caracterização das bombas de prótons vacuolares e seu

CARACTERIZAÇÃO DAS BOMBAS DE PRÓTONS VACUOLARES
E SEU PAPEL NAS RESPOSTAS ADAPTATIVAS DE PLANTAS
AO ESTRESSE HÍDRICO.
MICHELLE GUEDES CATUNDA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINESE
DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES
JANEIRO DE 2008
CARACTERIZAÇÃO DAS BOMBAS DE PRÓTONS VACUOLARES
E SEU PAPEL NAS RESPOSTAS ADAPTATIVAS DE PLANTAS
AO ESTRESSE HÍDRICO.
MICHELLE GUEDES CATUNDA
“Tese
apresentada
ao
Centro
de
Biociências e Biotecnologia da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,
como parte das exigências para obtenção do
título de Doutor em Biociências”.
Orientador: Arnoldo Rocha Façanha
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
JANEIRO DE 2008
ii
Dedico esta tese aos meus pais, meu irmão, meu esposo,
mas principalmente ao meu filho Daniel a quem ensino e
com quem aprendo a viver e a ser feliz a cada dia que
amanhece.
iii
AGRADECIMENTOS
Costumo dizer que minha vida é preenchida por seis grandes amores, aos quais
gostaria muito de agradecer...
•
Deus, que me deu a vida e essa oportunidade maravilhosa de ser feliz;
•
Meu filho, Daniel, que desde que chegou a esse mundão me ensinou o
real significado de duas nobres palavras: vida e felicidade!
•
Meu esposo, grande amor e companheiro de todos os momentos;
•
Minha mãe, exemplo de mulher, meu pai, o melhor pai do mundo, e
meu irmão, sempre o meu caçulinha.
Aos meus amores, o meu muito obrigada por cada minuto de amor,
atenção, dedicação e confiança... Sem vocês por perto, nada disso estaria
sendo concretizado agora!
Agradeço também ao meu orientador, Arnoldo Rocha Façanha pela
imensa paciência e por cada discurso apaixonado pela ciência... Prometo
que vou levar um pouquinho dessa paixão para sempre comigo!
À professora Anna Okorocova, ao professor Lev Okorocov e ao
professor Fábio Olivares pelos ensinamentos oportunos.
Ao pessoal do LQFPP, LMGV e LFBM, que sempre estiveram de
portas abertas para a utilização dos equipamentos necessários para o
desenvolvimento desse trabalho.
À UENF e à FAPERJ pelo suporte financeiro.
Aos meus amigos, que riram de mim e que riram comigo... Que graça
tem a vida sem amigos???
Inga, Rosivany e Rosane... Para sempre no meu coração!!
Ana Paula (cunhadona!!), Tati Felice, Nathália, Fabiana, Alena, Juares,
Daniel, Jorge André, Geórgia, Josimara, Flávia Emenegilda, ... Obrigada!!!
Ao pessoal do campo que me ajudou a cultivar e a colher tiririca, por
mais esquisito que isso lhes parecesse!!
iv
Ao pessoal do LBCT, Giovana, Bia e Márcia Adriana (ex-LBCT) pelo
carinho e pela força no preparo das amostras para microscopia!!
Ao amigo Noil pelo suporte no microscópio... Jamais teria alinhado
aquele “trem” sem a sua ajuda!!!
À Dona Maria pelo bolo de banana espetacular quando eu estava
grávida do Daniel!!!!!
Os meus alunos do CEDERJ por terem me permitido vivenciar a
experiência didática, e ao pessoal do CEDERJ, pólo Macaé, Aninha,
Giselli, Ada, Claudinha, Sílvio, Maurício, ..., obrigada pela força sempre!!
Enfim... A todos os que estiveram por perto, me acompanhando,
torcendo por mim ou mesmo rindo comigo, o meu super-hiper-mega muito
obrigada!!! Vocês fizeram dessa fase da minha vida uma passagem muito
mais agradável!
v
SUMÁRIO
página
RESUMO........................................................................
vii
ABSTRACT....................................................................
viii
1. INTRODUÇÃO...........................................................
01
2. REVISÃO DE LITERATURA......................................
03
+
03
+
2.2. H -PPase vacuolar.............................................
05
2.3. Estresse nas plantas..........................................
09
2.3.1. O estresse hídrico......................................
11
2.4. Tiririca (Cyperus rotundus)................................
12
2.5. Cana-de-açúcar (Híbrido interespecífico de
16
2.1. H -ATPase vacuolar...........................................
Saccharum L.)................................................................
2.6. Milho (Zea mays)..............................................
17
3. OBJETIVO GERAL.....................................................
19
3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS..............................
19
4. MATERIAL E MÉTODOS...........................................
20
4.1 Plantas.................................................................
20
4.2 Preparação da fração microssomal.....................
21
4.3 Purificação das vesículas de tonoplasto e
22
membrana plasmática....................................................
4.4 Determinação das atividades PPásicas e
23
ATPásicas......................................................................
4.5 Monitoramento do gradiente de prótons .............
23
4.6 Determinação da condutância estomática e da
23
transpiração....................................................................
4.7 Determinação da fluorescência da clorofila a......
24
4.8 Determinação do teor de clorofila........................
24
4.9 Microscopia eletrônica de transmissão e
24
imunocitoquímica............................................................
4.10 Microscopia eletrônica de varredura.................
25
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................
26
5.1 Atividade hidrolítica e de transporte de H+ da P-
26
vi
ATPase, da V-ATPase e da PPase em plantas de C.
rotundus..........................................................................
5.2 Condutância estomática e da transpiração.........
41
5.3 Fluorescência da clorofila a................................
42
5.4 Teores de clorofila...............................................
45
5.5 Microscopia eletrônica de varredura...................
46
5.6 Microscopia eletrônica de transmissão...............
48
5.7 Atividade hidrolítica e de transporte de H+ da P-
50
ATPase, da V-ATPase e da PPase em colmos de
Saccharum spp...............................................................
6. CONCLUSÕES..........................................................
53
7. BIBLIOGRAFIA...........................................................
55
vii
RESUMO
A Cyperus rotundus é uma espécie que possui alto vigor reprodutivo e
rusticidade, que expressam sua alta capacidade de sobreviver a
situações de estresse abiótico. O turgor celular é parcialmente
controlado pelas bombas de prótons vacuolares, que geram gradiente
de H+ e facilitam o transporte secundário de íons e água para dentro do
vacúolo. A análise das bombas de prótons de C. rotundus retiradas de
seu ambiente natural exibiram uma hidrólise de PPi de cerca de 30%
em relação a hidrólise do ATP, enquanto que o gradiente de prótons
gerado por ambas as bombas foram muito similares. Esses dados
sugerem que, em condição natural de campo, as bombas de prótons
vacuolares funcionam como em outras espécies vegetais e que a VATPase é a principal bomba. Analizando o desenvolvimento dessa
planta daninha sob condição de estresse hídrico, observou-se que as
atividadedes hidrolíticas de ambas as bombas foram progressivamente
inibida com o estresse hídrico. Após o restabelecimento da irrigação, a
atividade tanto de hidrólise, quanto de transporte de H+ pela PPase é
estimulada, estímulo esse que diminui para níveis próximos ao controle
48h após o restabelecimento da irrigação. A atividade da V-ATPase foi
pouco alterada, sugerindo que a capacidade de manter o turgor da
célula vem do trabalho em conjunto das duas bombas vacuolares. A
PPase funciona como um sistema back-up para a ATPase, suprindo o
meio citossólico de Pi para síntese de ATP pela ATPase. Em cana-deaçúcar, análise de data mining no banco de dados SUCEST sugere que
os genes que codificam para as bombas de prótons vacuolares são
expressos em altos níveis em tecido de casca e os dados apresentados
no presente trabalho confirmam a atividade alta das bombas de prótons
nesse tecido. Esses dados são discutidos em relação ao possível papel
dessas bombas no metabolismo da cana-de-açúcar.
viii
ABSTRACT
Cyperus rotundus is a weed that has high reproductive vigor and
rusticity that express high capacity to cope with abiotic stress. The cell
turgor is partially controlled by vacuolar H+-pumps, which generate a H+gradient that energize the uptake of ions and water into the vacuole.
The analysis of the vacuolar H+-pumps of plants of Cyperus rotundus
harvested from their natural environment exhibited a PPi hydrolysis
about 30% of their ATP hydrolysis, while the H+-gradients coupled to
either PPi and ATP hydrolytic activities were quite similar. These data
suggest that, on field conditions, the vacuolar proton pumps function just
like other plants and the V-ATPase is the main proton pump. Analyzing
this weed development under drought stress the activity of both
tonoplast H+-pumps were progressively inhibited. After rewatering, the
H+-PPase activity exhibited a striking stimulation, but this activation
declines to the level of control plants 48h after rehydration. In contrast,
the V-ATPase activity was only barely changed, suggesting that the
vacuolar turgor capacity of C. rotundus could be regulated by both
proton pumps working together during drought stress. It is likely that H+PPase function as backup system on ATP synthesis. On sugar cane
study, analyses of data mining in SUCEST bank (sugarcane EST
Project) suggest that the genes encoding this vacuolar H+-pumps are
expressed in higher levels in stem bark and our results confirm and
extend the data mining analysis of SUCEST bank suggesting that the
proton pumps are induced in the active form in stem bark of sugarcane.
These data are discussed in relation to a possible role of these pumps
in the yet underestimated metabolism of the stem bark of sugarcane.
1
1 - INTRODUÇÃO
A população mundial está aumentando em uma taxa alarmante e
espera-se que alcance aproximadamente seis bilhões de pessoas até o
final do ano de 2050. Por outro lado, a produção de alimentos está
diminuindo devido ao efeito de vários estresses bióticos e abióticos.
Assim, minimizar estas perdas é uma grande área de interesse para
todas as nações que precisam lidar com as exigências crescentes do
alimento. A herbivoria, a competição por plantas invasoras, o frio, a
salinidade e a seca são, entre os estresses principais, aqueles que
prejudicam o crescimento e a produtividade de plantas (Mahajan e
Tuteja, 2005).
Dados
divulgados
pela
Empresa
Brasileira
de
Pesquisa
Agropecuária (EMBRAPA) relatam que dos 3,3 bilhões de hectares
considerados aptos para a agricultura no mundo, cerca de 28% estão
sujeitos a estresse hídrico por déficit de água, 22% a estresses
minerais e 12% a estresse por excesso de água. Com isso, pode-se
dizer que o desenvolvimento de uma agricultura sustentável em áreas
tropicais deve estar apoiado em estratégias de desenvolvimento de
plantas mais adaptadas às condições de estresse ambiental,
associadas a práticas de manejo de água e nutrientes que conduzam a
ganhos de eficiência e desempenho das culturas.
O estresse hídrico é, sem dúvida, o maior limitador da
produtividade de plantas cultivadas em todo o mundo (Bohnert et al.,
1995). A identificação e compreensão dos mecanismos de tolerância ao
estresse hídrico são de grande importância para o desenvolvimento de
novas cultivares (van Rensburg, 1994; Ingram e Bartels, 1996).
Vários estudos têm sido feitos com o objetivo de identificar
padrões fisiológicos que possam ser usados como critérios para a
seleção de resistência ao estresse hídrico (Blum et al., 1996; Dure et
al., 1989).
Diferente do que ocorre nos laboratórios, as plantas no campo
estão sujeitas a incidência de vários estresses simultâneos. De fato,
2
dados recentes de varredura de expressão gênica mostram que os
mecanismos de tolerância a esses estresses apresentam vários
componentes que se sobrepõem (Bohnert et al.., 2001). Nesse projeto
será estudada a ação da ATPase e da H+-PPase vacuolar nos
mecanismos de adaptação ao estresse hídrico. Embora cada enzima
seja específica na utilização de seus respectivos substratos (Rea, et al.,
1992), ambas catalisam a translocação eletrogênica de prótons do
citossol para o lúmem do vacúolo para gerar um gradiente
eletroquímico de prótons. Esta força próton motriz promove a energia
para o transporte secundário de vários íons e metabólitos através da
membrana (Rea et al., 1992; Sze et al., 1992). No tonoplasto, a VATPase
é
a
mais
abundante
bomba
de
prótons,
sendo
extraordinariamente importante para manter a homeostase iônica e o
metabolismo celular (Lüttge e Ratajczak, 1997). A H+-PPase vacuolar é
uma bomba transportadora de prótons que têm suas atividade e/ou
expressão modulados durante os mais diversos estresses ambientais.
Rea e Poole (1993) citados por Maeshima (2000) indicaram a
importância desta enzima em células vegetais sob condições de
estresse energético, com
isso, exerce
função
importante
nas
estratégias de sobrevivência de plantas expostas a condições limitantes
de suprimento de ATP.
Plantas resistentes ao estresse hídrico são capazes de manter
seu turgor mesmo com potencial hídrico baixo, aumentando o número
de moléculas de solutos dentro da célula (Bray et al., 2000).
Para que as plantas sejam capazes de sobreviver as constantes
alterações do ambiente e ao mesmo tempo manter suas condições
metabólicas em um nível ótimo, a expressão e a atividade das bombas
de próntos deve ser muito bem reguladas (Gaxiola et al., 2007).
A planta daninha tiririca (Cyperus rotundus L.) e a cultivada
cana-de-açúcar (Saccharum sp) foram selecionadas para objeto de
estudo devido sua rusticidade e alta capacidade de proliferação.
3
2 - REVISÃO DE LITERATURA
Bombas de prótons são proteínas integrais da membrana que
funcionam a partir da hidrólise de moléculas de ATP, no caso das
ATPases, e PPi, no caso das PPases. Efetuam o transporte ativo dos
prótons através da membrana da célula e possuem como objetivos a
manutenção da composição iônica intracelular, a importação de solutos
contra o gradiente de concentração, o balanço da pressão osmótica dos
dois lados da membrana celular e também, a manutenção do potencial
da membrana celular.
As bombas podem funcionar contra o gradiente de concentração,
bombeando os prótons e, neste caso, consumindo energia. No entanto,
as ATPases podem também funcionar de forma reversa, sintetizando
ATP a partir de ADP e Pi, quando permitem a passagem dos prótons a
favor do gradiente de concentração.
Pedersen e Carafoli (1987) baseados em considerações de
estrutura e mecanismo de ação, agruparam as ATPases em 3 classes
principais: P, V e F. Essas ATPases estão distribuídas nas diversas
membranas celulares e sua função básica é a hidrólise ou síntese de
ATP e o transporte de íons. Além desses sistemas existe um quarto tipo
de bomba de prótons que foi posteriormente identificado, as H+pirofostatases (PPase).
Células vegetais são as únicas que contém vacúolos, que
ocupam grande parte de seu volume celular, e as principais enzimas,
presentes no tonoplasto, responsáveis pela acidificação do vacúolo
central são a V-ATPase e a PPase (Sze 1985, Taiz, 1992; Rea e Poole,
1993,). Essas 2 bombas de prótons fornecem o gradiente eletroquímico
de H+ que energiza o transporte de outros metabólitos (Rea e Sanders,
1987).
2.1 – H+-ATPase Vacuolar
A H+-ATPase vacuolar (V-ATPase) é a enzima responsável pela
acidificação do vacúolo central. Também está presente no Golgi e em
vários outros sistemas de endomembranas das células vegetais
4
(Ratajczak et al., 1999). A maior parte dos processos de transporte
secundário são impulsionados por um gradiente eletroquímico de
prótons gerado pela V-ATPase, incluindo reações de osmoregulação,
homeostase, armazenamento, defesa vegetal e muitas outras funções.
Ela exerce um importante papel no controle do pH extra e intra cellular
nas células eucarióticas, que é essencial para o bom funcionamento
dos processos celulares (Yao et al., 2007).
A V-ATPase de vegetais é estruturalmente muito semelhante a
de outros seres eucariotos e suas subunidades são codificadas por
uma família de múltiplos genes, que desempenha um importante papel
na regulação da expressão gênica e na separação das isoformas das
V-ATPase para as diferentes organelas (Taiz, 1992). É uma enzima
multimérica que exibe uma estrutura molecular complexa. Mais de 10
diferentes subunidades da V-ATPase já foram descritas para algumas
plantas (DuPont e Morrissey, 1992; Ward e Sze, 1992). Três dessas
subunidades, que foram encontradas em todas as V-ATPases
estudadas até o momento parecem ser mais importantes para o seu
funcionamento, são elas a subunidade calalítica A (~ 70kDa) e a
subunidade regulatória B (~ 60kDa), ambas localizadas na periferia da
membrana no domínio V1 e o canal de prótons hidrofóbico, formado
pela subunidade C (~ 16kDa) que formam o domínio V0, integral da
membrana (Rockel et al., 1998). No tonoplasto, a V-ATPase é a mais
abundante, atingindo 6,5 – 35% da proteína total do vacúolo de
diferentes espécies (Xiao et al., 2007). Sua estrutura pode ser
visualizada na figura 1.
5
Figura 1 - Modelo esquemático de uma V-ATPase de planta (Drory e
Nelson, 2006; Gaxiola et al., 2007)
Devido a sua função como uma bomba de H+ no tonoplasto, a VATPase está envolvida no transporte de metabólitos para dentro do
vacúolo. Por outro lado, em condições de estresse ambiental, a VATPase funciona como uma enzima de resposta a estresses sofrendo
modificações moderadas na expressão de suas subunidades e
modulação de estrutura (Dietz et al., 2001). Visto que está envolvida em
adaptações ecofisiológicas em níveis moleculares, a V-ATPase foi,
também denominada como uma “eco-enzima” (Lüttge et al., 1995, ).
Pouca atenção tem sido dada para a função da V-ATPase em
situação de estresse hídrico. Dietz et al.(2001) alertavam para a
necessidade de estudos da atividade e expressão da V-ATPase em
plantas submetidas ao déficit hídrico.
2.2 - H+-PPase Vacuolar
Uma característica própria de plantas é a existência de vias
metabólicas paralelas que usam tanto nucleotídeos quanto pirofosfato
como fontes alternativas de energia. Uma delas é a H+-ATPase, a qual
está presente em todos os eucarióticos e a outra é a Pirofosfatase
(PPase) que tem sido encontrada em todas as plantas e em algumas
bactérias fototróficas (Rea e Poole, 1993) e protozoários. Já está bem
6
estabelecido que a membrana vacuolar (tonoplasto) de células vegetais
possui 2 bombas de prótons, a H+-ATPase e a PPase. São sugeridas
duas hipóteses para a existência de duas bombas numa mesma
membrana: que a PPase agiria como um sistema back-up para a H+ATPase nas condições em que o fornecimento de ATP fosse limitado
ou que a PPase é reversível e pode usar o gradiente de H+ do transtonoplasto para sintetizar PPi (Leigh et al., 1992).
A localização da PPase é ainda controvertida. Quando ela foi
primeiramente isolada em tonoplasto, acreditava-se que ela fosse uma
enzima marcadora de vacúolo (Maeshima, 1990), porém estudos
recentes têm mostrado que a PPase é encontrada em membrana
plasmática (Long et al. 1995; Robinson et al.. 1996), complexo de Golgi
e retículo endoplasmático.
Por algum tempo já se suspeitava da existência de PPase
associada à membrana. Foi em meados dos anos 70, que Karlsson
(1975) demonstrou uma atividade PPase estimulada por K+ e Walker e
Leigh (1981) caracterizaram uma PPase dependente de Mg2+. Somente
em 1985 é que finalmente identificaram que o transporte de H+
dependente de PPi era mediado por uma PPase e não uma V-ATPase
capaz
de
usar
PPi
em
algumas
circunstâncias.
Seguidas
caracterizações mostraram que essa PPase diferia da V-ATPase em
vários aspectos: A PPase era estimulada pelo K+ enquanto que a VATPase era seletivamente ativada por halógenos; nem a hidrolise nem
o transporte de prótons pela PPase são inibidos por nitrato; finalmente
foi mostrado que a PPase é específica para MgPPi (ou Mg2PPi) como
substrato enquanto que a V-ATPase não mostra nenhuma atividade
em relação a esse composto.
As atividades tanto de transporte de prótons dependente de PPi
quanto a de hidrólise estimulada por K+ e /ou insensível a molibidato
tem sido demonstrada em membranas vacuolares da maioria dos
principais tipos de plantas vasculares (plantas monocotiledôneas,
dicotiledôneas, C3, C4 e CAM) como também em seus prováveis
ancestrais, a algas clarófitas. Mais ainda, a PPase é o componente
principal das membranas vacuolares e é capaz de gerar um gradiente
7
de prótons de magnitude similar ou superior do que a V-ATPase
(Maeshima e Yoshida, 1989). A estimativa de abundância sugere que
essas enzimas constituem de 1% (em Beta vulgaris) e 5-10% (em Mung
bean) da proteína total da membrana vacuolar (Maeshima e Yoshida,
1989).
A membrana vacuolar preparada a partir de várias espécies de
plantas, incluindo musgos, samambáias, e algas, apresenta atividades
PPásicas em adição a V-ATPase (Nakanishi e Maeshima, 1998).
Notáveis exemplos de PPases transportadoras ou conservadoras de
energia são as PPases reversíveis transportadoras de prótons
encontradas
em
cromatóforos
de
bactérias
não
sulfurosas,
Rhodospirillum rubrum, as PPases transportadoras de Prótons
vacuolares de células vegetais e PPase associada a membrana de
animal e mitocondria de levedura.
Essa última, porém, apresenta padrões de sensibilidade a
inibidores bem diferentes das duas primeiras (Baykov et al., 1993).
Baseado nestes resultados considera-se que as PPases associadas a
mitocôndria pertencem a um grupo distinto de PPases (Baykov et al.,
1993).
A PPase está amplamente distribuída entre as plantas
superiores, algas e bactérias fotossintéticas, Rhodospirillum rubrum.
Embora Lichko e Okorokov (1984) tenham demonstrado uma atividade
de transporte de prótons dependente de PPi em frações enriquecidas
de tonoplasto de Saccharomyces carlsbergenesis, a H+-PPase é ainda
considerada restrita a plantas (Rea et al., 1992) e certos procariotos.
A PPase consiste de um único peptídeo com uma massa
molecular de aproximadamente 73KDa (Nakanishi e Maeshima, 1998),
embora tenham sido encontrados valores de pesos moleculares
diferentes em várias espécies, 67,000 (Beta vulgaris) e 73,000 (Vigna
radiata) para a mesma subunidade. Essa subunidade mostra-se não
somente necessária, mas também suficiente para o transporte de H+
dependente de PPi. A subunidade que se liga ao substrato funciona
como um monômero durante a hidrólise de PPi (Rea e Poole, 1993),
embora tenha sido proposto uma estrutura dimérica para a PPase
8
funcional nativa (Sato et al., 1991). A estrutura primária da PPase foi
deduzida a partir do cDNA de Arabdopsis thaliana, cevada, beterraba,
tabaco e arroz, no entanto, poucos
resíduos característicos foram
determinados (Takasu et al.., 1997). A estrutura da PPase pode ser
visualizada na figura 2.
A abundância e a ubiqüidade da PPase em plantas necessita um
fornecimento regular de PPi citossólico e uma taxa de ação de massa
PPi:Pi em favor da translocação de prótons. O nível de PPi em tecidos
vegetais varia na faixa de 5-39 nmol/g de peso fresco (Smyth et al..,
1984) e esse PPi parece está quase que limitado ao citossol. Já foi
calculado em folhas de espinafre e protoplasto de mesófilo de trigo o
PPi citossólico de 200 a 300 µM (Weiner et al. , 1987), enquanto que
em outras organelas como vacúolo e cloroplasto de alga, Chara, foi
encontra <1 e 2-3µM respectivamente, contra 193µM para o citossol
(Takeshige e Takawa, 1989). Considerando uma estequiometria de H+:
PPi igual a 1, considera-se que a energia livre liberada pela hidrólise do
PPi citossólico exceda o mínimo teórico requerido para energização
vacuolar.
Figura 2 – Modelo de H+-PPase de Streptomyces coelicolor (Gaxiola et
al.., 2007)
9
Gaxiola (2001) mostrou que a PPase é codificada por um único
gene e, provavelmente por esse motivo, é mais fácil de ser sintetizada
que a V-ATPase em condições de estresse metabólico.
2.3 - Estresse nas Plantas
O termo estresse é definido como qualquer fator físicoquímico ou
ambiental capaz de produzir uma tensão prejudicial ao organismo vivo
(Levitt, 1980) e a definição mais aceita para estresse ambiental é, uma
força adversa ou uma condição que inibe o funcionamento normal de
um sistema biológico como as plantas (Jones e Jones, 1989). Na
natureza o estresse, normalmente, não acontece isoladamente, mas
sim em conjunto com outros, assim, existem diversas vias para que as
plantas sejam capazes de sobreviver a uma situação de estresse
(Mahajan e Narendra, 2005).
As plantas são constantemente expostas a uma série de fatores
de estresses como, baixas temperaturas, salinidade, seca, alagamento,
calor, estresses oxidativos e toxidade por metais pesados, sendo que
os estresses abióticos são a principal causa da queda na produtividade
mundial, causando perdas de centenas de milhões de dólares por ano
(Bray et al.., 2000).
As plantas respondem ao estresse ambiental de maneira
complexa e dinâmica. Um número crescente de evidências mostra que
as membranas possuem um papel central na percepção do estresse,
respondendo ao estímulo ambiental (e hormonal) através da alteração
do bombeamento de íons e da conformação das proteínas ligadas a
membrana e suas atividades. As membranas participam diretamente ou
indiretamente, determinando a compartimentalização de precursores,
intermediários, produtos, e efetores de sistemas enzimáticos não
ligados à membrana, influenciando o pH. Em resposta a situações de
estresses, vários genes são regulados de modo a minimizar os efeitos
do estresse em questão (Shinozaki et al., 2003).
Amzallag e Lerner (1994) dividem a resposta ao estresse em 2
grupos principais: os de resposta rápida, que está relacionada a um
programa de defesa preexistente na planta e ou outro denominado
10
adaptação, onde o tempo influencia de maneira crucial na elaboração
dessa resposta. A adaptação é uma resposta prolongada durante a
qual as plantas ajustam sua fisiologia as condições ambientais numa
maneira orientada pelo meio.
Quando uma planta responde ao estresse através de sua
resistência (resposta pré-adaptativa) ela expressa um programa
preexistente que lhe permite sobreviver ao estresse mantendo (mais ou
menos) seu programa original de desenvolvimento, onde o estresse é
considerado como o gatilho da expressão genética.
A resistência reflete a capacidade da planta de expressar, sob
estresse, seu programa de desenvolvimento original. Em geral, a
expressão deste programa preexistente ocorre relativamente rápido, em
48h de exposição ao estresse. A reação não é específica ao estresse
particular e rapidamente estabiliza ao nível atual. A diminuição do
crescimento é proporcional a intensidade do estresse e inversamente
proporcional a tolerância (capacidade pré-adaptativa) da planta.
Durante a adaptação a planta estabelece um novo programa de
desenvolvimento como função das condições precisas de estresse. No
início do processo de adaptação existe uma considerável diminuição no
crescimento,
que
é
comumente
mais
importante
do
que
a
preadaptação. Uma vez a planta esteja adaptada, a velocidade de
crescimento aumenta, e pode atingir níveis similares a média de
velocidade de crescimento relativo (RGR – relative growth rate)
comparada as plantas controle de mesma idade. Um aumento da RGR
no final do processo de adaptação indica que o fim do estresse à
planta. A resposta adaptativa inclui modifições do balanço hormonal,
processos metabólicos e expressão de genoma. Em contraste a
resposta pré-adaptativa não é completamente pré-programada no
genoma.
Enquanto
a
resposta
adaptativa
não
é
programada,
a
capacidade de responder ao estresse por adaptação é geneticamente
controlada. Nem toda espécie possui essa capacidade de adaptação.
Dentro de uma espécie capaz de se adaptar, nem todo o cultivar é
11
capaz . E mais ainda, dentro de uma espécie, nem todo o cultivar que
se adapta o faz com a mesma extensão (Amzallag e Lerner, 1994).
Quando ocorrem severas mudanças nas condições ambientais,
a célula pode responder de uma maneira específica e rápida
selecionando o aumento ou diminuição da expressão de genes
específicos. Os genes cuja expressão é aumentada durante o tempo de
estresse, são, presumivelmente críticos para a adaptação do organismo
à condição adversa; um exame dos genes ativados em resposta ao
estresse podem mostrar-se útil no entendimento da resposta biológica
de plantas em condições de estresse. Os sistemas genéticos que
respondem ao estresse são de interesse não somente devido ao seu
papel de apoiar a planta sob estresse, mas também por sua utilidade no
estudo dos eventos moleculares que controlam o nível quantitativo da
expressão gênica (Matters e Scandallos, 1986).
Nem toda resposta metabólica é considerada deletéria ou
prejudicial, e o maior desafio para os bioquímicos é distinguir as
respostas que representam um sintoma prejudicial e aquelas que são
verdadeiramente adaptativas, ou seja, que favorecem o crescimento
continuado durante a recuperação ao estresse. Na verdade para
qualquer variável no metabolismo deve existir uma faixa ótima, onde
abaixo dela a planta pode sofrer privação, e exceder essa faixa pode
levar a toxicidade (DeRocher e Bohnert, 1993).
2.3.1 - O estresse hídrico
O estresse hídrico pode ser causado por excesso ou por falta de
água. O estresse hídrico mais comum é o causado por falta de
disponibilidade de água para as plantas. A remoção de água das
membranas rompe a estrutura normal da bicamada lipídica e a
membrana plasmática fica extremamente porosa, podendo levar a um
desarranjo das proteínas presentes na membrana, o que contribui para
a perda de sua integridade e seletividade e também, na perda da
capacidade enzimática (Crowe et al., 1992; Hoekstra et al.., 2001;
Mahajan e Narendra, 2005). Além dos danos à membrana, o estresse
hídrico pode causar redução na atividade de proteínas citossólicas ou
12
de organelas. A alta concentração de eletrólitos durante a desidratação
pode causar rompimento no metabolismo celular (Liu e Zhu, 1998;
Yanqiong et al.., 2007).
Um outro efeito fisiológico causado pelo estresse hídrico é a
redução do crescimento vegetativo das plantas. A parte aérea é,
normalmente, mais sensível que as raízes e a redução da expansão da
parte aérea em situação de estresse hídrico é benéfica para a planta,
tendo em vista a redução na transpiração. Já o crescimento radicular
recebe um estímulo de crescimento, com o objetivo de explorar novas
áreas do solo a procura de água (Liu e Zhu, 1998).
O aumento da temperatura ou a rápida queda na umidade
resultam em uma condição de déficit hídrico para as plantas. A primeira
resposta de todas as plantas ao déficit hídrico é, em geral, o
fechamento dos estômatos, para evitar a perda de água por
transpiração (Mansfeld e Atkinson, 1990). O fechamento estomático
pode ser resultado da evaporação direta da água das células guarda
sem envolvimento metabólico, sendo conhecido como fechamento
hidropassivo, ou pode ser dependente do metabolismo, envolvendo
fluxo de íons que causam o fechamento estomático.
2.4 - Tiririca (Cyperus rotundus L.)
As plantas daninhas verdadeiras são, segundo Fisher (1973), as
que apresentam rusticidade e grande vigor vegetativo e reprodutivo,
tendo capacidade de sobreviver, crescer e reproduzir em condições
extremas de ambiente, como seca, encharcamento, altas e baixas
temperaturas, solos com problemas de salinidade, alcalinidade e
acidez. Além disso, são resistentes a pragas e doenças. De acordo com
Cardenas et al.. (1972), as principais características das plantas
daninhas são: ciclo de vida semelhante ao da cultura, plasticidade
populacional, germinação desuniforme (mecanismo de sobrevivência
em função da dormência), produção de inibidores (efeitos alelopáticos
ou teletóxidos) e produção de grande número de sementes (reprodução
sexuada) e/ou estruturas reprodutivas (reprodução assexuada).
13
Os danos causados pelas invasoras tendem a ser medido,
através do número de culturas que afetam, pela dificuldade de controle,
e pelo número de países em que ocorrem. A Cyperus rotundus, que
pode ser visualizada na figura 3, é considerada uma das espécie mais
nociva entre as plantas daninhas (Holm et al., 1977), sendo inclusive
citada no Guinnes Book (1994), como infestante de 52 importantes
culturas em 92 países. É uma planta altamente competitiva e de difícil
controle químico e/ou mecânico, ocorrendo com freqüência nas regiões
compreendidas entre as latitudes 30º Norte a 35º Sul (Junqueira Neto
et al.., 1982). No Brasil a Cyperus rotundus ocorre em toda extensão
territorial. É a invasora mais conhecida no país, possui ampla
distribuição, rápida disseminação, crescimento e desenvolvimento, alta
capacidade de competição e rusticidade. Pode ser ainda hospedeira
alternativa para fungos como e Fusarium spp, insetos, ácaros e para
diversas espécies de nematóides, além de causar efeitos alelopáticos,
produzindo substâncias que afetam a germinação, a brotação e o
desenvolvimento de outras espécies (Kissmann, 1991; Lorenzi, 1994).
A Cyperus rotundus é altamente beneficiada pelos cultivos
intensivos do solo, o que favorece a sua multiplicação e dispersão e,
além disso, é resistente a grande maioria dos herbicidas registrados
(Forster e Cerdeira, 1993; Sharma e Gupta, 2007). Em conseqüência
destas características e de sua rápida propagação vegetativa, esta
ciperácea passa a dominar áreas agrícolas com quase total
exclusividade.
A Cyperus rotundus é uma planta de metabolismo C4 (Mercado,
1979), e por este motivo é beneficiada por alta intensidade luminosa e
temperatura elevada (Holm et al., 1977) mantendo uma alta atividade
fotossintética
nestas
condições,
com
ausência
aparente
de
fotorespiração (Taiz e Zeiger, 1995; Guimarães, 1993). Essas
características fazem com que essa planta daninha se torne muito mais
competitiva nas regiões tropicais. Muitas culturas de importância
econômica são afetadas pela Cyperus rotundus, como a cana-deaçúcar, o milho, o feijão, o arroz, a soja e hortaliças.
14
Na cana-de-açúcar, cerca de 1 milhão de hectares plantados
com esta cultura apresentam infestação de Cyperus rotundus, no Brasil
(Kissmann, 1991). Os prejuízos decorrem de competição, durante todo
o ciclo, mas especialmente é na fase inicial da cultura e nas reformas
que a invasora ocasiona maiores problemas. Pela exudação de
substâncias químicas de efeito alelopático a Cyperus rotundus inibe a
brotação de gemas e o perfilhamento da cana, o que resulta em
estandes muito baixos (Lorenzi, 1983; Durigan, 1991). Na Colômbia
Cruz et al. (1971), demonstraram que uma competição inicial por 10
dias reduziu em 10% a produtividade da cana-de-açúcar, enquanto a
competição por 30 dias reduziu em 30%. Experimentos conduzidos na
Argentina, em 1965, citados por Kissmann (1991), mostraram que em
casos extremos de infestação há uma queda de até 75% na colheita de
cana e uma redução de 65% na produção de açúcar.
15
Rede de tubérculos
Figura 3 – A Cyperus rotundus L.
16
2.5 - Cana-de-açúcar (híbrido interespecífico de Saccharum L.)
Originária do sudeste da Ásia, onde é cultivada desde épocas
remotas, a exploração canavieira assentou-se, no início, sobre a
espécie S. officinarum. O surgimento de várias doenças e de uma
tecnologia mais avançada exigiram a criação de novas variedades, as
quais foram obtidas pelo cruzamento da S. officinarum com as outras
quatro espécies do gênero Saccharum e, posteriormente, através de
recruzamentos com as ascendentes (Doorembos e Kassam, 1979)).
Os trabalhos de melhoramento persistem até os dias atuais e
conferem a todas as variedades em cultivo uma mistura das cinco
espécies originais e a existência de cultivares ou variedades híbridas.
A importância da cana-de-açúcar pode ser atribuída à sua
múltipla utilização, podendo ser empregada in natura, sob a forma de
forragem, para alimentação animal, ou como matéria prima para a
fabricação de rapadura, melado, aguardente, açúcar e álcool (Orlando
Filho, 1983) .
O Brasil encontra-se em primeiro lugar no ranking mundial da
produção de cana-de-açúcar (Saccharum spp.), atualmente com uma
área total cultuvada de aproximadamente 5.400.000 há e uma
produção anual da ordem de 400.000.000 de toneladas (cana colhida).
O estado de Alagoas com aproximadamente 7,7% da área colhida do
Brasil (Agrianual, 2007). Com essa produção a cultura da cana-deaçúcar demonstra ser de grande importância para a economia do
Brasil.
As características dos cultivares influenciam a eficiência
fotossintética da cana, além das variações climáticas que prevalecem
durante o desenvolvimento da cultura. A fotossíntese é correlacionada
negativamente com a largura das folhas e positivamente com a sua
espessura. A temperatura e a disponibilidade de água no solo, dos
fatores climáticos, são os mais importantes para a produção de canade-açúcar (Vitória Filho e Christoffoleti, 2004). Sendo a cana-de-açúcar
uma planta de metabolismo fotossintético C4, é considerada altamente
eficiente na conversão de energia radiante em energia química.
17
Para o aprimoramento do cultivo da cana-de-açúcar, existe a
necessidade de melhor entendimento sobre o metabolismo do processo
fotossintético. É necessário conhecer-se mais e melhor o sistema de
transporte e de acúmulo dos metabólicos, principalmente sacarose, o
mais valioso produto da cana-de-açúcar .
2.6 – Milho (Zea mays L.)
O milho é uma das mais importantes plantas comerciais com
origem nas Américas. Há indicações de que sua origem tenha sido no
México, América Central ou Sudoeste dos Estados Unidos. É uma das
culturas mais antigas do mundo, havendo provas, através de
escavações arqueológicas e geológicas, e através de medições por
desintegração radioativa, de que é cultivado há pelo menos 5.000 anos.
Logo depois do descobrimento da América, foi levado para a Europa,
onde era cultivado em jardins, até que seu valor alimentício tornou-se
conhecido.
A importância econômica do milho é caracterizada pelas
diversas formas de sua utilização, que vai desde a alimentação animal
até a indústria de alta tecnologia. Na realidade, o uso do milho em grão
como alimentação animal representa a maior parte do consumo desse
cereal, isto é, cerca de 70% no mundo. Nos Estados Unidos, cerca de
50% é destinado a esse fim, enquanto que no Brasil varia de 60 a 80%,
dependendo da fonte da estimativa e de ano para ano (Fanceli e
Dourado Neto, 2000)
O milho é uma planta característica de clima tropical, ou seja,
exige calor e umidade para produzir satisfatoriamente e proporcionar
rendimentos compensadores (Resende et al., 2000).
Em plantas de milho, o déficit hídrico afeta praticamente todos os
aspectos relacionados ao desenvolvimento das plantas, reduzindo a
área foliar, diminuindo a fotossíntese e afetando vários outros
processos, além de alterar o ambiente físico das culturas, por modificar
o balanço de energia do sistema (Bergamaschi, 1992).
18
As restrições causadas pela baixa disponibilidade de água do
solo ou pela alta demanda evaporativa ativam certos mecanismos
fisiológicos que permitem aos vegetais escapar ou tolerar essas
limitações climáticas, modificando seu crescimento e desenvolvimento,
e até mesmo atenuando as reduções na produção final.
O milho é cultivado em regiões cuja precipitação varia de 300 a
5.000 mm anuais, sendo que a quantidade de água consumida por uma
lavoura de milho durante o seu ciclo está em torno de 600 mm. Dois
dias de estresse hídrico no florescimento diminuem o rendimento em
mais de 20%, quatro a oito dias diminuem em mais de 50% (Magalhães
e Durães, 2006).
Segundo Kramer (1969), os efeitos causados pelo déficit hídrico
são devidos às modificações na anatomia, morfologia, fisiologia e
bioquímica das plantas.
19
3 - OBJETIVO GERAL
Caracterizar a nível celular, bioquímico e molecular as enzimas
transdutoras de energia em espécies vegetais que expressem
diferentes suscetibilidades ao estresse hídrico. A abordagem visa
atender a grande demanda de conhecimento básico da área e
desenvolver ferramentas de suporte a programas de geração de
variedades mais adaptadas e tolerantes a condições de estresses
abióticos (extremos de seca).
3.1 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Gerar conhecimento científico básico sobre o funcionamento e
distribuição dos sistemas de transdução de energia da planta
daninha Cyperus rotundus, e da planta cultivada Saccharum spp.,
as quais apresentam impressionante tolerância a estresses
ambientais e das quais pouco se conhece sobre sua energética
celular, além de estabelecer comparação entre a planta daninha e a
cultivada Zea mays ;
2. Identificar padrões de distribuição, abundância e atividade das
bombas de prótons V-ATPase e PPase que possam ser usados
como indicadores para fenotipagem de plantas tolerantes ao
estresse hídrico.
3. Elucidar mecanismos envolvidos na ativação de vias alternativas do
metabolismo energético que utilizam pirofosfato ao invés de ATP,
durante a adaptação ao estresse hídrico em plantas visando o futuro
desenvolvimento de variedades adaptadas de culturas importantes.
20
4 - MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi realizado em duas fases, a primeira com plantas
retiradas de uma área experimental do campo e a segunda com plantas
cultivadas em casa de vegetação e submetidas ao estresse hídrico.
As médias dos dados climatológicos obtidos pelo Setor de Irrigação e
Agrometeorologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense na
estação evapotranspirométrica em Campos dos Goytacazes, RJ, entre
março de 2002 e dezembro de 2003 e março de 2004 e dezembro de
2005 , foram: precipitação, 620 mm; umidade relativa, 79,8 %;
temperatura
máxima, 28,3ºC; temperatura
mínima, 18,9 ºC e
temperatura média, 24,5 ºC.
A segunda fase foi realizada em casa de vegetação, também na
Unidade de Apoio à Pesquisa, no campus da Universidade Estadual do
Norte Fluminense Darcy Ribeiro – UENF, no município de Campos dos
Goytacazes, RJ.
4.1 – Plantas
Na primeira fase foram utilizadas plantas adultas de Cyperus
rotundus coletadas em campo aberto, na Unidade de Apoio à Pesquisa,
no campus da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro – UENF, no município de Campos dos Goytacazes, RJ, região,
segundo Andreazzi (1997), localizada ao Norte do Estado do Rio de
Janeiro a uma altitude de 13 m do nível médio do mar, tendo como
coordenadas geográficas 21º 45´15” de latitude Sul e 41º 19´28” de
longitude Oeste. O clima da região, conforme W. Koppen é classificado
como Awi, com temperatura média em torno de 24 ºC e precipitação
pluvial de 932 mm por ano.
Na segunda fase foram utilizados tubérculos de C. rotundus,
colmos de cana-de-açúcar e sementes de milho, que foram plantados
em vasos com capacidade para 8 litros, contendo uma mistura de
substrato e areia na proporção de 2 :1.
As características químicas da mistura de areia e substrato
utilizada são apresentadas no Quadro 1.
21
Quadro 1 - – Resultado da análise química do solo utilizado
Características Químicas
pH
Ca
2+
Mg2+
Na+
K
cmolc.dm3
H2 O
7,2
Al3+
2,2
2,3
0,0
P
mg.dm3
0,26
1,518
18,70
Análise realizada no Laboratório de Solos da UFRRJ em
Campos dos Goytacazes, RJ.
As plantas cultivadas foram irrigadas diariamente e após 15 a 20
dias da germinação, foram selecionadas para os procedimentos
experimentais.
O monitorando do estresse hídrico foi feito por quantidade (%) de
água no solo através do peso fresco comparado ao peso seco de três
amostras de 25 cm3 de solo, e após o estresse atingir o nível de 70% de
ressecamento do solo, a irrigação foi re-estabelecida e mantida
constante por 5 dias (120h).
A parte vegetal utilizada das plantas de C. rotundus e de milho foi
o pseudocaule (como indicado na figura 3). Também foram utilizados
colmos de cana-de-açúcar (Saccharum spp.), de onde foram separadas
casca (parte mais externa) e miolo para fracionamento celular.
No local do experimento, as temperaturas máxima, mínima e
média do ar e a umidade relativa (UR) foram monitoradas, entre as 8h e
às 17h, por meio de um termohigrômetro modelo 450, Spectrum
Technologies. A umidade do solo foi monitorada por um sensor Spectrum
Technologies.
4.2 - Preparacão da fração microssomal
A metodologia aplicada permite que de uma só vez, partindo-se
de uma mesma amostra, as frações de vesículas de membrana
plasmática e tonoplasto sejam isoladas. A fração microssomal contendo
vesículas de membrana plasmática e de tonoplasto foram isoladas de
pseudocaule das plantas de C. rotundus e do colmo de Saccharum spp,
através de centrifugação diferencial, essencialmente como descrito por
Giannini e Briskin (1987), com algumas modificações. Foram cortadas e
pesadas cerca de 15 a 20g de tecido e estes foram então
22
homogeneizadas em meio tamponado, usando grau e pistilo. O tampão
de extração é composto de sacarose 250 mM, glicerol a 10 %, 5 mM
DTT, 5 mM EDTA, 0,4 % de PVP-40, 100 mM KCl, 0,3 % BSA, PMSF 1
mM, Benzamidina 1mM, Tris-HCl (pH 8,0) 100 mM, na relação peso de
tecido/volume de tampão de 1:2. As soluções usadas na preparação
foram mantidas no gelo e toda a manipulação foi realizada a 4°C. O
homogenato resultante foi filtrado através de quatro camadas de gaze e
submetido a centrifugação a 3.000 x g durante dez minutos para a
remoção de células não rompidas, e núcleos. O sobrenadante foi
submetido a nova centrifugação a 100.000 x g por 30 minutos. O
precipitado dessa centrifugação é solubilizado em solução tampão
contendo: glicerol a 10 %, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, Benzamidina 1mM,
Tris-HCl 100 mM pH 7,6 e EDTA 5 mM.
4.3 - Purificação das vesículas de tonoplasto e membrana
plasmática
A purificação das vesículas de membrana plasmática, foi
realizada essencialmente como descrito por Serrano (1990). 1,5 mL da
fração microssomal foi aplicada sobre um gradiente descontínuo
bifásico de sacarose nas concentrações de 25/46 % p/p, contendo
ainda: Tris-HCl 100 mM pH 7,6, EDTA 5 mM, DTT 5mM, PMSF 1mM e
Benzamidina 1mM. O gradiente com a fração microssomal foi
submetido a uma centrifugação de 100.000 x g em um rotor SW40
(Beckman), durante 2 horas. Após a centrifugação a banda contendo as
vesículas de membrana plasmática purificadas localizava-se na
interface entre 30 e 46 %, enquanto as vesículas de tonoplasto situavase na interface de 10 e 25 % ou 10 e 30 %. As bandas foram coletadas
e congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a –70ºC até
utilização. A proteína total contida na preparação foi dosada pelo
método clássico descrito por Lowry et al.. (1951) e Bradford (1976).
23
4.4 - Determinação das atividades PPásicas e ATPásicas
As atividades PPásicas e ATPásica foram determinadas
colorimetricamente, segundo o método clássico descrito por Fiske e
Subbarrow (1925). A reação foi iniciada com a adição da proteína e
parada através da adição de ácido tricloroacético em baixas
temperaturas, para uma concentração final de 10 % (v/v). A
composição do meio de reação foi de Tris , 50 mM em pH 6,5 para
frações de membrana plasmática e 7,0 para frações de tonoplasto;
MgSO4, 3 mM, KCl 100 mM, ATP 1 mM para as ATPases e PPi 1 mM
para as PPases e 0,03mg.ml-1 de proteína. Como inibidores da
atividade ATPásica foram utilizados 0,2 mM de vanadato no caso de
vesículas de membrana plasmática (Bowman et. al., 1988) A hidrólise
de PPi foi aferida através de sua dependência por K+.
4.5 - Monitoramento do gradiente de prótons
O gradiente de próton foi monitorado pelo decréscimo da
fluorescência da sonda fluorescente metacromática, 9-amino-6-cloro-2metoxiacridina (ACMA), excitada com um feixe de λ 415 nm e a
emissão captada a 485 nm. O meio de reação era composto de 250mM
sacarose, 10 mM de Tris pH 6.5 ou 7,0, KCl 100 mM, ACMA 1,3 µM,
MgSO4 1 ou 3 mM e ATP 3 mM ou PPi 0,4mM e 50 µg de proteína. O
gradiente foi dissipado com NH4Cl 1,5 mM.
4.6
-
Determinação
da
condutância
estomática
e
da
transpiração
A taxa fotossintética líquida (A, µmol m-2 s-1), a condutância
estomática (gs, mol m-2 s-1) e a transpiração foram determinadas nas
plantas de C. rotundus mantidas sob tratamento, por meio do sistema
portátil de medição das trocas gasosas, modelo LI-6200 (LI-COR). Para
tanto, foi utilizada uma câmara de 0,25L com área de medição de
aproximadamente 7,5 cm2. Todas as medidas foram efetuadas entre 7h
e 14h com intervalos de 1h nos dias estabelecidos de estresse por
déficit hídrico, utilizando sempre a luz ambiente.
24
4.7 - Determinação da fluorescência da clorofila a
A variável da fluorescência emitida pela clorofila a foi
determinada, nas mesmas folhas que as trocas gasosas, por meio de
um fluorímetro de luz modulada modelo Mini-PAM (WALZ).
As folhas das plantas foram adaptadas ao escuro, com o uso de
pinças, por 30 minutos, para que os centros de reação, do PSII,
adquiram a condição de “abertos” (todos os aceitadores primários
oxidados) e a perda de calor seja mínima. A fluorescência inicial (F0) foi
obtida com luz modulada de baixa intensidade (< 0,1 µmol m-2 s-1) para
não induzir efeito na fluorescência variável. A fluorescência máxima
(Fm) foi determinada por um pulso de luz saturante de 0,3 s de duração,
com freqüência de 20000 Hz. A fluorescência variável (FV) foi
determinada pela diferença entre F0 e Fm. Esse pulso permite o
fechamento dos centros de reação do PSII. Com os valores de FV e Fm
foi obtida a relação FV/Fm.
4.8 - Determinação do teores de clorofila
Os teores de clorofila foram determinados a partir do início do
tratamento pelo estresse por déficit hídrico, por meio do medidor portátil
de clorofila modelo SPAD-502, Minolta, Japão.
4.9
-
Microscopia
Eletrônica
de
Transmissão
e
Imunocitoquímica
As amostras de plantas submetidas ao estresse hídrico e após
restabelecimento
da
irrigação
foram
fixadas
em
solução
de
glutaraldeído 2,5 % em tampão fosfato por 24 horas a temperatura
ambiente. Após a fixação primária, as amostras foram lavadas por três
vezes em tampão fosfato para remoção do glutaraldeído residual e
desidratadas em série etanólica crescente. Amostras destinadas a
microscopia eletrônica de transmissão (MET) foram pós-fixadas por 1
hora em solução de tetróxido de ósmio 1% em água, lavadas por três
vezes em tampão fosfato e só então sofreram desidratação em séria
etanólica crescente. Após a desidratação as amostras foram embebidas
25
em resina UNICRIL durante um período de 72h, sendo mantidas em
estufa para polimerização da resina. Para visualização do material
antes de ser levado ao MET foram obtidas seções semi-finas (0,7 - 1
µm) utilizando um ultramicrótomo Reichert-Jung Ultracut S (Leica) e
facas de vidro preparadas em um Knife maker II Reichert-Junga partir
dos blocos obtidos. Seções semi-finas coradas com azul de toluidina
solução 0,1% foram examinadas em um microscópio ótico Axioplan
(Zeiss). Seções ultra-finas para observação da imunocitoquímica ao
MET foram recolhidas em grades de níquel e incubadas com anticorpo
anti-PPase, subsequentemente contrastadas em acetato de uranila
solução 5% em água por 20 minutos e citrato de chumbo por 5 a 7
minutos
e então examinados em um microscópio eletrônico de
transmissão Zeiss modelo EM 900 (Carls Zeiss).
4.10 - Microscopia Eletrônica de Varredura
Amostras de raízes e mesocótilos fixadas em glutaraldeído e
tetróxido de ósmio da mesma forma como descrito para amostras
preparadas para MET, foram lavadas por três vezes em tampão fosfato
e desidratadas em série etanólica crescente. Em seguida, amostras
selecionadas foram transferidas para o equipamento Critical Point
Drying Apparatus (Mod CPD 030, Bal-tec), e após secagem, foram
metalizadas utilizando o Automatic Sputter Coater SCD 050, Bal-tec.
Finalizado este processo, as amostras estavam prontas para
observação no microscópio eletrônico de varredura DSEM 962 (Zeiss).
26
5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 - Atividade hidrolítica e de transporte de H+ da P-ATPase,
da V-ATPase e da H+-PPase em plantas de C. rotundus
O trabalho teve início com a caracterização das atividades das
bombas de prótons de membrana plasmática e de vacúolo da planta
daninha C. rotundus, crescidas em condições de campo.
A Figura 4 mostra os resultados de atividade hidrolítica e a
Figura 5 de transporte de H+ pelas bombas P-ATPase, V-ATPase e
PPase isoladas de plantas crescidas no campo, ou seja, os resultados
encontrados relatam a atividade dessas bombas em condições de
campo para tal espécie vegetal.
Atividade
µ mol.mg-1.min-1
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
P-ATPase
V-ATPase
V-PPase
Figura 4 - Atividade hidrolítica das bombas de prótons em vesículas
enriquecidas de membrana plasmática e de vacúolo de
plantas de C. rotundus crescidas em condições de campo
(média representativa de cinco experimentos).
27
Fluorescência (%)
120
100
80
b
c
60
40
a
20
0
0
200
400
600
800
Tempo (segundos)
Figura 5 – Transporte de prótons pelas bombas ATP/PPi dependente
de vesículas de membrana plasmática e tonoplasto de
plantas em condições de campo. P-ATPase (a), V-ATPase
(b) e PPase (c). Fluorescência do ACMA na presença de 50
µg de proteína de membrana.
Os experimentos mostraram que a atividade da V-ATPase de
membranas enriquecidas de tonoplasto na C. rotundus, foi, em média
de 1,6 µmol.mg ptn-1.min-1 e a atividade da PPase, de 0,5 µmol.mg ptn1
.min-1 (Figura 4), apresentando, portanto valores superiores aos
encontrados na literatura para Vigna unguiculata (Otoch et al., 2000) e
para Suaeda salsa (Han et al., 2005), porém, o balanço na atividade
entre as duas bombas de prótons vacuolares está coerente com o
padrão estabelecido para a maioria das preparações de tecido vegetal,
em que a V-ATPase, que é a principal bomba vacuolar, podendo gerar
um gradiente de H+ através da membrana vacuolar de magnitude
parecida ou maior que PPase (Perotti et al.,1994; Giannini e Briskin,
1987; Rea e Sanders, 1987), como é possível observar na figura 5.
Em condições ótimas para a planta, a atividade da V-ATPase
supera a da PPase (Nakanishi e Maeshima, 1998). Segundo Maeshima
(2000), uma maior quantidade da enzima PPase está presente em
28
tecidos jovens, ou em condições de estresse energético. Esta fase do
experimento foi realizada com plantas adultas não estressadas. Tendo
o conhecimento de que a C. rotundus possui característica de
tolerância a condições adversas do ambiente, esperava-se encontrar
um padrão diferenciado do descrito para outras plantas mais sensíveis
a alterações ambientais, com uma atividade hidrolítica e de transporte
pela PPase mais alto que a da V-ATPase, mostrando um padrão
diferenciado da C. rotundus, porém, os valores encontrados para as
atividades das bombas de prótons PPase e V-ATPase da C. rotundus
seguem o padrão descrito na literatura para outras plantas.
Quando o assunto é estresse abiótico, muitos grupos, com
muitos resultados contraditórios, têm estudado os efeitos do estresse
salino nas bombas de prótons vacuolares (V-ATPase e PPase). Otoch
et al. (2001) mostraram que a atividade de transporte dependente de
PPi sofre uma redução na germinação de sementes de Vigna
unguiculata crescidas sob condição de estresse salino. Qiu et al. (2007)
mostraram que em vesículas enriquecidas de tonoplasto de S. salsa a
atividade hidrolítica e de transporte de prótons da V-ATPase
aumentaram quando as plantas foram submetidas ao tratamento com
estresse salino em comparação com plantas controle. Russak e Klobus
(2007) mostraram que plantas submetidas ao estresse salino
apresentaram aumento na atividade da V-ATPase. Porém, estudos de
energética associados ao estresse hídrico estão limitados a poucos
grupos.
Com o objetivo de buscar características diferenciadas na
bioenergética da C. rotundus quando submetidas à situação de
estresse por déficit de água, realizamos experimentos em casa de
vegetação.
Os resultados apresentados a seguir mostram o comportamento
das bombas de prótons de membrana plasmática e vacuolares da C.
rotundus sob condição de déficit hídrico.
A figura 6 mostra a atividade de hidrólise da bomba de prótons
de membrana plasmática P-ATPase. Uma importante característica da
29
P-ATPase é que ela funciona como um indicador do funcionamento
celular e sua atividade é afetada por diversos fatores ambientais
(Serrano, 1990; Palmgren, 1998). Sendo assim, é possível detectar a
presença de estresse em nível celular através do funcionamento da PATPase.
Observou-se que durante o estresse hídrico a atividade
hidrolítica dessa bomba cai, chegando a aproximadamente 60% de
inibição em relação ao controle, indicado no eixo 0 (zero) da figura 7, e
após 24h do restabelecimento da irrigação a atividade retorna a níveis
próximos ao do controle, indicando o final do período de estresse.
hidrólise ATP
-1
-1
µ mol.mg .min
3
2
1
0
controle
dh.30%
dh.50%
dh.70%
ri.10min
ri.24h
ri.48h
ri.120h
Figura 6 – Atividade hidrolítica da bomba de próton P-ATPase em
vesículas enriquecidas de membrana plasmática de plantas
de C. rotundus submetidas a déficit de água (dh) e após o
restabelecimento da irrigação (ri) (média representativa de
três experimentos).
30
inibição/estímulo (%)
60
40
20
0
dh.30%
dh.50%
dh.70%
ri.10min
ri.24h
ri.48h
ri.120h
-20
-40
-60
Figura 7 - Porcentagem de inibição ou estímulo da atividade hidrolítica
(µmol.mg-1.min-1) da bomba de prótons P-ATPase dos
tratamentos em relação ao controle.
Os resultados que seguem (figuras 8, 9, 10, 11 e 12) mostram a
atividade hidrolítica das bombas V-ATPase e PPase, principal foco do
trabalho apresentado. Observou-se que ambas bombas sofreram
inibição da atividade de hidrólise conforme o aumento do estresse
hídrico, indicado pelo aumento na porcentagem de ressecamento do
solo.
O resultado apresentado na figura 12 indica claramente que a VATPase é a bomba de prótons mais inibida quando comparada a
PPase. Esse resultado sugere um déficit no suprimento de ATP,
levando a uma redução na quantidade de substrato para ser hidrolisado
pela V-ATPase. Corbineau et al. (2004), mostraram que o estresse
hídrico leva a um déficit energético avaliado pelos baixos níveis de
ATP, ADP e NTP, nucleotídeos responsáveis pelo armazenamento de
energia em suas ligações químicas para utilização nos diversos
processos celulares.
O suprimento de PPi, que é subproduto de muitos processos
metabólicos, parece ter sido menos afetado, já que a atividade da
PPase sofreu uma inibição cerca de 40% menor que a V-ATPase
quando comparadas ao controle (figura 12).
31
hidrólise ATP
-1
-1
µ mol.mg .min
2
1
0
controle
dh.30%
dh.50%
dh.70%
ri.10min
ri.24h
ri.48h
ri.120h
Figura 8 – Atividade hidrolítica da bomba de próton V-ATPase em
vesículas enriquecidas de tonoplasto de plantas de C.
rotundus submetidas a déficit de água (dh) e após o
restabelecimento da irrigação (ri) (média representativa de
inibição/estimulação (%)
três experimentos).
100
60
20
-20
dh.30% dh.50% dh.70% ri.10min
ri.24h
ri.48h
ri.120h
-60
-100
Figura 9 - Porcentagem de inibição ou estímulo da atividade
hidrolítica (µmol.mg-1.min-1) da bomba de prótons VATPase dos tratamentos em relação ao controle.
32
hidrólise PPi
-1
-1
mmol.mg .min
2
1
0
controle
dh.30%
dh.50%
dh.70%
ri.10min
ri.24h
ri.48h
ri.120h
Figura 10 – Atividade hidrolítica das bomba de próton PPase em
vesículas enriquecidas de tonoplasto de plantas de C.
rotundus submetidas a déficit de água (dh) e após o
restabelecimento da irrigação (ri) (média representativa de
inibição/estimulação(%)
três experimentos).
120
80
40
0
dh.30% dh.50% dh.70% ri.10min
ri.24h
ri.48h
ri.120h
-40
-80
-120
Figura 11 - Porcentagem de inibição ou estímulo da atividade hidrolítica
(µmol.mg-1.min-1)
da
bomba
de
tratamentos em relação ao controle.
prótons
PPase
dos
inibição/estimulação (%)
33
100
V-ATPase
PPase
50
0
dh. 30%
dh. 70%
ri. 24h
ri. 120h
-50
-100
Figura 12 – Comparação entre a porcentagem de inibição ou estímulo
da atividade hidrolítica (µmol.mg-1.min-1) das bomba de
prótons V-ATPase e PPase dos tratamentos em relação ao
controle.
24h após o restabelecimento da irrigação, é possível observar
um incremento de aproximadamente 20% da atividade da V-ATPase e
de 100% da PPase, quando comparadas ao controle (figura 12), o que
sugere que a capacidade de recuperação da PPase é muito superior
que a da V-ATPase.
A explicação para os resultados apresentados pode ter como
base o fato da enzima PPase ser um polipeptídeo único, codificada por
um único gene (Sarafian et al.., 1992), sendo assim, sua resposta de
expressão após o término do estresse com a finalidade de restabelecer
o metabolismo celular, torna-se mais rápida. Além disso, também é
possível discutir a partir do fato de que após o término do estresse
hídrico, que provocou um estresse energético com conseqüente
depleção nos níveis de ATP, o substrato mais abundante presente no
citossol é o PPi, então, 24h após o restabelecimento da irrigação, a
atividade PPásica superou a ATPásica.
A maior atividade PPásica acarreta na hidrólise do pirofosfato
(PPi) e aumenta a produção de fosfato inorgânico, que, juntamente com
o ADP, é substrato para formação de ATP. Na figura 12 é possível
34
observar que aos 5 dias após o restabelecimento da irrigação (120h) a
atividade da V-ATPase encontra-se em níveis semelhantes ao controle
e a da PPase é reduzida a um nível pouco maior que o controle. Nesta
situação, a planta, provavelmente, está retomando sua atividade
energética normal, onde o suprimento de ATP aos poucos está sendo
normalizado. É possível que após mais alguns dias a atividade da VATPase seja recuperada e volte a ser prioritária em relação a PPase.
Na figura 13, é possível observar o comportamento das plantas
de
C.
rotundus
no
período
do
estresse
hídrico
e
após
o
restabelecimento da irrigação. É possível observar que mesmo após
cinco dias sem irrigação, as folhas da planta se mantêm túrgidas e os
sintomas de déficit hídrico aparecem apenas aos 11 dias sem irrigação,
onde é possível observar sintomas de clorose e murcha.
Após o
restabelecimento da irrigação, a recuperação da planta é bastante
rápida, onde após 24h do restabelecimento da irrigação as folhas
retomam seu aspecto de turgescência e os sintomas da desidratação
sofrida podem ser observados apenas em algumas folhas.
Em 1971 e 1977, Gaff descreveu um grupo de plantas que
chamou de ressurection plants, que são um grupo de plantas que
possuem a habilidade de tolerar longos períodos de dessecação e
“ressuscitar” após o restabelecimento da irrigação. Plantas com tais
características podem utilizar diferentes mecanismos fisiológicos e
bioquímicos de adaptação à dessecação e de retorno ao padrão
metabólico normal após a re-hidratação (Bewley e Krochko, 1982;
Navari-Izzo e Rascio, 1999).
No decorrer do experimento foi possível observar que cerca de 3
dias após o restabelecimento da irrigação, novas brotações foram
observadas, provavelmente como uma estratégia da espécie em se
reproduzir enquanto as condições do ambiente permitem (dados não
apresentados).
A C. rotundus não foi descrita como uma ressurection plant,
porém, suas características de recuperação de seu estado metabólico
35
após a re-hidratação, como pode ser visualizado na figura 13, sugerem
características próximas a essas plantas.
Figura 13 – Plantas de C. rotundus. Controle (A), 5º dia de estresse
hídrico (B), 11º dia de estresse hídrico (C) e 24h após o
restabelecimento da irrigação (D).
36
Para facilitar a comparação com uma planta cultivada de
metabolismo C4, experimentos com milho (Zea mays) foram conduzidos
nas mesmas condições do experimento com a planta daninha C.
rotundus. Os dados comparativos para a atividade hidrolítica das
bombas de prótons vacuolares (V-ATPase e PPase) podem ser
observados na tabela 1.
Tabela 1 – Comparação entre a atividade hidrolítica das bombas de
prótons vacuolares de C. rotundus e Z. mays em situação
de déficit hídrico (dh) e após o restabelecimento da
irrigação (re-irri). Valores representativos (± SD) de três
experimentos.
controle
V-ATPase
dh 30%
dh 70%
re-irri 24h
Hidrólise ATP (µ
µmol.mg-1.min-1)
C. rotundus
1,77 ±0,15
1,16 ±0,18
0,54 ±0,03
1,93 ±0,08
Zea mays
0,14 ±0,04
0,09 ±0,04
0,05 ±0,03
0,13 ±0,05
V-PPase
C. rotundus
Zea mays
Hidrólise PPi (µ
µmol.mg-1.min-1)
0,92 ±0,07
0,93 ±0,07
0,63 ±0,03
1,95 ±0,05
0,1 ±,050
0,05 ±0,02
0,03 ±0,02
0,09 ±0,03
Os dados apresentados na tabela 1 mostram a diferença
metabólica existente entre a planta daninha e a cultivada, onde os
valores de atividade hidrolítica obtidos em preparações de plantas
controle, plantas sob déficit hídrico e plantas re-irrigadas de C. rotundus
superam os de Z. mays, sugerindo uma energética diferenciada, o que
sustentaria a condição de rusticidade da C. rotundus.
Nas figuras 14 e 15 é possível observar a atividade de transporte
de prótons pelas bombas vacuolares.
Normalmente o funcionamento de uma bomba de prótons é
avaliado por sua capacidade de hidrolisar substrato acoplado a
capacidade de transportar prótons e com isso favorecer o transporte
secundário.
37
Figura 14 – Bomba de próton ATP dependente de vesículas de
tonoplasto de plantas irrigadas diariamente (a), 30% dh (b),
70% dh (c) e 24h após restabelecimento da irrigação (d).
Fluorescência do ACMA na presença de vesículas de
tonoplasto (50 µg de proteína de membrana).
Figura 15 – Bomba de próton PPi dependente e permeabilidade da
membrana de vesículas de tonoplasto de plantas irrigadas
diariamente (a), 30% dh (b), 70% dh (c) e após
restabelecimento da irrigação (d). Fluorescência do ACMA
na presença de vesículas de tonoplasto (50 µg de proteína
de membrana).
38
% estímulo/inibição
V0
100
V-ATPase
PPase
80
60
40
20
0
-20
5º dia
11º dia
re-irrigada
-40
-60
-80
-100
Figura 16 – Porcentagem de inibição ou estímulo da velocidade inicial
do transporte de prótons pelas bombas de próton V-ATPase
e PPase da membrana de vesículas de tonoplasto dos
tratamentos em relação ao controle.
Com os resultados apresentados nas figuras 14, 15 e 16, é
possível observar que a atividade de transporte de prótons da VATPase parece estar em uma situação desacoplada de sua atividade
hidrolítica, pois sua atividade de transporte, mesmo com plantas sob
déficit hídrico de 70% apresentou-se maior que a da PPase, enquanto
que sua atividade hidrolítica foi 40% menor que a da PPase.
Matsuura-Endo et al. (1992) apresentaram dados em que o
tratamento com estresse por baixas temperaturas afetou a atividade
hidrolítica e de transporte da V-ATPase; Darley et al. (1995) mostraram
que sob condição de estresse por baixas temperaturas a V-ATPase
não foi afetada em plântulas de Mung bean e que no caso apresentado
a principal bomba de prótons foi a PPase; Colombo e Cerana (1993)
mostraram um incremento na atividade PPásica em suspensão de
células de cenoura sob tratamento com NaCl e Rea e Poole (1993)
mostraram a importância dessa bomba em células de plantas sob
condição de anoxia e estresse por baixas temperaturas. As diferenças
encontradas nos resultados dos trabalhos supracitados são atribuídas
39
ao fato de que as condições de crescimento para as diversas plantas
submetidas aos estresses variados são diferentes, favorecendo, a
variabilidade dos fenômenos celulares.
Os resultados seguintes mostram que a bomba de prótons VATPase apresentou-se pouco menos inibida, em relação a PPase
(figuras 17 e 18) quando comparada aos resultados citados
anteriomente, o que pode ser atribuído ao fato dos experimentos terem
sido conduzidos em diferentes épocas do ano, porém, este fato não
comprometeu as conclusões do trabalho.
Como a H+-PPase vacuolar é a principal enzima capaz de
hidrolisar PPi presente nas membranas do vacúolo, o estímulo
observado deve estar relacionado com a ativação desta enzima
induzida pelo re-estabelecimento da irrigação, sustentando a hipótese
de que existe um possível acoplamento entre as duas bombas de
prótons vacuolares, onde o gradiente eletroquímico gerado pela H+PPase energizaria a reversão do ciclo catalítico da H+-ATPase,
favorecendo a síntese de ATP (Façanha & de Meis, 1998). Assim, a
indução
deste
sistema
regenerador
de
ATP
durante
o
re-
estabelecimento da irrigação pode ser parte da resposta adaptativa da
planta ao estresse hídrico a que foi submetida.
Importante ressaltar que os dados apresentados mostram que as
duas bombas de prótons vacuolares trabalham em conjunto para
manter os processos fisiológicos da planta e superar o estresse a que
foi submetida.
40
Atividade
µ mol.mg-1.min-1
2.5
controle
5º dia
11º dia
re-irrigada
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
P-ATPase
V-ATPase
PPase
Figura 17 - Atividade hidrolítica das bombas de prótons em vesículas
enriquecidas de membrana plasmática e de vacúolo de
plantas de C. rotundus submetidas a estresse hídrico (média
inibição/estimulação (%)
representativa de três experimentos).
100
V-ATPase
PPase
80
60
40
20
0
-20
5º dia
11º dia
re-irrigada
-40
-60
-80
-100
Figura 18 - Porcentagem de inibição ou estímulo da atividade hidrolítica
(µmol.mg-1.min-1) das bombas de prótons V-ATPase e PPase
dos tratamentos em relação ao controle.
41
No presente trabalho, os resultados encontrados sugerem que
as plantas de C. rotundus possuem um metabolismo adaptado para
resistência ao estresse por déficit de água, pois mesmo após 11 dias
sem irrigação, e apesar das plantas apresentarem sintomas de clorose
severa e murcha, suas bombas de prótons vacuolares ainda possuíam
a capacidade de hidrolisar os substratos ATP e PPi, possivelmente com
a finalidade de manter as atividades celulares das plantas. Porém,
pode-se observar que houve um decréscimo na atividade de ambas as
bombas com o passar dos dias, sendo que a PPase foi a enzima que
sofreu maior inibição, quando comparada a V-ATPase. Esses
resultados corroboram com dados de literatura que apresentam a VATPase como uma enzima extraordinariamente importante para manter
a homeostase iônica e o metabolismo celular. Lüttge et al. (1995)
demonstraram que em condições de estresse ambiental a V-ATPase
funciona como uma enzima de resposta de estresse, sofrendo
pequenas modificações na expressão de subunidades. Observamos
também que após o restabelecimento da irrigação a porcentagem de
estímulo em relação ao controle da atividade hidrolítica da PPase
superou em aproximadamente 80% a da V-ATPase, o que nos sugere a
rápida recuperação dessa enzima objetivando a recuperação do
metabolismo da planta.
5.2
-
Determinação
da
condutância
estomática
e
da
transpiração
Nas figuras 19, 20 e 21 é possível observar os resultados da
taxa fotossintética líquida, transpiração e condutância estomática das
plantas submetidas ao estresse hídrico quando comparado às plantas
controle. É possível observar que as plantas sob estresse hídrico
possuem taxa de transpiração e condutância estomática mais baixas
que as plantas controle. Esse resultado vai de encontro aos dados
encontrados na literatura, onde em situação de déficit hídrico as plantas
fecham os estômatos. Esse fechamento estomático evita a transpiração
excessiva, prevenindo a perda de água pela planta, porém,
compromete a fotossíntese, uma vez que com os estômatos fechados,
42
as plantas não absorvem o CO2 da atmosfera, substrato para
ocorrência da fotossíntese. Aparentemente, a C. rotundus segue o
mesmo padrão das mais diversas espécies vegetais citadas na
literatura, onde sob déficit hídrico a condutância estomática decresce,
assim como a assimilação de carbono e conseqüentemente, a
fotossíntese. A visualização desse fechamento estomático foi possível
utilizando a técnica de microscopia de varredura, que será apresentada
no seguimento do trabalho.
5.3 - Determinação da fluorescência da clorofila a
A fluorescência da clorofila a indica a quantidade de energia que
não é aproveitada pela planta para a realização dos processos
fotoquímicos. Nos dados apresentados na figura 22, pode-se observar
que as diferenças entre as plantas controle e as submetidas ao
estresse somente apareceram no 11º dia, e os valores apresentados
são pouco menores que a faixa considerada normal para plantas não
submetidas ao estresse. Segundo Jakl e Bolhàr-Nordenkampf (1991),
a eficiência quântica (Fv/Fm) pode variar em uma faixa de 0,75 a 0,85
em plantas não submetidas a estresses. A diminuição da relação Fv/Fm
pode ser usada para estudar o efeito de estresse causado pela
aplicação de herbicidas (Eullaffroy, 2003).
Esses resultados sugerem a resistência fisiológica dessa planta
daninha ao estresse ambiental a que foi submetida.
43
Figura 19- Resultado da taxa fotossintética líquida (A) em plantas de C.
rotundus irrigadas todos os dias (contr.), submetidas ao
tratamento de déficit hídrico (dh) e após o restabelecimento
da irrigação (ri).
Figura 20 – Resultados da transpiração (gs) em plantas de C. rotundus
irrigadas todos os dias (contr.), submetidas ao tratamento
de déficit hídrico (dh) e após o restabelecimento da
irrigação (ri).
44
Figura 21- Resultado da condutância estomática (gs) em plantas de C.
rotundus irrigadas todos os dias (contr.), submetidas ao
tratamento de déficit hídrico (dh) e após o restabelecimento
Eficiência quântica (F v/Fm)
da irrigação (ri).
0,8
0,7
controle
tratamento
0,6
0,5
1º dia
5º dia
11º dia
re-irrigada
Figura 22 – Determinação da eficiência quântica (Fv/Fm) em plantas de
C. rotundus irrigadas todos os dias (controle) e submetidas
ao tratamento de estresse hídrico por 11 dias (tratamento).
45
5.4 - Determinação do teor de clorofila
Os dados apresentados para teor de clorofila na figura 23,
mostram a redução nas plantas estressadas em relação às plantas
controle ao longo dos dias de estresse. Quando comparados aos dados
de eficiência quântica apresentados na figura 22 esse decréscimo no
teor de pigmentos pode sugerir uma capacidade de adaptação da C.
rotundus às condições adversas de modo que a quantidade de fótons
captada pelas clorofilas do complexo antena que se mantiveram
inalteradas é o suficiente para manter os valores de fluorescência da
clorofila a nas plantas estressadas em relação ao controle até o 7º dia
após a suspensão da irrigação. No 11º dia, o estresse hídrico severo
contribuiu para redução do teor de pigmentos, o que também afetou o
rendimento quântico, porém, após o re-estabelecimento da irrigação,
com o ajuste do metabolismo da planta, o teor de pigmentos voltou a
aumentar, acompanhado do rendimento quântico da fotossíntese.
controle
tratamento
Teor de pigmentos
40
35
30
25
20
15
1º dia
5º dia
11º dia
re-irrigada
Figura 23 – Determinação do teor de pigmentos fotossintéticos em
plantas de C. otundus irrigadas todos os dias (controle) e
submetidas ao tratamento de estresse hídrico por 11 dias
(tratamento).
46
5.5 – Microscopia Eletrônica de Varredura
O déficit hídrico tem efeito em diversos processos fisiológicos
das plantas, visto que o estresse geralmente aumenta a resistência
difusiva ao vapor de água, mediante fechamento dos estômatos,
reduzindo a transpiração e, conseqüentemente, o suprimento de CO2
para a fotossíntese. Muitos desses efeitos refletem mecanismos de
adaptação das plantas ao ambiente (Nogueira, 1997).
Mendonça (2000) estudando os estômatos de plantas daninhas
monocotiledôneas observou em Cyperus rotundus L. a presença de
apenas uma fileira de estômatos nos bordos foliares da superfície
adaxial, e densidade estomática de 135 estômatos/mm2 na superfície
abaxial.
Procurou-se observar o comportamento estomático das plantas
de C. rotundus conforme os tratamentos de estresse hídrico a que
estavam sendo submetidas.
Observou-se após o preparo das amostras que nas plantas
controle, que recebiam irrigação diária, os estômatos apresentavam-se
abertos (figura 24 A e B), facilitando as trocas hídricas e gasosas,
porém, nas plantas submetidas ao estresse hídrico, os estômatos
estavam fechados (figura 24 C e D), o que faz com que a planta não
realize as trocas gasosas necessárias para o processo fotossintético,
com conseqüente perda de biomassa no decorrer do tempo. Pudemos
observar também que 24h após o restabelecimento da irrigação (figura
24 E e F), os estômatos ainda não estavam abertos como no controle,
porém, espera-se que após o ajustamento da planta a nova situação
(final do estresse hídrico), os estômatos voltem a abrir normalmente.
47
A
B
C
D
E
F
Figura 24 – Superfície abaxial de Cyperus roitundus. A) Visão geral da superfície
foliar de planta controle (500x); B) Detalhe do estômato (3000x); C) Visão
geral da superfície foliar de planta sob déficit de 50% de água (500x); D)
Detalhe de estômato (1000x); E) Visão geral da superfície foliar de planta
24h após restabelecimento da irrigação (500x); F) Detalhe de estômato
(3000x).
48
5.6 – Microscopia Eletrônica de Transmissão
Plantas tolerantes ao estresse hídrico são capazes de manter
sua pressão de turgor em situação de baixo potencial hídrico
aumentando o número de moléculas de soluto dentro das células
(Radin, 1983; Bray et al..,2000). Esse transporte de solutos acontece
por intermédio das bombas de prótons. Uma vez que a avaliação visual
do experimento mostrou que os sintomas do estresse, como a murcha
e a clorose das folhas, apareceram somente após um período de 11
dias sem irrigação e que após o restabelecimento da irrigação, a
recuperação da planta foi bastante rápida (figura 13), sugerindo uma
maior ativação das bombas vacuolares, ou mesmo um incremento na
expressão das mesmas, como mostrado por Gaxiola et al.. (2001).
Esperava-se encontrar a marcação ao redor da membrana
vacuolar das células das plantas, uma vez que a bomba de prótons
PPase encontra-se distibuída por tal membrana. Esperava-se, também,
encontrar uma maior marcação nas amostras coletadas de plantas reirrigadas, um vez que os dados bioquímicos apresentados apontavam
essa etapa como a de maior atividade da bomba PPase. No entanto, as
preparações obtidas não permitiram observar com clareza as estruturas
celulares. A imunomarcação para PPase permitiu observar que a
presença da bomba de prótons PPase é maior nas plantas controle
(figura 25), sofrendo uma redução durante o estresse (figura 26) e
apresentando uma quantidade ainda menor que o controle nas plantas
re-irrigadas (figura 27), sugerindo que a regulação dessas bombas de
prótons acontecem de maneira pós transcripcional.
49
Figura 25 – Micrografia eletrônica de transmissão com imunomarcação
anti PPase em plantas controle (20000x).
Figura 26 – Micrografia eletrônica de transmissão com imunomarcação
anti PPase em plantas sob estresse hídrico (20000x).
50
Figura 27 – Micrografia eletrônica de transmissão com imunomarcação
anti PPase em plantas re-irrigadas (20000x).
5.7 - Atividade hidrolítica e de transporte de H+ da P-ATPase,
da V-ATPase e da H+-PPase em colmos de Saccharum spp.
Os
resultados
apresentados
a
seguir
mostram
uma
caracterização inicial e preliminar das atividades das bombas de
prótons de membrana plasmática e de vacúolo em colmos da planta
Saccharum spp., cultivadas em condições de campo. Tal espécie foi
escolhida para o experimento por ser uma das plantas mais importantes
economicamente para o Brasil.
A figura 28 mostra os resultados de atividade hidrolítica e a
figura 29 de transporte de H+ pelas bombas P-ATPase, V-ATPase e
PPase isoladas de casca de colmo plantas crescidas em condições de
campo, ou seja, os resultados encontrados relatam a atividade dessas
bombas em tal tecido.
51
Atividade
µ mol.mg-1.ptn-1
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
P-ATPase
V-ATPase
PPase
Figura 28 - Atividade hidrolítica das bombas de prótons em vesículas
enriquecidas de membrana plasmática e de vacúolo de
casca de colmo de plantas cultivadas em condições de
campo (média representativa de três experimentos).
Figura 29 – Bomba de próton ATP/PPi dependente de vesículas de
membrana plasmática e tonoplasto de casca de colmo de
plantas cultivadas em condições de campo. P-ATPase (a),
V-ATPase (b) e
PPase (c). Fluorescência do ACMA na
presença de 50 µg de proteína de membrana.
52
Os resultados apresentados na figura 28 sugerem o padrão de
atividade hidrolítica para casca de colmo de cana-de-açúcar, onde a
bomba de prótons PPase apresentou atividade mais alta que as
demais, resultado esse que se confirmou no transporte de prótons
(figura 29).
É possível que esse resultado esteja relacionado com o
transporte de solutos, pois esta espécie vegetal é conhecida por sua
alta atividade de transporte de solutos e síntese de açúcares. O tecido
externo do colmo (que denominamos de casca), possui atividade
fotossintética e, possivelmente alta atividade de biossíntese de
açúcares, o que justificaria a alta atividade da PPase, que estaria
funcionando utilizando-se do PPi liberado pelas reações de biossíntese.
53
6 – CONCLUSÕES
•
Em condições de campo a planta daninha Cyperus rotundus
apresentou um padrão de atividade hidrolítica e de transporte
de prótons semelhante ao apresentado na literatura para as
demais plantas, onde a atividade hidrolítica é maior para a VATPase
e
o
gradiente
H+
de
apresenta
magnitude
semelhante ao da PPase;
•
Durante o estresse hídrico, observou-se que as plantas de C.
rotundus apresentaram sintomas de déficit hídrico somente
aos 11 dias sem irrigação e que após 24h do seu
restabelecimento, as folhas retomam seu aspecto de
turgescência,
semelhante
ao
que
acontece
com
as
ressurection plants;
•
Após restabelecimento da irrigação a bomba de prótons
PPase mostrou-se superior a V-ATPase tanto em hidrólise de
substrato quanto em transporte de prótons, sugerindo que o
gradiente de prótons gerado através da membrana vacuolar
pela hidrólise do PPi poderia estar sendo usado para síntese
de ATP, para que os processos celulares da planta fossem
mantidos;
•
Os parâmetros fisiológicos avaliados demonstram que a
planta daninha C. rotundus segue os mesmos padrões das
mais diversas espécies vegetais de metabolismo C4, onde
sob déficit hídrico, a condutância estomática, a eficiência
quântica e o teor de pigmentos decrescem;
•
As
avaliações
microscopia
de
morfológicas
varredura
utilizando
a
técnica
de
comprovam
o
fechamento
estomático durante o estresse hídrico;
•
As avaliações da quantificação e localização da bomba de
prótons PPase, utilizando a técnica de imunomarcação e
visualização em microscópio eletrônico de transmissão
mostraram que a presença das bombas de prótons PPase é
54
maior nas plantas controle, sofrendo redução durante o
estresse e não superando a quantidade encontrada no
controle mesmo após o restabelecimento da irrigação,
sugerindo que a regulação seja pós transcripcional;
•
As avaliações efetuadas em tecido de cana-de-açúcar
mostraram ser maior a atividade de hidrólise e transporte de
prótons pelas bombas vacuolares em casca e que, neste
caso, a PPase foi a que apresentou maior atividade,
sugerindo que seu funcionamento pode estar relacionado
com a síntese de ATP, utilizando o gradiente gerado pela
hidrólise do PPi, para ser utilizado durante os processos de
biossíntese de açúcares
55
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