transferibilidade de marcadores microssatélites de melão

 TRANSFERIBILIDADE DE MARCADORES
MICROSSATÉLITES DE MELÃO PARA MELANCIA
Maia, A. K. S (1); Albuquerque, L. B.(1); Antonio, R. P.(2); Silveira, L. M.(3); Nunes,
G. H. S (1); Silva, A. E. A (1); Dantas, A. C. A (1)
[email protected]
(1)
Laboratório de Biotecnologia Molecular Vegetal da Universidade Federal Rural do
Semi-Árido – UFERSA, Mossoró - RN, Brasil;
(2)
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – Embrapa Semi Árido, Mossoró RN, Brasil;
(3)
Laboratório de Recursos Genéticos Vegetais da Universidade Federal Rural do
Semi-Árido - UFERSA, Mossoró - RN, Brasil;
RESUMO
A família curcubitaceae possui diversas espécies economicamente importantes para a
região Nordeste do Brasil, como a melancia. Para melhorar as condições de cultivo
dos produtores, programas de melhoramento genético vêm sendo desenvolvidos para
esta espécie. Sendo uma de suas etapas a análise da variabilidade genética entre as
variedades
cultivadas.
Considerando
o
elevado
custo
necessário
para
o
desenvolvimento de primers microssatélites, a transferibilidade dos mesmos entre
espécies aparentadas é bastante apropriada. Diante disso, o objetivo desta pesquisa foi
analisar a transferibilidade de 30 primers microssatélites de melão para melancia. De
todos os primers analisados, 77% foram transmissíveis, desta forma, os mesmos
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podem ser utilizados como ferramentas de auxílio em programas de melhoramento
para a melancia.
Palavras- chave: Marcadores moleculares, acessos, SSR
INTRODUÇÃO
A família Cucurbitaceae é formada por 118 gêneros e contém
aproximadamente 825 espécies. Com significativa presença no
agronegócio brasileiro, e de bastante importância na agricultura
familiar, esta família apresenta espécies em cultivo como o melão
(Cucumis melo) e a melancia (Citrullus lanatus), entre outros que
colaboram para o seu destaque na economia brasileira (LEITE et al.,
2007).
Atualmente, programas de melhoramento genético vêm sendo
desenvolvidos para esta espécie com o objetivo de se desenvolver
variedades mais promissoras quanto ao aumento de produtividade e
resistência a doenças.
Uma das etapas dos programas de melhoramento consiste na análise de
variabilidade genética entre as variedades cultivadas da espécie em
questão através do uso de marcadores moleculares.
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Existem atualmente diversas classes de marcadores moleculares, dentre
eles, podemos destacar os marcadores microssatélites.
Os marcadores moleculares microssatélites ou SSR (Simple Sequence
Repeats) são amplamente utilizados em estudos genéticos de plantas e
animais, devido a sua expressão codominante e multialélica, contendo a
mais elevada informação de polimorfismo entre todos os marcadores
moleculares. Devido seu alto polimorfismo o SSR é extremamente
empregado em estudos de diversidade e mapeamento genético de
características
de
interesse
agronômico
(FERREIRA;
GRATTAPAGLIA,1998).
Entre muitas espécies esse marcadores se encontram bem relacionados,
tornando possível a transferência de uma espécie para outra, podendo
visualizar
o
grau
de
semelhança
entre
estas
(FERREIRA;
GRATTAPAGLIA, 1998).
Muitas transferências de marcadores microssatélites realizados tiveram
resultados positivos, dentre estas a transferibilidade para espécies da
mesma família como o melão e a melancia (LAMAS et al., 2006).
Diante disso, o objetivo deste trabalho foi verificar a transferibilidade
de 30 primers SSR desenhados para melão em melancia.
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MATERIAL E MÉTODOS
Trinta primers SSR desenvolvidos para melão foram testados em dois
acessos de melancia oriundos de uma coleção pertencente a UFERSA,
sendo os mesmos divergentes quanto a diversas características
morfoagronômicas.
Dois acessos de melancia, coletados em diferentes cidades do estado do
Rio Grande do Norte, pertencentes a coleção de acessos de melancia da
UFERSA, foram plantados em casa de vegetação e suas folhas foram
colhidas para extração de DNA 15 dias após a germinação das
sementes, conforme protocolo de Doyle e Doyle (1990) com
modificações.
A quantificação do DNA foi realizada em gel de agarose a 0,8% (p/v),
comparando visualmente a intensidade das bandas do DNA dos
genótipos extraídos com bandas de peso molecular conhecido de 100pb.
Após a quantificação, as amostras foram diluídas em água ultrapura e
padronizada em 10ng/µl para serem utilizadas nas reações de PCR.
Cada amostra de DNA genômico total foi amplificada com os 30 pares
de primers SSR, os quais foram otimizados para então serem testados
nesses genótipos.
contendo 20
Para cada reação de PCR foi utilizado um mix
g de DNA, 100 µM de cada um dos dNTPs, 1U de taq
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DNA polimerase, tampão composto de 50 mM de TRIS pH 8,3, 20mM
de KCl, 2mM de MgCl2, 10µg de BSA, 0,25% de Ficoll 400, 10mM de
tartrazine, 5mM de primer (2,5 mM de Forward e 2,5 mM de Reverse)
e água ultrapura. O volume final para cada reação foi de 12µl. A
amplificação foi realizada em termociclador modelo Mastercycler
Eppendorf, no qual foi empregado o seguinte programa: cinco minutos,
a 95ºC, para desnaturação do DNA; oito ciclos, em que foram usados
20 segundos, à temperatura de 94ºC para desnaturação; 20 segundos
para anelamento do primer, cujas temperaturas foram de 46ºC a 68ºC de
acordo com o primer; 1 minuto a 72ºC para extensão de DNA; 24 ciclos
que diferiram dos primeiros apenas na temperatura de anelamento que
variaram de 52ºC a 65ºC e uma extensão final, por quatro minutos, a
72ºC.
Os produtos de amplificação foram submetidos à eletroforese horizontal
por uma hora a 80 V em gel de agarose a 3%, corados com brometo de
etídio (0,5µg/ml), visualizados em transluminador de luz ultra-violeta e
fotografados com câmera digital para verificação do perfil eletroforético
obtido.
Para análise dos géis, adotou-se os critérios estabelecidos por Kuleung
et al. (2004). Desta forma, procedeu-se a construção de um score para
os primers que amplificaram fragmentos de tamanho esperado de
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acordo com a intensidade do sinal e a facilidade de avaliação, sendo (1)
sinal forte e facilidade de avaliação; (2) sinal fraco e facilidade de
avaliação; (3) sinal fraco e difícil avaliação e (4) ausência de sinal.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para o conjunto de primers de melão (C. melo) otimizados até o
momento para melancia (C. lanatus), 77% mostraram-se promissores.
Esse valor de transferibilidade é maior que o encontrado por (Lama et
al., 2006) de aproximadamente 49% testando a transferibilidade de
primers entre essas mesmas espécies. Outros trabalhos estimaram a
transferibilidade
de
melão
para
outras
espécies
da
família
Curcubitaceae e obtiveram taxas de transferibilidade de 21, 50, 60%
respectivamente (LIRA et al., 2008; DANIN-POLEG et al., 2001;
LEITE et al., 2007).
Tais resultados demonstram que o nível de transferibilidade no gênero
Cucumis se assemelha a outras comparações intra-genus como em trigo
onde observou-se que até 17% de microssatélites desenvolvidos para
esta espécie foram transferidos para centeio (KULEUNG et al., 2003).
Nesta pesquisa, somente os scores 1 e 2 foram considerados como
amplificação positiva. Na análise realizada, aproximadamente 80% dos
primers testados produziram um perfil de bandas em pelo menos um
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dos genótipos de melancia. A grande maioria das bandas amplificadas
apresentaram um excelente padrão de amplificação. Somente as bandas
mais nítidas foram analisadas.
Figura 1 – Padrão eletroforético de
genótipos de melancia amplificadas com
SSR de C. melo em gel de agarose a
3%.
Os resultados deste trabalho facilitarão estudos de variabilidade,
mapeamento e genética comparativa. Da mesma forma, a possibilidade
de utilização de marcadores SSR de melão para acesso ao polimorfismo
de DNA em espécies de curcubitáceas representa uma redução
significativa de custo e tempo no desenvolvimento de marcadores.
CONCLUSÃO
Os resultados obtidos neste trabalho são promissores para estudos de
melhoramento genético de espécies da família das curcubitáceas.
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Todos os primers que foram transferíveis podem ser utilizados como
ferramentas para auxiliar programas de melhoramento.
REFERÊNCIAS
LEITE, T. L.; MARCO, A. F.; TARCHETTI, B. D.; FERREIRA, M. A. J. F.;
AMARAL, Z. P. S.; BUSO, G. S. C. Análise de transferibilidade de primers
microssatélites de Cucumis melo para Curcubita moschata e Luffa cylindrica. Brasília,
2007.
FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores
moleculares em análise genética. 3.Ed. Brasília: EMBRAPA/CENARGEN, 1998.
220p.
DOYLE, I.J.; DOYLE, J.L. Isolation of plant from fresh tissue. Focus, Rockville,
v.12, p.13-15, 1990.
KULEUNG, C. ; BAENZIGER, P. S. ; DWEIKAT, I. Transferability of SSR markers
among wheat, rye, and triticale. Theoretical Applied Genetics, v. 108, p. 1147-2004.
LAMAS,N.S. ;FERREIRA, M. A. ; AMARAL, Z. P. De S. ; VIEIRA, J .
V. ;FERREIRA, M. A. J. da F. ; BUSO, G. S. C. Detecção de polimorfismo em
melancia com primers microssatélites de melão. In : 47 CONGRESSO BRASILEIRO
DE OLERICULTURA, 2007, PORTO SEGURO. Revista da Associação Brasileira de
Horticultura. Brasília : Associação Brasileira de Horticultura, 2007. V. 25, p. 94-94.
OLIVEIRA, M. S. P., et al. Variabilidade genética entre acessos de açaizeiro
utilizando marcadores microssatélites. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v.34, p.
1253-1260, 2010.
LIRA, M. T. R. ; PEIXOTO, A. A. P. ; FERREIRA, M. A. ; FERREIRA, M. A. J. F. ;
LAMAS, N. S. ; AMARAL, Z. P. S. ; BUSO, G. S. C. ; 2008. transferibilidade,
otimização e caracterização de marcadores microssatélites de melão para bucha.
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