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MicroRNAs: Novos Biomarcadores para Cancro da Próstata
Ana Luísa Teixeira1,2*, Joana Silva1,2*, Rui Medeiros1,2
1
Grupo de Oncologia Molecular- CI, Instituto Português de Oncologia do Porto FG, EPE
Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar, Universidade do Porto
*
Estes autores contribuíram de igual modo na elaboração do presente trabalho
2
Resumo
Os miRNAs representam uma nova abordagem no diagnóstico/prognóstico de
diversas patologias humanas. Estas moléculas consistem em pequenas sequências de
RNA não codificantes, que actuam como silenciadores da expressão genética,
actuando sobre mRNAs-alvo. Apesar do estudo de miRNAs ser algo recente, a sua
expressão anómala tem vindo a ser relacionada com diversas neoplasias,
nomeadamente com CaP, podendo estas moléculas funcionar como oncogenes ou
genes supressores tumorais. Desta forma, os miRNAs desempenham um importante
papel na carcinogénese, assumindo-se de futuro como uma importante ferramenta na
estratificação de grupos com impacto no diagnóstico e no prognóstico de CaP.
Abstract
miRNAs represent a new approach in the diagnosis/prognosis of several human
diseases. These molecules consist in small non-coding RNAs sequences that
negatively regulate gene expression by inhibiting translation of target mRNAs. Despite
the miRNAs study is somewhat recent, the aberrant expression of these molecules has
been associated to several tumors, namely prostate cancer, where they may act as
oncogenes or tumor suppressors. In this manner, miRNAs have an important role in
carcinogenesis, representing a potential tool to identify groups with different impact in
prostate cancer diagnosis and prognosis.
Introdução
A elevada heterogeneidade apresentada pelo cancro da próstata (CaP), torna
relevante
o
estudo
das
vias
moleculares
envolvidas
no
seu
desenvolvimento/progressão, bem como a identificação de genes chave envolvidos
nas diferentes etapas da história natural da doença. (Ferlay et al. 2010)
A aplicação do antigénio específico da próstata (PSA) como biomarcador permitiu
grandes avanços na detecção de CaP, sendo actualmente utilizado no programa de
rastreio da doença. No entanto, ainda existem alguns problemas relacionados com a
sua utilização, nomeadamente no que diz respeito aos valores de sensibilidade e
especificidade (Steuber et al. 2007). Os níveis de PSA no soro, o estadiamento do
tumor primário e o grau de Gleason apresentam limitações quando usados como
factores preditivos do outcome do doente, tornando-se relevante a identificação de
novos marcadores de diagnóstico e de agressividade. A utilização de marcadores mais
sensíveis e específicos será uma estratégia adequada na escolha de abordagens
terapêuticas mais efectivas, em especial no tratamento de estadios avançados de
desenvolvimento da doença.
Deste modo, torna-se importante a descoberta de novos biomarcadores que ajudem
no
diagnóstico
e
prognóstico
do
CaP,
de
forma
a
evitar
o
seu
desenvolvimento/progressão para doença metastática, possibilitando também o
desenho de novas terapias mais efectivas e individualizadas.
Recentemente, têm surgido evidências que suportam um importante papel dos
microRNAs (miRNAs) no diagnóstico e prognóstico de diferentes neoplasias. Estas
moléculas consistem em pequenos RNAs não codificantes, com cerca de 18 a 25
nucleótidos de comprimento, e que actuam como reguladores da expressão de genes
envolvidos em processos celulares fundamentais tais como desenvolvimento,
diferenciação, proliferação, sobrevivência e morte (Ambros 2004).
Biogénese de miRNAs
Os miRNAs são normalmente transcritos através da acção da RNA polimerase II,
resultando em transcritos primários de tamanho variável (normalmente entre 1kb e
3kb), denominados pri-miRNAs (Lee et al. 2004) (Figura 1). Estes pri-miRNAs são
posteriormente clivados ainda no núcleo pela RNase III, Drosha e o seu co-factor
DGCR8 (do inglês DiGeorge syndrome critical region gene 8), resultando em
moléculas precursoras do miRNA maduro, com cerca de 70-100 nucleótidos,
denominadas pré-miRNAs (Lee et al. 2003), que são por sua vez transportadas do
núcleo para o citoplasma através da exportina 5 (Exp5) (Bohnsack et al. 2004).
Chegado ao citoplasma, o pré-miRNA é processado por outra ribonuclease, Dicer,
originando um miRNA de dupla cadeia, maduro e com comprimento variável (18-25
nucleótidos). Este produto é depois incorporado num complexo multimérico
denominado RISC (do inglês RNA-induced silence complex), que inclui as proteínas
argonautas como principais componentes, juntamente com outros factores proteicos
(Garzon et al. 2010). Apenas uma das cadeias do miRNA permanece no complexo
RISC para controlar a expressão dos genes-alvo, enquanto a outra cadeia é
normalmente degradada (Schwarz et al. 2003).
Modo de regulação dos miRNAs
A regulação exercida pelos miRNAs depende do grau de complementaridade entre
estes e os respectivos genes-alvo. Quando o miRNA e a sequência-alvo do RNA
mensageiro (mRNA) apresentam uma complementaridade perfeita, o complexo RISC
induz a degradação do mRNA. Caso ocorra o emparelhamento imperfeito entre o
miRNA e a sequência alvo de mRNA, a tradução proteica é bloqueada (Bartel 2009).
Independentemente do evento que ocorra, o resultado final é um decréscimo na
quantidade de proteínas codificadas pelos mRNA alvos. Uma vez que o
emparelhamento completo entre miRNAs e genes-alvo não é uma condição essencial
para a sua acção, cada miRNA pode regular um grande número de genes (em média
cerca de 500 para cada família de miRNAs) (Garzon et al. 2010). Desta forma, os
miRNAs desempenham um papel fundamental na regulação da sinalização celular,
constituindo poderosas ferramentas para a sua compreensão. Análises bioinformáticas
prevêem que a região 3’ UTR de um único gene serve frequentemente de alvo para
diferentes miRNAs (Lewis et al. 2003. Krek et al. 2005). Muitas destas previsões têm
sido confirmadas experimentalmente, sugerindo que os miRNAs possam cooperar
para regular a expressão genética (Ivanovska e Cleary 2008). Para além dos
mecanismos de regulação genética por interacção de miRNAs com as regiões 3’ UTR
anteriormente referidos, existem outros, não tão bem estabelecidos, que têm vindo a
surgir,
nomeadamente
a
capacidade
dos
miRNAs
em
se
ligarem
a
ribonucleoproteinas, bem como ao próprio DNA (Eiring et al. 2010, Beitzinger e Meister
2010, Khraiwesh et al. 2010, Gonzalez et al. 2008 e Kim et al. 2008). De um modo
geral, estes dados revelam a complexidade e vasta regulação da expressão genética
por parte dos miRNAs, que se deve ter em conta quando de desenvolvem terapias
baseadas neste tipo de moléculas.
miRNAs e Cancro
O desenvolvimento neoplásico resulta da acumulação de múltiplos eventos genéticos
e epigenéticos que resultam na desregulação de genes e proteínas. A apoptose, o
ciclo celular, a adesão celular, a estabilidade cromossómica e a reparação de DNA
são processos frequentemente desregulados durante a carcinogénese. Atendendo à
função dos miRNAs como reguladores de diferentes vias, coordenando respostas
integradas nas células e tecidos normais, supõe-se que estes também desempenhem
um papel chave na coordenação do desenvolvimento neoplásico (Quadro I). O padrão
de expressão de miRNAs tem se revelado como uma ferramenta muito útil da
classificação tumoral, atendendo ao estadio de diferenciação e tecido de origem,
podendo também para fins de diagnóstico ser mais facilmente associado com a função
de um gene do que RNAs mensageiros, uma vez que não necessitam de ser
traduzidos em proteína para exercerem o seu efeito biológico (Siva et al. 2009).
Vários estudos demonstraram que tecidos malignos provenientes de doentes com
cancro exibem padrões de expressão de miRNAs distintos, existindo uma relação com
o tipo de neoplasia apresentada, o que sugere a existência de possíveis assinaturas
genéticas capazes de identificar tumores específicos (Lu et al. 2005 e Volinia et al.
2005). Isto conduziu à hipótese que miRNAs possam actuar como oncogenes ou
genes supressores tumorais. A sobre-expressão de miRNAs poderá funcionar como
oncogene por sub-regular genes supressores tumorais e/ou genes que controlam a
diferenciação celular e apoptose. Por outro lado, a sub-expressão de miRNAs poderá
comportar-se como gene supressor tumoral, regulando negativamente oncogenes e/ou
genes que controlam a diferenciação celular e apoptose (Zhang et al. 2007 e Croce et
al. 2008). Por outro lado, foi também descoberto que genes que codificam miRNAs se
encontram frequentemente localizados em zonas frágeis e de perda de heterozigotia,
em zonas de amplificação e ainda em breakpoints associados ao cancro (Calin et al.
2004). Apesar dos avanços recentes na compreensão dos mecanismos adjacentes à
desregulação de miRNAs, a principal tarefa passa por elucidar o papel biológico dos
miRNAs na iniciação e no desenvolvimento tumoral.
Detecção de miRNAs em circulação associados ao CaP
O estudo do perfil de miRNAs em diferentes tecidos tem revelado que este são
altamente informativos e mais preditivos do que a caracterização de mRNA.
Actualmente, ainda é limitado o número de estudos sobre o papel de miRNAs na
regulação do CaP, ao contrário do que acontece em outros modelos neoplásicos. Não
existindo consenso relativamente ao perfil de expressão de miRNAs associado
especificamente
a
CaP,
existindo
alguns
estudos
inconclusivos
e
alguma
inconsistência de resultados (Coppola et al. 2010).
Contudo, já se encontra estabelecido que diferentes miRNAs possam estar
desregulados no CaP encontrando-se sobre-expressos ou sub-expressos. MiRNAs
como o Let-7c, mir-195, mir-203, mir-125b, mir-221, mir-222 encontram-se sobreexpressos enquanto os mir-143, mir-145, mir-128a, mir-146a, mir-126 estão subexpressos (Ruan et al. 2009), verificando-se que em diferentes fases da doença ocorre
alterações da expressão de miRNAs específicos (Figura 2).
A detecção de ácidos nucleicos em circulação é uma das abordagens mais
promissoras no diagnóstico precoce de neoplasias malignas. Desregulações na
expressão de miRNAs em vários tecidos tem sido associada a uma grande variedade
de neoplasias malignas. Num estudo realizado por Chen e colaboradores (Chen et al.
2008), verificou-se que o perfil de miRNAs em circulação era significativamente
diferente quando se comparava doentes com cancro colo-rectal e indivíduos normais.
Trabalhos desenvolvidos por Porkka e colaboradores (Porkka et al. 2007) demonstram
ser possível diferenciar carcinomas de próstata de hiperplasia benigna da próstata
atendendo ao perfil de expressão de miRNA, assim como classificar os tumores de
acordo com a sua dependência androgénica. Verificando-se que a avaliação dos
níveis de miRNAs no soro ou plasma são mais estáveis, reproduzíveis e consistentes
do que o estudo de outros ácidos nucleicos em circulação.
Os miRNAs surgem como uma classe ideal de biomarcadores uma vez que 1) a sua
expressão é aberrante em casos de cancro, 2) há a ocorrência de perfis de expressão
tissue-specific, 3) são moléculas estáveis, existindo evidências da sua adequada
preservação em amostras de tecidos fixados em parafinas assim como em amostras
congeladas. A associação da expressão aberrante de miRNAs durante a
carcinogénese e a caracterização funcional de alguns miRNAs também tem
demonstrado a utilidade da utilização de miRNAs como alvos para a realização de
terapias dirigidas. A utilização do anti-miRNA 2-O-metil dirigido ao onco-miR-21
demonstrou capacidade de diminuir tumores mamários (Heneghan et al. 2009).
Os miRNAs surgem assim como importantes intervenientes da oncogénese,
assumindo-se de futuro como uma importante ferramenta na estratificação de grupos
com impacto no diagnóstico e no prognóstico.
Agradecimentos
Parte dos trabalhos desenvolvidos no âmbito deste artigo foram financiados pela
Fundação Calouste Gulbenkian-Projectos na área da Oncologia (Projecto Nº 96736).
Os autores agradecem também o apoio da Liga Portuguesa Contra o Cancro – Núcleo
Regional do Norte e FCT-Fundação para a Ciência e Tecnologia
(SFRH/BD/47381/2008).
Referências Bibliográficas
Ambros, V. (2004) The functions of animal microRNAs. Nature. 431(7006): 350-355.
Bartel, D. P. (2009) MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell.
136(2): 215-233.
Beitzinger, M. e Meister, G. (2010) MicroRNAs: from decay to decoy. Cell. 140(5):
612-614.
Bohnsack, M. T., Czaplinski, K., e Gorlich, D. (2004) Exportin 5 is a RanGTPdependent dsRNA-binding protein that mediates nuclear export of pre-miRNAs.
RNA. 10(2): 185-191.
Calin, G.A., Sevignani, C., Dumitru, C.D., et al. (2004) Human microRNA genes are
frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proc.
Natl Acad. Sci. USA. 101(9): 2999-3004.
Chen, X., Ba, Y., Ma, L., et al. (2008) Characterization of microRNAs in serum: a
novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res.
18: 997-1006.
Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. (2010) MicroRNAs and prostate cancer. Endocr
Relat Cancer. 17(1): F1-17
Croce, C.M. (2008) Oncogenes and cancer. N Engl J Med. 358(5): 502-511.
Eiring, A., Harb, J.G., Neviani, P., et al. (2010) miR-328 functions as an RNA decoy
to modulate hnRNP E2 regulation of mRNA translation in leukemic blasts. Cell.
140(5): 652-665.
Ferlay, J., Shin, H.R., Bray, F., et al. (2010) Estimates of worldwide burden of
cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer
Garzon, R., Marcucci, G., e Croce, C.M. (2010) Targeting microRNAs in cancer:
rationale, strategies and challenges. Nat Rev Drug Discov. 9(10): 775-789.
Gonzalez, S., Pisano, D.G. e Serrano, M. (2008) Mechanistic principles of
chromatin remodeling guided by siRNAs and miRNAs. Cell Cycle. 7(16): 26012608.
Heneghan, H.M., Miller, N., Lowery, A.J., et al. (2009) MicroRNAs as novel
biomarkers for breast cancer. J Oncol. 2010.
Ivanovska, I. e Cleary, M. A. (2008) Combinatorial microRNAs: working together to
make a difference. Cell Cycle. 7(20): 3137-3142.
Khraiwesh, B., Arif, M.A., Seumel, G.I., et al. (2010) Transcriptional control of gene
expression by microRNAs. Cell. 140(1): 112-122.
Kim, D. H., Saetrom, P., Snøve, O., et al. (2008) MicroRNA directed transcriptional
gene silencing in mammalian cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 105(42): 1623016235.
Krek, D., Grün, D., Poy, M.N., et al. (2005) Combinatorial microRNA target
predictions. Nature Genet. 37(5): 495-500.
Lee, Y., Ahn, C., Han, J., et al. (2003) The nuclear RNase III Drosha initiates
microRNA processing. Nature. 425(6956): 415-419.
Lee, Y., Kim, M., Han, J., et al. (2004) MicroRNA genes are transcribed by RNA
polymerase II. EMBO J. 23(20): 4051-4060.
Lewis, B., Shih, I., Jones-Rhoades, M., et al. (2003). Prediction of mammalian
microRNA targets. Cell. 115(7): 787-798.
Lu, J., Getz, G., Miska, E.A. et al. (2005) MicroRNA expression profiles classify
human cancers. Nature. 435(7043): 834-838.
Porkka, K. P., Pfeiffer, M.J., Waltering, K.K. (2007) MicroRNA expression profiling in
prostate cancer. Cancer Res. 67: 6130-6135
Ruan, K., Fang, X., Ouyang, G (2009) MicroRNAs: novel regulators in the
hallmarks of human cancer. Cancer Lett. 285: 116-126
Schwarz, D.S., Hutvagner, G., Du, T., et al. (2003) Asymmetry in the assembly of
the RNAi enzyme complex. Cell. 115(2): 199-208.
Siva, A., Nelson, L.J., Fleischer, C.L., et al. (2009) Molecular assays for the
detection of microRNAs in prostate cancer. Mol Cancer. 6: 8-17
Steuber, T., Helo, P. e Lilja, H. (2007) Circulating biomarkers for prostate cancer.
World J Urol. 25(2): 111-119.
Volinia, S., Calin, G.A., Liu, C.G. et al. (2005) A microRNA expression signature in
human solid tumors defines cancer targets. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 103(7):
2257-2261.
Zhang, B., Pan, X., Cobb, G.P., et al. (2007) microRNAs as oncogenes and tumor
supressors. Dev Biol. 302(1): 1-12.
Figura 1. Biogénese de miRNAs e vias envolvidas.
Quadro I. miRNAs e os hallmarks do cancro (adaptado de Ruan et al. 2009).
Hallmarks do cancro
Resistência a sinais antiproliferativos e independência de
factores de crescimento
Evasão à apoptose
Função do miRNA
Estimulação da
proliferação
miRNAs
miR-21, cluster miR-17, miR-221, miR-222
Inibição da proliferação
Let-7, miR-519, miR-146ª
Estimulação da apoptose
Cluster miR-34, miR-29, miR-15, miR-16
Inibição da apoptose
Cluster miR-17-92, miR-21
Regulação da
Potencial de replicação ilimitado
imortalização e
miR-290, miR-24, miR-34ª
senescência
Indução da angiogénese
Evasão ao sistema imunológico
Invasão do tecido e metastização
Instabilidade Genómica
Estimulação da
angiogénese
Escape a vigilância
miR-15, miR-16, miR-20ª, miR-20b
miR-155, Cluster miR-17-92, miR-20ª, miR-93,
imunológica
miR-106b, miR-372, miR373
Estimulação da
miR-10b, miR-21, miR-373, miR-520c, miR-
metastização
155
Inibição da metastização
Let-7, miR-335, miR-206, miR-126, miR-146ª
Promoção da instabilidade
Delecções e subexpressão de miR-17, miR-
genómica
20ª, miR-15, miR-16-1, let7
Figura 2. miRNAs com funções no desenvolvimento/progressão no cancro
da próstata.