furan-2(5H)

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
Estudo da atividade citotóxica do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinilfuran-2(5H)-ona
Juliana Bagatini Klein
Itajaí, 2012
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
Juliana Bagatini Klein
Estudo da atividade citotóxica do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinilfuran-2(5H)-ona
Dissertação submetida à Universidade do
Vale do Itajaí como parte dos requisitos
para a obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Profa Dra Nara Lins M. Quintão
Co-orientador: Prof. Dr. Rilton Alves de
Freitas
Itajaí, julho de 2012
FICHA CATALOGRÁFICA
K672e
Klein, Juliana Bagatini, 1984Estudo da atividade citotóxica do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)ona [Manuscrito] / Juliana Bagatini Klein. – 2012.
111 f. : il. Color.
Cópia de computador (Printout(s)).
Dissertação (mestrado) – Universidade do Vale do Itajaí, Programa de Mestrado
em Ciências Farmacêuticas Área de Concentração em Produtos naturais e Substâncias
Sintéticas Bioativas 2012.
“Orientadora: Profª. Drª Nara Lins M. Quintão ;
Co-orientador: Prof. Dr. Rilton Alves de Freitas ”.
Bibliografia: f. 96-108.
1. Produtos naturais. 2. Câncer - tratamento. 3. Farmacologia plantas medicinais. I. Quintão, Nara M. II. Freitas, Rilton Alves
de. III. Título.
CDU: 615.03
Claudia Bittencourt Berlim CRB 14-964
Estudo da atividade citotóxica do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinilfuran-2(5H)-ona
Juliana Bagatini Klein
07/2012
Orientador: Nara Lins M. Quintão, Dra.
Co-orientador: Prof. Dr. Rilton Alves de Freitas, Dr.
Número de Páginas: 118
Os cânceres de pele são os mais frequentes no Brasil e correspondem, em média, a
25% de todos os tumores malignos registrados. Destes, o melanoma representa não
menos que 5% e é caracterizado por seu alto poder metastático. O desenvolvimento
de fármacos antineoplásicos a partir de produtos naturais é considerado
fundamental para a farmacologia. O interesse pelo desenvolvimento de agentes
quimioterápicos mais eficazes vem crescendo a cada ano. Desta forma, o presente
trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antineoplásica da substância isolada
de Vernonia scorpioides (Lam) Pers o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)ona. Para avaliar a atividade citotóxica da substância foram utilizados os corantes
vitais MTT em células de melanoma murino B16F10, e o corante XTT para as
células leucêmicas, tumores sólidos e CMNH (células mononucleares normais
humanas). Os padrões de morte celular foram estabelecidos por microscopia de
fluorescência, utilizando os corantes brometo de etídeo, diacetato de fluoresceína e
alaranjado de acridina. A atividade da enzima caspase 3 foi determinada por ensaio
colorimétrico. O efeito antitumoral do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona
nos modelos in vivo de tumor sólido e metástase pulmonar em camundongos
C57BL6, foi avaliado observando-se os seguintes parâmetros: crescimento tumoral,
índice de metástase, peso corporal, atividade exploratória através do modelo de
campo aberto Open Field e a toxicidade do composto foi avaliada em diferentes
órgãos. A atividade antinociceptiva da substância isolada foi avaliada em animais
submetidos ao modelo de metástase pulmonar. Os resultados apresentados
mostraram que a substância poliacetileno apresentou níveis significativos de
citotoxicidade sobre células de melanoma murino B16F10 com CI50 de 17,39 ±
3,26µM; células leucêmicas NB4, RAMOS, JURKAT e NALM6 e de tumores sólidos
PC3, H1299, MG63 e NCI, não apresentando citotoxicidade significativa frente as
CMNH. O poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona apresentou a apoptose
como principal mecanismo de morte celular, pela indução de caspase 3. Também foi
observado inibição de 80 ± 15,95% no desenvolvimento do tumor sólido induzido
com B16F10 em camundongos bem como o aumento no número de cruzamentos no
modelo Open Field de 57,50 ± 5,90 na menor dose comparado com o grupo controle
com tumor de 34,5 ± 5,23. Pode-se observar a redução de nódulos metastáticos em
62% na menor dose, bem como no número de cruzamentos. Nenhum efeito
toxicológico significativo foi observado, bem como alteração no peso corporal de
animais sadios. Na avaliação da sensibilidade mecânica com a substância,
observou-se redução significativa na sensibilidade dos grupos tratados. Estes
resultados, em conjunto, demonstram que o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan2(5H)-ona apresentou importante atividade antineoplásica, podendo tornar-se uma
importante ferramenta no tratamento do câncer sem existência de efeitos
indesejáveis. Considerando os promissores resultados obtidos com o poliacetileno, é
necessário continuar os estudos farmacológicos e moleculares, para elucidar o
mecanismo de ação desta substância que pode ser uma nova e atrativa molécula
para o tratamento do câncer.
PALAVRAS
APOPTOSE.
CHAVES: VERNONIA SCORPIOIDES
(LAM)PERS.POLIACETILENO.CITOTOXICIDADE.
Abstract
Study of the cytotoxic activity of polyacetylene 5-octa-2,4,6-triinilfuran-2 (5H)-one
Juliana Klein Bagatini
07/2012
Supervisor: Nara Lins M. Quintao,Ph.D
Co-supervisor: Rilton Alves de Freitas,Ph.D
Number of Pages: 118
Skin cancers are the most common types of cancer in Brazil, and correspond to
around 25% of all malignant tumors recorded. Of these, melanoma represents at
least 5% and is characterized by its high metastatic power. The development of
anticancer agents from natural products is considered critical to pharmacology, and
interest in the development of more effective chemotherapeutic agents is increasing
each year. This study evaluates the antineoplastic activity of the substance isolated
from Vernoniascorpioides (Lam) Perspolyacetylene 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2 (5H)one. To assess the cytotoxic activity of the substance, vital MTT dyes were used in
vital cells of murine melanoma B16F10, and the dye XTT for the leukemia cells, solid
tumors and NHMC (normal human mononuclear cells). The patterns of cell death
were determined by fluorescence microscopy using the dyesethidium bromide,
fluorescein diacetate and acridine orange. The enzyme activity of caspase 3 was
determined by colorimetric assay. The antitumor effect of polyacetylene 5-octa-2 ,4,6triinil-furan-2 (5H)-one in in vivo models of solid tumors and lung metastasis in
C57BL6 mice, was evaluated using the following parameters: tumor growth, rate of
metastasis, body weight, and exploratory activity through the Open Field model. The
toxicity of the compound was evaluated in different organs. The antinociceptive
activity of the isolated substance was evaluated in animals submitted to the lung
metastasis model. The results showed that the substance polyacetylene has
significant levels of cytotoxicity on B16F10 cells, with IC50 of 17.39 ± 3.26 µM, while
the NB4 leukemic cells, RAMOS, JURKAT and NALM6 solid tumors and PC3,
H1299, and NCI MG63 and did not show significant cytotoxicity against CMNH. The
polyacetylene 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2 (5H)-one showed apoptosis as the main
mechanism of cell death,viathe induction of caspase 3. Inhibition of 80 ± 15.95% was
also observed in the development of solid tumors in mice, induced by B16F10, and
an increase in the number of crossings in the Open Field model of 57.50 ± 5.90 at the
lowest dose, compared with the control group tumor (34.5 ± 5.23). A 62% reduction
in metastatic nodules was seen at the lowest dose, as well as a reduction in the
number of crossings. No significant toxicological effect or changes in body weight of
the healthy animals were observed. In the evaluation of sensitivity to mechanical
substances, there was a significant reduction in sensitivity of the treated groups.
Taken together, these results demonstrate that the polyacetylene 5-octa-2,4,6-triinilfuran-2 (5H)-one showed significant anticancer activity, and may become an
important tool for the treatment of cancer, without the existence of undesirable side
effects. Based on the promising results obtained with polyacetylene, further
pharmacological and molecular studies are needed, to elucidate the mechanism of
action of this substance with potential as a new and attractive molecule for cancer
treatment.
Keywords: Vernoniascorpioides (Lam) Pers. polyacetylene. cytotoxicity.apoptosis.
Dedico esta dissertação, aquele que me faz sorrir toda manhã, que faz
o dia ficar mais leve, aquele que esta sempre do meu lado, que me faz
acreditar que sou capaz, agradeço a Deus por ser a pessoa mais feliz
do mundo, pois tenho VOCÊ ao meu lado meu amor.
Agradecimentos Especiais
Agradeço a Deus, que está sempre comigo, iluminando meus passos e guiando meu
caminho. Tudo o que tenho e sou agradeço a ele.
Nada na vida acontece por um acaso, e se aconteceu DEUS quis assim. O que
me resta é so correr atras de meus objetivos, ainda mesmo que pessoas
conspirem ao contrário DEUS estará comigo.
Eça de Queiroz
Agradeço aos meus pais, que me educaram, me deram amor, carinho, limites,
possibilidades e sabedoria. Para que eu pudesse trilhar meu caminho sozinha
reconhecendo princípios, valores e agisse de forma honesta e digna.
Obrigado por tudo!
Mãe sei que muitas vezes deixou de seguir seu caminho para que pudéssemos viver
de forma que julgava ser melhor, assim realizando nossos sonhos e ideais, saiba
que você faz parte de todos os sonhos que estão se realizando!
Carol, sem palavras para descrever o quanto te amo, o quanto me sinto melhor
quando esta por perto, e o quanto me orgulho de você.
Te amo!
A família do Jésum, que sempre me acolheu, mostrando amor e confiança.
Obrigada pelo incentivo, pela alegria e por estarem presentes nas minhas
conquistas.
Jésum
Meu companheiro, minha alma gêmea, o que dizer desta pessoa que está sempre
ao meu lado, me amando, elogiando, incentivando?
“Amar pode dar certo” é a frase mais simples possível para traduzir a convicção de
que nascemos para amar e ser amados, e que nossa felicidade consiste em realizar
essa missão.
Esteja sempre comigo,
TE AMO!
O amanhecer traz o louvor dos pássaros que cantam para glorificar a Deus.
A natureza inteira louva o Criador e demonstra os atributos de tudo o que
foi criado com perfeição.
Os Anjos não se cansam de cantar louvores e de enaltecer as qualidades
divinas que podem encontrar expressão em cada coração humano.
O louvor está no peito de cada um que
se devota a amar e a servir, sem medo de ser feliz.
Agradecimentos
Ao professor Rilton, pelo prazer da convivência, pelas inúmeras oportunidades
de aprendizado proporcionadas em diversas áreas do conhecimento, por saber
reconhecer aptidões individuais e estimulá-las, pelo incentivo de ir além.
Obrigada pelo respeito, dedicação e confiança;
A professora Nara, obra do destino, até pode ser! Quero agradecer por me aceitar
como sua orientanda. Posso me considerar privilegiada por ter tido a oportunidade
de ter dois orientadores: o Rilton e você. Foi um enorme prazer conviver este tempo
contigo, agradeço pelos conselhos, ensinamentos, pela ajuda e amizade;
Agradeço minhas amigas que sempre estiveram do meu lado, incentivando e
aplaudindo meus passos, presentes em todos os momentos, Mirela e Juliana;
Agradeço a minha amiga Dani, que mesmo de longe me aconselhou, esteve
presente em meu coração e se hoje estou aqui com certeza ela teve sua
participação. E hoje mais do que nunca estamos ligadas para toda a vida;
Amigas que conquistei fazendo o mestrado e que com certeza ficarão para
sempre, Sheila e Thaís. Obrigada pela amizade, pelos sorrisos, e algumas lágrimas
também, obrigada pelo convívio maravilhoso. Vocês fazem parte deste trabalho;
A amiga Juliana Nunes, obrigada pelas manhãs e tardes de muita conversa e
histórias contadas, obrigada por fazer com que eu fizesse parte de tua história;
A minha mais nova amiga, companheira de manhãs e tardes, querida Gi.
Obrigada, pelos conselhos, pelo carinho, pelos abraços, por me manter calma e
mais paciente;
A profª. Dr. Maique Biavatti, pela substância cedida para o estudo. Pela
atenção e confiança;
Aos professores do Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas, por
terem compartilhado seus conhecimentos;
As professoras Fátima e Márcia, pela dedicação, sugestões e críticas que
fizeram ao trabalho, colaborando e contribuindo na sua finalização;
Ao Juliano e Elenize, da secretaria do Programa de Mestrado em Ciências
Farmacêuticas, por terem me ajudado sempre que precisei e que, indiretamente me
auxiliaram no desenvolvimento deste trabalho;
As técnicas de laboratório Margie, Lilian e Cláudia pelo apoio sempre
presente, ajuda na realização de experimentos e conversas diversas que alegravam
nossos dias;
A profª. Dr. Tânia Bresolin, por estar sempre disposta a dar conselhos e
questionar. Obrigada por tudo;
Ao Gilberto Franchi, pela disposição e colaboração no trabalho;
As técnicas do laboratório de histologia Bia e Maria, pela ajuda, atenção e
dedicação;
A todos meus colegas de mestrado, pelo incentivo nas horas mais difíceis, e
troca de idéias;
A todas as pessoas que, direta ou indiretamente, auxiliaram e me
acompanharam durante a realização deste trabalho, proporcionando um ambiente
de luz, de amor e sabedoria. Por me ajudarem a enfrentar os obstáculos, e desviar
de pessoas que não mereciam a minha amizade ou indignação. Que me ajudaram a
vencer cada minuto, cada dia, cada mês, cada ano, cada pensar e agir nesta
dissertação;
Obrigada mais uma vez a Deus por criar os animais, seres de luz em minha
vida. Tenho a honra de compartilhar os meus momentos com meus dois filhos
peludos Tobi e Nicolas, os quais, com amor incondicional, me fazem uma pessoa
melhor;
Obrigada a CAPES pela bolsa concedida durante o período do mestrado,
possibilitando mais uma conquista.
Epígrafe
Que o “Mestre dos Mestres” lhe ensine que nas falhas e lágrimas se
esculpe a sabedoria.
Que o “Mestre da Sensibilidade” lhe ensine a contemplar as coisas
simples e a navegar nas águas da emoção.
Que o “Mestre da Vida” lhe ensine a não ter medo de viver e a superar
os momentos mais difíceis da sua história.
Que o “Mestre do Amor” lhe ensine que a vida é o maior espetáculo no
teatro da existência.
Que o “Mestre Inesquecível” lhe ensine que os fracos julgam e desistem,
enquanto os fortes compreendem e tem esperança.
Não somos perfeitos. Decepções, frustações e perdas sempre
acontecerão.
Mas Deus é o artesão do espírito e da alma humana. Não tenha medo.
Depois da longa noite surgirá o mais belo amanhecer. Espere-o.
Augusto Cury
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. APOPTOSE MEDIADA PELA VIA INTRÍNSECA (MITOCONDRIAL) E PELA VIA
EXTRÍNSECA (RECEPTORES DE MORTE). ................................................................... 31
FIGURA 2. ESTRUTURA QUÍMICA DE ALCALÓIDES DERIVADOS DE CATHARANTUS ROSEUS A
VINCRISTINA E VINBLASTINA ................................................................................... 34
FIGURA 3. ESTRUTURA QUÍMICA DO PACLITAXEL (TAXOL®) ............................................ 35
FIGURA 4.
ESTRUTURA QUÍMICA DA CAMPTOTECINA, ISOLADA DE CAMPTOTHECA
ACUMINATA(A) TOPOTECANO (B) IRINOTECANO ...................................................... 355
FIGURA 5.
ESTRUTURA QUÍMICA DA PODOFILOTOXINA DE PODOPHYLLUM EMODI E P.
PELTATUM E OS DERIVADOS SEMI-SINTÉTICOS TENIPOSÍDEO E ETOPOSÍDEO ................ 36
FIGURA 6. FOTO DAS PARTES AÉREAS DE VERNONIA SCORPIOIDES (LAM) PERS. ............ 38
FIGURA 7. REPRESENTAÇÃO DA ESTRUTURA QUÍMICA DE ÉSTER DEHIDROMATRICARIA ....... 40
FIGURA 8. POLIACETILENO ISOLADO DE V. SCORPIOIDES ................................................. 42
FIGURA 9. ESQUEMA REPRESENTANDO A METABOLIZAÇÃO DO MTT. ................................ 46
FIGURA 10. ESQUEMA REPRESENTANDO A METABOLIZAÇÃO DO XTT. .............................. 48
FIGURA 11. MICROSCOPIA
DE FLUORESCÊNCIA DE CÉLULAS B16F10 CORADAS COM
BROMETO DE ETÍDIO E ALARANJADO DE ACRIDINA E CLASSIFICADAS EM PADRÕES PRÉESTABELECIDOS. .................................................................................................... 51
FIGURA 12. INFLUÊNCIA SOBRE O CRESCIMENTO TUMORAL SÓLIDO DE CÉLULAS DE
MELANOMA MURINO B16F10 EM CAMUNDONGOS C57BL/6. ...................................... 53
FIGURA 13. FIGURAS ILUSTRATIVAS
DO PROCEDIMENTO DE PERFUSÃO CARDÍACA REALIZADA
NOS ANIMAIS PARA RETIRADA DOS PULMÕES E ÓRGÃOS. ............................................ 55
FIGURA 14. MODELO DO
ENSAIO DECAMPO ABERTO (OPEN FIELD) .................................. 56
FIGURA 15. FOTO
ILUSTRATIVA DA PLATAFORMA DE ARAME ELEVADA PARA AVALIAÇÃO
MECÂNICA UTILIZANDO O MONOFILAMENTO DE VON FREY .......................................... 57
FIGURA 16. VIABILIDADE DAS CÉLULAS B16F10 EXPOSTAS AO POLIACETILENO 5-OCTA2,4,6-TRIINIL-FURAN-2(5H)-ONA.TEMPO DE CONTATO COM O COMPOSTO (A) 24, (B) 48
E (C) 72 HORAS, MANTIDAS A 37ºC/5% CO2. ........................................................... 60
FIGURA 17. EFEITOS
DO COMPOSTO POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6-TRIINIL-FURAN-2(5H)ONA NA CONCENTRAÇÃO DE 5,43µM, NA MORFOLOGIA DAS CÉLULAS DE MELANOMA
MURINO B16F10.. ................................................................................................. 64
FIGURA 18. EFEITOS
DO COMPOSTO POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6-TRIINIL-FURAN-2(5H)ONA NA CONCENTRAÇÃO DE 54 µM, NA MORFOLOGIA DAS CÉLULAS DE MELANOMA
MURINO B16F10.. ................................................................................................. 65
FIGURA 19. EFEITOS
DO COMPOSTO POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6-TRIINIL-FURAN-2(5H)ONA NA CONCENTRAÇÃO DE 543 µM, NA MORFOLOGIA DAS CÉLULAS DE MELANOMA
MURINO B16F10. .................................................................................................. 65
FIGURA 20. EFEITOS
DO FÁRMACO PACLITAXEL UTILIZADO COMO CONTROLE POSITIVO NA
CONCENTRAÇÃO DE 100 µM, NA MORFOLOGIA DAS CÉLULAS DE MELANOMA MURINO
B16F10.. .............................................................................................................. 66
FIGURA 21. IMAGENS
DO CONTROLE NEGATIVO MEIO MEM+DMSO 1%, NA MORFOLOGIA
DAS CÉLULAS DE MELANOMA MURINO B16F10.......................................................... 66
FIGURA 22. QUANTIFICAÇÃO DA P-NITRO ANILINE (PNA) MMOL/L FORMADA NAS CÉLULAS
TUMORAIS B16F10EM PRESENÇA DO POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6-TRIINIL-FURAN2(5H)-ONA. ........................................................................................................... 69
FIGURA
23. EFEITO DO POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6-TRIINIL-FURAN-2(5H)-ONA NAS
DOSES DE (5,43 E 54,34 µMOL/KG) SOBRE O PESO DA MASSA TUMORAL DOS
CAMUNDONGOS C57BL/6N INDUZIDOS AO CRESCIMENTO DE TUMOR SÓLIDO POR
CÉLULAS DE MELANOMA MURINO B16F10.. .............................................................. 70
FIGURA 24. EFEITO DO POLIACETILENO SOBRE O VOLUME TUMORAL. EFEITO DO
POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6-TRIINIL-FURAN-2(5H)-ONA NAS DOSES DE (5,43 E
54,34µMOL/KG) SOBRE O VOLUME TUMORAL. ........................................................... 71
FIGURA 25. IMAGENS
REPRESENTATIVAS DA ANÁLISE MACROSCÓPICA DOS PULMÕES
RETIRADOS DOS CAMUNDONGOS TRATADOS COM O POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6TRIINIL-FURAN-2(5H)-ONA.. .................................................................................... 73
FIGURA 26. GRÁFICO DE INIBIÇÃO DE METÁSTASE PULMONAR INDUZIDA POR CÉLULAS
B16F10 INJETADAS VIA RETRO-ORBITAL EM CAMUNDONGOS C57BL/6 ....................... 74
FIGURA 27. ANÁLISE HISTOLÓGICA DE METÁSTASE PULMONAR (A) CONTROLE NEGATIVO (B)
CONTROLE POSITIVO (C) DOSE DE 5,43µMOL/KG (D) DOSE DE 54,34µMOL/KG. AUMENTO
DE 400X ................................................................................................................ 75
FIGURA 28. EFEITO DO POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6-TRIINIL-FURAN-2(5H)-ONA (5,43 E
543 µMOL/KG, I.P.) SOBRE OS PARÂMETROS COMPORTAMENTAIS “CROSSING”
(CRUZAMENTOS) NO MODELO DO OPEN FIELD EM MODELO DE TUMOR SÓLIDO ............. 76
FIGURA 29. EFEITO DO POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6-TRIINIL-FURAN-2(5H)-ONA (5,43 E
543 µMOL/KG, I.P.) SOBRE OS PARÂMETROS COMPORTAMENTAIS “CROSSING”
(CRUZAMENTOS) NO MODELO DO OPEN FIELD EM MODELO DE METÁSTASE PULMONAR . 76
FIGURA 30. EFEITO DO POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6-TRIINIL-FURAN-2(5H)-ONA (5,43 E
543 µMOL/KG, I.P.) SOBRE OS PARÂMETROS COMPORTAMENTAIS “CROSSING”
(CRUZAMENTOS) NA AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA. ....................................................... 77
FIGURA 31. FREQUÊNCIA
DE RESPOSTA DA PATA DIREITA DOS ANIMAIS DO MODELO DE
METÁSTASE PULMONAR TRATADOS COM O COMPOSTO POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6TRIINIL-FURAN-2(5H)-ONA NAS DOSES DE 5,43 E 543 µMOL/KG. ................................ 78
FIGURA 32. FOTOS ILUSTRATIVAS DO ASPECTO FÍSICO DOS ANIMAIS TRATADOS COM O
POLIACETILENO NAS DOSES DE 5,43µMOL/KG (A) E 543µMOL/KG (B, C) DURANTE 12
DIAS, PARA AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA DO COMPOSTO. .............................................. 79
FIGURA 33. GRÁFICO
DE VARIAÇÃO DO PESO INICIAL E PESO FINAL(G) DOS ANIMAIS
TRATADOS COM O POLIACETILENO 5-OCTA-2,4,6-TRIINIL-FURAN-2(5H)-ONA NAS DOSES
DE 5,43 E 543µMOL/KG, I.P, E GRUPO SALINA (C) TRATADOS POR 12 DIAS. .................. 79
FIGURA 34. ANÁLISE HISTOLÓGICA DO FÍGADO DOS ANIMAIS SUBMETIDOS A AVALIAÇÃO
TOXICOLÓGICA (A) GRUPO CONTROLE (B) DOSE DE 5,43µMOL/KG (C) 54,34µMOL/KG.
AUMENTO DE 400X. ............................................................................................... 80
FIGURA 35. ANÁLISE HISTOLÓGICA DO BAÇO DOS ANIMAIS SUBMETIDOS A AVALIAÇÃO
TOXICOLÓGICA (A) GRUPO CONTROLE (B) DOSE DE 5,43µMOL/KG (C) 54,34µMOL/KG.
AUMENTO DE 400X. ............................................................................................... 80
FIGURA 36. ANÁLISE HISTOLÓGICA DO RIM DOS ANIMAIS SUBMETIDOS A AVALIAÇÃO
TOXICOLÓGICA (A) GRUPO CONTROLE (B) DOSE DE 5,43µMOL/KG (C) 54,34µMOL/KG.
AUMENTO DE 400X. ............................................................................................... 80
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Concentração inibitória da viabilidade celular em cinquenta porcento das
células (CI50) das células PC3, LNCAP, H1299, OVCAR, NCI, MCF7, U138MG,
VW473, HELA, T84, HOS E MG63 expostas por 24 horas ao poliacetileno 5-octa2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona........................................................................................61
Tabela 2. Concentração inibitória da viabilidade celular em cinquenta porcento das
células (CI50) das células leucêmicas K562, KG1, HL60, NB4, RAMOS, RAJI, RS4,
JURKAT, MOLT4, NALM6, B15 e U937 e células normais CMNH, expostas por 48
horas ao poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona.........................................62
Tabela 3. Porcentagem de apoptose apresentada pelo poliacetileno 5-octa-2,4,6triinil-furan-2(5H)-ona no processo de morte celular através da marcação de morte
celular com Alaranjado de Acridina e Brometo de Etídeo na linhagem celular
B16F10.......................................................................................................................67
Tabela 4. Porcentagem de necrose apresentada pelo poliacetileno 5-octa-2,4,6triinil-furan-2(5H)-ona no processo de morte celular através da marcação de morte
celular com Alaranjado de Acridina e Brometo de Etídeo na linhagem celular
B16F10.......................................................................................................................68
Tabela 5. Porcentagem do Peso dos animais no 7º. e último dia de experimento em
relação ao peso inicial e porcentagem dos órgãos em relação ao peso final de
camundongos C57BL/6N, após administração do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinilfuran-2(5H)-ona..........................................................................................................72
LISTA DE ABREVIATURA
AA- Alaranjado de acridina
AChe- Acetilcolinesterase
B16F10- Célula de melanoma murino
B15- Linhagem celular de leucemia linfoblástica aguda
BE- Brometo de etídeo
BCRJ- Banco de células do Rio de Janeiro
Bid- Proteína pro-apoptótica
CADS (DNases)- Enzimas nucleases ativadas por caspase
Cdc27- Proteína reguladora do ciclo celular
CFA- Adjuvante completo de Freund
CMNH- Células mononucleares humanas
DNA-P- DNA polimerase
DR- Death receptors (receptores de morte)
DISC- Complexo sinalizador de morte
DMSO- Dimetilsulfóxido
EDTA- Ácido etilenodiamino tetra-acético
FADD- Proteína derivada da morte associada a FaS
FAS/CD95- Receptor de morte
FAsL- Receptor de morte
HE- Hematoxilina eosina
HELA- Adenocarcinoma de colo de útero humano
HEPES- Hidroxietil piperazinoltanossulfonico
HIV- Vírus da imunodeficiência humana
HOS- Linhagem celular de osteosarcoma humano
H1299- Linhagem celular de carcinoma de pulmão humano
HL-60- Linhagem celular de leucemia promielocítica humana
ICAD- Inibidor de ativação de caspase
INCA- Instituto Nacional do Câncer
JURKAT- Linhagem celular de leucemia/linfoma de células T
K562- Linhagem celular leucemia mielóide/eritroleucemia Ph+ humana
KG1- Linhagem celular de leucemia mielóide humana
LNCAP- Linhagem delular de câncer de próstata humano
MCF-7- Linhagem celular adenocarcinoma de mama humano
MEM- Meio essencial mínimo
MG63- Linhagem celular de osteosarcoma humano
MOLT4- Linhagem celular de leucemia linfoblástica aguda
MMP- Potencial de membrana mitocôndrial
MTT- 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio brometo
NALM6- Leucemia linfóide aguda B humana
NB4- Leucemia promielocítica aguda humana
NCI- Linhagem celular de câncer de pulmão humano
NALM6- Leucemia linfóide aguda B humana
NK562- Linhagem celular de leucêmia natural killer sensível
OMS- Organização Mundial de Saúde
OVCAR- Linhagem celular de adenocarcinoma de ovário humano
PARP- Proteína polimerase requerida no reparo do DNA
PBS- (Phosphate buffered saline) Salina tamponada com fosfato
PC3- Linhagem celular de Câncer de próstata humano
PKB/AKt- Proteína reguladora da sinalização apoptótica
RAMOS- Linhagem celular de linfoma humano de Burkitt’s
RAJI- Linhagem celular de linfoma humano de Burkitt’s
Rb- Proteína reguladora do ciclo celular
RIP quinase- Proteína mediadora da sinalização apoptótica
RPMI- Meio de cultura Instituto Roswell Park Memorial
RS4- Linhagem celular de leucemia aguda
SFB- Soro fetal bovino
TNF- Fator de necrose tumoral
TRAIL- Receptor de morte
T84- Linhagem celular de adenocarcinoma de cólon humano
U138MG- Linhagem celular de adenocarcinoma cervical humano
U937- Linhagem celular de linfoma monocítico
VEGF- Fator de crescimento endotelial vascular
VW473- Linhagem celular de meduloblastoma humano
XTT- 2,3-bis (2- metil-4-nitro-5-sulfofenil) – 5-[(fenilamino) carbonil] – 2H- hidróxido de
tetrazólio
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................
12
2 OBJETIVOS........................................................................................................
15
2.1 Objetivo geral..................................................................................................
15
2.2 Objetivos específicos....................................................................................
15
3 REVISÃO DA LITERATURA..............................................................................
17
3.1 Câncer.............................................................................................................
17
3.2 A carcinogênese.............................................................................................
18
3.2.1 Metástases....................................................................................................
20
3.2.2 Tumor sólido e resistência a fármacos antitumorais..............................
21
3.3 Câncer da pele................................................................................................
22
3.3.1 Tratamento melanoma................................................................................
24
3.3.2 Dor no câncer e melanoma........................................................................
26
3.4 Câncer e o processo de morte celular..........................................................
27
3.5 Importância das plantas medicinais na terapia antitumoral.......................
33
3.6 Gênero Vernonia: ocorrência e aspectos biológicos ................................
37
3.6.1 Poliacetileno: atividades biológicas........................................................
39
4 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................
43
4.1 Material vegetal e composto isolado............................................................
43
4. 2 Ensaios in vitro.............................................................................................
43
4.2.1 Linhagens celulares....................................................................................
43
4.2.1.1 Obtenção de células mononucleares humanas ..................................
44
4.2.1.2 Cultura de células.....................................................................................
44
4.2.1.3 Determinação da viabilidade celular......................................................
45
4.2.1.2.1 Ensaio de citotoxicidade (MTT)..........................................................
46
4.2.1.2.2 Ensaio de citotoxicidade (XTT)............................................................
47
4.2.2 Avaliação do processo de morte celular por microscopia de
fluorescência.........................................................................................................
48
4.2.2.1
Brometo
de
etídeo
e
diacetato
de
fluoresceína.........................................................................................................
4.2.2.2
Brometo
de
etídeo
e
alaranjado
48
de
acridina................................................................................................................
49
4.2.2.3 Critérios para classificação das células em apoptóticas, necróticas
ou viáveis utilizando dupla-coloração...............................................................
51
4.2.3
ensaio
52
4.3 Avaliação da atividade antineoplásica do poliacetileno............................
52
4.3.1 Animais........................................................................................................
52
4.3.2 Influência sobre o crescimento tumoral...................................................
53
Determinação
da
atividade
da
caspase-3
por
colorimétrico............................
4.3.3 Avaliação do efeito do tumor melanoma B16F10 sobre o peso
corporal dos animais......................................................................................
54
4.3.4 Avaliação do efeito antimetastático do poliacetileno.............................
54
4.3.5 Avaliação da atividade locomotora utilizando o modelo de campo
aberto (Open Field)..............................................................................................
55
4.3.6 Modelo de avaliação de hipernocicepção mecânica através do
monofilamento de Von Frey................................................................................
56
4.3.7 Avaliação histológica ................................................................................
57
4.3.8 Avaliação da Toxicidade aguda in vivo....................................................
57
4.4 Análise estatística.........................................................................................
58
5 RESULTADOS...............................................................................................
59
5.1 Avaliação da viabilidade celular..............................................................
59
5.1.2 Avaliação da morte celular por microscopia de fluorescência..........
63
5.1.2.1 Brometo de etídeo e diacetato de fluoresceína................................
63
5.1.2.2 Brometo de etídeo e alaranjado de acridina.....................................
63
5.2 Determinação da atividade de caspase-3 por ensaio
colorimétrico..........................
5.3 Avaliação da atividade antineoplásica do poliacetileno in vivo...........
69
5.3.1 Influência sobre o crescimento tumoral..............................................
70
5.3.2 Avaliação do efeito do tumor sobre o peso corporal dos animais....
71
5.3.3 Avaliação do efeito antimetastático do poliacetileno.........................
73
5.3.4 Avaliação da atividade locomotora (Open Field)................................
75
5.3.5
Avaliação
de
hipernocicepção
mecânica
através
70
do
monofilamento de Von Frey...........................................................................
77
5.3.6 Avaliação da atividade toxicológica aguda.........................................
78
6 DISCUSSÃO..................................................................................................
81
7 CONCLUSÃO................................................................................................
94
REFERÊNCIAS................................................................................................
96
12
1. INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas, o câncer ganhou uma dimensão maior, convertendo-se em
um evidente problema de saúde pública, segundo o Instituto Nacional do Câncer
(INCA 2012). Diante disso, fica evidente a necessidade de investimentos no
desenvolvimento de ações abrangentes para o controle do câncer nos diferentes
níveis de atuação, sobretudo na pesquisa (INCA 2010). Desta forma, a busca por
novos fármacos com ação antitumoral tem sido muito importante, visto que ainda
existem muitos tipos de tumores que não possuem tratamento ou são resistentes
aos fármacos atualmente existentes no mercado (NEVIN; VIJAYAMMAL, 2003).
A natureza é uma fonte atraente de novos compostos candidatos terapêuticos
com uma enorme diversidade química encontrada em milhões de espécies de
plantas, animais, organismos marinhos e microorganismos O papel dos produtos
naturais como fonte de medicamentos tem sido reconhecido desde os tempos
antigos. Apesar de grande progresso científico e tecnológico os fármacos derivados
de produtos naturais ainda contribuem para a descoberta de novos medicamentos.
(CRAGG; NEWMAN., 1997).
Várias moléculas derivadas de produtos naturais, seus derivados semi-sintéticos
ou seus modelos moleculares sintetizados são empregados atualmente com
sucesso no tratamento do câncer. Dentre eles os alcalóides vincristina e vimblastina
isolados de Catharantus roseus, destacam-se como dois dos mais importantes
agentes quimioterapêuticos (VIEIRA; BRAZ-FILHO, 2005) seguidos pelos produtos
semissintéticos etoposídeo e teniposídeo, obtidos de epipodofilotoxina derivados das
lignanas isolada de espécies Podophyllum peltatum e P. emodi, respectivamente, o
irinotecano etopotecano de Camptotheca acuminata os terpenóides taxol, paclitaxel
e docetaxel de Taxus brevifolia (CHOI et al., 2008).
Considerando estes aspectos, a busca de novos agentes farmacologicamente
ativos através de triagem de moléculas de fontes naturais, levou a descoberta e ao
desenvolvimento de muitos fármacos utilizados clinicamente e que desempenham
um importante papel no tratamento de várias doenças, especialmente a terapia de
doenças infecciosas e do câncer, estima-se que mais de 75 e 60% respectivamente
dos fármacos utilizados atualmente são derivados de fontes naturais (GRAGG;
NEWMAN, 2005).
13
Produtos naturais e seus derivados têm sido importantes historicamente como
fonte de agentes terapêuticos. No entanto, na última década as pesquisas com
produtos naturais na indústria farmacêutica têm diminuído. Com isto, novas
estratégias estão sendo utilizadas, despertando novamente o interesse pela
pesquisa em produtos naturais para a descoberta de novos medicamentos (KOEHN;
CARTER, 2005). Nos últimos anos, no entanto, a importância dos organismos
vegetais como fontes produtivas de substâncias anticancerígenas e outras
atividades biológicas reativaram interesses sociais e econômicos, superando
obstáculos na construção de cenário crescente, estimulando, inclusive, a percepção
das lideranças industriais empenhadas na fabricação de produtos sintéticos (BRAZFILHO, 2010).
Efeitos biológicos como citotoxicidade, ação antinflamatória e antimicrobiana da
planta V. scorpioides têm motivado o estudo de seu potencial para uso terapêutico,
uma vez que sua interação com as células poderia reduzir a proliferação de células
tumorais, e também induzir a resposta imunológica aumentando o número de
neutrófilos na área tumoral, possibilitando, assim um melhor prognóstico, quando
comparado a tratamentos quimioterápicos tradicionais (DALAZEN et al., 2005;
BUSKUHL et al., 2009; HOWARD et al., 2003; PAGNO, 2004; WILLIAMS et al.,
2005).
No gênero V. scorpioides são encontradas lactonas sesquiterpênicas (WARNING
et al., 1987), formando um dos maiores grupos com atividade antitumoral e citotóxica
já obtido de plantas (PICMAN, 1986; LEE et al., 1971). Assim, vem se
desenvolvendo muitos estudos para identificar qual ou quais frações estão
envolvidas nestas ações. A partir da fração diclorometano obtida pelo fracionamento
do extrato hidroalcoólico de flores e folhas de V. scorpioides, foi isolado um
poliacetileno, que apresentou atividade citotóxica e genotóxica frente a linhagens
tumorais, demonstrando considerável morte celular por via apoptótica (BUSKUHL et
al., 2009).
Visando a necessidade de se encontrar novos agentes antineoplásicos, têm-se
procurado identificar compostos isolados de plantas com propriedade citotóxica. Em
paralelo tem-se o desafio de encontrar sobstâncias que induzam morte de células
neoplásicas, sem ocasionar elevada citotoxicidade em células não malignas.
14
Dentro desta perspectiva, é interessante ressaltar o mecanismo de ação dos
fármacos antitumorais que ocorram pelo processo apoptótico, focando nas células
alvo da doença e minimizando os efeitos colaterais devido à indução do processo de
morte celular por necrose ou até mesmo de apoptose em outras células e tecidos
(DUARTE, 2010).
Deste modo, o objetivo deste trabalho foi a ampliação dos estudos
farmacológicos elucidando as atividades biológicas do composto poliacetileno
através de modelos in vitro, avaliando a atividade citotóxica a fim de avaliar o
mecanismo de morte celular, e in vivo, procedendo com estudos iniciais que possam
evidenciar a ação antineoplásica desta molécula, podendo ser um potencial fármaco
utilizado terapeuticamente.
15
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral:
Avaliar a atividade antitumoral do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)ona isolado das partes aéreas de Vernonia scorpioides, através de ensaios in vitro e
in vivo.
2.2 Objetivos Específicos:
- Analisar a citotoxicidade do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona sobre
células de linhagem de melanoma murino B16F10, células mononucleares humanas
(CMHN), as linhagens tumorais PC3, LNCAP, H1299, OVCAR, NCI, T84, MCF-7,
U138MG, VW473, HELA, HOS e MG63 e leucêmicas K562, KG1, HL60, NB4,
RAMOS, RAJI, RS4, JURKAT, MOLT4, NALM6, B15 e U937.
- Em células de linhagem de melanoma murino B16F10 observar o padrão de morte
induzido pelo poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona por microscopia de
fluorescência utilizando os corantes brometo de etídeo, diacetato de fluoresceína e
alaranjado de acridina em células de linhagem melanoma murino B16F10.
- Analisar a participação da enzima Caspase 3 no processo de morte celular
induzida
pelo
poliacetileno
5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona,
através
da
quantificação colorimétrica, em células de linhagem de melanoma murino B16F10.
- Avaliar a atividade antitumoral do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona
em camundongos C57BL-6 usando o tumor sólido induzido pela injeção subcutânea
de células B16F10 como modelo.
16
- Observar o efeito do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona sobre a
metástase pulmonar induzida pela injeção intravenosa de células B16F10 em
camundongos.
- Avaliar o efeito do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona
sobre a
toxicidade agudaem diferentes órgãos de camundongos C57BL-6, através de
análise histológica.
- Avaliar o efeito do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona sobre a
nocicepção mecânica induzida pelo melanoma metastático em camundongos
C57BL-6.
- Avaliar o efeito do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona sobre a atividade
locomotora dos animais submetidos aos modelos de melanoma sólido e metastático,
induzido pela inoculação de células B16F10.
17
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Câncer
Conhecido há muitos séculos, o câncer foi amplamente considerado como
uma doença dos países desenvolvidos. Há aproximadamente quatro décadas esta
situação vem mudando. A incidência global do câncer pode ser observada em
países em desenvolvimento, principalmente aqueles com poucos e moderados
recursos. Assim, nas últimas décadas, o câncer ganhou maior dimensão,
convertendo-se em evidente problema de saúde pública mundial (INCA, 2012).
O câncer é uma doença complexa envolvendo anormalidade em muitos
genes, levando a alterações na expressão ou funções de genes da homeostasia
celular. Acarretando em mudanças metabólicas e comportamentais, podendo
converter uma célula normal em uma célula transformada, levando a proliferação
descontrolada e anormal. O padrão de combinação dos vários genes mutados pode
revelar as relações funcionais entre genes e cascatas de sinalização que levam à
tumorigênese, além de identificar possíveis alvos terapêuticos (YEANG et al, 2008).
Estas mudanças surgem devido à alterações genéticas alterando a
proliferação celular, influenciando no relacionamento destas células com as células
vizinhas. Em muitos aspectos, as células cancerosas possuem uma organização
independente de sobrevivência não seguindo as regras de um ciclo celular normal.
Com isto, estas células se adaptam, lutando contra o sistema de defesa do
organismo, adotando então um comportamento agressivo e invasivo, resultando na
formação de uma massa cancerosa (DE VITA; HELLMANN; ROSENBERG, 2005;
WHO, 2008).
A maioria destas alterações pode ocorrer impulsionada por duas classes de
genes, os proto-oncogenes e os genes supressores de tumor. A alteração em um ou
mais destes grupos cooperam na indução da condição neoplásica. Os protooncogenes são importantes para o controle do crescimento, divisão celular e
sobrevivência, já os genes supressores de tumor atuam no atraso do ciclo celular,
inibindo a proliferação celular, e ativando o processo de morte celular (apoptose)
(HARRINGTON, 2011).
Assim, para compreender os mecanismos moleculares da metástase do
câncer, é indispensável identificar os genes que sofrem alterações acumulando-se
18
durante a progressão do câncer, bem como os genes cuja expressão é responsável
pela aquisição do potencial metastático em células neoplásicas (YOKOTA, 2000).
A Organização Mundial da Saúde (OMS) estimou que, no ano 2030, podemse esperar 27 milhões de casos incidentes de câncer, 17 milhões de mortes por
câncer e 75 milhões de pessoas vivas, anualmente, com câncer.
Segundo as estatísticas mundiais, é previsto a ocorrência de 12,4 milhões de
casos novos e 7,6 milhões de óbitos por câncer no mundo. Os cânceres mais
incidentes são o de pulmão, (1,52 milhões de casos novos), o de mama (1,29
milhões) seguido pelo de cólon de reto (1,15 milhões) e pelo câncer de estômago
com 870 mil casos novos (WHO, 2008).
Considerada a segunda maior causa de morte por doença no Brasil, segundo
o Instituto Nacional do Câncer (INCA), é ainda considerado um grande desafio para
a ciência e medicina, pois para muitos tipos de tumores ainda não se tem cura, e os
tratamentos convencionais apresentam consideráveis efeitos colaterais.
No Brasil, as estimativas para o biênio 2012-2013 apontam a ocorrência de
aproximadamente 518.510 casos novos de câncer, incluindo os de pele não
melanoma, reforçando a magnitude do problema do câncer no país. O estudo das
diversas etapas que estão envolvidas na progressão tumoral pode ser feito
utilizando modelos murinos de tumores de pele pois apresentam boa similaridade
com a neoplasia humana (VAN DYKE; JACKS, 2002).
O modelo de linhagem celular tumoral escolhido para ser estudado nesta
dissertação, avaliando a citotoxicidade e/ou atividade antitumoral, foi o de melanoma
murino B16F10, uma linhagem que se desenvolve in vitro e é altamente
tumorigênica in vivo, pois cresce espontaneamente em camundongos C57BL/6 e
com habilidade de formar metástases (ZHAO et al., 2001; NAKAMURA et al., 2002).
3.2 A carcinogênese
Há cerca de 3000 anos a.C, a primeira descrição registrada de câncer é
encontrada em um papiro egípcio. Hipócrates é considerado o criador da palavra
câncer, pois a forma dos tumores trouxe-lhe a lembrança de caranguejos. Assim, ele
usou as palavras carcinos, carcinoma e câncer, que se referem aos caranguejos em
grego, para descrever os tumores (COOPER; HAUSMAN,2007).
19
Eventualmente, algumas células podem sofrer transformações em genes
relacionados com funções biológicas e controles em relação à morfologia,
metabolismo, diferenciação e proliferação. Estes processos dependem de
complexas vias bioquímicas sinalizadoras, resultando em comportamentos anormais
em relação ao tecido em que se encontram como morfologia incompatível,
metabolismo
acelerado
e
proliferação
indiscriminada.
Além
da
perda
de
funcionalidade, essas células aberrantes acabam por se sobrepor as células normais
na disputa tanto por espaço como nutrientes (ALBERTS et al., 2008).
A
formação
e
o
desenvolvimento
das neoplasias,
denominado
de
carcinogênese, é um processo complexo, dividido em três etapas: iniciação,
promoção e progressão. O primeiro estágio, a iniciação, é quando acontece a
desregulação genômica, devido a um agente cancerígeno, provocando modificações
em alguns genes, transformando a célula. O estágio de promoção acontece por uma
série de interações entre citocinas, fatores de crescimento e seus receptores,
consistindo na proliferação, ou expansão das células iniciadas. A etapa de
progressão tumoral é considerada irreversível, onde ocorrem inúmeras modificações
biológicas, ou seja, caracterizada pela alta instabilidade genômica, tornando o
câncer cada vez mais agressivo (KUMMAR,2005).
Depois de anos de rápidos avanços na pesquisa do câncer foi gerado um rico
e complexo campo de conhecimento, revelando o câncer com uma doença envolvida
em dinâmicas mudanças genômicas (HANAHAN;WEINBERG, 2000; HARRINGTON,
2011). Na recente revisão apresentada por Hanahan e Weilberg, delineou-se e
ampliou-se o conhecimento com duas características cruciais a instabilidade
genômica e a inflamação, permitindo assim, a aquisição das oito habilidades
fisiológicas que caracterizam uma célula tumoral. Quando ocorre instabilidade
genômica as células cancerosas perdem o controle da integridade de seu material
genético
assim
facilitando
a
acorrência
de
inúmeras
alterações
que
progressivamente promovem o surgimento do câncer. A segunda característica, a
inflamação descreve um situação comum em que as lesões pré-malignas e lesões
malignas promovem
um estado inflamatório, recrutando e ativando mediadores
químicos que apoiam o crescimento e disseminação do tumor.
Essas habilidades se aplicam à grande maioria, se não, a todos os tipos de
câncer, variando apenas a ordem destes eventos e os mecanismos pelos quais elas
podem se estabelecer. As habilidades das células cancerosas são: a perda da
20
inibição por contato; independência com relação aos fatores de crescimento;
imortalidade, desvio no controle da apoptose, capacidade de promover a
angiogênese, capacidade de invasão tecidual e metástase, reprogramação do
metabolismo energético e a capacidade de fuga da destruição imune.Como
características gerais têm-se que a célula guarda um certo grau de diferenciação
característico do tecido original (HANAHAN; WEINBERG, 2011).
3.2.1 Metástases
A metástase é considerado um processo complexo, responsável por 90% da
mortalidade relacionada ao câncer. Além de fatores ambientais e genéticos, as
interações físicas de células cancerosas com o seu microambiente, bem como sua
modulação por forças mecânicas, são fundamentais na determinação deste
processo (WIRTZ et al., 2011).
Metástase é a propagação de células neoplásicas para áreas não diretamente
adjacentes ao tecido primário. O espalhamento pode ocorrer por invasão de vasos
sanguíneos ou linfáticos, por penetração das células tumorais no interior da
cavidade corpórea ou espaços que circundam órgãos. Quando estas células se
desprendem do tumor primário, elas podem invadir o hospedeiro e penetrar em
vasos sangüíneos e linfáticos. Para tanto, estas células necessitam se infiltrar na
membrana basal que circunda os vasos sangüíneos (Figura 1). Em casos eventuais,
essas células podem deixar as veias, ficando protegidas de ataques tecidoespecífico (CRAIG & LOBERG, 2006; RUFFINI et al, 2007).
As células que completam todos os passos de proliferação metastática
invadem outros tecidos. A visão emergente para o papel de processos físicos e
mecânicos na metástase deve contribuir para o desenvolvimento de novas
abordagens para o câncer, diagnóstico e novos alvos terapêuticos (WELCH et al.,
2008;STAFFORD et al, 2008; WIRTZ et al., 2011).
O melanoma metastático é uma doença devastadora, as opções de
tratamento são limitadas. Uma gama de medicamentos citotóxicos têm sido
avaliados e utilizados na clínica terapêutica como agentes únicos no tratamento de
melanoma, apresentando poucas respostas terapêuticas (KIRKWOOD et al., 2005).
21
Em 2011, era esperado que o melanoma cutâneo afeta-se aproximadamente
70.000 pacientes, e cerca de 8.800 pacientes morreriam da doença. Devido à
dificuldade de prever um prognóstico individual para um paciente diagnosticado com
melanoma, porque o prognóstico varia amplamente entre ambose dentro de estádios
da doença. Particularmente para pacientes com melanoma que invadiram linfonodos
(CALLENDER et al., 2012).
Embora ocorra a detecção precoce, cirurgia adequada e, em alguns casos, a
terapia adjuvante, pelo menos, um terço dos pacientes com melanoma em fase
inicial irá desenvolver metástases. Estes pacientes têm uma sobrevida média de
aproximadamente 6 a 8 meses e < 5% geralmente sobrevivem 5 anos ou mais
(BALCH et al., 1997).
3.2.2 Tumor sólido e resistência a fármacos antitumorais
Tumores sólidos são organizados como estruturas que são heterogêneas e
complexas. Eles compreendem as células cancerosas e células do estroma (
fibroblastos e células inflamatórias) que são incorporados em uma matriz
extracelular e alimentados por uma rede vascular Cada um destes componentes
pode variar de um local para outro no mesmo ambiente tumoral (TRÉDAN et al.,
2007).
A maioria dos tumores apresenta vascularização irregular e limitada fazendo
com que existam células muito distantes de qualquer capilar, estando, em privação
de nutrientes e em hipóxia crônica.Tal situação pode levar à necrose das células,
porém, a maioria das células hipóxicas são ainda viáveis. Com a morte das células
localizadas próximas aos vasos, ou seja, aquelas que estão em maior contato com o
quimioterápico, o aporte de nutrientes e oxigênio às células hipóxicas melhoram
consideravelmente, permitindo assim que estas células sobrevivam e contribuam
para a proliferação tumoral (TRÉDAN et al., 2007).
Para a
penetração de fármacos anticancerígenos em células distantes é
necessário um sistema vascular para a eficácia da quimioterapia contra tumores
sólidos. Entretanto, muitos tumores sólidos têm um sistema sanguíneo vascular mal
formado com taxas variáveis de fluxo sanguíneo e distâncias muito maiores do que
as que são
encontradas em tecidos normais. A exigência de fármacos que
22
possuem a capacidade de penetrar em várias camadas de tecido pode representar
uma barreira para o tratamento eficaz de tumores sólidos (TUNGGAL et al., 1999).
A resistência de tumores sólidos à fármacos anticâncer é frequentemente
atribuída a mutações genéticas, amplificação gênica, ou mudanças epigenéticas que
influenciam na absorção, metabolismo ou exportação de drogas a partir de células
individuais. Outra importante causa de resistência a fármacos anti-cancerígenos é a
capacidade limitada destes em penetrar o tecido do tumor e alcançar todas as
células tumorais em uma concentração potencialmente letal (TRÉDAN et al., 2007).
Alterações
no
microambiente
tumoral
vêm
sendo
apontadas
como
importantes causas de resistência às drogas. Considerando a heterogeneidade
dentro do microambiente tumoral que leva a gradientes marcados na taxa de
proliferação celular bem como para regiões de hipoxia e acidez, é importante
relacionar tais fatores influenciando na sensibilidade das células tumorais para o
tratamento químico (TRÉDAN et al., 2007).
Em face da necessidade de se encontrar novos fármacos, tem se procurado
identificar compostos isolados de plantas capazes de reduzir a proliferação celular,
tendo como desafio encontrar compostos que induzam a morte de células malignas
driblando as células do microambiente tumoral, sem contudo, ocasionar elevada
citotoxicidade em células não neoplásicas, representando uma importante direção
para a terapia do câncer.
3.3 Câncer da pele
Há milhares de anos atrás (460 375 a.c) nas escrituras de Hipócrates já havia
manuscrito referente ao melanoma. No entanto, o termo "melanoma" só foi
empregado em 1838 por Robert Carswell, que o descreveu como lesões malignas
pigmentadas da pele (WAINSTEIN; BELFORT, 2004).
Os cânceres de pele são classificados em tumores de pele não melanoma e
melanomas. Dentre os não melanomas, estão o carcinoma basocelular e o
epidermoide. O melanoma cutâneo origina-se nos melanócitos e tem predominância
em adultos brancos. Mesmo representando menos do que 5% dos tipos de câncer
de pele, o melanoma cutâneo é o mais grave, devido a seu alto poder metastático
(PARK et al., 2010; HOON et al., 2012).
23
A sua incidência vem aumentando, significativamente, em todo o mundo, mais
rapidamente do que qualquer outro tipo de neoplasia maligna. A Organização
Mundial de Saúde estima que, anualmente, ocorram em torno de 132 mil casos
novos de melanoma no mundo (LENS et al., 2004).
O melanoma da pele acomete principalmente os caucasianos que moram em
países com alta intensidade de radiação ultravioleta. No entanto, esse tipo de câncer
afeta todos os grupos étnicos em alguma proporção. A prevenção do câncer de pele,
inclusive os melanomas, inclui ações de prevenção primária, por meio de proteção
contra luz solar, que são efetivas e de baixo custo. O auto-exame também contribui
para o diagnóstico precoce. Ao surgimento de manchas/sinais novos ou mudança
em alguns, o indivíduo deve procurar o dermatologista. A educação em saúde, tanto
para profissionais quanto para a população em geral, no sentido de alertar para a
possibilidade de desenvolvimento de câncer de pele e de possibilitar o
reconhecimento de alterações precoces sugestivas de malignidade, é outra
estratégia internacionalmente aceita (MAHON, 2003; INCA 2012).
Sua letalidade é elevada, porém sua incidência é baixa. As maiores taxas
estimadas em homens e mulheres encontram-se na região Sul. Apresenta altos
percentuais de cura se for detectado precocemente, em alguns casos em que há
demora no diagnóstico, esse câncer pode levar a ulcerações e deformidades físicas
graves ou metástases (PARK et al., 2010; INCA, 2012).
Os melanomas são tumores malignos decorrentes da transformação e
proliferação de melanócitos, células produtoras de melanina que normalmente
residem
na
membrana
basal
da
epiderme.
Os
melanócitos
são
células
especializadas em pigmentação, que podem ser vistos em qualquer área da pele
bem como região dos olhos, sistema nervoso central, respiratório, gastrointestinal e
trato genitourinário, originam-se na crista neural progenitora de alta mobilidade e
migram para a pele durante o desenvolvimento embrionário. Na pele, estão
localizados na membrana basal da epiderme e nos folículos capilares, e sua
homeostase é regulada por queratinócitos epidérmicos (DE VITA; HELLMANN;
ROSENBERG, 2005).
Acredita-se que cerca de 30 a 50% dos melanomas possam surgir a partir de
nevo pré-existentes. Quando surge uma lesão denominada de nevo atípico, é
possível a geração de uma malignidade derivada da crista neural, que é o
melanoma, assumindo um crescimento radial ou superficial não invasivo.
Pode
24
tornar-se invasivo devido a alterações genética bem como angiogênico e
metastático, iniciando a ocorrência de metástases e invasão de células neoplásicas
em tecidos distantes e possível morte (GOVINDARAJAN et al., 2007).
As células de melanoma são caracterizadas pelo relativo crescimento
autônomo. Um mecanismo autócrino de estimulação de crescimento tem sido
sugerido, envolvendo a secreção de peptídeos endógenos de fatores de crescimento
(REED et al., 1985; HERLYN et al., 1992).
A pele é a principal barreira contra as agressões do ambiente externo, os
melanócitos propiciam fotoprotecção e termorregulação por produzir um pigmento
denomindado melanina. O grau de produção de pigmentos se manifesta como
'fototipo' de pele (cor de pele e facilidade de bronzeamento) é o indicador mais útil
de risco de câncer de pele na população em geral (LIN e FISHER, 2007).
O crescimento ou alteração da forma deste tumor é progressivo. No estágio
inicial do tumor, o melanoma encontra-se confinado na epiderme, fase esta
denominada crescimento radial ou lateral. Na fase seguinte, o melanoma progride,
invadindo a epiderme podendo atingir ou não a derme superior. Na fase de
crescimento vertical, o melanoma é caracterizado pelo seu crescimento acelerado
através da espessura da pele, formando nódulos visíveis e palpáveis capazes de
sofrerem metástase (BANDARCHI et al., 2010).
Os principais fatores de risco são: (1) exposição excessiva aos raios
ultravioleta (UV), (2) o aumento do número de nevo congênito (pinta escura), (3)
xeroderma pigmentoso ou nevo displásico, (4) indivíduos de pele clara, (5) história
prévia de câncer de pele, (6) história familiar de melanoma, (7) irritações crônicas, e
(8) exposição a fatores químicos. A radiação ultravioleta ocasiona mudanças
genéticas na pele, prejudicando a funcão do sistema imune cutâneo, aumentando a
produção dos fatores de crescimento, bem como induzindo a formação de espécies
reativas de oxigênio afetando assim os queratinócitos e melanócitos (MILLER e
MIHM, 2006).
3.3.1 Tratamento do melanoma
Os estudos para o tratamento do melanoma iniciaram há cerca de 150 anos,
sendo um desafio, considerando que sua evolução está intimamente relacionada
com os avanços da biologia e sua história natural (WAINSTEIN; BELFORT, 2004).
25
Quando o melanoma é detectado precocemente o tratamento mais indicado é
a cirurgia com boas taxas de cura. Quando os pacientes não apresentam lesões
ulcerativas confinadas na pele, a cirurgia torna-se eficaz, porém no estágio
disseminado do melanoma o procedimento cirúrgico é ineficaz (KLUGER et al.,
2009).
Terapias adjuvantes têm sucesso limitado no tratamento de estágios
avançados de melanoma. Na quimioimunoterapia ou bioquimioterapia o primeiro
adjuvante utilizado é o IFN-α, mostrando significativa sobrevivência em pacientes de
alto risco (MOCELLIN et al., 2010). A IL-2 é outro adjuvante imunoterápico utilizado,
porém, foi demonstrado que é necessário o uso de altas doses de IL- 2 para induzir
a remissão de 6% dos casos de melanoma metastático (AGARWALA, 2003). A
radioterapia também é limitada em sua eficácia devido a
radioresistência do
melanoma quando comparado com outros canceres. A resposta deste tipo de terapia
é dose dependente, portanto, devido às altas doses de radiação necessárias para a
redução do tumor, a radioterapia é menos utilizada em decorrência do alto índice de
efeitos adversos (TESTORI et al., 2009).
Alguns agentes como os anticorpos monoclonais tem sido desenvolvidos
como adjuvantes da quimioterapia. Como o Ipilimumab, aprovado em 2011 para o
tratamento do melanoma em estágio avançado, o mecanismo de ação do ipilimumab
é indireto, pela potenciação da resposta imunitária mediada pelas células T,
resultando na ativação das células T, proliferação e infiltração dos linfócitos nos
tumores. Outro anticorpo monoclonal que apresentou resultados significantes é o
Bevacizumab, que age bloqueando a ação da VEGF( fator de crescimento endotelial
vascular), ou seja, impede a angiogênese (THIRLWELL et al., 2008). Quando há
ocorrência de metástases, o melanoma é incurável na maioria dos casos, portanto, a
estratégia de tratamento para a doença avançada deve ter como objetivo aliviar os
sintomas e melhorar a qualidade de vida do paciente (INCA, 2012).
Quando o melanoma é comparado a outros canceres ele apresenta uma das
piores taxas de resposta a quimioterapia. Poucos agentes demonstraram atividade
antitumoral significativa contra o melanoma metastático. Um grande número de
ensaios clínicos tem testado diferentes fármacos como agentes alquilantes
(Dacarbazina), alcalóides da vinca (Vincristina), taxanos (Paclitaxel), análagos da
platina (Cisplatina), nitrossouréias (Fotemustina), inibidores da topoisomerase e
26
antraciclinas, mas poucos têm mostrado uma taxa de resposta significativa (<20%)
ou um aumento nas taxas de sobrevida (ATKINS, 1997; GOGAS et al., 2007).
A eficácia da quimioterapia sozinha é menor que 10% onde o agente
quimioterápico mais eficaz é a Dacarbazina com aproximadamente 14% a 20% a
taxa de resposta e uma média de duração de quatro a seis meses. A Dacarbazina foi
aprovada em 1975 como o único agente quimioterápico para o tratamento de
melanoma metastático. Ela é mais eficaz em tumores subcutâneos, linfonodos e
metástases pulmonares. (HUNCHAREK et al., 2001; KLUGER et al., 2009).
A Dacarbazina é um pró-fármaco que, para que seu efeito antineoplásico
ocorra, ela precisa ser metabolizada por enzimas hepáticas, formando um
intermediário que decompoem-se imediatamente no derivado ativo, que metila o
DNA das células, impedindo-as de se replicar corretamente, ocasionando a
fragmentação do DNA e a morte celular (COLVIN, 2001).
3.3.2 Dor no câncer e melanoma
A dor é classificada como aguda e crônica e na definição da fisiopatologia, a
dor pode ser denominada de acordo com o tipo da lesão e/ou dos mediadores
envolvidos em “nociceptiva”, “neurogênica” e “psicogênica”, a qual está associada,
respectivamente, com estimulação excessiva dos nociceptores, com lesão ao tecido
neural, com disfunção do nervo ou com fatores psicológicos.
Além disso, podem ocorrer manifestações dolorosas decorrentes de algumas
alterações sensoriais comumente apresentadas em pacientes que a experimentam
como a hiperalgesia (sensibilidade exacerbada a um estímulo doloroso), alodínia
(sensibilidade anormal dos neurônios sensoriais) e hiperestesia (sensibilidade
anormal a um estímulo sensorial) (SERPELL et al., 1998; MILLAN, 1999; LOESER E
TREEDE., 2008). Em humanos pouco se sabe da distinção entre hiperalgesia e
alodínia, pois apesar do interesse clinico poucos estudos revelam as bases
moleculares para esta distinção (VERRI et al., 2005, SANTODOMINGO-GAZON.,
2006).
Expondo a pele ou mesmo qualquer outro órgão a diferentes estímulos, como
químicos, térmicos ou mecânicos, que induzem a uma sensação desagradável,
proporcionam ao indivíduo uma resposta de ativação, repassando assim a
informação sobre um perigo real ou potencial para sua integridade física. Este
27
mecanismo de resposta pode ser diferenciado como dor fisiológica ou dor
patológica; onde a dor fisiológica é aquela que vai induzir um reflexo, caracterizando
a dor conhecida como aguda causada pela ativação intensa, potencial ou efetiva dos
nociceptores (COSTIGAN et al., 2009), e a dor patológica, a qual está relacionada
com respostas adaptativas específicas, geradas por estímulos intensos na superfície
da pele, caracterizando a dor crônica (ALMEIDA et al., 2006).
A dor sentida por um paciente com câncer pode ser proveniente de diversos
fatores sendo que de 5 a 20% esta relacionada ao tratamento antitumoral como no
pós-operatório, pós-quimioterapia e pós-radioterapia. Muitos pacientes com câncer
avançado sofrem de mais de um tipo de dor e o tratamento adequado vai depender
da identificação de sua origem.
Muitos agentes farmacológicos são utilizados para alívio da dor nestes
pacientes como antiálgicos, opióides, antidepressivos entre outros, porém a
preocupação com o uso terapêutico destes é com seus efeitos adversos que são
inúmeros podendo causar dependência, depressão respiratória e até levar a óbito,
frente a tal situação cresce o interesse de descobertas de novas moléculas para fins
terapêuticos com atividade tanto antitumoral como analgésica (BRASIL, 2001).
3.4 Câncer e o processo de morte celular
Há mais de 30 anos atrás, Kerr, Wyllei e Durrie (1972), já diziam que a
apoptose através de suas características morfológicas sugeria ser um fenômeno já
programado. Podendo ser iniciada ou inibida por uma variedade de
estímulos
ambientais, fisiológicos e patológicos. Com características morfológicas distintas
como a condensação nuclear e citoplasmática e fracionamento da célula, fragmentos
ultraestruturalmente bem preservados. No segundo momento, os referidos corpos
apoptóticos, onde se submetem a uma série de mudanças
são rapidamente
degradados por enzimas lisossomais. O envolvimento da apoptose em tecidos
normais
é responsável pela eliminação
de células durante o desenvolvimento
embrionário normal. Ocorre espontaneamente em neoplasias malignas não tratadas,
e participa pelo menos em alguns tipos de regressão do tumor terapeuticamente
induzido. Estando envolvida na involução fisiológica e atrofia de vários tecidos e
órgãos.
28
A morte celular programada, ou apoptose, é considerada crítica para a
autodestruição
celular,
para
uma
variedade
de
processos,
tais
como
o
desenvolvimento ou a prevenção da transformação oncogênica. A apoptose deve
ser rigorosamente controlada, pois seu mecanismo desregulado pode levar ao
desenvolvimento de um grande número de diferentes patologias. Porém, as células
desenvolveram um grande número de processos celulares que servem para impedir
o processo de morte celular programado inadequado ou prematuro. Estas
estratégias consideradas de sobrevivência celular, envolvem uma complexa rede
fisiológica, coordenada e sistemática, bem como mudanças genéticas que servem
para impedir a morte celular (GREENWOOD et al., 2011).
No processo apoptótico ocorre uma seqüência de eventos morfológicos e
atuação de um programa interno bioquímico de suicídio. Pode ser considerado um
mecanismo de autodefesa destruindo células infectadas com patógenos ou aquelas
que sofreram mutações. Neste caso, uma cascata de componentes celulares detecta
e destrói estas células ativando a via apoptótica prevenindo o desenvolvimento do
câncer (ROBBINS, COTRAN, 2008; FANELLI, et al., 2012).
Desde 2002 com o prêmio Nobel recebido por Sulston, Brenner e Horvitz
pelos estudos realizados sobre a morte celular programada, ou seja, que alterações
de vias apoptóticas são uma característica comum entre os tumores, permitindo que
as células cancerosas sobrevivam a intervenções quimioterapêuticas, o interesse
pelos mecanismos da apoptose como alvo para a terapia do câncer vem crescendo
(BARBOUR, 2002; RUFINI; MELINO, 2011).
Dividindo a apoptose em três fases, tem-se a fase de iniciação, a efetora e a
de degradação. A fase de iniciação é caracterizada por depender do tipo de estímulo
apoptótico recebido pela célula via intrínseca ou pela via extrínsica. A primeira fase
influencia a eficácia das fases subsequentes (efetora e de degradação). Na fase
efetora, ocorre a ativação da cascata de caspases, constituída da ativação de
proteases, nucleases, e de outros intermediários que participam dessa fase. E na
fase de degradação, a célula adquire as características bioquímicas e morfológicas
características desse processo (GREEN & KROEMER, 1998).
A morfologia de células apoptóticas é reconhecida por alterações no
citoesqueleto que induzem contração celular, agregação da cromatina levando a
aparência de núcleos picnóticos, fragmentação nuclear, formação de vesículas sem
perda de integridade da membrana e sem resposta inflamatória. O evento na
29
apoptose que define seu mecanismo é a ativação de cascatas de enzimas
proteolíticas denominadas caspases, as quais são responsáveis pela iniciação,
execução e regulação do processo apoptótico. Envolvidas num mecanismo de
clivagem específica de proteínas as caspases levam ao colapso da infra-estrutura
celular através da desintegração do citoesqueleto, desarranjo metabólico e
fragmentação genômica. Essas enzimas ativadas, por sua vez, ativam nucleases
como as CADs (DNAases ativadas por caspase) que degradam o DNA e outras
enzimas importantes de morte celular. Seus principais alvos são as proteínas
estruturais e de funções essenciais como proteínas requeridas no reparo do DNA
(DNA-PK, PARP), proteínas reguladoras do ciclo celular (Cdc27, Rb), proteínas
envolvidas em patologias humanas e proteínas diretamente envolvidas na regulação
da apoptose (ICAD, Bid), assim como reguladoras/mediadoras da sinalização
apoptótica (PKB/Akt, RIP quinase (kÖHLER et al., 2002, GHOBRIAL et al., 2005).
Duas vias distintas atuam na ativação das caspases, a via mitocondrial e a via
receptor de morte, denominadas de intrínseca e extrínseca, respectivamente
(CROCE, 2008).
A via extrínseca da apoptose (Figura 1) é iniciada após a ligação extracelular
de receptores localizados na superfície celular, denominados DR “death receptors”
com seus ligantes específicos, como o membro da superfamília do Fator de Necrose
Tumoral (TNF), que se acoplam a um receptor da família dos receptores de morte
correspondente (FAsL, FAS/CD95, TRAIL) induzindo, assim a sua oligomerização
(KUMAR, 2007), que resulta na formação do complexo intracelular de indução de
morte denominado DISC, que é o complexo sinalizador de morte celular, o qual é
formado pela interação entre a parte citoplasmática dos receptores com inúmeras
moléculas adaptadoras como FADD/MORT1 ( Proteína derivada da morte associada
a Fas) por exemplo. Está interação entre os receptores e moléculas adaptadoras
acontece através de domínios de interação proteína-proteína denominados domínios
de morte (DD) presentes em ambas as moléculas (FULDA, 2009).
Posteriormente, as caspases iniciadoras, como as caspases 8 ou 10, são
recrutadas onde interagem com moléculas adaptadoras. A interaçãos com proteínas
adaptadoras leva a oligomerização destas caspasaes, aumentando assim a
concentração local e favorecendo a autoclivagem e autoativação dessas caspases
iniciadoras. Sendo que, uma vez ativada a caspase 8 cliva e ativa a caspase 3,
30
induzindo diretamente a próxima fase do processo apoptótico a execução (FULDA,
2009).
A via mitocondrial ou intrínseca (Figura 1) inicia-se pela ação de diversos
sinais como danos no material genético, defeitos nos pontos de checagem do ciclo
celular, mitose catastrófica, hipóxia, ausência de fatores de crescimento, agentes
quimioterápicos, radiação, drogas citotóxicas e outros tipos severos de estresse
intracelulares. Envolvendo a ativação e extravasamento de proteínas próapoptóticas para o citoplasma e ativação das caspases. Como Bax e Bad, que agem
na mitocôndria, afetando sua permeabilidade seletiva através da formação de poros
por onde extravasam fatores apoptogênicos como citocromo c.
Alguns estudos indicam que durante o processo apoptótico ocorre a formação
de um megaporo contendo proteínas, através deste ocorre a liberação do citocromo
c no citosol, em presença de dATP, induzindo a formação dos apoptossomos. O
apoptossomo consiste num heptâmero de moléculas adaptadoras APAF-1 (fator
ativador de protease apoptótica), que promove a clivagem da pró-caspase 9,
liberando a caspase 9 ativa. Esta caspase atua sequencialmente no processamento
e ativação das caspases efetoras 3 e 7 e iniciando a execução da apoptose
similarmente à caspase 8. O complexo apoptossômico provavelmente serve como
um regulador alostérico da caspase 9 que, em situações onde não haja estímulo
apoptótico, encontra-se livre no citosol na forma de monômeros inativos. A
integração da caspase 9 ao apoptossomo induz sua dimerização e ativação
(CROCE, 2008).
Abaixo desenho esquemático das duas vias (Figura 1).
31
Figura 1. Apoptose mediada pela via intrínseca (mitocondrial) e pela via extrínseca (receptores de
morte).
Fonte: Adaptado de Fulda et al., 2009.
As vias intrínseca e extrínseca podem agir em conjunto nas fases de indução
e execução do processo apoptótico, cooperando na recepção do sinal de morte e na
amplificação da ativação de caspases. Com isso, a ativação de receptores de morte
pode levar à ativação da via mitocondrial através da clivagem da proteína próapoptótica Bid pela caspase 8. A Bid (tBid) transloca-se para a mitocôndria onde
ativa Bak e Bax, induzindo a oligomerização dessas moléculas e a formação de
poros por onde extravasam o citocromo c e demais fatores apoptogênicos
mitocondriais levando à ativação de caspases efetoras (FULDA, 2009).
A maioria dos tecidos sofre um constante processo de renovação celular
graças ao equilíbrio entre a proliferação e morte das células, caracterizada por um
processo ativo de alterações morfológicas e bioquímicas, a apoptose. A
compreensão dos mecanismos e das alterações nos componentes das vias
apoptóticas e sua correlação com a ocorrência do câncer são importantes para o
desenvolvimento de novas terapias e métodos de prevenção do câncer (Grivicich et
al., 2007)
32
A necrose foi descrita em detalhes por Walker et al. (1988) e tem sido
considerada por anos como uma forma acidental e descontrolada de morte celular.
A necrose é morfologicamente identificada por um aumento na volume da célula
(oncose), expansão das organelas e plasma, ruptura da membrana seguido por
perda de conteúdo intracelular. Além disso, ela demonstra comprometimento
bioenergético, degradação aleatória do DNA e desencadeia a liberação de fatores
envolvidos na estimulação da resposta imune ou ativa o sistema de
reparo de
feridas e lesões (WALKER et al., 1988; ZONG et al., 2006). Todos estes eventos
resultam em perda de função homeostática. A necrose, diferentemente da apoptose,
impede a reposição celular e a regeneração de tecidos (PORTH, 2004).
A morte celular por necrose não é considerada a via desejada pelos
medicamentos antitumorais, por não ser um processo específico para as células
cancerígenas assim como, pela promoção de processo inflamatório intenso
(BURLACU et al., 2001). É considerada uma resposta passiva à lesão celular,
entretanto estudos recentes sugerem que a necrose também pode ser regulada
geneticamente (ZONG; THOMPSON, 2006).
A definição de apoptose considera que a eliminação da célula apoptótica é
realizada por lesão irreversível e, na sequência fagocitada. No entanto, outro
processo pode estar envolvido,
a necrose secundária, a qual é um processo
autolítico de desintegração celular com liberação de componentes celulares que
ocorre quando não existe intervenção de de células fagocitárias e todo o sistema
apoptótico é completado. Necrose secundária tem sido implicada na gênese de
importantes patologias humanas, é uma forma de eliminação de células e deve ser
considerada como o resultado natural de todo o programa de apoptose (SILVA,
2010).
Com isso, é de interesse ressaltar que inúmeros medicamentos que foram
desenvolvidos para o tratamento do câncer e doenças infecciosas são derivados de
plantas, a seguir será mencionado a importância das plantas medicinais na terapia
antitumoral.
33
3.5 Importância das plantas medicinais na terapia antitumoral
A natureza, de maneira pródiga, tem produzido a maioria das substâncias
orgânicas conhecidas. Dentre os diversos reinos da natureza, o reino vegetal é o
que tem contribuído de forma mais significativa para o fornecimento de metabólitos
secundários, muitos destes de extremo valor agregado devido às suas aplicações
como medicamentos, cosméticos, alimentos e agroquímicos (PHILLIPSON et al,
1998).
A medicina tradicional tem sido empregada por milhares de anos em todo o
mundo, tendo um papel essencial no cuidado a saúde. Desde os primórdios dos
tempos as plantas medicinais são fundamentais tanto para a alimentação quanto
para a cura de doenças. Para a população, o uso de plantas medicinais, muitas
vezes, é a opção disponível e a mais aceita (CECHINEL FILHO et al, 2003). A
Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que 80% dos habitantes mundiais se
beneficiam desta medicina (CECHINEL FILHO et al., 2007).
O Brasil possui grande diversidade vegetal e em muitos países a pesquisa
com plantas vem aumentando significativamente o interesse por fontes alternativas
de medicamentos. Dos 250 medicamentos considerados como básicos e essenciais
pela Organização Mundial da Saúde (OMS), 11% são obtidos de plantas medicinais.
Considerando que o Brasil possui uma flora invejável para o resto do mundo, em
termos de matéria prima para a produção de fitofármacos, e que apenas cerca de
8% foram estudadas, é de grande importância a busca e estudos dessas plantas,
impulsionando as pesquisas para a obtenção de novos fármacos mais eficazes e
específicos (BRAZ-FILHO, 2010; CECHINEL FILHO et al., 2003).
A necessidade do desenvolvimento de novos fármacos eficazes de ação
antitumoral e dotados de menores efeitos adversos comparada à quimioterapia e
radioterapia tradicionais tem impulsionado a comunidade científica a novas e
incessantes pesquisas nesta área. Além da diversidade de tumores que ainda não
possuem tratamento satisfatório, os quimioterápicos atuais provocam leucopenia,
deixando o paciente susceptível a infecções. Então, um possível tratamento que
condicione o estímulo do sistema imunológico auxiliaria na recuperação do paciente,
proporcionando um possível prognóstico mais favorável para a cura (HENTY et al.,
2001; NEVIN; VIJAYAMMAL, 2003; PAGNO, 2004).
34
Dentre os fármacos antineoplásicos derivados de plantas usados clinicamente
ressalta-se os alcalóides vimblastina (Velban®) e vincristina (Oncovin®), ambos
extraídos de Catharantus roseus, utilizados para o tratamento de linfomas e na
leucemia infantil (PASA et al., 2001; CRAGG; NEWMAN, 2007) (Figura 2). Entre os
alcalóides da vinca, a existência de pequenas diferenças na estrutura resulta em
notáveis diferenças na toxicidade e nos espectros antitumorais.
Estas moléculas têm a ação de inibir o fuso mitótico, ligando-se as proteínas
microtubulares assim, interrompendo a divisão celular (SUI et al., 2005). A
incapacidade de segregação correta dos cromossomos durante a mitose leva à
morte celular. Tanto as células normais quanto as malignas expostas à vincristina
sofrem alterações características do processo de apoptose (HAIT et al., 2007).
Figura 2. Estrutura química de alcalóides derivados de Catharantus roseus a (A) Vincristina e (B)
Vinblastina
A
B
OH
OH
N
N
H C
O
H3CO
N
CH3
N
H
OH
H3CO
N
O COCH3
H
CHO C OCH3
O
N
H C
H3CO
O
H3CO
CH3
N
H
OH
N
O COCH3
H
CH3 C OCH3
O
Fonte: BOLZANI et al., 2002.
O diterpeno taxol ou paclitaxel (Taxol®) é considerada uma das mais
promissoras descobertas para a cura do câncer. Isolado de Taxus brevifolia, é
empregado para o tratamento dos cânceres ovariano, mamário e pulmonar
(GANESAN, 2008). O mecanismo de ação desses medicamentos é único. Os
taxanos impedem a ocorrência da mitose pela interferência no funcionamento normal
dos microtúbulos (Figura 3). Eles agem como agentes estabilizadores da tubulina,
favorecendo a sua polimerização, porém inibindo a despolimerização dos
microtúbulos, levando à morte das células cancerosas (MALONGA et al., 2005).
35
Figura 3. Estrutura química do Paclitaxel (Taxol®)
H3C
O
O
OH
O
O
NH
O
OH
H
O
OH O
O
H
O
O
CH3
O
Fonte: BOLZANI et al., 2002;
Outro importante agente antineoplásico é a Camptotecina alcalóide extraído
da Campotheca acuminata Decne, que age inibindo a enzima topoisomerase I. É
utilizada para o tratamento de câncer ovariano e cervical (BUTLER, 2004). Devido à
sua alta toxicidade, a semisíntese da camptotecina deu origem ao derivado
irinotecano, que apresentou menos efeitos tóxicos. A partir desta última molécula,
obteve-se ainda o topotecano (Figura 4) (CHOI et al., 2008).
Figura 4. Estrutura química da Camptotecina, isolada de Camptotheca acuminata
O
N
N
O
HO
H3C
O
Fonte: BOLZANI et al., 2002; NEGI et al., 2005.
Outros agentes clinicamente ativos são o etoposídeo (Veperide®) e o
teniposídeo (Figura 5) (Vumon®), derivados semi-sintéticos do produto natural
36
epipodofilotoxina. Eles podem ser considerados os compostos mais relacionados
com o emprego original da planta no tratamento de câncer. A epipodofilotoxina é um
isômero da podofilotoxina que foi isolada como um agente ativo antitumoral obtido
das raízes de várias espécies do gênero Podophyllum, ambos atuam inibindo a
enzima topoisomerase II (CRAGG; NEWMAN, 2007).
Figura 5. Estrutura química da Podofilotoxina de Podophyllum emodi e P. peltatum e os derivados
semi-sintéticos (A) etoposídeo e (B) teniposídeo
A
CH3
B
O
OH
O
O
HO HO
O
O
O
O
O
O
O
O
O
CH3O
CH3O
OCH3
OCH3
OCH3
OH
Fonte: BOLZANI et al.; 2002.
Além destas moléculas utilizadas na terapia contra o câncer, outros
quimioterápicos são utilizados em combinação com outras terapias ou utilizadas
isoladamente. A descoberta e desenvolvimento de medicamentos contra o câncer foi
revolucionada na última década. Devido a alta toxicidade de muitos fármacos, a
pouca eficácia bem com a resistência adquirida, a terapia antineoplásica passou de
uma quimioterapia citotóxica para uma estratégia de medicina personalizada que
enfoca a descoberta e o desenvolvimento de medicamentos molecularmente
orientados que exploram a genética, vícios, dependências e vulnerabilidades de
células do câncer (HOELDER; WORKMAN, 2012).
Muitas dessas substâncias servem como protótiposs para o desenvolvimento
de medicamentos sintéticos modernos como citado anteriormente. Neste contexto, é
37
através destes conhecimentos adquiridos e descobertos através dos produtos
naturais que podemos entender a busca incessante de algumas indústrias e
pesquisadores por busca de substâncias bioativas novas.
3.6 Gênero Vernonia: Ocorrência e aspectos Biológicos
O gênero Vernonia é pertencente à família Asteraceae (Compositae)
compreende 1100 gêneros e 2500 espécies, sendo a maior família das
angiospermas. Compreende plantas de hábitos bem variados como ervas,
subarbustos, trepadeiras e árvores, a grande maioria de pequeno porte (JOLY,
1998). Segundo Bremer (1994 apud NAKAJIMA, 2001), a família Asteraceae
representa cerca de 10% da flora mundial e vem sendo muito estudada nos últimos
anos.
Estima-se que o Brasil possua 200 espécies de Vernonia, utilizadas na
medicina popular para o tratamento de diversas desordens. A espécie V. cinerea
demonstrou significante atividade analgésica, antiinflamatória e antipirética em
estudo realizado em ratos onde foi analisado o efeito de vários extratos da planta
(IWALEWA, 2003). A V. amygdalina provavelmente é a mais usada como planta
medicinal do gênero Vernonia, apresentando tanto atividade antibacteriana quanto
antifúngica (ERASTO et al., 2006). Também foi relatado atividade antitumoral nas
espécies V. pachyclada, V. amygdalina e V. scorpioides (PAGNO, 2004; WILLIAMS
et al., 2005).
Rao et al.,(2010), demonstraram atividade antidiabética e antihiperglicemiante
das sementes de Vernonia anthelmintica, em diabetes induzida por estreptozocina
em ratos, sem relato de efeitos tóxicos. O nome científico da planta indica que é uma
erva medicinal utilizada na medicina popular como antihelmíntico (HORDEGEN et
al., 2003).
As
lactonas
sesquiterpênicas
têm
demonstrado
inúmeras
atividades
biológicas como citotóxica e imunomoduladora (IZEVBIGIE et al., 2004; BUSKUHL
et al., 2007), antibacteriana (AFOLAYAN et al., 2006), antitumoral e antinflamatória
(PAGNO et al., 2006).
A espécie V. scorpioides (Figura 6) é uma erva comum da vegetação
secundária da encosta atlântica e da floresta latifoliada do alto do Uruguai, no
extremo oeste catarinense. Apresenta também uma extensa distribuição geográfica,
38
sendo encontrada desde o Ceará até o Rio Grande do Sul, como também no centrooeste conhecida popularmente como Enxuga, Erva de São Simão e Piracá
(CORREA, 1984; CABRERA, 1980). Exibe características físicas de arbusto, com
ramos numerosos(Figura 6) (CORREA, 1978; REITZ, 1980). Na medicina popular é
utilizada por via tópica no tratamento de várias desordens cutâneas, incluindo
úlceras crônicas, alergias, irritações, prurido, edemas provocados por traumatismos
ou infecção, nevralgia, processos inflamatórios e lesões cutâneas em geral
(CABREIRA,1980).
Figura 6. Foto das partes aéreas de Vernonia scorpioides (LAM) PERS.
Fonte: Cytocymura, 2010
Das inúmeras espécies de Vernonia encontradas no Brasil, a Vernonia
scorpioides é utilizada popularmente como antiinflamatório e cicatrizante, sendo o
efeito cicatrizante comprovado por Almeida e Palhano (2001) e a ação
antiinflamatória confirmada por Dalazen et al. (2005). Estudos são encontrados com
relação à atividade biológica da espécie, em relação a sua ação citotóxica, ação
antiinflamatória e antimicrobiana (TOIGO et al.; 2004; LEITE et al., 2002; BARDON,
2007; IWALEWA,2003; ERASTO et al., 2006; PAGNO, 2004; WILLIAMS et al., 2005)
Considerando que a Vernonia scorpioides é uma planta comumente utilizada
na medicina popular para o tratamento de desordens da pele e tendo informações
sobre suas propriedades farmacológicas, a atividade antinflamatória do extrato
etanólico da mesma foi investigada em modelos murinos de inflamação cutânea
aguda e crônica, apresentando inibição significativa da migração de neutrófilos no
tecido inflamado (CABRINI et al., 2011).
39
Dreux (2005) demonstrou atividade antiinflamatória do extrato hidroalcóolico
administrado por via intraperitonial, em modelos de edema de pata induzido por
carragenina e histamina em camundongos. Com a administração oral deste extrato
em modelo de peritonite induzida por carragenina, pode-se observar uma redução
significativa na migração de neutrófilos e leucócitos mononucleares, confirmando
uma ação antiinflamatória.
O efeito citotóxico da fração diclorometano de V. scorpioides também foi
verificado em estudo com camundongos tratados com este extrato em modelo de
lesões cutâneas (DALAZEN E MOLON, 2003).
Kreuger et al., (2009) verificaram ainda que a fração 2125 de extrato das
folhas da V. scorpioides apresentou atividade antitumoral em camundongos com
tumor de Ehrlich, quando tratados por via intraperitoneal. Similarmente, Pagno
(2006) demonstrou uma alta citotoxicidade contra o tumor de Ehrlich, em
camundongos, com fração diclorometano de V. scorpioides.
A atividade citotóxica de Vernonia sp, assim como da espécie scorpioides, é
atribuída em parte a presença de lactonas sesquiterpênicas em sua fração
diclorometano. Entretanto, Buskuhl et al., (2007) identificaram substâncias ativas na
fração acetato de etila, denominado de poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)ona, com potencial citotóxico, preliminarmente avaliados em linhagens celulares de
adenocarcinoma (Hela), melanoma (B16F10) e de fibroblasto (L929).
3.6.1 Poliacetileno: Atividades Biológicas
Produtos naturais acetilênicos incluem todos as substâncias com ligação tripla
ou um grupo alquil funcional, embora o termo poliacetileno seja, muitas vezes,
utilizado para descrever esta classe de produtos naturais. Produtos naturais
acetilênicos são amplamente distribuídos, ocorrendo em plantas, musgos e liquens,
fungos, algas marinhas, esponjas, tunicados, insetos, sapos e até em pequenas
quantidades em humanos. Os próprios compostos tendem a ser instáveis perante
oxidação, fotolíticos ou decomposição dependente de pH, desafiando seu
isolamento e caracterização (ARNAUD, 1892,1902 apud MINTO et al, 2008).
O
primeiro
produto
natural
alcino
foi
isolado
em
1826,
o
éster
dehidromatricaria (Figura 7), porém não foi totalmente caracterizado naquela época.
Entre os anos 1960 a 1980 os produtos naturais altamente insaturados começaram
40
a ser sintetizados devido ao crescimento dos químicos orgânicos no âmbito de
conhecimento químico (BOHLMANN et al.,1973). Nos últimos 25 anos com o
crescimento no aspecto de exploração, isolamento e síntese, o aumento do número
de novos poliacetilenos tem se destacado, mais de 2000 poliacetilenos são
conhecidos, sendo mais de 1100 de plantas da família Asteraceae (MINTO;
BLACKLOCK, 2008).
Figura 7. Representação da estrutura química de éster dehidromatricaria
Fonte: MINTO;BLACKLOCK, 2008.
Poliacetilenos
com
origem
de
produtos
naturais
como
mencionado
anteriormente são uma classe de compostos frequentemente instáveis contendo
uma ligação tripla carbono-carbono, coM ampla variedade de funções bioquímicas,
ecológicas, com potencial econômico e, de modo surpreendente de biossíntese.
Experimentos realizados entre 1960 e 1990 demonstraram que a maioria destes
compostos são derivados de ácidos graxos e precursores policetídeos.
Durante a última década, a investigação sobre o metabolismo de
poliacetilenos tem
avançado, o estado atual do conhecimento da genética
bioquímica e molecular de vias metabólicas secundárias poliacetilênicas tem sido
apresentado em pesquisas com novos poliacetilenos terrestres e marinhos (MINTO
et al., 2008).
Os Poliacetilenos vem sendo identificados em muitos estudos, considerados
uma classe de produtos naturais que tem demonstrado várias atividades biológicas,
incluindo ação antimicrobiana, inibidor da bomba de sódio e potássio ATPase,
inibidor do
HIV, envolvidos em
atividade imunosupressora,
antitumoral e
antinflamatória (FUSETANI et al., 1993; HALLOCK et al., 1995; CHRISTENSEN et
al., 2006).
Em um estudo realizado por Nho et al., (2010), foi isolado o poliacetileno
Gymnasterkoreayne (GKB) da espécie Gymnaster koraiensis, uma planta endêmica
Coreana, o qual demonstrou efeitos quimiopreventivos em ensaios in vitro e in vivo,
41
através de enzimas de desintoxicação, resultando na proteção de células do
estresse oxidativo e hepatotoxicidade.
O interesse por produtos naturais marinhos tem aumentado nos últimos
tempos. Uma espécie de interesse farmacológico é a esponja marinha Petrosia sp.
Segundo Kim et al (2002), o poliacetileno Dideoxypetrosynol A isolado deste
organismo apresentou significativa citotoxicidade sobre diversas células tumorais
humanas. Evidenciou-se que este poliacetileno inibiu a replicação do DNA,
predominantemente no seu estágio inicial de replicação.
O poliacetileno isolado do extrato clorofórmico das folhas de Crithmum
maritimum denominado falcarindiol, amplamente distribuído na família Apiacea,
demonstrou atividade contra Micrococcus luteus e Bacillus cereus. Também
apresentou atividade citotóxica em células IEC-6 (células epitélio intestinal de rato)
após exposição por 48 horas. Estes estudos sugeriram que Crithmum maritimum
pode ser potencialmente utilizado em fábricas de produtos alimentares e
cosmetologia como agentes conservantes e biopesticidas, ou na medicina como
novos antibióticos (DUROS et al., 2010).
Aralia nudicaulis, uma planta medicinal canadense conhecida como
salsaparilha selvagem, é utilizada para muitas doenças como a tuberculose. Gray e
colaboradores (2012) investigaram o extrato aquoso desta planta isolando dois
poliacetilenos, o (3R)-falcarinol e (3R, 9R, 10S)-panaxidol, que apresentaram
significativa atividade contra a Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
A Panax ginseng, tem sido fonte de inúmeras substâncias inclusive
poliacetilenos. Suas raízes são usadas popularmente no Japão, China e Korea
devido ao efeito tônico. Dois novos poliacetilenos, o 1-hidroxidihidropanaxacol e o
17-hidroxipanaxacol foram isolados e investigados da Panax ginseng, apresentando
atividade
antimicrobiana
frente
a
Staphylococcus aureus,
Bacillus
subtilis,
Cryptococcus neoformans e Aspergillus fumigatus (ORIHARA et AL., 2012).
O fracionamento do extrato n-hexano de raízes de Echinacea pallida levou ao
isolamento de dois poliacetilenos, mostrando que o poliacetileno mais hidrofóbico
apresentou atividade moderada frente às células de adenocarcinoma do pâncreas
(PELLATI, 2006).
Buskühl (2009) isolou e caracterizou o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan2(5H)-ona (Figura 8) a partir da fração diclorometano obtida pelo fracionamento do
extrato hidroalcoólico obtido de flores e folhas da V. scorpioides. Deste foi
42
investigado o potencial antitumoral e genotóxico em várias linhagens celulares,
observando resultados significantes. O mesmo poliacetileno demonstrou uma
diminuição da viabilidade celular frente às células B16F10 após exposição de 24
horas, demonstrando um processo necrótico, juntamente com o apoptótico.
Entretanto ficou evidenciado que o poliacetileno apresentou maiores índices de
apoptose, apesar de não ser exclusivo.
Devido aos dados promissores o interesse pelo estudo do mecanismo de ação
do poliacetileno e seu possível efeito antineoplásico cresceu. Deste modo, neste
trabalho os estudos farmacológicos in vitro e in vivo do composto isolado de
Vernonia scorpioides o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona foi avaliado,
demonstrando sua atividade citotóxica, como indicativo de propriedade antitumoral,
bem como estudos iniciais in vivo, possibilitando evidenciar mecanismos de ação e
seu efeito antitumoral.
Figura 8. Poliacetileno isolado de V. scorpioides
PM: C12H8O2 PM: 184 g/mol
5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona
Fonte: BUSKUHL et al., 2009.
43
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material vegetal: composto isolado
O poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, obtido das partes aéreas
da espécie Vernonia scorpioides, foi gentilemente cedido pela Dra. Maique W.
Biavatti, Universidade Federal de Santa Catarina. Foi preparado na concentração de
1mg/mL em PBS 0,1 M pH 7,4 contendo 1% de DMSO e posteriormente diluído no
mesmo solvente (DMSO) em fluxo laminar.
4.2 Ensaios in vitro
4.2.1 Linhagens celulares
As linhagens celulares utilizadas foram
B16F10 (melanoma murino), PC3
(câncer de próstata humano), LNCaP (câncer de próstata humano), H1299
(carcinoma de pulmão humano), OVCAR (adenocarcinoma de ovário humano), NCI
(câncer de pulmão), MCF-7 (adenocarcinoma de mama humano), U138MG
(adenocarcinoma cervical humano), VW473 (meduloblastoma humano), HELA
(adenocarcinoma
cervical),
T84
(adenocarcinoma
cólon
humano),
HOS
(osteosarcoma humano), MG63 (osteosarcoma humano), NK562 (natural Killerleucêmia sensível), KG1 (mielóide humano),
HL60 (leucemia promielocítica
humana), NB4 (leucemia promielocítica aguda humana), RAMOS (linfoma humano
de
Burkitt’s), RAJI (linfoma humano de
Burkitt’s), U937 (Leucemia linfoma
monocitico humano), JURKAT (leucemia/linfoma das células T), MOLT4 (leucemia
linfoblastica aguda humana), NALM6 (leucemia linfoblástica aguda humana), B15
(leucemia linfoblastica aguda humana), RS4 (leucemia aguda humana) e CMNH
linfócitos não tumorais. As células foram cultivadas em meio MEM ou RPMI 1640
(Gibco-BRL) suplementadas com 10% de soro fetal bovino inativado (Gibco),
contendo 1% de uma solução de antibióticos (Gibco) (5mg/mL de penicilina, 5mg/mL
de streptomicina e 10mg/ml de neomicina), 2 mM L-Glutamina (Glutamax-Gibco) and
piruvato de sódio (Gibco). As células foram mantidas em estufa CO2 5% a 37°C.
44
4.2.1.1 Obtenção das células mononucleares humanas normais
As CMHN foram obtidas por separação em gradiente de densidade conforme
método descrito por Boyum (1968) e modificado por Boyum (1976). O sangue
venoso foi coletado assepticamente a vácuo em tubos estéreis contendo heparina
sódica. Os tubos foram centrifugados a 1500 rpm durante 5 minutos à temperatura
ambiente (Fanem, modelo 206-BR Exelsa Baby II, São Paulo, SP, BRASIL). A
interface entre os eritrócitos e o plasma contendo os leucócitos foi colhida e diluída a
1:2 com tampão salina fosfato estéril 0,1M, pH7,4 (PBS). Esta suspensão celular foi
depositada lentamente sobre o gradiente de densidade Ficcoll Paque™ (densidade
de 1,077, Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia). Após centrifugação a 3000 rpm
durante 15 minutos em temperatura ambiente, foi removido o anel de células
mononucleares formado sobre o Ficcoll Paque™ e a segunda centrifugação a 1000
rpm por 5 minutos para retirada das plaquetas. O precipitado celular resultante foi
ressuspenso em 1 mL de meio de cultura RPMI suplementado e quantificado em
câmara de Neubauer, sendo avaliada simultaneamente a viabilidade celular pelo
teste de exclusão com Azul de Tripan a 0,4% em PBS (Sigma). Somente foram
utilizadas suspensões celulares com viabilidade superior a 90%.
4.2.1.2 Cultura de Células
Os testes com a linhagem celular B16F10 obtida a partir de melanoma de
pele de camundongos (Mus musculus C57BL/6J) (BCRJ CR010) e células
mononucleares normais humanas foram realizados no laboratório de Farmacologia
in Vitro (Laboratório de cultivo celular animal) da UNIVALI. Os testes com as
linhagens celulares de tumores sólidos humanos e leucemias humanas foram
realizados no Centro Integrado de Pesquisa Oncológica da Infância (CIPOI),
UNICAMP com a colaboração de Alexandre Nowill e Gilberto Carlos Franchi Junior.
As linhagens celulares foram cultivadas a 37o C 5% CO2 em meio MEM ou RPMI
1640 (Gibco-BRL) suplementado com Soro Fetal Bovino (Gibco) a 10% já estéril,
inativado e filtrado em fluxo laminar, e 1% de mistura de antibióticos (Gibco 15640)
sendo 5mg/mL de penicilina, 5mg/mL de estreptomicina e 10mg/ml de neomicina e
45
antifúngico (Gibco) (250 μg/ml), 2mM de L-glutamina (Ajinomotto) e piruvato de
sódio (Gibco) para as linhagens leucêmicas e de tumores sólidos humano.
As células foram descongeladas rapidamente em banho-maria a 37˚C e
transferidas para garrafas de cultivo celular, em meio de cultura apropriado e
devidamente suplementado como descrito acima, e mantidas a 37º C, com 5% de
CO2.
O meio de cultura MEM foi trocado a cada 2 dias até uma confluência de 8090% das células na garrafa, sendo então realizado o procedimento de tripsinização.
As células foram lavadas com PBS 0,1 M pH 7.4. Posteriormente, foi adicionado 1
mL de tripsina (0,25% tripsina,0.038% EDTA) seguido de incubação em estufa a
37ºC/, 5% de CO2, por no máximo 10 minutos.. A atividade da tripsina foi inativada
com meio MEM contendo 10% de soro fetal bovino e íons Mg ++ e Ca++, seguido de
transferência das células para um tubo falcon de 15 mL, centrifugação a 1000 xg/10
min a 10oC, descarte do sobrenadante e ressuspensão em meio MEM suplementado
e transferências em um “split” de 1:3 a 1:6.
4.2.1.3 Determinação da viabilidade Celular pela exclusão do corante azul de
tripan
Para a avaliação da viabilidade celular foi utilizado o corante azul de tripan
diluído em PBS (0,4%). Após tripsinização as células foram ressuspendidas em meio
MEM e adicionado azul de tripan a 0,4% com posterior contagem em câmara de
Neubauer através de microscópio óptico em aumento de 400X, avaliando-se o
número de células vivas (não coradas) e mortas (coradas). A viabilidade celular foi
determinada utilizando-se a seguinte equação:
46
4.2.1.2.1 Ensaios de Citotoxicidade (MTT)
Na figura 9 tem-se o esquema de metabolização do MTT em sais de
formazan em células viáveis, que em meio biológico ocorre através da enzima
mitocondrial succinato desidrogenase. A citotoxicidade nas células foi determinada
pelo teste MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio brometo) (Sigma). O MTT
(sal de tetrazólio) é convertido em sal de formazan, em células vivas, principalmente
pela atividade da succinato desidrogenase mitocondrial, formando uma coloração
azulada (sal de formazan) (MOSMANN, 1983).
Figura 9. Esquema representando a metabolização do MTT.
Fonte: Roche, 2008.
Os testes de citotoxicidade das células tumorais PC3, LNCAP, H1299,
OVCAR, NCI, T84, MCF-7, U138MG, VW473, HELA, HOS e
MG63
e
células
leucêmicas K562, KG1, HL60, NB4, RAMOS, RAJI, RS4, JURKAT, MOLT4, NALM6,
B15 e U937 foram realizados no Centro Integrado de Pesquisa Oncológica da
Infância (CIPOI), UNICAMP com a colaboração de Alexandre Nowill e Gilberto
Carlos Franchi Junior. Os demais experimentos foram realizados no laboratório de
cultivo celular animal da UNIVALI.
Os ensaios foram realizados em triplicata de experimentos independentes, em
quadruplicata para cada tipo celular por experimento. As células foram plaqueadas,
em placas de 96 poços, a 1.104 células/poço e incubadas com 200 L de meio MEM
suplementado por 24h a 37C em 5% CO2. Posteriormente, o meio foi removido e
substituído por 180 μL de meio MEM ou RPMI suplementado e foram adicionadas 20
μL da substância teste em diferentes concentrações (0,054; 0,54; 5,4; 54 e 543 μM),
dos fármacos paclitaxel (0,01; 0,1; 1; 10 e 100 µM), doxorubicina (0,01; 0,1; 1; 10 e
47
100 µM), daunorubicina (0,01; 0,1; 1; 10 e 100 µM) e do controle negativo (meio de
cultura com SFB contendo 1% de DMSO) e incubadas por 48h ( células leucêmicas)
e 24h (células tumorais) a 37ºC em estufa CO2 5%. Após este tempo foi retirado o
meio e adicionado 180 L de MEM sem SFB e 20 L de MTT (5 mg/mL) e foram
novamente incubadas por 4h a 37ºC em 5% CO2. O meio, juntamente com o MTT,
foi retirado e os cristais de formazan insolúveis foram dissolvidos em 100 L de
DMSO 1%. A determinação da absorbância foi realizada em leitor de microplaca a
570 nm (MOSMANN, 1983). A viabilidade relativa das células relacionadas ao
controle sem as substâncias testes foi calculada conforme equação abaixo.
A utilização dos fármacos antitumorais na avaliação da viabilidade celular foi
realizada para fins comparativos em relação ao composto isolado.
4.2.1.2.2 Ensaio de citotoxicidade (XTT)
A citotoxicidade das CMHN foi avaliada pelo teste XTT (2,3-bis (2- metil-4nitro-5-sulfofenil) – 5-[(fenilamino) carbonil] – 2H- hidróxido de tetrazólio) (Figura 11).
Neste teste, o XTT sofre redução pela atividade da desidrogenase
mitocondrial das células vivas e é convertido em sal formazan solúvel em água
permitindo
a
quantificação
da
coloração
formada
em
espectrofotômetro
(MARSHALL; GOODWIN; HOLT; 1999). Este ensaio apresenta a vantagem de não
necessitar do processo de solubilização, permitindo leituras de absorbância direta,
uma vez que as CMHN crescem em suspensão. Além disto, há redução do tempo e
risco de erros no procedimento. Quando o XTT é associado ao metassulfato de
fenazina apresenta maior sensibilidade e maior faixa dinâmica do método de
citotoxicidade, devido ao acoplamento de elétrons causados pelas enzimas
oxirredutases de membrana (MARSHALL; GOODWIN; HOLT, 1999).
Após a obtenção das CMHN, foram plaqueados 180 µL da suspensão celular,
mantida em meio RPMI e suplementado com 10% SFB (GIBCO), antibióticos PSN
(Gibco, 5mg/mL de penicilina, 5mg/mL de estreptomicina e 10 mg/ml de neomicina)
e antifúngico (Gibco, anfotericina 250µg/ml), 2mM de L-glutamina estéril (Ajinomoto),
48
em placas de 96 poços a uma densidade celular de 1,5.10 5
células/poço e
adicionadas 20µL do composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona em
diferentes concentrações (0,054; 0,54; 5,4; 54 e 543μM) do controle positivo triton X100 a 1% e do paclitaxel ( 0,1;1;10 e 100µM) e do controle negativo (meio RPMI sem
SFB contendo 1% de DMSO), mantidas por 44 horas a 37˚C em 5% de CO2. Após foi
adicionado 20µl de XTT (3mg/mL) com metassulfato de fenazina 1%, previamente
diluída em PBS estéril e incubadas por mais 4h a 37ºC em 5% CO2 para a formação
dos cristais de formazan. A determinação da absorbância foi realizada em leitor de
microplaca a 492nm e referência a 690nm. A viabilidade relativa das células
relacionadas ao controle sem o composto foi calculada utilizando a equação abaixo:
Figura 10. Esquema representando a metabolização do XTT.
Fonte: Roche, 2008
4.2.2 Avaliação do processo de morte celular por microscopia de
fluorescência
4.2.2.1 Análise através dos corantes brometo de etídeo e diacetato de
fluoresceína
Para confirmação dos dados obtidos no ensaio de citotoxicidade as células de
melanoma murino B16F10 foram plaqueadas em placas de 96 poços na
concentração de 1.104 células por poço e incubadas com 200 L de meio MEM
49
suplementado por 24 h a 37ºC em estufa CO2 5%. Após este período o meio foi
removido e substituído por 180 μL de meio MEM suplementado e foram adicionadas
20 μL do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, com concentrações finais
de (0,054; 0,54; 5,4; 54 e 543 μM), do controle positivo Paclitaxel (0,01; 0,1; 1, 10 e
100µM), e do controle negativo (meio MEM com soro fetal bovino e solvente 1%
DMSO) sendo mantidas em estufa a 37ºC a CO2 5% por 24, 48 e 72 h.
Posteriormente o meio de cultura foi removido e as células foram fixadas com 100
µL de metanol gelado por 10 minutos. O corante diacetato de fluoresceína (5mg/ml)
foi diluído em acetona mantido em freezer -20˚C e posteriormente diluído para a
concentração de trabalho (1:100). O brometo de etídeo (0,1mg/mL), para a solução
final foi adicionado 10 µL de diacetato de floresceína e 1mL de brometo de etídeo
conservado em freezer -20˚C e vedado de luz. Após o tempo de incubação o
sobrenadante da placa foi removido e adicionado 100 µL de metanol gelado e
deixado em geladeira por aproximadamente 10 minutos.
Retirado o metanol as
células foram hidratadas com 100µL de PBS e posteriormente colocado 100 µL da
solução dos corantes. A solução estoque de diacetato de fluoresceína (5mg/mL) foi
diluída em uma proporção 1:100 em brometo de etídeo (0,3 mg/mL em PSB estéril)
e em seguida incubados por 10 minutos em temperatura ambiente. O sobrenadante
foi removido e lavado com 100 µL de PBS estéril para posterior análise morfológica
celular.
Realizou-se a análise em microscópio de fluorescência (Olympus
CKX41SF2, sistema de fluorescência CKX41-RFA e Sistema Olympus Q-color3 de
aquisição de imagens, da Olympus Optical Co. Ltd., e filtro de 480 e 520 nm)
(NOBRE JUNIOR, 2006).
4.2.2.2 Análise através dos corantes brometo de etídeo e alaranjado de acridina
São inúmeras as técnicas designadas para identificar, quantificar e
caracterizar os mecanismos de morte celular apoptose e necrose. Podendo analisar
as características morfológicas destes mecanismos através da sua coloração, a
segunda metodologia empregada para avaliar estes mecanismos de morte celular foi
realizada com os corantes de alaranjado de acridina e brometo de etídeo.
Este método de coloração pelo BE e AA (MCGAHON et al., 1995) permite
diferenciar células viáveis daquelas em processo de morte por apoptose ou necrose,
50
através da coloração diferencial por fluorescência dos corantes alaranjado de
acridina e brometo de etídeo (0,1 mg/mL). Este método baseia-se na revelação das
células controle e tratadas com a coloração por BE e AA no núcleo. O corante AA
intercala-se ao DNA, sendo capaz de permear membranas intactas, penetrando em
células viáveis e inviáveis emitindo fluorescência verde e fluorescência vermelhoalaranjado. Após ligação com RNA e devido ao seu acúmulo nos lisossomas. Já o
corante BE emite fluorescência vermelha depois que intercala no DNA de células
com alguma alteração membranar (último estágio de apoptose e necrose). As
células viáveis com membrana intacta apresentam núcleo uniformemente corado de
verde pelo AA. E como o BE não é capaz de atravessar a membrana íntegra, esta
não é marcada ou pouco marcada. As células em apoptose inicial, possuindo a
membrana intacta, apresentam manchas verdes brilhantes no núcleo, devido à
característica morfológica de condensação da cromatina e não são marcadas por
BE; morfologicamente podem-se observar alterações da membrana em decorrência
da formação de corpúsculos apoptóticos ou corpos apoptóticos. As células em
processo de necrose, com lesão de membrana apresentam um padrão de coloração
uniforme, laranja-avermelhada e não ocorre a formação de corpos apoptóticos.
(KOSMIDER et al, 2004).
Para este teste as células de melanoma murino B16F10 foram plaqueadas
em placas de 96 poços na concentração de 1.104 células por poço foram cultivadas
por 24 horas mantidas em estufa a 37ºC e CO2 5%, posteriormente incubadas em
presença do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, com concentrações
finais de (0,054; 0,54; 5,4; 54 e 543 μM), do controle positivo paclitaxel na
concentração final de 100 µM e controle negativo (meio MEM com soro fetal bovino)
e solvente (1% DMSO) por 2, 6, 12 e 24h a 37ºC a 5% de CO2. O meio MEM da
placa foi removido e adicionado 95 µL de meio MEM sem SFB e 5µl de BE e AA
(100mg/L PBS). Mantidas em temperatura ambiente por 15 minutos e analisados os
resultados quanto ao mecanismo de morte celular.
As células foram analisadas usando microscópio de fluorescência (Olympus
CKX41SF2, sistema de fluorescência CKX41-RFA e Sistema Olympus Q-color3 de
aquisição de imagens, da Olympus Optical Co. Ltd., e filtro de 480 e 520 nm)
(NOBRE JUNIOR, 2006).
51
4.2.2.3 Critérios para classificação das células em apoptóticas, necróticas ou
viáveis utilizando dupla-coloração
Através das análises morfológicas das células tratadas com o poliacetileno, 5octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, realizadas através da coloração por BE e AA para
microscopia de fluorescência, foi calculado a porcentagem de células viáveis,
apoptóticas e necróticas.
As análises para identificação e quantificação de células em processos de
apoptose e necrose celular foram realizadas por meio dos parâmetros cor e aspecto
morfológico do núcleo, analisando em torno de 50 eventos, além da condensação e
fragmentação da cromatina também avaliada.
Diferentes padrões celulares podem ser observados e classificados:
a) As células vivas possuem seu núcleo verde uniforme (Figura 11a);
b) As células necróticas apresentam núcleo avermelhado uniforme (Figura11b).
c) Apoptose inicial quando as células ainda possuem suas membranas intactas e,
portanto, apresentam núcleo verde, porém não uniformemente corado. Devido a
condensações da cromatina, clivagem do DNA e/ou fragmentação nuclear (Figura
11c);
d) Apoptose tardia (necrose secundária ou apoptose-necrose) o BE penetra na
célula já que ocorre alteração da membrana mantendo o núcleo alaranjado,
apresentam condensação da cromatina e fragmentação (Figura 11b ). As células
apoptóticas podem ainda apresentar corpos apoptóticos (LEITE et al, 1999.;
VERMES et al, 2000.; KOSMIDER et al, 2004).
Figura 11. Microscopia de fluorescência de células B16F10 coradas com brometo de etídio e
alaranjado de acridina e classificadas em padrões pré-estabelecidos: a) célula viável, b) células em
necrose e c) célula em apoptose.
Fonte: Autor, 2012
52
4.2.3 Determinação da caspase-3 por ensaio colorimétrico
As células B16F10 foram plaqueadas, em placas de 6 poços a 5X106
células/poço e mantidas por 6, 12 e 24h na presença do poliacetileno 5-octa-2,4,6triinil-furan-2(5H)-ona, nas concentrações de 5,4, 54 e 543 µM. Para o controle
negativo foi utilizado meio de cultura MEM suplementado e DMSO 1% e para o
controle positivo paclitaxel na concentração de 100 μM (KHALILZADEH et al., 2007).
Nos tempos determinados de 6, 12 e 24h, as células foram ressuspendidas
em 50 μL de tampão de lise e incubadas por 10 minutos em banho de gelo. Após
centrifugar a 10000 x g a 4C, por 5 minutos, o sobrenadante corresponde ao lisado
(extrato citosólico). A concentração de proteína do lisado celular foi determinada pelo
método de Bradford, a fim de estabelecer a mesma concentração de proteínas para
todas as amostras e assim determinar a atividade da enzima caspase-3.
A determinação da enzima caspase-3 foi preparada em placa de 96 poços
conforme as instruções do fabricante, contendo branco, branco com inibidor de
caspase-3, controle negativo, controle positivo e o tratamento com o poliacetileno
(Chemicon´s Caspase-3 Colorimetric Activity Assay Kits).
A presença de caspase 3 no lisado consequentemente produz a p-nitroanilina
(pNa) gera coloração, sendo quantificada em 405 nm no leitor de microplacas. Os
resultados foram expressos em μM pNa, utilizando uma curva de pNa preparada
obtendo a seguinte equação da reta: y= -0,01631+ 0,00325.x, onde y é a
absorbância e x a concentraçãp de pNa (r= 0,998).
4.3 Avaliação da atividade antineoplásica do Poliacetileno
4.3.1. Animais
Foram utilizados camundongos C57BL/6, machos, com idade entre 1,5 e 3
meses, pesando em média 20-30g, obtidos do Biotério Central da Universidade do
Vale do Itajaí. A pesquisa seguiu as normas estabelecidas pela Comitê de Ética no
Uso de animais CEUA da Univali. A pesquisa seguiu as normas estabelecidas pelos
Princípios Internacionais Orientadores para Pesquisa Biomédica envolvendo
Animais, do Conselho de Organização Internacional de Ciências Médicas (GOLDIM,
1997) e foi aprovada pelo CEUA da UNIVALI, protocolo 001/2010
53
Os animais foram distribuídos em grupos contendo 8 camundongos, que
foram alojados em gaiolas plásticas, em temperatura controlada (22± 2°C), com ciclo
claro/escuro de 12 horas, recebendo dieta comercial e água ad libitum.
4.3.2 Influência sobre crescimento tumoral
As células de melanoma da linhagem B16F10 foram inoculadas no dia zero
(1x106 volume = 100µL/animal) por via subcutânea no dorso de camundongos
C57BL/6 machos (n=8 animais/grupo) de seis semanas de idade. Os animais foram
tratados por via i.p com doses diárias do composto Poliacetileno de 5,43 e
54,34µmol/kg, como controle positivo (inoculação de células tumorais e tratamento
com salina) e negativo (inoculação de meio MEM suplementado sem células e
tratamento com salina), durante 12 dias, iniciando o tratamento quando os tumores
se tornaram palpáveis a partir do 14 dia. Ao final do experimento, os animais foram
eutanasiados para retirada do tumor, o diâmetro tumoral foi mensurado com auxílio
de paquímetro e posterior pesagem para o cálculo da massa tumoral (V) (Figura12).
Assim, a atividade antitumoral foi determinada através da redução da massa e
volume tumoral sólido gerado. O volume do tumor (mm3) foi calculado de acordo
com a fórmula V= [ comprimento x (largura)2 ] / 2. (DEVALAPALLY et al., 2007; KIM
et al., 2010).
Figura 12. Influência sobre o crescimento tumoral sólido de células de melanoma murino B16F10 em
camundongos C57BL/6N. A) grupo controle negativo sem tumor, B) grupo controle negativo com
tumor e C) procedimento de tricotomia D) visualização do tumor E) retirada da massa tumoral F)
massa tumoral
Fonte: Autor, 2012
54
4.3.3 Avaliação do efeito do tumor melanoma B16F10 sobre o peso corporal
dos animais
O registro do controle de peso dos animais foi realizado no dia zero, no
momento do crescimento do tumor palpável e ao fim do experimento.
No
final
do
período
experimental,
os
animais
foram
sacrificados
cuidadosamente por deslocamento cervical. Foi realizada a retirada e pesagem dos
tumores subcutâneos e dos órgãos coração, baço, rins, fígado e o tumor sólido
foram removidos e imediatamente pesados.
Os resultados foram expressos em porcentagem do peso dos animais no 7º e
último dia de experimento em relação ao peso inicial e da porcentagem dos órgãos
em relação ao peso final dos animais.
4.3.4
Avaliação
do
efeito
antimetastático
do
Poliacetileno
sobre
o
desenvolvimento de metástases pulmonar
Para o estudo de metástase pulmonar os animais (n=8 animais/grupo) foram
submetidos à inoculação de células de melanoma murino B16F10 na concentração
de 1X106 células num volume de 50µL/animal através da injeção intraocular. Os
animais foram tratados por via i.p com o composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinilfuran-2(5H)-ona, nas doses de 5,43 e 54,34µmol/kg, controle positivo (inoculação de
células tumorais e tratamento com salina), e controle negativo (inoculação de meio
MEM suplementado sem células e tratamento com salina), com doses diárias com
início no dia 0 (dia da inoculação) até o 12º dia experimental. Depois de 12 dias de
tratamento com o Poliacetileno, os animais foram anestesiados com uma solução de
hidrato de cloral a 7%. A cavidade toráxica foi dissecada e a perfusão cardíaca foi
realizada com solução de PBS e fixador paraformaldeído a 4% (Figura 13). Os
pulmões foram coletados e em seguida cortes deste material foram obtidos e as
lâminas foram coradas com hematoxilina-eosina conforme item 4.3.7. Os pulmões
foram analisados e os pontos de metástase foram enumerados.
As lâminas foram analisadas e fotografadas usando o microscópio (Olympus
CKX41SF2, sistema de fluorescência CKX41-RFA e Sistema Olympus Q-color3 de
aquisição de imagens, da Olympus Optical Co. Ltd., e filtro de 480 e 520 nm, em
aumento de 400x, para posterior análise no software EARP onde os pontos
metastáticos foram medidos por mm2.
55
Figura 13. Figuras ilustrativas A e B do procedimento de perfusão cardíaca realizada nos animais
para retirada dos pulmões e órgãos.
As imagens foram capturadas e a análise foi realizada através do analisador
de imagens software EARP, com o qual as regiões de pontos metastáticos foram
interativamente selecionadas e marcadas para posterior medição em mm2. Através
destes parâmetros estabelecidos por Lentini et al., (2000) a área foi calculada
através da equação área da metástase / área total x 100.
4.3.5 Avaliação da atividade locomotora utilizando o Modelo do campo aberto
(Open Field)
A atividade exploratória pode ser analisada pelo modelo de campo aberto
(Open Field), objetivando avaliar possíveis efeitos colaterais, como alterações na
atividade locomotora, avaliando compostos estimulantes ou depressores do Sistema
nervoso central (HO et al., 2002). Este experimento consiste de um círculo de
acrílico transparente com 60 cm de diâmetro e borda de 50 cm de altura, com um
piso dividido em 12 quadrantes (Figura 14). O número de quadrantes cruzados com
as quatro patas foi quantificado durante o tempo de 6 minutos. Os animas foram
avaliados no sétimo dia de tratamento com o composto poliacetileno 5-octa-2,4,6triinil-furan-2(5H)-ona, nas 5,43 e 54,34 µmol/kg nos modelos experimentais de
tumor sólido e metástase induzido pelas células de melanoma murino B16F10.
56
Figura 14. Modelo do campo aberto (Open Field)
Fonte: Autor , 2012
4.3.6 Modelo de avaliação de hipernocicepção mecânica através do
monofilamento de Von Frey
Para
avaliar
individualmente
em
a
nocicepção
compartimentos
mecânica
de
os
acrílico
animais
foram
transparente
colocados
(9x7x11cm),
organizados em uma plataforma de arame elevada para permitir o acesso à
superfície ventral das patas traseiras (Figura 15). Os animais foram mantidos nos
compartimentos por pelo menos 30 minutos para aclimatação antes da realização
dos testes. A frequência de resposta de retirada foi obtida através de 10 aplicações
de 1 segundo cada, do filamento de Von Frey 0,6g (VFH, Stoelting, Chicago, USA).
Os estímulos foram realizados na superfície plantar da pata direita. Neste modelo
apenas os animais do modelo de metástase pulmonar foram avaliados (QUINTÃO et
al., 2005).
57
Figura 15. Foto ilustrativa da plataforma de arame elevada para avaliação mecânica utilizando o
monofilamento de Von Frey
Fonte: Autor, 2012
4.3.7 Avaliação histológica
Foi avaliada a presença ou não de metástases pulmonares a partir da leitura
de cortes histológicos obtidos através da inclusão total do órgão. Foram preparadas
lâminas em número suficiente para que todo o pulmão fosse mostrado, variando de
duas a três em corte seriado. Os cortes foram feitos em micrótomo rotativo
(American Optical 820®) com navalhas descartáveis, com 4 µm de espessura e
corados pela técnica de hematoxilina-eosina (HE). As lâminas foram fotografadas e
avaliadas no programa EARP para posterior cálculo da porcentagem relativa de
nódulo metastáticos em cada pulmão.
Foram avaliadas no ensaio toxicológico as alterações morfológicas dos
órgãos retirados como fígado, pulmão, rim e baço. Foram preparadas lâminas em
número suficiente para que todo o órgão fosse mostrado, variando de duas a três.
Os cortes foram feitos em micrótomo rotativo (American Optical 820®) com navalhas
descartáveis, com 4 µm de espessura e corados pela técnica de hematoxilina-eosina
(HE).
4.3.8 Avaliação da Toxicidade aguda in vivo
Para avaliação da toxicidade do composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinilfuran-2(5H)-ona, os animais camundongos C57BL6 machos (n=6 animais/grupo) de
seis semanas de idade foram submetidos ao tratamento via i.p do mesmo durante 12
dias, nas doses de 5,43 e 54,34 µmol/kg como controle negativo (tratados com
58
salina). Ao final do experimento, os animais foram eutanasiados por deslocamento
cervical e retirados os órgãos, fígado, rins e baço para posterior análise histológica
com o objetivo de identificar alterações morfológicas devido ao tratamento.
4.4 Análise estatística
Os resultados dos experimentos in vitro e in vivo foram expressos por média,
± desvio padrão, analisados de forma independentes. Os ensaios in vitro foram
analisados por ANOVA seguido de Tukey-Kramer. A CI50 foi determinada pelo
método de linearização de PROBITOS das viabilidades celulares em função da
concentração ou aproximada através da regressão sigmoidal utiizando software
Origin 5.0, para os experimentos com células, utilizando-se em função do log das
concentrações aplicadas***p<0, 001ANOVA seguido de TUKEY.
Os dados in vivo foram analisados por ANOVA de uma via seguida pelos
testes de Dunnet e Newman-Keuls. O nível de significância foi de p<0,05. Todas as
análises citadas foram realizadas utilizando o software GraphPad Instat® ou
GraphPad PRISM (VIEIRA, 1991).
59
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Avaliação da viabilidade celular
A avaliação da citotoxicidade foi realizada, em princípio para relacionar a
atividade citotóxica do composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, em
linhagens células tumorais e não tumoral. Em testes onde foi observada uma relação
dose-resposta da citotoxicidade, foi determinada a concentração letal ou inibitória em
cinqüenta porcento das células (CI50).
Inicialmente foi realizado um ensaio de citotoxicidade em células B16F10 nos
tempos de 24, 48 e 72 horas, utilizando o composto isolado poliacetileno (Figura 16).
Foi observada uma relação citotóxica dose dependente para o poliacetileno 5-octa2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona em todos os tempos de incubação. Após 24 horas de
incubação, o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, foi capaz de reduzir de
maneira dependente da dose a viabilidade celular, com redução de 7,4 a 96,5 %
com CI50 de 17,39 ± 3,26 µM (Figura 16A). Em 48 horas de incubação o composto
também reduziu de forma dose dependente a viabilidade celular, com redução de 11
a 95,5% e CI50 de 18,47 ± 19,02 µM (Figura 16B), já no tempo de 72 horas a redução
da viabilidade celular teve um decréscimo, reduzindo de 55 a 75% a viabilidade
celular a partir da dose de 54 µM e CI50 de 41,30 ± 6,52 µM (Figura 16C). Não houve
diferença significativa dos tempos de 48 e 72 horas, mesmo sendo observado um
aparente decréscimo no efeito citotóxico.
Os resultados de citotoxicidade foram
semelhantes aos obtidos com Paclitaxel a 100 µM (98,3% de redução da viabilidade
celular). A seguir imagens das células de melanoma B16F10 após tratamento com o
poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona (Figura 17).
60
Figura 16. Viabilidade das Células B16F10 expostas ao poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)ona. (A) 24 (B) 48 e (C) 72 horas de incubação, como controle negativo meio MEM +DMSO 1% (O) e
como controle positivo (C+) o Paclitaxel a 100µM. Gráfico representado por média ± desvio
padrão.**p< 0,01 ***p<0,001 ANOVA, post-test TUKEY.
A
100
50
***
***
54
3
54
5,
43
0,
54
C
0
***
c+
Viabilidade Celular (%)
150
Concentração (M)
B
100
50
***
***
54
3
54
5,
43
0,
54
C
0
***
c+
Viabilidade Celular (%)
150
Concentração (M)
C
150
100
**
50
**
***
Concentração (M)
c+
54
3
54
5,
4
0,
54
0
C
Viabilidade Celular (%)
200
61
De acordo com os dados obtidos, foram selecionadas algumas linhagens
celulares para avaliar o potencial citotóxico do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan2(5H)-ona, assim dando continuidade aos ensaios de citotoxicidade. Nas tabelas 1 e
2 tem-se representada as respostas citotóxicas nos modelos celulares tumorais
(PC3, LNCAP, H1299, OVCAR, NCI, T84, MCF-7, U138MG, VW473, HELA, HOS
e MG63), leucêmicos (K562, KG1, HL60, NB4, RAMOS, RAJI, RS4, JURKAT,
MOLT4, NALM6, B15 e U937) e (CMNH), comparando os resultados da
concentração inibitória da viabilidade celular em cinqüenta por cento das células
(CI50) do composto isolado poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona.
Tabela 1. Concentração inibitória da viabilidade celular em cinquenta porcento das células (CI 50) das
células PC3, LNCAP, H1299, OVCAR, NCI, MCF7, U138MG, VW473, HELA, T84, HOS E MG63
expostas por 24 horas ao poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona nas concentrações de
0,054 a 543µM e a Doxorubicina nas concentrações de 0,01 a 100µM. Tabela representada por
média ± desvio padrão. post-test TUKEY.
Linhagens celulares tumorais
Composto isolado Poliacetileno
Fármaco Doxorubicina
IC50µM
IC50µM
PC3
17,22 ± 2,17
4,22 ± 0,24
LNCAP
20,16 ± 2,5
3,15 ± 0,65
H1299
17,17 ± 0,81
8,87 ± 1,53
OVCAR
41,52 ± 11,14
2,20 ± 1,12
NCI
17,88 ± 0,87
12,84 ± 0,96
MCF7
39,18 ± 2,93
12,60 ± 2,15
U138MG
26,25 ± 1,30
1,82 ± 0,95
VW473
21,46 ± 2,17
4,63 ± 2,36
HELA
38,04 ± 4,61
5,01 ± 0,76
T84
19,29 ± 1,41
18,51 ± 0,62
HOS
20,54 ± 3,09
1,79 ± 0,22
MG63
17,98 ± 2,22
0,79 ± 0,06
As linhagens celulares acima foram expostas por 24 horas ao 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona
(0,054-543 µM) e Doxorubicina (0,01-100µM). Sem eguida a viabilidade celular foi avaliada pelo
ensaio do MTT. Os valores representam a média ± DP da concentração da substância capaz de
manter 50% das células vivas (IC50) obtidos de 3 experimentos independentes, cada um realizados
em triplicata.
62
Tabela 2. Concentração inibitória da viabilidade celular em cinquenta porcento das células (CI 50) das
células leucêmicas K562, KG1, HL60, NB4, RAMOS, RAJI, RS4, JURKAT, MOLT4, NALM6, B15 e
U937 e células normais CMNH, expostas por 48 horas ao poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)ona nas concentrações de 0,054 a 543µM e a Daunorubicina nas concentrações de 0,01 a 100µM.
Tabela representada por média ± desvio padrão. post-test TUKEY.
Linhagens celulares leucêmicas
Composto isolado Poliacetileno
Fármaco Daunorubicina
IC50µM
IC50µM
NK562
25,10 ± 3,31
0,36 ± 0,24
KG1
25,16 ± 1,19
0,57 ± 0,01
HL60
15,43 ± 0,76
0,24 ± 0,01
NB4
13,42 ± 1,73
0,19 ± 0,03
RAMOS
12,77 ± 0,59
0,57 ± 0,05
RAJI
23,91 ± 6,79
0,11 ± 0,03
U937
14,72 ± 4,40
0,32 ± 0,01
JURKAT
12,66 ± 0,59
0,13 ± 0,07
MOLT4
18,96 ± 1,84
0,07 ± 0
NALM6
4,40 ± 0,21
0,03 ± 0,01
B15
17,71 ± 1,30
0,07 ± 0
RS4
15,32 ± 0,76
0,38 ± 0
CMNH (normais)
>100
Não avaliado
As linhagens celulares acima foram expostas por 48 horas ao 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona
(0,054-543 µM) e Daunorubicina (0,01-100µM). Sem eguida a viabilidade celular foi avaliada pelo
ensaio do XTT. Os valores representam a média ± DP da concentração da substância capaz de
manter 50% das células vivas (IC50) obtidos de 3 experimentos independentes, cada um realizados
em triplicata.
A atividade citotóxica do composto frente às células tumorais PC3, H1299,
MG63, NCI mantidas em contato com o composto por 24 horas, foi considerada
significativa (Tabela 1), sendo que na maior concentração (543µM) o composto
poliacetileno
5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona,
provocou
a
morte
celular,
diminuindo, respectivamente, 87%, 85%, 84% e 86% a viabilidade celular, no
entanto nas demais linhagens a atividade citotóxicica do composto foi menor. Nas
células leucêmicas tratadas com o composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan2(5H)-ona por 48 horas, os resultados também mostraram-se promissores (Tabela 2)
sendo que na linhagem NB4, RAMOS, JURKAT e NALM6, na concentração de
543µM a redução da viabilidade celular foi de respectivamente 91%, 93%, 84% e
81%. Apesar da citotoxicidade apresentada nestas linhagens celulares pelo
poliacetileno, o resultado da viabilidade celular das CMNH, apresentou baixa
atividade citotóxica (Tabela 2).
63
5.1.2 Avaliação da morte celular por microscopia de fluorescência
5.1.2.1 Brometo de etídeo e diacetato de fluoresceína
Os resultados do ensaio de citotoxicidade foram monitorados por microscopia
de fluorescência nas células de melanoma murino B16F10 utilizando os corantes
vitais brometo de etídeo e diacetato de fluoresceína, como controle negativo (meio
MEM sem SFB) e positivo (Paclitaxel 100 µM). As imagens das células foram
fotografadas e estão demonstradas detalhadamente nos apêndices A e B,
confirmando os resultados do ensaio de citotoxicidade celular por MTT.
5.1.2.2 Brometo de etídeo e alaranjado de acridina
O método de microscopia de fluorescência utilizando os corentes BE e AA, foi
utilizado para a melhor caracterização de morte celular por apoptose precoce e tardi
e necrose. A avaliação da atividade citotóxica, visando o possível mecanismo de
morte celular da linhagem B16F10 do composto isolado poliacetileno 5-octa-2,4,6triinil-furan-2(5H)-ona, controle negativo e utilizando como controle positivo o
fármaco paclitaxel foi determinada usando a combinação destes dois corantes, o BE
e AA.
O experimento foi realizado nos tempos de exposição de 2, 6, 12 e 24 horas,
com diferentes concentrações da substância testada nas células tumorais B16F10.
As imagens da avaliação do processo de morte celular por microscopia de
fluorescência das células B16F10 marcadas com BE e AA encontram-se nas Figuras
17, 18, 19, 20, 21 e 22.
De acordo com as imagens pode-se sugerir a apoptose como o mecanismo
de morte celular mais expressivo desde as primeiras horas de contato com o
composto, apresentando condensação da cromatina bem como formação de corpos
apoptóticos e fragmentação do DNA. Mesmo em menor proporção também pode-se
observar células em processo necrótico. Nas tabelas 3 e 4 a porcentagem de
eventos apoptóticos e necróticos foi calculada através da análise quantitativa
morfológica de um campo de células, onde 50 células foram contadas e
caracterizadas.
64
No tratamento com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona na
concentração de 5,43µM no tempo de 24 horas (Figura 17d) é clara a alteração
morfológica das células, apresentando fragmentação nuclear, dando indícios de um
processo apoptótico.
Figura 17. Efeitos do composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, na concentração de
5,43µM, na morfologia das células de melanoma murino B16F10. Corantes AA(0,01mg/mL) e BE
(0,01mg/mL). Período de incubação 2,6,12 e 24 horas. Excitação de BP460-490nm, Filtro BA520nm.
Aumento de 400x. (FR) Fragmentação nuclear
Nos tempos de 2 e 6 horas na concentração de 54µM (Figura 18 a,b) é
possível observar o processo de apoptose tardia observando as alterações
morfológicas característicos onde a cromatina se fragmenta e os dois corantes se
intercalam, visivelmente no tempo de 6 horas, onde as células em apoptose tardia
dividem espaço com células em processo de necrose. Nos tempos de 12 e 24 horas
a morfologia característica indica inúmeros eventos apoptóticos, a porcentagem de
células apoptóticas é de respectivamente 87% e 75% (Tabela 3).
Podemos observar o padrão morfológico e de coloração (Figura 18 d)
fluorescência verde e fragmentação nuclear representativo de apoptose precoce. Em
contrapartida, podemos notar os padrões de apoptose tardia onde vemos núcleos
com cromatina fragmentada (Figura 18a) e coloração vermelha fluorescente (BE) e
necrose apresentando núcleo normal e coloração vermelha fluorescente (Figura
18b).
65
Figura 18. Efeitos do composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, na concentração de
54 µM, na morfologia das células de melanoma murino B16F10. Corantes AA (0,01mg/mL) e BE
(0,01mg/mL). Período de incubação 2, 6,12 e 24 horas. Excitação de BP460-490nm, Filtro BA520nm.
Aumento de 400x. (AT) Apoptose tardia (N) Necrose.
De acordo com a Figura 19 onde as células foram expostas a concentração
de 543µM do composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, todos os
tempos apresentam a apoptose como o mecanismo de morte celular predominante,
com uma redução significatica na quantidade de células no campo. Sua atividade
pode ser comparada ao Paclitaxel utilizado como controle (Figura 20). É possível
observar que nas primeiras horas de contato com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinilfuran-2(5H)-ona, o processo necrótico é visível,bem como apoptose tardia onde os
corantes se intercalam, no entanto após 24 horas o composto apresentou morte
celular predominantemente apoptótica.
Figura 19. Efeitos do composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, na concentração de
543 µM, na morfologia das células de melanoma murino B16F10. Corantes AA (0,01mg/mL) e BE
(0,01mg/mL).Período de incubação 2,6,12 e 24 horas. Excitação de BP460-490nm, Filtro BA520nm.
Aumento de 400x.
66
Figura 20. Efeitos do fármaco Paclitaxel utilizado como controle positivo na concentração de 100 µM,
na morfologia das células de melanoma murino B16F10. Corantes AA (0,01mg/mL) e BE
(0,01mg/mL). Período de incubação 2,6,12 e 24 horas. Excitação de BP460-490nm, Filtro BA520nm.
Aumento de 400x.
Na Figura 21 pode-se evidenciar que as células B16F10 expostas somente
com meio de cultura MEM+DMSO 1% utilizado como controle negativo do
experimento, estão viáveis em todos os tempos analisados.
Figura 21. Imagens do controle negativo meio MEM+DMSO 1%, na morfologia das células de
melanoma murino B16F10. Corantes AA (0,01mg/mL) e BE (0,01mg/mL). Período de incubação
2,6,12 e 24 horas. Excitação de BP460-490nm, Filtro BA520nm. Aumento de 400x.
67
Tabela 3: Tabela demonstrativa da porcentagem de apoptose apresentada pelo poliacetileno 5-octa2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona no processo de morte celular através da marcação de morte celular com
Alaranjado de Acridina e Brometo de Etídeo na linhagem celular B16F10.
Poliacetileno
O
O
2h
Linhagem Celular
B16F10
6h
12h
24h
(concentrações)
543µM
100%
100%
100%
100%
54µM
84%
50%
67%
100%
5,4µM
79%
75%
87%
75%
0,543µM
65%
69%
80%
70%
0
0
0
0
44%
50%
45%
Controle negativo
Paclitaxel 100µM
51%
68
Tabela 4: Tabela demonstrativa da porcentagem de necrose apresentada pelo poliacetileno 5-octa2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona no processo de morte celular através da marcação de morte celular com
Alaranjado de Acridina e Brometo de Etídeo na linhagem celular B16F10.
Poliacetileno
O
O
2h
Linhagem Celular
B16F10
6h
12h
24h
(concentrações)
543µM
0
54µM
16%
5,4µM
21%
0,543µM
0
0
0
33%
0
25%
13%
25%
35%
31%
20%
30%
0
0
0
0
56%
50%
55%
50%
Controle negativo
Paclitaxel 100µM
49%
69
5.2 Determinação da caspase-3 por ensaio colorimétrico
A quantificação da caspase 3, uma enzima efetora pertencente às duas vias
de ativação apoptótica, foi realizada nas células tumorais B16F10 utilizando o
composto isolado poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona que, devido aos
resultados anteriores demonstrou ser uma substância com indício de morte celular
apoptótica. Podemos observar na Figura 22 que no tempo de 6 horas houve
aumento da pNa quando as células B16F10 foram expostas a 100µM de Paclitaxel
comparado ao controle negativo.
Pode-se observar que na concentração de 543µM do poliacetileno 5-octa2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, ocorre um aumento da pNa, ou seja, um aumento da
caspase 3, já nos tempos de 12 e 24 horas não foi possível observar as mesmas
alterações na concentração de pNa.
Figura 22. Quantificação da p-nitro aniline (pNa) mmol/L formada nas células tumorais B16F10em
presença do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona. Utilizando meio de cultura MEM para
controle negativo e Paclitaxel como controle positivo com tempo de exposição de 6h. As barras são
expressas pela média ± desvio padrão. *p<0,05**p<0,01***p<0,001 ANOVA seguido de TUKEY.
80
pNa (mmoL/L)
p<0,001
p<0,001
60
p<0,001
p<0,001
40
20
0
Inibidor Caspase
0
5,4
54
543
543
c+
c+
-
-
-
-
+
-
+
70
5.3 Avaliação da atividade antineoplásica do poliacetileno in vivo
5.3.1 Influência sobre o crescimento tumoral
As células de melanoma murino B16F10 foram injetadas no dorso dos
animais
e,
em
média,
14
dias
após
pode-se
observar
os
tumores
macroscopicamente. Na figura 25 tem-se o gráfico do peso da massa tumoral dos
camundongos após o tratamento com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)ona nas doses de 5,43 e 54,34µmol/kg.
Figura 23. Efeito do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona nas doses de 5,43 e 54,34
µmol/kg sobre o peso da massa tumoral dos camundongos C57BL/6N induzidos ao crescimento de
tumor sólido por células de melanoma murino B16F10. As barras representam a média ± desvio
padrão do peso do tumor de 8 animais por grupo. p< 0,001 ANOVA seguido de TUKEY.
p< 0,001
Massa tumoral (g)
15
10
5
***
0
C
54,34
5,43
Poliacetileno
(mol/kg,i.p)
Na figura 23 o gráfico representa o peso da massa tumoral dos camundongos
após tratamento com o composto nas doses de 5,43 e 54,34 µmol/kg, apresentando
redução ativa (p< 0,001) de 65,6± 18,9% e 80 ± 15,95% do tamanho tumoral
promovido por células B16F10 em ambas as doses quando comparadas com o
controle negativo (C).
Na figura 24 o gráfico mostra o volume tumoral (mm3), onde os tumores foram
medidos com um paquímetro e analisou-se a redução do volume tumoral nos
camundongos tratados com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, nas
71
doses de 5,43 e 54,34 µmol/kg, apresentando significância de p < 0,05 para a
concentração de 54,34 µmol/kg comparado com o controle (C).
Figura 24. Efeito do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona nas doses de 5,43 e 54,34
µmol/kg sobre o volume tumoral dos camundongos C57BL/6N induzidos ao crescimento de tumor
sólido por células de melanoma murino B16F10. A barra foi expressa pela média ± desvio padrão de
8 animais por grupo. p<0,05 ANOVA seguido de TUKEY.
*
Volume tumor (mm3)
5
4
3
2
1
0
C
5,43
54,34
Poliacetileno
(mol/kg,i.p)
5.3.2 Avaliação do efeito do tumor sobre o peso corporal dos animais
O peso corpóreo dos animais foi acompanhado a partir da data de início do
tratamento, quando o tumor já está palpável. Do peso corporal total foi subtraído o
valor da massa tumoral resultando no valor do peso real dos animais (g).
A porcentagem do peso dos animais no 7º dia de tratamento, no último dia de
tratamento em relação ao peso inicial e porcentagem dos órgãos em relação ao
peso final corporal dos camundongos C57BL/6, após tratamento com o composto
isolado poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, nas doses de 5,43 e 54,34
µmol/kg estão descritos na tabela 5 abaixo.
72
Tabela 5. Porcentagem do peso dos animais no 7º. e último dia de experimento em relação ao peso
inicial e porcentagem dos órgãos em relação ao peso final de camundongos C57BL/6N, após
administração do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, nas doses de 5,43 e 54,34 µmol/kg
%Peso
7º dia
%Peso
final
Coração
(%)
Baço
(%)
Rins
(%)
Fígado
(%)
C negativo 100
sem tumor
98,54±
8,07
91,32
±
15,05
0,67 ±0,13
0,37±0,06
1,43±0,09
6,40±1,15
C negativo 100
com tumor
100,92±
16,35
119,58
±
16,09
0,43±0,00 *
0,50±0,00
0,87±0,08
3,97±0,68
100
95,38 ±
11,26
111,44
± 8,66
0,56±0,16
0,60±0,19
b*
0,40±0,10
5,36±0,84
Poliacetileno 100
54,34µmol/kg
94,07 ±
11,94
102,37
±
14,44
0,54±0,08
0,71±0,18
a***
1,34±0,33
Grupos
Poliacetileno
5,43µmol/kg
%Peso
inicial
a *
a*
b**
5,50±1,33
Análise estatística: Dados representados por média ± desvio padrão. *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001
ANOVA seguido de Dunnett’s.
a
diferenças significativas em relação ao grupo sem tumor no final do experimento.
b
diferenças significativas em relação ao grupo com tumor no final do experimento.
Na tabela 5 podemos observar os seguintes resultados, no tratamento com o
composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, utilizando as doses de
5,43 e 54,34 µmol/kg via intraperitoneal nos camundongos, não foi observado
diferença significativa sobre a porcentagem do peso dos animais.
No grupo de animais com crescimento tumoral sólido de melanoma murino,
pode-se observar uma diminuição significativa da porcentagem do peso do coração
em relação ao grupo negativo sem tumor (p<0,05).
Pode-se observar também que, ao baço os grupos apresentaram-se
semelhantes. É possível notar o aumento do baço de todos os grupos comparado
ao controle negativo sem tumor, apresentando significância o grupo que recebeu o
tratamento na dose de 54,34µmol/kg. Em relação ao peso dos fígados não foi
observado diferença significativa entre os grupos.
Analisando o peso dos rins pode-se observar que o grupo que recebeu
tratamento com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona 54,34µmol/kg
apresentou diferença significativa quando comparado ao grupo negativo com tumor,
73
já o grupo controle com tumor apresentou uma dimuinuição da porcentagem do peso
dos rins quando comparados com o grupo controle sem tumor (p< 0,05).
5.3.3 Avaliação do efeito antimetastático do poliacetileno
Após a indução de metástase pulmonar os animais foram tratados por 12
dias, após este período foram anestesiados e submetidos à perfusão cardíaca
seguido de coleta dos pulmões. A figura 25 mostra os pulmões dos animais retirados
após perfusão cardíaca, onde é possível observar macroscopicamente a redução
dos nódulos metastáticos nos tratamentos com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinilfuran-2(5H)-ona nas doses de 5,43 e 54,34 µmol/kg comparando com o controle
onde foram inoculadas células tumorais e não houve tratamento.
Também é possível notar significante redução do número de nódulos
metastáticos nos pulmões comparado com o controle, sendo que na dose de 5,43
µmol/kg houve uma redução de 62,08 ± 4,96% e na dose de 54,34µmol/kg 43,58 ±
6,82% valores demonstrados no gráfico da figura 26 (setas indicam os nódulos
metastáticos).
Figura 25. Imagens representativas da análise macroscópica dos pulmões retirados dos
camundongos tratados com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona. Doses de 5,43µmol/kg
(A), 54,34µmol/kg (B), controle negativo (sem inoculação de células B16F10) (C) e controle positivo
(D) com inoculação de células sem tratamento.
74
Figura 26. Gráfico de inibição de metástase pulmonar induzida por células B16F10 injetadas via
retro-orbital em camundongos C57BL/6, tratados com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)ona nas doses de 5,43 e 54,34 µmol/kg; i.p durante 12 dias. Barras representam a média ± EPM do
número de nódulos observados por grupo, cada um com 8 animais.**p<0,01 ANOVA seguido de
Dunnett’s.
**
Nódulos
30
20
10
0
T
5,43
54,34
Poliacetileno
(mol/kg, i.p)
Na figura 27, pode-se observar lâminas histológicas dos pulmões dos
animais. Na figura A representando o grupo controle negativo sem presença de
nódulos metastáticos, na figura B o controle positivo, onde é possível observar vários
nódulos metastáticos, e nas figuras C e D os tratamentos com o poliacetileno 5-octa2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona nas respectivas doses de 5,43 e 54,34µmol/kg, podendo
observar uma significativa redução nos nódulos metastáticos, quando comparado
com o controle positivo.
75
Figura 27. Análise histológica de metástase pulmonar (A) controle negativo (B) controle positivo (C)
dose de 5,43μmol/kg (D) dose de 54,34μmol/kg. Ampliação de 400x.
5.3.4 Avaliação da atividade locomotora (Open Field)
A atividade locomatora dos animais foi observada através do modelo do
campo aberto (Open Field) a fim de avaliar a ação do poliacetileno 5-octa-2,4,6triinil-furan-2(5H)-ona e seus possíveis efeitos. Os resultados apresentados na
Figura 30 demonstram que a indução de tumor sólido pelas células B16F10 reduziu,
de forma significativa o número de cruzamentos (crossing) no modelo apresentado
em relação ao grupo sem tumor. A administração de Poliacetileno na dose de
5,43µmol/kg, i.p do composto conduz ao aumento do número de cruzamentos,
quando comparado ao grupo controle com tumor. Já o composto na dose de
54,34µmol/kg, i.p, não apresenta diferença significativa quando comparado ao grupo
controle com tumor.
76
Figura 28. Efeito do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona (5,43 e 54,34 µmol/kg, i.p.) sobre
os parâmetros comportamentais “crossing” (cruzamentos) no modelo do Open Field em modelo de
tumor sólido, (M) animais sem tumor e (T) animais com tumor. Cada grupo representa a média de 8
animais. A barra representa *p<0,05. ANOVA seguido de Dunnett’s.
120
*
Número de
cruzamentos
90
60
30
0
M
T
5,43
54,34
Poliacetileno
(mol/kg, i.p)
Os resultados apresentados na Figura 29 demonstram que a indução de
metástases pulmonar não alterou de forma significativa o número de cruzamentos
(crossing) nas doses de 5,43 e 54,34µmol/kg, i.p em relação ao grupo controle com
tumor.
Figura 29. Efeito do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona (5,43 e 54,34 µmol/kg, i.p.) sobre
os parâmetros comportamentais “crossing” (cruzamentos) no modelo do Open Field em modelo de
metástase pulmonar, (M) animais sem tumor e (T) animais com tumor. Cada grupo representa a
média de 8 animais. ANOVA seguido de Dunnett’s.
Número de
cruzamentos
150
100
50
0
M
T
5,43
54,34
Poliacetileno
(mol/kg,i.p)
77
Na figura 30 o gráfico expressa os valores referente ao efeito do poliacetileno
5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona no modelo de avaliação toxicológica onde os
animais foram tratados com o composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)ona nas doses de 5,43 e 54,34 µmol/kg, i.p. Em nenhuma das doses administradas
foi apresentado aumento ou redução significativa no número de cruzamentos
comparado com o controle salina (0).
Figura 30. Efeito do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona (5,43 e 54,34 µmol/kg, i.p.) sobre
os parâmetros comportamentais “crossing” (cruzamentos) na avaliação toxicológica, (0) grupo
controle salina. Cada grupo representa a média de 6 animais. ANOVA seguido de Dunnett’s.
Número de
cruzamentos
150
100
50
0
0
5,43
54,34
Poliacetileno
(mol/kg, i.p)
5.3.5 Avaliação de hipernocicepção mecânica através do monofilamento de
Von Frey
Os animais que foram inoculados com células B16F10 por via retro-orbital a
fim de induzir metástase pulmonar foram avaliados no último dia de tratamento
quanto à nocicepção mecânica. Com o intuito de avaliar um possível efeito antinociceptivo do composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, os animais
foram submetidos a avaliação mecânica através do monofilamento de Von Frey. A
figura 31 demonstra que os animais submetidos ao modelo de metástase pulmonar
apresentaram aumento significativo da sensibilidade mecânica quando comparado
ao grupo tratado com meio. O tratamento com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinilfuran-2(5H)-ona nas concentrações de 5,43 e 54,34µmol/kg, foi capaz de reduzir a
sensibilização mecânica, com inibição de 67,47 e 57,14%.
78
Com base nestes dados ensaios para a avaliação de hipernocicepção
mecânica foram realizados utilizando como agentes flogísticos a carragenina e o
CFA, porém não foi observado efeito anti-hiperalgésico do composto poliacetileno, 5octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona tais resultados não estão demonstrados no
trabalho.
Frequência de Resposta (%)
Figura 31. Frequência de resposta da pata direita dos animais do modelo de metástase pulmonar
tratados com o composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona nas doses de 5,43 e 54,34
µmol/kg, i.p, controle negativo meio MEM (M) e controle positivo inoculação do tumor (T). O gráfico é
expresso por média ± EP de 8 animais por grupo. Diferença significativa do grupo controle *p< 0,05. ≠
difere significativamente em relação ao grupo (M). ANOVA seguido de Dunnett’s.
#
50
40
*
*
5,43
54,34
30
20
10
0
M
T
Poliacetileno
(mol/Kg. i.p)
5.3.6 Avaliação da atividade toxicológica aguda
A fim de avaliar o possível efeito citotóxico do composto poliacetileno 5-octa2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, os animais foram submetidos ao tratamento com o
composto nas doses de 5,43 e 54,34 µmol/kg; i.p durante 12 dias. No ínicio e fim do
tratamento os animais foram pesados com o objetivo de avaliar o peso corporal. Na
figura 34 o gráfico demonstra que não houve redução ou ganho de peso corporal
significativo comparando os pesos inicias e finais dos animais. Observou-se um
ganho de peso de 7,01 ± 3,29% no grupo tratado com a concentração de 54,34
µmol/kg e 3,63 ± 0,26% na concentração de 5,43 µmol/kg não apresentando
significância comparado com o controle salina que apresentou ganho de peso
corporal de 9,90 ± 8,03%.
79
Na figura 32 fotos ilustrativas do aspecto físico dos animais são mostradas.
Na visualização macroscópica destes órgãos não foi observada nenhuma alteração
significativa.
Figura 32. Fotos ilustrativas do aspecto físico dos animais tratados com o poliacetileno 5-octa-2,4,6triinil-furan-2(5H)-ona nas doses de 5,43µmol/kg (A) e 54,34µmol/kg (B, C) durante 12 dias, para
avaliação toxicológica do composto.
Figura 33. Gráfico de variação do peso inicial e peso final (g) dos animais tratados com o
poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona nas doses de 5,43 e 54,34µmol/kg, i.p, e grupo salina
(0) tratados por 12 dias.
Peso inicial
Peso final
Peso corporal (g)
40
30
20
10
0
0
5,43
54,34
Poliacetileno
(mol/kg, i.p)
Após o período de tratamento dos animais, os mesmos foram anestesiados e
foi realizada a perfusão cardíaca para retirada dos órgãos fígado, rim e baço a fim de
avaliar possível efeito tóxico do composto. Para análise histológica dos órgãos as
lâminas histológicas foram fotografadas e analizadas. Na figura 34 estão
representadas as lâminas de cortes histológicos do fígado do grupo negativo e dos
80
respectivos tratamentos com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, nas
doses de 5,43 e 54,34µmol/kg, não apresentando alteração na morfologia celular
quando comparado com o controle.
Na figura 35, os cortes histológicos do baço também não apresentam
diferença morfológica dos grupos tratados com o composto quando comparado com
o controle. O mesmo pode ser observado na figura 36 os cortes histológicos do rim
dos animais tratados com o Poliacetileno também não apresentaram alteração
morfológica quando comparados ao grupo controle.
Figura 34. Análise histologica do fígado dos animais submetidos a avaliação toxicológica. (A) grupo
controle (B) dose de 5,43µmol/kg (C) dose de 54,34µmol/kg. Aumento de 400x.
Figura 35. Análise histologica do baço dos animais submetidos a avaliação toxicológica. (A) grupo
controle (B) dose de 5,43µmol/kg (C) dose de 54,34µmol/kg. Aumento de 400x.
Figura 36. Análise histologica do rim dos animais submetidos a avaliação toxicológica. (A) grupo
controle (B) dose de 5,43µmol/kg (C) dose de 54,34µmol/kg. Aumento de 400x.
81
6. Discussão
Embora o processo do câncer tenha sido estudado por séculos, os
conhecimentos sobre os mecanismos biológicos de transformação e progressão do
tumor eram poucos no início da medicina molecular em meados do século 20. Até o
ano de 1950, a terapia utilizada para o câncer era predominantemente a intervenção
cirúrgica. Em 1960, a radioterapia se tornou uma ferramenta primordial para o
controle da doença, mas, apresentaram os mesmos resultados apresentados pela
cirurgia, não sendo capaz de exterminar com o câncer metastático. Um tratamento
que fosse efetivo para muitos pacientes necessitava ultrapassar os limites do sítio
tumoral, penetrando cada órgão do corpo (CHABNER & ROBERTS, 2005).
Atualmente o foco da medicina é outro. Na tentativa de desenvolver fármacos
para alvos específicos relacionados ao câncer, a pesquisa científica se tornou
multidisciplinar e tem trabalhado em conjunto na busca por medicamentos mais
efetivos para o tratamento de tumores, com redução da resistência do paciente ao
mesmo, diminuição da toxicidade, aumento da especificidade e biodisponibilidade do
fármaco (CHABNER & ROBERTS, 2005).
Nas últimas décadas, intensificou-se a procura de uma explicação genética
sobre a origem, o crescimento e a progressão do melanoma cutâneo. Encontrar uma
ligação direta entre as mutações gênicas e a origem da doença tem sido objetivo
dos pesquisadores dedicados ao estudo dessa neoplasia (FAURI et al., 2010).
Considerado o tumor de pele mais agressivo, o melanoma cutâneo é mantido na
liderança das mortes por câncer de pele nos países industrializados. A sua
incidência vem aumentando significativamente em todo o mundo, mais rapidamente
do que qualquer outro tipo de neoplasia maligna (ALONSO et al., 2004).
Considerando que o Brasil é privilegiado com uma das mais complexas
biodiversidades do planeta, ainda pouco se conhece de seus recursos naturais
(CECHINEL FILHO et al., 2003). A intensa procura, nos últimos anos por alternativas
eficientes para o tratamento do câncer tem feito com que a grande diversidade
brasileira se destaque, levando em consideração o importante papel das plantas e
de seus fitoconstituintes na descoberta de novos agentes anticâncer.
A atividade antitumoral de plantas do gênero Vernonia é relatada na literatura,
onde as substâncias isoladas lactonas sesquiterpênicas glaucolida 2 e hirsutinolida 4
82
demonstraram significativa atividade citotóxica in vitro sobre células HeLa (BIAVATTI
et al., 2010). Ngeh e colaboradores (2012) demonstraram que a fração
diclorometano, extratos e compostos isolados de tubérculos de Vernonia guineensis
Benth apresentaram atividade antitumoral em células de câncer de próstata,
sugerindo seu uso como um importante agente antineoplásico.
Nosso trabalho avaliou inicialmente, a viabilidade de células de diferentes
linhagens após a incubação com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona.
Demonstrando que o tratamento com a substância, nas concentrações de 0,054 a
543 µM, foi capaz de reduzir a viabilidade de B16F10 nos diferentes tempos de
incubação (24, 48 e 72 h). Os resultados de citotoxicidade foram comparados aos
obtidos com o Paclitaxel (100µM), quimioterápico utilizado como controle positivo,
apresentando citotoxicidade semelhante.
Com o objetivo de complementar os dados obtidos com a linhagem celular
B16F10, foram realizados ensaio de viabilidade celular utilizando linhagens de
tumores sólidos PC3, LNCAP, H1299, OVCAR, NCI, T84, MCF-7, U138MG, VW473,
HELA, HOS e MG63 expostas por 24 h com o composto poliacetileno, células
leucêmicas K562, KG1, HL60, NB4, RAMOS, RAJI, RS4, JURKAT, MOLT4, NALM6,
B15 e U937 expostas por 48h com o composto e células mononucleares humanas
CMNH. Nosso resultados demonstram mais uma vez atividade citotóxica do
poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona em linhagens de tumores sólidos e
leucêmicas.
Durante os últimos 25 anos, mudanças substanciais têm ocorrido na área de
biossíntese de produtos naturais acetilênicos. A expansiva triagem liderada pelo
Instituto Nacional do Câncer revigorou a descoberta de novos compostos. Mais de
2000 poliacetilenos são conhecidos, com mais de 1100 da família Asteraceae
(MINTO et al., 2008). Dados anteriores demonstraram atividade antitumoral e
genotóxica deste poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, caracterizada por
morte celular apoptótica envolvendo um mecanismo dependente de caspase 3
(BUSKUHL et al., 2009).
Pellati et al., (2006), relataram a característica hidrofóbica aos poliacetilenos
isolados de Echinacea pallida, testados em células de adenocarcinoma pancreático
humano (PaCa2). Os resultados demostraram que os poliacetilenos mais
hidrofóbicos tiveram atividade citotóxica moderada comparado aos outros compostos
hidroxilados. Purup et al. (2009), relatam que o falcarinol e falcarindiol, poliacetilenos
83
isolados da cenoura (Daucus carota) apresentaram atividade citotóxica significativa
sobre células de câncer intestinal humano Caco-2. Segundo os autores, a
bioatividade do Falcarinol se deve, provavelmente,a sua característica hidrofóbica
(CHRISTENSEN et al., 2006).
É digno de nota que, apesar da marcante atividade citotóxica apresentada
pelo poliacetileno, quando incubados com diferentes linhagens de células
neoplásicas, o mesmo apresentou baixa citotoxicidade quando adicionado às células
mononucleares humanas (CMNH). O fármaco antineoplásico Paclitaxel, utilizado
como controle positivo nos experimentos in vitro, é um fármaco com propriedade
hidrofóbica com capacidade de auto-agregação e consequente precipitação
dependendo do meio e da concentração utilizados (BALASUBRAMANIAN;
ALDERFER, 1994).
O mecanismo de ação desses medicamentos é único. Os taxanos impedem a
ocorrência da mitose pela interferência no funcionamento normal dos microtúbulos.
Eles agem como agentes estabilizadores da tubulina, favorecendo a sua
polimerização, porém inibindo a despolimerização dos microtúbulos, levando à morte
das células cancerosas (MALONGA et al., 2005). Já foi descrito na literatura
inúmeros efeitos tóxicos do Paclitaxel, dentre eles mielosupressão e neurotoxicidade
periférica dando origem a quadros de dor neuropática (NIETO e VAUGHAN, 2004).
Outra classe importante de medicamentos utilizados no tratamento do câncer
compreende os antibióticos do grupo das antraciclinas, são compostos considerados
importantes no tratamento do câncer, com atividade tanto em tumores sólidos como
em neoplasias hematológicas. A Daunorubicina e a Doxorubicina estão entre os
principais fármacos aprovados para uso pelo FDA (LOFTI; ZACKRISSON et al.,
2002).
A Daunorrubicina (DNR) é um quimioterapêutico que foi desenvolvido como
aplicação clínica no tratamento da leucemia, tornou-se uma das mais eficazes
drogas anti-câncer (JOHNSON et al., 1998; LÖWENBERG et al., 2009). No entanto,
como outros tipos de agentes quimioterápicos, a resistência das células neoplásicas
a terapia continua a ser um importante obstáculo para o sucesso do tratamento de
leucemia, limitando assim seu uso clínico. A resistência às drogas é considerado ser
um
fenômeno multifatorial que envolve vários mecanismos importantes, como
reparação de danos aumentado do DNA,
apoptose reduzida, alterações no
metabolismo do fármaco, e aumento da energia de efluxo dependente do fármaco,
84
bem como alterações na expressão da glutationa transferase II e topoisomerase
(MCLORNAN et al., 2007; MICHAEL et al., 2008). A Doxorrubicina é considerada o
principal antibiótico antineoplásico deste grupo. Sua atividade citotóxica acontece
através da ligação ao DNA assim inibindo tanto a síntese de DNA, quanto a de RNA,
porém sua principal ação é mediada por um efeito na topoisomerase II, cuja
atividade é muito intensa em células em proliferação (RANG et al., 2007).
Semelhante ao Paclitaxel, os fármacos do grupo das antraciclinas, como a
Daunorrubicina e a Doxorrubicina apresentam manifestações tóxicas preocupantes,
ocasionando obstáculos para seu uso. Dentre as complicações estão a
mielosupressão e a toxicidade cardíaca, hepática, renal e neuronal limitando
consideravelmente a janela terapêutica destes fármacos (DEVITA; HELLMAN et al.,
2005).
Os dados de citotoxicidade foram confirmados através da utilização dos
corantes brometo de etídeo e o diacetato de fluoresceína. Como mencionado
anteriormente, o corante diacetato de fluoresceína é metabolizado por ação de
estearases citoplasmáticas, assim torna-se concentrado no interior das células, na
forma de fluoresceína, emitindo fluorescência esverdeada em células viáveis,
enquanto que as células que apresentam núcleos corados de vermelho-alaranjado
estão mortas por permitirem que o brometo de etídeo se intercale no DNA exposto.
Existem diversos mecanismos que estão envolvidos na evolução de uma
célula normal para uma célula maligna (HANAHAN; WEINBERG, 2000), mas a maior
parte deles interfere na divisão celular. Oncogenes são derivados a partir de versões
mutadas de genes celulares normais, os chamados proto-oncogenes, que
ocasionam a proliferação descontrolada, sobrevivência e disseminação celular. Em
células normais, a expressão de proto-oncogenes está muito bem regulada evitando
o crescimento descontrolado de células (HARRINGTON, 2011). Assim, muitos
fármacos eficazes contra o câncer exercem sua ação sobre as células que se
encontram no ciclo celular, ou seja, aquelas que estão em multiplicação constante,
são denomindos fármacos ciclo celular específicos.
Os produtos naturais ciclo-celular específicos são muito utilizados na terapia
clínica oncológica, dentre eles está o Paclitaxel com o mecanismo de ação
detalhado anteriormente (SALMONM, 1998; OLIVEIRA et al., 2002). Com base nos
dados observados nos testes de viabilidade celular, a substância poliacetileno
apresenta característica semelhante ao Paclitaxel quanto a sua atividade citotóxica,
85
pressupondo que o poliacetileno seja um produto natural ciclo celular específico, já
que em células mononucleares humanas sua ação citotóxica não foi significativa.
A capacidade de agentes antitumorais de inviabilizar células tumorais, com o
mínimo de danos em células não tumorais, é o objetivo da procura por novas
moléculas com propriedades antineoplásicas. Com isto, o conhecimento do
mecanismo de morte celular do poliacetileno fez-se importante, possibilitando
entender melhor a ação deste composto frente a células tumorais, bem como a
etiologia do câncer.
Para avaliar o tipo de morte celular induzida pelo poliacetileno 5-octa-2,4,6triinil-furan-2(5H)-ona, as células B16F10 foram incubadas com brometo de etídeo e
alaranjado de acridina. Esta metodologia, como mencionado anteriormente, permite
diferenciar células viáveis daquelas em processo de morte por apoptose ou necrose,
através da diferença de coloração por fluorescência. O corante alaranjado de
acridina intercala-se ao DNA, dando cor verde ao núcleo da célula, este corante é
capaz de atravessar membranas intactas. Já o brometo de etídeo é incorporado
predominantemente por células não viáveis, que possuem membranas instáveis,
assim o corante intercala-se ao DNA e o cora de laranja, ligando-se fracamente ao
RNA, que se mostrará com uma coloração vermelha. As células que estiverem
viáveis apresentando membrana intacta terão seu núcleo corado de verde pelo
alaranjado de acridina. Como o brometo de etídeo não ultrapassa membranas
celulares íntegras, estas células não são coradas, ou coradas fracamente. Pode-se
também avaliar células em apoptose inicial, a membrana ainda intacta, apresentam
manchas verdes brilhantes no núcleo, devido a condensação da cromatina, não
sendo coradas pelo brometo de etídeo. Já as células em necrose, que apresentam
ruptura de membrana mostram coloração laranja-avermelhada uniforme (VERMES
et al., 2000).
Os resultados obtidos apontam a apoptose como sendo a principal via de
morte celular induzida pelo poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, uma vez
que através da microscopia de fluorescência pode-se identificar as características de
células em processo de morte celular apoptótica, como fragmentação do DNA,
condensação de cromatina e presença de corpos apoptótico. Além da análise
quantitativa que através da porcentagem de células viáveis, em apoptose ou
necrose,
mostraram
que
a
substância
poliacetileno
tem
sua
ação
predominantemente por via apoptótica. Para fins de comparação utilizou-se o
86
fármaco Paclitaxel como controle positivo, que da mesma forma apresentou maior
índice de morte celular pelo mecanismo de apoptose. A necrose que também foi
evidenciada nas células em contato com o poliacetileno pode ser responsável por
um pequeno processo inflamatório, o que não seria ruim, pois seriam recrutadas
células de reparo como descrito por Dalazen et al., (2005).
Em estudos anteriores realizados por Buskhul et al., (2009) foi demonstrado
que o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona induziu morte celular tanto por
via apoptótica quanto necrótica, quando incubado com células de linhagem B16F10
e Hela, utilizando Anexina V-FITC. Estes resultados corrobam com nossos achados,
sugerindo uma associação de necrose e processo apoptótico. Porém, as células
necróticas totalizavam menos que 25% das células totais indicando um predomínio
de morte celular por apoptose.
Corroborando com nossos resultados, Ryan e Whelan (2004) investigaram os
efeitos do poliacetileno Capillin isolado da Artemisia monosperma, frente a quatro
linhagens humanas tumorais HT29 (carcinoma de cólon), PaCa-2 (carcinoma
pancreático), HEp-2 (carcinoma epidermóide de laringe) e A549 (carcinoma de
pulmão). O mesmo foi capaz de inibir a proliferação celular das linhagens celulares
citadas acima de forma dose e tempo dependente, apresentando morte celular por
via apoptótica e fragmentação nuclear também dose e tempo dependente
confirmada por análise em citômetro de fluxo, acumulando as células nas fases S (
síntese de DNA) e G2/M (mitose e divisão) do ciclo celular.
Outro estudo realizado por Park e colaboradores (2006), com o poliacetileno
dideoxypetrosynol A isolado da esponja marinha Petrosia sp, demonstrou que o
composto foi capaz de manter as células de leucemia monocítica humana em
transição da fase G1 para a fase S do ciclo celular. Sugeriu-se ainda o envolvimento
das proteínas p16 e pRB na ação deste composto.
Os nossos resultados até então apresentados, em conjunto com dados da
literatura, sugerem que poliacetilenos possivelmente induzem a apoptose em células
tumorais de melanoma. O balanço entre a divisão celular e a morte celular é
importante para o desenvolvimento e manutenção de organismos multicelulares. A
desregulação neste balanço pode levar a condições patológicas, como o câncer
(HOTCHKISS et al., 2009).
A apoptose é um processo específico de morte celular programada através da
ativação de uma via intracelular conservada evolutiva, levando a alterações celulares
87
distintas morfologicamente e bioquimicamente da necrose celular. Sendo essencial
na homeostase de tecidos normais, especialmente as do trato gastrointestinal,
sistema imunológico e da pele. Existem evidências crescentes de que os processos
de transformação neoplásica, progressão e metástase envolvem alterações nas vias
normais de apoptose. Além disso, a maioria dos agentes quimioterapêuticos, bem
como a radiação utilizam a via apoptótica para induzir a morte celular. A resistência
à quimioterapia também parece ser determinada por alterações nas vias apoptóticas
das células cancerosas. Desta forma, compreender os sinais de apoptose o
mecanismo de apoptose pode permitir o desenvolvimento de um melhor agente
terapêutico para o tratamento do câncer (KROEMER et al., 2009; FULDA et al.,
2010).
As vias da apoptose representam os dois processos muito estudados. A via
extrínseca da apoptose é iniciada após a ligação extracelular de receptores
localizados na superfície celular, denominados DR (death receptors) com seus
ligantes específicos, como o membro da superfamília do fator de necrose tumoral
(TNF) que se acopla a um receptor da família dos receptores de morte
correspondente, a ativação destes receptores de morte recrutam e ativam as
caspases iniciadoras como as caspases 8 e 10. Este processo envolve a formação e
ativação do complexo DISC, levando a ativação dos efetores de caspases, como a
caspase 3. (VANDENABEELE et al., 2009; WHELAN et al., 2010).
A via mitocondrial ou intrínseca regulada pela mitocôndria, inicia-se pela ação
de diversos sinais de estresse intracelular, tais como irradiação, agentes
quimioterápicos, vírus, bactérias e ausência de fatores de crescimento celular, os
quais convergem para a mitocôndria com a formação do apoptossoma. O
apoptossoma ativa as caspases iniciadoras, caspase 9 tipicamente, a qual ativa a
caspase 3. As quais são responsáveis pela iniciação, execução e regulação do
processo apoptótico. Envolvidas num mecanismo de clivagem específica de
proteínas as caspases levam ao colapso da infra-estrutura celular através da
desintegração do citoesqueleto, desarranjo metabólico e fragmentação genômica.
Seus principais alvos são as proteínas estruturais e de funções essenciais como
proteínas requeridas no reparo do DNA (DNA-PK, PARP), proteínas reguladoras do
ciclo celular (Cdc27, Rb), proteínas envolvidas em patologias humanas e proteínas
diretamente envolvidas na regulação da apoptose (ICAD, Bid), assim como
88
reguladoras/mediadoras da sinalização apoptótica (PKB/Akt, RIP quinase (kÖHLER
et al., 2002, GHOBRIAL et al., 2005).
Dando continuidade ao estudo, foi realizada a avaliação da atividade
apoptótica pela via da caspase executora 3. As modificações morfológicas que
ocorrem na célula em apoptose são promovidas por uma família de cisteína
proteases denominadas caspases. A família de genes da caspase consiste de 15
membros que são agrupadas em duas grandes sub-famílias, nomeadamente
caspases inflamatórias e caspases apoptóticas.
As caspases formam um sistema de cascata que desempenha o papel central
na indução, transdução e amplificação de sinais intracelulares apoptóticos para
determinação do destino celular, regulação da imunidade, proliferação celular e de
diferenciação (BHAT et al., 2008).
O aumento da caspase 3 nas células tumorais B16F10, após exposição ao
poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona por um período de 6 h, mostra
novamente que a morte celular acontece por via apoptótica e que possivelmente
envolva a via mitocondrial ou intrínseca ( evidenciada pela ativação da enzima
caspase 3). Não foram encontrados dados significativos com períodos de incubação
de 12 e 24 horas. Considerando que nesta via um dos principais alvos das caspases
são as proteínas reguladoras do ciclo celular, como já mencionado anteriormente, o
poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona pode ser um candidato fitofármaco
antineoplásico ciclo celular específico.
Dados da literatura confirmam que muitos fármacos quimioterápicos clássicos,
como a cisplatina, taxol, etoposídeo e doxorubicina ocasionam através da via
intrínseca da morte celular apoptótica, uma forma dependente de p53, por exemplo,
através da ativação de uma resposta aos danos no DNA. A ativação da proteína p53
pode promover a parada do ciclo celular e induzir a célula à apoptose (VOUSDEN;
LANE, 2007).
Nossos resultados são similares aos apresentados por Choi et al. (2006),
onde foram quantificadas as caspases 3 e 9 na presença de um poliacetileno isolado
de Petrosla sp, em células de melanoma humano (SK-MEL-2) nas concentrações
de 5 e 10 µM por um período de 24 horas. O método de quantificação das caspases
foi semelhante ao utilizado neste trabalho, ou seja, quantificação da p-nitroanilina (pNa). O poliacetileno na concentração de 5µM obteve pequeno aumento na caspase
3, sendo semelhante aos aqui obtidos com a concentração de 5,4µM,porém em
89
tempo de 6 horas, mas na concentração de 54µM a atividade de caspase 3 se torna
duas vezes mais potente comparada a concentração inferior, sugerindo resposta
dose dependente.
Ativação de caspases iniciadoras geralmente envolve o recrutamento
de várias enzimas homólogas para uma molécula adaptadora, as caspases
iniciadoras são ativadas por dimerização do zimógeno por uma proteína adaptadora,
liberando assim o sítio catalítico da enzima. Em seguida, a cascata proteolítica
propaga o sinal de morte e enzimas efetoras clivam uma série de proteínas (SLEE et
al., 1999). Estas são as responsáveis pelo englobamento das células durante a
apoptose, através da proteólise, posteriormente a externalização de fosfolipídeos, na
condensação e fragmentação nuclear bem como na alteração do citoesqueleto.
A importância das caspases para o mecanismo de morte celular apoptótico
para alguns autores é considerada como a característica mais importante para a
definição de morte celular por apoptose (KROEMER et al., 2005). Todos os agentes
antineoplásicos podem induzir a apoptosee ativar caspases nas células tumorais.Por
exemplo, em células U937 humanas células leucêmicas, a caspase-3 e caspase-6
desempenham um papel central na apoptose desencadeada por inibidores de
topoisomerase. (SORDETet al,1999). A caspase-3 é considerada necessária para
algumas características típicas de apoptose, tais como a fragmentação do DNA,
blebbing de membrana e outras mudanças morfológicas e bioquímicas (SAHARA et
al, 1999).
Para melhor entendimento da ação antitumoral do poliacetileno 5-octa-2,4,6triinil-furan-2(5H)-ona, foram realizados ensaios in vivo. Muitos modelos para o
estudo da neoplasia melanoma estão disponíveis. Os modelos murinos são
utilizados para melhor entender o câncer e o seu desenvolvimento, constituindo
importantes ferramentas experimentais, atribuindo uma melhor conpreensão de
novas drogas e novas estratégias fornecendo inúmeras possibilidades para o
tratamento antineoplásico ( NAKAMURA et al., 2002).
As células da linhagem
B16F10, após serem inoculadas em camundongos C57BL/6, além de crescerem
espontaneamente possuem a habilidade de formar metástases (NAKAMURA et al.,
2002). Apesar da análise tumoral in vivo ser complexa, algumas diferenças são
visíveis
macroscopicamente,
como
a
redução
do
tumor,
a
melhora
do
comportamento e estado físico do animal, peso corporal entre outros. No entanto, os
90
tumores possuem um microambiente bastante complexo e de grande importância
para o seu desenvolvimento e progressão ou regressão (CONTENTE, 2010).
A ação antineoplásica do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona foi
avaliada em modelo de tumor sólido e metástase pulmonar em camundongos
C57BL/6. A atividade antitumoral desta substância nas doses de 5,43 e 54,34
µmol/kg,
administrado
por
via
intraperitoneal,
apresentou
inibição
do
desenvolvimento do tumor sólido em camundongos, com redução de 65 a 80% da
massa tumoral, sugerindo uma importante atividade antineoplásica. Os animais
foram acompanhados quanto ao peso corporal, bem como, em relação ao peso de
vários órgãos.
A evolução tumoral nos diferentes grupos foi visivelmente distinta. Não
apenas em relação a massa tumoral e a sobrevida, mas também em relação ao
aspecto físico dos animais. Os animais do grupo controle inoculados com células
B16F10 mostraram-se mais debilitados, e com perda de pelo. No entanto, não foi
observada diferença significativa sobre a porcentagem do peso dos animais, bem
como do fígado em relação ao controle negativo sem tumor e com tumor. Pode-se
observar redução significativa do peso dos corações do grupo controle com tumor
quando comparado com o controle sem tumor e os grupos tratados.
Pode-se observar, em relação ao peso dos baços, aumento significativo no
grupo tratado com a maior dose do poliacetileno, quando comparado ao controle
com tumor. O sistema imune é uma rede de células e órgãos que trabalham juntos
com a principal função de monitorar os tecidos mantendo a homeostase, assim
protegendo contra a invasão de patógenos infecciosos e para eliminar células
danificadas (VISSER et al., 2006). Por exemplo, o baço serve como um reservatório
para o sangue, filtrando e purificando o sangue e a linfa que fluem através dele. O
baço sofrendo qualquer dano, o indivíduo tem mais probabilidades a infeccções (YU
et al., 2007).
Analisando o peso dos rins pode-se observar que o grupo que recebeu
tratamento com o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona na maior dose
apresentou diferença significativa quando comparado ao grupo negativo com tumor.
Entretanto, o grupo controle com tumor apresentou uma diminuição da porcentagem
do peso dos rins quando comparados com o grupo controle sem tumor. É possível
sugerir que tais alterações possam ser ocasionadas devido ao tratamento com a
substância, sendo que alteração renal é um dos efeitos adversos da quimioterapia
91
convencional, porém para poder sugerir uma possível causa destas diferenças de
porcentagens nos pesos dos rins, é necessários estudos mais detalhados e
específicos.
No modelo de indução de metástases pulmonares, foi observado redução de
nódulos metastáticos durante a necropsia os grupos tratados com o composto
poliacetileno na menor e maior doses, respectivamente, uma significante redução do
número de nódulos metastáticos nos pulmões comparado com o controle. No
entanto, podemos observar que ocorreu uma redução da atividade antineoplásica do
poliacetileno na maior dose. Estes dados podem ser relacionados com a dificuldade
encontrada na terapia antineoplásica de encontrar uma resposta eficaz para o
tratamento de metástases. Sendo que o melanoma é uma das formas mais
agressivas de câncer, e muito resistente aos tratamentos baseados em drogas que
agem sobre o DNA, microtúbulos e as topoisomerases (CHEN et al., 2006).
Para a maioria dos cânceres metastáticos a única opção baseia-se em
tratamentos sistêmicos com uso de terapia quimioterápica, é muitas vezes a única
opção para retardar o crescimento do tumor ou para aliviar a morbidade associada à
metástase (SETHI e KANG, 2011).
Levando-se em consideração os resultados in vitro e in vivo até então
apresentados, pode-se sugerir que o poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona
apresenta importante atividade anticâncer, possivelmente através da indução da
apoptose de células neoplásicas através da indução da enzima caspase-3.
Outros dados somam a este estudo informações importantes. A avaliação da
atividade exploratória avaliada através do modelo de campo aberto (Open Field).
Nosso resultados demonstram que a indução de tumor sólido pelas células B16F10
reduziu de forma significativa o número de cruzamentos no modelo apresentado em
relação ao grupo controle negativo sem tumor. Este resultado evidencia sinais de
prostação, comuns em pacientes com neoplasias em estágios avançados (INCA,
2012).
A administração sistêmica do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona,
na dose 5,43 µmol/kg, promoveu um aumento do número de cruzamentos, quando
comparado ao grupo controle com tumor, sugerindo uma melhora na atividade
exploratória dos animais. Já os animais tratados com a dose de 54,34 µmol/kg do
composto não apresentaram diferença significativa quando comparado ao grupo
controle com tumor. A indução de metástases pulmonar não alterou de forma
92
significativa o número de cruzamentos nas doses utilizadas em relação ao grupo
controle com tumor.
Outro parâmetro importante avaliado foi à sensibilidade mecânica dos
animais submetidos ao modelo de metástase pulmonar. A dor é um dos sintomas
mais comuns em pacientes com câncer ocorrendo em 90% dos pacientes durante a
doença. A dor é considerada um fenômeno complexo, que pode ser exacerbada por
inúmeros outros fatores. Considera-se que se a dor for controlada corretamente 80%
dos pacientes conseguem melhorar a qualidade de vida. Portanto, 20% destes
pacientes com dor do câncer tem dificuldade para controlar está dor. O controle da
dor do câncer é alcançado com ótimos resultados
através da integração de
analgésicos durante o tratamento ou outro adjuvante que seja necessário (LAIRD et
al., 2008).
As neuropatias periféricas são efeitos colaterais comuns dos medicamentos
quimioterápicos, incluindo taxanos, fármacos baseadas em platina, alcalóides da
vinca, e talidomida. Os sintomas mais comuns são dormência, formigamento e / ou
dor em queimação. Em casos mais grave de neuropatias requer redução da dose,
uma mudança na quimioterapia , ou cessar a quimioterapia. Não há intervenções de
eficácia comprovada para prevenir ou tratar a neuropática induzida por quimioterapia
(AMI et al., 2012). Um terço dos pacientes com câncer metastático sofrem de dor e
60 a 90% dos pacientes com câncer avançado tem dor (LEVY, 1996). O câncer é
associado frequentemente com dor crônica, também é ocasionalmente associado a
episódios prolongados de dor excruciante (dor do câncer emergencial) que requere
uma aplicação rápida de poderosas estratégias analgésicas (HAGEN et al., 1997).
De modo surpreendente, ambas as doses utilizadas (5,43 e 54,34 µmol/kg,
i.p) do poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona, foram capazes de reduzir
significativamente a sensibilização mecânica, quando comparado com o grupo de
controle negativo inoculado com B16F10. Diante destes resultados pode-se sugerir
dois mecanimos importantes. Primeiramente podemos enfatizar a ação analgésica
do composto frente à dor induzida por metástase. Entretanto, quando avalia-se os
principais efeitos tóxicos das terapias antineoplásicas convencionais, observa-se o
surgimento de neuropatias periférias (LEVY, 1996). O composto em questão, além
de promover redução do tumor e metástase, reduziu a sensibilização induzida pelas
células tumorais. Cabe ressaltar que a ação anti-nociceptiva deste composto foi
avaliada em diferentes modelos de dor inflamatória (dados não apresentados neste
93
estudo), porém nenhuma atividade foi observada, sugerindo que esta ação antinociceptiva citada acima seja decorrente da sua atividade anti-neoplásica.
Por
fim,
na
tentativa
de
buscarmos
outras
informações
sobre
o
comportamento da substância poliacetileno in vivo, foi proposto um estudo de
toxicidade aguda. No entanto, a maioria dos agentes antineoplásicos atua de forma
não-específica, ou seja, lesando tanto as células neoplásicas quanto as normais,
principalmente as células que possuem um crescimento rápido como as
gastrointestinais, capilares e as do sistema imunológico, explicando os efeitos
colaterais da quimioterapia (MURAD et al., 1996).
O fígado é considerado o órgão de detoxificação, e os rins como o órgão
excretor mais importante, assim ambos são vulneráveis perante a fármacos
quimioterápicos, como disfunções hepáticas ocasionadas pela mitramicina e a
toxicidade renal causada pelo fármaco docetaxel (SALMONM, 1998).
Assim os animais receberam tratamento com a substância nas doses de 5,43
e 54,34 µmol/kg; i.p durante 12 dias. Os animais foram avaliados quanto a
alterações no peso corporal, os resultados sugeriram que, não houve redução ou
ganhos de peso corporal significativa comparando os pesos inicias e finais dos
animais. Os órgãos analisados fígado, rim e baço não apresentaram nenhuma
alteração significativa. Nenhuma alteração foi observada quando a atividade
locomotora destes animais foi avaliada.
Os resultados obtidos até o momento são considerados promissores. Foi
possível estabelecer modelos básicos de experimentação e documentar fatos
importantes como estudo de influência tumoral, metástase pulmonar, avaliação de
peso corporal e órgãos e toxicidade aguda do composto poliacetileno 5-octa-2,4,6triinil-furan-2(5H)-ona. O estudo mostrou que o tratamento com o poliacetileno é
efetivo no combate as células tumorais, menos tóxico e bem tolerado.
Sendo assim, nossos resultados sugerem que a substância isolado da
planta Vernonia scorpioides o poliacetileno, pode ser considerado uma molécula
promissora com potencial ação antineoplásica, podendo servir de molécula base
para modificações químicas, que podem aumentar seu efeito citotóxico utilizando
como via de morte o processo apoptótico.
94
7. Conclusão
Este trabalho nos permite concluir que o composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinilfuran-2(5H)-ona isolado de Vernonia scorpioides
 Apresenta capacidade antiproliferativa significativa contra células leucêmicas,
de tumor sólido, células de melanoma murino B16F10
utilizando como
análise os ensaios colorimétricos com MTT e XTT;
 O composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona é semelhante ao
Paclitaxel quanto a sua atividade citotóxica;
 A apoptose pode ser a principal via de morte celular após incubação com
Poliacetileno;
 Também pode ser evidenciado que a atividade citotóxica é moderadamente
reduzida na presença do inibidor de caspase;
 O
poliacetileno
5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona
mostrou
atividade
antineoplásica frente ao modelo de tumor sólido, reduzindo de forma
significativa a massa tumoral e o volume tumoral;
 No modelo de metástase pulmonar o composto reduziu significativamente os
nódulos metastáticos;
 Conclui-se também que o composto poliacetileno 5-octa-2,4,6-triinil-furan2(5H)-ona não apresentou efeitos tóxicos significativos quando administrado
por 12 dias de tratamento nos animais. Mantendo o peso corporal, e órgãos
como o fígado, baço e rins sem alterações macroscopicamente visíveis;
Considerando os promissores resultados apresentados neste trabalho pelo
composto
poliacetileno
5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona,
é
de
interesse
a
continuidade dos estudos com a pesquisa, avaliando de forma mais detalhada
mecanismos de morte celular envolvendo outras caspases iniciais, bem como o
envolvimento de outras proteínas no processo apoptótico como a p53, além de
estudo in vivo buscando análises bioquímicas de mediadores inflamatórios utilizando
de forma mais complexa as ferramentas de biologia molecular.
Em conclusão, embora não seja possível apresentar um mecanismo exato da
substância
poliacetileno
5-octa-2,4,6-triinil-furan-2(5H)-ona,
os nossos
dados
sugerem que sua ação antineoplásica está associada a indução de morte celular por
95
apoptose. Outros estudos são importantes para detalhar este efeito em nível
molecular.
96
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ZONG, W.X.; THOMPSON, C, B. Necrotic death as a cell fate. Genes & Development. v.20, p.1-15,
2006.
Apêndices
109
Apêndice A
Análise morfológica das células
110
Figura 1. Efeitos do composto poliacetileno obtido de V. scorpioides, na morfologia das células de
melanoma murino B16F10. As células foram mantidas durante 24 horas a 37ºC/5% de CO2, utilizando
como controle negativo meio MEM com solvente (G) e controle positivo Paclitaxel a 100μM (F) e as
respectivas concentrações de 0,0543 μM (A); 0,54 μM (B); 5,4 μM (C); 54 μM (D); 543 μM (E).
Excitação BP480-550nm, Filtro BA590nm, com aumento de 400X.
111
Apêndice B
Análise morfológica das células
Figura 2. Efeitos do composto Poliacetileno obtido de V. scorpioides, na morfologia das células de
melanoma murino B16F10. As células foram mantidas durante 48 horas a 37ºC/5% de CO2, utilizando
como controle negativo meio MEM com solvente (G) e controle positivo Paclitaxel a 100 μM (F) e as
respectivas concentrações de 0,0543 μM (A); 0,54 μM (B); 5,4 μM (C); 54 μM (D); 543 μM (E).
Excitação BP480-550nm, Filtro BA590nm, com aumento de 400X.