Apresentação do PowerPoint
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10 SEMINÁRIO REGIONAL SOBRE LEISHMANIOSE VISCERAL FLORIANÓPOLIS-SC Diagnostico da leishmaniose visceral humana José Angelo Lauletta Lindoso Instituto de Infectologia Emílio Ribas-SES-SP Laboratório de Soroepidemiologia-LIM38 HC-FMUSP Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo 90% dos casos: Brasil, Etiopia, Nepal, Índia, Sudão e Bangladesh Urbanização da LV no Brasil Harhay et al. Trends in Parasitology 2011 Distribuição de municípios do Estado de São Paulo segundo classificação epidemiológica para leishmaniose visceral americana. Dezembro/2012. Classificação dos municípios quanto a área de transmissão de LVA, ESP, 2010 a 2012 Sem transmissão Esporádica Moderada Intensa Situação geográfica, magnitude e transcendência Mundo Américas Brasil 76 países com casos registrados 11 países com casos registrados 5 Regiões e 21 Unidades Federadas com casos registrados Países prioritários: Índia, Bangladesh, Sudão, Sul de Sudão, Brasil e Etiópia Países prioritários: Brasil, Paraguai, Argentina e Colômbia Regiões prioritárias: Nordeste, Norte e Sudeste Casos esporádicos: Nicarágua, Venezuela, Honduras, Costa Rica, Bolívia Média casos/ano: 0,2 a 0,4 milhões Média de casos registrados ao ano: 3.500 Estimativa de casos: 4.500-6.800 casos/ano (Alvar, 2012) 20.000 a 40.000 mortes/ano Letalidade: 7% Média de casos registrados ao ano: 3.383 Estimativa de casos: 4200-6300 casos/ano (Alvar, 2012) Letalidade: 6,9% Leishmaniose Visceral DOENÇA MULTIFATORIAL Agente Etiológico Vetor Reservatório Hospedeiro susceptível Alterações Geográficas Fatores físicos humanos ou sociais biológicos Imunopatogenia das Leishmanioses Interação Parasito Intracelular Resposta imunológica celular e humoral do hospedeiro Espectro clínico da doença FATORES DETERMINANTES DA INFECÇÃO PARASITA TAMANHO DO INÓCULO FASE DE METACICLOGÊNESE Fase de Metaciclogênese (crescimento lento) 0 5 dias METACICLOGÊNESE VETOR Maturação Expressão de moléculas na sua superfície LPG GP63 SUBSTÂNCIAS NA SALIVA HOSPEDEIRO MAXADILAN FATOR GENÉTICO FATORES IMUNES R. Inata R. Adquirida Leishmaniose Vetor Pele Hospedeiro Órgãos Diferenciação Macrófago Progressão da doença Promastigotas.........Amastigotas Infecção PMN Inespecífica Eo IGF-I oxLDL complemento Mf GM-CSF TGFb TNFa IL-10 NK IL-12 IFNg IFNg IFNg IL-2 TNFa IL-3 CD8+ IL-10 IL-4 CD4+ TH1 CD4+ TH2 Específica Aspectos imunopatogênicos da leishmaniose visceral Órgãos alvo 1 Infecção de células do sistema reticulo endotelial 2 Linfonodos Fígado Medula óssea 3 Comprometimento da medula óssea e desvio na produção de outros tipos celulares 4 Baço Hemácias 7 Triade clássica Febre Emagrecimento Hepatoesplenomegalia 5 Monócitos Diminuição na produção dos progenitores dos linfócitos T Plaquetas Neutrófilos Alterações laboratoriais: Anemia Plaquetopenia Neutropenia Linfopenia 6 Comprometimento do sistema imune 1 2 Ativação imune sistêmica Imunossupressão específica a antígenos de Leishmania 4 Deficiência da imunidade efetora 3 Ativação policlonal células B Hipergamaglobulinemia Ativação policlonal células T 5 Teste de Montenegro negativo Elevados níveis de citocinas inflamatórias Diminuição de linfócitos T 6 7 Reversíveis após o tratamento 7 Síndrome inflamatória sistêmica Leishmaniose Visceral Assintomática Oligossintomática Clássica Sorologia + ++ ++++ Teste de Montenegro + + ou - - Hepatoesplenomegalia Ausente Discreta Volumosa FORMAS CLÍNICAS DA LEISHMANIOSE VISCERAL Clássica: 5 a 10% dos infectados por L.chagasi Subclínica ou Oligossintomática: sintomatologia leve. Facilmente confundidas com processos infecciosos de diversas etiologias. Progressão para a cura ou para a LV clássica. Assintomática: infectados sem evidência clínica. (Badaró et al, 1986) AI: asymptomatic infection=LST+/++++ and IFAT− SRI: subclinical resistant infection= LST+/++ and IFAT+/++ III: indeterminate initial infection=LST−and IFAT+/++ SI: symptomatic infection=LST− and IFAT+++/++++ SOI: subclinical oligosymptomatic infection=LST− and IFAT+++/++++ Crescente et al, AJTMH, 103, 2009 Perfil Clínico de LV Silveira et al SINAIS E SINTOMAS SINAIS E SINTOMAS FEBRE ESPLENOMEGALIA HEPATOMEGALIA LINFOADENOPATIA DIARRÉIA PALIDEZ ADINAMIA EPISTAXES PETÉQUIAS ICTERÍCIA FREQUENCIA 98-100% 98-100% 90-100% 30-50% 15-35% 35-70% 80-100% 15-30% 20% 5% Diagnóstico Laboratorial • Exames Inespecíficos: • Hemograma • Leucopenia • Anemia • Plaquetopenia • Eletroforese de proteínas • Hipergamaglobulinemia • Inversão da relação albumina/proteína Diagnóstico Laboratorial • Sorológico: • Elisa • IFI • Western blot • Parasitológico • Pesquisa direta • Cultura: Meio NNN • Inoculação em hamster • Molecular • PCR Diagnóstico da Leishmaniose Visceral • Critérios clínicos • Manifestações clínicas • Laboratoriais • Sorologia • IFI e ELISA • Pesquisa e cultura • Testes imunocromatográficos • rK 39 Diagnóstico de laboratório Exames específicos • Métodos diagnósticos disponíveis : - Métodos diretos: Exame parasitológico, cultura e PCR - Métodos indiretos: Teste Imunocromatográfico (Teste rápido), Imunofluorescência indireta (IFI) e ELISA Diagnóstico de laboratório Métodos diretos Permitem a visualização do parasito na amostra obtida do paciente e incluem: • A visualização de amastigotas no esfregaço de material obtido a partir de punção aspirativa. Foto: Costa, JML, CPq GM-Fiocruz, Brasil • A visualização de promastigotas em cultivos de material obtido na punção aspirativa Foto: Costa, JML, CPq GM-Fiocruz, Brasil • A detecção de material genético (ADN o ARN) do parasito por meio de técnicas como a Reação em Cadeia de Polimerase (PCR). Foto: Braz, LM, IMT-USP-SP, Brasil Métodos diretos Técnica: Punção aspirativa • Procedimento invasivo • Necessita de instalações adequadas e apoio para a realização de possíveis transfusão e cirurgia, se houver complicações relacionadas ao procedimento; • Requer habilidade e conhecimento técnico específico do médico • Sensibilidade variável, quando utilizado o exame parasitológico direto: • aspirado de baço: 93% a 99% • aspirado de medula óssea: 53% a 86% • aspirado de gânglio linfático: 53% a 65% ATENÇÃO: A cultura de Leishmania aumenta a sensibilidade do diagnóstico direto http://youtu.be/XwaiUBudFj4 Métodos diretos • A sensibilidade dos métodos diretos é variável e depende: • da experiência do analista e o tempo utilizado para a leitura da lâmina •da técnica utilizada para punção aspirativa e processamento da amostra •da condição imunológica do paciente • Tempo de resultado do diagnóstico • A realização do exame parasitológico direto é rápido e de amplo uso DEMONSTRAÇÃO DO PARASITO ATRAVÉS DE EXAME DIRETO DE AMOSTRAS DE MEDULA ÓSSEA. Solução fisiológica (salina), estéril e gentamicina Inoculação em animais Diagnóstico molecular • Gênero específico • kDNA • Espécie específico • mannose phosphate isomerase gene (MPI) • Distingue braziliensis, peruviana e guyanensis • cysteine proteinase B: PCR-RFLP • brazisliensis e não braziliensis • Gp 63: PCR-RFLP • G6PD • Hsp 70: PCR-RFLP Métodos diretos • Tempo de resultado do diagnóstico: • o PCR é rápido, com elevada sensibilidade e de acordo com os iniciadores usados, apresenta também elevada especificidade. É mais oneroso e requer uma estrutura laboratorial mais complexa. Foto: Martins, T. IMT-USP-SP Foto: Braz, LM. IMTUSP-SP • o cultivo requer pelo menos 30 dias para obter o resultado Foto: Kanashiro, EY. e Martins, T. IMT-USP-SP Métodos indiretos • Se baseiam na detecção de anticorpos específicos contra Leishmania. • As técnicas disponíveis são: • imunocromatografia - teste rápido – rK 39 • imunofluorescência indireta (IFI) valores ≥ 1:80 • ELISA (EIE) • Imunocromatografia (teste rápido): • detecta anticorpos contra o antígeno rK39 • é fácil de realizar, rápido e econômico • recomendado para diagnóstico precoce devendo estar disponível em todos os níveis de atenção • sensibilidade: 84,7% (79,7 – 88,7%) e 92,0% (87,8 – 94,8%) • especificidade: 96,8% (93,9 – 98,4%) e 95,6% (92,2 – 97,5%) •O teste rápido está validado para uso em soro. http://youtu.be/g1mIDwiYX4w DIRECT AGGLUTINATION TEST (DAT) • KIT Biomedical Research, Amsterdam, The Netherlands • • • • • Promastigotas de L. donovani Leishmania donovani, L. infantum or L. chagasi Não requer equipamento e treinamento Alta sensibilidade e especificidade Placas 96 poços fundo em V TESTE RÁPIDO PARA LEISHMANIOSE VISCERAL HUMANA (Kalazar Detect Rapid Teste – InBios) APRESENTAÇÃO: 50 TESTES E DOIS TAMPÕES OU 25 TESTES E UM TAMPÃO TESTE RÁPIDO PARA LEISHMANIOSE VISCERAL HUMANA (Kalazar Detect Rapid Teste – InBios) 20 µl soro 2 a 3 gotas de tampão (Chase Buffer) Linha controle TESTE NEGATIVO Linha teste (+) Linha controle TESTE POSITIVO Imunocromatografia (teste rápido): • Interpretação dos resultados de um teste rápido rK39. • Positivo: quando a linha do controle e a linha teste estiverem presentes, o teste é considerado reagente mesmo quando sua linha for levemente vermelha. • Negativo: quando apenas a linha do controle estiver presente. • Inválido: quando houver ausência da linha controle Funed: Representação Esquemática do resultado do teste rápido Teste rápido é um teste de diagnóstico fácil de utilização ao lado do paciente. Quando positivo, pela alta especificidade, permite definir o diagnóstico de LV. Porém, pela sua sensibilidade que não é elevada, não permite descartar o diagnóstico de LV. Métodos indiretos • Imunocromatografia (teste rápido): • O teste rápido está indicado para pacientes com suspeita clinica de leishmaniose visceral, de qualquer idade, proveniente de área endêmica e com os seguintes sinais e sintomas: • Febre de qualquer duração associada à esplenomegalia • Febre de qualquer duração associada à hepatomegalia • Febre de duração igual ou superior a 14 dias, associada a qualquer citopenia (anemia, leucopenia, plaquetopenia ou pancitopenia). • ELISA • detecta anticorpos anti-Leishmania • menor especificidade • a amostra é feita a partir da coleta de sangue, de onde se separa o soro e o plasma, que podem ser usados para detecção dos anticorpos • procedimento realizado em laboratório e processamento feito em espectrofotômetro a 492 nm. • a amostra é considerada positiva quando a densidade ótica é igual ou superior a densidade ótica média dos soros controles negativos mais dois desvios padrões Técnicas recomendadas para o diagnóstico de leishmaniose visceral para áreas endêmicas , segundo nível de sistema de saúde. Nivel de lo sistema de salud Técnicas de diagnóstico Centro de Atención Primaria Serológico: Antígeno rK39, detectado en prueba inmunocromatográfica Hospital Distrital o Regional Serológico: Antígeno rK39, detectado en prueba inmunocromatográfica o prueba de aglutinación directa * Parasitologico: Microscopía de aspiración en la médula ósea, los ganglios linfáticos o el bazo ** Hospital de Referencia (Atención terciaria) Serología : Antígeno rK39 detectado en prueba inmunocromatográfica, prueba de aglutinación directa, otro prueba serológica (por ejemplo, IFAT, ELISA) Parasitologico: Microscopía de las muestras de crema leucocitaria, médula ósea, ganglios linfáticos o bazo Cultivo o PCR Fuente: WHO TRS 949,2010 (*)Prueba de aglutinación directa se debe utilizar sólo si la adecuada supervisión y control de calidad (**) Aspiración del bazo debe ser realizado únicamente por personal médico experimentado y si las instalaciones para el tratamiento de las complicaciones hemorrágicas se encuentran disponibles. IMPORTANTE Em decorrência do aumento da coinfecção Leishmania/HIV nos últimos anos, recomenda-se oferecer o teste de HIV a todo paciente com diagnóstico de leishmaniose visceral, tendo em vista que esta pode manifestar-se como doença oportunista em pessoas imunodeprimidas. Projeto de pesquisa em andamento Validação do teste imunocromatográficos rk39 em humanos utilizando sangue total e exsudado de mucosa oral (saliva). Local Campo Grande Bauru Aracaju São Paulo Total LV 22 17 27 66 CS 2 0 2 4 Local CI 1 0 0 1 Campo Grande N=26 Bauru N=8 Tabela 2. Frequência de amostras positivas no teste rápido, em amostras de soro de pacientes de LV e controles, de acordo com o local de coleta LV – leishmaniose visceral, CS – controle sadio, CI – controle infectado As quatro amostras de controle saudáveis (CS) e uma de controle infectado (CI) reagiram fracamente (linha tênue). Aracaju N=18 Total N=52 Teste TR-ST TR-FO TR-SO TR-ST TR-FO TR-SO TR-ST TR-FO* TR-SO TR-ST TR-FO# TR-SO P% 96,15 84,62 92,31 100,0 62,50 100,0 83,33 68,75 77,78 92,31 76,00 88,46 IC 95% 81,11-99,32 66,57-93,85 75,86-97,86 67,56-100,0 30,57-86,32 67,56-100,0 60,78-94,16 44,00-85,84 54,79-91,00 81,83-96,97 62,59-85,70 77,03-94,60 Tabela 4. Positividade (%) e intervalos de confiança de 95% de probabilidade (IC 95%) do teste rápido em amostras soro de pacientes com LV, de acordo com o local de coleta Local Campo Grande N=14 Bauru N=8 Aracaju N=11 Total N=33 Teste DAT IFI P% 85,71 92,86 IC 95% 57,19-98,22 66,13-99,82 DAT IFI DAT IFI DAT IFI 100,00 87,50 100,00 100,00 93,94 93,94 63,06-100,0 47,35-99,68 71,51-100,0 71,51-100,0 79,77-99,26 79,77-99,26 Tabela 9. Positividade (%) com intervalos de confiança de 95% de probabilidade (IC 95%) do DAT e IFI em amostras de pacientes com LV Local Campo Grande N=5 Bauru N=2 Aracaju N=6 Total N=13 Teste DAT IFI DAT IFI DAT IFI DAT IFI P% 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 50,00 0,00 23,08 IC 95% 0,00-43,45 0,00-43,45 0,00-65,76 0,00-65,76 0,00-39,03 18,76-81,24 0,00-22,81 8,18-50,26 José Angelo Lauletta Lindoso • • Instituto de Infectologia Emílio Ribas – SES-SP • 3896-1236 Instituto de Medicina Tropical • 3061-7023 E-mail: [email protected]
