Texto Completo - Apresentação

CENTRO UNIVERSITÁRIO FRANCISCANO
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
ÁREA DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS
Curso de Mestrado em Nanociências
ADRIANNE DEL FABRO CECCIM
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA HspBP1 EM INFECÇÕES VIRAIS
Santa Maria, RS
2011
ADRIANNE DEL FABRO CECCIM
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA HspBP1 EM INFECÇÕES VIRAIS
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em
Nanociências, área de Ciências Tecnológicas, do
Centro Universitário Franciscano como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em
Nanociências.
Orientador: Prof. Dr. LUIZ CARLOS RODRIGUES JÚNIOR
Santa Maria, RS
2011
Ficha Catalográfica
C387a
Ceccim, Adrianne Del Fabro
Avaliação da expressão da proteína HspBP1 em infecções
virais / Adrianne Del Fabro Ceccim; orientação Luiz Carlos
Rodrigues Júnior. – Santa Maria: Centro Universitário Franciscano,
2011.
85 f. : il.
Dissertação (Mestrado em Nanociências) – Centro Universitário
Franciscano, 2011.
1. HspBP1. 2. HSV-1. 3. HIV. 4. Replicação viral. I. Rodrigues
Júnior, Luiz Carlos. II. Título.
CDU 578:62-181.4
Elaborada pela Bibliotecária Zeneida Mello Britto CRB10/1374
Dedico este trabalho,
ao meu esposo, Paulo,
uma pessoa extremamente visionária,
que me incentivou a realizar o mestrado em Nanociência;
aos meus filhos, Luiza e Barth,
inspirações da minha vida;
a minha mãe Belmira e minha irmã Lola
por todo o apoio durante este período.
AGRADECIMENTOS
A cada dia crescemos! Crescemos moralmente, intelectualmente; nossas ideologias se
aprimoram e nossos valores se intensificam. Isso tudo se solidifica em nossas caminhadas e, sem
dúvida, com o auxílio daqueles que se fazem presentes em muitos momentos de nossa trajetória.
Assim, primeiramente, meu agradecimento em especial a Dr. Ana Paula Duarte, da PUC- RS, pelo
empenho dedicado, tanto na parte de suporte técnico como na parte científica, essenciais para a
realização desse estudo.
Ao meu orientador, professor Dr. Luiz Rodrigues Junior, agradeço pela orientação,
oportunidade, mas principalmente pelos ensinamentos transmitidos durante o mestrado.
Ensinamentos esses que me fizeram ampliar conhecimentos e acreditar na concretização deste
trabalho; orientação para que eu sempre soubesse o rumo a seguir em minha pesquisa; e
oportunidade para que eu pudesse adquirir e desenvolver todo o saber necessário para alcançar os
objetivos traçados.
A Nélia Portugal, farmacêutica do setor de carga viral HUSM, o meu muito obrigada por ter
se mostrado sempre pronta a separar as amostras dos pacientes usadas nessa dissertação.
A professora Dr. Renata Rafin, obrigada pela disponibilidade e pelo grande auxílio na
estatística do trabalho.
Agradeço à colega do laboratório de Biologia Celular e Molecular, Gabriela M., pelo
carinho, amizade e força para chegar ao término desse trabalho; às colegas do mestrado, Dani,
Gabriela F. e Marcinha pelos ótimos momentos compartilhados; a Isabel, Camila, Thais e Rodrigo,
pela prestatividade e ajuda na parte experimental; à coordenação e professores do mestrado, em
especial à professora Dr. Solange Binoto Fagan, por ter mostrado a importância da Nanociência ao
farmacêutico.
Obrigada ao meu chefe no HUSM/ UFSM, Zanoni Segala, pela flexibilidade nos horários, o
que permitiu a realização desse mestrado.
Finalmente, um agradecimento a minha família, pelo carinho, apoio e incentivo constantes.
Obrigada por se fazerem presentes em mais essa conquista!
RESUMO
Milhares de pessoas morrem anualmente por infecções causadas por algum tipo de vírus, mesmo
que, nos últimos anos, se invista muito no desenvolvimento de tecnologias para aprimorar o
diagnóstico e prognóstico de viroses. Entretanto, ainda existe uma carência de métodos diagnósticos
mais sensíveis, de baixo custo, que contornem problemas como a janela imunológica, os limites de
detecção em determinadas fases da infecção, assim como a baixa quantidade de vírions. As Hsps 70
são chaperonas moleculares que se expressam em várias situações de estresse e ou calor,
constituindo um sistema genético altamente conservado, sendo altamente expressas em diversos
tipos de tumores e em certos tipos de viroses. Do mesmo modo, a sua co-chaperona, a proteína de
choque térmico 70 ligada à proteína 1 (HspBP1), está envolvida em processos tumorais, como no
câncer de pulmão e no neuroblastoma, e recentemente, foi identificada como um marcador de
prognóstico no câncer de mama. Embora existam estudos relacionando à expressão da HspBP1 no
câncer e o prognóstico deste, os estudos de sua expressão em infecções virais são raros. Em razão
dessa proteína poder ser utilizada como um indicador de alteração metabólica celular, e a infecção
viral induzir estresse celular, a alteração de sua expressão durante o ciclo viral pode predizer um
maior ou menor índice replicativo. Assim, essa propriedade pode ser utilizada como ferramenta no
diagnóstico viral. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo determinar o padrão de expressão
da proteína HspBP1 em células hospedeiras do vírus HSV-1 (células Vero) in vitro através da
técnica de Western-blotting, avaliando um provável aumento ou diminuição da sua expressão. Além
disso, quantificar a proteína HspBP1 e os anticorpos IgG anti-HspBP1 no soro de indivíduos HIV
positivos através da técnica de ELISA. Os resultados demonstraram que após a infecção viral não
houve diferença no padrão de expressão de proteína total, quando analisados por SDS-PAGE. No
entanto, pela técnica de Western-Blotting, a expressão de HspBP1 apresentou aumento nas 48
horas após a infecção em comparação com células Vero não infectadas. Setenta e duas horas após a
infecção, a expressão diminuiu. Os resultados da pesquisa da proteína HspBP1 pelo teste ELISA
mostraram que houve um aumento significativo dessa proteína no grupo dos indivíduos infectados
pelo HIV apresentando carga viral alta e contagem de linfócitos T CD4+ baixos quando comparado
com os grupos dos infectados pelo HIV com carga viral indetectável e com os não infectados. Em
relação a pesquisa de anticorpos IgG anti-HspBP1 os resultados mostraram que houve um aumento
da proteína em indivíduos infectados pelo HIV. Assim, esses resultados sugerem que a expressão
HspBP1 está aumentada em indivíduos infectados pelo HIV, seguidos por um aumento na produção
de anticorpos contra a HspBP1 e redução dos linfóctios T CD4+ para uma carga viral elevada.
Palavras-chave: HspBP1. HSV-1. HIV. Replicação viral.
ABSTRACT
Thousands of people die annually due to infections caused by some kind of virus, despite the large
investment on development of technologies that improve the diagnostics and prognostics of virus
diseases. However, there is a lack of methods for diagnosis that are more accurate, low cost and that
handle problems such as the immunologic window, the bounds of different infection phases, as well
as the low amount of virions. The Hsps 70 are molecular chaperones that are expressed in various
situations of stress or heat, forming a highly preserved immunologic system. They are highly
expressed in different kind of tumors and in some in almost all viral infections. In the same way, its
co-chaperona, the heat chock protein 70 linked to protein 1 (HspBP1) is involved in tumors
processes, such as the lung cancer and the neuroblastoma. Recently, it was identified as a marker
for the prognostic of breast cancer. Despite having studies related to the expression of HspBP1 on
cancers and on its prognostics, the studies of its expression in viral infections are rare. Due to the
fact that this protein can be used as an indicator of cellular metabolic alteration and that the viral
infection will induce the cellular stress, the modification of its expression during the viral cycle can
predict a higher or lower replicative index. This property can be used as a tool in the viral
diagnostic. The mainly objective of this study was to determine the pattern of expression of protein
HspBP1 in cells that hosts HSV-1 (vero cells) in vitro using the Western-blotting and determine
increasing or reduction on its expression. In addition, the levels of HspBP1 and antibodies agains
HspBP1 in the serum of HIV infected people were analized by ELISA. The results in vitro showed
that after the viral infection there was no different in the pattern of expression of the total protein,
when analyzed by SDS-PAGE. However, using the Western-Blotting the expression of HspBP1
increased in the 48 hours after the infection, comparing with non-infected Vero cells. Seventy-two
hours after infection the expression decreased. The results of HspBP1 protein by ELISA showed a
significant increasing of this protein in the HIV infected group that also presented a high viral load
and low number of T CD4+ lymphocytes, when compared with the groups with an undetected load
of HIV infected and uninfected. Regarding the research of anti-HspBP1 the results showed an
increase in serum protein from HIV infected people. In conclusion these results suggest that the
expression of HspBP1 is increased in HIV infected people and it is followed by an increasing in
antibody production against HspBP1 and decreasing in T CD4+ lymphocytes for high viral load.
Keywords: HspBP1. HSV-1. HIV. Viral replication.
LISTA DE ABREVIATURAS
ADP – Adenosina Difosfato
ANOVA – Análise de variança (Analysis of Variance)
ATP – Adenosina Trifosfato
ATTC – American Type Culture Collection
BSA – Albumina de Soro Bovino
CCR5 – co-receptor para HIV-1
CXCR4 – co-receptor para HIV-1
CDC – Centers for Disease Control and Prevention
CN – Controle negativo
CTL – Linfócito T Citotóxico
DMEM – Dulbecco’s modified Eagle’s medium
DMSO – Dimetil Sulfóxido
DNA – Ácido Desoxirribonucléico
DO – Densidade Óptica
DP – Desvio padrão
DPR – Desvio padrão Relativo
ELISA – Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
EPM – Erro Padrão da Média
gB – Glicoproteína B
gC – Glicoproteína C
gD – Glicoproteína D
gH – Glicoproteína H
gL – Glicoproteína L
HBsAg – Antígeno de Superfície da Hepatite B
HBV – Vírus da Hepatite B
HCV – Vírus da Hepatite C
HEVEM – Mediador da Entrada de Herpes vírus
HIV – Vírus da Imunodeficiência Adquirida
HPV – Papiloma Vírus Humano
HS – Sulfato de Heparano
Hsc70 – Heat Schok Cognate Protein70
HSE – Elementos de Choque Térmico
Hsps – Proteína de Choque Térmico (Heat Schok Proteins)
Hsp100 – Proteína de Choque Térmico de 100 KDa
Hsp90 – Proteína de Choque Térmico de 90 KDa
Hsp70 – Proteína de Choque Térmico de 70 KDa
Hsp60 – Proteína de Choque Térmico de 60 KDa
Hsp40 – Proteína de Choque Térmico de 40 KDa
sHsp – Pequena Proteína de Choque Térmico (Small Heat Schock Proteins)
HspBP1 – Hsp70 ligada a proteína 1 (Hsp70 binding protein 1)
HSF – Fator de Transcrição de Choque Térmico (Heat Schock Transcription factors)
HSF1 – Fator 1 de Transcrição de Choque Térmico
HSV – Herpes simplex virus
HSV-1 – Herpes simplex virus 1
HSV-2 – Herpes simplex virus 2
HTLV – Vírus Linfotrópico Humano
ICTV – International Committee on the Taxonomy of viruses
IFN – Interferon
IgG – Imunoglobulina G
IgA – Imunoglobulina A
IL – Interleucina
IL2 – Interleucina 2
LTR – Repetições Terminais Longas
MHC – Complexo de Principal de Histocompatibilidade
MTT – Teste de Viabilidade Celular
NEF – Fator de Troca de Nucleotídeo
KOS – Linhagem de HSV
NIAID – The National Institute of Allergy and Infectious Diseases
NTCs – Nanotubos de Carbono
NK – Célula Natural Killer
OMS – Organização Mundial da Saúde
PAGE –Eletroforese em Gel de Policrilamida
PBS – Solução Salina Tamponada com Fosfato (Phosphate- Buffered Saline)
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
PFU – Unidade Formadora de Placa (Plaque Forming Unit)
pH – Potencial Hidrogeniônico
RNA – Ácido Ribonucléico
RPM – Rotações por Minuto
SDS – Dodecil Sulfato de Sódio
SFB – Soro Fetal Bovino
SIDA – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
TCID – Dose de Infecção em Cultura de Tecidos (Tissue Culture Infections Dose)
TMB – 3’,3’,5,5’,-Tetrametilbenzidina
TNFα – Fator de Necrose Tumoral alfa
WHO – World Health Organization
LISTA DE SÍMBOLOS
kDa – quilo Dalton
keV – quilo elétron-volts
mM – milimolar
mM/mL – milimolar por mililitro
ng/mL – nanograma por mililitro
nm – nanômetro
v/v – relação volume/ volume
µg/mL – micrograma por mililitro
λ – comprimento de onda
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Ilustração da interdisciplinaridade das diversas áreas envolvidas na
nanociência ...................................................................................................
18
Figura 2 – Estrutura e funcionamento da Hsp70 ............................................................
24
Figura 3 – Função da HspBP1 ........................................................................................
27
Figura 4 – Estrutura de uma partícula viral (vírion) .......................................................
28
Figura 5 – Replicação de um vírus DNA em uma célula eucariótica ............................. 29
Figura 6 – Estrutura, ligação e entrada do vírus HSV-1 na célula .................................
32
Figura 7 – Organização do genoma HIV proviral e suas proteínas ................................
35
Figura 8 – Fotomicrografia das células Vero não infectadas .........................................
48
Figura 9 – Fotomicrocrafia da células Vero infectadas nas 12, 24, 48 e 72 horas (A-D) 49
Figura 10 – Representação gráfica da curva padrão da BSA ...........................................
51
Figura 11 – Perfil Eletroforético das proteínas ................................................................. 53
Figura 12 – Western-Blotting de células Vero não infectadas e de células Vero
infectadas com HSV-1 KOS .......................................................................
54
Figura 13 – Western-Blotting de células Vero infectadas em 96 horas ...........................
55
Figura 14 – Curva padrão de HspBP1 ..............................................................................
59
Figura 15 – Relação entre os níveis de HspBP1 e a carga viral ......................................
61
Figura 16 – Relação entre os níveis de HspBP1 e a contagem de linfócitos TCD4+......
65
Figura 17 – Relação entre os níveis de HspBP1 e a contagem de linfócitos TCD8+......
66
Figura 18 – Correlação entre os níveis da HspBP1 e os anticorpos Anti-HspBP1 ..........
69
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Família Hsp70 .................................................................................................. 23
Tabela 2 – Tabela representativa da curva padrão de BSA ..............................................
43
Tabela 3 – Concentrações referente à curva padrão de BSA ............................................. 51
Tabela 4 – Quantificação das proteína totais .....................................................................
52
Tabela 5 – Perfil das amostras HIV+ com carga viral alta ................................................
57
Tabela 6 – Perfil das amostras HIV+ com carga viral indetectável ................................... 58
Tabela 7 – Detecção da proteína HspBP1 em amostras HIV + e HIV- ............................ 60
Tabela 8 – Variação da HspBP1 nos diferentes grupos estudados ...................................
61
Tabela 9 – Relação entre os níveis da HspBP1 e a contagem de linfócitos T CD4+ em
indivíduos HIV+...............................................................................................
64
Tabela 10 – Relação entre os níveis da HspBP1 e a contagem de linfócitos T CD8+ em
indivíduos HIV+.............................................................................................
65
Tabela 11 – Pesquisa dos anticorpos Anti-HspBP1 em amostras HIV+ e HIV - ..............
67
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 17
2 REFERENCIAL TEÓRICO ......................................................................................
21
2.1 AS PROTEÍNAS CHAPERONAS: CARACTERÍSTICAS GERAIS ........................ 21
2.1.1 Hsps ..........................................................................................................................
22
2.1.1.1 Hsp70 .....................................................................................................................
23
2.2 CO-CHAPERONAS ....................................................................................................
25
2.2.1 HspBP1 .....................................................................................................................
26
2.3 OS VÍRUS: ESTRUTURA E BIOLOGIA ..................................................................
28
2.3.1 Herpes Simplex Vírus ...............................................................................................
30
2.3.1.1 Estrutura e Biologia do HSV-1 ..............................................................................
30
2.3.2 Vírus da Imunodeficiência Humana - HIV................................................................ 33
2.3.2.1 O Genoma do HIV-1 .............................................................................................. 33
2.3.2.2 O Ciclo Viral .......................................................................................................... 36
2.3.2.3 Resposta Imunológica na Infecção ........................................................................
36
2.3.2.4 Diagnóstico ............................................................................................................
37
2.3.2.5 Chaperonas e HIV .................................................................................................. 38
3 METODOLOGIA ........................................................................................................
41
3.1 VÍRUS E CÉLULAS ...................................................................................................
41
3.2 CULTIVO DAS CÉLULAS ........................................................................................
41
3.3 EXTRATO DE CÉLULAS VERO .............................................................................. 41
3.4 PROPAGAÇÃO DO VÍRUS ....................................................................................... 41
3.5 QUANTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS ..................................................................... 42
3.6 ELETROFORESE DAS PROTEÍNAS .......................................................................
43
3.7 WESTERN- BLOTTING ............................................................................................
43
3.8 SORO DOS INDIVÍDUOS ........................................................................................
44
3.9 ELISA ..........................................................................................................................
45
3.10 TRATAMENTO ESTATÍSTICO DOS DADOS ...................................................... 46
3.11 ASPÉCTOS ÉTICOS ................................................................................................
46
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES .............................................................................. 48
4.1 ANÁLISE IN VITRO DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA HspBP1 .........................
48
4.1.1 Propagação Viral ....................................................................................................... 48
4.1.2 Quantificação das proteínas ......................................................................................
50
4.1.3 Eletroforese ...............................................................................................................
52
4.1.4 Western-Blotting ....................................................................................................... 53
4.2 ANÁLISE IN VIVO DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA HspBP1 .........................
56
4.2.1 Perfil das amostras analisadas ................................................................................... 56
4.2.2 Detecção da proteína HspBP1 nas amostras ............................................................. 59
4.2.3 Pesquisa dos anticorpos IgG Anti-HspBP1 nas amostras ........................................
66
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................................................
71
REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 73
ANEXO I .........................................................................................................................
83
ANEXO II ........................................................................................................................
84
INTRODUÇÃO
1 INTRODUÇÃO
Em todo o mundo, milhares de pessoas são portadoras de algum tipo de vírus, e alguns
desses são mais patogênicos do que os outros. Os vírus da família herpesvirinea estão entre os mais
disseminados na natureza, isso é justificado pela facilidade de transmissão que independe de sexo e
idade (MACKIE, 2003). Esses vírus, ao penetrarem na célula hospedeira, causam um desequilíbrio
no metabolismo celular, o que leva à ruptura da célula hospedeira e, consequentemente, à expressão
de uma grande variedade de proteínas.
As proteínas de choque térmico ou de estresse (Hsps) são um grupo de proteínas mais
abundantemente expressas (LIBEREK; LEWANDOWSKA; ZIETKIEWICZ, 2008). Entre elas, os
membros da família das Hsp70 são os mais estudados (NOLLEN; MORIMOTTO, 2002). Tais
estudos têm mostrado que a Hsp70 tem expressão aumentada em vários tumores
(TORRONTEGUY et al., 2006), o que se relaciona também com a sua co-chaperona, a Hsp70
ligada à proteína 1 (HspBP1) (SOUZA et al., 2008). Existem outros estudos que apresentam a
maquinaria das chaperonas com papel importante no ciclo de vida de diferentes viroses mediadas
por RNA e DNA (SANTORO, 1994). No entanto, poucos estudos indicam que anticorpos antiHspBP1 estão aumentados no soro de pacientes HIV positivos, o que pode ser indicativo de que
essa proteína pode ser utilizada como marcador nos testes de detecção e prognóstico da infecção
(PAPP et al., 2005).
Existe uma dificuldade em firmar um diagnóstico nas infecções virais, pela inespecificidade
dos sintomas e pelas limitações dos ensaios laboratoriais. Por exemplo, a janela imunológica é um
período no qual não são detectados anticorpos pelos ensaios, isso continua sendo um grande
problema tanto para o diagnóstico quanto para as transfusões de sangue, ocasionando resultados
falsos negativos (MENDELSON et al., 2006).
Além disso, um outro problema é quando o vírus entra em processo de latência, como no
Herpes, no qual ele pára de produzir ou reduz a um nível mínimo a expressão de suas proteínas
(BLOOM; GIORDANI; KWIATKOWSKI, 2010). Esse vírus também faz o processo de reativação,
que muitas vezes é assintomática e os sintomas clínicos não são observados durante o diagnóstico
clínico. Nessas situações, em que os métodos convencionais são falhos, as técnicas moleculares são
extremamente úteis, principalmente para pacientes transplantados e em suspeita de encefalite
herpética, em que o resultado rápido e sensível é vital.
17
A diversidade genética dos vírus também pode afetar o diagnóstico e monitoramento das
infecções, como por exemplo no HIV, pela falta de detecção nos ensaios sorológicos e em ensaios
de ácido nucléico de algum variante, ou seja, de algum subtipo do vírus. Assim como na hepatite B,
a pesquisa do antígeno da hepatite B (AgHBs) pode apresentar resultados falso-negativos, isso pelo
fato de não conseguir detectar mutações nos HBsAg (CDC, 2005).
Nos últimos anos, tem-se investido muito no desenvolvimento de tecnologias para
diagnóstico e prognóstico de viroses (MEDELSON et al., 2006). Essas pesquisas são baseadas na
detecção do vírus, pesquisa de antígenos, anticorpos, e de ácidos nucléicos virais em amostras
diretas de pacientes (SANTOS; ROMANOS; WIGG, 2002). Entretanto, ainda existe uma carência
de métodos diagnósticos mais sensíveis que contornem problemas como janela imunológica, limite
de detecção em determinadas fases da infecção, assim como a baixa quantidade de vírions. Com a
multidisciplinariedade da nanociência (figura 1) é possível criar alternativas para minimizar as
falhas dos testes de diagnósticos utilizados atualmente. Uma dessas alternativas é a utilização de
nanotubos de carbono (NTCs) conjugados a proteínas para melhorar a sensibilidade e especificidade
em ensaios imunoenzimáticos, uma vez que essa interação altera as propriedades físico-químicas
melhorando a afinidade antígeno-anticorpo (PANTAROTTO et al., 2003).
Figura 1. Ilustração da interdisciplinaridade das diversas áreas envolvidas na nanociência.
18
Estudos iniciais de caracterização de proteínas com potencial para conjugação com NTCs
são extremamente relevantes. A HspBP1 surge como uma alternativa para aplicação nesses estudos,
pois a alteração do padrão dessa proteína pode ser relacionada com a replicação viral. Em razão
disso, essa proteína poder ser utilizada como um indicador de alteração metabólica na célula, e os
vírus, por serem partículas intracelulares, a alteração de sua expressão na infecção pode predizer um
maior ou menor índice de replicação viral. Existem também vários estudos relacionando à
expressão de HspBP1 no câncer e o prognóstico deste. Por outro lado, os estudos de sua expressão
em infecções virais são inexistentes, embora não seja encontrado estudos da expressão in vitro da
expressão desta proteína, Papp e colaboradores (2005) mostrou através de sua pesquisa os níveis de
anticorpos anti-HspBP1 estão aumentados em pacientes HIV positivos.
Sendo assim, esse trabalho teve como objetivo determinar se ocorre aumento ou diminuição
da expressão in vitro da proteína HspBP1 em células de linhagem Vero infectadas com HSV-1 em
diferentes tempos da infecção pela técnica de Western-Blotting. Além disso, a detecção da proteína
HspBP1 e a pesquisa de anticorpos anti-HspBP1 em soro de pacientes HIV positivos pela técnica
ELISA.
19
REFERENCIAL TEÓRICO
20
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 AS PROTEÍNAS CHAPERONAS: CARACTERÍSTICAS GERAIS
As chaperonas moleculares são proteínas constituídas por uma sequência de aminoácidos
que determinam sua forma e sua estrutura tridimensional (ALBERTS et al., 2005). O termo
chaperona significa assistente molecular, isto quer dizer que assistem o dobramento de proteínas em
processo de síntese ou renaturação. Embora a estrutura nativa de uma proteína seja codificada em
uma sequência de aminoácidos, o processo de dobramento in vivo requer a assistência de
chaperonas moleculares associado à hidrólise de ATP (LIBEREK; LEWANDOWSKA;
ZIETKIEWICZ, 2008).
Uma proteína recém sintetizada só se torna funcionalmente ativa após adquirir a sua
estrutura tridimensional, condição para que exerça a sua atividade biológica na célula. O processo
pelo qual uma proteína recém sintetizada obtém sua estrutura terciária ou tridimensional é
denominado de enovelamento. As chaperonas interagem com polipeptídeos parcialmente ou
inadequadamente enovelados, facilitando, assim, as vias corretas de enovelamento ou fornecendo
microambientes para que ocorra o correto dobramento (THULASIRAMAN; YANG; FRYDMAN,
1999; FRYDMAN, 2001).
Além do papel nesse processo de enovelamento protéico, as chaperonas têm função na
proteção contra o enrolamento incorreto e agregação. A agregação se torna um problema para
aquelas cadeias polipeptídicas que ainda não conseguiram adquirir sua estrutura nativa, podendo
ocorrer agregações com outras cadeias nascentes ou macromoléculas no citosol, formando um
aglomeramento molecular, que podem remover proteínas de suas vias de enrolamento (BUKAU;
HOORWICH, 1998). Normalmente, os polipeptídeos apresentam porções hidrofóbicos de seus
aminoácidos protegidos no interior da molécula, enquanto seus componentes hidrofílicos estão
expostos, possibilitam a solubilidade em meio aquoso o que impede a agregação (MEYER; SILVA,
1999). Quando ocorre, em resposta a qualquer condição de estresse, as chaperonas moleculares
controlam e neutralizam esse processo através de solubilização dos agregados e, se necessário,
encaminham para a proteólise (BUKAU et al., 2000).
21
As chaperonas também assistem outros processos importantes nas células, permitindo que:
os polipeptídeos fiquem na sua conformação desdobrada ou parcialmente desdobrada para que
possa ocorrer a passagem do citoplasma para as organelas; auxiliem na estabilização de fatores de
transcrição e no controle de qualidade de proteínas, reconhecendo proteínas mal enroladas
mediando o seu re-enrolamento; e, por outro lado, encaminhem essas proteínas para a degradação
(FRIDMAM, 2001).
Existem diversas famílias de chaperonas moleculares, as quais são classificadas de acordo
com a sua localização e mecanismo de funcionamento. Entretanto, neste trabalho, enfocar-se-á a
família das proteínas de choque térmico (Hsps), que são as proteínas mais abundantemente
expressas e de grande relevância na área biológica (LIBEREK; LEWANDOWSKA;
ZIETKIEWICZ, 2008).
2.1.1
Hsps
As Hsps, do inglês Heat Shock Proteins, são chaperonas moleculares induzidas
principalmente em resposta ao choque de calor ou ao estresse celular. Essa resposta constitui um
sistema genético conservado evolutivamente, ocorrendo tanto em células procarióticas como em
células eucarióticas (NOLLEN; MORIMOTTO, 2002). Em condições normais de crescimento, as
Hsps são constitutivamente expressas e estabilizam as formas não estáveis de proteínas à sua
conformação nativa, consequentemente, auxiliam na manutenção da homeostase celular
(HENDRICK; HARTL, 1993).
As Hsps de mamíferos foram classificadas principalmente em cinco grandes famílias, de
acordo com a sua massa molecular: Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60 e as pequenas proteínas de
choque térmico (sHsp). Dentro dessas famílias, a Hsp70 é a mais conservada, estruturalmente, no
homem, é 72% homóloga às Hsps70 das drosófilas e também a mais estudada entre elas, devido ao
provável papel homeostático desenvolvido por essas proteínas (WYNN et al., 1994). Normalmente
são encontradas no citosol, retículo endoplasmático e na mitocondria das células (JOLLY;
MORIMOTTO, 2000).
Com relação à resposta ao estresse celular, sabe-se do efeito protetor das Hsps nas células e
nos tecidos em processos inflamatórios, nos quais acontece a prevenção da quebra de cadeias de
DNA e de outras proteínas induzidas por metabólicos de oxigênios reativos. Além disso, ocorre o
envolvimento das Hsps no câncer, como na estabilização do mRNA de proto-oncogenes e interação
22
com proteína p53 mutante (MEYER; SILVA, 1999); como prováveis marcadores de
imunogenicidade e com propriedades imunogênicas para aplicação no desenvolvimento de vacinas
(CLARK;
MENORET,
2001)
e
também
como
marcadores
de
metástase
tumoral
(TORRONTEGUY et al., 2006).
2.1.1.1 Hsp70
A família Hsp70 (70 kDa) foi descoberta a partir da exposição de células glandulares
salivares de Drosophila buschi ao calor, nessa situação ocorreu um significativo aumento da
expressão dessas proteínas (RITOSSA, 1963). A família das Hsp70 é constituída de sete membros,
conforme suas funções específicas na célula (Tabela 1). A Hsp70 é uma chaperona molecular que
depende de ATP para o seu funcionamento nas células, está envolvida no auxilio ao dobramento de
cadeias polipeptídicas nascentes, na montagem de complexos multiprotêicos e no transporte das
proteínas através das membranas celulares (BUKAU et al., 2000; FRIDMAM, 2001).
Tabela 1. Família Hsp70 (adapatado de DAUGAARD; JAATELA, 2005).
Proteína
Sinônimo
Localização Celular
Hsp70
Hsp70-1(A), Hsp72, Hsp70i
Citosol, núcleo, membranas
Hsc70
Hsp73
Citosol, núcleo, lisossomas
Bip
Grp78
Retículo endoplasmático
MtHsp70
Grp75
Mitocôndria
Hsp70-6
Hsp70B
Citosol, núcleo
Hsp70t
Hsp70-Hom
Citosol
Hsp70-2
HSPA2
Citosol, núcleo
A expressão da Hsp70 é regulada por fatores de transcrição de choque térmico (HSFs), no
qual o HSF1 é essencial para a transcrição desses genes em células mamíferas. Na situação de
choque térmico, o HSF1 é fosforilado pela proteína kinase CK2 e translocado para o núcleo,
23
ligando-se a elementos de choque térmico (HSEs), iniciando a transcrição do gene Hsp (SONCIN
et al., 2003).
Do ponto de vista estrutural, as Hsps70 possuem duas estruturas dominantes: um domínio C
(carboxil) terminal de 18 KDa que contem o sítio de ligação ao substrato, esta porção reconhece
segmentos hidrofóbicos de proteínas não nativas; e um domínio N (amino) terminal de 44 KDa que
possui atividade ATPásica que controla a abertura e fechamento do domínio C- terminal (Figura 2)
(ZHU et al., 1996).
A)
Domínio N- terminal
ATPásica
Domínio C-terminal
ligação ao peptídeo
B)
Ribossoma
mRNA
proteína recém
Hsp70
formada
Hsp40
chaperoninas
Proteína liberada
para sua função nas
células
Figura 2. Estrutura e funcionamento da Hsp70. A) A Hsp70 é constituída por um domínio N (amino) terminal,
ATPase dependente e um domínio C (carboxil) terminal, com função de ligação ao peptídeo. B) A Hsp70 liga-se com
ajuda da co-chaperona Hsp40 ao peptídeo recém formado e estabiliza seus dobramentos até que a proteína esteja pronta.
Fontes: Adaptado de BUKAU; HORWICH, 1998 e <www.palaeos.com/.../EuGlossary/Images/Hsp70.gif.>.
24
Os membros da família Hsp70 promovem o processo de enrolamento de segmentos
hidrofílicos expostos pelas proteínas nos seus estados não nativos, através de ciclos de ligaçãolibertação do substrato. Estes ciclos são realizados por uma ATPase e favorecem o dobramento
dessas proteínas não nativas, sendo que a forma da proteína ligada a ATP tem baixa afinidade pelo
substrato e a forma que está ligada a ADP tem maior afinidade ao substrato.
A troca de ADP para ATP resulta no desligamento do peptídeo, esse processo é também
regulado pelas proteínas acessórias, conhecidas como co-chaperones. As co-chaperones inibem ou
regulam a atividade das proteínas chaperonas “oficiais” (LEHNINGER et al., 2006). Essas cochaperonas promovem o direcionamento das chaperonas para os seus substratos, como também
determinam o tempo de vida do complexo Hsp70-substrato (BUKAU et al., 1998).
Níveis elevados de Hsp70 têm sido reportados em certos tipos de tumores, incluindo mama
(CIOCCA et al, 1993; TORRONTEGUI, 2006), pulmão (VOLM; MATTERN; STAMMLER,
1995), cervical (RALHAN; KAUR, 1995), próstata e renal (JAATTELA, 1999; JOLLY;
MORIMOTO, 2000), como também em leucemias (SEDLACKOVA et al., 2010). Estudos
anteriores indicam dois efeitos exercidos pela Hsp70 na tumorogênese, um de promoção do
crescimento e da sobrevivência de células tumorais, e outro de estímulo da imunidade antitumoral,
ativando o sistema imune contra o tumor (BASU et al, 2001).
A sobrevivência da célula tumoral está relacionada com a manutenção da conformação de
proteínas próprias da célula tumoral e também com a indução da resistência à apoptose (CIOCCA et
al.,1993). Além disso, pela indução da imunidade através da estimulação de macrófagos e células
dendríticas a secretar citocinas como fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) (BASU, 2000).
2.2 CO- CHAPERONAS
Conforme estudo de Frydman e Hohfeld (1997), existem várias proteínas que atuam como
co-chaperonas e regulam a atividade da Hsp70, sendo mais complexo do que o inicialmente
descrito. Entre elas: a Hsp40 estimula a atividade da hidrólise de ATP e resulta na produção da
forma ADP na Hsp70 facilitando a ligação com o substrato, possuem também atividade de
chaperona intrínseca (FAN; LEE; CYR, 2003). A Hip previne a dissociação do ADP da Hsp70 e
por isso estabiliza a ligação do substrato (HOHFELD; MINAMI, 1995); a Hop é uma proteína
organizadora das Hsp70 e Hsp90 (JONHSON et al.,1998). Outras proteínas regulatórias, como a
BAG-1, que inibem a ligação de proteínas mal dobradas da Hsp70, catalisam a liberação do ADP da
25
Hsp70, a re-ligação do ATP e consequentemente a liberação do substrato peptídeo (ZEINER;
GEBAUER; GEHRING, 1997). Além dessas, a Hsp70 ligada à proteína 1 (HspBP1) é uma outra
co-chaperona que inibe e regula a atividade ATPase da Hsp70.
2.2.1 HspBP1
A HspBP1 é uma proteína isolada a partir de uma biblioteca cDNA de coração humano no
estudo de Raynes e Guerriero (1998). Através deste estudo, pela análise de Northen-blots de
RNAm, demonstraram que a HspBP1 está presente no citoplasma, sendo abundante no coração e
músculo esquelético. A HspBP1 ao interagir com a Hsp70 inibe e regula a sua atividade ATPásica e
de redobramento. Desta forma, podendo inibir a Hsp70 em altas concentrações. A função da
HspBP1 está esquematizada na Figura 3.
Segundo Kabani e colaboradores (2002), a HspBP1 é um fator de troca de nucleotídeo
(NEF) que atua inibindo ou estimulando a Hsp70, como a sua homóloga, a levedura citoplasmática
Fes1, na qual promove a dissociação da Ssa1p e da Hsc70, também homólogas da Hsp70 em
eucarióticos. Da mesma forma, McLellan e colaboradores (2003) também sugerem que a HspBP1 é
capaz de alterar a conformação do domínio ATPase Hsp70. Segundo esses autores, a HspBP1
apresenta dois domínios estruturais, o domíno I (1-83 aminoácidos) e
o domínio II (84-359
aminoácidos). Apenas o domínio II está envolvido na mudança da conformação ATPase Hsp70,
consequentemente inibindo o dobramento da proteína associada a Hsp70, bem como a inibição da
renaturação da luciferase.
Baseado em outro experimento in vitro da inibição do redobramento da luciferase pela
HspBP1 por Raynes e colaboradores (2003), a proporção molar para inibir 50% da Hsp70 pela
HspBP1 é de aproximadamente 1 para 4. Além desses dados, esses autores, através de uma análise
in vivo, verificaram que a expressão da HspBP1 está aumentada em células tumorais murinas, com
também já foi mostrada nas Hsps70.
26
Figura 3. Função da HspBP1. A HspBP1 é uma co-chaperona que possui atividade de troca de nucleotideo (NEF). A
ligação e liberação do substrato protéico são moduladas pela afinidade intrínseca do peptídeo com a Hsp70 pela
hidrólise do ATP. Este mecanismo é regulado pela HspPB1, ocorre uma interação da HspBP1 com a Hsp70 e regulam a
atividade ATPásica da Hsp40. O peptídeo ligado é liberado após dissociação do ADP e re-ligação do ATP.
Outros autores também reportam o papel da HspBP1 em tumores, como no estudo de Souza
colaboradores (2008), no qual foi avaliado a expressão de HspBP1 em amostras de tumores de
pacientes com câncer de mama, comparando o tecido tumoral com o normal presente na região
adjacente. Nesse estudo, foi observado que expressão de HspBP1 está elevada em amostra de
tumores de pacientes com câncer de mama, comparando com o tecido normal adjacente. Além
disso, verificaram que níveis reduzidos de HspBP1 nestes tumores está relacionado com pior
prognóstico da doença, pois foi realizado um acompanhamento de sete anos para cada paciente
(SOUZA a, et al., 2008).
Um outro estudo do mesmo autor avaliou o potencial antitumoral da proteína HspBP1 em
modelo de melanoma murino, e a influência da superexpressão no crescimento tumoral e resposta
imune. Os resultados indicaram que houve um aumento da expressão de HspBP1 em melanoma
murino e uma regressão do crescimento tumoral in vivo. Deste modo, concluíram que a HspBP1
pode ser um alvo promissor para uma nova terapia antitumoral (SOUZA b, 2008).
Considerando que células tumorais passaram por um processo de transformação genética, e
que resulta em diferentes padrões de expressão protéica, é possível que infecções virais, que
também podem ocasionar transformações genéticas, levem a alteração de proteínas. Assim, a
expressão da HspBP1 também pode ser influenciada pelo processo de replicação viral.
27
2.3 OS VÍRUS: ESTRUTURA E BIOLOGIA
Os vírus são definidos pelo The National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID)
como: organismos subcelulares causadores de uma infecção viral, constituídos de uma ou mais
moléculas de DNA ou RNA, contendo no seu interior a informação genética, rodeados de uma
proteína que constitui o seu capsídeo e, em casos de vírus envolto, possuem uma proteína lipídica
externa, o invólucro (NIAID, 2001). Uma representação da estrutura geral do vírus pode ser
observada na Figura 4.
As estratégias de fabricação das proteínas virais e de replicação mudam segundo a natureza
do ácido nucléico (DNA e RNA, simples ou dupla hélice) e o mecanismo de síntese do RNAm.
Segundo David Baltimore, os vírus podem ser classificados em: CLASSE I: DNA de fita dupla (ex:
Herpesvirus); CLASSE II: DNA de fita simples (ex: Parvovirus); CLASSE III: RNA de fita dupla.
(ex: Reovirus); CLASSE IV: RNA fita simples (ex: Picornavirus); CLASSE V: RNA fita simples
negativo (ex: Ortomixovirus); CLASSE VI: RNA simples com intermediário DNA (ex: Retrovirus);
e CLASSE VII: DNA duplo com intermediário RNA (ex: Hepadnavirus) (FLINT, 2004).
Glicoproteína
Envelope
Tegumento
Capsídeo
DNA
Figura 4. Estrutura de uma partícula viral (vírion). A partícula viral é constituída por um material genético que pode
ser DNA ou RNA; um capsídeo que envolve esse DNA; o tegumento onde se encontram as proteínas do vírus; e, em
alguns casos, o envelope com glicoproteínas. Fonte: <www.healthcare.uiowa.edu/.../images/VIRION.GIF>.
Os vírus apresentam um ciclo de reprodução exclusivamente intracelular sem nenhum
metabolismo fora da célula, embora eles possuam a informação genética em seu DNA ou RNA, não
possuem uma maquinaria sintética para o processamento da informação em novo material viral.
Então, o vírus só é capaz de se replicar após a infecção de uma célula hospedeira, no qual a utiliza
28
para a amplificação de seu material genético e progêne (SANTOS; ROMANOS; WIGG, 2002).
Para a entrada do vírus nas células, é necessário que o vírus interaja com um receptor de
superfície da membrana celular, e assim penetre na célula hospedeira liberando o genoma viral para
o citoplasma celular. Após a penetração, dependendo do tipo de vírus, começa na célula a
transcrição do DNA ou do RNA viral; geralmente a replicação de um vírus DNA ocorre no núcleo e
de um vírus RNA no citoplasma. Ambos serão traduzidos no citoplasma, utilizando os ribossomas
das células hospedeira para a síntese de proteínas virais a partir das informações contidas nos ácidos
nucléico dos vírus. Essas partículas virais, chamadas de vírions, se reúnem para formar novas
partículas virais que irão infectar outras células sadias (MIMS et al., 1995), conforme mostra a
Figura 5. A reprodução viral é muitas vezes letal para a célula hospedeira, pois leva a lise celular,
dessa maneira, libera a progêne do vírus, permitindo o acesso às células vizinhas, ocasionando a
quebra da homeostasia celular (DRAKESMITH; PRENTICE, 2008).
1 O vírus se fixa
na célula e
interage com
os receptores
da membrana
celular
6. As novas partículas
virais escapam para
infectar outra células.
2. O vírus é
internalizado
5. As proteínas virais
e DNA viral se
recombinam
e formam novas
partículas virais.
3 Libera
o material
genético
4. Enzimas das células
transcrevem o DNA viral em
RNA e também copiam viral
o DNA viral. Os ribossomas
fazem a síntese protéica.
Figura 5. Replicação de um vírus DNA em uma célula eucariótica. A replicação influencia a expressão de proteínas
da célula. O vírus se fixa na célula. Libera o material genético e no núcleo ocorre a transcrição do DNA viral em RNA e
a cópia do DNA viral. Após, as proteínas virais e o DNA se recombinam formando novas proteínas que irão contaminar
novas células. Fonte: Adaptado da revista SCIENTIFIC AMERICAN, n28.
29
2.3.1 Herpes Simplex Virus
Entre as infecções virais, o Herpes Simplex virus (HSV) é o mais disseminado entre a
população humana, pertence à família Herpesviridae, subfamília Alpha-herpesvirinea, gênero
Simplexvirus (MACKIE, 2003). Existem dois subtipos de HSV: o Herpes Simplex vírus tipo 1
(HSV-1); e o Herpes Simplex virus tipo 2 (HSV-2), estruturalmente e geneticamente semelhantes,
porém, diferem basicamente na forma de transmissão e no local onde se desenvolve a lesão
(WAGGONER-FONTAIN ; GROSSMAN, 2004).
Sabe-se que o HSV-1 apresenta preferencialmente um tropismo orolabial, podendo ser
transmitido por gotículas de saliva ou através do contato direto com secreções infectadas pelo vírus.
Por outro lado, o HSV-2 infecta a mucosa do trato genital, e é considerado o mais comum agente
causador de lesões genitais em humanos, sendo que sua transmissão ocorre sexualmente (SACKS,
2004). Esse vírus é também responsável pelo herpes neonatal, uma forma grave da infecção
herpética, resultante da contaminação pela mãe na hora do parto por via natural, podendo levar a
danos irreversíveis ou à morte (COREY; WALD, 2009). Quando associados com outras viroses,
aumentam os riscos de desenvolverem doenças severas. Conforme estudos de Pisani e
colaboradores (2004), e Szostek e colaboradores (2009), pacientes co infectados com o Papiloma
Vírus Humano (HPV) têm um risco aumentado para desenvolver o carcinoma cervical. Já, outros
estudos mostram que os portadores do HSV-2 são mais suscetíveis a contrair o HIV (CELUM,
2004; LINGAPPA; CELUM, 2007).
2.3.1.1 Estrutura e Biologia do HSV-1
O vírion do HSV é composto de um DNA de fita dupla com cerca de 150 kb com
sequências para a codificação de 70 proteínas. Esse material genético é protegido por um capsídeo
protéico de formato icosaédrico medindo em torno de 100-110 nm (MACKIE, 2003). O espaço
entre o capsídeo e o envelope é preenchido pelo tegumento, no qual é composto pela proteína ICP5
e também pelas proteínas VHS e α-TIF, importantes na replicação viral (METTENLEITER, 2004).
Ao redor do tegumento, forma-se o envelope, uma membrana externa de constituição lipoproteica
com glicoproteínas específicas, tais como a gB, gC, gD e gH-gL (SPEAR, 2004).
30
A entrada do vírion HSV-1 na célula epitelial depende da ligação entre receptores de
superfície celular e proteínas de superfície do vírion. Em relação a estes receptores, inclui-se o
sulfato heparano (HS) que se liga a gC na matrix extracelular, e a gB se liga ao HS e ao mediador
da entrada de herpes vírus (HVEM) (SACKS, 2004). Além disso, para que ocorra a fusão dessas
glicoproteínas na membrana plasmática, é necessário a ação da glicoproteína gD, específica para os
alfa-herpesvirus, entretanto ela apresenta estrutura de uma proteína de fusão, sendo necessário que
seja ativada no momento da ligação com os outros receptores de superfície celular, tais como o
HVEM , nectin-1 e nectin-2 e alguns sítios específicos da HS gerados pela 3-O-sulfotransferases.
Os receptores HVEM e nectin-1 são excelentes receptores de entrada para vírus HSV, tanto
para o HSV-1 quanto para o HSV-2. O HS modificado pelo 3-O-sulfotransferases está envolvido a
entrada do HSV-1. Já o nectin-2 é utilizado para o HSV-2 (PERTEL et al., 2004; SPEAR et al.,
2006; CAMPADELLI-FIUME et al., 2007; SEDY et al., 2008). Uma representação da estrutura, da
ligação e da entrada do vírus HSV-1 na célula é mostrada na Figura 6.
Quando ocorre a fusão, o vírus é internalizado por endocitose para dentro do citoplasma, e,
desta forma, o capsídeo e parte do tegumento são transportados até a membrana nuclear. O DNA
viral, juntamente com as proteínas do tegumento, penetra no núcleo e começa a replicação viral.
Assim, os primeiros genes são expressos e transcritos através da enzima Polimerase II e do estímulo
da proteína do tegumento VP16. O processo de replicação estimula a expressão de vários genes,
muitos dos quais codificam proteínas estruturais virais. A montagem do capsídeo viral e a
encapsulação da progênie DNA é feita no núcleo, seguidos do egresso do vírion da célula que
potencialmente irão infectar novas células (KNIPE; CLIFFE, 2008).
Uma vez estabelecida à infecção, ocorre ativação do sistema imunológico e, dependendo de
sua competência, poderá ou não desenvolver a doença clínica. Os vírus possuem mecanismos de
escape que possibilitam driblar o sistema imune, o que limita a eficácia da imunidade inata ou
adquirida (SACKS et al., 2004; WEISS, 2004).
A resposta imune inata, a primeira resposta do hospedeiro contra o vírus, inclui células
natural killer (NK), neutrófilos, macrófagos e proteínas do complemento, bem como citocinas.
Estas células restringem a replicação viral na mucosa e no sistema nervoso, como também iniciam a
resposta adaptativa através da apresentação de antígenos para ativar linfócitos B, linfócitos T CD4+
e linfócitos CD8+ (ADLER et al.,1999; BENENCIA; COURREGES, 1999; COSTA et al.,1999;
MILLIGAN et al., 1998 ; MILLIGAN, 1999).
31
Normalmente, após a infecção primária, as partículas virais não são eliminadas, são
transportadas dos neurônios sensoriais até o gânglio trigêmeo, onde se estabelece uma infecção
latente (BLOOM et al., 2010). Muitas vezes no estado de latência, podem ocorrer infecções
recorrentes, tais como, a queratite e a encefalíte herpética. Sendo, mais graves, principalmente, em
pacientes imunocomprometidos, recém nascidos e gestantes, os quais necessitam de terapia antiviral
mais intensiva (TOMA et al., 2008).
HSV livre
DNA dupla
Envelope
fita
LIGAÇÃO INICIAL
Tegumento
A RECEPTORES
Capsídeo
LIGAÇÃO ESPECÍFICA
E FUSÃO
SULFATO DE
HEPARANO
HVEM
NECTIN-1
VÍRUS INTERNALIZADO
NECTIN-2
( HS )
Figura 6. Estrutura, ligação, fusão e entrada do vírus na célula. O HSV interage com receptores específicos da
superfície celular; liga-se ao sulfato de heparano (HSPG) através dos receptores gB e gC. A Entrada do vírus na célula é
mediada pela ligação aos receptores secundários de gD na superfície da célula (HVEM e Nectinas). gH e gL são
glicoproteínas acessórias na entrada. O vírus é internalizado na membrana por endocitose. FONTE: adapatado de SEDY
et al.,2008.
32
2.3.2 Vírus da Imunodeficiência Humana – HIV
Os últimos dados divulgados pela Organização Mundial da Saúde (OMS) em 2009,
estimaram que mais 1.8 milhões de pessoas morreram por infecção pelo Vírus da Imunodeficiência
Adquirida (HIV), sendo esse, agente causador da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS),
uma doença progressiva e fatal com envolvimento do sistema imunológico. É definido pela Centers
for Disease Control and Prevention (CDC) como o estágio mais avançado pela infecção pelo HIV,
com uma ou mais de 20 infecções oportunistas relacionadas (CDC, 2008).
O vírus HIV é classificado pelo Comitê Internacional de Classificação dos Vírus
(International Committee on the Taxonomy of viruses – ICTV) como um lentivirus pertencente à
família Retroviridae, uma família de vírus envelopados, que apresenta a enzima transcriptase
reversa, na qual converte o RNA viral em DNA, permitindo a entrada nas células hospedeiras
(CLEMENTS; ZINK, 1996).
Existem dois tipos de HIV: o HIV-1 e o HIV-2, sendo o HIV-1 o mais disseminado no
mundo e o mais virulento, enquanto o HIV-2 é o menos patógeno, no entanto, devido a mutações e
recombinações, esses vírus apresentam variantes. Até o momento, sabe-se que o HIV-1 apresenta
onze subtipos (A1, A2, B, C, D, F1, F2, G, H, J, K) e 43 formas recombinantes que pertencem ao
grupo M, e um menor número de cepas divergentes pertencem ao grupo O, enquanto o HIV-2
possui cinco subtipos (A-E) THOMSON; PEREZ-ALVAREZ; NÁJERA, 2002; GURJAR et al.,
2009).
2.3.2.1 O genoma do HIV-1
O HIV-1 apresenta aproximadamente 120 nm e seu genoma é formado por duas moléculas
idênticas de RNA de fita simples com polaridade positiva, codifica proteínas estruturais e não
estruturais, comuns para todos os retrovírus e necessárias para a replicação viral. Na extremidade 5’
a 3’ são encontrados os genes estruturais padrões (env, gag e pol) que codificam, respectivamente,
as glicoproteínas do envelope, as proteínas do núcleo e as enzimas (HASELTIN, 1991). A
organização do genoma do HIV-1 está representada na Figura 7.
O gene env, que codifica a gp160 (proteína do envelope), é clivado por uma protease celular,
formando as glicoproteínas gp120 e a glicoproteína transmembrana gp41, que mediam a entrada do
vírus na célula hospedeira. A gp120 é responsável pela ligação a receptores (CD4) e a co-receptores
33
(CCR5 ou CXCR4), enquanto a gp41 catalisa a fusão do vírus na bicamada da membrana lipídica
(ZAITSEVA, 2003; ARIËN, 2005, PEREZ-NUENO, 2009). O gene gag, por sua vez, codifica a
poliproteína precursora, chamada de Pr 55gag, que através de clivagem proteolítica forma as
principais proteínas, como as: da matrix (p17), do capsídeo (p24), do nucleocapsídeo (p7), p1 e p6
(JACOBS et al.,1989; SCARLATA; CARTER, 2003).
Através de um deslocamento translacional entre o gene gag e pol, ocorre a formação da
poliproteína Gag-Pol160gag/poll, também clivada pela protease viral, origina a transcriptase reversa e
RNase H, integrase e a protease (FRANKEL, 1998). Além dos genes estruturais, existem outros
genes que participam do processo de replicação, como as proteínas regulatórias (Tat e Rev) e as
acessórias (Vpr, Vif, Vpu, e Nef). Desta forma, essas proteínas podem controlar a capacidade de
infectar uma célula, produzir novas cópias virais ou causar doenças.
Em relação às proteínas regulatórias, a proteína Tat por ser uma proteína de transativação, é
crítica no processo de transcrição por repetições terminais longas (LTR), acelerando a produção de
proteínas virais. A Rev codifica proteínas que regulam a expressão do RNAm viral, e apresenta
também um papel importante no transporte do RNA viral do núcleo para o citoplasma (FRANKEL,
1998; SEELAMGARI et al., 2004; MALIM, 2008).
Já as proteínas acessórias, também chamadas de auxiliares, são essenciais para a replicação e
patogenia in vivo. Um estudo de Erwann e Benichou (2005) mostrou o envolvimento da vpr em
processos-chave no ciclo de vida viral, ou seja, na transcrição reversa e importação nuclear do
DNA. Em um outro estudo, Carr e colaboradores (2008) mostraram que a proteína Vif está
relacionada com a infectividade do vírus e a transmissão do HIV de uma célula para outra. Do
mesmo modo, Mehle (2004) estudou a proteína Vif e verificou que esta interagia com a
APOBEC3G e a considerou ser uma proteína de defesa antiviral em células do hospedeiro por
inativar o efeito antiviral e reforçar a replicação viral do HIV (MEHLE, 2004). Por sua vez, a
proteína nef, apresenta-se importante na replicação viral como também na patogenicidade in vivo.
uma vez que mantém altos níveis de carga viral pela subregulação das moléculas de superfície,
como as CD4, MHC classe I e II, CD28 e CD3, isto proporciona um mecanismo de escape do vírus
a um ataque das células T CD8+ citotóxicas. Essa proteína também está envolvida nas vias
intracelulares de transdução de sinal (JERE, 2010).
34
p32
gp 120
Integrase
gp 41
p 17
p 24
ssRNA
p10 protease
Transcriptase reversa
(p66-p51)
Proteínas do MHC
Figura 7. Organização do genoma HIV proviral e suas proteínas. A posição vertical, iniciando com as repetições
terminais longas (LTR), mostram um cada dos três fragmentos lidos que codificam as proteínas virais. O gene gag
codifica as da matrix (p17), do capsídeo (p24), do nucleocapsídeo (p7, p1 e p6). O gene pol codifica polimerases e
integrases necessárias para a replicação: a transcriptase reversa (p66/p55), protease (p10), e integrase (p32). O gene env
codifica as proteínas do envelope a gp120 e a gp41 (Da SILVA, 2008).
35
2.3.2.2 O Ciclo Viral
Primeiramente, para que ocorra a entrada do HIV nas células hospedeiras, a gp120 do HIV
se liga às células que apresentam moléculas CD4, receptores pertencentes à família das
imunoglobulinas e encontrados na superfície das células T auxiliar, células T reguladoras, nos
monócitos e nas células dendríticas. Essa ligação da gp120 a receptores CD4 com uma nova
interação com os co-receptores (CCR5 ou CXCR4) leva a uma conformação da gp 41 e,
consequentemente, à fusão com as membranas lipídicas (PÉREZ-NUENO et al, 2009; TILTON;
DOMS, 2010). Assim, permitem a entrada das proteínas virais, do ácido nucléico, da enzima
transcriptase reversa e da integrase do HIV na célula hospedeira. No interior dessa célula, a enzima
transcriptase reversa promove a transcrição do RNA para o DNA viral, que por sua vez é
transportado para o núcleo, aonde irá se integrar ao DNA da célula hospedeira através da enzima
integrase (FREED, 2001; SLUIS-CREMER; TACHEDJAN, 2008).
No citoplasma, o novo RNA viral é usado como RNA genômico para formar novas
proteínas virais. O RNA viral, juntamente com as novas proteínas virais, move-se para a superfície
celular e um novo e imaturo vírus HIV é formado. O amadurecimento desse vírus acontece pela
enzima protease, bem como a sua liberação que potencialmente irá infectar novas células (SIERRA;
KUPFER; KAIZER, 2005).
2.3.2.3 Resposta imunológica na infecção por HIV
Em um indivíduo sadio, o número normal de linfócitos T encontrado é de duas células T
CD4+ para uma célula T CD8+. As linfocinas produzidas pelos linfócitos T auxiliares são
necessárias para que o linfócito B seja transformado em plasmócito, produzindo anticorpos
(imunidade humoral) e para o linfócito T citotóxico exercer sua ação lítica sobre as células
infectadas. A infecção pelo HIV ocasiona uma disfunção no sistema imunológico por uma
considerável destruição dos linfócitos T CD4+, por lise, apoptose ou imunoativação alterada.
Em consequência, tanto a resposta imune humoral como celular ficarão prejudicadas
ocorrendo uma inversão na relação T CD4:T CD8, levando à imunodeficiência, uma doença crônica
e progressiva (PICKER, 2006; PANTALEO, 2004). Também podem ser afetadas pelo vírus HIV,
células como os monócitos, macrófagos e células dendríticas, uma vez que estas também possuem
moléculas CD4 na sua superfície. Anormalidades nessas células incluem defeitos na quimiotaxia, na
36
depuração mediada por complemento, diminuição na proliferação de células T e da função do
receptor Fc.
Além dessas, quando as células B, são afetadas, ocorre uma estimulação policlonal, levando
a uma produção anormal de imunoglobulina G (IgG), imunoglobulina A (IgA) Imunoglobulina D
(IgD). Já as alterações nas células Natural Killer (NK) provocam uma diminuição da produção de
Interleucina 2 (IL2), prejudicando a resposta imune inata (FLINT et al., 2004).
A resposta imune durante a fase aguda do HIV ou fase primária é um fator determinante do
curso da doença. Num primeiro momento, logo após a exposição ao HIV, não haverá RNA viral no
plasma. No entanto, não existem dados na literatura sobre a duração dessa fase, isso dependerá do
sistema imunológico e da quantidade de inoculo viral. Sabe-se que o HIV replica-se nos linfonodos
e, talvez, nesta fase, a viremia não seja suficiente para infectar. Após essa fase, normalmente ocorre
um aumento considerável do RNA viral (carga viral) no plasma, apresentando um pico em torno
dos 21-28 dias da infecção e uma alta depleção das células T CD4+. Além do RNA viral, outros
marcadores também começam a serem detectados, como o antígeno p24 e anticorpos específicos
anti-HIV. A carga viral diminuiu lentamente e aproximadamente nos 100 dias após a infecção a
concentração no plasma do RNA viral entra em platô, indicando o início da fase crônica
(McMICHAEL et al., 2010).
2.3.2.4 Diagnóstico
Em uma fase inicial da doença, os sintomas são autolimitados e quase sempre a doença não
é diagnosticada devido à semelhança com outras doenças virais. Rotineiramente, a detecção do
vírus HIV é realizada pelo teste ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), ou seja, ensaios
sorológicos imunoenzimáticos que identificam anticorpos e ou antígenos. Em geral, os anticorpos
anti HIV aparecem depois de três semanas do contágio. Quando a pesquisa de anticorpos é realizada
precocemente, existe a possibilidade de o teste resultar falsamente negativo, caracterizando o que se
conhece como janela imunológica. Para diminuir esta possibilidade, pesquisa-se a proteína p24,
que aparece precocemente após a infecção. Contudo, a pesquisa do genoma viral pela reação em
cadeia da polimerase (PCR) é mais sensível e específico do que a pesquisa de antígeno (CDC,
2008).
37
Além de detectar a presença da infecção por HIV, é necessário averiguar a integridade do
sistema imune. Para isto, o paciente deve ser monitorado com outros marcadores biológicos, tais
como: a contagem de células TCD4+ no sangue dos pacientes infectados, o RNA viral plasmático,
ou seja, quantidade de vírus no plasma (RNA/mL de soro), determina o nível de replicação viral.
2.3.2.5 Chaperonas e HIV
Baseado em estudos, têm-se mostrado o envolvimento das Hsps com o vírus HIV. Já em
1999, Brenner e Wainberg documentavam que as Hsps participavam tanto no ciclo viral como na
imunidade. Este estudo, através da técnica de western-blotting e co-imunoprecipitação, mostrou a
expressão das Hsp27, Hsp70 e Hsp78, que por sua vez formaram complexo intracelularmente com
as proteínas virais durante o ciclo de infecção pelo HIV. Como consequência, estas proteínas
favorecem o reconhecimento da célula infectada pelo sistema imune, servindo como alvo para as
NK e anticorpos-citotoxidade celular dependente.
Outros estudos relacionam o envolvimento do HSF1 com a proteína Tat HIV-1 como
estratégia para aumentar intracelularmente os níveis da Hsp70. Wheeler e colaboradores (2002)
evidenciaram a liberação intracelular da Hsp70 usando a proteína Tat HIV-1. Esta proteína pertence
a um dos membros de uma classe de proteínas que contém segmentos curtos, chamados de
domínios de transdução da proteína que aumentam os níveis da Hsp70 em resposta a várias
situações de estresse. As Hsps, nestas situações, são reguladas pelo HSF1, principal fator de
transcrição, os quais normalmente estão inativos e quando ativados construtivamente formam a
proteína de fusão HSF1 (+).
Para avaliar a liberação da HSF1 (+), Hou e Zou (2009), utilizaram o domínio de transdução
da proteína Tat HIV-1; investigaram a expressão e purificação da proteína HSF1(+)- Tat em
Escherichia coli; e verificaram que houve a expressão das Hsps. Também avaliaram a eficiência da
transdução e a função da HSF1(+)-Tat pelo teste de viabilidade celular, onde o teste de MTT
mostrou que as células tratadas com a proteína HSF1(+)-Tat aumentam em 22% quando comparada
com as células tratadas com HSF1(+).
Um estudo de Papp e colaboradores (2005) mostrou então o envolvimento da co-chaperona
HspBP1 com o HIV ao desenvolver um teste sensível para medir anticorpos contra a HspBP1 em
soro de HIV positivos, verificando que os anticorpos anti-HspBP1 estavam aumentados em soro de
pacientes HIV positivos. Assim, é de extrema relevância estudo que avaliem a expressão da
38
proteína HspBP1 em diferentes fases ou situações de um infecção viral, pois ela pode ser
relacionada com níveis de replicação viral e aspectos da imunidade.
39
MATERIAIS E MÉTODOS
40
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 VÍRUS E CÉLULAS
Vírus HSV-1 de linhagem KOS foram produzidos em células Vero (linha celular derivada
de rim de macaco verde africano), nº ATTC CCL-81, cultivadas em meio DMEM (GIBCO),
suplementados com 10% de soro fetal bovino (SFB) inativado e antibióticos (40 mg/mL
gentamicina- ARISTON) em estufa (LABOVEN) com atmosfera de 5% CO2 a 37 ºC.
3.2 CULTIVO DAS CÉLULAS
O cultivo das células Vero foi realizado em intervalos de 5 a 7 dias em frascos de cultura.
Para a subcultura (repique) das células, o meio de cultura foi decantado e a monocamada celular foi
lavada duas vezes consecutivas com uma solução 1:10 v/v Tripsina/Tampão Fosfato Salino (PBS).
Quando as células apresentavam-se desprendidas, foram ressuspendidas com 3 mL do meio DMEM
10% SFB. Após, 300 µL desta suspensão foi colocada no frasco, acrescido de meio DMEM 10%
SFB até recobrir o fundo. As células foram observadas em microscópio invertido - NIKON Eclipse
TS100 e colocadas para incubação a 37° C, 5 % de CO2.
3.3 PROPAGAÇÃO VIRAL
Células Vero em monocamada cultivadas em frascos de cultura (75cm² de área) foram
infectadas com 1x105 PFU diluídos em 10 mL de meio DMEM 1X, a infecção ocorreu a 37° C, 5 %
de CO2 por 1 hora. Transcorrido esse tempo, acrescentou-se 15 ml de meio DMEN suplementado
com 10% de SFB. A cultura foi incubada a 37° C, 5 % de CO2 por um período de até 72 horas.
Durante esse período, foram avaliados os efeitos citopáticos caracterizados por células com volume
aumentado e arredondadas, apresentando degenerações citoplasmáticas. As células foram mantidas
em cultura até 80% da monocamada celular ser destruída.
3.4 EXTRATO CELULAR
Para a extração da proteína das células Vero, o meio de crescimento foi decantado e, com
auxílio de um raspador de células, as células foram desprendidas do fundo da garrafa. O material foi
coletado em um tubo falcon e centrifugado por 10 minutos a 4 ºC e 8000 RPM. A seguir, o
41
sobrenadante resultante foi desprezado e o pellet reservado. Adicionou-se ao pellet 20 µL de
tampão lise celular (10 mM Tris- HCl pH 7,0, 1 mM Cloreto de Magnésio (VETEC), 1 mM EDTA
(NUCLEAR), 0,1 mM PMSF (SIGMA- Aldrich), 5 mM β - mercaptoetanol (SIGMA- Aldrich),
0,5% CHAPS (SIGMA- Aldrich) e 10% Glicerol, água destilada qsp. 50 mL por um período de
uma 1 hora, com homogeneização a cada 5 minutos. Transcorrido esse tempo, foi realizada uma
centrifugação a 4 º C 13.000 RPM por 1 hora. O sobrenadante foi separado e congelado a -80 º C
até o momento de análise.
3.5 QUANTIFICAÇÃO DA PROTEÍNA
A quantificação das proteínas totais foi realizada pelo método de BRADFORD a partir de
uma curva padrão usando uma solução padrão da albumina de soro bovino (BSA) na concentração
de 1mg/mL (BRADFORD, 1976). Para o preparo da curva, utilizaram-se as seguintes diluições:
1/1000, 1/500, 1/250, 1/125 e 1/100 em água destilada. As amostras foram preparadas na diluição
1/500, porém, quando apresentavam altas concentrações de proteínas, passando do ponto mais alto
da curva, foi utilizada a diluição 1/1000. Duzentos microlitros das diluições foram descartados e
substituídos por reagente BRADFORD (SIGMA-Aldrich), os tubos foram mantidos ao abrigo da
luz por 5 minutos. Após, fez-se à leitura em espectrofotômetro (UV-VIS 1650 PC – Shimadzu) em
595 nm, e o aparelho foi zerado somente com diluente.
A curva padrão e sua respectiva equação da reta foram determinadas através do estudo de
regressão linear pelo método dos mínimos quadrados. Para construção do gráfico, foram plotadas
no eixo das ordenadas as absorbâncias das determinações, e no eixo das abscissas, as concentrações
em (µg/mL). Os valores experimentais foram tratados estatisticamente através da análise de
variância - ANOVA. Na Tabela 2, encontram-se as diluições e as concentrações finais de BSA
empregadas na curva padrão.
42
Tabela 2. Tabela representativa da curva padrão da BSA. A concentração referente à curva analítica da BSA,
determinada por espectrofotometria em comprimento de onda (λ) de 595 nm. As concentrações finais encontram-se
expressas em µg/ml.
Tubo
Diluente
(µL)
Concentração
(µ
µg/ml)
1
Solução padrão
BSA (1mg /mL)
(µ
µL)
1
1000
1
2
2
999 (1/1000)
2
3
4
998 (1/500)
4
4
8
992 (1/250)
8
5
10
990 (1/125)
10
3.6 ELETROFORESE DE PROTEÍNAS
A eletroforese foi realizada seguindo Laemmli (1970), as amostras foram lisadas em tampão
de amostra (4% SDS, 20% glicerol, 10% 2-mercaptoetanol- SIGMA, 0,004% azul de bromofenolGIBCO, 0,125 M Tris-HCl pH 6,8) e PBS para um volume total de 10µL, correspondendo a 10
µg/mL. As proteínas extraídas e quantificadas pelo método de BRADFORD foram resolvidas em
gel SDS-PAGE (gel de policriamida 10%), em temperatura ambiente sob voltagem de 100 Volts.
Como padrão de peso molecular, foi utilizado 10 µL de padrão molecular (BenchMarkTM PreStained Protein Ladder- INVITROGEN). Após, o gel foi corado com 30 mL azul de comassie
(40% metanol, 10% ácido acético, 0,25% comassie brilhante blue R250-GIBCO, água destilada
q.s.p) em banho maria a 37 ºC por 30 minutos e descorado com solução STAIN (150 mL metanol,
50 mL ácido acético glacial, água destilada q.s.p).
3.7 WESTERN-BLOTTING
As proteínas resolvidas em gel de eletroforese foram transferidas para uma membrana de
nitrocelulose (MILLIPORE), utilizando um tampão de transferência contendo 0,634 g de Carbonato
de Sódio, 1,68 g de Bicarbonato de Sódio, 1000 mL de água destilada, 400 mL de metanol, qsp 2 L
e volume ajustado para 9,9. A transferência foi feita em banho de gelo no aparelho Owl Bandit™
uVEP-2 overnight, sendo a amperagem estabelecida em função da área da membrana.
43
Após, transcorrido a transferência das bandas, a membrana foi corada com PONCEOU RED
(SIGMA) para verificar se as proteínas foram transferidas corretamente, e lavada com água
destilada ou PBS 1X para que fossem descoradas. Para o bloqueio, a membrana foi coberta com
tampão de bloqueio (Leite pó 5% em PBS 1X) por 30 minutos. Posteriormente, para a marcação
com o anticorpo primário, a membrana foi lavada 10 vezes por 5 minutos em agitação com tampão
PBS TWEEN 0,05% (1000 µL de PBS 1X com 500 µL de TWEEN 20) e incubada por 5 horas ou
overnight com o anticorpo anti-HspBP1 (anticorpo primário), na concentração de 0,25 µg/mL. Esse
anticorpo foi preparado diluindo no tampão de bloqueio em um volume de 2,5 mL para cada
membrana (1 µL de anti-HspBP1 para 1 mL de tampão de bloqueio).
Novamente, após a primeira incubação, lavou-se 10 vezes com tampão PBS TWEEN
0,005% em agitação de 5 minutos e incubado por 6 horas. A presença das proteínas foram
detectadas com o conjugado preparado com a peroxidase anti-IgG de ovelha (anticorpo secundário),
onde fez-se uma diluição 1:1000 com tampão de bloqueio em um volume de 2,5 mL para cada
membrana. A incubação foi realizada em temperatura ambiente por 1 hora, e a seguir as lavagens
nas mesmas condições que as anteriores. A revelação do Western-blotting foi realizada com
reagente ECL (AMERSHAN LIFE SCIENCE) e após a incubação o filme foi exposto à membrana
e à detecção através de raio-X. A análise da quantificação da proteína foi realizada utilizando o
programa ImageMaster.
3.8 SORO DOS INDIVÍDUOS
A dosagem da proteína HspBP1 humana foi determinada no soro de indivíduos HIV
positivos (n=60) e negativos (n=30). O soro dos indivíduos HIV positivos (HIV+) foi obtido do
Serviço de Carga Viral do Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Universitário de Santa
Maria (HUSM). Foram utilizadas as amostras destinadas para descarte previamente analisadas para
a quantificação do número de cópias virais, CD4 e CD8.
As amostras HIV negativas (HIV-) foram obtidas de indivíduos saudáveis, doadores de
sangue do Hemocentro Regional de Santa Maria (HEMORGS), as quais também eram destinadas
para descarte. O material foi transportado com os devidos cuidados e as normas de biossegurança
do laboratório do HUSM e do HEMORGS até o laboratório de Biologia Molecular do Centro
Universitário Franciscano e armazenado em freezer - 80 ºC.
44
3.9 ELISA
O teste ELISA para a HspBP1 foi realizado a partir do descrito anteriormente por Raynes e
colaboradores (2006), com algumas adaptações. Esse teste utiliza o princípio de que antígenos ou
anticorpos que se fixam a uma fase sólida podem ser detectados por um anticorpo ou antígeno
complementar marcado por uma enzima. Sendo assim, capazes de agir sobre um substrato
cromogênico e na presença de antígenos ou anticorpos, desenvolverá um produto final colorido.
Para dosagem da proteína foram sensibilizadas microplacas (COSTAR- hight binding) de 96 poços
com 100 µL de 1 µg/mL do anticorpo anti- HspBP1 de ovelha em tampão fosfato (PBS 1X) durante
a noite a 4 ºC. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS 1X e TWEEN 0,05%, seguidas de
bloqueio com um tampão contendo 5% de leite em pó desnatado em PBS TWEEN 0,05% por 1
hora à temperatura ambiente com agitação. As amostras de soro diluídas a uma diluição 1:5, seguida
de uma diluição seriada de 20 a 0,625 ng com tampão de bloqueio da proteína HspBP1
(aminoácidos 84-359) foram adicionadas na placa em uma quantidade de 100 µL e incubadas por 2
horas à temperatura ambiente em agitação. Após a lavagem, adicionou-se 100 µL do anticorpo antiHspBP1 de coelho a 0,01 µg/mL (Delta Biolabs, Campbell, CA) com incubação de 1 hora em
agitação, seguidos de lavagem. 100 µL do conjugado enzimático anti-IgG de coelho produzido em
cabra – HPR (Zymed, San Francisco, CA), diluído a 1:10.000, com tampão bloqueio e incubação
de 1hora em agitação foi adicionado na placa. Para detecção da HspBP1 foi adicionado a reação
100 µL do substrato cromógeno (TMB e peróxido de hidrogênio). O resultado final foi um produto
colorido, no qual a absorbância foi lida em uma leitora ELISA (Bio-Rad) usando um comprimento
de onda de 450 nm.
Para a pesquisa dos anticorpos IgG anti-HspBP1 foi utilizado o protocolo de Papp e
colaboradores (2005). As microplacas foram sensibilizadas com 1 µg/mL da HspBP1( aminoácidos
84-359). Após, foram bloqueadas com um tampão (5 % de leite em pó diluído em PBS TWEEN
0,05%) e incubadas por 1 hora sob agitação à temperatura ambiente. As amostras diluídas com PBS
(1:5) foram adicionadas e incubadas por 4 horas a 4 ºC. O conjugado enzimático anti-IgG humano
produzido em cabra – HPR foi adicionado a diluição 1:500 e incubados por 1 hora. A revelação foi
realizada com TMB (Bio-Rad) e a absorbância foi lida na leitora ELISA (Bio-Rad) com um
comprimento de onda de 450 nm.
45
Para determinar qualitativamente os resultados foram considerados dois pontos de corte para
a reação, sendo este calculado conforme descrito a seguir:
• Ponto de corte (cut-off) (1)
Média CN + 2 DP
Em que:
CN= controle negativo
DP= desvio padrão
• Ponto de corte (cut-off) (2)
Média CN + 1 DP
• Zona Cinza: resultados com valores 5% superiores ou inferiores ao cut-off.
3.10 TRATAMENTO ESTATÍSTICO DOS DADOS
Os resultados foram avaliados estatisticamente pelo teste de variância ANOVA, pelo teste
não paramétrico Kruskall-Wallis, seguido do teste Student Newman-Keuls, considerando um nível
de significância de 95%. Os dados foram expressos com a média ± erro padrão da média (EPM).
3. 11 ASPECTOS ÉTICOS
O projeto foi submetido para apreciação e avaliação do Comitê de Ética em Pesquisa com
Seres Humanos da UNIFRA, registros: CONEP nº 1246 e CEP/UNIFRA nº 028.2010.2, atendendo
a Resolução 196/96, do Conselho Nacional de Saúde, conforme ANEXO II. Também foi solicitada
a autorização da Direção de Ensino, Pesquisa e Extensão do Hospital Universitário de Santa Maria,
assim como do Ministério da Saúde. Junto a esse estudo foi anexado (ANEXO I) o termo de
confidencialidade, o qual contribuiu para a preservação da identidade e dados obtidos para o estudo.
46
RESULTADOS
47
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 ANÁLISE IN VITRO DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA HspBP1
4.1.1 Propagação Viral
Os vírus são estruturas que apresentam um mecanismo de reprodução no interior de uma
célula hospedeira, controlam o sistema celular e asseguram sua multiplicação. A propagação do
vírus HSV-1 KOS foi realizada em células da linhagem Vero. Esta linhagem celular é um
fibroblasto que se deriva de células epiteliais do rim de macaco verde africano, e foi produzida por
Yasumura e Kawakita em 1963.
Na Figura 8, é apresentada a imagem de células Vero em monocamada cultivadas em meio
DMEM com 10% SFB. As células ilustradas apresentam as características cito-morfológicas dentro
da normalidade. Desta forma, apresentam uma relação núcleo-citoplasma normal, citoplasma
abundante e nucléolos localizados centralmente (SHEETS, 2000).
Figura 8. Fotomicrografia das células Vero não infectada. Células Vero em monocamada apresentando as
características dentro da normalidade. Aumento de 400x.
A fim de estudar o comportamento da expressão da proteína HspBP1 durante o ciclo de uma
infecção viral, células Vero foram infectadas com HSV-1. A evolução do nível de replicação viral
foi acompanhada a partir dos efeitos citopáticos apresentados pelas células infectadas em diferentes
tempos.
48
Na Figura 9 (A-D) são observadas as células Vero após a infecção pelo vírus em 12, 24, 48 e
72 horas. As células Vero apresentaram efeitos citopáticos bem característicos durante o processo
de replicação pelo vírus HSV-1KOS. As alterações celulares apresentaram-se visíveis nas 24 horas
após a inoculação do vírus, com um aumento gradual no decorrer das 48 e 72 horas. Foi possível
observar o aumento da relação núcleo-citoplasma, células com volume aumentado e arredondadas,
presença de degenerações citoplasmáticas.
A
B
C
D
Figura 9. Fotomicrografia das células Vero infectadas 12, 24, 48 e 72 horas. A) Células Vero infectadas em 12
horas. B) Células Vero infectadas em 24 horas apresentando aumento da relação núcleo-citoplasma, células com
volume aumentado e arredondadas, presença de degenerações citoplasmáticas e corpos de inclusões intranucleares
(indicada pela seta). C e D) Células Vero infectadas em 48 e 72 horas com um número maior de células infectadas,
respectivamente. Aumento 400x.
49
Esses mesmos efeitos citopáticos já foram relatados por Motamedifar e Noorafshan (2008),
sendo 1 a 3 dias o tempo necessário para serem detectados em diferentes culturas celulares, em
sistema de análise convencional (microscópio invertido). Porém, através de um estudo
estereológico1, esses autores mostraram que os efeitos citopáticos acontecem 4 horas após a
infecção do HSV-1 nas células Vero.
Em função deste potencial para a propagação viral, as células Vero também estão sendo
usadas na fabricação de vacinas virais, como a poliovírus vacina inativada, produzida pela Aventis
Pasteur. Estudos com o propósito de desenvolvimento de novas vacinas continuam sendo realizados
devido à mutagenicidade viral. Um desses estudos, como o de Wressnigg e colaboradores (2009),
mostrou que o vírus mutante Influenza B com gene NS1 truncado foi produzido eficientemente em
células Vero e são imunogênicas em camundongo. Assim, vistos como prováveis candidatos para o
desenvolvimento de uma vacina de vírus influenza vivo atenuado.
4.1.2 Quantificação das Proteínas
O processo de infecção viral modifica o padrão de expressão protéico (SULLIVAN;
PIPPAS, 2001), assim, quantidades de proteínas diferentes podem ser observadas em intervalos
com diferentes tempos de infecção, de acordo com a replicação viral (LIVINGSTON et al., 2009).
Células Vero infectadas foram colhidas em intervalos diferentes após infecção e as proteínas
extraídas por um processo de lise celular. As proteínas extraídas foram quantificadas usando o
método BRADFORD, a partir de uma curva analítica de 1 µg/mL de BSA (BRADFORD, 1976). O
reagente de BRADFORD determina a concentração de proteínas em uma solução. Esse
procedimento é baseado na formação de um complexo entre a proteína-azul brilhante G e a proteína
da solução. A quantidade de proteína é proporcional à absorção lida em um comprimento de onda
de 595 nm.
1
Análise morfológica das células por medida do volume celular e nuclear.
50
Para a análise precisa da quantidade de proteínas no extrato celular, foi utilizada uma curva
padrão da BSA na concentração de 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 e 10,0 µg/mL. A Tabela 3 apresenta as
absorbâncias médias correspondentes à concentração da BSA, relativas a cada uma das diluições. O
Desvio Padrão Relativo (DPR) médio obtido neste experimento foi de 2,78%, sendo este, inferior a
5%, limite máximo aceitável.
Tabela 3. Concentração referente à curva padrão de BSA. Curva determinada por espectrofotometria na região do
ultravioleta em um λ de 595 nm (n=2).
Concentração (µg/mL)
1,0
2,0
4,0
6,0
10,0
Absorbâncias
Médias ± DP
DPR (%)
0,083
0,08
0,082 ± 0,002
2,60
0,115
0,121
0,118 ± 0,004
3,60
0,156
0,153
0,155 ± 0,002
1,37
0,252
0,294
0,239
0,307
0,246 ± 0,009
0,301 ± 0,009
3,74
3,06
A Figura 10 representa a curva padrão contendo a equação da reta obtidas por regressão
linear pelo método dos mínimos quadrados para a BSA.
Curva Padrão
BSA
Figura 10. Representação gráfica da curva padrão de BSA. No eixo das ordenadas as absorbâncias das
determinações realizadas em um λ de 595 nm e no eixo das abscissas as concentrações de BSA em µg/ml.
51
A curva padrão de BSA, apresentada na figura 10, apresentou regressão linear significativa
(p<0,05), não havendo desvio significativo da linearidade (p>0,05). A equação da reta para o
método foi: y = 0,0234x + 0,063, onde “x” é a concentração em µg/mL e “y” a absorbância no λ de
595 nm
, apresentando um coeficiente de correlação igual a 0,996.
De acordo com os resultados, os dados demonstram que a curva pode ser utilizada para a
interpolação de valores experimentais, visando à determinação quantitativa de proteínas contidas
nos extrato celular. Os resultados da quantificação dessas proteínas, a partir da curva padrão, são
mostrados na Tabela 4.
Tabela 4. Quantificação das proteínas totais. Amostras de extrato celular quantificadas pelo método de BRADFORD
foram lidas em absorbância (λ 595 nm) e calculadas para um volume de amostra na concentração de µg/µL
Amostra
Proteínas totais
VERO não infectada
0,151
Quantidade da amostra
(µg/µL)
3,76
VERO infectada 12 h
0,147
3,58
VERO infectada 24 h
0,160
4,14
VERO infectada 48 h
0,235
7,35
VERO infectada 72 h
0,165
4,35
4.1.3 Eletroforese
As proteínas totais dos extratos celulares foram submetidas à técnica de eletroforese, sendo
separadas de acordo com sua carga elétrica e com o peso molecular. A partir da separação, foi
possível avaliar o padrão eletroforético quanto à quantidade, ao tamanho e às diferenças entre as
bandas. Na Figura 11, é apresentado o resultado da separação das proteínas totais extraídas das
células infectadas com HSV-1 nos diferentes tempos. As amostras do controle e das células Vero
infectadas foram quantificadas e ajustadas com tampão de amostra 4X e PBS 1 X, para um total de
10 µg de proteínas.
52
1
2
3
4
5
6
180 kDa
115 kDa
82 KDa
64 kDa
49 kDa
37 kDa
26 kDa
Figura 11. Perfil eletroforético das proteínas. Coluna 1: peso molecular; Coluna 2: 10 µg de células Vero; Coluna 3:
10 µg de proteínas de células Vero infectadas extraídas em 12 horas; Coluna 4: 10 µg de proteínas de células Vero
infectadas extraídas em 24 horas; Coluna 5: 10 µg de proteínas de células Vero infectadas extraídas em 48 horas;
Coluna 6: 10 µg de proteínas de células Vero infectadas extraídas em 72 horas.
Em uma análise comparativa com o padrão de peso molecular, observa-se que as células
Vero expressaram inúmeras proteínas. Essas proteínas foram expressas em todas as amostras com
bandas bem definidas, tanto nas células Vero infectadas como no controle, porém não apresentaram
diferenças de expressão quando comparadas com o controle, em relação à quantidade, ao tamanho e
às diferenças entre elas. A análise realizada foi proposta porque alguns estudos demonstram que é
possível observar alterações no padrão eletroforético de proteínas, quando as células são tratadas
com diferentes substâncias ou condições. Nesse caso, é possível que a infecção viral alterasse as
proteínas nos diferentes tempos, entretanto não ocorreu. Além disso, não foi observada diferença
nas proteínas de 40 kDa, segundo Raynes e Guerriero (1998), o peso molecular da HspBP1 é
aproximadamente 40 KDa.
4.1.4 Western-Blotting
Com o objetivo de avaliar especificamente a HspBP1, foi realizada a técnica de WesternBlotting no extrato de células Vero dos diferentes períodos de infecção. A Figura 12 mostra o
Western-Blotting do extrato de proteínas de células Vero não infectadas e de células Vero
infectadas com o HSV-1 KOS em diferentes tempos (12, 24, 48 e 72 horas), onde a linha corada
reflete a reação do anticorpo monoclonal anti-HspBP1 com a proteína.
53
1
2
3
4
5
6
7
8
Figura 12. Western-Blotting de células Vero e de células Vero infectadas com HSV-1KOS em 12, 24, 48 e 72
horas. Coluna 1,2,3: curva padrão da HspBP1(84-356 aminoácidos); Coluna 4: 10 µL de extrato de células não
infectada (215,58 ng); Coluna 5: 10 µL de extrato de células Vero infectada e extraídas nas 12 horas (221,71 ng);
Coluna 6: 10 µL de extrato de células Vero infectada e extraídas em 24 horas (212,34 ng); coluna 7: 10 µL de extrato
de células Vero infectada nas 48 horas (281,31 ng); Coluna 8: 10 µL de extrato de células Vero infectada nas 72 horas
(160,04 ng).
Em uma primeira análise, foi possível observar, através da técnica de Western-Blotting, que
as células Vero expressaram a proteína HspBP1. Normalmente, as linhagens celulares usadas para
expressar essa proteína eram às de origem tumoral, como as: 3LL (Lewis Lung carcinoma) no
estudo de Raynes e colaboradores (2003). Da mesma forma, Graner e colaboradores (2007)
utilizaram as células D54MG (linhagem de glioma adulto), D392MG (glioma adulto), D341MED
(meduloblastoma) e a SMA560 (astrocitoma anaplásico de murino) e observaram, através da
técnica de Western-Blotting, a presença da HspBP1, como também das: Hsp27, Hsp70 e a Grp78 na
superfície dessas células.
O presente estudo é o primeiro relato mostrando a identificação da HspBP1 humana em
células Vero normais e infectadas por HSV-1 KOS. Tal fato impossibilitou uma análise
comparativa dos resultados obtidos com outros estudos usando o mesmo modelo experimental. Por
este motivo os resultados obtidos foram comparados com estudos que avaliaram respostas
utilizando modelo tumoral.
É importante salientar que HspBP1 humana é uma proteína citoplasmática e é expressa em
todos os tecidos em pequenas concentrações. No entanto, Raynes e colaboradores (1998) mostraram
que HspBP1 está aumentada em tecidos tumorais, como o de pulmão, do músculo esquelético e do
pâncreas. Em outro estudo in vivo, Souza e colaboradores (2008) separou a HspBP1 de tumores
primários de mama e de soro de pacientes com um seguimento de 6 a 7 anos. Nesse trabalho, os
níveis de HspBP1 estavam aumentados no início do câncer de mama e era inversamente
proporcional à agressividade do tumor.
54
Nos resultados aqui obtidos, analisando o comportamento de expressão da proteína pela
análise de Western-Botting, foi possível verificar um ligeiro aumento no padrão de expressão da
proteína HspBP1 nas 48 horas (281,31ng) após a infecção, reduzindo nas 72 horas (160,04 ng).
Essa concentração foi determinada por densitometria óptica. Provavelmente, esse ligeiro aumento
está relacionado ao ciclo replicativo do HSV-1 e, consequentemente, ao aparecimento dos efeitos
citopáticos que começaram a ser vistos nas 24 horas. Um estudo de Montamedifar e Noorafshan
(2008) mostra que os efeitos citopáticos causados por um processo replicativo do HSV-1, quando
vistos por microscopia ótica, aparecem entre as 24 e 72 horas.
Além disso, esse aumento pode estar relacionado com a interação da HspBP1 com a Hsp70.
Uma vez que ocorre um aumento das Hsps70 em resposta a algum estímulo ao estresse, incluindo a
infecção viral (BRENNER; WAINBER, 1999). Segundo um estudo de Gurer e colaboradores
(2002), a Hsp70 e outras proteínas (Hsp27, Hsp40, Hsp60 e Hsc70) incorporam no vírion HIV. Da
mesma forma, outro estudo de Papp e colaboradores (2005) mostram que a Hsp70 interage com a
proteína HIV-1 gag durante o processo de liberação do vírion HIV das células infectadas e,
consequentemente, irão infectar novas células. Nesses processos replicativos, é provável que a
HspBP1, uma co-chaperona da Hsp70, interaja com a Hsp70 citosólica para inibir a atividade
ATPásica e de redobramento das novas proteínas formadas. Segundo, Raynes e colaboradores
(1998) e Shomura e colaboradores (2005) a HspPB1 regula a Hsp70, pois ela é um fator de troca de
nucleotídeo (NEF) e reguladora da ATPase Hsp70.
Na Figura 13, está representado o Western-Blotting de extrato de células Vero não
infectadas e de células Vero infectadas com HSV-1KOS em 96 horas. No poço número 3, foi
aplicado 10 µL da proteína HspBP1 purificada, e nos poço 1 e 2, correspondendo a células Vero
não infectadas (controle) e células Vero infectadas em 96 horas, respectivamente, foram aplicadas
10 µL do extrato devidamente ajustados para 10 ng/mL.
1
2
3
Figura 13. Western-Blotting de células Vero não infectadas e infectadas em 96 horas. Coluna 1: 10 µL de células
Vero não infectada (controle); coluna 2: 10 µL de células Vero infecta e extraídas nas 96 horas; coluna 3: 10 µL da
proteína HspBP1 purificada.
55
Analisando a Figura 13, observa-se que a HspBP1 extraída das células Vero infectadas em
96 horas está levemente diminuída em relação ao controle, conforme também mostrado na extração
das 72 horas (Figura 12). Assim, provavelmente, o aumento das 48 horas está relacionado com o
processo replicativo, o que reforça a hipótese de que a HspBP1 pode estar envolvida em um
processo viral in vitro. Assim, tornam-se necessários que sejam feitos estudos comparativos dessa
pesquisa in vitro com a pesquisa in vivo da proteína HspBP1, seguindo o mesmo experimento.
4.2 ANÁLISE IN VITRO DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA HspBP1 EM SORO HUMANO
4.2.1 Perfil das amostras analisadas
Os resultados obtidos nos experimentos in vitro indicaram que a expressão da proteína
HspBP1 é influenciada durante uma infecção viral, assim, essa alteração pode acontecer durante a
infecção in vivo. Somando-se a isso, a pesquisa de proteínas durante as fases de uma infecção viral
é um importante método para o diagnóstico e prognóstico de certas doenças.
Nesse experimento, através do teste imunoenzimático ELISA, pesquisou-se epítopos
(antígenos) da proteína HspBP1 no soro de pacientes HIV+ e no soro de indivíduos saudáveis. As
amostras dos pacientes HIV+ foram originadas do Serviço de Carga Viral do Laboratório de
Análises Clínicas do Hospital Universitário de Santa Maria (HUSM), e as amostras soronegativas
para o HIV foram as dos doadores de sangue do Hemocentro Regional de Santa Maria
(HEMORGS). As amostras de ambos os grupos de pacientes eram destinadas para descarte.
A população estudada foi de 60 pacientes HIV+, sendo estes divididos em 2 grupos. No
primeiro grupo, 30 pacientes HIV+ (21 do sexo masculino e 9 do sexo feminino) apresentando a
carga viral em altos níveis. Entre esses, 22 com uma média de 247.799 cópias/mL e 8 com a carga
viral maior que o limite máximo, um baixo nível de linfócitos CD4+ (média=140.516 células/mL),
altos níveis de linfócitos TCD8+ (média= 865.403 células/mL) e uma baixa relação CD4+/CD8+
(média= 0,18). No segundo grupo, 30 pacientes HIV+ (11 do sexo masculino e 19 do sexo
feminino) apresentando a carga viral indetectável (menor que 50 células/mL), uma média de
756.033 células/mL para os linfócitos CD4+, 842.800 células/mL para os linfócitos TCD8+, e 0,95
a relação CD4+/CD8+.
Conforme o Ministério da Saúde (2007/2008), é considerado uma carga viral alta quando os
valores forem acima de 100.000 cópias/mL de sangue e um número baixo de linfócitos T CD4+
56
quando esses se encontrarem abaixo de 500 células/mL de sangue periférico.Já a relação CD4/CD8
é considerável normal quando estiver entre 1,2 a 1,4 e alterado quando for inferior a 1,0 (RAYet
al, 2006) Nas Tabelas 5 e 6, é apresentado o perfil das amostras de pacientes HIV+ referentes ao
primeiro e segundo grupo, com os seguintes dados: sexo, idade, contagens e porcentagem de
linfócitos TCD4+ e TCD8+, relação CD4/CD8, e a carga viral. Para o grupo-controle utilizou-se 30
doadores de sangue apresentando os testes de triagem sorológica não reagente.
Tabela 5. Perfil das amostras HIV + com carga viral alta. As 30 amostras HIV+ apresentam altos níveis de carga
viral, baixos níveis de linfócitos CD4+, altos níveis de linfócitos TCD8+ e baixa relação CD4+/CD8+.
Amostra
Idade
Sexo
CD4 %CD4 CD8 %CD8
(µL)
(µL)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
55
35
37
39
33
50
58
28
41
37
52
51
39
33
48
42
45
49
56
46
14
46
49
29
47
30
36
67
33
61
Masc.
Masc.
Masc.
Masc.
Masc
Masc.
Masc.
Fem.
Fem.
Masc.
Masc.
Masc.
Mac.
Fem.
Fem.
Masc.
Masc.
Fem.
Fem.
Masc
Masc.
Masc
Fem.
Masc
Masc
Fem.
Fem.
Masc
Fem
Masc
5
19
49
19
516
520
76
75
66
90
55
45
42
161
129
31
73
132
18
238
81
171
132
348
258
10
263
147
163
212
1,0
2,0
3,0
9,0
22,0
3,0
5,0
6,0
6,0
6,0
12,0
2,0
10,0
9,0
7,0
1,0
3,0
11,0
7,0
18,0
7,0
15,0
10,0
19,0
19,0
3,0
15,0
7,0
11,0
12,0
165
649
1.146
74
854
1.437
1.051
647
532
927
126
1.494
281
1.188
1.248
2.530
1.761
688
159
759
834
613
797
1.029
744
115
1.195
1.639
1.051
995
57
43,0
66,0
64,0
36,0
37,0
70,0
64,0
52,0
50,0
66,0
29,0
80,0
65,0
66,0
69,0
81,0
84,0
57,0
63,0
54,0
69,0
55,0
63,0
56,0
55,0
37,0
70,0
77,0
70,0
58,0
CD4/CD8 Carga viral
(cópias)
0.063
0.03
0.04
0,26
0,60
0,08
0,07
0,12
0,12
0,10
0,44
0,03
0,15
0,14
0,10
0.01
0,04
0,19
0,11
0,33
0,10
0,28
0,17
0,34
0,35
0,09
0,02
0,09
0,16
0,21
> L Máx
128.042
> L Máx
319.446
> L Máx
237.561
213.286
205,944
395,201
> L Máx
> L Máx
> L Máx
> L Máx
372.832
> L Máx
374.814
302.167
> L Máx
> L Máx
307.246
147.675
134.062
221.878
473.341
185.514
349.545
316.856
237.967
365.457
257.749
Tabela 6. Perfil das amostras HIV+ com carga viral indetectável. 30 amostras HIV+ apresentando carga viral
inferior menor que o limite mínimo detectável (50 cópias/mL) pela técnica de b-DNA.
Amostra Idade
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
48
27
48
45
37
40
33
26
66
39
32
48
36
27
45
51
14
41
29
41
46
57
36
31
62
45
46
62
47
47
Sexo
Masc
Masc
Masc
Masc
Fem
Masc
Masc
Fem
Fem
Fem
Fem
Fem
Fem
Fem
Masc
Masc
Fem
Fem
Fem
Fem
Fem
Masc
Masc
Fem
Fem
Fem
Fem
Fem
Masc
Fem
CD4
(µL)
CD4
%
CD8
(µL )
CD8
%
CD4/
CD8
Carga Viral
(cópias)
682
712
466
964
555
659
1.119
685
634
667
805
673
721
932
705
872
797
1.054
1.109
570
548
929
640
727
593
885
680
466
869
963
30,0
21,0
31,0
37,0
32,0
25,0
38,0
29,0
38,0
25,0
38,0
40,0
34,0
28,0
29,0
36,0
30,0
44,0
37,0
35,0
35,0
39,0
32,0
43,0
31,0
34,0
39,0
36,0
38,0
34,0
857
1305
525
916
564
1.379
691,0
1.112
578
1.022
746
465
854
1.436
1.052
865
989
891
952
808
548
923
825
440
619
893
686
590
858
895
38,0
39,0
35,0
35,0
33,0
52,0
23,0
46,0
35,0
38,0
35,0
27,0
40,0
44,0
44,0
35,0
37,0
37,0
31,0
50,0
32,0
38,0
41,0
26,0
32,0
35,0
39,0
45,0
37,0
30,0
0,80
0,55
0,89
1,05
0,98
0,48
1,62
0,62
1,10
0,65
1,08
1,45
0,84
0,65
0,67
1,01
0,81
1,18
1,16
0,71
1,00
1,01
0,68
1,65
0,96
0,99
0,99
0,79
1,01
1,13
< L Mín
< L Mín
< L Mín
< L Min
< L Min
< L Min
< L Mín
< L Mín
< L Mín
< L Mín
< L Mín
< L Mín
< L Mín
< L Mín
< L Mín
< L Mín
< L Mín
< L Mín
< L Mín
< L Mín
< L Mín
< L Min
< L Min
< L Min
< L Min
< L Min
< L Min
< L Min
< L Min
< L Min
58
4.2.2 Detecção de HspBP1 nas amostras
A investigação da HspBP1 nas amostras HIV positivas e negativas foi realizada através da
técnica de ELISA quantitativo. Foi preparada uma curva padrão da proteína HspBP1(1 µg/mL) nas
diluições 1/50, 1/100, 1/200, 1/400, 1/800 e 1/ 1600 com água milli-Q como diluente,
correspondendo, respectivamente, a 20 ng/mL, 10 ng/mL, 5 ng/mL, 2,5 ng/mL, 1,25 ng/mL e 0,625
ng/mL. O gráfico representativo da curva de calibração e a equação da reta obtida por regressão
linear pelo método dos mínimos quadrados são representados na Figura 14.
Curva Padrão
HspBP1
Figura 14. Curva padrão da HspBP1. A proteína HspBP1 foi diluída em água milli-Q e as absorbâncias obtidas foram
lidas em uma leitora ELISA a 450 nm. Os dados foram analisados estatisticamente pelo teste de variança ANOVA, que
apresentou um coeficiente de correlação igual a 0,9871.
A partir da concentração da HspBP1 determinada, foi realizado o teste ELISA com as
amostras, utilizando essa proteína como parâmetro para a quantificação da mesma no plasma dos
pacientes. Na Tabela 7, são mostradas a quantidade de proteínas (ng/mL) referentes à pesquisa da
proteína HspBP1 nos 3 grupos analisados.
59
Tabela 7. Detecção da proteína HspBP1 em amostras HIV+ e HIV-. A análise no soro de pacientes HIV+ e no
soro de indivíduos saudáveis (contole) foi realizada em duplicata, usando o ensaio imunoenzimático ELISA por captura.
Na tabela estão representadas as quantidades da proteína em ng/mL das amostras dos três grupos estudados.
Amostra
n=30
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
ELISA HspBP1
HIV+ carga viral
alta
(ng/ml)
ELISA HspBP1
HIV+ carga <limite
mínimo
(ng/ml)
9,34
4,64
5,32
4,93
10,85
1,20
4,96
9,29
8,64
4,45
8,69
4,67
2,59
1,10
1,25
1,12
9,84
2,5
1,14
2,48
5,19
2,46
5,28
11,00
1,12
4,9
4,64
11,00
1,03
11,10
1,18
4,67
0,65
1,0
0,52
1,17
1,15
1,08
0,96
13,51
10,10
9,29
1,15
4,96
0,58
1,26
0,98
2,77
0,97
0,64
0,63
1,05
2,73
0,54
1,13
2,38
1,19
11,85
13,31
1,05
ELISA HspBP1
HIVcontrole
(ng/ml)
1,05
4,67
1,16
1,17
11,95
4,67
1,25
4,83
1,03
1,08
1,27
1,13
1,26
5,54
1,09
2,75
1,12
1,08
1,02
1,21
1,87
1,83
10,01
2,26
0,97
1,03
0,53
0,86
0,98
0,96
Os dados da Tabela 7 foram analisados, estatisticamente, pelo teste Kruskall-Wallis, teste
não paramétrico, o qual faz uma comparação entre as médias de grupos independentes. Em uma
análise comparativa entre os 3 grupos, evidenciou-se um nível de significância de p=0,0003, sendo
que se considera como diferença significativa quanto o valor de p for inferior a 0,05 (p < 0,05).
Devido à existência desta diferença, analisou-se os dados utilizando teste de comparação múltiplica
com nível de significancia de 95% teste Student Newman-keuls. A Tabela 8 apresenta as médias e
as diferenças entre os grupos.
60
Tabela 8. Variação da HspBP1 nos diferentes grupos estudados.
Amostras
Média HspBP1(ng/mL)
DP
HIV + carga viral alta
5,22 b
3,52
HIV + carga viral indetectável
3,45 a
4,23
HIV negativo
3,06 a
3,55
Letras iguais indicam grupos iguais e letras diferentes indicam grupos com diferença significatica a 95% de confiança (teste
Student Newman Keuls)
A Figura 15 representa os níveis da proteína HspBP1 no soro de indivíduos HIV+ e HIV-.
Em uma análise comparativa, é possível verificar que houve uma diferença significativa dos títulos
da proteína HspBP1 nas amostras de soro do grupo dos HIV+ com carga viral alta quando
comparado com os grupos HIV+ carga viral indetectável e HIV-. No entanto, não foi observada
uma diferença significativa entre o grupo dos HIV+ carga viral indetectável comparado com o
grupo dos HIV-.
ng/mL
HspBP1
*
Figura 15. Relação entre os níveis da HspBP1 e a carga viral. *. Indica diferença significativa p<0,005).
61
Inicialmente, avaliando o grupo dos HIV-, os resultados indicam que existe uma
concentração normal da proteína HspBP1 circulando no sangue em indivíduos saudáveis. Da
mesma forma, Raynes e colaboradores (2006), ao desenvolver um teste ELISA para a pesquisa da
HspBP1 em pacientes saudáveis, verificaram que existe, constitutivamente, uma concentração entre
0,7 ng/mL a 3,98 ng/mL presente no soro humano em indivíduos saudáveis. Neste estudo, a
concentração média da HspBP1 nas amostras analisadas, a partir da curva padrão, foi de 3,06 a 5,22
ng/mL.
Considerando uma avaliação dos 3 grupos, é possível verificar um aumento dos títulos da
proteína HspBP1 no grupo dos HIV+ com carga viral alta (5,22 ng/mL) quando comparado com o
grupo dos HIV- (3,06 ng/mL). Do mesmo modo, percebe-se um aumento dos títulos do grupo dos
HIV+ carga viral alta quando comparados com o grupo dos HIV+ com carga viral indetectável
(3,45 ng/mL).
A partir desses resultados, observa-se que houve um aumento da expressão da HspBP1 em
pacientes HIV+ com a carga viral alta. Diante disto, sugere-se que o estresse causado pelo processo
viral induziu a expressão da HspBP1, uma vez que os pacientes estavam na fase replicativa do vírus
e que várias proteínas são expressas nesse momento garantindo a homeostase celular. Esse é o
primeiro estudo sugerindo a alteração da proteína HspBP1 em um processo viral, contudo, existem
outros mostrando que os vírus induzem a expressão de chaperonas nas diferentes etapas da infecção
viral (BRENNER; WAINBERG, 1999; PRANGE; WERR; LOFFLER-MARY, 1999; CHO et al.,
2000; O'KEEFFE et al., 2000; RAMALANJAONA et al., 2007, SULLIVAN et al., 2001).
Um desses eventos acontece a nível de entrada dos vírus nas células, as chaperonas atuam
como receptores de superfície celular. Segundo o estudo de Guerrero e colaboradores (2002), a
Hsc70 na superfície da membrana extracelualar funciona como um dos receptores necessários para
a fusão do rotavírus nas células, participando diretamente do processo de entrada do vírus. A
adição de anticorpos anti-Hsc-70 ou preincubação com a proteína Hsc reduz a infectividade do vírus
em células MAO104. Outro vírus que interage com chaperonas durante o processo de entrada na
célula é o Borna Disease Virus (BDV), envolvido na patogênse da encefalite animal. A chaperona
BIP de 78 KDa interage com a glicoproteína de superfície do vírus (GP1) na superfície da
membrana de células nervosas, facilitando a entrada e a disseminação viral para outras células
nervosas (HONDA et al., 2009). Da mesma forma, Reys-Del Valle e colaboradores (2005) relatam
que a Hsp90 e a Hsp70 são chaperonas que fazem parte do complexo de receptores utilizados pelo
62
vírus da dengue durante o processo de entrada em células humanas (macrófagos e monócitos).
Curiosamente, a capacidade de infecção por esse vírus é reduzida na presença de lipolissararídeo
(LPS), uma molécula com alta afinidade pela proteína Hsp70 (BAUSINGER et al., 2002).
Assim, como no momento da entrada, as chaperonas também estão envolvidas em processos
de transporte, encapsidação e empacotamento no citoplasma, o que leva a um aumento e/ou uma
redistribuição das chaperonas celulares. No momento da infecção por HSV-1, ocorre a
reorganização celular e aumento da quantidade da Hsp27 citoplasmática. Essa chaperona é
importante para o processo de replicação viral, pois a diminuição dessa proteína está relacionada
com a redução de níveis de replicação viral (MATHEW et al., 2009).
A replicação de vírus RNA e DNA, como também a expressão gênica, são auxiliadas por
chaperonas. Pela pesquisa de Mitra e Kumar (2005), a Hsp40 auxilia a Nef na replicação e na
regulação da expressão de genes virais do HIV-1. A Nef é a proteína mais importante e necessária
para a patogênese e progressão da doença, conhecida como uma proteína de infectividade viral. A
interação entre a Nef e a Hsp40 promove a translocação nuclear para a célula infectada, deste modo,
facilitando o aumento da expressão de genes virais, isso acontece por fazerem parte da quinase 9
dependente de ciclina (CDK9) associada ao complexo de transcrição e regulados por repetições
terminais longas (RTLs).
Além do já descrito, as chaperonas atuam nos processos de dobramento das proteínas virais
recém sintetizadas e montagem dos vírions. Um estudo de Brenner e Wainberg (1999) mostra que a
associação das Hsps e as ciclofilina A com as proteínas virais do HIV-1 facilitam nesses processos,
tendo um impacto na produção viral e infectividade. Esse estudo mostrou que as Hsp27 e Hsp70
estão aumentadas no ciclo de vida do HIV-1 e são altamente imunogênicas, podendo ser usadas
como estratégia contra o HIV-1.
As interações dos vírus com as chaperonas foram relatadas por Xiao e colaboradores (2010),
estas ocorrem tanto de forma direta para facilitar a patogenia viral como de forma indireta por
participar do mecanismo de resposta celular ao estresse causado pela infecção. Desta forma,
apresentam um papel pró-viral ou anti-viral durante os vários eventos do ciclo viral. O efeito na
patogenia viral depende da sua localização celular.
Sabe-se que as chaperonas são proteínas intracelulares que apresentam atividade
citoprotetora contra a apoptose, porém, algumas dessas estão localizadas na superfície celular, com
isso, exercendo uma função extracelular, como importante mediadora de sinalização célula a
63
célula, estimulando o sistema imunológico à produção de anticorpos (WU; TANGCHUM, 2006).
Desta forma, as Hsps têm sido investigadas como moduladoras nos processos imunológicos por
atuarem como apresentadoras de antígenos e atuarem no transporte dos peptídeos ao MHC
estimulando a resposta imune humoral (SRIVASTAVA, 1993).
A fim de se relacionar a quantidade de HspBP1 com o número de linfócitos T CD4+ nas
amostras HIV+, realizou-se uma análise estatística pelo teste Kruskall-Wallis das D.Os da HspBP1
presentes nas amostras que apresentavam uma contagem de linfócitos T CD4+ de 0-100
células/mL, 100-500 célula/mL e maior que 500 células/mL, a qual se obteve como resultado uma
diferença significativa de p=0,0011 com 95% de confiânça. As médias da diferença entre os
grupos pelo teste Student Newman-Keuls estão representados na Tabela 9.
Tabela 9. Relação entre os níveis da HspBP1 e a contagem de linfócitos T C D4+ em indivíduos HIV+.
Nº de linfócitos TCD4+
Média HspBP1(mg/mL)
DP
0-100 células/mL
5,61 a
2,71
100- 500 células/mL
3,61 b
4,41
>500 células/mL
1,64 b
0,98
Letras iguais indicam grupos iguais e letras diferentes indicam grupos com diferença significatica a 95% de
confiança (teste Student Newman Keuls).
O gráfico da Figura 16 mostra os níveis da HspBP1 encontrados no plasma de pacientes
HIV+ nos 3 grupos analisados. Em uma análise comparativa, é possível verificar, pelo teste Student
Newman-Keuls, que houve uma diferença significatica no nível da HspBP1 entre os grupos com
linfócitos T CD4+ de 0-100 quando comparado com o grupo de 100-500 células/mL e com o grupo
apresentando uma contagem maior que 500 células/mL. No entanto, não foi observada uma
diferença entre os 2 grupos de 100-500 e de > 500 células/mL. Este aumento da proteína ocorrido
nos indivíduos que apresentavam linfócitos T CD4+ baixos, são coerentes conforme encontrado na
relação proteína HspBP1 com a carga viral, uma vez que a carga viral se relaciona com os linfócitos
T CD4+ e é considerada uma marcador de queda da contagem de linfócitos T CD4+.
64
HspBP1
ng/mL
*
Linfócitos TCD4+
(células/mL)
Figura 16. Relação entre os níveis de HspBP1 e a contagem de linfócitos TCD4+. * Indica diferença significativa (p
< 0,005).
Relacionando a quantidade de HspPB1 com a contagem de linfócitos TCD8+ nos 3 grupos,
0-500 células/mL, 500-1000 células/mL e maior que 1000 células/mL, verificou-se, pelo teste de
Kruskall-Wallis, que não houve uma diferença significativa entre eles (p=0,7088). Da mesma
forma, não foi observado pelo teste Student Newman-Keuls uma diferença entre os pares, como
mostra a Tabela 10 e a Figura 17. Os linfócitos T CD8+ não apresentam relação com a carga viral,
por isso não ocorreu diferença da HspBP1 quando comparada com essas células.
Tabela 10. Relação entre os níveis da HspBP1 e a contagem de linfócitos TCD8+.
Nº de linfócitos TCD8+
Média HspBP1(DO)
DP
0-500 células/mL
4,71 a
4,08
500-1000 células/mL
4,28 a
4,33
>1000 células/mL
4,19 a
3,86
Letras iguais indicam grupos iguais.
65
HspBP1
ng/mL
Linfócitos CD8+
(células/mL)
Figura 17. Comparação entre os níveis de HspBP1 e a contagem de linfócitos TCD8+.
Analisando os resultados da relação CD4+ e CD8+ com a HspBP1, verifica-se que houve
um aumento da expressão da HspBP1 somente nos pacientes que apresentavam uma depleção dos
linfócitos CD4+. Este aumento está relacionado ao fato que o HIV apresenta tropismo apenas para
células que apresentam moléculas CD4+ e não para células CD8+ (KAIZER et al., 2007; KULZAR
et al., 2008 ).
4.2.3 Pesquisa dos anticorpos IgG anti-HspBP1 nas amostras
A fim de determinar se na infecção viral pelo HIV ocorre alteração da resposta imune
humoral contra a HspBP1, realizou-se um teste ELISA com as mesmas amostras utilizadas para a
pesquisa da proteína HspBP1. Na Tabela 11, são apresentados as D.Os referentes a pesquisa dos
anticorpos anti-IgG contra a proteína HspBP1 nas amostras HIV+ e HIV-.
66
Tabela 11. Pesquisa de anticorpos IgG anti-HspBP1 em amostras HIV+ e HIV-. Os anticorpos IgG anti-HspBP1
foram pesquisados em amostras no soro de indivíduos saudáveis e com HIV+ com carga viral alta e com carga viral
indetectável por um teste ELISA indireto.
Amostra
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Média:
DP:
ELISA
Anti IgG- HspBP1
(HIV+ com carga alta)
n=30
ELISA
Anti IgG-HspBP1
(HIV+com carga<
limite máximo) n=30
ELISA
Anti IgG-HspBP1
(HIV-)controle
n=30
0,294
0,133
0,102
0,482
0,214
0,161
0,291
0,245
0,229
0,281
0,210
0,148
0,104
0,321
0,330
0,125
0,205
0,257
0,246
0,238
0,143
0,110
0,312
0,488
0,110
0,174
0,453
0,095
0,192
0,280
0,138
0,449
0,127
0,223
0,110
0,365
0,101
0,136
0,139
0,226
0,116
0,112
0,295
0,141
0,351
0,139
0,100
0,116
0,208
0,166
0,116
0,151
0,109
0,242
0,129
0,123
0,193
0,347
0,128
0,165
0,181
0,151
0,196
0,203
0,174
0,133
0,249
0,144
0,265
0,100
0,168
0,181
0,113
0,126
0,100
0,167
0,229
0,149
0,177
0,150
0,122
0,125
0,272
0,242
0,201
0,102
0,144
0,199
0,160
0,227
0,232
0,108
0,182
0,092
0,168
0,045
Na pesquisa de anticorpos IgG anti-HspBP1 quando aplicado como ponte de corte da reação
o valor da média dos CN + 2DP (cut-off= 0,258), obteve-se 100% de especificidade, isto é, nenhum
dos indivíduos saudáveis apresentaram resultado positivo. Entre os indíviduos HIV+ (n=60),
independente da carga viral, 25% apresentaram reação positiva com resultados acima do ponte de
corte, fora da zona cinza. Quando aplicado o ponte de corte usando o valor da média dos CN + 1DP
(cut-off= 0,213), a especificidade passou a ser de 91%. Contudo, com este ponto de corte 40% dos
indivíduos HIV+ resultaram reagente para a pesquisa anti- HspBP1. Sendo a maior parte destes
indivíduos com carga viral alta.
67
A partir dos resultados mostrados, verifica-se que há um aumento nos níveis de anticorpos
IgG anti-HspPB1 nos indivíduos HIV+ com carga viral alta e contagens de linfócitos CD4+ baixos
e nos indivíduos HIV+ com a carga viral indetectável e níveis variáveis de CD4+. O aumento dos
anticorpos anti-HspBP1 nas amostras de pacientes HIV+ está de acordo com Papp e colaboradores
(2005). Estes autores, com o propósito de desenvolverem um teste ELISA para medir os anticorpos
contra a proteína HspBP1, compararam os níveis de anticorpos anti-HspBP1 de amostras de
indivíduos infectados
com as amostras de doadores de sangue soronegativos,
relacionaram
também com os parâmetros clínicos (idade, sexo e CD4+). Desta forma, incluiram para o estudo 37
indivíduos HIV+ apresentando uma média de 355 células/mL de linfócitos CD4+ e 47 indivíduos
HIV-. Após a padronização do teste, determinaram os níveis de anticorpos IgG anti-HspBP1 e
verificaram que a concentração média dos anticorpos no grupo HIV+ foi aproximadamente duas
vezes maior do que o grupo HIV- e,
que não existia uma relação entre os anticorpos e os
parâmetros clínicos. No presente trabalho pode ser observado que a maior proporção de indivíduos
que apresentaram a presença de anticorpos encontrava-se no grupo com carga viral elevada.
Importante salientar que dependendo do limiar de reatividade escolhido, pode-se ser obtido
100% de especificidade, diferente de Papp e colaboradores (2005) que apesar de detectarem 75,7%
de anti-HspBP1 em indivíduos HIV+, relatam resultados falsos positivos. A presença desses
autoanticorpos anti-HspBP1 também já foi relatada por Raynes e colaboradores (2006), nesse
estudo, pesquisando os anticorpos anti-HspBP1 em indivíduos saudáveis, encontraram cerca de
0,7 a 1.1 ng/mL. Em uma análise comparativa entre os níveis da proteína e os níveis de
anticorpos, esses autores verificaram que não existia uma relação entre ambos.
Em nossos estudos, para verificar se existia essa correlação, realizou-se o cálculo do
coeficiente de correlação de Pearson entre os níveis da proteína HspBP1 com os níveis de
anticorpos Anti-HspBP1 nos 3 grupos analisados (Figura 18), considerando cada indivíduo do
grupo amostral. Este coeficiente varia entre os valores -1 e 1, o valor 0 (zero) significa que não há
relação linear. Quanto mais próximo estiver de 1 ou -1, mais forte é a associação linear entre as
duas variáveis. Conforme verificamos, na Figura 18, não há correlação entre as amostras devido às
mesmas apresentarem o coeficiente de correlação de Pearson próximo a zero.
68
A)
B)
C)
Figura 18. Correlação entre os níveis de HspBP1 e os anticorpos Anti-HspBP1. A) Correlação entre cada indivíduo
HIV+ com carga viral alta; B) Correlação entre cada indivíduo HIV+ com carga viral indetectável; C) Correlação entre
os individuos HIV-.
69
CONSIDERAÇÕES FINAIS
70
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Tendo em vista que as chaperonas moleculares são de grande relevância na área
biológica, por participarem de vários processos metabólicos para manterem a homeostasia celular,
destacou-se o seu potencial para o diagnóstico e prognóstico de tumores. Baseando-se na
importância dessas moléculas na biologia das infecções virais, avaliou-se a proteína HspBP1
através de uma análise in vitro celular e em soro humano. A realização desse trabalho permitiu as
seguintes conclusões:
•
De acordo com a pesquisa da HspBP1 in vitro, através da infecção de células Vero com
o vírus HSV-1 KOS, observou-se que essas células expressam a proteína HspBP1. Com
relação ao perfil eletroforético das proteínas totais do extrato, não houve diferença entre o
tamanho e a quantidade
das bandas em tempos diferentes de infecção. Já, quanto a
identificação da HspBP1, pela técnica de Western-Blotting, ocorreu um aumentou da
expressão em 48 horas após a infecção, sugerindo, assim, um provável envolvimento em
processos virais in vitro. A capacidade de células Vero infectadas com HSV-1 expressar a
proteína HspBP1 proporciona a oportunidade e perspectiva de estudo in vitro desta proteína,
em processos virais.
•
Pela pesquisa da HspBP1 in vitro em soro humano pela técnica de ELISA, ocorreu um
aumento significativo da expressão da proteína nas amostras de pacientes HIV+ com carga
viral alta e contagem de linfócitos T CD4+ baixo. Da mesma forma a análise global dos
resultados mostra que ocorreu um aumento dos anticorpos anti- HspBP1 nos pacientes HIV
positivos, refletindo provavelmente uma resposta do aumento da expressão da proteína.O
aumento da HspBP1 parece estar relacionado com a carga viral circulante, evidenciando a
possibilidade de sua aplicação no seguimento de indivíduos infectados pelo HIV. Contudo,
mais estudos são necessários para confirmar esta possibilidade.
•
Diante desses resultados, o aumento da HspBP1 in vitro, tanto celular com em soro
humano indica uma provável alteração da proteína em processos virais.
•
Como perspectiva de continuidade deste trabalho, será realizada a pesquisa da proteína
em processo de soroconversão pelo HIV usando a mesma metodologia empregadas nesse
estudo, assim como funcionalização com nanotubos para aplicação diagnóstica.
71
REFERÊNCIAS
72
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82
ANEXOS
ANEXO I
TERMO DE CONFIDENCIALIDADE
Título do projeto: AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DA PROTEÍNA HspBP1 EM INFECÇÕES VIRAIS
Pesquisador responsável: Adrianne Del Fabro Ceccim
Demais pesquisadores: Luiz Carlos Rodrigues Junior
Instituição de origem do pesquisador: UNIFRA
Área de Conhecimento: Imunologia
Curso: Mestrado em Nanociência- UNIFRA
Telefone para contato: 55 32212266
Local da Coleta de dados: HUSM (Laboratório de Análises Clínicas-setor: carga viral e Hemocentro
Regional de Santa Maria)
Registro no CEP/UNIFRA:
Os pesquisadores do projeto acima identificados assumem o compromisso de:
I. Preservar o sigilo e a privacidade dos sujeitos cujos dados (informações e/ou materiais
biológicos) serão estudados;
II. Assegurar que as informações e/ou materiais biológicos serão utilizados, única e
exclusivamente, para a execução do projeto em questão;
III. Assegurar que os resultados da pesquisa somente serão divulgados de forma anônima, não
sendo usadas iniciais ou quaisquer outras indicações que possam identificar o sujeito da pesquisa.
Os pesquisadores declaram ter conhecimento de que as informações pertinentes às técnicas do
projeto de pesquisa somente podem ser acessados por aqueles que assinaram o Termo de Confidencialidade,
excetuando-se os casos em que a quebra de confidencialidade é inerente à atividade ou que a informação
e/ou documentação já for de domínio público.
Santa Maria,............ de ............................... de 20.....
____________________________
____________________________
Assinatura Pesquisador
Assinatura Farmacêutico Bioquímico
Nome: ..................................................
Nome:....................................................
RG: ......................................................
RG:........................................................
83
ANEXOS II
84
85