Alterações imunológicas e epigenéticas em células natural killer de
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA LUANA SILVA SOARES Alterações imunológicas e epigenéticas em células natural killer de pacientes infectados pelo HIV-1 Ribeirão Preto 2016 LUANA SILVA SOARES Alterações imunológicas e epigenéticas em células natural killer de pacientes infectados pelo HIV-1 Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutora em Ciências. Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada. Orientadora: Prof.a Dr.a Fabiani Gai Frantz Ribeirão Preto 2016 AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE. Catalogação da publicação Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo Soares, Luana Silva Alterações imunológicas e epigenéticas em células natural killer de pacientes infectados pelo HIV-­1. Ribeirão Preto, 2016. 113 p. : il. ;; 30 cm Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada. Orientador: Frantz, Fabiani Gai. 1. Imunidade Inata 2. HIV/AIDS. 3. Metilação Global. 4. Células natural killer. SOARES, L. S. Alterações imunológicas e epigenéticas em células natural killer de pacientes infectados pelo HIV-1. Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutora em Ciências. Aprovada em: ___/___/___ Banca Examinadora Prof. Dr. ______________________________________ Instituição: ___________________ Julgamento: _____________________ Assinatura: __________________________________ Prof. Dr. ______________________________________ Instituição: ___________________ Julgamento: _____________________ Assinatura: __________________________________ Prof. Dr. ______________________________________ Instituição: ___________________ Julgamento: _____________________ Assinatura: __________________________________ Prof. Dr. ______________________________________ Instituição: ___________________ Julgamento: _____________________ Assinatura: __________________________________ Prof. Dr. ______________________________________ Instituição: ___________________ Julgamento: _____________________ Assinatura: __________________________________ Dedico este trabalho aos meus queridos pais Marcos e Roselene Soares pelo amor incondicional, pela força nos momentos em que mais precisei, sobretudo, por sonharem comigo um sonho que eu não achava possível de ser realizado. AGRADECIMENTOS À minha orientadora Profa. Dra. Fabiani Gai Frantz, pela oportunidade e confiança para a realização deste trabalho. Muito obrigada pelos ensinamentos, científicos e pessoais, e sobretudo, por contribuir na minha formação. Agradeço imensamente todo o apoio e crescimento que me foi proporcionado! À Profa. Dra. Lúcia Faccioli, pelos ensinamentos e oportunidades de discussões científicas, assim como pelo compartilhamento da infra-estrutura de seu laboratório. Ao Prof. Dr. Celio Lopes Silva, pelo auxílio desde o meu mestrado, ao disponibilizar a infraestrutura de seu laboratório para realização dos experimentos de clonagem, assim como sua excelente equipe técnica representada pela Aninha, Iza e Wendy, que não medem esforços para te ajudar e compartilhar conhecimento. Ao Prof. Dr. Valdes Roberto Bollela, por intermediar nosso acesso à Unidade Especial de Tratamento de Doenças Infecciosas (UETDI) do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto e estar sempre disposto a ajudar no que fosse preciso durante todo o desenvolvimento do projeto. À Dra. Fernanda Guioti Puga, por auxiliar na abordagem dos pacientes atendidos no Centro de Saúde Escola da FMRP/USP. À Profa. Dra. Cleni Marzocchi Machado, por disponibilizar a infra-estrutura de seu laboratório para realização dos experimentos de quimioluminescência. À Profa. Dra. Silvana Giuliatti, pela atenção e auxílio nas análises de bioinformática. Aos meus queridos pais e à minha irmã de coração Joana, por estarem sempre presentes em minha vida independente da distância, sobretudo, por me darem força e acreditarem em mim mais do que eu mesma. Amor é muito pouco perto do que sinto por vocês! A todos os outros membros da minha família, pelo apoio e carinho em todos os momentos, assim como pela alegria dos nossos reencontros. Ao Thiago Malardo (Pamonha!), por todos esses anos, que não foram poucos, de companheirismo, alegrias, conquistas, trapalhadas e sempre com muito carinho e amor envolvidos. Por me dar uma segunda família em Ribeirão Preto que não mediram esforços para que eu sempre me sentisse em casa. Muito obrigada também, Valéria, Euvaldo e Vanessa! Aos queridos amigos do LIIP e LIME, por compartilharem seu conhecimento, seja nas discussões científicas e/ou no dia a dia da bancada. Por fazerem as, muitas vezes, incansáveis horas de trabalho mais divertidas e produtivas. Agradeço especialmente ao Leonardo Galvão, Morgana Prado, Karina Zoccal, Francisco Silva e Mouzarllem Barros. Às amigas Fabiana Zambuzi (Fabiii), Priscilla Cardoso (Priii) e Verônica Brauer (Veee), por todo auxílio direto e/ou indireto para a realização deste trabalho. Pela amizade, risadas, e conversas infinitas sobre a vida. Obrigada por me aguentarem e por sempre compartilharem das minhas gordices. À Milena Sobral Espíndola, pela amizade e companhia de bancada, viagens e congressos. Pelos ensinamentos científicos, inclusive aqueles relacionados à escolha de um bom vinho! Ao Murilo Soares, pela atenção e auxílio nas análises epigenéticas relacionadas à metilação. À equipe técnica do laboratório, Caroline Fontanari, Thaísa Araújo, Alyne Galvão, Carlos Sorgi e Fabiana Morais, pelo apoio técnico essencial para manutenção do laboratório e realização dos experimentos. À Wendy, meu anjo da guarda desde que cheguei em Ribeirão Preto, por estar sempre presente e disposta a ajudar. Por todo carinho e preocupação, além dos conselhos científicos e pessoais. Pelo exemplo de profissional e, sobretudo, pelo auxílio nos experimentos de clonagem. Muito obrigada pela oportunidade de conviver com você e o Fernando! Vocês são muito especiais para mim! À Natália de Paula, querida amiga sempre disposta a me ouvir e a me ajudar, seja cientificamente ou pessoalmente. Pela amizade durante todos esses anos, e com certeza pela pipoca doce e o amendoim! Brincadeiras à parte, obrigada por ser essa inspiração de menina/mulher batalhadora e perseverante. Às meninas do Interpós, pelos ensinamentos futebolísticos, amizade e horas de diversão, sem as quais não conseguimos recuperar as energias para mais um dia de labuta. Aos funcionários da UETDI, por todo auxílio durante a abordagem dos pacientes e coleta de informações para a realização do estudo, em especial ao Chico. A todos os doadores de sangue, especialmente aos pacientes HIV-1+, que aceitaram participar do trabalho e que depositaram em nós parte de suas esperanças de um futuro melhor. À Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto e à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, por fornecerem a infra-estrutura para a realização deste trabalho. Ao Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, pela oportunidade de crescimento científico e pessoal proporcionada pela troca de conhecimentos. Agradeço também à secretária do programa, Ana Cristine, pelo auxílio, principalmente nas questões burocráticas. À FAPESP, pelo auxílio financeiro fundamental para realização deste trabalho (Processos FAPESP n° 2011/24026-3 e n°2011/12199-0). “In examining disease, we gain wisdom about anatomy and physiology and biology. In examining the person with disease, we gain wisdom about life." Oliver Sacks SOARES, L.S. RESUMO SOARES, L. S. Alterações imunológicas e epigenéticas em células natural killer de pacientes infectados pelo HIV-1. 2016. 113f. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2016. A infecção pelo HIV caracteriza-se como doença inflamatória crônica e está associada a diversas disfunções do sistema imune, as quais aumentam a suscetibilidade dos indivíduos infectados a infecções oportunistas. Dentre os componentes da imunidade inata, as células natural killer possuem importante função de defesa contra os vírus, no entanto seu fenótipo e função estão alterados durante a infecção pelo HIV. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar as mudanças fenotípicas e funcionais das células NK em pacientes infectados pelo HIV-1, sob tratamento antirretroviral ou não, e a relação destas alterações com possíveis modificações epigenéticas em genes do sistema imune nestas células. O perfil inflamatório sistêmico foi avaliado por meio da dosagem de mediadores plasmáticos, sendo que pacientes HIV-1+ apresentaram maior ativação imunológica, sobretudo os virgens de tratamento, o que foi constatado pelo aumento de moléculas pró-inflamatórias, principalmente: TNF-α, IP-10, sCD14 e sCD163. Ao avaliarmos especificamente a população de células NK, observou-se diminuição do número de células circulantes nos indivíduos infectados, tratados ou não, assim como alteração da proporção das subpopulações destas células. A expansão característica das células NK não funcionais foi observada tanto em pacientes não tratados, quanto naqueles sob tratamento antirretroviral, embora apenas nos indivíduos sob tratamento, houve recuperação parcial da função citotóxica celular. O fenótipo das células NK do grupo HIV-1+ sugeriu desenvolvimento do estado de exaustão celular, com poucas células desse grupo expressando os receptores característicos de NK como o NKp46 e alguns receptores de inibição (KIR2DL1, KIR2DL2/L3 e KIR2DL1), assim como pela inibição da função citotóxica e redução na produção de citocinas. Em contrapartida, as células NK do grupo TARV demonstraram maior estado de ativação verificado pelos altos níveis de produção de citocinas inflamatórias como TNF-α, e que poderia estar relacionado também ao maior tempo de infecção desses pacientes. Aliado a isso, as células NK dos indivíduos HIV-1+ sob tratamento apresentaram aumento da produção de espécies reativas de oxigênio, indicativo do estado de imunosenescência nessas células. Considerando as disfunções observadas, investigou-se a possível associação com modificações epigenéticas nessas células. A porcentagem de metilação global do DNA de células NK dos pacientes HIV-1+ sob estágio avançado da doença (AIDS) estava aumentada, embora o perfil de metilação do gene KIR2DL2 permaneceu inalterado entre os grupos. A frequências das enzimas de ativação e repressão da transcrição envolvidas nas mudanças epigenéticas também não demonstraram modulação evidente. Este é um dos primeiros estudos a demonstrar a ocorrência de modificações epigenéticas em células NK de pacientes HIV-1+, ainda que sutis. Além disso, os resultados aqui apresentados sugerem exaustão das células NK dos indivíduos recentemente infectados em contraste com possível estado de imunosenescência nos pacientes HIV-1+ sob tratamento antirretroviral e com maior tempo de infecção. Outros marcadores devem ser investigados para confirmação dessa hipótese e melhor compreensão da patogênese do HIV, com o intuito de fornecer informações e novas estratégias que possam contribuir para o reestabelecimento da homeostase das células do sistema imune, como as células natural killer. Palavras-chave: imunidade inata, HIV/AIDS, metilação global, células natural killer. SOARES, L.S. ABSTRACT SOARES, L. S. Immunological and epigenetic alterations in natural killer cells from patients infected with HIV-1. 2016. 113f. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2016. HIV infection is characterized as an inflammatory chronic disease and is associated to many dysfunctions of the immune system, which increase the susceptibility of infected individuals to opportunistic infections. Among the innate immunity components, natural killer cells have an important function of defense against viruses, however their function and phenotype are disturbed during HIV infection. In this way, the aim of this study was to evaluate phenotypic and functional changes in natural killer cells from HIV-1 infected patients, with or without antiretroviral treatment, and correlate these changes to epigenetic alterations in genes of the immune system on these cells. The systemic inflammatory profile was evaluated by quantifying the plasmatic mediators, wherein HIV-1+ patients showed higher immunologic activation, mainly the treatment-naïve patients, which was observed by the increase of proinflammatory molecules levels, mainly TNF-α, IP-10, sCD14 e sCD163. When we specifically evaluated the NK cell population, it was verified a reduction in the numbers of circulating NK cells from infected individuals, treated or not, as well as changing in the subpopulation proportions of these cells. The characteristic expansion of the non-functional NK cells was observed both in the treatment-naïve patients as well in the treated ones, although only in the treated HIV-1+ patients, there was a partial recovery of the cytotoxic function. The NK cell phenotype from HIV-1+ group suggested an exhaustion state of these cells, with fewer cells from this group expressing the characteristic receptors of NK such as NKp46 and some inhibitory receptors (KIR2DL1, KIR2DL2/L3 e KIR2DL1), as well as by the reduced cytotoxic function and cytokine production. In contrast, NK cells from TARV group showed higher activation state that was verified by the elevated levels of inflammatory cytokines production such as TNF-α, and that could also be related to the long-term infection on these patients. Besides this, NK cells from HIV-1 treated individuals exhibited increased production of oxygen reactive species, indicative of immunosenescence in these cells. Considering the observed dysfunctions, we investigated the possible association with epigenetic modifications in these cells. The percentage of global DNA methylation of NK cells from HIV-1+ patients on advanced stage of disease (AIDS) was increased, although the methylation profile of the KIR2DL2 gene remained unchanged between the groups. The frequency of enzymes of activation and repression of transcription involved in epigenetic changes also showed no apparent modulation. This is one of the first studies to show the occurrence of epigenetic modifications on NK cells from HIV-1+ patients, although these changes were subtle. Besides this, the results showed here suggested exhaustion of NK cells from recently infected individuals, in contrast to the potential immunosenescence state of HIV-1+ patients under antiretroviral treatment and with long-term infection. Other markers should be investigated in order to confirm this hypothesis, as well as contributing to the understanding of HIV pathogenesis, with the aim of providing information and new strategies which may help in the recovery of the immune cells homeostasis, such as natural killer cells. Key words: innate immunity, HIV/AIDS, global methylation, natural killer cells. SOARES, L.S. SUMÁRIO 1. Introdução .......................................................................................................................... 13 1.1. Histórico, etiologia e epidemiologia da infecção por HIV ............................................... 14 1.2. Patogênese do HIV ........................................................................................................... 16 1.3. Disfunções associadas às células natural killer durante a infecção por HIV .................... 18 1.4. Correlação entre mecanismos epigenéticos e doenças...................................................... 21 2. Objetivos ............................................................................................................................. 24 2.1. Objetivo Geral................................................................................................................... 25 2.2. Estratégias utilizadas para alcançar o objetivo ................................................................. 25 3. Delineamento Experimental.............................................................................................. 26 4. Material e Métodos ............................................................................................................ 28 4.1. Casuística .......................................................................................................................... 29 4.2. Obtenção de células mononucleares do sangue periférico ............................................... 29 4.3. Ensaio imunoenzimático para quantificação das moléculas CD14 e CD163 solúveis no plasma .................................................................................................................................. 30 4.4. Quantificação de citocinas e quimiocinas no plasma ....................................................... 30 4.5. Análise fenotípica das células NK e suas subpopulações por citometria de fluxo ........... 31 4.6. Separação das células NK por esferas magnéticas ........................................................... 31 4.7. Análise fenotípica das células NK por PCR em Tempo Real ........................................... 32 4.8. Avaliação funcional das células NK por ensaio de citotoxicidade ................................... 33 4.8.1. Cultivo das células alvo ................................................................................................. 33 4.8.2. Ensaio de citotoxicidade ................................................................................................ 33 4.8.3. Quantificação de citocinas e quimiocinas em sobrenadante de cultura ......................... 33 4.8.4. Quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio por quimioluminescência34 4.9. Avaliação de mudanças epigenéticas relacionadas às células NK.................................... 34 4.9.1. Determinação do padrão de metilação global do DNA cromossômico ......................... 34 4.9.2. Avaliação do padrão de metilação gene-específico ....................................................... 34 4.9.2.1. Análise da sequência genômica referente ao gene KIR2DL2 ..................................... 35 4.9.2.2. Quantificação da metilação do gene KIR2DL2 após modificação por bissulfito ....... 36 4.9.3. Quantificação da expressão de enzimas que promovem as alterações epigenéticas ..... 38 4.9.4. Imunoprecipitação da cromatina .................................................................................... 38 4.10. Análise estatística............................................................................................................ 40 5. Resultados ........................................................................................................................... 41 5.1. Características da população em estudo ........................................................................... 42 5.2. Análise de moléculas relacionadas à progressão da doença ............................................. 44 5.2.1. Quantificação das moléculas CD14 e CD163 solúveis no plasma ................................ 44 5.2.2. Quantificação de citocinas e quimiocinas do plasma .................................................... 46 5.2.3. Correlação entre os marcadores de ativação do plasma................................................. 49 5.3. Avaliação fenotípica das células NK e suas subpopulações ............................................. 53 5.3.1. Determinação da frequência de células NK e a distribuição de suas subpopulações .... 53 5.3.2. Análise da expressão dos receptores de ativação e inibição das células NK ................. 57 5.4. Avaliação funcional das células NK ................................................................................. 62 5.4.1. Análise da citotoxicidade das células NK purificadas ................................................... 62 5.4.2. Quantificação das citocinas e quimiocinas no sobrenadante do ensaio de citotoxicidade .............................................................................................................................................. 64 5.4.3. Correlações entre os parâmetros que caracterizam as disfunções das células NK nos indivíduos HIV-1+ ............................................................................................................... 68 5.4.4. Determinação da produção de granzima B pelas células NK ........................................ 74 SOARES, L.S. 5.4.5. Quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio pelas células NK ............ 76 5.5. Caracterização das modificações epigenéticas relacionadas às disfunções das células NK .............................................................................................................................................. 78 5.5.1. Determinação do padrão de metilação global do DNA das células NK ........................ 78 5.5.2. Avaliação do padrão de metilação específico do gene KIR2DL2/L3 ............................ 80 5.5.3. Análise da frequência de enzimas que promovem as modificações epigenéticas ......... 85 5.5.4. Investigação de modificações epigenéticas associadas às histonas em genes da resposta imune de células NK ............................................................................................................ 90 6. Discussão ............................................................................................................................. 93 7. Conclusões ........................................................................................................................ 104 8. Referências Bibliográficas ............................................................................................... 106 APÊNDICE........................................................................................................................... 114 APÊNDICE A – FIGURAS SUPLEMENTARES ................................................................ 115 ANEXOS ............................................................................................................................... 130 ANEXO I – MANUSCRITO PARA PUBLICAÇÃO .......................................................... 131 ANEXO II – Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa para Seres Humanos .................. 150 ANEXO III – Aprovação do Centro de Saúde Escola para coleta de amostras .................... 151 ANEXO IV – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – Indivíduos Controles .......... 152 ANEXO V – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – Pacientes HIV-1+ ................ 154 SOARES, L.S. 1. Introdução 13 SOARES, L.S. Introdução 1. Introdução 1.1. Histórico, etiologia e epidemiologia da infecção por HIV A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS do inglês Acquired immune deficiency syndrome) foi primeiramente reconhecida como doença no início dos anos 80 [1] e desde então, diversos grupos de pesquisa têm se dedicado ao estudo dessa patologia em busca de sua prevenção e cura efetivas. Os primeiros casos de AIDS foram descritos em 1981 em homens homossexuais com infecção pulmonar rara por Pneumocystis carinii [2]. Em seguida, surgiram relatos de casos de sarcoma de Kaposi que também foram associados à AIDS [3]. Nesse cenário, em 1982, o Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) dos Estados Unidos passou a definir os casos de AIDS a partir da “ocorrência de pelo menos uma doença preditiva de um defeito na imunidade celular e de causa desconhecida para diminuição da resistência a essa doença. Tais doenças incluíam pneumonia por Pneumocystis carinii, sarcoma de Kaposi e outras infecções oportunistas” [1]. De junho de 1981 a setembro de 1982, aproximadamente 75% dos casos de AIDS ocorreram entre homens homossexuais ou bissexuais e havia evidências de possível transmissão sexual, levando essa síndrome a ser inicialmente chamada de GRID, do inglês Gay-related immune deficiency [4]. Essa denominação alimentou grande parte do preconceito e estigma social que perduram, embora de forma mais discreta, até os dias atuais. Considerando que a falta de informação pode induzir a atitudes e julgamentos errôneos, a evolução do conhecimento sobre a AIDS foi e é de extrema importância no contexto da saúde mundial. Até então não havia sido isolado o agente etiológico responsável pela síndrome, até que em 1983, dois principais grupos de pesquisadores (liderados por Luc Montagnier e Robert Gallo) descreveram o isolamento de um novo retrovírus, o qual foi posteriormente definido como agente causador da AIDS e denominado HIV, do inglês Human Immunodeficiency Virus [5-7]. O grupo do pesquisador francês Luc Montagnier inicialmente nomeou o vírus de LAV, do inglês lymphadenopathy-associated virus [7], e a ele foi creditado o primeiro relato verdadeiro do isolamento desse vírus, rendendo a ele e à Françoise Barré-Sinoussi, pesquisadora de seu grupo, o prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 2008. A caracterização molecular do HIV ocorreu em 1985 e forneceu a base para o estudo da diversidade, origem e evolução desse vírus [8-10]. O HIV é um vírus pertencente ao gênero Lentivirus, da família Retroviridae. Existem duas linhagens principais de vírus conhecidas por causar a doença em humanos, o HIV do tipo 1 e 2, no entanto HIV-1 é descrito como mais 14 SOARES, L.S. Introdução comum e mais patogênico. Acredita-se que o HIV-1 tenha surgido na espécie humana após a manipulação da carne de chimpanzé (Pan troglodytes troglodytes) infectada com o vírus da imunodeficiência símia (SIV) por caçadores selvagens. Esse evento teria ocorrido entre 1900 e 1930 próximo ao sudeste de Camarões, na região ocidental da África Central [11, 12]. Por outro lado, o HIV-2 teria se originado do SIV proveniente do macaco verde africano “sooty mangabey” (Cercocebus atys), o qual era comumente caçado na África ocidental [13]. Outro fato importante na história da AIDS/HIV foi a aprovação do AZT (zidovudina) como primeiro antirretroviral licenciado para uso em humanos em 1987 [14]. A partir de então, surgiram diversos medicamentos antirretrovirais que auxiliaram na contenção da expansão da infecção, mas sem levar à cura [15]. Vale ressaltar que o Brasil foi um dos países pioneiros na acessibilidade ao tratamento após promulgação da Lei 9.313, em 1996, que garantiu o direito e o acesso gratuito à terapia antirretroviral a todos os indivíduos portadores do HIV [16]. Apesar de haver tratamento disponível que auxilia no controle do desenvolvimento da doença, a cura ainda é um assunto muito discutido. O primeiro relato de cura da infecção por HIV ocorreu em 2008 e é conhecido como o “paciente de Berlim” [17]. Embora existam outros possíveis casos, estes são denominados de cura funcional, ou seja, supressão da replicação viral na ausência de tratamento, entretanto, sem a completa eliminação do reservatório viral [18, 19]. Enquanto diversos grupos de pesquisa têm se empenhado na busca da cura e prevenção efetivas, tem-se falado bastante em profilaxia pré e pós exposição como alternativas para frear o avanço da epidemia da AIDS no mundo [20]. Apesar de diversos esforços, o Programa Conjunto das Nações Unidas sobre HIV/AIDS (UNAIDS) relatou a incidência de 2 milhões de casos de infecção por HIV em 2014, e a morte de 1,2 milhões de pessoas em decorrência da AIDS. Estima-se que existam aproximadamente 36,9 milhões de pessoas com HIV no mundo, sendo a maior prevalência na África Subsaariana (aproximadamente 25,8 milhões de pessoas) [21]. No Brasil, desde o início da epidemia de AIDS até junho de 2015, foram registrados em torno de 798 mil casos, sendo a maior concentração nas regiões Sudeste (53,8%) e Sul (20%). Por outro lado, a região Sudeste é a única a apresentar tendência de queda no número de casos nos últimos dez anos, enquanto as regiões Norte, Nordeste e Centro-Oeste ainda demonstram crescimento significativo. Quanto à mortalidade por AIDS, até dezembro de 2014, havia sido reportado cerca de 291 mil óbitos em todo o Brasil [22]. Em 2014, foram definidas três metas para o monitoramento clínico das pessoas com HIV como uma das principais ferramentas para acompanhamento da evolução da epidemia. 15 SOARES, L.S. Introdução Essas metas ficaram conhecidas como 90-90-90, cujo objetivo é atingir, até 2020, o diagnóstico de no mínimo 90% das pessoas infectadas por HIV, sendo que dessas pessoas, 90% deveriam estar em tratamento antirretroviral, e 90% dessas últimas estariam em supressão viral. Essas metas também são denominadas de cascata de cuidado contínuo e no Brasil, estimou-se que, ao fim de 2014, 83% das pessoas com HIV tinham sido diagnosticadas, e dessas, 52% estavam em tratamento. Das pessoas sob tratamento antirretroviral, 46% apresentavam supressão viral por pelo menos seis meses após início da terapia [22]. Esses dados sugerem um cenário relativamente positivo quanto ao controle da doença no Brasil, embora não seja o ideal. Para tanto, faz-se necessário a conscientização da população e adoção de política públicas, aliados a estudos cada vez mais detalhados visando a maior compreensão da patogênese do HIV. 1.2. Patogênese do HIV O curso da infecção por HIV apresenta variações entre as pessoas, no entanto, a maioria delas desenvolvem doenças oportunistas que são utilizadas como indicativo do quadro de imunodeficiência [23]. A principal via de transmissão do vírus é a sexual, podendo também ocorrer a transmissão vertical, por compartilhamento de seringa ou agulha contaminada, transfusão sanguínea e em menor número, por acidente com material perfuro-cortante não esterilizado [24]. Acredita-se que as primeiras células a serem infectadas sejam os linfócitos T CD4+ de memória residentes, mas também pode ocorrer infecção de outras células como os monócitos e macrófagos, que podem servir como reservatórios virais; e células dendríticas, que podem transportar o vírus e promover a infecção de outras células nos linfonodos drenantes [25]. A entrada do vírus na célula ocorre após ligação da proteína viral gp120 com a molécula CD4, seguida da interação entre a subunidade gp41 com os correceptores CCR5 ou CXCR4 presentes na membrana das células alvo, propiciando assim a fusão do envelope viral à membrana celular. No interior da célula, o RNA viral é transformado em DNA pela transcriptase reversa do vírus e a partir da maquinaria celular são geradas novas partículas virais com potencial de infectar outras células [26]. A partir de estudos realizados em pacientes, observou-se que aproximadamente dez dias após a transmissão, o RNA viral passa a ser detectado no plasma e em seguida, o vírus alcança os linfonodos drenantes, onde pode infectar outras células T, assim como células dendríticas e células B. Dentro de 21 a 28 dias após a infecção, observa-se a maior carga viral 16 SOARES, L.S. Introdução no sangue, sendo que neste período podem aparecer os primeiros sintomas associados à doença e ocorre redução significativa das células T CD4+ presentes na mucosa [27]. A infecção por HIV caracteriza-se não somente pelos altos níveis de replicação viral e depleção de linfócitos T CD4+ de forma sistêmica, mas também pela disfunção generalizada do sistema imune correlacionada a um estado de inflamação crônica que está fortemente associado à progressão do paciente à AIDS. Esse perfil inflamatório permanece, mesmo que em níveis menores, nos pacientes que estão sob tratamento antirretroviral evidenciando a participação de outros fatores na indução desse perfil [28, 29]. Em 2006, Brenchley [30] e colaboradores demonstraram a ocorrência do fenômeno de translocação microbiana devido à quebra da integridade da mucosa gastrintestinal, que foi proporcionada pela depleção maciça de linfócitos T CD4+ naquela região após a infecção pelo HIV. Dessa forma, esse fenômeno amplifica a inflamação sistêmica observada nos pacientes HIV-1+, sendo sugerido alguns marcadores da fase aguda da infecção, como elevados níveis plasmáticos de IP-10, IL-10 e TNF-α, os quais poderiam ser considerados indicadores da progressão rápida da doença, em paralelo à contagem de linfócitos T CD4+ e carga viral [31]. Em pacientes com boa adesão ao tratamento antirretroviral, é possível controlar a replicação viral e recuperar a contagem de linfócitos T CD4+, no entanto, por não existir cura efetiva, o paciente deve tomar a medicação por toda a vida. Além disso, a resposta imune nestes indivíduos não é completamente restaurada e tem-se observado aumento da ocorrência de co-morbidades não relacionadas à infecção por HIV como: doenças cardiovasculares, neurocognitivas, osteoporose, doenças relacionadas ao fígado e rim, assim como alguns tipos de câncer. Considerando que muitas dessas patologias ocorrem principalmente em indivíduos idosos, tem-se especulado que a infecção por HIV possa promover de alguma forma o avanço do envelhecimento natural [32]. Cada célula possui funções específicas na resposta imune ao HIV e, na maioria das vezes, suas funções tornam-se alteradas como influência direta e/ou indireta do vírus. A maioria das células descritas por desempenhar funções protetoras ao início da infecção por HIV, como as células dendríticas e células T CD8+, passam a exibir disfunções com o decorrer da infecção dificultando o controle da replicação viral e contribuindo para o desenvolvimento de infecção com caráter sistêmico [33, 34]. Estes fatores associados à redução significativa de linfócitos T CD4+ tornam os indivíduos infectados por HIV suscetíveis a diversas infecções oportunistas que dependem da imunidade celular para seu controle efetivo [35]. Diante desse painel, outras células do sistema imune passaram a ser estudadas no 17 SOARES, L.S. Introdução contexto da infecção por HIV, visto que as principais células associadas à imunidade adaptativa (linfócitos T CD4+ e T CD8+) estão com suas funções diminuídas, o que dificulta o controle efetivo da infecção por HIV, assim como de infecções oportunistas. Células classicamente caracterizadas como sendo da imunidade inata têm sido alvo de vários estudos por serem rapidamente ativadas e tornarem-se funcionais logo ao início das infecções [36]. Além disso, recentemente tem sido demonstrado um fenótipo de memória associado à função destas células, especificamente das células NK [37], caracterizando-as como importante alvo de estudo na infecção por HIV. 1.3. Disfunções associadas às células natural killer durante a infecção por HIV As células NK foram primeiramente identificadas em 1975 e descritas como linfócitos grandes e granulares com citotoxicidade natural contra células tumorais [38]. Atualmente, são classificadas como células inatas linfóides pertencentes ao grupo 1, com base na expressão dos fatores de transcrição: T-box, EOMES e T-bet; e na produção de IFN-γ [39]. Além de atuarem na defesa contra tumores, as células NK constituem importante mecanismo de proteção a infecções, principalmente aquelas causadas por vírus [40]. Em humanos, as células NK representam de 5 a 15% dos linfócitos encontrados no sangue periférico e são fenotipicamente caracterizadas como CD3-CD56+ [41]. Também expressam a molécula CD16 (receptor para a porção Fc dos anticorpos) e conforme a expressão de CD16 e CD56, as células NK são subdivididas em subpopulações funcionalmente distintas. A subpopulação CD56dimCD16+ corresponde a 90% das células NK encontradas no sangue periférico e baço e possui função predominantemente citotóxica. Enquanto as células NK CD56brightCD16- estão presentes em maior quantidade nos linfonodos e estão envolvidas na produção de citocinas como IFN-γ, entre outras [34]. A função efetora desempenhada pelas células NK depende sobretudo do balanço dos sinais advindos de seus receptores de ativação e inibição (KAR – Killer Activation Receptor e KIR – Killer Inhibtory Receptor). Os receptores de ativação reconhecem moléculas que passam a ser expressas nas células sob condições de estresse, assim como substâncias derivadas dos patógenos. Enquanto os receptores de inibição interagem com as moléculas de MHC de classe I, sendo que essa interação além de estar envolvida no processo de ativação das células NK, também é importante durante o desenvolvimento dessa população celular [42, 43]. 18 SOARES, L.S. Introdução Dentre as principais funções efetoras das células NK está a lise de células alvo infectadas antes mesmo do recrutamento das células da imunidade adaptativa [44], destacando a importância dessas células na proteção do hospedeiro durante a infecção por HIV, assim como em infecções de caráter oportunista. No entanto, ao longo dos anos têm sido descritas algumas disfunções das células NK em pacientes infectados pelo HIV, como a observação de que havia diminuição dos mecanismos de lise celular mediada por essas células conforme a doença progredia [45-47]. Em 2003, Portales et al. [48] reportaram a diminuição das reservas de perforina e granzima nas células NK de indivíduos HIV-1+, o que poderia explicar a diminuição da citotoxicidade celular observada nestes pacientes. Além disso, a viremia persistente em alguns indivíduos tem sido associada à expressão anormal de vários receptores nas células NK, como a menor expressão dos receptores de citotoxicidade natural (NCRs), entre eles: NKp46 e NKp30. Esse fato pode estar associado à diminuição dos mecanismos citotóxicos desencadeados pelas células NK e consequente redução da eliminação de células infectadas in vivo [49]. Por outro lado, a maioria dos trabalhos demonstram aumento da expressão dos receptores inibitórios na superfície das células NK de indivíduos infectados pelo HIV-1, entre eles: KIR2DL1, KIR2DL2 e KIR3DL1, principalmente nos indivíduos com carga viral detectável [50, 51]. No entanto, os resultados quanto à expressão desses receptores nas células NK variam de um estudo para outro conforme o estágio da doença e a subpopulação analisada. Em resumo, a maior expressão dos receptores inibitórios e menor dos de ativação, durante a infecção por HIV-1, contribuem para um estado de supressão das células NK, comprometendo a resposta imune destes indivíduos. Outra função alterada em células NK de pacientes HIV-1+ é a produção de citocinas e quimiocinas. Em indivíduos com carga viral detectável, observou-se menor produção de IFNγ, TNF-α e GM-CSF pelas células NK, influenciando principalmente na maturação e migração de células dendríticas [52]. Dessa forma, há diminuição da diferenciação da resposta imune para o padrão Th1 e a interação entre essas duas populações celulares é comprometida. Além disso, células NK possuem importante função de eliminar células dendríticas imaturas, o que também diminui durante a infecção pelo HIV-1, causando o acúmulo destas células imaturas nos indivíduos infectados [34]. Em relação às quimiocinas, a produção de CCL3, CCL4 e CCL5 pelas células NK auxilia no bloqueio da entrada de vírus com tropismo para o correceptor CCR5. A menor produção dessas quimiocinas também contribui para o aumento da replicação viral, evidenciando outra importante função das células NK durante a infecção pelo HIV-1 [53]. 19 SOARES, L.S. Introdução Um dos primeiros estudos a reportarem mudanças fenotípicas nas células NK durante a infecção pelo HIV-1 utilizando a técnica de citometria de fluxo foi publicado em 1995 [54]. Dentre os principais resultados estava o relato da diminuição das células NK CD56+CD16+ citotóxicas e a expansão daquelas CD56-CD16+. Esse último fenótipo foi posteriormente atribuído a células NK denominadas não funcionais, caracterizadas pela expressão de altos níveis de receptores inibitórios, menor produção de citocinas e por possuir defeitos na lise de células alvo infectadas [52]. Acredita-se que grande parte das disfunções associadas às células NK durante a infecção pelo HIV-1 seja devido à expansão dessa subpopulação não funcional. Em resumo, o vírus da imunodeficiência humana está envolvido na indução de diversas alterações fenotípicas e funcionais das células NK. Esses efeitos podem ser desencadeados mediante a ligação direta do vírus aos receptores de quimiocinas, ou como resultado da ativação generalizada do sistema imune pelo vírus, ou ainda após infecção direta das células NK [55]. Esta última possibilidade tem sido descrita em um subtipo de células NK, que além de expressar os receptores CXCR4 e CCR5, passa também a expressar o receptor CD4, propiciando assim a entrada do vírus na célula NK [56]. Quando no interior das células, em geral, o vírus é capaz de modular a expressão das moléculas de HLA, diminuindo especificamente a expressão dos HLA-A e B, mas não dos HLA-C e E. Dessa forma, a célula infectada escapa dos mecanismos efetores dos linfócitos T CD8+ direcionados aos epítopos restritos aos HLA-A/B, assim como da morte mediada pelas células NK, pois estas células expressam receptores inibitórios que reconhecem os HLA-C/E. Este mecanismo de evasão é desencadeado pela proteína Nef (fator negativo) do vírus, que também está envolvida na diminuição da expressão de ligantes dos receptores de NK (NKG2D) como MICA, ULBP1 e ULBP2 nas células infectadas [57, 58]. Alguns estudos têm descrito a associação entre a expressão de certos receptores de NK e moléculas de HLA com o maior controle da replicação viral e, portanto, menor progressão da doença desencadeada por HIV [59, 60]. Alter et al. [61] reportaram, em 2009, a expansão de células NK KIR3DS1+ e KIR3DL1+ durante a infecção de indivíduos com HIV-1 e que expressavam o HLA-Bw4-80I. Essa observação estava relacionada à supressão da replicação viral em células alvo que expressavam essa molécula de HLA. Os receptores do tipo KIR constituem um grupo de moléculas altamente polimórficas, sendo que alguns destes genes encontram-se silenciados, enquanto outros não. Durante o desenvolvimento e maturação das células NK ocorrem modificações em nível de expressão gênica, denominadas mudanças epigenéticas, como a demetilação dos genes KIR para que ocorra sua expressão nas células NK [62]. Considerando que na infecção por HIV são observadas modificações na expressão 20 SOARES, L.S. Introdução de diversos receptores do tipo KIR, assim como de outras moléculas, sugere-se que mudanças epigenéticas possam estar envolvidas nesse processo. Num estudo conduzido com vietnamitas usuários de drogas e que permaneciam soronegativos mesmo após vários anos de exposição ao HIV, verificou-se maior capacidade efetora das células NK quanto a sua atividade citolítica e produção de quimiocinas e citocinas do que em indivíduos HIV soropositivos [63]. E uma das hipóteses levantadas quanto a esta atividade aumentada das células NK vista em indivíduos expostos, mas não infectados, foi a possível associação com as características genéticas do indivíduo que favorecem a expressão de certos receptores e moléculas nas células NK. Essas observações também foram feitas em indivíduos HIV-1+ considerados progressores lentos e naqueles denominados controladores de elite [51]. Considerando que muitas das alterações descritas até aqui podem ser resultado também de modificações epigenéticas, justifica-se a importância do estudo destes mecanismos na infecção por HIV, especificamente em relação às alterações funcionais desencadeadas como consequência destas modificações nas células NK. 1.4. Correlação entre mecanismos epigenéticos e doenças O termo epigenética refere-se aos mecanismos que controlam a expressão gênica, sem modificar a sequência de DNA dos organismos. As modificações epigenéticas são potencialmente herdáveis e a importância do seu estudo tem sido associada à observação de que muitas doenças se desenvolvem após a ocorrência de mudanças epigenéticas errôneas. Os mecanismos epigenéticos incluem modificações químicas no DNA e/ou nas suas histonas associadas, resultando na mudança da acessibilidade física do DNA aos fatores transcricionais. Tais modificações podem ser agrupadas em quatro principais categorias: metilação do DNA, alterações na histona, posicionamento dos nucleossomos, e a regulação do DNA por RNAs não codificantes (Ex.: microRNAs) também é considerada um mecanismo epigenético [64, 65]. Os mecanismos envolvidos na regulação epigenética dos produtos gênicos podem ser generalizados como ativador transcricional ou silenciador gênico. Sabe-se, por exemplo, que a acetilação da histona 4 (AcH4) ou a tri-metilação da lisina 4 da histona 3 (H3K4me3) geralmente aumentam o acesso ao DNA e estão envolvidas com ativação gênica [66], enquanto a di- ou tri-metilação da lisina 27 da histona 3 (H3K27me2 ou me3) fecham o DNA resultando em silenciamento gênico [67]. Dentre as enzimas envolvidas em tais modificações estão as histona-acetiltransferases (HATs), histona-metiltransferases (HMTs), histona 21 SOARES, L.S. Introdução quinases (HKs), entre outras [68]. Já os eventos de metilação do DNA e a regulação pelos microRNAS estão relacionados principalmente ao silenciamento gênico [65]. Em doenças auto-imunes, câncer e desordens neurológicas já foram relatadas várias alterações epigenéticas, as quais foram associadas ao aparecimento ou agravamento das doenças [65]. Além disso, estudos recentes demonstraram o envolvimento de mudanças epigenéticas no direcionamento do fenótipo de macrófagos, assim como na função de células dendríticas durante a sepse [69-71]. Até 2011, ainda eram poucos os trabalhos publicados com o assunto epigenética e a relação patógeno versus hospedeiro [65]. Em relação ao patógeno, existem várias evidências do envolvimento dos mecanismos epigenéticos para sua manutenção e sobrevivência no hospedeiro. Por exemplo, a acetilação de histonas em Toxoplasma gondii está relacionada à mudança entre os estágios replicativo e não replicativo desse patógeno [72]. O controle epigenético também tem sido associado à expressão de fatores de virulência em protozoários (Ex.: Plasmodium falciparum) e em bactérias (Ex.: Samonella enterica) [73, 74]. Essas observações são de grande importância, pois sugerem novas possibilidades de intervenções terapêuticas em doenças infecciosas. As modificações epigenéticas também podem ocorrer no hospedeiro como consequência da infecção por determinado patógeno. Durante a infecção por Mycobacterium tuberculosis, a expressão de genes induzidos por IFN-γ é reprimida via acetilação de histonas nos macrófagos alveolares, o que se correlaciona ao desenvolvimento da doença crônica em alguns pacientes [75]. Interessantemente, na infecção pelo vírus Influenza, a proteína viral NS1 possui uma sequência de aminoácidos similar à cauda da histona H3 de humanos. Dessa forma, essa proteína “sequestra” o fator de transcrição hPAF1 do hospedeiro, suprimindo a produção de proteínas antivirais e consequentemente a resposta imune contra o vírus [76]. No contexto da infecção por HIV-1, já foram realizados estudos caracterizando o epigenoma das principais células alvo durante a infecção (células T CD4+, monócitos e macrófagos). Vale ressaltar que o vírus da imunodeficiência humana foi o primeiro patógeno a ser descrito como indutor de mudanças epigenéticas nas células hospedeiras. Sabe-se que as proteínas Nef e Tat induzem aumento da enzima DNA metiltransferase 1 (DNMT1), favorecendo a metilação do DNA e consequente repressão gênica [77]. Os mecanismos de regulação epigenética mais estudados na infecção por HIV-1 são aqueles relacionados à indução e manutenção da latência viral. Essa latência é mantida em parte pela atividade da enzima histona deacetilase (HDAC), envolvida na remoção de grupos acetil das histonas, afetando dessa forma a expressão gênica [78]. Diante desse conhecimento, 22 SOARES, L.S. Introdução há alguns anos sugeriu-se a utilização do medicamento vorinostat como aliado ao tratamento convencional contra o HIV. O vorinostat é um inibidor de HDAC utilizado na terapia de alguns tipos de câncer. Essa sugestão de tratamento recebeu o nome de “shock and kill”, pois com o emprego do vorinostat ocorreria a produção de novas partículas virais que seriam retiradas da latência e as drogas antirretrovirais atuariam eliminando tais vírus [79]. Essa estratégia abriu novas perspectivas de tratamento da infecção por HIV aplicando os conhecimentos adquiridos na área de epigenética. Diante desse painel, consideramos que o estudo das alterações epigenéticas em genes relacionados à resposta imune efetora das células NK pode ter um papel chave na elucidação dos mecanismos pelos quais o HIV influencia na função dessas células, além de fornecer subsídios para novas intervenções terapêuticas. 23 SOARES, L.S. 2. Objetivos 24 SOARES, L.S. Objetivos 2. Objetivos 2.1. Objetivo Geral Avaliar as mudanças fenotípicas e funcionais das células NK em pacientes infectados pelo HIV-1, sob tratamento antirretroviral ou não, e a relação destas alterações com possíveis modificações epigenéticas em genes do sistema imune. 2.2. Estratégias utilizadas para alcançar o objetivo a) Caracterização fenotípica das células NK de pacientes HIV-1+, em tratamento antirretroviral ou não, por meio da comparação da expressão de receptores específicos e distribuição das subpopulações celulares em relação aos indivíduos controle; b) Avaliação da função efetora de células NK de pacientes HIV-1+, em tratamento antirretroviral ou não, a partir de ensaios funcionais in vitro e quantificação da produção de moléculas solúveis (citocinas, quimiocinas, granzima B e espécies reativas de oxigênio); c) Análise do padrão de metilação global e específico de genes relacionados aos receptores das células NK de pacientes HIV-1+, em tratamento antirretroviral ou não; d) Determinação da expressão de enzimas relacionadas à ativação e repressão gênica em células NK de pacientes HIV-1+, em tratamento antirretroviral ou não; e) Análise das modificações de histonas associadas à ativação ou repressão dos genes relacionados à resposta imune das células NK. 25 SOARES, L.S. 3. Delineamento Experimental 26 Delineamento Experimental Figura1. Esquema representativo do delineamento experimental realizado no presente trabalho. SOARES, L.S. 27 SOARES, L.S. 4. Material e Métodos 28 SOARES, L.S. Material e Métodos 4.Material e Métodos 4.1. Casuística O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo em reunião realizada em 13/08/2012 (Processo HCRP n° 9818/2012). A coleta das amostras do grupo experimental foi realizada a partir de pacientes soropositivos para HIV-1, sob tratamento antirretroviral ou não, atendidos na Unidade do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP-USP). Como critérios de inclusão, foram selecionados pacientes HIV-1+ virgens de tratamento (n=28) e pacientes HIV-1+ em uso regular da terapia antirretroviral por no mínimo 6 meses (n=29). E como critérios de exclusão, foram excluídos do estudo todos os pacientes menores de 18 anos e maiores de 65 anos de idade, assim como os que não consentiram em participar da pesquisa. Os pacientes foram abordados no momento da consulta pelo clínico e convidados a participar voluntariamente do estudo, registrando a sua autorização por meio da assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa do HCFMRP-USP (Anexo V). Como controle, obtivemos amostras de sangue de indivíduos com sorologia negativa para HIV (n=30) com idade entre 18 e 65 anos atendidos regularmente no Hemocentro de Ribeirão Preto e concordantes com o termo de consentimento livre e esclarecido aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa do HC-FMRP-USP (Anexo IV). 4.2. Obtenção de células mononucleares do sangue periférico Foram coletadas amostras de sangue total (40 mL cada) dos indivíduos via punção venosa em tubo contendo heparina sódica (Vacutainer®; Becton, Dickinson and Company). Em seguida, procedeu-se à separação do plasma após centrifugação a 400 x g por 10 min a 20°C. Homogeneizou-se o sangue e diluiu-se em tampão fosfato salina (PBS) pH 7,4 na proporção de 1:2. As amostras de sangue diluídas foram aplicadas cuidadosamente sobre a solução de Ficoll-PaqueTM PLUS, d=1,078 g/mL (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden). Logo após, as amostras foram centrifugadas a 640 x g por 30 minutos a 20°C para separação da camada de células mononucleares. As células presentes na interfase do gradiente 29 SOARES, L.S. Material e Métodos de separação foram cuidadosamente coletadas, transferidas para um novo tubo e lavadas duas vezes pela adição de 50 mL de PBS seguida de centrifugação a 400 x g por 10 min a 20°C. Por fim, ressuspendeu-se o precipitado celular em 5 mL de meio RPMI-1640 incompleto e procedeu-se à contagem das células em câmara de Neubauer, utilizando o corante azul de Tripan para análise da viabilidade celular. 4.3. Ensaio imunoenzimático para quantificação das moléculas CD14 e CD163 solúveis no plasma As amostras de plasma separadas no dia da coleta e armazenadas a -20°C foram descongeladas e centrifugadas a 1000 x g por 10 min a 10°C. Em seguida, utilizou-se 100 µL da amostra previamente diluída para dosagem por ELISA das moléculas CD14 (diluição de 1000x) e CD163 (diluição de 100x) solúveis com a utilização de kit específico (DuoSet ELISA Development System, R&D). As concentrações foram determinadas empregando-se anticorpos de captura, citocinas-padrão e anticorpos associados à biotina e amplificados com estrepto-avidina-peroxidase. Como substrato foi utilizado tetrametilbenzidina (TMB) e a reação bloqueada adicionando-se ácido sulfúrico 1M aos poços. A leitura das amostras foi realizada em espectrofotômetro a 450 nm. 4.4. Quantificação de citocinas e quimiocinas no plasma Para determinação da quantidade de citocinas e quimiocinas presentes no plasma foi empregada a plataforma multiplex customizada (MILLIPLEX MAP magnetic bead-based multi-analyte panels, Cat #HCYTOMAG-60K, Merck Millipore®) e analisada em leitor de placas próprio (Luminex Multiplexing Instrument - EMD Millipore, Luminex Corporation, Austin, TX, USA). Segundo instruções do fabricante, foram detectadas as seguintes citocinas: IFN-γ, IL-10, IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-α2, IL-12p70, IL-17A, IL-4, IL-5; e as quimiocinas: MCP-1, RANTES, IP-10, MIP-1α, MIP-1β, e GM-CSF. As amostras foram adicionadas às placas específicas para o ensaio e diluídas em tampão fornecido pelo kit e, após a incubação com microesferas magnéticas fluorescentes recobertas por anticorpos de captura específicos para as citocinas listadas, realizou-se a leitura das amostras no equipamento. Os dados adquiridos foram analisados por meio do software Milliplex Analyst v3.5 (Millipore; VigeneTech Inc., Boston, EUA) utilizando uma curva logística de três parâmetros. 30 SOARES, L.S. Material e Métodos 4.5. Análise fenotípica das células NK e suas subpopulações por citometria de fluxo A partir de 5x105 células mononucleares do sangue periférico realizou-se a marcação de moléculas de superfície para caracterização das células NK e suas subpopulações. Para tanto, as células foram resssuspendidas em 100µL de PBS contendo 2% de SBF e a esse volume foi adicionado 20µL da solução de anticorpos previamente diluída. Foram utilizados os seguintes anticorpos: CD3 PerCPCy5.5 (clone SK7), CD56 APC (clone NCAM 16.2), CD16 PE-Cy7 (clone 3G8), NKp46 PE (clone 9E2), NKB1 FITC (clone DX9), NKAT2 PE (clone DX27) e CD158a FITC (clone HP-3E4), adquiridos da BD Biosciences. Os anticorpos foram titulados para utilização da melhor diluição no experimento, sendo os volumes padronizados para cada um de: 5 µL (CD3), 3µL (CD56, NKp46, NKB1, NKAT2 e CD158a) e 2µL (CD16). A marcação foi realizada por 25 min a 4°C, no escuro. Após o tempo de incubação, adicionouse 2 mL de PBS contendo 2% de Soro Bovino Fetal (SBF) em cada tubo. Os tubos foram centrifugados por 10 min a 400 x g, 4°C e o sobrenadante foi descartado. Em seguida, as células foram fixadas em 200 µL de PBS com 1% de formaldeído e mantidas a 4°C até o momento da aquisição. Foram adquiridos 100.000 eventos de cada amostra no citômetro FACS Canto II (BD Biosciences, San Diego, EUA) e a análise realizada no software FlowJo versão 7.6.5. 4.6. Separação das células NK por esferas magnéticas Após obtenção das células mononucleares do sangue periférico, a suspensão celular foi utilizada como amostra para separação magnética das células NK. Para tanto, após contagem, as células mononucleares foram ressuspendidas em solução tampão de PBS livre de Ca2+ e Mg2+ contendo 2mM de EDTA e 0,5% de SBF na proporção de 40 µL para cada 107 células totais. Em seguida, acrescentou-se 10 µL da solução de anticorpos humanos monoclonais anti-CD56 acoplados a esferas magnéticas (MACS, Miltenyi Biotec Inc., Auburn CA, USA) para cada 107 células totais e incubou-se a 4°C por 15 min. A seguir, as células foram lavadas pela adição de 2 mL do tampão descrito acima e centrifugadas a 400 x g por 10min. Descartou-se o sobrenadante, ressuspendeu-se o precipitado em 500 µL do tampão para cada 108 células totais e procedeu-se à separação magnética (seleção positiva), segundo instruções do fabricante utilizando as colunas LS (Miltenyi Biotec Inc., Auburn CA, USA). As células NK obtidas foram contadas em câmara de Neubauer para análise do rendimento do método de separação e utilizadas nos ensaios subsequentes. Para verificar a 31 SOARES, L.S. Material e Métodos pureza da separação, foi realizada citometria de fluxo empregando-se os anticorpos CD3 PerCPCy5.5 (clone SK7) e CD56 APC (clone NCAM 16.2). Na figura 2 abaixo está demonstrada pureza obtida de um dos experimentos realizados. Observa-se que as células NK obtidas após separação correspondiam a 74,3% (Q1) das células dentro da população de linfócitos. Figura 2. Análise da pureza das células NK obtidas após separação magnética. 4.7. Análise fenotípica das células NK por PCR em Tempo Real Após obtenção das células NK, o precipitado celular foi armazenado a -80°C até posterior extração do RNA total utilizando-se o reagente TRIzol (Ambion®) segundo instruções do fabricante. O RNA extraído foi quantificado no fluorímetro Qubit 2.0 e estocado a -80ºC. O RNA obtido foi tratado com Turbo DNase (Ambion®) segundo o protocolo do fabricante. O DNA complementar foi sintetizado utilizando-se o High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). A partir de 50 ng da amostra de RNA convertido em cDNA, foi realizada a reação em cadeia da polimerase em tempo real empregando-se a sonda TaqMan® Fast da Applied Biosystems. As moléculas quantificadas por PCR em tempo real foram: CD69 (Hs00934033_m1), Lamp1 (Hs00174766_m1), NCR3 (Hs00394809_m1), KLRC1 (Hs00970274_m1). Para análise da expressão gênica, empregou 32 SOARES, L.S. Material e Métodos se o método comparativo ou 2- ΔΔ Ct [80] e utilizou-se os seguintes genes constitutivos: GAPDH e β-actina. 4.8. Avaliação funcional das células NK por ensaio de citotoxicidade 4.8.1. Cultivo das células alvo Para realização do ensaio de citotoxicidade, utilizou-se como célula alvo a linhagem celular K-562 (ATCC N° CCL-243™). Essa linhagem celular foi gentilmente cedida pela Profa. Dra. Fabíola Attié de Castro da FCFRP/USP. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 acrescido de 10% de SBF, em estufa úmida a 37°C e 5% de CO2. No dia anterior ao ensaio, realizou-se o subcultivo destas células em placa de 24 poços contendo 5 x 105 células/mL por poço. 4.8.2. Ensaio de citotoxicidade O ensaio de citotoxicidade foi realizado utilizando-se o “CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay” (Promega), segundo instruções do fabricante. Para isso, células NK purificadas (efetoras) foram cultivadas com as células alvo (células K-562) em placas de 96 poços de fundo U sob diferentes razões entre células efetoras e células alvo (20:1; 10:1 e 5:1). O ensaio foi realizado em triplicata num volume total de 100 µL/poço. A porcentagem de citotoxicidade foi calculada a partir da quantificação da enzima lactato desidrogenase (LDH) liberada no meio de cultura após lise celular, segundo a fórmula: %citotoxicidade = Experimental − Efetora espontânea − Alvo Espontânea x 100 Alvo máxima − Alvo espontânea 4.8.3. Quantificação de citocinas e quimiocinas em sobrenadante de cultura O sobrenadante da cultura do ensaio de citotoxicidade descrito acima foi coletado para quantificação das citocinas e quimiocinas. Para tanto, utilizou-se o “Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit” (Cat #HCYTOMAG-60K, Millipore) e realizou-se o ensaio segundo instruções do fabricante. Foram detectadas as seguintes citocinas: IFN-γ, IL-10, IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-α2, IL-12p70, IL-17A, IL-4, IL-5; e as quimiocinas: MCP-1, RANTES, IP-10, MIP-1α, MIP-1β, e GM-CSF. A fluorescência foi 33 SOARES, L.S. Material e Métodos quantificada no equipamento Magpix (Luminex Corporation) segundo instruções do fabricante e os resultados foram analisados no software Analyst. 4.8.4. Quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio por quimioluminescência A produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) foi avaliada por meio de quimioluminescência amplificada por Luminol (Sigma). As células NK purificadas foram divididas em dois tubos, sendo que cada um recebeu 1x105 células. Foram adicionados aos tubos 10% do volume total de Luminol ([ ] final de 100 µM) para realização da leitura. Utilizou-se como controle positivo da produção de ROS, a estimulação das células com PMA a 10-7M. O controle de produção espontânea (negativo) foi realizado sem a adição de estímulo. A leitura foi realizada em luminômetro (AutLumat LB 953 Multi-Tube Luminometer from Berthold) no Laboratório de Imunologia e Citologia dos Fluidos Biológicos da FCFRP/USP, sob responsabilidade da Profa. Dra. Cleni Mara Marzocchi Machado. 4.9. Avaliação de mudanças epigenéticas relacionadas às células NK 4.9.1. Determinação do padrão de metilação global do DNA cromossômico O DNA genômico foi extraído das células NK purificadas utilizando-se o “PureLink Genomic DNA kit” (Invitrogen, Life Technologies), segundo instruções do fabricante. Em seguida, o DNA foi quantificado no fluorímetro Qubit 2.0. Foram utilizadas 50 ng da amostra de DNA genômico de cada indivíduo para quantificação do perfil de metilação global relativa utilizando-se o “Imprint Methylated DNA Quantification kit” (Sigma-Aldrich), conforme instruções do fabricante. Os cálculos de porcentagem relativa da metilação global foram realizados considerando-se o controle positivo de DNA 100% metilado fornecido pelo kit. 4.9.2. Avaliação do padrão de metilação gene-específico Após análise do fenótipo de células NK por citometria de fluxo e PCR em Tempo Real, definiu-se a molécula KIR2DL2 como alvo para estudo da metilação gene-específico. A 34 SOARES, L.S. Material e Métodos estratégica utilizada foi clonagem e posterior sequenciamento do DNA pelo método de Sanger, conforme descrito por Gao et al. em 2009 [81], com modificações. 4.9.2.1.Análise da sequência genômica referente ao gene KIR2DL2 Inicialmente, realizou-se a amplificação da região analisada por Gao et al., antes da modificação do DNA por bissulfito, pela técnica de PCR. A reação foi feita utilizando-se 1 µL da amostra de DNA genômico previamente extraído (50 ng/µL) e o seguintes reagentes: 0,1 µL de Taq DNA Polymerase (Invitrogen); 1,25 µL de tampão; 0,25 µL de MgCl2 (50mM); 0,25 µL de cada primer a 10µM (2DL2-gen F e 2DL2-gen R); 0,25 µL de dNTP (10mM) e 9,65 µL de H2O Nuclease-Free. As amostras foram submetidas a reação de PCR no termociclador no Veriti Thermal Cycler (ThermoFisher Scientific) com a seguinte programação: 94°C por 5 minutos; 35 ciclos de 94°C por 30 segundos, 56°C por 30 segundos e 72°C por 30 segundos; e extensão final a 72°C por 10 minutos. Após amplificação, analisou-se o resultado em gel de agarose a 1,5% (Apêndice -Figura suplementar 01) corado com SYBR Safe DNA Gel Stain (Thermo Fisher Scientific). As respectivas sequências de cada primer estão demonstradas abaixo: 2DL2-gen F: 5’ – GTACTAGAAACTCAAGCAGG – 3’ 2DL2-gen R: 5’ – ACACGCCATGCTGACGACCA – 3’ Em seguida, extraiu-se os produtos de PCR a partir do gel de agarose utilizando-se o “Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit” (Ge Heatlhcare), segundo instruções do fabricante. O DNA purificado foi quantificado no fluorímetro Qubit 2.0 e analisado em gel de agarose a 1,5% corado com SYBR Safe DNA Gel Stain (Thermo Fisher Scientific). A partir de 2 µL da amostra de DNA purificado, realizou-se a reação de sequenciamento do DNA pelo método de Sanger utilizando o “BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit” (ThermoFisher Scientific). A reação foi feita no equipamento ABI Prism 3130 Genetic Analyzer do Núcleo de Serviços em Biotecnologia da Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto. Os cromatogramas e as sequências foram obtidas com auxílio do programa FinchTV, comparadas com a sequência referência depositada no banco de dados GenBank (sequência referência NM_014219.2) e alinhadas utilizando-se o programa MultAlin [82] e Clustal. 35 SOARES, L.S. Material e Métodos 4.9.2.2. Quantificação da metilação do gene KIR2DL2 após modificação por bissulfito Após avaliação in silico das sequências genômicas relativas à região analisada do gene KIR2DL2 de cada amostra, realizou-se a reação de modificação por bissulfito utilizando-se o EZ DNA Methylation Gold Kit (Zymo Research), segundo instruções do fabricante. Utilizouse 300 ng de DNA genômico total para cada reação e o DNA modificado foi eluído no volume final de 20 µL. Após a modificação por bissulfito, amplificou-se a região específica por meio de PCR empregando-se os seguintes reagentes: 0,05 µL de Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen, 5U/µL); 1,25 µL de tampão; 0,5 µL de MgSO4 (50mM); 0,25 µL de dNTP (10mM); 0,25 µL de cada primer (2DL2-bis Fa/Ra) e 8,95 µL de H2O Nuclease-Free. Utilizou-se 0,5 µL da amostra de DNA modificado por bissulfito em cada reação. As configurações do termociclador foram as seguintes: 94°C por 1 minuto e 30 segundos; 35 ciclos de 94°C por 45 segundos, 53°C por 45 segundos e 68°C por 45 segundos; e extensão final a 68°C por 1 minuto e 30 segundos. Para a clonagem do fragmento amplificado acima, realizou-se a PCR aumentando a quantidade proporcional de cada reagente para o volume final de 100 µL. O tamanho de 452 pb do fragmento amplificado foi verificado em gel de agarose a 1,5% (Apêndice - Figura suplementar 02) corado com SYBR Safe DNA Gel Stain (Thermo Fisher Scientific). Os primers foram desenhados com auxílio do software on line MethPrimer [83]. As sequências dos respectivos primers estão demonstradas abaixo: 2DL2-bis Fa: 5’ – GAAGAAGAGTTTGAATTTTAGA – 3’ 2DL2-bis Ra: 5’ – CCTATATCTCCAACTCTAAACC – 3’ A reação de clonagem foi realizada utilizando-se o TOPO TA Cloning kit (pCR 2.1 – TOPO vector, ThermoFisher Scientific). Para tanto, inicialmente adicionou-se a cauda poli-A nas extremidades do fragmento amplificado por meio da incubação do produto de PCR amplificado acima com a Taq DNA Polymerase (Invitrogen) a 72°C por 10 minutos. Em seguida, os produtos da PCR foram purificados utilizando-se o kit “Wizard SV Gel and PCR Clean-up System” (Promega). O DNA foi eluído em 20 µL e quantificado no fluorímetro Qubit 2.0. Para reação de clonagem, incubou-se 1 µL do DNA (7 ng/µL) com 1 µL do vetor TOPO (10 ng/µL), 1µL da solução de sal e 3 µL de H2O Nuclease-Free por 30 minutos a temperatura ambiente. 36 SOARES, L.S. Material e Métodos Todo o volume da ligação acima foi utilizado na transformação de células de E. coli Top10 competentes, as quais foram plaqueadas em meio LB ágar suplementado com canamicina, visto que o vetor TOPO pCR 2.1 apresenta o gene de resistência a esse antibiótico. A seleção dos clones recombinantes foi feita a partir da PCR de colônias, na qual o molde consistiu de uma solução de bactérias “palitadas” a partir da placa de cultura, dissolvidas em 20 µL de água estéril Nuclease-free e fervidas por 5 minutos. Para a reação, utilizou-se: 0,1 µL de Taq DNA Polymerase (Invitrogen); 1,25 µL de tampão; 0,25 µL de MgCl2 (50mM); 0,25 µL de cada primer a 10µM (2DL2-bis Fa/Ra); 0,25 µL de dNTP (10mM) e 9,65 µL de H2O Nuclease-Free. O produto da PCR foi analisado em gel de agarose a 1,5% e a partir desse resultado, extraiu-se os plasmídios das colônias que apresentaram banda de amplificação de 452 pb (Apêndice - Figura suplementar 03), relativa ao tamanho do fragmento analisado por Gao et al. O DNA obtido foi quantificado no fluorímetro Qubit 2.0, diluído a 105 ng/ µL e enviado para sequenciamento no Centro de Pesquisas sobre o Genoma Humano e Células-Tronco da USP/SP, utilizando nas reações o primer universal M13 Forward (Life Technologies). As sequências foram obtidas com auxílio do programa FinchTV e a qualidade das bases analisadas no programa computacional PHRED [84]. Os pontos de metilação foram alinhados pelo programa Clustal Omega (EMBL-EBI). A região amplificada compreendeu o estudo do percentual de metilação de 19 dinucleotídeos CpG como destacado na figura 3 abaixo. A comparação entre as sequências tratadas com bissulfito e as de referência foram realizadas com o auxílio do programa QUMA – Quantification tool for Methylation Analysis [85]. As análises de bioinformática foram realizadas com o auxílio da Profa. Dra. Silvana Giuliatti do Departamento de Genética da FMRP/USP, Dr. Murilo Racy Soares e Dra. Maria Gabriela Fontanetti Rodrigues. Figura 3. Sequência genômica analisada do KIR2DL2 quanto ao perfil de metilação. Estão destacados em amarelo os 19 dinucleotídeos CpG analisados, compreendidos entre as regiões -271 a +82. As regiões de pareamento dos primers utilizados estão destacadas em vermelho. 37 SOARES, L.S. Material e Métodos 4.9.3. Quantificação da expressão de enzimas que promovem as alterações epigenéticas Extraiu-se o RNA total a partir das amostras de células NK purificadas dos diferentes grupos, conforme descrito nas seções anteriores, utilizando-se o reagente TRIzol (Ambion®). A partir de 30 ng da amostra de RNA convertido em cDNA foi realizada a reação em cadeia da polimerase em tempo real empregando-se o RT2 Profiler PCR Array customizado pela Qiagen para análise da expressão das enzimas envolvidas na ativação da transcrição gênica (ATF2, HAT1, KAT2B, KAT5, CARM1, PRMT5, SMYD3, SUV39H1, ASH1L, KMT2C, KMT2E, SETD1B, KDM5B, KDM6B) utilizando-se o RT2 SYBR Green PCR Master Mix, segundo instruções do fabricante. Para cálculo da expressão gênica, empregou-se os seguintes genes constitutivos: GAPDH e β-actina. E para determinação da expressão das enzimas envolvidas na repressão da transcrição gênica, utilizou-se o “TaqMan→ Array Human DNA Methylation & Transcriptional Repression kit” (Applied Biosystems, Foster City, EUA). Foram analisadas as seguintes enzimas: DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, MBD2, MBD3 e MECP2. Para cálculo da expressão gênica, empregou-se os seguintes genes constitutivos: GAPDH, ACTB, 18S, HPRT1, GUSB, RPLPO, HMBS e B2M. A partir dos resultados de Ct (cycle treshold) obtidos acima, calculou-se os níveis de expressão relativa utilizando-se o método comparativo ou 2- ΔΔ Ct [80]. 4.9.4. Imunoprecipitação da cromatina A partir de 1x106 células NK purificadas foi realizada a fixação da estrutura DNAproteína com 55 µL de formaldeído a 18,5% em 1 mL de PBS, durante 10 minutos a 37°C. Em seguida, adicionou-se 100 µL por tubo da solução de glicina concentrada 10 vezes ([]FINAL= 125mM) e incubou-se a temperatura ambiente por 5 minutos. Centrifugou-se a amostra a 3400 x g por 5 minutos a 4°C e descartou-se o sobrenadante. Realizou-se duas lavagens seguidas do precipitado celular com 500 µL de PBS acrescido da solução de inibidores de protease (Sigma) diluída 1:100 e centrifugou-se a 3400 x g por 5 minutos a 4°C. Ao final, descartou-se o sobrenadante e armazenou-se o precipitado celular a -80°C. A lise das células foi realizada pela adição de 50 µL de tampão de lise (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8,1) e 150 µL de tampão de diluição (0,01% SDS; 1,1% 38 SOARES, L.S. Material e Métodos Triton X-100; 1,2 mM EDTA; 16,7 mM Tris-HCl pH8,1 e 167 mM NaCl) acrescidos dos inibidores de protease (1:100). Homogeneizou-se a amostra com auxílio do vórtex e incubouse no gelo por 10 minutos. Cada amostra foi dividida em dois tubos contendo 100 µL cada para ser realizada a etapa de sonicação utilizando-se o Bioruptor Pico Sonication System (Diagenode). Conforme padronização prévia (Apêndice - Figura suplementar 04), realizou-se 11 ciclos de 15 segundos-on e 90 segundos-off a 4°C. Em seguida, centrifugou-se a amostra a 12000 x g por 20 minutos a 4°C e transferiu-se o sobrenadante para um novo tubo. Após a centrifugação, o sobrenadante contendo a cromatina foi diluído com tampão de diluição (200 µL para cada anticorpo), e uma alíquota (5% em volume) foi reservada para indicar a quantidade de DNA de cada amostra (input). As frações de cromatina restantes foram submetidas à imunoprecipitação e incubadas com os anticorpos específicos, overnight a 4°C, com suave rotação. Foram utilizados os seguintes anticorpos: normal mouse IgG (1µg, Millipore), anti-histone H3K27me3 (4µg, Abcam) e anti-histone H3K4me3 (4µg, Abcam). Após incubação com os anticorpos específicos, adicionou-se 50 µL da solução de esferas de agarose com DNA de esperma de salmão por tubo e incubou-se por 1 hora a 4°C sob rotação. Realizou-se as lavagens do precipitado com os diferentes tampões (low-salt, high-salt, LiCl e TE) por 5 minutos a 4°C, sob agitação, seguida de centrifugação a 100 x g por 1 minuto. Os complexos imunes foram eluídos pela adição de tampão de eluição e a ligação DNA-proteína foi revertida após incubação a 62°C por 2 horas com proteinase K. O DNA livre foi purificado por protocolo padrão de precipitação por fenol/clorofórmio/álcool isoamílico e quantificado no fluorímetro Qubit 2.0. O DNA obtido após imunoprecipitação da cromatina foi utilizado como amostra na PCR em Tempo Real para quantificação de regiões específicas das moléculas de IFN-γ e TNF-α, previamente descritas como alvo de modificações de histona [86, 87]. Foram utilizados 2 µL da amostra de DNA imunoprecipitado em cada reação, empregando-se o reagente SYBR Green Master Mix (Life Technologies), segundo instruções do fabricante. A reação foi realizada no aparelho StepOnePlus Real-Time PCR System (Life Technologies) conforme as seguintes configurações: 94°C por 10 minutos, 50 ciclos de 94°C por 20 segundos e 60°C por 1 minuto, seguida da curva de dissociação ao final. A análise foi realizada segundo a fórmula: 100*2^(input ajustado – Ct(IP)), onde o input ajustado refere-se ao valor de input corrigido pela diluição inicial e o IP, à amostra de cada anticorpo empregado. 39 SOARES, L.S. Material e Métodos 4.10. Análise estatística Os dados obtidos foram analisados utilizando-se o programa GraphPad Prism 6.0 (San Diego, CA, EUA) e as diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p < 0,05. Considerando a natureza não paramétrica do conjunto de dados, verificado pelo teste de Kolmogorov-Smirnov, empregou-se o teste de Mann-Whitney para comparações entre dois grupos ou o teste de Kruskal-Wallis, para comparações múltiplas. Com o objetivo de avaliar a associação entre duas variáveis distintas, realizou-se o teste de correlação de Spearman. As correlações significativas foram compiladas no software Cytoscape (versão 3.2.1; http://www.cytoscape.org). As redes foram construídas usando o layout de círculo e as conexões entre as variáveis designadas como linhas, com espessura de acordo com o índice de correlação (r). As correlações foram classificadas em negativa (r < 0), fraca (r ≤ 0,35), moderada (0,36 ≥ r ≤ 0,67) e forte (r ≥ 0,68), de acordo com estudos prévios [88]. Para análise do perfil de citocinas e quimiocinas presentes no plasma ou produzidas pelas células NK, realizou-se o cálculo da mediana global de cada molécula, o qual foi utilizada como ponto de corte na classificação dos indivíduos em altos ou baixos produtores para cada citocina ou quimiocina. Esses dados foram utilizados para gerar diagramas, nos quais os indivíduos classificados como altos produtores foram destacados e sua frequência determinada para cada indicador. A partir desses resultados, construiu-se gráficos de radar para demonstrar as respectivas frequências dos indivíduos com níveis elevados para cada molécula analisada. 40 SOARES, L.S. 5. Resultados 41 SOARES, L.S. Resultados 5. Resultados 5.1. Características da população em estudo Com o objetivo de caracterizar fenotipicamente e funcionalmente as células NK de pacientes infectados com HIV-1 submetidos ou não ao tratamento antirretroviral, foram obtidas 28 amostras de sangue periférico dos indivíduos HIV-1+ virgens de tratamento (grupo HIV-1+), 29 amostras daqueles em uso regular dos antirretrovirais (grupo TARV) e 30 amostras do grupo controle, como descrito em Materiais e Métodos. Na tabela 1 estão resumidos os principais dados de cada grupo considerando os parâmetros de gênero, idade, contagem de linfócitos T CD4+, carga viral, tempo aproximado de infecção, assim como o esquema terapêutico empregado nos pacientes do grupo TARV e o respectivo tempo de tratamento. Os três grupos apresentam características de idade e distribuição de gêneros semelhantes, com a observação de que o grupo TARV compreende indivíduos de idade um pouco mais avançada, sendo a mediana da idade de 46 anos, o que reflete as características dessa população em estudo. Desde dezembro de 2013, o Ministério da Saúde recomenda o início imediato da terapia antirretroviral em pessoas vivendo com HIV/AIDS, independente da contagem de linfócitos T CD4+ e estágio clínico da doença, na perspectiva de diminuir a transmissão do HIV, dentre outros fatores. Dessa forma, o grupo HIV-1+ compreendeu indivíduos recentemente infectados, sendo a mediana do tempo de infecção de 5,3 meses quando comparado ao grupo TARV com 156,4 meses. O tempo aproximado de infecção foi determinado a partir do primeiro resultado positivo para o teste de ELISA. Além disso, os pacientes do grupo HIV-1+ apresentavam menor contagem de linfócitos T CD4+, sendo a mediana de 415,5 células/mm3, em relação ao grupo TARV com mediana de 705 células/mm3. Os indivíduos do grupo TARV incluídos no estudo possuíam carga viral indetectável (<40 cópias/mL) e estavam sob determinado esquema terapêutico a no mínimo seis meses, sendo a mediana do tempo de tratamento atual de 72,3 meses. Os pacientes desse grupo foram subdivididos de acordo com a terapia a qual foram submetidos, sendo a primeira linha de tratamento, preconizada pelo Ministério da Saúde, composta por dois Inibidores da Transcriptase Reversa Análogos Nucleosídeos ou Nucleotídeos (ITRN/ITRNt) associados a um Inibidor da Transcriptase Reversa Não Análogo de Nucleosídeo (ITRNN). Na segunda linha de tratamento, há substituição do ITRNN por um Inibidor de Protease (IP) e esta terapia é selecionada baseada em fatores clínicos inerentes ao paciente. 42 SOARES, L.S. Resultados Tabela 1. Características da população em estudo. Controle HIV-1+ TARV n Idade Esquema terapêutico 30 32,0 (27,5 - 54) M = 21 F=9 - 28 33,5 (23 - 43,3) M = 21 F=7 - Carga viral (cópias/mL) - 21638 (4272 - 117414) não determinado 415,5 (214,5 - 640,3) 705 (597,5 - 932) 5,3 (2 - 29,5) 156,4 (73,2 - 193,6) Gênero Células T CD4+ (céls/mm3) Tempo aproximado de infecção (meses) - Tempo de tratamento (meses) - - 29 46,0 (40,5 - 52,5) M = 14 F = 15 ITRN + ITRNN (n = 17) ITRN + IP/r (n = 12) < 40 72,3 (27 - 114,9) Os dados referentes a idade, carga viral, células T CD4+, tempo de infecção e de tratamento estão expressos como mediana (percentil 25-75). 43 SOARES, L.S. 5.2. Resultados Análise de moléculas relacionadas à progressão da doença Inicialmente, com o intuito de caracterizar a progressão da infecção por HIV-1, realizou-se a quantificação das citocinas e quimiocinas presentes no plasma, assim como das moléculas CD14 e CD163 solúveis. Para tanto, após obtenção das amostras de sangue periférico dos indivíduos dos grupos controle, HIV-1+ virgens de tratamento e TARV, procedeu-se à separação do plasma, o qual foi armazenado à -20°C e posteriormente descongelado para dosagem das citocinas e quimiocinas por plataforma Multiplex, e das moléculas CD14 e CD163 por ELISA, como descrito na seção de materiais e métodos. 5.2.1 Quantificação das moléculas CD14 e CD163 solúveis no plasma A quantidade de CD163 solúvel no plasma dos indivíduos infectados com HIV-1 e virgens de tratamento foi significativamente maior quando comparada aos grupos controle e TARV. Quanto à molécula sCD14, os grupos HIV-1+ e TARV apresentaram aumento significativo em relação aos indivíduos controle, sendo a mediana do grupo TARV maior que o HIV-1+, embora não estatisticamente significativa (Figura 4). 44 SOARES, L.S. Resultados Figura 4. Pacientes HIV-1+ apresentam níveis plasmáticos elevados de sCD163 e sCD14 plasmáticos. Quantificação das moléculas CD14 e CD163 solúveis no plasma dos indivíduos controle, HIV-1+ virgens de tratamento e TARV. O plasma foi obtido do sangue periférico e a análise quantitativa foi realizada por meio de ensaio imunoenzimático (ELISA). As diferenças entre os grupos foram calculadas a partir do Teste de Kruskal Wallis seguido do Teste de Dunn. A linha indica a mediana de cada grupo e cada ponto representa um indivíduo. *p<0,05; ***p<0,001; ****p<0,0001. 45 SOARES, L.S. Resultados 5.2.2. Quantificação de citocinas e quimiocinas do plasma Na figura 5, estão demonstrados os níveis de citocinas pró-inflamatórias, aquelas mais relacionadas à resposta TH2 (IL-4 e IL-5) e reguladora (IL-10) quantificadas no plasma dos indivíduos dos diferentes grupos. No grupo HIV-1+, observou-se aumento significativo de TNF-α quando comparado aos grupos controle e TARV. Os níveis plasmáticos da citocina IL-10 também estavam aumentados neste grupo, sendo este aumento estatisticamente significativo em relação aos pacientes HIV-1+ sob tratamento antirretroviral (grupo TARV). As demais citocinas quantificadas não apresentaram diferenças significativas entre os grupos analisados (Figura 5). Quanto aos níveis plasmáticos das diferentes quimiocinas analisadas, verificou-se maior quantidade de IP-10 no grupo HIV-1+, em relação aos grupos controle e TARV. Os indivíduos infectados e tratados também apresentaram aumento significativo desta quimiocina quando comparado aos controles. Por outro lado, a molécula GM-CSF apresentou diminuição significativa no grupo TARV. E por fim, a quimiocina CCL5, envolvida no recrutamento de leucócitos para os sítios inflamatórios e que também atua como fator supressor do HIV, estava diminuída no grupo HIV-1+, sendo essa diminuição estatisticamente significativa em relação ao grupo TARV, o qual parece restaurar os níveis dessa quimiocina próximos aos do controle (Figura 6). 46 SOARES, L.S. Resultados Figura 5. Quantificação de citocinas no plasma dos indivíduos controle, HIV-1+ virgens de tratamento e TARV. O plasma foi obtido do sangue periférico e a análise quantitativa foi realizada utilizando-se microesferas magnéticas na plataforma Magpix®. O limite de detecção de cada citocina foi <5pg/mL. As diferenças entre os grupos foram calculadas a partir do Teste de Kruskal Wallis seguido do Teste de Dunn. A linha indica a mediana de cada grupo e cada ponto representa um individuo. *p<0,05; **p<0,01 e ****p<0,0001. 47 SOARES, L.S. Resultados Figura 6. Quantificação de quimiocinas no plasma dos indivíduos controle, HIV-1+ virgens de tratamento e TARV. O plasma foi obtido do sangue periférico e a análise quantitativa foi realizada utilizando-se microesferas magnéticas na plataforma Magpix®. O limite de detecção de cada citocina foi <5pg/mL. As diferenças entre os grupos foram calculadas a partir do Teste de Kruskal Wallis seguido do Teste de Dunn. A linha indica a mediana de cada grupo e cada ponto representa um individuo. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 e ****p<0,0001. 48 SOARES, L.S. Resultados 5.2.3. Correlação entre os marcadores de ativação do plasma Para compreender melhor a progressão da infecção pelo HIV-1+, além de analisarmos os níveis plasmáticos das diferentes moléculas, faz-se necessário o estudo da correlação entre essas variáveis e os parâmetros empregados na rotina clínica (contagem de linfócitos T CD4+ e carga viral). Dessa forma, a partir dos resultados obtidos por meio dessa análise no grupo HIV-1+, nota-se correlação negativa entre a contagem de linfócitos T CD4+ e a viremia, ou seja, à medida que ocorria aumento da carga viral no individuo infectado, o número de células T CD4+ diminuía (Figura 7). Quando correlacionamos a viremia com as citocinas IL-10 e TNF-α, e a quimiocina IP10, as quais estavam estatisticamente aumentadas no grupo HIV-1+, observou-se forte correlação positiva, confirmando em nossos dados a relação dessas moléculas como indicadores da progressão da doença. 49 SOARES, L.S. Resultados Figura 7. Correlação entre os marcadores plasmáticos e o aumento da viremia em pacientes HIV-1+. Associação entre os principais marcadores plasmáticos da progressão da infecção por HIV-1+ foi feita a partir da determinação da concentração de cada variável no grupo HIV-1+ e então calculou-se o coeficiente de correlação de Spearman entre as variáveis. Nos gráficos estão representados os valores de r e p, respectivamente. 50 SOARES, L.S. Resultados A partir dos resultados dos mediadores solúveis quantificados no plasma, caracterizouse o perfil imunológico de cada grupo. Para tanto, calculou-se a frequência de indivíduos definidos como altos produtores a partir da mediana global de cada marcador, como representado na figura 8. No diagrama, os quadrados preenchidos correspondem aos valores superiores à mediana global do respectivo analito, e em branco, aqueles com valores inferiores à mediana. Cada linha representa um individuo daquele grupo e as moléculas quantificadas estão dispostas em colunas. Ao final de cada coluna, estão demonstradas as frequências de altos produtores para aquele determinado analito. No grupo controle, observou-se que a frequência de altos produtores para a maioria dos marcadores plasmáticos analisados foi inferior ou próxima a 50%, exceto para IL-17 e GMCSF, em que 63% dos indivíduos controles apresentaram níveis elevados de ambos acima da mediana global (5,13 e 11,4 pg/mL, respectivamente). Quanto às moléculas associadas à progressão da infecção por HIV como TNF-α, IP-10 e IL-10, apenas 22, 15 e 48%, respectivamente, dos indivíduos controles apresentaram quantidade maior que a mediana global. De forma semelhante ao grupo controle, o grupo TARV também apresentou frequências de altos produtores inferiores ou próximas a 50%, exceto para sCD14, RANTES e IL-5 (77, 67 e 60%, respectivamente). Enquanto os níveis de altos produtores para TNF-α, IP-10 e IL10 foram de: 47, 47 e 33% , respectivamente. Em resumo, nota-se que a maioria dos pacientes do grupo TARV demonstram diminuição do perfil inflamatório sistêmico, mas ainda exibem um painel de marcadores plasmáticos diferente daquele observado para os indivíduos não infectados (grupo controle). Por sua vez, o grupo compreendendo os indivíduos infectados pelo HIV-1+ e virgens de tratamento, apresentou frequência maior do que 50% de altos produtores para 11 dos 18 mediadores solúveis analisados. É interessante notar que os maiores valores foram observados para os seguintes marcadores: sCD163, TNF-α, IP-10 e IL-10 (76%, 75%, 86% e 64%, respectivamente). Dentre as moléculas analisadas no grupo HIV-1+, verificou-se que a menor frequência de indivíduos considerados altos produtores foi observada para a quimiocina CCL5, em que somente 32% dos pacientes deste grupo apresentaram níveis plasmáticos maior que a mediana global de 8505 pg/mL. 51 Figura 8. Frequência de individuos caracterizados como altos produtores para os diferentes mediadores plasmáticos. Os diagramas das frequências foram construídos utilizando-se o valor da mediana global de cada mediador solúvel como ponto de corte para marcar cada individuo como “altos” ou “baixos” produtores para cada analito. Os quadrantes marcados em preto correspondem aos valores superiores à mediana global do respectivo analito, e em branco aqueles com valores inferiores à mediana. Abaixo de cada quadro estão representados a frequência (%) de individuos que apresentam níveis elevados dos mediadores e os dados relevantes (≥ 50%) estão sublinhados. SOARES, L.S. Resultados 52 SOARES, L.S. Resultados 5.3. Avaliação fenotípica das células NK e suas subpopulações 5.3.1. Determinação da frequência de células NK e a distribuição de suas subpopulações A quantidade de células NK e suas subpopulações no contexto da infecção por HIV-1 foi determinada por meio da técnica de citometria de fluxo a partir da utilização dos anticorpos: anti-CD3, anti-CD56 e anti-CD16, previamente titulados. As células NK foram definidas dentro da população de linfócitos determinada de acordo com tamanho e granularidade e que possuíam a marcação CD3-CD56+. Na figura 9 estão demonstrados os valores de porcentagem e número das células NK obtidas a partir da população em estudo. A mediana relativa à frequência de células NK do grupo controle foi de 9,6% comparada aos valores de 7,3 e 5,8% nos grupos HIV-1+ e TARV, respectivamente. A diminuição observada nos pacientes infectados pelo HIV-1+, independente do tratamento, foi estatisticamente significativa em relação aos indivíduos controles. Quanto ao número de células NK, observou-se diminuição estatisticamente significativa no grupo HIV-1+, comparado aos grupos controle e TARV. Não se observou diferença significativa quanto aos esquemas terapêuticos empregados (dados não mostrados). 53 SOARES, L.S. Resultados Figura 9. Infecção pelo HIV-1 reduz a porcentagem e o número de células NK circulantes no sangue periférico. Análise da quantidade de células NK (CD3-CD56+) encontrada no sangue periférico dos indivíduos controle, HIV-1+ virgens de tratamento e TARV. Frequência e número das células NK quantificadas no sangue periférico por meio da técnica de citometria de fluxo. As diferenças entre os grupos foram calculadas a partir do Teste de Kruskal Wallis seguido do Teste de Dunn. A linha indica a mediana de cada grupo e cada ponto representa um indivíduo. *p<0,05 e ****p<0,0001. 54 SOARES, L.S. Resultados Conforme dados da literatura, as subpopulações de células NK foram classificadas de acordo com a intensidade de expressão das moléculas CD56 e CD16 [89]. Dessa forma, foram determinadas três subpopulações de células NK: CD56brightCD16-, CD56dimCD16+ e CD56CD16+ (Figura 10A), sendo que cada uma é descrita por possuir funções específicas, justificando sua análise durante a infecção pelo HIV-1. A subpopulação de células NK de fenótipo CD56dimCD16+, caracterizada por sua elevada capacidade citotóxica, estava diminuída significativamente no grupo HIV-1+ em relação ao controle, evidenciando umas das disfunções encontradas nos pacientes infectados e não tratados (Figura 10B, C). Essa subpopulação corresponde à maioria das células NK encontradas no sangue periférico, sendo a mediana de sua frequência semelhante nos grupos controle e TARV (87,6 e 81,7%, respectivamente). Quanto às células NK CD56brightCD16-, descritas por possuírem função predominante de produção de citocinas, notou-se diminuição no grupo HIV-1+, embora não significativa, com valor de mediana relativo à frequência dessa subpopulação de 3,9%. Assim como observado para as células NK CD56dimCD16+, os indivíduos controle e do grupo TARV mantiveram quantidades próximas quanto a essa outra subpopulação, sendo a mediana de 5,9 e 5,5% do total de células NK encontradas no sangue periférico, respectivamente (Figuras 10B,C). E, por fim, a frequência de células NK de fenótipo CD56-CD16+ apresentou aumento significativo nos indivíduos HIV-1+, independente do tratamento antirretroviral (Figura 10B,C). Essa subpopulação é denominada não funcional por expressar altos níveis de receptores inibitórios, secretar menor quantidade citocinas e possuir defeitos na lise de células alvo infectadas. A porcentagem destas células NK não funcionais manteve-se elevada no grupo TARV, embora ainda menor que o grupo HIV-1+. Dessa forma, sugere-se redução da função de defesa desempenhada pelas células NK durante a infecção por HIV-1+, em decorrência da alteração da distribuição de suas subpopulações, principalmente nos indivíduos recentemente infectados e que não iniciaram a terapia antirretroviral. O tratamento, por sua vez, parece reestabelecer parcialmente as proporções de células NK, exceto para a subpopulação não funcional que permanece elevada. Não foram observadas diferenças quanto aos esquemas terapêuticos do grupo TARV. 55 SOARES, L.S. Resultados Figura 10. Alteração da distribuição das subpopulações de células NK nos pacientes HIV-1+. A) Estratégia para análise das subpopulações de células NK por citometria de fluxo. B) Gráficos representativos da distribuição das subpopulações de células NK dos grupos controle, HIV-1+ e TARV. C) Frequência das subpopulações de células NK. (O total de células NK foi definido como a soma das três subpopulações analisadas). As diferenças entre os grupos foram calculadas a partir do Teste de Kruskal Wallis seguido do Teste de Dunn. A linha indica a mediana de cada grupo e cada ponto representa um indivíduo. **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001. 56 SOARES, L.S. Resultados 5.3.2. Análise da expressão dos receptores de ativação e inibição das células NK Além de alterar a proporção das subpopulações de células NK, a infecção por HIV-1 também está associada à modificação da expressão dos receptores nestas células. Dessa forma, com o objetivo de complementar a caracterização fenotípica das células NK na população em estudo, realizou-se a quantificação da expressão dos receptores de ativação e inibição por citometria de fluxo e PCR em Tempo Real. Inicialmente, verificou-se a expressão dos receptores inibitórios: CD158a (KIR2DL1), NKAT2 (KIR2DL2/L3) e NKB1 (KIR3DL1). Não foi observada diferença significativa quanto à porcentagem de células NK expressando esses receptores entre os três grupos estudados (Figura 11A-C), com exceção do grupo TARV que demonstrou diminuição na frequência de células NK positivas para CD158a em relação ao grupo controle (Figura 11A). Essa redução também foi verificada quanto ao número de células NK CD158a+ nos pacientes HIV-1+, independente do tratamento antirretroviral (Figura 11D). Notou-se ainda diminuição estatisticamente significativa no número de células NK positivas para NKAT2 e NKB1 no grupo HIV-1+ comparado ao controle (Figura 11E, F), refletindo em parte a redução do número total de células NK nos pacientes desse grupo. Em contrapartida, a mediana da intensidade de fluorescência (MIF) da molécula NKAT2 estava aumentada no grupo HIV-1+ em relação aos grupos controle e TARV (Figura 11H). Dessa forma, conclui-se que poucas células NK do grupo HIV-1+ expressavam o receptor NKAT2, mas com alta densidade na superfície celular como demonstrado pela mediana da intensidade de fluorescência desse receptor. Os outros receptores não apresentaram diferença significativa quanto ao MIF (Figura 11 G-I), embora verifique-se relativo aumento da mediana da molécula NKB1 no grupo TARV (Figura 11-I). Uma vez identificadas alterações na porcentagem e número de células NK expressando os receptores de inibição entre os grupos avaliados, investigou-se também se entre as diferentes subpopulações de células NK havia variação na expressão desses receptores. Observou-se que a expressão dos receptores inibitórios nas subpopulações de células NK foi diferente somente para a molécula CD158a, como demonstrado na figura 12. A redução na expressão desse receptor foi estatisticamente significativa na subpopulação citotóxica (CD56dimCD16+) do grupo TARV. Por sua vez, o grupo de pacientes que receberam IP em seu esquema terapêutico apresentaram aumento da expressão de CD158a na subpopulação não funcional em níveis próximos ao grupo controle. 57 SOARES, L.S. Resultados Figura 11. Diminuição da quantidade de células NK positivas para os receptores de inibição. A, B, C) Porcentagem de células NK que expressam as moléculas: CD158a, NKAT2 e NKB1, respectivamente. D, E, F) Número de células NK que expressam as moléculas: CD158a, NKAT2 e NKB1, respectivamente. G, H, I) Mediana da intensidade de fluorescência das moléculas: CD158a, NKAT2 e NKB1 na superfície de células NK, respectivamente. As diferenças entre os grupos foram calculadas a partir do Teste de Kruskal Wallis seguido do Teste de Dunn. A linha indica a mediana de cada grupo e cada ponto representa um indivíduo. *p<0,05; **p<0,01 e ***p<0,001. 58 SOARES, L.S. Resultados Figura 12. Modulação da expressão do receptor de inibição CD158a nas diferentes subpopulações de células NK de acordo com o tratamento do paciente. As diferenças entre os grupos foram calculadas a partir do Teste de Kruskal Wallis seguido do Teste de Dunn para comparações múltiplas, e Teste de Mann-Whitney para comparações entre dois grupos. A linha indica a mediana de cada grupo e cada ponto representa um indivíduo. *p<0,05. 59 SOARES, L.S. Resultados Outro conjunto de moléculas envolvidas na modulação da resposta das células NK são os receptores de ativação. Nesse sentido, quantificou-se a expressão da molécula NKp46 pertencente à família dos receptores de citotoxicidade natural (Figura 13 A-C). Verificou-se diminuição significativa no número de células NK expressando a molécula NKp46 nos grupos HIV-1+ e TARV (Figura 13B). Interessantemente, a mediana da intensidade de fluorescência deste receptor nas células NK do grupo HIV-1+ foi estatisticamente maior em relação ao grupo controle (Figura 13C). Esse resultado demonstra que apesar de poucas células NK expressarem esse receptor no grupo HIV-1+, a expressão na superfície celular estava aumentada, sugerindo maior estado de ativação dessas células. Quanto à análise da expressão da molécula NKp46 nas diferentes subpopulações de células NK, observou-se aumento desse receptor na superfície das células NK CD56brightCD16- nos indivíduos infectados, independente do tratamento, sendo significativo no grupo TARV (Figura 14). Por outro lado, notou-se diminuição dessa molécula, principalmente nos pacientes tratados, quanto à subpopulação citotóxica (CD56dimCD16+), embora não significativa. Interessantemente, as células NK descritas como não funcionais apresentaram redução estatisticamente significativa da expressão de NKp46 nos grupos HIV1+ e TARV+, sendo essa diminuição ainda mais pronunciada no grupo TARV (Figura14). Com o objetivo de complementar a análise fenotípica das células NK quanto à expressão das moléculas de ativação, realizou-se a quantificação da expressão gênica das moléculas: CD69, NCR3 (NKp30) e KLRC1 (NKG2a) pela técnica de PCR em Tempo Real. Na figura 15, estão demonstrados os resultados da expressão relativa das amostras dos grupos HIV-1+ e TARV, sendo o grupo controle utilizado como amostra de referência para o cálculo da expressão relativa. Não foi observada diferença estatisticamente significativa quanto às moléculas analisadas entre os grupos. 60 SOARES, L.S. Resultados Figura 13. Poucas células NK de pacientes HIV-1+ expressam elevados níveis do receptor de ativação NKp46. Análise da expressão do receptor de ativação NKp46 nas células NK (CD3-CD56+) encontradas no sangue periférico de indivíduos controle, HIV-1+ virgens de tratamento e TARV. A) Porcentagem de células NK que expressam a molécula NKp46. B) Número de células NK que expressam a molécula NKp46. C) Mediana da intensidade de fluorescência da molécula NKp46 na superfície de células NK. As diferenças entre os grupos foram calculadas a partir do Teste de Kruskal Wallis seguido do Teste de Dunn. A linha indica a mediana de cada grupo. A linha indica a mediana de cada grupo e cada ponto representa um indivíduo. *p<0,05 e ****p<0,0001. Figura 14. Aumento da expressão do receptor de ativação NKp46 na subpopulação de células NK produtoras de citocinas do grupo TARV e diminuição na subpopulação de células NK não funcionais. As diferenças entre os grupos foram calculadas a partir do Teste de Kruskal Wallis seguido do Teste de Dunn para comparações múltiplas. A linha indica a mediana de cada grupo e cada ponto representa um indivíduo. *p<0,05; **p<0,01 e ****p<0,0001. CD69 NCR3 KLRC1 4 0.5 1 V R V R TA H IV -1 + V R TA 2 0 0.0 H IV -1 + 0.0 1.0 3 TA 0.5 1.5 H IV -1 + 1.0 Expressão relativa 2.0 Expressão relativa Expressão relativa 1.5 Figura 15. Níveis de expressão relativa dos genes que codificam moléculas de ativação das células NK de indivíduos dos grupos HIV-1+ e TARV. A expressão gênica foi quantificada pela técnica de PCR em Tempo Real, utilizando-se os genes constitutivos: β-actina e GAPDH e a média do grupo controle como referência. Os dados estão expressos como mediana e interquartil (Teste de Mann-Whitney). 61 SOARES, L.S. Resultados 5.4. Avaliação funcional das células NK 5.4.1. Análise da citotoxicidade das células NK purificadas Para avaliar a função das células NK obtidas após separação magnética, realizou-se o ensaio de citotoxicidade, utilizando como célula alvo a linhagem celular K-562. A porcentagem de citotoxicidade foi calculada a partir da quantificação da enzima lactato desidrogenase liberada no meio de cultura após lise celular e segundo fórmula detalhada na seção de materiais e métodos. No ensaio, foram utilizadas diferentes razões de células efetoras em relação à célula alvo (razão E:A). Conforme demonstrado na figura 16, foi possível diferenciar a porcentagem de citotoxicidade da célula NK entre as diferentes razões e observou-se tendência de diminuição da função citotóxica nas células do grupo HIV-1+. Por outro lado, os valores de citotoxicidade do grupo TARV estavam próximos aos do controle, sugerindo recuperação parcial da função citotóxica nos indivíduos infectados após tratamento antirretroviral. 62 SOARES, L.S. Resultados 100 Controle HIV-1 + TARV % Citotoxicidade 80 60 40 20 5: 1 10 :1 20 :1 0 NK:K-562 Figura 16. Ensaio de citotoxicidade realizado a partir da quantificação da enzima lactato desidrogenase. Células NK purificadas (efetoras) dos grupos controle, HIV-1+ virgens de tratamento e TARV foram cultivadas com células alvo (K-562) em diferentes razões entre células efetoras e células alvo (20:1; 10:1; 5:1), considerando a concentração inicial de 5x103 células alvo. A porcentagem de citotoxicidade foi calculada a partir da quantificação da enzima lactato desidrogenase (LDH) liberada no meio de cultura após lise celular. Os dados estão expressos como média ± SEM (Teste de Kruskal Wallis seguido do Teste de Dunn). 63 SOARES, L.S. Resultados 5.4.2. Quantificação das citocinas e quimiocinas no sobrenadante do ensaio de citotoxicidade Com o objetivo de complementar a caracterização funcional das células NK dos grupos controle, HIV-1+ virgem de tratamento e TARV, realizou-se a quantificação de citocinas e quimiocinas liberadas no sobrenadante de cultura durante o ensaio de citotoxicidade. Pela plataforma Multiplex foram detectadas as seguintes citocinas: TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-12p70, IFN-γ, IFN-α2, IL-5, IL-4, IL-10 (Figuras 17 e 18); e as quimiocinas: RANTES (CCL5), MCP-1 (CCL2), IP-10, MIP-1α (CCL3), MIP-1β (CCL4) e GM-CSF (Figura 19). Os resultados obtidos a partir das amostras coletadas do grupo TARV demonstram aumento significativo na produção da maioria das citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-6, IFN-γ, IFN-α2 e IL-12p70) pelas células NK dos indivíduos desse grupo quando comparados ao controle e/ou HIV-1+ virgens de tratamento (Figura 17). Essa maior produção de citocinas inflamatórias pode ter favorecido o aumento na porcentagem de citotoxicidade observada no grupo TARV no experimento descrito anteriormente. Por outro lado, nota-se que as principais citocinas relacionadas à função das células NK estão diminuídas no grupo HIV-1+, inclusive em relação ao grupo controle, embora essa diferença não tenha sido estatisticamente significativa. A mediana da produção de TNF-α no grupo HIV-1+ foi de 192,9 pg/mL comparado aos valores de 400,9 e 1031 pg/mL nos grupos controle e TARV, respectivamente. Quanto à citocina IFN-γ, essa redução foi de 4,8 vezes em relação ao grupo controle e de aproximadamente 10 vezes em relação ao grupo TARV considerando os valores de mediana. A produção das citocinas IL-12p70 e IFN-α2 também estava consideravelmente diminuída no grupo HIV-1+ com valores de mediana 2,9 e 1,5 vezes menores que os indivíduos controles, respectivamente. Concomitantemente ao aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias pelas células NK do grupo TARV, verificou-se também elevada produção de IL-10, IL-4 e IL-5 (Figura 18). A mediana da quantidade de IL-10 foi de 8,2 pg/mL comparada aos valores de 2,2 pg/mL no grupo controle e 1,1 pg/mL no grupo HIV-1+. Embora os níveis de produção das citocinas IL-4 e IL-5 tenham sido baixos, os valores correspondentes à mediana foram respectivamente: 4,3 e 1,7 vezes maior no grupo TARV do que no grupo HIV-1+. Quanto à análise da produção das diferentes quimiocinas, observou-se aumento significativo de RANTES e MCP-1 no grupo TARV em relação ao grupo HIV-1+ e em relação aos grupos HIV-1+ e TARV, respectivamente. As outras quimiocinas analisadas 64 SOARES, L.S. também estavam Resultados aumentadas nos pacientes infectados e tratados, embora não significativamente (Figura 19). Vale ressaltar a diminuição na produção de RANTES/CCL5 pelas células NK do grupo HIV-1+, sendo a mediana de 52,1 pg/mL. Enquanto nos grupos controle e TARV, os valores observados foram de 167 e 461,2 pg/mL, evidenciando outra possível disfunção das células NK nos indivíduos recentemente infectados e que ainda não iniciaram a terapia antirretroviral. 65 SOARES, L.S. Resultados TNF-α 25 pg/mL 1000 2 500 1 0 0 15 10 5 0 IL-6 IFN-γ 20 IL-1β 1500 500 * 400 15 1000 10 pg/mL pg/mL *** 500 5 *** 20 3 pg/mL 300 200 100 tr on V R C C TA ol R e V + TA tr on H IV -1 R ol e V 0 TA C on tr H IV -1 ol e + 0 + 0 H IV -1 pg/mL ** 4 1500 pg/mL IFN-α2 ** IL-12p70 ** 2000 Figura 17. Células NK de indivíduos do grupo TARV apresentam maior capacidade de produção de citocinas pró-inflamatórias. Células NK purificadas (efetoras) dos grupos controle, HIV-1+ virgem de tratamento e TARV foram cultivadas com células alvo (K-562) na proporção 20:1, e a liberação de citocinas no sobrenadante foi avaliada quantitativamente utilizando-se microesferas magnéticas na plataforma Magpix®. O limite de detecção de cada citocina foi <5pg/mL. Os dados estão expressos como mediana e interquartil (Teste de Kruskal Wallis seguido do Teste de Dunn). A linha indica a mediana de cada grupo e cada ponto representa um indivíduo. *p<0,05; **p<0,01 e ***p<0,001. IL-4 8 4 0.1 2 0 -1 IV H TA R V + e ol TA R V -1 IV H tr ol e + 0.0 on C TA R V -1 IV H on tr ol e + 0 0.2 tr 10 0.3 ** 6 pg/mL pg/mL pg/mL 20 * 0.4 on ** 30 C IL-5 10 C IL-10 * 40 Figura 18. Células NK de indivíduos do grupo TARV apresentam maior capacidade de produção de citocinas do perfil TH2 (IL5, IL-4) e regulador (IL-10). Células NK purificadas (efetoras) dos grupos controle, HIV-1+ virgem de tratamento e TARV foram cultivadas com células alvo (K-562) na proporção 20:1, e a liberação de citocinas no sobrenadante foi avaliada quantitativamente utilizando-se microesferas magnéticas na plataforma Magpix®. O limite de detecção de cada citocina foi <5pg/mL. Os dados estão expressos como mediana e interquartil (Teste de Kruskal Wallis seguido do Teste de Dunn). A linha indica a mediana de cada grupo e cada ponto representa um indivíduo. *p<0,05 e **p<0,01. 66 SOARES, L.S. Resultados IP-10 RANTES GM-CSF 300 40 200 * 1000 800 pg/mL pg/mL 40 30 20 pg/mL 30 50 20 10 400 200 10 0 0 600 0 MCP-1 MIP-1α 2000 2000 500 500 TA R V + -1 IV H H IV -1 ol tr on TA R V e + 0 V R TA + H IV -1 C C on tr ol e 0 e 0 1000 ol 500 1000 tr 1000 1500 1500 pg/mL pg/mL 1500 pg/mL MIP-1β 2500 on ** C * 2000 Figura 19. Aumento da produção de quimiocinas pelas células NK dos indivíduos do grupo TARV. Células NK purificadas (efetoras) dos grupos controle, HIV-1+ virgem de tratamento e TARV foram cultivadas com células alvo (K-562) na proporção 20:1, e a liberação de citocinas no sobrenadante foi avaliada quantitativamente utilizando-se microesferas magnéticas na plataforma Magpix®. O limite de detecção de cada citocina foi <5pg/mL. Os dados estão expressos como mediana e intervalo interquartil (Teste de Kruskal Wallis seguido do Teste de Dunn). A linha indica a mediana de cada grupo e cada ponto representa um indivíduo. *p<0,05 e **p<0,01. 67 SOARES, L.S. Resultados 5.4.3. Correlações entre os parâmetros que caracterizam as disfunções das células NK nos indivíduos HIV-1+ A partir dos dados obtidos da quantificação de citocinas e quimiocinas no sobrenadante do ensaio de citotoxicidade, nota-se um perfil de maior ativação das células NK provenientes dos indivíduos do grupo TARV em relação aos outros grupos. Para compreender melhor essa observação, realizou-se a análise da frequência de indivíduos considerados altos produtores para as diferentes moléculas estudadas considerando a mediana global de cada mediador. Dessa forma, construiu-se os gráficos de radar demonstrados na figura 20, evidenciando o estado de ativação do grupo TARV, no qual a frequência de altos produtores foi maior de 50% para a maioria dos analitos. Por outro lado, o grupo HIV-1+ sugere uma disfunção generalizada nas células NK dos indivíduos desse grupo, visto que a frequência de pacientes com altos níveis de produção das diferentes citocinas estava consideravelmente menor do que o grupo controle. 68 Figura 20. Representação do perfil de produção de citocinas pelas células NK dos grupos controle, HIV-1+ e TARV. As frequências foram calculadas utilizando-se o valor da mediana global de cada mediador solúvel como ponto de corte para definição dos indivíduos como altos ou baixos produtores em relação a determinado analito. SOARES, L.S. Resultados 69 SOARES, L.S. Resultados Além de investigarmos as variações individuais das moléculas quantificadas, faz-se necessário o estudo da correlação entre as mesmas para melhor compreensão do cenário doença versus hospedeiro. Percebe-se que muitas correlações positivas são formadas, sendo que o maior número delas é encontrado no grupo controle (Figura 21). Enquanto no grupo HIV-1+, ocorre perda de grande parte dessas correlações e formação de novas. Por exemplo, a quimiocina GM-CSF apresentou correlação positiva de moderada a forte com 12 outras citocinas/quimiocinas (IFN-α2, IFN-γ, IL-12p70, IL-1β, IL-6, TNF-α, IP-10, MCP-1, MIP1α, MIP-1β, IL-5 e IL-10) no grupo controle. Todas essas correlações foram perdidas no grupo HIV-1+, e formaram-se novas conexões com as moléculas IL-17 e IL-1β. Interessantemente, houve recuperação parcial no grupo TARV das correspondências inicialmente observadas no grupo controle para essa quimiocina. Para a citocina IFN-γ, importante na função desempenhada pelas células NK, à medida que sua produção aumentava, ocorria também aumento das quimiocinas MIP-1α e MIP-1β, quimioatraentes relevantes na atração de outros leucócitos durante o processo inflamatório. Essa correlação observada no grupo controle foi perdida nos grupos HIV-1+ e TARV, sendo que, interessantemente, quando os pacientes são tratados, o número de conexões formadas considerando a citocina IFN-γ foi o menor observado entre os três grupos. A quimiocina RANTES apresentou o menor número de correlações entre os outros analitos nos três grupos. Nos indivíduos controles, verificou-se correlação positiva forte com IP-10 e moderada com IL-17. Enquanto no grupo HIV-1+, essas correspondências foram perdidas e observou-se somente associação fraca com IL-10. Nos pacientes sob tratamento, esta quimiocina não teve correlação significativa com nenhuma outra citocina/quimiocina, embora sua produção tenha sido significativamente maior neste grupo (Figura 19). Outra molécula com pequeno número de correlações formadas foi a quimiocina IP-10. No grupo HIV-1+, esse marcador perdeu todas as seis conexões positivas existentes com as moléculas: IL-6, IL-17, GM-CSF, RANTES, MIP-1α e MIP-1β, as quais foram observadas no grupo controle. Essas conexões não foram reestabelecidas nos pacientes tratados, nos quais surgiram diferentes associações com IL-5 e IFN-γ. Esses resultados evidenciam a importância de estudarmos as correlações entre as diferentes moléculas e não somente sua expressão de forma individual. Isso porque mais importante que a quantidade de determinada citocina e/ou quimiocina é a interação existente entre elas no contexto da infecção, e o resultado de tal interação como sendo benéfico ou não para o hospedeiro. Nota-se claramente os diferentes perfis de células NK entre os grupos 70 SOARES, L.S. Resultados analisados, sendo que no grupo HIV-1+, esta célula aparenta estar não funcional, e mesmo após o tratamento antirretroviral, a homeostase não é restaurada. Outra associação relevante observada nos pacientes infectados pelo HIV-1+ foi entre as citocinas/quimiocinas produzidas pelas células NK e o tempo aproximado de infecção nesses indivíduos. Na figura 22, verifica-se correlação positiva significativa entre o tempo de infecção e as principais moléculas produzida pelas células NK, independente do tratamento antirretroviral. Ou seja, quanto maior o tempo em que o individuo encontra-se infectado pelo HIV-1+, maiores são os níveis de produção das moléculas: IFN-α2, IFN-γ, TNF-α, IL-12, IL6, MCP-1, IL-10 e IL-5, sugerindo maior estado de ativação dessas células. Essa observação corrobora com a definição atual da infecção por HIV-1 como doença inflamatória crônica destacando aspectos que devem ser levados em consideração quanto a sua implicação, principalmente naqueles pacientes que convivem com o vírus há vários anos. 71 Figura 21. Rede de interações entre as citocinas e quimiocinas produzidas pelas células NK. A análise da rede mostra correlações significativas (p<0,05) em todas as variáveis, calculadas por meio da correlação de Spearman entre cada par de moléculas e são representadas por linhas nos diferentes grupos clínicos estudados. A força de correlação foi determinada pelo valor de “r”. Os tipos de interações foram definidos como: forte (preto), moderada (verde) e fraca (vermelho pontilhado). SOARES, L.S. Resultados 72 SOARES, L.S. Resultados Figura 22. Tempo de infecção é determinante na modulação do estado de ativação das células NK. A partir dos valores referentes à concentração das citocinas/quimocinas produzidas pelas células NK e o tempo aproximado de infecção dos indivíduos HIV-1+, independente do tratamento, calculou-se o coeficiente de correlação de Spearman entre essas duas variáveis. Nos gráficos estão representados os valores de r e p, respectivamente. 73 SOARES, L.S. Resultados 5.4.4. Determinação da produção de granzima B pelas células NK Dentre as principais funções descritas para as células NK está a função citotóxica. Para executar tal função, após ativação da célula ocorre liberação de moléculas importantes como granzimas e perforinas. As granzimas estão envolvidas na ativação de caspases no interior da célula-alvo e consequente indução da apoptose. Nesse sentido, avaliou-se a produção de granzima B pelas células NK dos diferentes grupos clínicos estudados mediante o estímulo com IL-2. No entanto, não se observou diferença significativa entre os grupos como demonstrado na figura 23, com valores de mediana similares entre os grupos controle e TARV (188,7 e 264,5 pg/mL, respectivamente). No grupo HIV-1+, a mediana da produção de granzima B foi de 624,2 pg/mL, embora seja uma quantidade significativa, ocorreu grande variação neste grupo, como demonstrado pela dispersão dos valores na figura 23. 74 SOARES, L.S. Resultados Granzima B (pg/mL) 2500 2000 1500 1000 500 V R TA H IV -1 + C on tr ol e 0 Figura 23. Determinação da produção de granzima B pelas células NK. As células NK obtidas após separação por microesferas magnéticas foram incubadas com IL-2 (200U/mL) por 72 horas. Após esse período, coletou-se o sobrenadante e quantificou-se a produção de granzima B por ELISA. Boxplot dos valores relativos à produção de granzima pelas células NK, em que os dados estão expressos como mediana e intervalo interquartil (Teste de Kruskal Wallis seguido do Teste de Dunn). 75 SOARES, L.S. Resultados 5.4.5. Quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio pelas células NK O estresse oxidativo celular pode ser indicativo do fenômeno de senescência celular e é facilmente avaliado pela quantificação de espécies reativas de oxigênio (ROS – reactive oxygen species) por quimioluminescência. Considerando que na senescência, a célula também perde sua função, realizou-se a quantificação de ROS por quimioluminescência na população em estudo, para verificarmos se as células dos indivíduos infectados pelo HIV-1 estavam não funcionais devido a esse fenômeno. Como demonstrado na figura 24, observou-se tendência no aumento da produção de ROS pelas células NK do grupo TARV (quando estimulada com PMA), com valor de mediana 1,7 vezes maior que a do grupo controle e aproximadamente 2 vezes maior que a do grupo HIV-1+. Esse resultado sugere a ocorrência do fenômeno de imunosenescência nestas células e que pode estar correlacionado devido ao maior estado de ativação verificado nesse grupo pela produção de citocinas e quimiocinas durante o ensaio de citotoxicidade. 76 SOARES, L.S. Resultados Área sob a curva 6×106 Controle HIV-1+ TARV 4×106 2×106 0 PMA - + - + - + Figura 24. Quantificação de espécies reativas de oxigênios liberadas por células NK de indivíduos dos grupos controle, HIV-1+ e TARV espontaneamente ou após estímulo com PMA. As células NK foram purificadas e estimuladas com PMA a 10-7 M. Os resultados estão expressos em mediana e intervalo interquartil da área sob a curva de quimioluminescência do Luminol em células NK após 3500 segundos de estímulo. 77 SOARES, L.S. Resultados 5.5. Caracterização das modificações epigenéticas relacionadas às disfunções das células NK 5.5.1. Determinação do padrão de metilação global do DNA das células NK Considerando as alterações fenotípicas e funcionais observadas nas células NK de indivíduos HIV-1+ submetidos ou não ao tratamento antirretroviral, procedeu-se à investigação de mudanças epigenéticas que pudessem estar correlacionadas à resposta imune das células NK nestes indivíduos. Para tanto, inicialmente analisou-se o perfil de metilação global do DNA purificado de células NK dos grupos controle, HIV-1+ e TARV como demonstrado na figura 25. Apesar da mediana da porcentagem de metilação relativa ter sido semelhante entre os grupos, quando os pacientes HIV-1+ foram analisados conforme a progressão da doença, nota-se aumento na frequência de metilação do DNA das células NK dos indivíduos em estágio avançado da doença (carga viral > 10.000 cópias/mL e células T CD4+ < 200/mm3), mais especificamente dos pacientes HIV15 e HIV18, como destacado na figura. Por outro lado, observa-se semelhança no perfil de metilação global do DNA das células NK dos indivíduos do grupo TARV em relação ao controle. Considerando que as células NK do grupo TARV encontram-se mais ativadas, essa observação parece refletir em parte na menor porcentagem de metilação global do DNA em relação ao grupo HIV-1+, sendo que essa diferença deve ser mais pronunciada quanto à metilação dos genes específicos como TNF-α , IFN-γ, IFN-α2 e RANTES (não analisadas neste trabalho). Não foi vista diferença no perfil de metilação quanto aos diferentes esquemas terapêuticos do grupo TARV. Esses dados sugerem fortemente a relação de alterações epigenéticas em genes da resposta imune nas células NK com as modificações fenotípicas e funcionais observadas nestas células nos pacientes HIV-1+ e TARV, que podem ser resultado direto dos mecanismos de escape induzidos pelo vírus no hospedeiro assim como do contexto inflamatório em que essas células se encontram. 78 SOARES, L.S. Resultados %metilação global DNA HIV18 HIV15 100 80 60 40 30 20 10 V R TA + H IV -1 C on tr ol e 0 Figura 25. Provável correlação entre a frequência de metilação global das células NK de pacientes HIV-1+ e o grau de progressão da doença. Os dados estão expressos em relação ao DNA controle 100% metilado e a linha indica a mediana relativa de cada grupo (Teste de Kruskal Wallis seguido do Teste de Dunn). 79 SOARES, L.S. Resultados 5.5.2. Avaliação do padrão de metilação específico do gene KIR2DL2/L3 Considerando que os mecanismos epigenéticos, em especial a metilação, possuem grande importância na regulação da expressão dos receptores do tipo KIR e que eles estavam alterados nas células NK analisadas, prosseguiu-se à investigação da porcentagem de metilação específica na região promotora do gene KIR2DL2. Interessantemente, as células NK positivas para esse marcador estavam diminuídas em número no grupo HIV-1+, no entanto os valores de MIF estavam aumentados em relação aos grupos controle e TARV. Com o intuito de correlacionar esses resultados com possíveis modificações epigenéticas, realizou-se a análise da metilação após modificação do DNA por bissulfito, com posterior clonagem e sequenciamento do DNA pelo método de Sanger. Inicialmente, verificou-se a sequência de DNA genômico da região analisada antes da reação de modificação do DNA por bissulfito para confirmação da sequência e investigação de possíveis polimorfismos, os quais devem ser levados em consideração para correto alinhamento das sequências em análise posterior. Os resultados obtidos após sequenciamento do DNA pelo método de Sanger e os respectivos alinhamentos com a sequência referência do genoma estão demonstrados na figura suplementar 05 (Apêndice). As amostras foram escolhidas para análise da metilação com base nos níveis de expressão da molécula NKAT2. Dentre os indivíduos investigados, observou-se a ocorrência de dois polimorfismos na sequência do paciente HIV11 do grupo HIV-1+ (Figura 26). O primeiro polimorfismo (rs10414999) envolveu a troca da base Adenina por uma Guanina. Enquanto o segundo polimorfismo identificado (rs10415421) referiu-se à troca de uma Citosina por uma Adenina. Ambos polimorfismos encontram-se mapeados na região promotora do gene KIR2DL2 (sequencia referencia GenBank NM_014219.2). 80 SOARES, L.S. Resultados Figura 26. Identificação de dois polimorfismos na região analisada do gene KIR2DL2 no paciente HIV11. Os resultados foram obtidos após sequenciamento do DNA pelo método de Sanger e o alinhamento foi realizado no programa MultiAlin tendo como base a sequência referência do genoma obtida da base de dados do GenBank (NM_014219.2). Identificação dos polimorfismos: rs10414999 (A/G) e rs10415421 (C/A). 81 SOARES, L.S. Resultados Após verificação das sequências de DNA antes da modificação por bissulfito, realizouse a clonagem do fragmento de interesse e posterior sequenciamento de no mínimo oito clones positivos de cada amostra para quantificação da porcentagem de metilação. Foram analisadas o total de 19 dinucleotídeos CpG localizados na posição física do cromossomo 19: 54738176-54738672 (ou -271 a +81) do gene KIR2DL2, tendo como referência a base de dados do GenBank. Para quantificação da frequência de metilação, os pontos de metilação foram alinhados com auxílio dos programas Clustal e MultiAlin como demonstrado na figura suplementar 06 (Apêndice). Na figura 27 estão demonstrados os resultados representativos de cada grupo quanto ao perfil de metilação dos clones sequenciados. Nota-se que a maioria dos dinucleotídeos CpG estão metilados como representado pelo círculo preenchido. A média da porcentagem de metilação foi semelhante entre os grupos, sendo de 74,5; 76,5 e 75,3% nos grupos controle, HIV-1+ e TARV, respectivamente (Figura 28). Em resumo, não foi observada diferença significativa entre os níveis de metilação total da região analisada entre os grupos (Figura 28). Quanto às frequências de metilação pontuais também não foi verificada diferença significativa entre os grupos como demonstrado pelos gráficos representativos na figura 29. 82 SOARES, L.S. Resultados Figura 27. Gráficos representativos dos níveis de metilação na região analisada do gene KIR2DL2. O perfil de metilação para cada posição CpG está representada pelos círculos não preenchidos (não metilado) e preenchidos (metilado). Os números referem-se à posição física de cada CpG em relação ao sítio de inicio da transcrição. 83 SOARES, L.S. 100 80 60 40 20 V R TA ol tr on C H IV -1 + 0 e %Metilação total - KIR2DL2 Resultados Figura 28. Maior porcentagem de metilação total na região analisada do gene KIR2DL2. A avaliação da metilação foi feita após clonagem e sequenciamento do DNA pelo método de Sanger seguida do alinhamento com a sequência referência do gene em questão e análise no software QUMA. Figura 29. Frequências de metilação pontuais dos dinucleotídeos CpG na região -271 a +81 do gene KIR2DL2. Os gráficos são representativos dos grupos controle, HIV-1+ e TARV, respectivamente. 84 SOARES, L.S. Resultados 5.5.3. Análise da frequência de enzimas que promovem as modificações epigenéticas Em resumo, os mecanismos epigenéticos envolvidos na regulação gênica podem ser classificados como ativador transcricional ou silenciador gênico. Na primeira análise do perfil epigenético, quantificou-se a porcentagem de metilação global e específico do DNA das células NK, sendo que essa modificação está associada à repressão gênica. Com o objetivo de continuar essa caracterização, procedeu-se à quantificação das enzimas envolvidas nas alterações que promovem a transcrição (Figura 30) e a repressão gênica (Figuras 31 e 32). Para tanto, analisou-se por PCR em tempo real a expressão dessas enzimas nas células NK dos grupos controle, HIV-1+ e TARV, sendo que os dados estão expressos considerando-se o grupo controle como amostra de referência. Dentre as enzimas que promovem as alterações relacionadas à transcrição gênica estão as histonas acetil-transferases. Essas enzimas estão envolvidas na acetilação de histonas, promovendo o remodelamento da cromatina e regulação dos processos nucleares. Não foram constatadas diferenças significativas entre as histonas acetil-transferases analisadas (ATF2, HAT1, KAT2B, KAT5) nas células NK dos pacientes infectados pelo HIV-1+, independente do tratamento (Figura 30). Outro grupo de enzimas quantificadas foram as histonas metil-transferases (CARM1, PRMT5, SMYD3, SUV39H1, ASH1L, KMT2C, KMT2E e SETD1B). Enquanto a metilação do DNA está sempre associada à repressão gênica, a metilação de histonas pode promover a ativação da transcrição gênica. A expressão dessas enzimas também não se modificou nas células NK dos diferentes indivíduos estudados como demonstrado na figura 30. E, por fim, as histonas demetilases KDM5B e KDM6B também não modificaram sua expressão nos grupos HIV-1+ e TARV. Embora seja importante ressaltar a maior expressão de KDM6B nos pacientes infectados, independente do tratamento, com valores de mediana 3,6 e 2,2 vezes maior que os indivíduos controles nos grupos HIV-1+ e TARV, respectivamente. Essa enzima está envolvida especificamente na demetilação da lisina 27 da histona H3 e possui importante função na resposta inflamatória e diferenciação de macrófagos. Quanto às enzimas envolvidas na repressão gênica, realizou-se a quantificação de uma classe de proteínas que atuam por meio da remoção de grupos acetilas das lisinas de histonas denominadas histonas deacetilases (HDAC). Foram analisadas um total de 11 HDACs (Figura 31) nas células NK provenientes dos grupos controle, HIV-1+ e TARV, sem alteração significativa da expressão nestes três grupos. 85 SOARES, L.S. Resultados Outro conjunto de enzimas analisadas foram as DNA metil-transferases (DNMT1, 3A e 3B), MECP2 (methyl CpG binding protein 2), MBD2 e 3 (methyl-CpG binding domain protein), RBBP4 e 7 (Retinoblastoma binding protein), CHD4 (Chromodomain helicase DNA binding protein 4), SIN3A, TRDMT1 (TRNA aspartic acid methyltransferase 1), SAP18 e 30. Não se verificou alteração estatisticamente significativa quanto à expressão dessas proteínas nos diferentes grupos analisados, com a observação de tendência de aumento de CHD4 no grupo TARV (Figura 32). Essa enzima representa um dos componentes principais do complexo de deacetilases e atua no remodelamento do nucleossomo, sendo sua função fundamental na repressão da transcrição gênica. As enzimas analisadas estão envolvidas na formação de complexos protéicos com funções biológicas importantes na regulação gênica. Os resultados obtidos quanto às expressões de cada proteína indicam que, a princípio, as células NK circulantes nos pacientes infectados pelo HIV-1+ não apresentam alterações epigenéticas no seu estado basal, quanto ao nível de enzimas promotoras dessas modificações. 86 SOARES, L.S. Resultados HAT1 0.0 1.0 0.5 0.0 CARM1 0.5 0.0 1.5 1.0 0.5 ASH1L 0.0 1.0 0.5 0.0 KDM5B 0.0 8 Expressão relativa Expressão relativa 0.5 0.5 1.5 1.0 0.5 0.0 SETD1B 1.5 1.0 0.5 0.0 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 KDM6B 2.0 1.0 1.0 2.0 Expressão relativa Expressão relativa Expressão relativa 0.5 SUV39H1 KMT2E 2.0 1.0 0.5 2.0 0.0 1.5 1.0 0.0 1.5 KMT2C 2.0 1.5 SMYD3 0.0 1.5 0.5 2.0 Expressão relativa Expressão relativa Expressão relativa 1.0 1.0 0.0 2.0 1.5 1.5 PRMT5 2.0 Expressão relativa 0.5 1.5 2.0 Expressão relativa 1.0 KAT5 2.0 Expressão relativa Expressão relativa Expressão relativa 1.5 1.5 KAT2B 2.0 Expressão relativa ATF2 2.0 7 6 HIV-1+ TARV 5 4 3 2 1 0 Figura 30. Níveis de expressão relativa dos genes que codificam as enzimas promotoras de modificações epigenéticas relacionadas à transcrição gênica. A expressão gênica foi quantificada pela técnica de PCRArray em Tempo Real, utilizando-se os genes constitutivos: β-actina e GAPDH e a amostra controle como referência. Os dados estão expressos como mediana e intervalo interquartil. 87 SOARES, L.S. Resultados HDAC2 1 3 2 1 0 HDAC5 1.0 0.5 0.0 3 2 1 HDAC9 0 2 1 2 1 0 HDAC8 3 2 1 0 HDAC11 4 Expressão relativa 1 1 4 3 HDAC10 Expressão relativa 2 2 0 0 4 3 3 HDAC7 0 4 3 1 4 Expressão relativa Expressão relativa Expressão relativa 1.5 2 0 4 2.0 3 HDAC6 2.5 4 Expressão relativa 2 HDAC4 4 Expressão relativa Expressão relativa Expressão relativa 3 0 Expressão relativa HDAC3 4 Expressão relativa HDAC1 4 3 HIV-1 + TARV 2 1 0 Figura 31. Níveis de expressão relativa dos genes que codificam as enzimas promotoras de modificações epigenéticas relacionadas à repressão gênica: Histonas Deacetilases (HDAC). A expressão gênica foi quantificada pela técnica de PCR-Array em Tempo Real. Os dados estão expressos como mediana e intervalo interquartil. 88 SOARES, L.S. Resultados DNMT3A 2 1 0 MBD2 1 0 3 2 1 1 0 0 RBBP7 2 1 3 2 1 0 TRDMT1 SAP18 4 Expressão relativa Expressão relativa 1 2 1 4 0 4 3 2 0 3 SIN3A CHD4 3 3 RBBP4 0 2 1 4 Expressão relativa Expressão relativa Expressão relativa 2 2 0 4 3 3 MBD3 4 Expressão relativa 1 3 4 Expressão relativa 2 MECP2 4 Expressão relativa Expressão relativa Expressão relativa 3 0 Expressão relativa DNMT3B 4 3 2 1 0 4 Expressão relativa DNMT1 4 3 2 1 0 SAP30 Expressão relativa 4 3 HIV-1 + TARV 2 1 0 Figura 32. Níveis de expressão relativa dos genes que codificam as enzimas promotoras de modificações epigenéticas relacionadas à repressão gênica. A expressão gênica foi quantificada pela técnica de PCR-Array em Tempo Real. Os dados estão expressos como mediana e intervalo interquartil. 89 SOARES, L.S. Resultados 5.5.4. Investigação de modificações epigenéticas associadas às histonas em genes da resposta imune de células NK Os resultados descritos no tópico anterior demonstraram que a maioria das enzimas envolvidas nas modificações de histonas não estão alteradas nas células NK durante a infecção por HIV-1+. Dessa forma, investigou-se se essas alterações já teriam ocorrido nas regiões promotoras dos genes relativos às citocinas que apresentaram diferença de expressão entre os grupos estudados. Dentre as modificações de histonas, avaliou-se a trimetilação da lisina 27 na histona H3 (H3K27me3) associada à repressão da transcrição gênica e a trimetilação da lisina 4 na histona H3 (H3K4me3) relacionada à ativação. Para tanto, realizou-se o ensaio de imunoprecipitação da cromatina utilizando anticorpos específicos para essas modificações e posterior quantificação da região imunoprecipitada por PCR em Tempo Real. As sequências analisadas eram relativas à região promotora das citocinas TNF-α e IFN-γ, previamente descritas na literatura por influenciarem a transcrição gênica dessas proteínas. Na figura 33 estão demonstrados os resultados obtidos quanto à citocina TNF-α por alguns individuos de cada grupo. Se compararmos a porcentagem de DNA imunoprecipitado relativo à quantidade de amostra inicial (% input), constata-se aumento da modificação H3K27me3, relacionada à repressão em detrimento daquela associada à ativação (H3K4me3) em todos os indivíduos analisados, exceto pelo CT19, que apresentou maior ativação do que repressão. Devido à variação entre os indivíduos, não foi possível a observação de um padrão entre os grupos analisados e a consequente correlação com os níveis de produção dessa citocinas pelas células NK. Quanto ao perfil de modificação de histonas observada na região promotora da citocina IFN-γ, também não foram constatadas diferenças significativas, com aparente enriquecimento de alterações associadas à repressão (H3K27me3) em detrimento daquelas relacionadas à ativação (H3K4me3) em todos os grupos analisados (Figura 34). Esses resultados não explicam o aumento na produção de citocinas pelas células NK no grupo TARV como esperado. No entanto, justificam em parte a menor quantidade dessas citocinas no grupo HIV-1+, embora os indivíduos controle também tenham apresentado perfil de histonas mais relacionado à repressão. Além disso, analisou-se somente uma pequena porção da região promotora, sendo que podem ocorrer modificações de histonas associadas a regiões próximas às que foram amplificadas e que possuam maior influência na transcrição 90 SOARES, L.S. Resultados das proteínas quantificadas. Nesse sentido, mais estudos devem ser realizados para compreensão dos mecanismos epigenéticos diretamente relacionados à alteração de expressão das diferentes moléculas nos indivíduos HIV-1+, submetidos ou não ao tratamento antirretroviral, e a implicação de tais alterações a longo prazo. 91 SOARES, L.S. Resultados H3K4me3 - TNF-α 15 10 5 2.0 2.0 1.0 1.5 1.0 0.0 0.0 TA R V TA 06 R V TA 15 R V TA 18 R V2 1 CT 16 CT 19 CT 24 CT 29 0.5 HI V1 2 HI V1 4 HI V1 7 0.5 TA R V TA 06 R V TA 15 R V TA 18 R V2 1 1.5 HI V1 2 HI V1 4 HI V1 7 % Input 15 10 5 CT 16 CT 19 CT 24 CT 29 % Input H3K27me3 - TNF-α Figura 33. Regulação epigenética via modificações de histonas associadas à região promotora da citocina TNF-α. Após separação por esferas magnéticas, 1x106 células NK foram empregadas no ensaio de imunoprecipitação da cromatina utilizando anticorpos específicos paras modificações de histonas associadas à repressão (H3K27me3) e transcrição (H3K4me3) gênicas. As regiões imunoprecipitadas foram quantificadas por PCR em Tempo Real utilizando-se primers específicos para a região promotora dessa proteína. H3K4 IFN-γ 5 4 3 2.0 2.0 1.0 1.5 1.0 0.0 CT 16 CT 19 CT 24 CT 29 0.0 TA R V TA 06 R V TA 15 R V TA 18 R V2 1 0.5 HI V1 2 HI V1 7 HI V1 9 0.5 TA R V TA 06 R V TA 15 R V TA 18 R V2 1 1.5 HI V1 2 HI V1 7 HI V1 9 % Input 5 4 3 CT 16 CT 19 CT 24 CT 29 % Input H3K27 - IFN-γ Figura 34. Regulação epigenética via modificações de histonas associadas à região promotora da citocina IFN-γ Após separação por esferas magnéticas, 1x106 células NK foram empregadas no ensaio de imunoprecipitação da cromatina utilizando anticorpos específicos paras modificações de histonas associadas à repressão (H3K27me3) e transcrição (H3K4me3) gênicas. As regiões imunoprecipitadas foram quantificadas por PCR em Tempo Real utilizando-se primers específicos para a região promotora dessa proteína. 92 SOARES, L.S. 6. Discussão 93 SOARES, L.S. Discussão 6. Discussão A infecção por HIV-1 tem sido caracterizada como doença inflamatória crônica devido aos elevados níveis de citocinas pró-inflamatórias encontradas no plasma dos indivíduos infectados [90], assim como pela ativação de células T, principalmente durante a infecção aguda [91], e posterior evolução para estado de disfunção e exaustão dessas células com a cronicidade da infecção [92]. Com os avanços da terapia antirretroviral, os indivíduos infectados pelo HIV têm controlado mais eficientemente o desenvolvimento de infecções oportunistas e a progressão da doença para o quadro de imunodeficiência. No entanto, em detrimento do aumento da expectativa de vida, associada ao novo status imunológico após o tratamento, esses indivíduos têm apresentado maior incidência de doenças não relacionadas à AIDS, como doenças cardiovasculares, osteoporose, diabetes, e alguns tipos de câncer, as quais geralmente são associadas ao processo de envelhecimento. Apesar do tratamento antirretroviral diminuir significativamente a viremia, os reservatórios virais não são completamente eliminados e a integridade de mucosa não é inteiramente reestabelecida, permanecendo o estímulo ao sistema imunológico. Essa observação levantou a hipótese de que a infecção por HIV-1 poderia estar relacionada à aceleração do envelhecimento natural [32, 93]. Além disso, considerando que em pacientes tratados, a progressão da doença tem sido mais relacionada às células da imunidade inata [94], tem crescido o número de estudos objetivando maior compreensão do envolvimento dessas células na patogênese do HIV. Nesse sentido, este trabalho descreveu as principais alterações fenotípicas e funcionais de células natural killer na infecção por HIV-1 e a correlação com modificações epigenéticas nessas células. Embora estas últimas tenham sido sutis, em conjunto com as disfunções observadas, sugerimos possível grau de exaustão nas células NK provenientes dos indivíduos HIV-1+ recentemente infectados, em paralelo ao estado de imunosenescência celular naqueles sob tratamento antirretroviral regular há no mínimo seis meses. Os resultados obtidos a partir da análise plasmática da população em estudo demonstram o perfil pró-inflamatório característico nos pacientes infectados pelo HIV-1+. Esse perfil é evidente nos indivíduos recentemente infectados (grupo HIV-1+) como visto pelos maiores níveis de sCD163, TNF-α, IP-10 e IL-10 (Figuras 4, 5 e 6). O aumento dos níveis plasmáticos de CD163 solúvel está relacionado à clivagem dessa molécula a partir da membrana de monócitos e/ou macrófagos, após ativação do receptor do tipo Toll, entre outros, como forma de diminuir a ativação dos monócitos e a inflamação [95]. Em 2011, 94 SOARES, L.S. Discussão Burdo e colaboradores [96] observaram pela primeira vez a associação desse marcador com a replicação do HIV e sugeriram a utilização do sCD163 como um dos fatores preditivos de progressão da doença. As moléculas TNF-α, IP-10 e IL-10 estão entre o conjunto de citocinas descritas previamente como aumentadas sistemicamente nos pacientes HIV-1+, especificamente naqueles considerados progressores rápidos, os quais apresentam diminuição da contagem de linfócitos T CD4+ abaixo de 350 células/mm3 em até doze meses após a infecção [31], assim como naqueles que ainda não iniciaram a terapia antirretroviral [29]. Diversas células são consideradas fontes dessas moléculas, sendo que em pacientes virêmicos a maior quantidade de TNF-α é produzida por monócitos e sua produção excessiva compromete a integridade da barreira epitelial favorecendo ainda mais a indução da inflamação sistêmica [97]. A produção de IL-10 pelas células T reguladoras também está relacionada à progressão da doença, pois seus altos níveis em decorrência do excesso de inflamação acabam por inibir o desenvolvimento da resposta imune adaptativa protetora durante a infecção [98]. E por fim, a quimiocina IP-10 foi destacada como fator preditivo, melhor indicador do prognóstico do paciente do que a carga viral e a contagem de linfócitos T CD4+, logo ao inicio da infecção [31]. As células T são consideradas a principal fonte de IP-10 em resposta ao estímulo de IFN do tipo I, e a principal função dessa quimiocina é o recrutamento de células CXCR3+ para os linfonodos, amplificando a inflamação e atraindo novos alvos para infecção pelo HIV [99], justificando sua utilização na análise da progressão da doença. Outra importante ferramenta para análise da progressão da infecção pelo HIV é a quantificação da expressão das moléculas CD38 e HLA-DR, principalmente nas células T CD8+ [100, 101]. Nesse sentido, um estudo recente também demonstrou a correlação entre a expressão desses marcadores nas células NK e a progressão da doença [102]. Embora essas moléculas não tenham sido analisadas em nosso estudo, realizamos a quantificação de outros marcadores como o CD69 (Figura 15). Dados na literatura geralmente demonstram aumento da expressão de CD69 nas células NK, caracterizando-as como ativadas fenotipicamente, mas não funcionais [51]. Em nossos resultados, nos indivíduos HIV-1+ virgens de tratamento, a expressão de CD69 estava ligeiramente aumentada, embora não significativa. Observou-se discreto aumento dos receptores de ativação NKp30 e NKG2A em relação aos grupos controle e TARV (Figura 15), no entanto os resultados obtidos não nos permitem tirar mais conclusões nesse sentido, sendo necessária também a quantificação dessas proteínas, além de sua expressão gênica. 95 SOARES, L.S. Discussão Diversos fatores estão relacionados à inflamação sistêmica observada nos pacientes HIV-1+, principalmente naqueles recentemente infectados e que ainda não iniciaram a terapia antirretroviral como visto em nossos resultados. Dentre as causas estão a expansão de células T HIV-específicas, ativação de células inatas em resposta aos ligantes de TLR, diminuição de células T reguladoras, ocorrência de co-infecções, e principalmente a ruptura da integridade de barreira epitelial da mucosa intestinal [103]. Esse último fenômeno favorece a translocação de produtos microbianos como LPS, sendo que um de seus ligantes é a molécula CD14, além do TLR4 [104]. Dessa forma, a quantificação de CD14 solúvel no plasma funciona como medida indireta da translocação microbiana, e em nossos resultados, esse aumento foi progressivo nos pacientes sob tratamento antirretroviral (Figura 4), assim como demonstrado por Burdo et al. [96] e Sandler et al. [105]. Essas observações sugerem a não recuperação da integridade da mucosa intestinal mesmo após o tratamento e evidenciam a importância do início imediato da terapia antirretroviral, como recomendado atualmente. Diante desse cenário inflamatório sistêmico encontrado nos pacientes HIV-1+, a caracterização dos mecanismos envolvidos, em níveis celular e molecular, é essencial para compreensão da patogênese do HIV e subsequente implementação de estratégias translacionais visando a melhoria da qualidade de vida desses pacientes. Nesse sentido, os linfócitos T, monócitos e macrófagos estão entre as células mais estudadas durante a infecção, principalmente pela correlação positiva entre seu estado de ativação e a progressão da doença [96, 100], e por serem os principais reservatórios virais [106, 107]. Em paralelo, as células NK também são importante personagem neste cenário, sendo que seu perfil de ativação também está correlacionado com a progressão da doença [102]. Desta forma, os resultados aqui apresentados, especialmente aqueles relacionados a maior produção de citocinas inflamatórias nos pacientes do grupo TARV, os quais possuíam maior tempo de infecção, reforçam seu papel chave na resposta contra o HIV. A maioria dos estudos com células NK durante a infecção por HIV-1 descrevem alterações quanto à expressão dos receptores de ativação e inibição, assim como as variações nas proporções das subpopulações destas células, verificadas por meio da técnica de citometria de fluxo [50, 51, 108]. A partir da utilização dessa técnica, confirmamos neste trabalho a diminuição da frequência e número de células NK nos pacientes infectados por HIV-1+ e a recuperação parcial, embora não significativa, do número dessas células nos pacientes tratados (Figura 9). Essa diminuição também já foi descrita por outros grupos de pesquisa [51, 55, 109]. No entanto, existem resultados que demonstram aumento inicial das células NK devido à expansão da subpopulação CD56dimCD16+ [108]. Esse aumento foi 96 SOARES, L.S. Discussão relatado durante a fase aguda, em que os pacientes ainda não apresentavam resultado positivo para o teste de ELISA, mas possuíam vírus detectável no organismo. Em nossos resultados, não foi possível observar esse fenômeno, provavelmente devido aos diferentes tempos de infecção em que os pacientes se encontravam, e considerando a mediana do tempo de infecção de 5,3 e 156,4 meses nos grupos HIV-1+ e TARV, respectivamente, nota-se que grande parte dos pacientes analisados não estavam mais durante a fase aguda da infecção. Proporcionalmente, a queda no número de células NK da subpopulação citotóxica foi a principal responsável pela diminuição significativa do total de células NK no grupo HIV-1+ (Figura 10). Em contrapartida, a subpopulação não funcional CD56-CD16+ permaneceu elevada, inclusive nos pacientes HIV-1+ sob tratamento antirretroviral, sendo que nessa subpopulação observou-se diminuição significativa do receptor de ativação NKp46, característico das células NK (Figura 14). A expansão dessas células anérgicas foi observada há cerca de 20 anos e está relacionada em grande parte à desregulação funcional apresentada pelas células NK durante os diferentes estágios da infecção por HIV [54]. Com nossos resultados, mostramos que essa desregulação foi mais evidente no grupo HIV-1+, como visto pela menor porcentagem de citotoxicidade contra a linhagem tumoral K-562 e diminuição da produção de citocinas pelas células NK desse grupo (Figuras 16-19). A redução da função citotóxica em indivíduos com carga viral detectável também foi reportada por Mavilio et al. [50], por meio da análise da expressão da molécula CD107a na superfície das células NK como indicativo do fenômeno de desgranulação. Interessantemente, as células NK do grupo HIV-1+ demonstraram certa responsividade ao estímulo com IL-2 como observado pela produção de granzima B por essas células, embora a diferença entre os grupos não tenha sido significativa (Figura 23). Vale ressaltar que essa maior produção de granzima B foi observada naqueles pacientes com quantidade de células NK CD56brightCD16- acima da mediana do grupo HIV-1+ (dados não mostrados). Um fator bastante interessante e essencial ao entendimento deste resultado é que essa subpopulação é a única a expressar constitutivamente o receptor heterotrimérico de alta afinidade para a citocina IL-2, o que a torna responsiva mesmo a quantidades mínimas de IL2 [110]. Em nossos resultados, esse fato pode estar relacionado à maior produção de granzima B pelas células NK especificamente nesses indivíduos. Além da liberação de granzimas que estão relacionadas à indução de apoptose nas células infectadas, as células NK também são importantes produtoras de citocinas que auxiliam as demais células do sistema imune em suas funções essenciais. Enquanto os indivíduos do grupo HIV-1+ exibiram retração da resposta funcional das células NK, os 97 SOARES, L.S. Discussão pacientes do grupo TARV apresentaram recuperação da função citotóxica, acompanhada de elevada produção de citocinas e quimiocinas por essas células, sendo que para alguns analitos, como IFN-α2 e MCP-1, a produção foi significativamente maior até mesmo em relação ao grupo controle (Figuras 17 e 19). Esse fenótipo mais ativado do grupo TARV sugeriu, a principio, restauração da função das células NK em decorrência do tratamento antirretroviral. No entanto, após analisarmos o perfil de produção de citocinas e quimiocinas por meio do gráfico de radar e as correlações existentes entre essas moléculas (Figuras 20 e 21), nos deparamos com um fenótipo totalmente diferente do grupo controle e, sendo assim, distante do perfil inicial dessas células NK antes da infecção pelo HIV. Portanto, apesar do tratamento antirretroviral reduzir a viremia e auxiliar na recuperação parcial dos níveis de linfócitos T CD4+, estes pacientes apresentam inflamação residual comprometendo a completa restauração da função das células NK. Segundo a literatura, o fenômeno de exaustão ocorre após exposição excessiva e contínua a determinado estímulo [111], fato que ocorre durante o início da infecção pelo HIV1 nos indivíduos virêmicos. Em paralelo, existem dois outros eventos denominados anergia e imunosenescência, os quais também estão intimamente relacionados à disfunção da resposta imune. Na anergia, o estímulo é subótimo; enquanto na senescência, a causa está associada à permanência do estímulo de forma repetitiva mesmo após o desenvolvimento da resposta imune primária. Este último compara-se ao cenário encontrado nos pacientes do grupo TARV, que mesmo após tratamento antirretroviral, apresentam inflamação residual e replicação viral persistente, principalmente naqueles locais denominados santuários anatômicos, devido à baixa penetração das drogas antirretrovirais, como: mucosa intestinal, linfonodos, trato genital e sistema nervoso central [112]. O perfil super ativado das células NK do grupo TARV corrobora com a ideia de imunosenescência nas células desses pacientes. Embora não tenham sido analisados neste estudo os marcadores característicos de senescência, como atividade da telomerase e tamanho dos telômeros [113], os resultados obtidos quanto à produção de ROS, que estava elevada (Figura 24), são outro forte indicativo da ocorrência desse fenômeno nas células NK do grupo TARV. Isto porque o aumento do estresse oxidativo celular está entre os fatores característicos da senescência celular [114]. Além disso, observou-se diminuição da expressão do receptor de inibição CD158a na subpopulação de células NK citotóxicas do grupo TARV (Figura 12) e maior expressão do receptor de ativação NKp46 na subpopulação CD56brightCD16- deste grupo (Figura 14), o que pode ter favorecido o maior estado de 98 SOARES, L.S. Discussão ativação dessas células e a subsequente maior capacidade citotóxica e de produção de citocinas. A primeira evidência clínica do envelhecimento celular durante a infecção por HIV refere-se ao acúmulo de células T CD8+ que perderam a expressão do correceptor CD28 e aumentaram a expressão da molécula CD57. Essas células possuem capacidade reduzida de produção de IL-2 e proliferação, além de apresentarem encurtamento do comprimento dos telômeros [115]. No entanto, os estudos ainda não são conclusivos quanto à associação desse fenótipo celular à imunosenescência, assim como sua relação com a progressão da doença. Além disso, é importante ressaltar que a molécula CD57 foi inicialmente descrita em células NK e é considerada um marcador de maturação final dessas células e não necessariamente um marcador de imunosenescência [116]. Entretanto, há relatos do acúmulo de células NK CD57+ com o avanço da idade, e também em hepatites virais [117, 118]. Dessa forma, mais estudos são necessários com o objetivo de compreender as implicações do perfil relacionado à senescência na infecção por HIV, visto que os pacientes HIV+ tem aumentado sua expectativa de vida ao mesmo tempo em que passaram a apresentar maior incidência de comorbidades, que são mais frequentes em indivíduos idosos. Considerando que a imunosenescência caracteriza-se como um estado de inflamação crônica sistêmica semelhante ao observado nos pacientes HIV-1+, existem diversos fatores que podem estar relacionados à indução desse fenômeno. Entre eles estão: a própria infecção viral, a terapia antirretroviral, assim como a ocorrência de co-infecções [93]. Dentre os antirretrovirais utilizados no tratamento da infecção por HIV-1, os inibidores da transcriptase reversa como o AZT (zidovudina) e Tenofovir inibem a atividade da telomerase in vitro e estão relacionados ao encurtamento do telômero, evidenciando a influência também do tratamento antirretroviral na senescência celular além da infecção per se [119, 120]. Além disso, co-infecções também favorecem a ativação do sistema imune nos pacientes HIV-1+, como a co-infecção com CMV, que mesmo em indivíduos assintomáticos estava associada ao aumento da ativação de células T e da replicação viral nos pacientes HIV-1+, tratados ou não [121]. Nos pacientes analisados em nosso estudo, a maioria possuía anticorpos IgG positivo para o CMV (dados não mostrados), no entanto não temos como afirmar se esses indivíduos apresentavam a infecção ativa no período em que foram realizadas as coletas e não fica clara a sua relação com o estado de ativação das células NK nesses pacientes. Enquanto nas células NK do grupo TARV sugerimos o estado de imunosenescência, as células do grupo HIV-1+ apresentaram características mais condizentes com o perfil de exaustão celular. Dentre as propriedades observadas nesse sentido estão a menor porcentagem 99 SOARES, L.S. Discussão de citotoxicidade contra a linhagem tumoral K-562 (Figura 16) e reduzida produção de citocinas (Figura 17-19). Outro aspecto analisado por nós e que também está relacionado à exaustão celular foi a expressão de receptores de inibição nestas células (Figura 11). Embora o número de células NK positivas para os três KIR analisados tenha diminuído no grupo HIV1+, observou-se aumento significativo da mediana da intensidade de fluorescência para o receptor NKAT2. Em contrapartida, foi interessante notar que essas células também possuíam maior expressão do receptor de ativação NKp46 (Figura 13), o que contradiz com o perfil de exaustão celular, pois nesse estado, as células diminuem a expressão de marcadores característicos das células NK como o NKp46. Portanto, para confirmação da hipótese aqui sugerida, outras moléculas devem ser quantificadas como PD-1 e Tim-3, que apresentam forte correlação com o fenômeno de exaustão celular [111]. Em resumo, verificamos neste trabalho que o estado funcional das células NK nas diferentes fases da doença (infecção recente versus crônica associada ao tratamento antirretroviral) encontra-se alterado e parece estar associado à progressão da doença. Nos pacientes do grupo TARV que estão infectados há mais tempo, as células NK modificam seus perfis de ativação, evoluindo de um padrão de exaustão como observado na infecção recente para a imunosenescência. Após analisarmos os efeitos que a infecção pelo HIV induziu nas células NK dos pacientes investigados, nossa principal hipótese era de que essas alterações fenotípicas e funcionais das células NK discutidas até aqui seriam resultado de modificações epigenéticas nestas células. Isto porque sabemos que infecções podem alterar o estado funcional do sistema imune e já foi mostrado que modificações epigenéticas estariam envolvidas nesta programação celular. A primeira análise feita nesse sentido foi a quantificação da metilação global do DNA em células NK obtidas do sangue periférico dos indivíduos infectados pelo HIV-1, em tratamento antirretroviral ou não (Figura 25). Interessantemente, observou-se aumento significativo da metilação global do DNA naqueles pacientes virgens de tratamento e que estavam em estágio avançado da doença, com carga viral maior que 10 000 cópias/mL e células T CD4+ menor que 200 por mm3. Esses resultados sugerem uma relação de causa e efeito entre a maior porcentagem de metilação do DNA e o estado disfuncional das células NK desses pacientes, em que a não responsividade dessas células poderia ser explicada pela menor expressão de moléculas essenciais para execução de sua função durante a infecção viral. Ainda existem poucos estudos que investigam alterações epigenéticas em decorrência da infecção por HIV-1, visto que a maioria está relacionada à análise de modificações associadas à latência viral. Recentemente, foi publicado um trabalho com gêmeos 100 SOARES, L.S. Discussão monozigóticos em que um deles estava infectado pelo HIV-1 e o outro não [122]. A partir da quantificação da metilação global em células mononucleares do sangue periférico, notou-se que o gêmeo infectado possuía maior percentual de metilação global em comparação ao gêmeo saudável, corroborando com nossos dados. Outro trabalho também demonstrou resultado semelhante utilizando modelo de infecção in vitro, com aumento da porcentagem de metilação global após 12 horas de cultura das células mononucleares com o HIV-1 [123]. Considerando a provável influência do mecanismo de metilação do DNA no fenótipo e função das células NK dos pacientes HIV-1+, realizou-se a análise do perfil de metilação gene-específico. Para tanto, quantificou-se a porcentagem de metilação das ilhas CpG presentes na região promotora do gene KIR2DL2. Esse receptor foi quantificado por citometria de fluxo por meio da utilização do anticorpo anti-NKAT2, sendo que poucas células NK do grupo HIV-1+ expressavam esse receptor em grande quantidade como observado pela mediana da intensidade de fluorescência dessa molécula (Figura 11). Para quantificação da metilação gene-específico, empregou-se a técnica de modificação por bissulfito seguida da clonagem e sequenciamento do DNA de no mínimo oito clones de cada amostra pelo método de Sanger. No entanto, não se observou diferença significativa quanto à porcentagem de metilação da região analisada entre os diferentes grupos (Figuras 27-29). Embora um estudo prévio tenha relacionado o maior percentual de metilação dessa região do gene KIR2DL2 com a menor expressão da proteína [81], pode ser que, em nosso contexto, outras regiões e/ou até mesmo outros mecanismos estejam envolvidos na regulação da expressão desse receptor nas células NK dos indivíduos HIV-1+. Interessantemente, a partir dos resultados obtidos do sequenciamento de DNA antes da modificação por bissulfito, observou-se a ocorrência de dois polimorfismos na sequência analisada do gene KIR2DL2 de um dos pacientes do grupo HIV-1+ (HIV11) (Figura 26). Esses dois SNPs foram previamente descritos em estudos relacionados à história da evolução e adaptação de populações [124]. No entanto, não foram encontrados trabalhos relacionando esses polimorfismos com alterações da função de células NK. Dessa forma, não podemos afirmar se essa troca de bases na região intrônica do KIR2DL2 teria alguma implicação na função dessas células e consequentemente na resposta imune desse indivíduo contra o HIV. Embora dados da literatura demonstrem que dentre os polimorfismos, as trocas de base única (SNPs – single nucleotide polymorphims) são os mais frequentes e geralmente estão localizados ao longo de todo o genoma, sendo relativamente estáveis e variando entre as populações estudadas [125]. 101 SOARES, L.S. Discussão Outra abordagem realizada nesse estudo com objetivo de investigar as alterações epigenéticas, foi a quantificação da expressão gênica, pelas células NK, de enzimas que promovem essas modificações, ou seja, que estão relacionadas à ativação ou repressão da transcrição gênica. Apesar de não ter sido observada diferença significativa para nenhuma das enzimas avaliadas, algumas delas apresentaram sua expressão relativamente aumentada nos indivíduos infectados em comparação aos controles (Figuras 30-32). Dentre essas enzimas está a KDM6B, envolvida na demetilação da lisina 27 da histona 3, propiciando a transcrição gênica e também está relacionada a respostas inflamatórias ao participar da diferenciação de macrófagos [126]. Outras enzimas que estavam ligeiramente aumentadas foram as histonas deacetilases 4, 5, 10 e 11. Estas últimas promovem a deacetilação de histonas e favorecem a repressão da transcrição gênica [127]. Embora não tenhamos observado diferenças significativas quanto à expressão das enzimas envolvidas na indução das modificações epigenéticas, podemos sugerir que essas alterações não estejam associadas às disfunções observadas nas células NK dos pacientes HIV-1+ ou ainda que, no momento analisado, essas células já teriam retornado ao nível de expressão basal dessas enzimas. Além disso, não investigamos se as células NK dos indivíduos estudados estavam infectadas com o HIV, o que poderia exercer efeito mais significativo na modulação dessas enzimas como observado por alguns autores. Em modelos de infecção in vitro foi relatado aumento da histona deacetilase 2 (HDAC2) assim como da DNMT1, ambas associadas ao silenciamento gênico [128, 129], o que pode favorecer tanto a indução da latência viral quanto a diminuição da função da célula infectada. Nos dois casos, essas modificações estariam relacionadas a um mau prognóstico para o paciente HIV-1+. Considerando a hipótese de que algumas modificações epigenéticas já teriam ocorrido nas células NK e que por isso as enzimas não apresentaram mudanças significativas, analisamos também o padrão de metilação das histonas associadas à sequência de DNA de algumas das citocinas diferencialmente expressas nos grupos HIV-1+ e TARV(Figuras 33 e 34). Embora as regiões analisadas após imunoprecipitação da cromatina com anticorpos específicos para as modificações de ativação (H3K4me3) e repressão (H3K27me3) tenham sido previamente associadas com mudanças na expressão do IFN-γ e TNF-α [86, 87], em nossos resultados não observamos diferenças significativas entre os indivíduos testados. Apesar disso, não podemos afirmar que esse perfil de histonas não está relacionado à menor expressão dessas citocinas no grupo HIV-1+ e maior no grupo TARV, visto que outras regiões desses e de outros genes também precisariam ser quantificadas. 102 SOARES, L.S. Discussão De maneira geral, as células NK circulantes do sangue periférico de pacientes HIV-1+ apresentaram mudanças epigenéticas sutis quando comparadas às notórias alterações funcionais e fenotípicas encontradas nestas células. Grande parte da literatura existente sobre células NK e modificações epigenéticas está associada à regulação da expressão dos receptores característicos destas células durante seu desenvolvimento. Dessa forma, este é um dos primeiros trabalhos a investigar a existência de modificações epigenéticas ex vivo, em células NK provenientes diretamente de pacientes infectados pelo HIV-1. Mais estudos devem ser realizados nesse sentido com o intuito de compreendermos detalhadamente a relação desta população celular com a patogênese do HIV, e sobretudo com o fenômeno de senescência evidenciado. Com este trabalho e o conjunto de dados aqui discutidos, temos o intuito de promover avanços na área de ciência básica, os quais poderão, de forma translacional, influenciar na terapia do paciente. Isto porque tão importante quanto a redução da carga viral, está o controle da inflamação crônica em seus níveis celular e molecular, assim como é de suma relevância o reestabelecimento das funções de células do sistema imune inato que cooperam para manter o organismo vigilante, como as células natural killer. 103 SOARES, L.S. 7. Conclusões 104 SOARES, L.S. Conclusões 7. Conclusões Neste trabalho demonstramos a associação entre o perfil inflamatório sistêmico de pacientes infectados pelo HIV-1+ e as alterações de fenótipo e função de células NK. Nos pacientes recentemente infectados e virgens de tratamento, as células NK apresentaram perfil sugestivo de exaustão imune, com retração da produção de citocinas e função citotóxica. Naqueles indivíduos HIV-1+ sob estágio avançado da doença, essas disfunções foram mais pronunciadas e parecem estar correlacionadas ao maior grau de metilação do DNA nessas células. Por outro lado, células NK de pacientes sob tratamento antirretroviral e com maior tempo de infecção apresentaram um padrão de ativação indicativo do estágio de imunosenescência, evidenciado pela elevada produção de citocinas e maior estresse oxidativo nestas células. E por fim, a maioria das modificações epigenéticas observadas nas células NK foram sutis, sugerindo o envolvimento de outros mecanismos na mudança fenotípica e funcional dessas células durante a infecção pelo HIV-1. 105 SOARES, L.S. 8. Referências Bibliográficas 106 SOARES, L.S. Referências Bibliográficas 8. Referências Bibliográficas 1. (CDC), C.f.D.C., Update on acquired immune deficiency syndrome (AIDS)--United States. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 1982. 31(37): p. 507-8, 513-4. 2. 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O fragmento amplificado corresponde a 452 pb e foi analisado em gel de agarose a 1,5%. (MM- marcador molecular 1Kb Plus). 115 SOARES, L.S. Figura suplementar 03. Amplificação por PCR da região referente ao gene KIR2DL2 a partir dos plasmídeos purificados dos clones positivos. O fragmento amplificado corresponde a 452 pb e foi analisado em gel de agarose a 1,5%. (MM- marcador molecular 1Kb Plus) A numeração acima de cada gel refere-se à identificação dos clones positivos para o fragmento analisado em cada amostra. 116 SOARES, L.S. Figura suplementar 04. Padronização da etapa de sonicação para o ensaio de imunoprecipitação da cromatina. Após fixação da estrutura DNA-proteína e posterior lise de 1x106 células NK, o DNA foi sonicado sob diferentes condições no aparelho Bioruptor – Diagenode. (MM- marcador molecular 100pb). 117 SOARES, L.S. Figura suplementar 05a. Sequenciamento da região referente ao gene KIR2DL2 antes da modificação por bissulfito no grupo controle. O alinhamento foi realizado com auxílio da ferramenta MultiAlin e tendo com base a sequência referência da base de dados GenBank (NM_014219.2). 118 SOARES, L.S. Figura suplementar 05b. Sequenciamento da região referente ao gene KIR2DL2 antes da modificação por bissulfito no grupo HIV-1+. O alinhamento foi realizado com auxílio da ferramenta MultiAlin e tendo com base a sequência referência da base de dados GenBank (NM_014219.2). 119 SOARES, L.S. Figura suplementar 05c. Sequenciamento da região referente ao gene KIR2DL2 antes da modificação por bissulfito no grupo TARV. O alinhamento foi realizado com auxílio da ferramenta MultiAlin e tendo com base a sequência referência da base de dados GenBank (NM_014219.2). 120 SOARES, L.S. Figura suplementar 06a. Sequenciamento dos clones positivos para o fragmento do gene KIR2DL2 da amostra CT12. O alinhamento foi realizado com auxílio das ferramentas MultiAlin e Clustal, tendo com base a sequência predita in silico após conversão por bissulfito. 121 SOARES, L.S. Figura suplementar 06b. Sequenciamento dos clones positivos para o fragmento do gene KIR2DL2 da amostra CT16. O alinhamento foi realizado com auxílio das ferramentas MultiAlin e Clustal, tendo com base a sequência predita in silico após conversão por bissulfito. 122 SOARES, L.S. Figura suplementar 06c. Sequenciamento dos clones positivos para o fragmento do gene KIR2DL2 da amostra CT18. O alinhamento foi realizado com auxílio das ferramentas MultiAlin e Clustal, tendo com base a sequência predita in silico após conversão por bissulfito. 123 SOARES, L.S. Figura suplementar 06d. Sequenciamento dos clones positivos para o fragmento do gene KIR2DL2 da amostra HIV11. O alinhamento foi realizado com auxílio das ferramentas MultiAlin e Clustal, tendo com base a sequência predita in silico após conversão por bissulfito. 124 SOARES, L.S. Figura suplementar 06e. Sequenciamento dos clones positivos para o fragmento do gene KIR2DL2 da amostra HIV15. O alinhamento foi realizado com auxílio das ferramentas MultiAlin e Clustal, tendo com base a sequência predita in silico após conversão por bissulfito. 125 SOARES, L.S. Figura suplementar 06f. Sequenciamento dos clones positivos para o fragmento do gene KIR2DL2 da amostra HIV18. O alinhamento foi realizado com auxílio das ferramentas MultiAlin e Clustal, tendo com base a sequência predita in silico após conversão por bissulfito. 126 SOARES, L.S. Figura suplementar 06g. Sequenciamento dos clones positivos para o fragmento do gene KIR2DL2 da amostra TARV04. O alinhamento foi realizado com auxílio das ferramentas MultiAlin e Clustal, tendo com base a sequência predita in silico após conversão por bissulfito. 127 SOARES, L.S. Figura suplementar 06h. Sequenciamento dos clones positivos para o fragmento do gene KIR2DL2 da amostra TARV05. O alinhamento foi realizado com auxílio das ferramentas MultiAlin e Clustal, tendo com base a sequência predita in silico após conversão por bissulfito. 128 SOARES, L.S. Figura suplementar 06i. Sequenciamento dos clones positivos para o fragmento do gene KIR2DL2 da amostra TARV12. O alinhamento foi realizado com auxílio das ferramentas MultiAlin e Clustal, tendo com base a sequência predita in silico após conversão por bissulfito. 129 SOARES, L.S. ANEXOS 130 SOARES, L.S. ANEXO I – MANUSCRITO PARA PUBLICAÇÃO NATURAL KILLER CELLS EXHIBIT FEATURES OF IMMUNOSENESCENCE IN LONG-TERM HIV-1 TREATED PATIENTS Luana Silva Soares1, Milena Sobral Espíndola1, Fabiana Albani Zambuzi1, Leonardo Judson Galvão de Lima1, Valdes Roberto Bollela2, Fabiani Gai Frantz1,*. 1 – Laboratório de Imunologia e Epigenética, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil; 2 – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil. *Corresponding author: Fabiani Gai Frantz, DACTB, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil. ZIP Code: 14041903. Tel: +55 1633150241; e-mail: [email protected] Key words: natural killer cells, HIV infection, activation state, immunosenescence. ABSTRACT HIV-1 infection is one of the main concerns regarding infectious disease worldwide. Nowadays, it is recognized as an inflammatory chronic disease and affects many immune cells such as the natural killer cells. Our aim in this work was to characterize the dysfunctions of NK cells during HIV-1 infection as a result of cell senescence. In our study population, there was an expansion of the non-functional NK cell subset, despite of antiretroviral treatment, that is also seen in the elderly people. NK cells from HAART group had increased cytotoxic function and overall cytokine production, even higher than the non-infected individuals. This higher activated state associated to increased production of oxygen reactive species by NK cells from this group confirm our hypothesis of immunosenescence in these cells. Although other markers of senescence might be investigated to better understand this phenomenon during HIV-1 infection creating perspectives of new interventions for restoration of immune cell homeostasis. 131 SOARES, L.S. Introduction The Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) was first recognized as a disease in the early 80s [1] and since then, many research groups have studied this pathology aiming its effective cure and prevention. The etiologic agent is the Human Immunodeficiency Virus (HIV) that have been originated from a virus that infects primates (Simian Immunodeficiency Virus - SIV) [2]. Nowadays, HIV infection is recognized as an inflammatory chronic disease in parallel with a dysfunctional immune system [3]. Despite the advance of antiretroviral therapy and the subsequent increase in life expectancy, the HIV-1+ patients have shown higher occurrence of non-AIDS related diseases such as cardiovascular and liver diseases, osteoporosis, cancers and metabolic syndromes. As these pathologies are usually seen in the elderly people, nowadays HIV infection has been associated to acceleration of natural aging [4]. The pro-inflammatory state seen in HIV infected individuals is mainly due to the disruption of intestinal mucosa and the translocation of microbial products from the gut to the blood and tissues [5]. In this context, many cells of the immune system have shown higher activation status, such as CD8 T cells, monocytes and macrophages, and that was correlated to disease progression [6, 7]. A recent study also reported an activated phenotype of natural killer cells in HIV+ patients even on ART by analyzing the expression of surface markers [8]. Considering that NK cells are one of the pivotal cells of innate immune system, the understanding of its role and dysfunctions during HIV infection is of great importance. Natural killer cells constitute nearly 10% of peripheral blood lymphocytes [9], and most studies have reported changes in NK cell frequency and subset distribution during HIV infection [10-12]. As the infection progresses, phase described as chronic, a non-functional NK cell subset characterized as CD3-CD56-CD16+ accumulates, impairing the function of the total NK cells [13]. Also, the increased expression of inhibitory receptors in parallel with a decrease of activating receptors renders the NK cells unresponsive and not functional during HIV infection [10]. It is not known whether the phenotypic and functional changes seen in the NK cell population during HIV infection is due to the direct infection of these cells or if is a consequence of the overall disease. The distinct phenotype and function of NK cells during HIV-1 infection may occur as a result of genetic, epigenetic and environmental factors. In this work, we are particularly interested in analyzing the function of these cells and some markers of immunosenescence that might be related to disease progression. Also, we investigated some epigenetic 132 SOARES, L.S. modifications that could be involved in the alterations of these cell’s function during HIV-1 infection. Our results clearly showed a higher activation status of NK cells from HIV-1+ treated patients. This phenotype was very similar to that seen in elderly people, also reinforced by the expansion of the non-functional NK subset and the higher oxidative stress in these cells. On the other hand, these alterations might not be directly due to epigenetic modifications, as enzymes involved in these process were not changed in our study. Materials and Methods Blood samples and study population Samples from 28 adult subjects ART-naïve and 29 on ART were collected at the Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto – São Paulo, Brazil. Control samples (n = 30) were obtained from Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto – São Paulo, Brazil (Table 1). The individuals were from both sexes and aged between 18 and 65 years. Patients on ART were included in the study considering that viremia was undetectable for at least six months. All of the participants gave written, informed consent, and the study was evaluated and accepted by the Ethics Committee of the Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto (Process HCRP # 9818/2012). Flow Cytometry After collection of blood samples (40 mL), peripheral blood mononuclear cells were obtained by gradient density separation. The total PBMC was then counted in a Neubauer chamber, and the cell viability was evaluated with Tripan blue 0.5% staining. Thereafter, 1 x 105 cells were stained for surface markers at 4°C for 25 min using the following fluorochrome-labeled mAb: anti-CD3 PerCPCy5.5 (clone SK7), anti-CD56 APC (clone NCAM 16.2) and antiCD16 PE-Cy7 (clone 3G8). Next, the cells were washed and fixed in 1% paraformaldehyde. At least 100,000 events were acquired from each sample in a FACSCantoTM II flow cytometer (BD Biosciences, San Diego, USA) using the FACSDiva 6.1.3 software for data acquisition. Data were analyzed on lymphocyte population defined by size and granularity using FlowJo software version 7.6.5 (Tree Star Inc., Oregon, USA) Evaluation of NK cell cytotoxicity NK cells were purified from PBMC by positive selection using CD56 MicroBeads (MACS, Miltenyi Biotec Inc., Auburn CA, USA) according to manufacturer’s instructions. Then, NK cells were co-cultured with K-562 (ATCC N° CCL-243™) as a target cell in different effector 133 SOARES, L.S. to target ratios for four hours. NK cytotoxicity was measured using the CytoTox 96 NonRadioactive Cytotoxicity Assay (Promega) by quantifying the lactate dehydrogenase release in the supernatant following manufacturer’s protocol. Quantification of cytokines and chemokines produced by NK cells The production of cytokines and chemokines by NK cells was quantified by a customized multiplex kit (16-plex, EMD Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts, USA) in the supernatant of the cytotoxicity assay. The multiplex plate was read in a fluorescent beadbased instrument (Luminex® MAGPIX® System; Luminex Corporation, Austin, Texas, USA) and analyzed using the Milliplex Analyst software v3.5 ((Millipore; VigeneTech Inc., Boston, Massachusetts, USA) with a three-parameter logistic curve fit. Assessment of oxidative stress of NK cells After purification of NK cells by CD56 MicroBeads, oxidative stress was quantified by monitoring the induction of NADPH oxidase activity in a luminol-dependent 5 chemiluminescence assay. For this, 1 x 10 NK cells were stimulated with 10-7M PMA or not (spontaneous) and 100µM Luminol was used. The reaction was recorded with a luminometer (EG & G Berthold, AutoLumat Plus LB 953, Bad Wildbad, Germany). The area under the time-course curve of chemiluminescence (AUC) was calculated for each individual. Measurement of enzymes that promote epigenetic modifications Total RNA was extracted from NK cells with Trizol Reagent (Ambion®) and treated with Turbo DNase (Ambion) according to manufacturer’s instructions. Total RNA was quantified in a Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific) and then reverse transcribed into cDNA using the High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems). 30ng of total RNA after reverse transcription was applied in the RT2 Profiler PCR Array for quantification of enzymes involved in the activation of gene transcription (ATF2, HAT1, KAT2B, KAT5, CARM1, PRMT5, SMYD3, SUV39H1, ASH1L, KMT2C, KMT2E, SETD1B, KDM5B, KDM6B). Relative expression of each enzyme was calculated by using the 2- ΔΔ Ct method considering the control group as reference. And GAPDH and beta-actin as housekeeping genes. 134 SOARES, L.S. ChIP Assay The chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure was performed starting from 1 x 106 purified NK cells. DNA-protein structure was cross-linked by 1% paraformaldehyde for 10 minutes at 37°C. Then, cells were washed with PBS plus protease inhibitors at 400 x g for 10 min at 4°C and lysed in 200 µL SDS Lysis Buffer. The lysate was sonicated to obtain DNA fragments around 400 bp using a Bioruptor Pico Sonication System (Diagenode) under the following conditions: 11 times for periods of 15 seconds on and 90 seconds off. Next, samples were centrifuged and the supernatant containing chromatin was diluted, and an aliquot (5% volume) was separated as the input DNA in each sample. The remaining chromatin fractions were precleared with salmon sperm DNA/protein A agarose beads followed by immunoprecipitation with the following antibodies: anti-histone H3K27me3 (Abcam), anti-histone H3K4me3 (Abcam) and normal mouse IgG (Millipore) overnight at 4°C with gentle rotation. Cross-linking was reversed for 2 hours at 62°C associated with proteinase K digestion. DNA was purified by standard phenol/chloroform and ethanol precipitation and was subjected to real-time PCR. Primers for the promoter regions of IFN-γ and TNF-α were described elsewhere [14, 15]. Results Characteristics of the study population The characteristics of the individuals included in this study were described in the Material and Methods section and detailed in table 1. The HIV-1+ infected patients were separated in two groups: HIV-1+ (naïve-treated) and HAART (HIV-1+ patients on two distinct antiretroviral regimens). Patients on HAART had undetectable levels of plasma viral load and a median of 72,3 months of treatment. On the other side, HIV-1+ naïve-treated patients were recently infected with a median of 5,3 months of infection compared to 156,4 months in the HAART group. Change in the distribution of NK cell subsets in HIV-1 infected individuals Our first aim in this work was to characterize the distribution of NK cell subsets in our study population. The figure 1a shows the gating strategy used to calculate the proportion of NK cell subsets. NK cells were analyzed in the lymphocyte population defined by size and granularity, and by the expression of CD56 and lack of expression of the CD3 molecule. The 135 SOARES, L.S. proportion of NK cell subsets were determined considering the differential expression of the markers CD56 and CD16. Considering this characterization, we observed that the cytotoxic NK cell subset (CD3-CD56dimCD16+) was significant reduced only in the HIV-1+ group compared to the control one (Figures 1b, c). Although, the NK cell subset described as more related to cytokine production (CD3-CD56brightCD16-) showed no differences between the groups. On the other hand, the non-functional NK cell subset (CD3-CD56-CD16+) was increased in the HIV-1+ patients, despite of antiretroviral treatment. These results clearly indicated that the antiretroviral treatment did not restore the proportions of NK cell subsets. And that patients recently infected should have greater loss of effector response mediated by NK cells against HIV-1. Impaired function of NK cells from treatment-naïve patients We next investigated if the change in the distribution of NK cell subsets in HIV-1+ patients could have an affect on the function of these cells. So, we evaluated the cytotoxic function of NK cells against a target cell line that down-regulates the expression of HLA-class I (K-562). The percentage of NK cytotoxicity was reduced in the treatment-naïve patients compared to control and treated groups, although it was not statistically significant (Figure 2). Interestingly, the HAART group demonstrated a trend of higher cytotoxicity function even than the control individuals, first suggesting a more activated phenotype of NK cells from these patients. NK cell activation correlates with time of infection To better characterize the activation phenotype of NK cells beyond the expression of surface molecules, we quantified the cytokine and chemokine production in the supernatant of the cytotoxicity assay by a Multiplex Platform. While NK cells from the HIV-1+ group produced small amounts of all the molecules analyzed, NK cells from the HAART group exhibited increased levels of pro-inflammatory cytokines, chemokines and also of regulatory and antiinflammatory cytokines (Figure 3). For some molecules, such as IFN-α2, MCP-1 and IL-10, the median production by NK cells from treated patients was even higher than the control individuals. Although the expression of enzymes related to activation of transcription were very similar between the groups, suggesting that other mechanisms might be related to the modulation of these cytokines (Figuure S1). The super-activated state of NK cells from the HAART group was better seen after the calculation of frequency of higher producers for each molecule considering the overall 136 SOARES, L.S. median of every analyte. The radar charts shown in Figure 4 clearly demonstrated that more than 50% of all the patients in the HAART group were higher producers for all the molecules quantified. On the other hand, treated-naïve patients showed a contraction of the NK cell effector response. When we analyzed the presence of histone marks related to activation (H3K4me3) or repression (K3K27me3) of transcription in the promoter region of the cytokines IFN-γ and TNF-α, that were differentially expressed, we didn’t see any difference between the groups (Figure S2). Although other regions must be investigated in order to understand the mechanisms that are driving these modifications in NK cells during HIV-1 infection. We next asked ourselves if this activated phenotype was a result of drug therapy or time of infection. We didn’t see any correlation between the cytokine production by NK cells from the HAART group and the time of treatment (data not shown). But we did see a positive correlation between the levels of some cytokines and the time of infection, irrespective of patient’s treatment as demonstrated in figure 5. The higher association was seen between the levels of IFN-α2 and time of infection (r = 0.61, p = 0.0012). The molecules TNF-α and IL10, that are usually associated to disease progression, were also positive correlated to time of infection. These results suggest that antiretroviral treatment does not restore effector response of NK cells during HIV-1 infection and that as longer as the patient is infected, their NK cells progresses to a more activated state. However, considering that this activation is even higher than the control group, this phenotype may not be a good prognostic for the patient. Increased NK cell activation is associated to oxidative stress and an immunosenescence phenotype Taken together the accumulation of the non-functional NK cell subset, the higher activated phenotype of these cells as the infection goes by, and the evidence in the literature that HIV-1 infection accelerates natural aging, we speculated that NK cells were evolving to a immunosenescence phenotype. To evaluate this phenomena, we quantified the production of reactive oxygen species by NK cells either spontaneously or stimulated with PMA. NK cells from the HAART group produced increased levels of ROS compared to the other groups (Figure 6). Other markers of cellular senescence must be evaluated in order to better characterize this phenotype, but our results strongly suggest that this might be the case of NK cells during HIV-1 infection. 137 SOARES, L.S. Discussion HIV infection is an inflammatory chronic disease that has no cure, except for the Berlin patient, and so patients have to be treated for all their lifetime [3]. Despite the increase in survival, HIV-infected individuals have shown acceleration of natural aging and subsequently higher occurrence of comorbidities related to senescence [4]. In this context, we demonstrated, in our work, that natural killer cells from HIV-1 infected patients exhibited characteristics of immunosenescence such as an increased activation state and oxidative stress, mainly in the long-term treated patients. Considering that immunosenescence is an inflammatory state [16] similar to what is seen in HIV-1+ patients, there are many factors related to the induction of this phenomena. Among them are: residual virus replication, antiretroviral therapy, as well as occurrence of coinfections [4]. For example, the antiretrovirals AZT and Tenofovir are involved on the inhibition of telomerase activity in vitro and are related to telomere shortening [17, 18]. Also, co-infections like the co-infection with Cytomegalovirus can promote T cell activation and virus replication during HIV-1 infection [19]. Although in our study the treated patients had no detectable viremia, it is well known that antiretroviral drugs do not penetrate well in tissues called sanctuary anatomic such as intestinal mucosa, lymph nodes, genital tract and central nervous system, thus favoring residual replication of the virus [20]. Also, some studies [21], including ours [22], had demonstrated that HIV-1+ patients on treatment had elevated levels of plasma inflammatory markers. Considering that cellular senescence cause is associated to the presence of a constant stimulus even after the development of a primary immune response [16, 23], we can conclude that this is the case during HIV-1 infection after long-term treatment. One of the first evidences of the immunosenescence phenotype in our study was the expansion of the non-functional NK cell subset in HIV-1+ individuals, despite of antiretroviral treatment, as usually seen in the elderly people [24]. This expansion is well related in the literature, but until know no one had correlated to aging process in HIV-1 infection. Many studies usually investigate surface markers of differentiation in NK cells such as CD57 [25], but this phenotype is not clearly related to senescence. Another characteristic of immunosenescence is an increased effector function as shown in our results by the higher production of overall cytokines by NK cells from the HAART group. This enhanced function was even seen in the cytotoxicity assay and correlated to time of infection, raising the question that this phenomenon might not only be a result of antiretroviral drugs. On the other hand, patients that were recently infected demonstrated 138 SOARES, L.S. signs of NK cells exhaustion, mainly because of reduced effector response, although other markers might be investigated. To confirm our hypothesis of NK cell senescence in the HAART group, we quantified the oxidative stress in these cells. There was an increased production of reactive oxygen species by NK cells from the HAART group even when these cells were not stimulated. At a glance, our results clearly demonstrated the development of NK cell senescence during HIV-1 infection, mainly in the long-term treated patients. This finding contributes to the understanding of HIV pathogenesis and also creates new strategies of intervention aiming the restoration of immune cell homeostasis, specifically of natural killer cells. Authorship LSS, FGF, VRB: conceived and designed the study; LSS, MSE, FAZ, LJGL: conducted the experiments; LSS, FGF: were involved in writing the manuscript. Acknowledgments This work was supported by São Paulo Research Foundation (FAPESP, grants #2011/24026-3; #2011/12199-0). The authors are grateful to Caroline Fontanari and Thaisa da Silva Araújo for their technical support. Disclosures The authors declare no conflict of interest. 139 SOARES, L.S. References 1. (CDC), C.f.D.C., Update on acquired immune deficiency syndrome (AIDS)--United States. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 1982. 31(37): p. 507-8, 513-4. 2. Gao, F., et al., Origin of HIV-1 in the chimpanzee Pan troglodytes troglodytes. Nature, 1999. 397(6718): p. 436-41. 3. 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Nielsen, C.M., et al., Functional Significance of CD57 Expression on Human NK Cells and Relevance to Disease. Front Immunol, 2013. 4: p. 422. 141 SOARES, L.S. Tables and Figures Table 1. Characteristics of the study population Control HIV-1+ HAART n 30 28 29 Age 32,0 (27,5 - 54) 33,5 (23 - 43,3) 46,0 (40,5 - 52,5) Gender M = 21 M = 21 M = 14 F=9 F=7 F = 15 NRTI + NNRTI - - Treatment (n = 17) NRTI + PI (n = 12) Viral load (copies/mL) - 21638 (4272 - 117414) < 40 CD4+ T cells (cells/mm3) Not determined 415,5 (214,5 - 640,3) 705 (597,5 - 932) Months of infection - 5,3 (2 - 29,5) 156,4 (73,2 - 193,6) Months on ART - - 72,3 (27 - 114,9) The data for age, viral load, CD4+ T cell count, time of infection and treatment were expressed as median (25-75 percentil). 142 SOARES, L.S. Figure 1. Alteration of NK cell subset distribution in HIV-1+ patients. A) Gating strategy for analysis of NK cell subsets by flow cytometry. B) Representative plots of NK cell subsets distribution in the groups: control, HIV-1+ and HAART. C) Frequency of NK cell subsets (Total NK cells were defined as the sum of the three subpopulations analyzed). Differences between the groups were calculated according to Kurskal-Wallis test for multiple comparisons. The line indicates the median f the group and each dot represents one individual. **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001. 143 SOARES, L.S. 100 Control HIV-1 + HAART % Citotoxicity 80 60 40 20 5: 1 10 :1 20 :1 0 NK:K-562 Figure 2. Increased cytotoxic function of NK cells from HAART group. NK cells were purified from the blood and co-cultured with a target cell (K-562) in different effector to target ratios. The percentage of cytotoxicity was calculated from the quantification of lactate dehydrogenase enzyme released in the supernatant. Data are expressed as mean ± SEM. (Kruskal-Wallis Test for multiple comparisons). 144 SOARES, L.S. 2 500 1 0 0 * 10 10 500 0 0 0 MCP-1 RANTES GM-CSF 300 * 1000 40 200 1000 *** 5 5 IP-10 IL-1β 1500 15 15 pg/mL 1000 IL-6 IFN-γ 20 *** 20 pg/mL pg/mL * 2000 ** 800 500 0 0 pg/mL 4 0.1 T A A R + IV H H -1 ol tr A A H -1 R + T 0.0 T A A 0.2 on pg/mL ** 6 R + -1 ol tr on C A A * 0.3 0 R + ol tr on IL-5 0.4 2 IV pg/mL 0 C A A IL-4 10 ** 8 T 0 R + IV H H -1 ol tr on C 10 T 0 IL-10 * 20 500 H 500 1000 -1 1000 30 IV pg/mL 1500 1500 H 2000 40 C MIP-1β 2000 H MIP-1α 2500 pg/mL 200 H 0 1000 0 10 0 400 10 IV 100 600 ol 20 20 H 30 tr 40 on 200 pg/mL pg/mL 300 1500 30 50 C 400 pg/mL pg/mL 25 3 500 pg/mL ** 4 1500 pg/mL IFN-α2 ** IL-12p70 ** pg/mL TNF-α 2000 Figure 3. NK cells from treated HIV-1+ patients have increased production of cytokines and chemokines. Purified NK cells were co-cultured with target cell K-562 in the 20:1 ratio and the release of cytokines in the supernatant was quantified by a Multiplex Platform. Data are expressed as median an interquartile. (Kruskal-Wallis test for multiple comparisons). The line indicates the median f the group and each dot represents one individual. *p<0,05; **p<0,01 e ***p<0,001. Figure 4. Radar charts representing the cytokine profile of NK cells from the different groups analyzed. Frequencies were calculated considering the global median of each mediator as a cutoff to define the individuals as higher or lower producers. 145 SOARES, L.S. p=0,0012 r= 0,5054 80 60 60 IFN-γ (pg/mL) IFN-α2 (pg/mL) r= 0,61 80 40 20 0 0 100 200 300 40 20 0 400 0 Months of infection r= 0,4623 p=0,02 r= 0,5693 IL-12 (pg/mL) TNF-α (pg/mL) 2000 0 100 200 300 r= 0,4462 p=0,0037 2 0 100 200 300 400 Months of infection p=0,0254 r= 0,5231 p=0,0073 10000 MCP-1 (pg/mL) IL-6 (pg/mL) 400 4 0 400 3000 2000 1000 0 100 200 300 8000 6000 4000 2000 0 400 0 Months of infection r= 0,43 100 200 300 400 Months of infection r= 0,4794 p=0,0319 100 1.0 80 0.8 IL-5 (pg/mL) IL-10 (pg/mL) 300 6 Months of infection 60 40 p=0,0153 0.6 0.4 0.2 20 0 200 8 4000 0 100 Months of infection 6000 0 p=0,01 0.0 0 100 200 300 Months of infection 400 0 100 200 300 400 Months of infection Figure 5. Time of infection is crucial in the modulation of the activation state of NK cells. Spearman correlation coefficient was calculated between the cytokine/chemokine levels and time of infection, independent of treatment. 146 SOARES, L.S. Area under curve 6×106 Control HIV-1+ HAART 4×106 2×106 0 PMA - + - + - + Figure 6. Increased oxidative stress in NK cells from HIV-1+ treated patients. Purified NK cells were stimulated with PMA 10-7M or not and the reactive oxygen species production was quantified by chemoluminescence. Data are expressed as median and interquartile range of the area under the curve of the chemoluminescence of luminol after 3500 seconds of stimulus. 147 SOARES, L.S. HAT1 0.5 0.0 CARM1 0.0 1.0 0.5 ASH1L 0.0 0.5 0.0 KDM5B SETD1B 1.5 1.0 0.5 0.0 KDM6B 5 0.5 KMT2E Fold change 0.5 1.0 0.0 1.5 1.0 1.5 SUV39H1 1.5 1.0 KMT2C Fold change 0.5 0.0 0.0 1.5 1.0 0.5 SMYD3 0.0 1.5 1.0 1.5 Fold change Fold change Fold change 0.5 0.5 0.0 1.5 1.0 1.0 PRMT5 1.5 Fold change 1.0 1.5 Fold change 0.5 KAT5 1.5 Fold change Fold change Fold change 1.0 0.0 Fold change KAT2B 1.5 Fold change ATF2 1.5 1.0 0.5 0.0 HIV-1+ HAART 0.5 Fold change Fold change 4 1.0 3 2 1 0.0 0 Figure S1. Relative expression levels of enzymes that promote epigenetic modifications related to activation of transcription. Gene expression was quantified by PCR-Array, considering the housekeeping genes: actin-b and GAPDH and the control group as reference. Data are expressed as median and interquartile range. 148 SOARES, L.S. H3K4 IFN-γ % Input H3K27 - IFN-γ 5 4 3 5 4 3 2.0 2.0 1.5 1.5 1.0 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 H3K24 - TNF-α H3K27 - TNF-α % Input Control HIV-1+ HAART 15 10 5 15 10 5 2.0 2.0 1.5 1.5 1.0 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 Control HIV-1+ HAART Figure S2. Epigenetic modifications associated with histones in the promoter region of IFN-γ and TNF-α. After magnetic separation, 1x106 NK cells were used in the immunoprecipitation chromatin assay with antibodies specific for histone modifications of repression (H3K27me3) or activation (H3K4me3) of gene transcription. The immunoprecipitated DNA was quantified by Real-Time PCR. Each bar represents an individual. 149 SOARES, L.S. ANEXO II – Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa para Seres Humanos 150 SOARES, L.S. ANEXO III – Aprovação do Centro de Saúde Escola para coleta de amostras 151 SOARES, L.S. ANEXO IV – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – Indivíduos Controles UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO -­ Campus Universitário Monte Alegre HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO NOME DA PESQUISA: “CARACTERIZAÇÃO DE CÉLULAS NATURAL KILLER DE PACIENTES HIV+ E ESTUDO DE ALTERAÇÕES EPIGENÉTICAS RELACIONADAS AS SUAS FUNÇÕES E FENÓTIPO”. PESQUISADOR RESPONSÁVEL: MSc. Luana Silva Soares Profª. Drª. Fabiani Gai Frantz Gostaríamos de convidá-­lo a participar deste projeto de pesquisa. Este projeto faz parte de uma linha de pesquisa que é desenvolvida pela Faculdade de Farmácia da USP de Ribeirão Preto em conjunto com os pesquisadores do Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro de Ribeirão Preto e da Unidade de Doenças Infecciosas do Hospital das Clínicas da FMRP-­USP, com o objetivo de avaliar aspectos imunológicos a partir da análise do sangue de pacientes infectados com o vírus HIV. A sua participação é voluntária. Para participar, é necessário ler atentamente este documento e ouvir nossas explicações em caso de dúvidas. Se estiver interessado em participar, solicitaremos que assine este documento. Caso não queira participar, o seu atendimento no Hemocentro de Ribeirão Preto continuará o mesmo, sem prejuízo nenhum. O que é célula natural killer? As células natural killer são células de defesa do corpo importantes no combate a doenças infecciosas e tumorais. O que são alterações epigenéticas? As alterações epigenéticas constituem modificações associadas ao DNA e que podem influenciar na função das células no corpo humano. Porque esta pesquisa está sendo feita? Esta pesquisa trará benefícios para o entendimento de como as células de defesa de um indivíduo infectado com HIV funcionam em comparação com as células de indivíduos que não estejam infectados com o vírus (controle negativo). Além disso, os dados dessa 152 SOARES, L.S. pesquisa poderão ser úteis para o desenvolvimento de um teste para melhorar o tratamento de pacientes infectados com HIV. Para a realização deste trabalho, precisamos da coleta de sangue de pessoas que NÃO estejam infectadas com o vírus HIV-­1 e que também não estejam infectadas com fungos e bactérias oportunistas. Será importante para utilizar como controle negativo nesta pesquisa. A pessoa que participar desta pesquisa deverá doar 40 mL de sangue. Esta quantidade de sangue retirada não será prejudicial à saúde. A coleta de sangue será realizada no braço durante o processo de doação de sangue juntamente com as amostras usualmente coletadas, com seringas e agulhas descartáveis por um profissional capacitado. Não há riscos previsíveis decorrentes da pesquisa para o doador, a não ser o desconforto da picada da agulha na coleta de sangue. Não haverá nenhuma despesa e nenhum ganho em dinheiro. Afirmamos que os dados obtidos serão guardados de maneira sigilosa e que os nomes dos participantes não serão divulgados em nenhum momento, e os mesmos serão informados dos resultados finais da pesquisa. Esta pesquisa não trará benefício direto ao sujeito envolvido, ficando a critério do mesmo a desistência em participar da pesquisa a qualquer momento, sem nenhum prejuízo ao seu seguimento hospitalar. Qualquer dúvida sobre esta pesquisa, entrar em contato com Luana Silva Soares pelo telefone (16) 3602-­4189 ou (16) 99719-­4270. Eu,_______________________________________________________________________ RG n°: ____________________________, autorizo a retirada de 40 mL do meu sangue da veia do braço para a realização de pesquisa. Fui informado (a) sobre o procedimento e que o volume retirado não causará dano a minha saúde. Fui informado (a) também que a finalidade dessa pesquisa é de entender como o vírus se comporta e promove o aparecimento das infecções. Ribeirão Preto, _____ de _________________ de 20__. _______________________________ _________________________________ Assinatura do paciente – Registro MSc. Luana Silva Soares (Pesquisador Responsável) 153 SOARES, L.S. ANEXO V – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – Pacientes HIV-­1+ UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO -­ Campus Universitário Monte Alegre HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO NOME DA PESQUISA: “CARACTERIZAÇÃO DE CÉLULAS NATURAL KILLER DE PACIENTES HIV+ E ESTUDO DE ALTERAÇÕES EPIGENÉTICAS RELACIONADAS AS SUAS FUNÇÕES E FENÓTIPO”. PESQUISADOR RESPONSÁVEL: MSc. Luana Silva Soares Profª. Drª. Fabiani Gai Frantz Gostaríamos de convidá-­lo a participar deste projeto de pesquisa. Este projeto faz parte de uma linha de pesquisa que é desenvolvida na Faculdade de Farmácia da USP de Ribeirão Preto em conjunto com os pesquisadores do Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro de Ribeirão Preto e da Unidade de Doenças Infecciosas do Hospital das Clínicas da FMRP-­USP, com o objetivo de avaliar aspectos imunológicos a partir da análise do sangue de pacientes infectados com o vírus HIV. A sua participação é voluntária. Para participar, é necessário ler atentamente este documento e ouvir nossas explicações em caso de dúvidas. Se estiver interessado em participar, solicitamos que assine este documento. Caso não queira participar, o seu atendimento no ambulatório continuará o mesmo, sem prejuízo nenhum para o seu tratamento. O que é célula natural killer? As células natural killer são células de defesa do corpo importantes no combate a doenças infecciosas e tumorais. O que são alterações epigenéticas? As alterações epigenéticas constituem modificações associadas ao DNA e que podem influenciar na função das células no corpo humano. Como você, paciente, vai participar da pesquisa? A pessoa que participar desta pesquisa deverá doar 40 mL de sangue. Esta quantidade de sangue retirada não será prejudicial à saúde. A coleta de sangue será realizada no braço, com seringas e agulhas descartáveis por um profissional capacitado. Não há riscos 154 SOARES, L.S. previsíveis decorrentes da pesquisa para o doador, a não ser o desconforto da picada da agulha na coleta de sangue. Qual o objetivo desta pesquisa? Esta pesquisa trará benefícios para o entendimento de como as células de defesa de um indivíduo infectado com HIV funcionam em comparação com as células de indivíduos que não estejam infectados com o vírus (controle negativo). Além disso, os dados dessa pesquisa poderão ser úteis para o desenvolvimento de um teste para melhorar o tratamento de pacientes infectados com HIV. Não haverá nenhuma despesa e nenhum ganho em dinheiro. Afirmamos que os dados obtidos serão guardados de maneira sigilosa e que os nomes dos participantes não serão divulgados em nenhum momento, e os mesmos serão informados dos resultados finais da pesquisa. Esta pesquisa não trará benefício direto ao sujeito envolvido, ficando a critério do mesmo a desistência em participar da pesquisa a qualquer momento, sem nenhum prejuízo ao seu seguimento hospitalar. Qualquer dúvida sobre esta pesquisa, entrar em contato com Luana Silva Soares pelo telefone (16) 3602-­4189 ou (16) 99719-­4270. Eu,_______________________________________________________________________ RG n°: ____________________________, autorizo a retirada de 40 mL do meu sangue da veia do braço esquerdo para a realização de pesquisa. Fui informado (a) sobre o procedimento e que o volume retirado não causará dano a minha saúde. Fui informado (a) também que a finalidade dessa pesquisa é de entender como o vírus se comporta e promove o aparecimento das infecções. Ribeirão Preto, _____ de _________________ de 200__. ________________________________ ________________________________ Assinatura do paciente – Registro MSc. Luana Silva Soares (Pesquisador Responsável) 155
