104 Avaliação do impacto de polimorfismos de nucleotídeo único na

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Avaliação do impacto de polimorfismos de nucleotídeo único na
regulação por microRNAs em genes envolvidos no carcinoma
colorretal
Palermo J.M, Verbisck N.V.
CCNH, Universidade Federal do ABC
Av. dos Estados, 5001, Santo André, SP
Os microRNAs são uma classe de pequenos RNAs não codificadores de proteínas que se ligam a RNAs mensageiros e interferem em
sua tradução. Os miRNAs encontram-se com expressão alterada em diferentes tipos de câncer, existindo uma forte relação entre os
miRNAs, seus genes-alvo e o desenvolvimento de câncer. Os polimorfismos genéticos de nucleotídeo único (SNPs) podem residir em
locais de ligação de miRNAs ao mRNA, ou então na unidade transcricional do miRNA, sendo responsável pela sua alteração de
expressão. Neste trabalho buscaram-se na literatura relatos sobre microRNAs com expressão alterada em câncer colorretal. Em
seguida, cada artigo foi analisado de modo a listar os miRNAs alterados nesse tipo de câncer. A partir dessa análise, foram
identificados 34 miRNAs com expressão aumentada e 34 miRNAs com expressão reduzida. Utilizando-se diferentes critérios, foram
selecionados alguns miRNAs para estudo mais detalhado, como mir-21, mir-31, mir-200c, mir-191, mir-200a e mir-200b, super
expressos em câncer colorretal, além do mir-145, mir-143, mir-342 e let-7b, pouco expressos. Na etapa seguinte, cada miRNA foi
analisado de modo a identificar os SNPs presentes nos diferentes miRNAs maduros, e em elementos regulatórios de expressão gênica
presentes nas unidades transcricionais desses miRNAs, tais como ilhas de CpG, regiões promotoras e sítios para ligação de fatores de
transcrição (TFBS), já que alterações nessas estruturas podem desencadear alterações na expressão dos miRNAs. Foram encontrados
diversos SNPs em cada elemento citado, sendo que 43 SNPs foram observados em 13 ilhas de CpG analisadas, e 83 SNPs em 42
elementos de regulação da expressão gênica analisados. Ainda foi identificado um único SNP em um TFBS, considerando todos os
miRNAs analisados. A nossa análise dos SNPs nos microRNAs e em suas unidades transcricionais possibilitou identificar possíveis
marcadores para diagnóstico (SNPs) e candidatos a tratamento (miRNAs) do carcinoma colorretal.
Palavras chave: miRNA, câncer colorretal, SNP
I. INTRODUÇÃO
O
câncer de cólon e reto ou colorretal é um dos tumores
malignos mais comuns nos países ocidentais, sendo o 2º
em países industrializados. A relativa facilidade com que os
vários estágios do desenvolvimento do tumor podem ser
observados faz com que o câncer colorretal seja um bom
modelo de estudo para outros tipos de câncer. Muitos estudos
demonstraram que a desregulação de genes é um mecanismo
chave para o desenvolvimento de câncer. Recentemente têm
sido descobertos novos mecanismos relacionados com o
desenvolvimento do câncer, sendo que um importante
mecanismo é a regulação pós-transcricional através de
microRNAs (miRNAs).
MicroRNAs representam umas classe de pequenos
RNAs não codificadores de proteínas que regulam a expressão
pós-transcricional de genes-alvo em função de suas sequências
de nucleotídeos. Eles se ligam a RNAs mensageiros e
interferem em sua tradução, regulando assim o crescimento,
diferenciação celular e desenvolvimento das células. Assim,
mesmo uma pequena mudança na expressão de um miRNA
pode causar um grande efeito na expressão de centenas de
mRNAs nos níveis pós-transcricionais e traducionais, havendo
de fato uma estreita relação entre os miRNAs, seus genes
alvos e o desenvolvimento do câncer, o que torna os
microRNAs alvos de muitas pesquisas e estudos.
Durante
o
projeto
genoma
humano
de
seqüenciamento de todo o DNA e sua informação, tornou-se
claro que a extensão da variação genética é muito maior do
que se estimava. A variação de seqüência mais comum no
genoma humano é a substituição estável de uma única base, o
polimorfismo de nucleotídeo único – SNP (da sigla do inglês
Single Nucleotide Polymorphism).
Os polimorfismos genéticos podem residir em locais
de ligação de miRNAs ao mRNA. Assim, é concebível que a
regulação do mRNA por miRNAs possa ser afetada por
polimorfismos nas UTRs (sigla do inglês UnTranslated
Region). Como a desregulação gênica é um dos mecanismos
chave através do qual as células podem progredir para o
câncer, polimorfismos em sítios de ligação para miRNAs de
genes-alvo podem ter uma importante influência no risco
individual de câncer.
II. MATERIAIS E MÉTODOS
1) Estudo na literatura
Para o aprendizado dos conceitos básicos que se
relacionam ao tema deste projeto, tais como expressão gênica,
polimorfismos
(SNPs),
mutações,
mecanismos
de
silenciamento
gênico
pós-transcricional, microRNAs,
oncogenes e genes-supressores de tumor, carcinoma colorretal
etc, foi feito o levantamento bibliográfico, em livros e
periódicos especializados, com os quais foram feitos os
estudos e produzido resenhas e resumos semanais dos artigos
científicos. Utilizou-se para pesquisa de artigos específicos o
banco
de
dados
PubMed
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez/), do NCBI, que
constitui o mais importante ferramenta para acessar
informação da biologia e ciências da saúde.
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2) Análise in silico
Foram realizados estudos para identificar polimorfismos de
nucleotídeo
único
(SNPs)
que
possam
alterar
significativamente a regulação de genes com função no
carcinoma colorretal, de modo a identificar possíveis
microRNAs alvos de terapia. Para a obtenção das sequências
gênicas completas e seus polimorfismos já identificados e
caracterizados
foi
usado
o
GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/) e o Ensemble
(http://www.ensembl.org/), dois dos mais utilizados bancos de
dados genômicos. Foi usado o banco de dados de microRNAs
denominado miRBase, e diferentes ferramentas de
bioinformática disponíveis na Internet para predição de alvos
de
microRNAs,
como
por
exemplo
TargetScan
(http://www.targetscan.org/), de acordo com as regras de
predição estabelecidas até o momento.
III. RESULTADOS
A. Estudo bibliográfico
Inicialmente buscaram-se na literatura artigos relacionados
a microRNAs com expressão alterada em câncer colorretal de
modo a listar todos os miRNAs encontrados e também seus
genes-alvo, já que há uma importante relação entre a
expressão alterada desses pequenos RNAs não codificadores,
seu genes alvos e o desenvolvimento de diferentes tipos de
câncer. Foram encontrados no total 70 microRNAs com
expressão alterada em câncer colorretal.
B. Expressão dos miRNAs em câncer colorretal e seleção
de alguns para estudo
A partir da pesquisa bibliográfica também foi possível
identificar o nível de expressão alterada no carcinoma
colorretal dos miRNAs encontrados. Muitos miRNAs são
encontrados super expressos, como por exemplo, mir-21, mir31, mir-191, mir-200a, mir-200b, dentre outros, enquanto
outros estão pouco expressos, como o caso do mir-143, mir145, mir-342. Os miRNAs encontrados alterados em câncer
colorretal até o momento na literatura são no total 34 com
expressão aumentada e 34 com expressão diminuída.
Para podermos selecionar alguns miRNAs a serem
estudados mais detalhadamente quanto à existência de SNPs
em sítios de ligações ao mRNA, foi feita uma classificação
arbitrária, de modo a estabelecer prioridade de análise,
observando os seguintes critérios nos artigos estudados: tipos
de amostras, se linhagem celular tumoral ou amostra de tumor
de paciente; número de pacientes; número de artigos que
estudaram um mesmo miRNA.
Estabeleceu-se que os miRNAs alterados descritos após
análise e validação com amostras de tecido de pacientes, em
um número de pacientes maior que 50, teriam prioridade no
nosso estudo. Assim, foi dado um score de 1 aos trabalhos que
utilizaram tanto análise e validação com tecido de pacientes
como o número destes maior que 50. Em seguida os miRNAs
relatados com amostras de tecido de pacientes e linhagens de
células, em um número de pacientes menor que 50, o score
dado a esses trabalhos foi de 0,5. Por último os miRNAs que
fizeram validação apenas com linhagens de células, nos quais
foram dados um score de 0,2. Foi feita a soma do score de
cada miRNA e os microRNAs mais pontuados foram
selecionados para o estudo detalhado, sendo eles mir-21, mir31, mir-200c, mir-191, mir-200a e mir-200b, que estão super
expressos em câncer colorretal, além do mir-145, mir-143,
mir-342 e let-7b, que estão pouco expressos em câncer
colorretal.
C. Análise da unidade transcricional dos miRNAs
Na etapa seguinte, cada miRNA foi analisado de modo a
identificar os SNPs presentes nos diferentes miRNAs
maduros, em ilhas de CpG, em elementos de regulação gênica
e TFBS das unidades transcricionais dos miRNAs
selecionados, já que alterações nessas estruturas podem
desencadear alterações na expressão dos miRNAs.
Foram encontrados diversos SNPs em cada elemento citado.
A partir da análise dos SNPs em ilhas de CpG foi possível
encontrar 43 SNPs em 13 ilhas de CpG analisadas, enquanto
que a análise dos elementos de regulação gênica permitiu
encontrar 83 SNPs em 42 elementos de regulação da
expressão gênica analisados. Ainda foi identificado um único
SNP em um TFBS, presente na unidade transcricional tanto do
mir-143, quanto do mir-145.
IV. DISCUSSÃO
Muitos trabalhos recentes têm se concentrado no estudo de
miRNAs, já que mesmo uma pequena alteração na expressão
do miRNA pode causar um grande efeito na expressão de
centenas de genes de mRNAs a nível pós-transcricional ou
traducional. Há muitas evidências de que os miRNAs estão
envolvidos em câncer, inclusive no câncer colorretal. Como os
SNPs podem residir em locais de ligação de miRNAs ao
mRNA, é possível que a regulação do mRNA por miRNAs
possa ser afetada por eles. Assim, polimorfismos, em sítios de
ligação para miRNAs-alvo, podem ter uma importante
influência no risco individual de câncer. Atualmente há
poucos artigos publicados que relacionam miRNAs e câncer
colorretal, tornando importante o estudo destes. A pesquisa de
SNPs relacionados a miRNAs ou genes-alvo em câncer
colorretal é ainda mais deficiente.
A partir da análise dos diferentes miRNAs observou-se que
nenhum deles possui SNPs na sua estrutura. Assim, partiu-se
para análise alargada da unidade transcricional de cada um.
Com isso, analisaram-se SNPs nas ilhas de CpG, em
elementos de regulação gênica e em TFBS, já que alterações
nessas estruturas podem desencadear alterações na expressão
dos miRNAS. Entretando, somente um SNP foi encontrado
nos TFBS.
V. CONCLUSÃO
Com esta análise foi possível, a partir de dados da literatura,
listar os miRNAs que têm um papel funcional no carcinoma
colorretal. A partir da análise da bibliografia encontrada sobre
esse tema foram selecionados alguns miRNAs, como mir-21,
mir-31, mir-200c, mir-191, mir-200a e mir-200b, que estão
super expressos em carcinoma colorretal, além do mir-145,
mir-143, mir-342 e let-7b, que estão pouco expressos nesse
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tipo de câncer.
A análise de variações em ilhas de CpG, em elementos de
regulação gênica e em TFBS, revelou 43 SNPs em 13 ilhas de
CpG analisadas, e 83 SNPs em 42 elementos de regulação da
expressão gênica analisados. Considerando os TFBS, foi
encontrado apenas um SNP.
A nossa análise dos SNPs nos microRNAs e em suas unidades
transcricionais possibilitou identificar possíveis marcadores
para diagnóstico (SNPs) e candidatos a tratamento (miRNAs)
do carcinoma colorretal.
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