999) que, usando células
endoteliais de cérebro bovino, observaram que a totalidade dos eritrócitos
aderidos estavam parasitados com merozoítos de B. bovis.
O fato de a adesão dar-se somente com eritrócitos não parasitados
sugere que no plasma de um animal em fase aguda de babesiose são
encontradas proteínas liberadas, bem seja pelo parasita ou pela ruptura das
hemácias, as quais são ou atuam como exoantígenos. Segundo GOODGER
(1973 e 1976) e GOODGER et al. (1981), os exoantígenos de B. bovis
constituem um grupo heterogêneo de proteínas que têm afinidade pela
superfície eritrocitária. Muitos deles estão associados em complexos com
algumas proteínas de fase aguda da infecção como haptoglobina, hemoglobina
e fibrina ou com anticorpos, especialmente IgM. Assim, a adesão de eritrócitos
não parasitados que foi observada pode ser resultado de modificação da
superfície das hemácias pela adsorção de antígenos de B. bovis, os quais se
ligariam a receptores específicos presentes na superfície das células
endoteliais de veia umbilical bovina.
A adsorção destes antígenos citofílicos foi demonstrada nos trabalhos de
CAETANO (2001), por testes de hemaglutinação, nos quais hemácias
tanizadas provenientes de bovinos livres de B. bovis foram sencibilizadas com
soro de animais a partir de 12 dias após a inoculação com BbovUFV1
patogênica, coincidindo com o desenvolvimento de parasitemia. Paralelamente,
imunofluorescência indireta em esfregaços de sangue periférico dos animais
inoculados mostrou a presença de eritrócitos não parasitados reativos a
anticorpos anti-BbovUFV1.
A proteína VESA 1 é o antígeno de B. bovis que apresenta a variação
mais marcante entre os diversos isolados, como demonstrado por ALLRED et
71
al. (1994). O’CONNOR & ALLRED (2000) também demonstraram que
dependendo da isoforma de VESA 1 que se expresse, clones de B. bovis
possuem ou não a capacidade de induzir a adesão de eritrócitos parasitados
em células endoteliais de cérebro bovino. De maneira similar, a molécula de
adesão PfEMP1 do P. falciparum apresenta variação na sua porção
extracitoplasmática, naqueles domínios responsáveis pela ligação com os
receptores endoteliais, afetando a capacidade de indução de adesão pelo P.
falciparum, fato demonstrado por SU et al. (1995). Assim, é possível que a
amostra BbovUFV1 7a passagem patogênica induza à expressão, em
eritrócitos parasitados, de uma isoforma de VESA 1 não aderente.
Um outro mecanismo que pode ter contribuído para a adesão é a
ativação do sistema de coagulação por esterases liberadas pela B. bovis
durante a fase aguda da doença. Segundo WRIGHT et al. (1988 e 1989), este
fato facilita a adesão por desencadear a produção de monômeros solúveis de
fibrina que têm afinidade pela superfície das hemácias. A fibrina pode-se ligar à
trombospondina na superfície de células endoteliais e, portanto, promover a
adesão eritrocitária.
Existem poucas evidências experimentais que confirmem esta hipótese.
Entretanto, PARRODI et al. (1989) observaram que eritrócitos parasitados e
não parasitados de animais inoculados com uma amostra patogênica de B.
bovis aderiam em superfícies plásticas tratadas com trombospondina, mas não
definiram qual a molécula da superfície eritrocitária atuava como ligante. Por
outro lado, em um estudo de microscopia eletrônica sobre seqüestro de
eritrócitos em capilares cerebrais de animais inoculados com amostras
patogênicas de B. bovis, WRIGHT (1972) descreveu a formação de filamentos
de fibrina que ligavam eritrócitos parasitados e não parasitados entre si e ao
endotélio.
Em experimentos seqüenciais, ALLRED et al. (1993 e 1994),
O’CONNOR et al. (1997) e O’CONNOR & ALLRED (2000) demonstraram que
VESA 1 é sintetizada pelos merozoítos de B. bovis e inserida nas projeções
espiculares da membrana do eritrócito parasitado. Apesar de não esclarecerem
os mecanismos de transporte e inserção da mesma na bicamada lipídica, os
pesquisadores descartaram a possibilidade desta proteína ser secretada e
adsorvida inespecificamente na superfície de células. Em primeiro lugar, testes
72
de imunofluorescência com eritrócitos de cultivo de B. bovis, onde foram
empregados anticorpos específicos para VESA 1 demonstraram a presença da
molécula exclusivamente nas células parasitadas, demonstrando que VESA 1
está inserida na bicamada lipídica ou ancorada fortemente em ligações com
fosfatidilinositol.
Concordando com o anteriormente exposto, e resumindo, a adesão
encontrada neste trabalho pode ser devida a antígenos citofílicos localizadas
em hemácias não parasitados de animais infectados com B. bovis.
Na cinética de adesão dos eritrócitos provenientes dos animais
infectados verificou-se variação nas médias de hemácias aderidas para cada
animal. Isto pode ser explicado já que os bovinos utilizados neste experimento
não eram isogênicos, o que leva a diferentes padrões da resposta imune que
medeia o processo inflamatório.
O pico de adesão dos eritrócitos, coletados no 8º dia pós-inoculação,
coincidiu com o pico de parasitemia que foi mensurado por FIGUEIREDO
(2002) usando a técnica de hidroetidina. Uma explicação para esta maior
adesão seria que o aumento da parasitemia levou a um aumento dos
exoantígenos citofílicos liberados pela B. bovis, os quais se ligariam à
superfície das hemácias levando ao aumento da sua adesão nas células
endoteliais.
A queda nos níveis de adesão que foi observada a partir do dia 8 pósinoculação, provavelmente tenha sido devido ao efeito inibidor da replicação
parasitaria provocada pelo oxido nítrico (ON), já que a resolução da infecção
aguda depende dos produtos derivados dos macrófagos ativados, como
citocinas inflamatórias e ON, os quais são induzidos pela
exposição a
merozoítos ou à membrana de merozoítos de B. bovis, mas esta indução é
dependente de IFN-γ e de TNF-α (STICH et al., 1998; GOFF et al., 2002). Além
disto, os macrófagos ativados por parasitos inibem o crescimento deste durante
a infecção aguda e contribuem para o desenvolvimento de uma resposta tipo
Th1 (SHODA et al., 2000). Por outro lado, análises in vivo das citocinas
liberadas em resposta à B. bovis revelaram a importância de IL-12, IFN-γ e ON
para a proteção contra esta doença, sugerindo que a imunidade protetora
contra este agente está associada com o desenvolvimento de uma resposta
tipo 1, envolvendo ON, a qual pode ser modulada por IL-4 ou IL-10 (GOFF et
73
al., 2002). Pesquisas realizadas por COURT et al. (2001) comprovaram que
durante o pico de parasitemia e eliminação do parasito, em exposições
primarias à B. bovis, a atividade fagocítica dos neutrófilos e a explosão
oxidativa dos monócitos estão aumentadas. Uma outra explicação para a
queda da adesão é que em animais não esplenectomizados esta pressão é
exercida pelo sistema retículo-endotelial esplênico, que fagocita e elimina o
agente ou as células parasitadas pelo mesmo (RISTIC & KAKOMA, 1988).
A adesão de polimorfonucleares neutrófilos e eosinófilos e alguns
monócitos que foi observada nas células estimuladas ou não, parece indicar
que as células endoteliais utilizadas nesta pesquisa poderiam estar
expressando constitutivamente alguma molécula de adesão. Acredita-se que
essa adesão possa se dever a moléculas como a E-selectina, a qual é a
primeira a ser induzida sobre células endoteliais após 1 a 2 horas de estímulo
com diferentes tipos de imunomoduladores, por exemplo, lipopolissacarídeos
(LPS) e TNFα (ABBAS, 1998; VAN KAMPEN & MALLARD, 2001), mediando
assim a ligação in vitro de polimorfonucleares (PMNs) e algumas subpopulações de linfócitos (GRABER et al., 1990., SHIMIZU et al., 1991).
Já nos teste de adesão feitos neste estudo com eritrócitos provenientes
de animais inoculados com B. bovis em células edoteliais estimuladas, houve
maior adesão nos tratamentos com plasma e com sobrenadante de PBMC
comparada com a adesão apresentada nas células sem estímulo. A maior
adesão dos eritrócitos, provenientes dos animais infectados, indica que no
plasma dos animais infectados com B. bovis há fatores que além de mediar a
adesão de eritrócitos nas células endoteliais também as estimulam a
incrementar a expressão de moléculas de adesão.
Não há estudos in vivo sobre as interleucinas liberadas na fase aguda da
babesiose, mas pesquisas feitas em malária têm relatado os níveis de citocinas
in vivo e in vitro durante e depois da infecção com P. falciparum em Gabon,
sugerindo que no plasma, os níveis de IL-6 chegam ao pico máximo na fase
aguda da doença e, a liberação de esta citocina in vitro, é elevada durante e
depois da infecção. De fato se conclui uma implicação de citocinas tipo 2 e
IFNγ, com particularmente altos níveis de IL-6 (AUBOUY et al., 2002). Em
trabalhos realizados por SHODA et al. (2000), constatou-se que monócitos
derivados de macrófagos ativados com B. bovis expressavam altos níveis de
74
citocinas inflamatórias como IL-1β, IL-12 e TNF-α. EAST et al. (1997) relataram
altos níveis de IFN-γ e TNF-α, produzidas em culturas de células
mononucleares de sangue periférico de bovinos vacinados em pico de
parasitemia. Tudo isto indica que a infecção com a amostra patogênica de B.
bovis (BbovUFV 7a passagem), induz grande liberação de citocinas como IFN-γ
e TNF-α que estimulam e aumentam a expressão de moléculas de adesão nos
endotélios vasculares gerando adesão de eritrócitos no lúmen dos vasos, razão
pela qual houve adesão dos eritrócitos provenientes dos animais infectados.
Também foi observado neste experimento que TNF-α, IL-12 e INF-γ
presentes no sobrenadante de cultura de PBMC, usado para o estímulo das
células endoteliais, incrementaram a expressão de moléculas de adesão em
BUVECs. A semelhança do que foi constatado neste trabalho, vários estudos
têm demonstrado o importante papel das citocinas como TNF-α e INF-γ na
expressão de moléculas de adesão em células endoteliais, dentre eles, os
realizados por BEVILACQUA (1993), que sugere que a expressão de ICAM-1
e VCAM pode estar regulada por muitos tipos de citocinas, incluindo TNF-α e
outros imunomoduladores como os LPS.
Em outros animais como ovinos as UVECs apresentaram uma cinética
de expressão de VCAM similar à da VCAM humana depois de 6 a 12 horas de
estímulo com TNF alfa recombinante ovina (GROOBY et al., 1997).
Estudos feitos por VAN KAMPEN & MALLARD et al. (2001)
demonstraram que a estimulação de BAECs com fator de necrose tumoral-α
recombinante (rbTNF-α) resultou na expressão de VCAM em menos de 5% da
cultura, após uma hora pós-estimulação, seguido de um significante incremento
após 3 horas, o qual foi mantido até 48 horas quando então a proporção de
células VCAM positivas decresceram significativamente. A estimulação com
LPS de Escherichia coli induz um significativo incremento na expressão de
ICAM-1 mRNA entre 1 e 12 horas após o estímulo, depois do que diminuem
rapidamente até chegar a níveis basais. Os pesquisadores concluíram que
diferentes estímulos produzem cinética de expressão similar de VCAM-1 em
BAECs.
Neste trabalho o estimulo das BUVECs foi de duas horas, usando
plasma ou
sobrenadante de PBMC. Isto porque de acordo com os
75
pesquisadores, citados no parágrafo anterior, a cinética de expressão das
diferentes moléculas varia. Ademais, experimentos prévios com o modelo aqui
apresentado, determinaram que o tempo de estímulo era suficiente para
expressão das moléculas.
Corroborando o antes exposto, quando as BUVECs foram estimuladas,
durante 2 horas com plasma de animal infectado e PBMC contendo citocinas,
houve uma expressão muito mais intensa de ICAM-1, VCAM, PECAM-1, Eselectina e trombospondina quando comparada com o tratamento controle.
Estes resultados são corroborados pelo trabalho de RAAB et al. (2002), no qual
claramente é demonstrado que a combinação de citocinas como TNF-α, IL-1
ou IFN-γ adicionadas ao meio de incubação, podem modular de forma sinérgica
ou antagônica, a expressão de moléculas de adesão como VCAM-1, ICAM-1,
PECAM-1, CD-34, E e P-selectina em HUVECs.
O plasma utilizado neste experimento foi coletado de animais em fase
aguda de babesiose, possivelmente contendo altos níveis de TNF-α
estimulando a expressão de varias moléculas de adesão na superfície das
células endoteliais, igualmente, o sobrenadante de cultura de PBMC continha
níveis quantificados desta citocina. No que tange ao plasma é necessário
lembrar de que macrófagos derivados de monócitos ativados por B. bovis,
expressam níveis elevados de citocinas inflamatórias como IL-12 e TNF-α,
embora a indução de citocinas inflamatórias na babesiose, não tem sido bem
estudada (SHODA et al., 2000).
O porque usar monoclonais humanos neste trabalho tem como base as
pesquisas de VAM KAMPER & MALLARD (2001) onde foi demonstrado que o
anticorpo monoclonal anti VCAM-1 humano tem reatividade cruzada com
VCAM-1 expressa em células endoteliais de aorta bovina (BAECs), mostrando
uma cinética de expressão similar à humana. Os resultados do presente
trabalho também mostram claramente que os anticorpos monoclonais humanos
utilizados reconhecem moléculas como ICAM-1, PECAM-1 e trombospondina
bovinas, sendo que esta última por informações do fabricante também
reconhece trombospondina de origem ovina.
As moléculas de adesão ICAM-1 e VCAM apresentaram uma expressão
intensa em BUVECs quando estimuladas com plasma e sobrenadante de
76
PBMC, coincidindo com os resultados de
trabalhos realizados por
BEVILACQUA (1993), que indicaram que a expressão destas moléculas pode
estar regulada por muitos tipos de citocinas incluindo o TNF-α e outros
imunomoduladores. Outros estudos in vitro
também revelaram que a
expressão de ICAM-1 foi induzida com IL-1α, IL-1β, TNF-α, TNF-β e IFN-γ
sobre múltiplos tipos de células em suínos, incluindo células hematopoiéticas e
fibroblastos (ROTHLEIN et al., 1991). VCAM é outra molécula que também
tem sido induzida in vitro com TNF-α e IL-1α (GROOBY et al., 1997). Outros
estudos em suínos mostram que os níveis de expressão in vitro de VCAM-1
foram altos após 9 horas de estímulo com LPS, TNF-α, e IL-1α, ficando
expressa até por 48 horas, e a expressão de VCAM-1 em HUVECs,
estimuladas com LPS ou TNF-α foi prolongada só em células estimuladas com
TNF-α, porém há diferenças na cinética de expressão de VCAM-1 humano e
suíno (TSANG et al., 1994)
Igualmente, PECAM-1 teve expressão intensa nas células endoteliais
estimuladas
com
plasma
procedente
de
animais
infectados,
embora
apresentou uma expressão medianamente intensa quando as células foram
estimuladas com sobrenadante de PBMC.
Já as células endoteliais do
tratamento controle mostraram uma expressão pouco intensa. Estas
observações concordam com os resultados obtidos por MÜLLER et al. (2002),
que
evidenciaram
expressão
homogênea
de
PECAM-1
em
culturas
estimuladas e não estimuladas de células endoteliais de veia umbilical humana
(HUVEC) e de células endoteliais de microvasculatura pulmonar humana
(HPMEC). A presença pouco intensa nas BUVECs, pode ser explicada porque
o PECAM-1 é constituinte das junções intercelulares endoteliais. A expressão
intensa causada pelo plasma, pode ser devida à quantidade de citocinas pró e
inflamatórias presentes e que as interleucinas no sobrenadante de PBMC
deveriam atuar em sinergismo com outras moléculas para obter uma expressão
maior.
Evidentemente, a heterogeneidade na resposta da célula endotelial varia
com o tipo de citocina, a concentração e o tempo de exposição, um fator não
muito bem reconhecido nem documentado (MANTOVANI et al., 1997;
PETZELBAUER et al., 1993). Assim, a expressão de E-selectina em BUVECs
77
após a estimulação durante 2 horas com plasma e sobrenadante foi muito
maior que a expressão das outras moléculas de adesão estudadas. Isto pode
ser devido ao fato que a E-selectina é a primeira molécula de adesão a ser
induzida após 1 a 2 horas de estimulo com TNF (ABBAS, 1998), coincidindo
com o tempo de estímulo usado neste experimento. As células endoteliais não
estimuladas também expressaram E-selectina, mas em baixa intensidade.
Pesquisas feitas por BISCHOFF & BRASEL (1995) relataram que o mRNA da
E-selectina pode ser sobre-regulado por TNF-α em monocamadas confluentes
de células endoteliais bovinas.
A expressão intensa da trombospondina na superfície das células
estimuladas com plasma e a expressão pouco intensa quando estimuladas
com
sobrenadante
de
PBMC,
não
concorda
com
os
achados
de
LOGANADANE et al. (1997), que estudaram a expressão desta molécula em
culturas HUBEC estimuladas. Porem, é importante ter em conta que neste
trabalho não estudamos a correlação da concentração da matriz sub-endotelial
da molécula e a densidade da cultura, fatos que influenciam a secreção de
trombospondina por células endoteliais in vitro, conforme postulado pelo
mesmo autor.
A expressão das moléculas de adesão in vivo não sempre foi igual à
expressão in vitro, porém deve ser levado em consideração que os modelos in
vitro utilizando culturas de células em monocamada podem ter algumas
limitações, principalmente aquelas referentes à ausência de fatores fisiológicos
essenciais do micro-ambiente tecidual e à própria estimulação exercida pelas
células vizinhas.
No experimento foi observado um aumento na expressão de ICAM-1,
VCAM, PECAM-1, E-selectina e trombospondina em cérebro, pulmão e rim nos
bovinos infectados com B. bovis. Isso pode acontecer devido à ação das
citocinas que são liberadas na fase aguda da babesiose que podem estimular a
célula endotelial a expressar grande quantidade de moléculas de adesão. Os
resultados aqui mostrados evidenciam uma possível participação destas
moléculas de adesão no seqüestro de eritrócitos nos capilares, estes achados
coincidem com os obtidos por GARETH et al. (1994) em tecidos de pacientes,
que morreram de malária por P. falciparum, onde o seqüestro é mediado por
interação entre ligante e receptor específico do eritrócito e da superfície da
78
célula endotelial, respectivamente. Entre os receptores identificados in situ
estão CD36, CD-31, ICAM-1, E-Selectina, trombospondina e VCAM-1.
No presente trabalho foi observada uma expressão muito intensa de
ICAM-1 e E-selectina no endotélio dos capilares cerebrais dos animais
inoculados com B. bovis, comparada com a apresentada no endotélio cerebral
dos animais controle. Também no rim dos animais que morreram de babesiose,
a E-selectina teve uma expressão medianamente intensa, e no rim controle,
não houve expressão. Todos estes resultados concordam com os obtidos em
trabalhos de GARETH et al. (1994) onde estudos de imunohistoquímica
demonstraram que a expressão destas duas moléculas era mais alta no
endotélio cerebral e renal de pacientes que morreram de malária do que em
indivíduos com outros tipos de patologia e que a expressão estava fortemente
associada ao seqüestro de hemácias parasitadas naqueles órgãos. Assim, de
forma geral, tendo em conta nossos resultados o mesmo pode acontecer com
B. bovis onde, concordando com GARETH et al. (1994), os níveis de expressão
de receptores endoteliais para citoaderência em P. falciparum (ICAM-1, VCAM,
PECAM-1 e TSP) são variáveis porque muitos são dependentes da ativação
induzida por citocinas.
A E-selectina e a trombospondina foram as moléculas de adesão que
mais se expressaram em todos os tecidos pesquisados, sendo também
observadas em alguns dos tecidos controle, provavelmente pelo fato de que a
E-selectina esteja envolvida no rolamento de leucócitos e a trombospondina se
expresse constitutivamente. Outros trabalhos sugerem que a E-selectina pode
ter um papel muito importante no rolamento e seqüestro de eritrócitos
infectados
na
patogênese
da
malária
produzida
pelo
P.
falciparum
demonstrando que isolados de PfEMP1 podem funcionar como ligantes para Pselectina (SENEZUK et al., 2001). Igualmente, os antígenos expressos na
superfície das hemácias infectadas por B. bovis aderem a superfícies tratadas
com trombospondina, laminina (PARRODI et al., 1989). Então, é possível que
no caso da babesiose produzida pela amostra de B. bovis patogênica
(BbovUFV1 7a passagem), também haja envolvimento destas duas moléculas
de adesão na patogênese da doença.
O aumento da expressão de ICAM-1, VCAM, PECAM-1 E-selectina e
trombospondina em cérebro, pulmão e rim dos bovinos que morreram após a
79
infecção com B. bovis sugere que as de citocinas como TNF-α, as quais são
liberadas na fase aguda da babesiose e estimulam as células endoteliais a
expressar grande quantidade de moléculas de adesão, a semelhança do que
acontece nos casos de malária aguda em que os níveis de
TNF-α estão
elevados, estando também correlacionados com a severidade da doença
(KWIATKOWSKI et al., 1990).
Aumento na expressão de moléculas de adesão nos endotélios
cerebrais tem sido observado também em outros modelos animais como no
caso da encefalomielite autoimune experimental, vírus da imunodeficiência em
símios e em doenças humanas produzidas por lesões necróticas e
inflamatórias. Todas estas patologias têm como mecanismo patogênico básico
a liberação de citocinas (TURNER et al., 1994)
A expressão de ICAM-1, na babesioses bovina, principalmente
localizada nos glomérulos renais e nos capilares intertubulares é um fato que
ajuda a explicar a fisiopatologia da infecção. A presença desta molécula, por
outros estímulos como LPS já tinha sido relatada por NITTA et al. (1995), que
evidenciaram a expressão de ICAM-1 na superfície de células de glomérulo
renal bovino.
Os resultados da expressão de PECAM-1 nas células endoteliais do
cérebro e do pulmão são similares aos resultados obtidos por MÜLLER et al.
(2002), em biópsias pulmonares de pacientes com patologias pulmonares ou
em lobectomia de pacientes com carcinoma pulmonar, que verificaram reação
positiva contra PECAM-1 homogeneamente expressada em todos os vasos
pulmonares independentemente do calibre.
O seqüestro de eritrócitos não parasitados na microcirculação sempre foi
descrito como conseqüência da estase sangüínea, da agregação dos eritrócitos
não parasitados em torno dos eritrócitos parasitados e da ativação da
coagulação. Seria, na verdade, um “empacotamento” dos eritrócitos, sendo
impedidos de fluir pelos vasos. Trabalhos anteriormente realizados por KILGER
(1999) e PATARROYO et al. (1999) mostram que pode haver mecanismos
específicos de ligação dos eritrócitos não parasitados com a célula endotelial,
via antígenos adsorvidos pelos eritrócitos. Isto explica os resultados da
imunohistoquímica para detecção de antígenos de B. bovis, os quais
mostraram reação positiva nos eritrócitos aderidos ao lúmen dos vasos de
80
tecidos como cérebro e pulmão e também presença de antígenos nos capilares
glomerulares no rim dos animais que morreram de babesiose.
A fisiopatologia da B. bovis inclui hiperemia passiva, deposição de
pigmentos e seqüestro de eritrócitos infectados nas vênulas pós-capilares.
Como na malária produzida pelo P. falciparum, um dos fatos mais importantes
na babesiose é o seqüestro de eritrócitos parasitados e não parasitados na
microcirculação e acumulação em órgãos vitais.
A retenção de eritrócitos não parasitados na microcirculação facilita a
proliferação da B. bovis nos tecidos e o escape do parasita da resposta
imunológica do hospedeiro. Com os eritrócitos justapostos, os merozoítos
podem se transferir diretamente de uma hemácia a outra, escapando da
fagocitose ou opsonização por anticorpos. Desenvolvimento de mecanismos
que aumentem a retenção de hemácias favorecem a sobrevivência do parasita.
Neste contexto, a B. bovis utiliza a adesão de eritrócitos não parasitados como
um mecanismo para escapar da resposta imune do hospedeiro.
Em pesquisas realizadas em malária cerebral produzida pelo P.
falciparum, encontraram-se evidências de que na fisiopatologia desta doença
citocinas como o TNF, em especial, junto com as alterações na adesão e
função das células endoteliais têm um papel importante no seqüestro de
eritrócitos nos capilares do cérebro e um conseqüente dano cerebral
(MANTOVANI et al., 1997). A semelhança deste mecanismo, na babesiose
produzida pela B. bovis, caso o cérebro esteja envolvido, o dano causado pelo
bloqueio dos capilares pode levar a uma condição fatal conhecida como
babesiose cerebral (DE SOUZA & RILEY, 2002).
81
7. CONCLUSÕES
•
Células endoteliais de veia umbilical bovina (BUVECs) constituem um bom
modelo para o estudo da fisiopatologia da babasiose produzida pela B.
bovis.
•
Eritrócitos provenientes de animais inoculados com a amostra patogênica
de Babesia bovis BbovUFV1 7a passagem se aderem em BUVECs in vitro.
•
A adesão de eritrócitos provenientes de animais inoculados com amostra
patogênica de B. bovis em BUVECs é maior quando estimuladas com
plasma de animais inoculados e com sobrenadante de PBMC os quais
contêm interleucinas como TNF-α e IFN-γ capazes de induzir expressão de
moléculas de adesão sobre as células endoteliais in vitro.
•
O aumento da adesão de eritrócitos provenientes de animais inoculados
com B. bovis em BUVECs estimuladas pode ser devido à maior expressão
de moléculas de adesão como ICAM-1, VCAM, PECAM-1, TSP, E-selectina
e trombospondina na superfície das células endoteliais.
•
As moléculas de adesão ICAM-1, VCAM, PECAM-1, TSP, E-selectina e
trombospondina estão claramente envolvidas na fisiopatologia da babesia
visceral produzida pela B. bovis.
82
7.1 Perspectivas futuras
Pesquisar outras moléculas de adesão como a CD36 e o Sulfato A de
Condroitina que possam estar envolvidas na fisiopatologia da B. bovis e que
tenham uma participação comprovada na citoaderência em patologias similares
como no caso da malária.
Podem-se empregar testes de adesão realizando bloqueio das
moléculas de adesão usando anticorpos monoclonais das moléculas como
ICAM-1, VCAM, PECAM-1, E-selectina e Trombospondina.
O bloqueio na
adesão dos eritrócitos por um anticorpo específico contra uma molécula de
adesão reafirmaria a participação direta desta molécula na adesão dos
eritrócitos infectados com B. bovis.
A partir da identificação das moléculas de adesão pode-se dar início a
uma nova etapa do estudo. Então, poder-se-á testar o potencial destas como
terapêuticos capazes de induzir a produção de anticorpos bloqueadores, os
quais impediriam o processo de adesão in vivo. Uma vacina com estas
características
seria
uma
ferramenta
importante
para
prevenção
do
desenvolvimento da babesiose aguda e da mortalidade por ela causada.
As moléculas de adesão em bovinos não têm sido profundamente
estudadas, razão pela qual ainda há muitas questões sobre expressão e
regulação destas moléculas no endotélio vascular e circulação de leucócitos. A
caracterização das moléculas de adesão na superfície das BUVECs e a sua
resposta frente à citocinas, poderia permitir um melhor entendimento dos
receptores que mediam a adesão de eritrócitos parasitados e não parasitados
por B. bovis.
83
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