TOXICIDADE DE FISETINA E SEU MECANISMO DE - IPTSP

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
MAYSA PAULA DA COSTA REIS
Toxicidade de fisetina e seu mecanismo de ação sobre
leveduras do complexo Cryptococcus neoformans e
dermatófitos
Goiânia
2016
i
TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E
DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás
(UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações
(BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o
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1. Identificação do material bibliográfico:
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Autor (a):
Maysa Paula da Costa Reis
E-mail:
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[ X ]Sim
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Vínculo empregatício do autor
Agência de fomento:
Não
Coordenação de Aperfeiçoamento Sigla:
CAPES
de Pessoal de Nível Superior
País:
Brasil
UF:
DF
CNPJ:
00.889.834/0001-08
Título:
Toxicidade de fisetina e seu mecanismo de ação sobre leveduras do complexo
Cryptococcus neoformans e dermatófitos
Palavras-chave:
Toxicidade, mecanismo de ação, fisetina
Título em outra língua:
Fisetin toxicity and its mechanism of action about complex yeast
Cryptococcus neoformans and dermatophytes
Palavras-chave em outra língua:
toxicity, mechanism of action, fisetin
Área de concentração:
Microbiologia
Data defesa: (dd/mm/aaaa)
29/02/2016
Programa de Pós-Graduação:
Programa de Pós-Graduação de Medicina Tropical e Saúde
Pública
Orientador (a):
Dra. Maria do Rosário Rodrigues Silva
E-mail:
rosá[email protected]
Co-orientador (a):*
E-mail:
*Necessita do CPF quando não constar no SisPG
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_____________________________________
31/05/2016
Assinatura do (a) autor (a)
Data:
1
Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo
suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante
o período de embargo.
ii
MAYSA PAULA DA COSTA REIS
Toxicidade de fisetina e seu mecanismo de ação sobre
leveduras do complexo Cryptococcus neoformans e
dermatófitos
Tese de Doutorado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical e Saúde Pública da Universidade
Federal de Goiás para obtenção do Título
de Doutor em Medicina Tropical e Saúde
Pública.
Orientadora: Dra.
Rodrigues Silva
Maria
do
Rosário
Goiânia
2016
iii
iv
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública
da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO
Aluno (a): Maysa Paula da Costa Reis
Orientador (a): Maria do Rosário Rodrigues Silva
Co-orientador (a):
Membros:
1. Maria do Rosário Rodrigues Silva
2. Marcílio Sérgio Soares da Cunha Filho
3. Gisele Augusto Rodrigues de Oliveira
4. Joelma Abadia Marciano de Paula
5. Carolina Rodrigues Costa Carvalho
Data: 29/02/2016
v
“O que vale na vida não é o ponto
de partida e sim a caminhada.
Caminhando e semeando, no fim
terás o que colher”.
Cora Coralina
vi
Aos meus familiares.
Por todo amor e carinho a mim
dedicados e por me mostrarem todos
os dias o quanto é bom e importante
se ter uma família.
vii
AGRADECIMENTOS
À Deus, por estar sempre orientando e guiando meus passos, encorajando-me a
enfrentar todos os desafios e por colocar pessoas maravilhosas no meu caminho.
Aos meus pais, Sebastião (in memorian) e Mariana, pelos ensinamentos, o
incentivo e amor. A minha mais profunda gratidão pela lição de vida que, sabiamente, me
prestaram e continuam a prestar, auxiliando na construção do meu alicerce, com muita
integridade. Este título também é de vocês. Pai, o senhor não pôde estar presente neste
momento tão importante e especial para nós dois. Mas sei que está feliz comigo e sou
eternamente grata por todo esforço que fez e pelo apoio que me deu para que eu pudesse
realizar esse nosso sonho.
Estendo este agradecimento às minhas irmãs Mônica, Márcia e Mágda, aos meus
sobrinhos Rafael, Ádrian, Júlia e Ana Clara e aos meus cunhados André e Ronaldo pelo
apoio, os momentos de alegria e diversão, pelo amor e carinho a mim dedicados.
Um agradecimento especial ao meu amado esposo Guilherme, por seu amor,
carinho, paciência e dedicação por mim. Por estar sempre ao meu lado me apoiando,
auxiliando e participando dos meus sonhos, tornando-os seus também, e por ser esta
pessoa admirável, da qual me orgulho de ter escolhido para amar por toda a minha vida.
À Profa. Dra. Maria do Rosário Rodrigues Silva meu eterno agradecimento pela
convivência, amizade, dedicação, empenho, carinho, apoio, incentivo, conhecimento
científico a mim transmitido e pela ajuda, que foram fundamentais para a realização deste
trabalho, contribuindo para o meu crescimento pessoal e profissional.
Às Professoras, Dra. Carolina Rodrigues Costa Carvalho e Dra. Orionalda de
Fátima Lisboa Fernandes, pela amizade, carinho, apoio e pelos inúmeros momentos de
grande aprendizado.
À Profa. Dra. Marize Campos Valadares pela receptividade, esclarecimentos e
incentivo durante o desenvolvimento deste trabalho.
À Profa. Dra. Josiane Faganello pela receptividade e pelo auxílio na execução e
interpretação dos dados de microscopia eletrônica de varredura.
À Profa. MSc. Adriana de Moraes Costa Crespo pela amizade, pela ajuda nas
etapas de conclusão da tese, pela paciência nos momentos em que estive ausente do
laboratório e por ter me recebido tão bem na equipe da imunologia e da unidade de ensino
do IPTSP.
viii
À Biomédica Hildene Meneses e Silva meu agradecimento especial pelos
momentos de alegria, pela amizade, apoio e auxílio nos ensaios micológicos e por me
orientar na vida com um verdadeiro carinho de mãe.
Ao Laboratório de Toxicologia e Farmacologia Celular pela disponibilização dos
equipamentos e materiais necessários para o desenvolvimento do trabalho.
Aos amigos do Laboratório de Micologia: Thaísa, Fabyola, Viviany, Fernanda,
Andressa, Nathany, Rayssa e Cícero pelo convívio e amizade.
Aos amigos do Laboratório de Imunopatologia das doenças infecciosas e
Bacteriologia Molecular: Bruna, Adeliane, Monalisa, Viviane, Fábio, Lázaro, Rogério e
André pela amizade e auxílio nas análises dos ensaios de citometria de fluxo.
Aos amigos do Laboratório de Toxicologia e Farmacologia Celular, representados
por Renato, Wanessa e Larissa pela ajuda durante a realização e análise dos ensaios
toxicólogicos.
Aos servidores do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública que sempre se
mostram solícitos e por proporcionarem diversos momentos de descontração e alegria
Ao Programa de Pós Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública do
IPTSP/UFG, pela oportunidade, por acreditar no projeto e permitir sua realização.
Aos servidores do PPGMT-IPTSP/UFG José Clementino de Oliveira Neto e
Kariny Vieira Soares pela atenção e disposição em auxiliar sempre que precisamos.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e á
Fundação de Amparo á Pesquisa do Estado de Goiás pelo apoio financeiro.
A todos que de uma forma direta ou indireta colaboraram na realização e
conclusão desse trabalho, minha eterna gratidão e reconhecimento.
ix
SUMÁRIO
FIGURAS E ESQUEMAS ............................................................................................. xii
ABREVIATURAS ......................................................................................................... xv
RESUMO ...................................................................................................................... xvi
ABSTRACT ................................................................................................................. xvii
1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA ....................................................... 1
1.1. Complexo Cryptococcus neoformans ................................................................ 1
1.1.1. Características gerais .................................................................................. 1
1.1.2. Patogenia e fatores de virulência ................................................................ 3
1.1.3. Tratamento da criptococose ........................................................................ 7
1.2. Dermatófitos ...................................................................................................... 8
1.2.1. Caracteristicas gerais .................................................................................. 8
1.2.2. Manifestações clínicas ................................................................................ 8
1.2.3. Tratamento das dermatofitoses ................................................................. 13
1.3. Flavonóides ...................................................................................................... 13
1.4. Fisetina ............................................................................................................. 15
1.5. Ensaios de segurança para a avaliação de um fármaco.................................... 17
2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................... 18
3. OBJETIVOS ........................................................................................................... 20
3.1. Geral ................................................................................................................. 20
3.2. Específicos ....................................................................................................... 20
4. MÉTODO(S) .......................................................................................................... 21
4.1. Isolados ............................................................................................................ 21
4.2. Mecanismos de Ação de fisetina sobre os fungos ........................................... 21
4.2.1. Doseamento de Ergosterol ........................................................................ 21
4.2.2. Determinação da viabilidade e do metabolismo celular por citometria de
fluxo ........................................................................................................................22
4.2.3. Características morfológicas por microscopia eletrônica de varredura .... 24
4.3. Ensaios de toxicidade de fisetina ..................................................................... 25
4.3.1. Animais..................................................................................................... 25
4.3.2. Hepatotoxicidade ...................................................................................... 28
5. RESULTADOS ...................................................................................................... 33
5.1. Mecanismos de Ação de fisetina sobre os fungos ........................................... 33
5.1.1. Doseamento de Ergosterol ........................................................................ 33
5.1.2. Citometria de Fluxo .................................................................................. 34
5.1.3. Características morfológicas por microscopia eletrônica de varredura .... 36
5.2. Ensaios de segurança de fisetina ...................................................................... 37
5.2.1. Potencial hemolítico ................................................................................. 37
5.2.2. Mielotoxicidade ........................................................................................ 39
5.2.3. Toxicidade Oral Aguda ............................................................................ 40
5.2.4. Hepatotoxicidade in vitro ......................................................................... 41
6. ARTIGO ................................................................................................................. 45
7. DISCUSSÃO .......................................................................................................... 46
8. CONCLUSÕES ...................................................................................................... 54
9. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 56
ANEXOS ........................................................................................................................ 81
x
Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética – Hospital das Clínicas - UFG ..................... 81
Anexo 2 – Parecer do Comitê de Ética – Hospital de Doenças Tropicais de Goiás .. 82
Anexo 3 – Parecer da Comissão de ética no uso de animais – Universidade Federal de
Goiás ...........................................................................................................................83
xi
FIGURAS E ESQUEMAS
Figura 1: Cryptococcus neoformans: Aspecto microscópico: células arredondadas com
cápsula, coradas com tinta nanquim (400x) ..................................................................... 1
Figura 2: Vesículas contendo GXM formadas no citoplasma atravessando a parede celular
para a cápsula.................................................................................................................... 4
Figura 3: Síntese de melanina utilizando L-3,4-dihidroxifenilalanina como substrato. . 6
Figura 4: T. rubrum. A - colônias algodonosas brancas de reverso com pigmento
avermelhado. B - hifas septadas hialinas e microconídios dispostos em acladio (400x).11
Figura 5: T. mentagrophytes var. mentagrophytes. A - colônia pulvurulenta brancoamarelada. B - hifas em espiral e microconídios agrupados (400x). .............................. 11
Figura 6: T. tonsurans. A: colônias pregueadas, algodonosas de coloração branca a
amarelada. B - hifas septadas hialinas e microconídios piriformes (400x). ................... 12
Figura 7: M. cannis. A - colônia algodonosas. B- Aspecto microscópico: hifas septadas
hialinas e macroconídios septados, parede rugosa e extremidades afiladas (400x). ...... 12
Figura 8: E. floccosum. A colônias rugosas no centro e lisas na periferia, pulvurulentas,
verde-acastanhada. B - hifas septadas hialinas e macroconídios em forma de raquete
dispostos em cachos (400x). ........................................................................................... 12
Figura 9: Estrutura de flavonoíde, contendo anéis benzenos (A e B) ligados ao anel pirano
(C). .................................................................................................................................. 14
Figura 10: Estrutura da fisetina. .................................................................................... 16
Figura 11: Curva espectrofotométrica obtida em diferentes comprimentos de onda de
células não tratadas de C. gattii. ..................................................................................... 33
Figura 12: Curva de espectrofotometria de células de C. gattii (controle) e em contato com
½ CIM e CIM de itraconazol e de fisetina. .................................................................... 34
Figura 13: Histogramas mostrando o controle da célula fúngica sem adição de fisetina. Acontrole de viabilidade de FUN-1. B- controle de viabilidade de PI. ............................ 34
Figura 14: Fluorescência com o marcador FUN-1 sobre células de C. gattii ATCC 24065
tratadas com fisetina (em vermelho), e sem tratamento (em preto) A=tratadas com 2x CIM
de fisetina (redução de 76,3%), B= tratadas com 1xCIM de fisetina (redução de 72,4%) e
C= tratadas com ½ CIM de fisetina (redução de 51%). ................................................. 35
xii
Figura 15: Fluorescência com o marcador PI sobre células de C. gattii ATCC 24065
tratadas com fisetina (em vermelho), e sem tratamento (em preto). A=2x CIM de fisetina
(23,9%), B=1x CIM de fisetina (23,8%), C=½ CIM de fisetina (22,7%). ..................... 35
Figura 16: Células do complexo C. neoformans em microscopia de varredura. Sem
tratamento mostrando-se íntegras, (A e C) e tratadas com fisetina, evidenciando-se
leveduras murchas com cápsulas rugosas (B e D). ......................................................... 36
Figura 17: Microscopia de varredura de T. mentagrophytes e de T. rubrum. Filamentos e
conídios de dermatófitos não tratados com fisetina (A e C). Tratados com fisetina (B e D).
........................................................................................................................................ 37
Figura 18: Placa de microtitulação mostrando a avaliação do potencial hemolítico de
fisetina em diferentes concentrações sobre os eritrócitos. .............................................. 38
Figura 19: Percentual de hemólise em eritrócitos de camundongos Swiss após tratamento
com fisetina. ................................................................................................................... 38
Figura 20: Efeito da fisetina sobre a formação de colônias de UFC-GM da medula óssea
de camundongos. Quantificação de colônias em percentual de crescimento em relação ao
grupo controle (100% de crescimento). .......................................................................... 39
Figura 21: Colônias UFC-GM de medula óssea de camundongo. A – difusa/espalhada
(controle). B – Compacta (controle). C – Difusa espalhada [Tratada com o veículo de
diluição da fisetina (DMSO+RPMI)]. D – Compacta e reduzida (tratada com itraconazol. E
– Colônia difusa /espalhada semelhante ao controle (tratada com fisetina a 6,25µg/mL). F –
Colônia compacta semelhante ao controle (tratada com fisetina 200µg/mL).
Fotomicrografia em lupa 3,2x. Barra:100 pixel. ............................................................ 40
Figura 22: Rins e fígado de camundongo submetido à administração oral de fisetina sem
alterações macroscopicamente visíveis (Análise de toxicidade aguda). ........................ 40
Figura 23: Curva da viabilidade mitocondrial de carcinoma hepatocelular humano HepG2
após exposição à diferentes concentrações de fisetina e itraconazol.............................. 41
Figura 24: Células de carcinoma hepático humano HepG2. A - Sem tratamento. BTratadas com itraconazol a 229 µM. C- Tratadas com fisetina a 44 µM (12 µg/mL).
Fotomicrografia em microscópio invertido 100x. .......................................................... 42
Figura 25: Microscopia de fluorescência de células HepG2 coradas por Hoechst 33342. Acontrole B- tratadas com itraconazol (229 µM) e C-fisetina (12 µg/mL).
Células com
compactação do núcleo
células com fragmentação da cromatina. Microscopia de
fluorescência 40x. ........................................................................................................... 42
Figura 26: Análise por citometria de fluxo da externalização de fosfatidilserina em células
HepG2 tratadas com fisetina e itraconazol. Representação do dot plot do ensaio. (A - não
tratadas; (B)- Tratadas com 229 µM de itraconazol; (C) tratadas com 44,6 µM de fisetina.
(barra representa a média ± DP de duas experiências independentes. ........................... 43
Figura 27: Comparação do percentual (média ± DP de duas experiências independentes)
de células HepG2 viáveis, em apoptose e em necrose tratadas com fisetina e com
itraconazol. ..................................................................................................................... 44
xiii
Esquema 1: Processamento das amostras fúngicas para análise de alterações morfológicas
por microscopia eletrônica de varredura...................................................24
Esquema 2: Processo da análise da atividade hemolítica de fisetina sobre
eritrócitos......................................................................................................................26
Esquema 3: Procedimento para classificação da toxicidade oral aguda segundo as
doses iniciais preconizada por Organisation for Economic Co-operation and
Development (OECD) guidelines 423, 2001................................................................28
Esquema 4: Representação esquemática dos orifícios da placa de microtitulação após
formação de monocamada de células HepG2 e adição de concentrações crescentes de
fisetina para o ensaio de redução de MTT.............................................30
xiv
ABREVIATURAS
ASD
Ágar Sabouraud dextrose
ATCC
American Type Culture Colletion
CGB
Canavanina-Glicina-azul de Bromotimol
CIM
Concentração Inibitória Mínima
CNA
Contagem de Neutrófilos Absoluto
DMEM
Dulbecco`s Modified Eagle`s Medium
DMSO
Dimetilsulfóxido
E
Eritróides
FITC
Fluorescein Isothiocyanate
FUN-1
(2-cloro-4-(2,3-diidro-3-methil-(benzo-1,3-thiazol-2-il)-methili-dene)
GM
Granulócitos-Macrófagos
GXM
Glucuronoxilomanana
GXMGal Galacto Glucuronoxilomana
IC
Indice de Citotoxicidade
L-DOPA
Dihidroxifenilalanina
MAO
Monoamina Oxidase
MDE
Método de Doseamento de Esterol
MK
Megacariócitos
MP
Manoproteína
MTT
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide)
OECD
Organisation for Economic Co-operation and Development
PBS
Phosphate Buffer Saline
PI
Iodeto de Propidio
RPMI
Meio Roswell Park Memorial Institute
SE
Solução de Eritrócitos
SFB
Soro Fetal Bovino
SNC
Sistema Nervoso Central
UFC
Unidades Formadoras de Colônias
xv
RESUMO
O aumento na resistência aos antibióticos e os efeitos colaterais dos antifúngicos
disponíveis têm aumentado a necessidade de desenvolver novos e mais eficazes agentes
antifúngicos. Entre os compostos extraídos de plantas, os flavonóides são considerados
como possíveis fontes de novos agentes terapêuticos para infecções fúngicas, bacterianas e
virais. O mecanismo de ação antifúngica e a toxicidade de fisetina, flavonóide com
atividade antifúngica previamente estabelecida para o complexo de espécies Cryptococcus
neoformans e dermatófitos, foram determinados. A ação deste flavonóide foi avaliada pelo
doseamento de ergosterol, pela viabilidade celular por citometria de fluxo e por alterações
na morfologia fúngica visualizadas por microscopia eletrônica de varredura. A toxicidade
de fisetina foi determinada in vitro através da avaliação do potencial hemolítico e
mielotóxico e in vivo pela toxicidade oral aguda. A hepatotoxicidade deste flavonóide, em
células da linhagem de carcinoma hepatocelular HepG2, foi realizada pela determinação da
viabilidade mitocondrial usando o método de redução de MTT, avaliação da morfologia
celular e nuclear por coloração com May-Grunwald-Giemsa e Hoechst 33342 e análise da
viabilidade e morte celular pelo método de externalização da fosfatidilserina. Os resultados
obtidos permitiram verificar que as leveduras submetidas à ação de fisetina apresentaram
redução do conteúdo de ergosterol, alteração no metabolismo celular visualizadas na
citometria de fluxo. As células fúngicas tratadas com fisetina e observadas por microscopia
eletrônica de varredura apresentaram, na análise de leveduras do complexo C. neoformans,
retração no citoplasma celular e nos dermatófitos verificaram-se modificações nas hifas e
redução acentuada de conídios. Na análise toxicológica de fisetina, observou-se baixo
potencial hemolítico e ausência de danos nas células progenitoras de granulócitos e
macrófagos.
Animais
tratados
com
fisetina
não
apresentaram
alterações
de
comportamento, com fígado e rins macroscopicamente normais. A avaliação de
citotoxicidade verificada sobre células HepG2 em diferentes concentrações do composto
mostrou viabilidade celular com uma variação de 65,9% a 18,5% em concentrações de
3,12 a 400 μg/mL de fisetina, sugerindo que a ação deste flavonóide sobre a linhagem
celular HepG2 é concentração-dependente. Raras alterações morfológicas celulares e
nucleares, com poucas células em apoptose foram observadas em HepG2 na presença de
fisetina. Concluindo, embora vários outros testes de citotoxicidade e mecanismo de ação
devam ser realizados para a introdução de fisetina como um novo fármaco, os resultados
apresentados mostram um perfil favorável para conduzir ao estudo e desenvolvimento
desta substância no tratamento de criptococose e dermatofitose.
xvi
ABSTRACT
Increases in antimicrobial resistance and the side effects of available antifungal drugs have
increased the need to develop new and more effective antifungal agents. Among the
compounds extracted from plants, flavonoids have been considered to be possible sources
of new therapeutics for fungal, bacterial and viral infections. The antifungal mechanism of
action and toxicity of fisetin, flavonoid with antifungal activity previously established for
the Cryptococcus neoformans species complex and dermatophytes were determined. The
action of this flavonoid was evaluated by quantitation of ergosterol, cell viability by flow
cytometry and by changes in fungal morphology visualized by scanning electron
microscopy. The fisetin toxicity was determined in vitro through the evaluation of
hemolytic and myelotoxic potential and in vivo by acute oral toxicity. Hepatotoxicity of
this flavonoid in hepatocellular carcinoma cell line (Hepg2) was performed by
determination of mitochondrial viability using the MTT reduction method, evaluation of
cellular and nuclear morphology by staining with May-Grunwald-Giemsa and Hoechst
33342 and analysis of viability and death cell by method of phosphatidylserine
externalization. The obtained results have allowed to verify that the yeast subjected to the
action of the fisetin showed a content ergosterol reduction, changes in cellular metabolism
viewed in flow cytometry. Fungal cells treated with fisetin and observed by scanning
electron microscopy showed in the analysis of yeast C. neoformans complex, retraction in
the cell cytoplasm and in the dermatophytes there have been changes in hyphae and sharp
reduction of conidia. The toxicological analysis of fisetin, observed a low potential
hemolytic and an absence of damage on the granulocyte-macrophage progenitors cells.
Animals treated with fisetin did not show behavioral changes, with liver and kidneys
macroscopically normal. The cytotoxicity assessment observed on HepG2 cells in different
concentrations of the compound showed cell viability with a range of 65.9% to 18.5% at
concentrations from 3.12 to 400 μg/mL fisetin, suggesting that the action this flavonoid on
the HepG2 cell line is concentration-dependent. Rare cellular and nuclear morphological
changes, with few cells in apoptosis were observed in HepG2 cells in the presence of
fisetin. In conclusion, although many cytotoxicity assays and mechanism of action must be
made to introduce fisetin as a new drug, the present results show a favorable profile to
conduct the study and development of this substance in the treatment of cryptococcosis and
dermatophytosis.
xvii
1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA
1.1.
1.1.1.
Complexo Cryptococcus neoformans
Características gerais
Leveduras do complexo de espécies Cryptococcus neoformans, pertencentes ao
subfilo Basidiomycota (DE GARCIA et al., 2012; SRIKANTA et al., 2014), foram
descritas pela primeira vez no ano de 1894 pelo patologista alemão Otto Busse. Este
médico isolou nesta época, o fungo de lesão localizada na tíbia de uma paciente do sexo
feminino (COELHO et al., 2014). Estes fungos são encapsulados (Figura 1), ubíquos na
natureza, relacionados com processos infecciosos que acometem humanos e outros
animais como cães e gatos (BARTLETT et al., 2008; HOLE et al., 2012; SINGER et
al., 2014).
Figura 1: Cryptococcus neoformans: Aspecto microscópico: células arredondadas com
cápsula, coradas com tinta nanquim (400x)
Fonte: Acervo do autor, 2012
Atualmente, este complexo é dividido em duas espécies distintas: Cryptococcus
neoformans e Cryptococcus gattii que podem ser diferenciadas por métodos fenotípicos
como crescimento em meio contendo canavanina-glicina-azul de bromotimol - CGB
(LIN, 2009).
Diferenças antigênicas na estrutura polissacarídica capsular, permitem a
identificação de cinco sorotipos: A, B, C, D e AD (NISHIKAWA et al., 2003; LIN,
2009; O'MEARA; ALSPAUGH, 2012; WU et al., 2015). A espécie C. neoformans,
compreende os sorotipos A (var. grubii), D (var. neoformans) e o híbrido AD que
1
apresenta características de ambos os sorotipos A e D. A espécie C. gattii abrange os
sorotipos B e C. O sorotipo A é predominante entre amostras clínicas responsável por
aproximadamente 95% dos casos de criptococose em todo o mundo (JAIN et al., 2005;
LIN, 2009; FIRACATIVE et al., 2012; WU et al., 2015).
Genotipicamente, o complexo C. neoformans foi caracterizado com base em
diferentes métodos moleculares como PCR fingerprinting, RAPD (DNA Polimórfico
Amplificado Aleatoriamente), RFLP (Polimofismo de Tamanho de Fragmentos de
Restrição) e AFLP (Polimorfismo do Tamanho de Fragmentos Amplificados) em 9
tipos moleculares distintos. VNI, VNII e VNB (sorotipo A, var. grubii), VNIII (sorotipo
AD), VNIV (sorotipo D, var. neoformans), VGI, VGII e VGIII, VGIV sorotipos B e C
respectivamente, ambos pertencentes à espécie C. gattii (LIN; HEITMAN, 2006;
FIRACATIVE et al., 2012; GULLO et al., 2013).
C. neoformans pode ser encontrado no solo, árvores, madeira em decomposição e
de fezes de aves, principalmente excrementos de pombos (LUGARIN et al., 2008; LIN,
2009). O isolamento do fungo em excretas de outras aves, como psitacídeo em
zoológicos, em pet shops ou em residências onde vivem estes tipos de aves, sugere os
excrementos destes como reservatórios ambientais importantes deste patógeno
(ABEGG et al., 2006). As excretas de aves são consideradas como um ambiente
favorável ao crescimento dessas leveduras, pela grande quantidade de purinas, ácido
úrico e creatinina, os quais são assimilados pelo fungo como fonte de nitrogênio
(CASADEVALL; PERFECT, 1998). Há vários relatos de criptococose humana
decorrentes provavelmente do contato com excretas de aves (NOSANCHUK et al.,
2000; SHRESTHA et al., 2004; LAGROU et al., 2005).
C. gattii ocorre em regiões tropicais e subtropicais e tem seu habitat natural
frequentemente associado à madeira em decomposição e a ocos de árvores como
aquelas pertencentes a espécies de Eucalyptus spp, Senna spp, Ficus microcarpa,
Cedrus deodara, Acacia visca e Cassia grandis (HALLIDAY; CARTER, 2003;
KOBAYASHI et al., 2005; REFOJO et al., 2009). Embora mais encontrado em árvores,
Kidd et al. (2007) sugerem que o solo pode ser o reservatório comum para C. gattii.
Esta espécie é considerada endêmica no nordeste do Brasil, Paraguai, México,
Austrália, em alguns países da África, Índia, sudeste da Ásia, Canadá e no estado da
Califórnia nos Estados Unidos. Casos autóctones na Alemanha, Espanha, França e Itália
foram relatados (NISHIKAWA et al., 2003; TINTELNOT et al., 2004; COLOM et al.,
2005; MACDOUGALL et al., 2007).
2
1.1.2.
Patogenia e fatores de virulência
As leveduras ou os basidiósporos de Cryptococcus entram no hospedeiro por via
inalatória, atingindo os pulmões, a partir daí podem se disseminar por via hematogênica,
causando infecções sistêmicas envolvendo órgãos como a pele, olhos, ossos, pulmões,
sistema nervoso central (SNC), próstata ou trato urinário (PRATES et al. 2009; LIN,
2009). C. neoformans tem tropismo pelo SNC causando meningite criptocócica e
meningoencefalite. Este tropismo é justificado pela presença de tiamina, carboidratos,
minerais e nutrientes assimiláveis pelo fungo, assim como pela presença de precursores
da melanina, como dopamina e lacase (IKEDA et al., 2002). A associação com
imunocomprometimento tem sido descrita, sendo que a reativação da doença tem sido
observada
em
pacientes
imunodeprimidos,
previamente
expostos
ao
fungo,
especialmente aqueles com a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS)
(COELHO et al., 2014).
A presença da cápsula, capacidade de crescer a 37ºC e produção de melanina são
fatores de virulência considerados essenciais para o estabelecimento da infecção e
sobrevivência do fungo no hospedeiro (Bose et al. 2003; Idnurm et al. 2005; Bien et al.
2009; Lester et al. 2011).
A capacidade de crescer e sobreviver à temperatura de 37ºC, em uma atmosfera
de aproximadamente 5% de CO2, e pH entre 7,3 a 7,4 é decisivo para C. neoformans
invadir o tecido e causar infecção (LIN; HEITMAN, 2006). O gene (CNA1) que
codifica a subunidade catalítica A da proteína calcineurina, uma fosfatase
serina/treonina específica que é ativada pela calmodulina cálcica (Ca2+), e está
envolvido na resposta a diversos estímulos ambientais para adaptação do fungo a
diferentes tipos de estresses, está relacionado diretamente com a capacidade de
sobrevivência desse microrganismo a 37ºC (CRUZ et al., 2001).
Isolados de C. neoformans, cujo gene CNA1 está ausente apresentam dificuldade
de crescimento a 37ºC e mostram-se incapazes de causar a morte em animais
experimentais. A calcineurina é, portanto determinante para o fungo sobreviver à
temperatura do hospedeiro, sendo, portanto, essencial para sua patogenicidade (CRUZ
et al., 2001; FOX et al., 2001; STEINBACH et al., 2007).
A cápsula é uma estrutura de processo dinâmico que sofre alterações em tamanho
e reorganização durante seu processo de formação (MCFADDEN et al., 2006).
Polissacarídeos como glucuronoxilomanana (GXM), que representam aproximadamente
3
85% da massa capsular, galacto glucuronoxilomana (GXMGal) e algumas
manoproteínas são os constituintes desta estrutura fúngica (KWON-CHUNG;
RHODES, 1986; CASADEVALL; PERFECT, 1998; BOSE et al., 2003; GATES et al.,
2004; ZARAGOZA et al., 2009, RAMOS et al., 2012).
Liberação de GXM que se acumula no tecido lesionado tem sido observada
durante o processo infeccioso (MCFADDEN et al., 2006; ZARAGOZA et al., 2008).
Este composto apresenta ligações lineares de  (1,3) manana, residuos de  (1,2) ácido
glucurônico, ligados a uma tríade de manose com ligações laterais de 6-O-acetil e um
grupo de xilose  (1,2) ou  (1,4) laterais, que varia de acordo com o sorotipo das
espécies do complexo Cryptococcus (MCFADDEN et al., 2006).
A síntese do GXM da cápsula ocorre dentro do citoplasma sendo exportado por
vesículas. A secreção extracelular pode ser mediada pela parede, que permite o
transporte destas vesículas. Assim, a síntese da cápsula parece estar associada com o
acúmulo de vesículas na parede celular (VAN-DUIN et al., 2004; SILVA RODRIGUES
et al., 2008; DOERING, 2009). A Figura 2 esquematiza a transposição da vesícula e
liberação de GXM para a cápsula.
Figura 2: Vesículas contendo GXM formadas no citoplasma atravessando a parede
celular para a cápsula.
Fonte: DOERING, 2009
GXMGal representa juntamente com algumas manoproteinas 5 a 12% da cápsula
(VAISHNAV et al., 1998; ZARAGOZA et al., 2008). Este composto é um polímero de
α−1,6−galactose (Gal), α−1,3 manose, α−1,4 manose, β−1,3−galactose, β−1,2 xilose,
β−1,3 xilose e β−1,3 glucose (HEISS et al., 2009).
4
As manoproteínas (MPs) compostas principalmente de manano e quantidades
significativas de galactose e xilose (CHERNIAK; SUNDSTROM, 1994) são
heterogêneas em C. neoformans, e compartilham efeitos imunomoduladores. Duas MPs
(MP1 e MP2) extraídas de C.neoformans são capazes de induzir o fator de necrose
tumoral alfa (TNF-alfa) e a produção de IL-12 por monócitos humanos (PIETRELLA et
al., 2005).
Os polissacarídeos capsulares de C. neoformans atuam no hospedeiro inibindo a
fagocitose por células do sistema imunológico; impedem a migração dos leucócitos e
neutrófilos, para o local da inflamação, interferem na apresentação de antígenos às
células T, favorecendo a redução de citocinas como fator de necrose tumoral α (TNFα),
interleucina 1 e 6 (IL-1 e 6) pelos monócitos e macrófagos e depletam a cascata do
complemento (CASADEVALL; PERFECT, 1998; ELLERBROEK et al., 2004;
PIETRELLA et al., 2005). Por isso, a maior parte da atenção a essa estrutura celular,
observados através de estudos imunológicos, têm consistentemente demonstrado seus
inúmeros efeitos deletérios sobre a função imunológica do hospedeiro (MCFADDEN et
al., 2006).
No meio ambiente, a cápsula protege a levedura da desidratação, reduz a sua
ingestão por amebas existentes no solo, contribuindo para a sua sobrevivência em
condições hostis (ZARAGOZA et al., 2008).
Vários genes estão envolvidos na formação da cápsula, tais como CAP10, CAP59,
CAP60, CAP64, MAN1, CAS1, CAS6 essenciais pra biossíntese de seus componentes,
estando, portanto, associados à virulência (CASADEVALL; PERFECT, 1998;
CHANG; KWON-CHUNG, 1998; OKABAYASHI et al., 2007).
Melaninas são macromoléculas sintetizadas por polimerização oxidativa de
compostos fenólicos e classificadas em três grandes grupos: eumelanina de cor marrom
ou negra insolúvel, sintetizadas a partir de um processo complexo de polimerização
envolvendo quinonas e radicais livres (fenilalanina para dihidroxifenilalanina e
dopaquinona) conforme a Figura 3; feomelanina de cor amarela ou vermelha, solúvel
em álcool, que tem além da dihidroxifenilalanina (L-DOPA), a cisteína e tirosina
incorporada durante a sua biossíntese, e alomelanina pigmento derivado de precursores
livres de nitrogênio, geralmente de coloração negra ou marrom (HAMILTON; GOMEZ,
2002; WAKAMATSU; ITO, 2002; PLONKA; GRABACKA, 2006; URÁN; CANO,
2008). A síntese de melanina pelo C. neoformans ocorre apenas na presença de
compostos fenólicos, tais como L-3, 4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), metil-dopa,
5
epinefrina e norepinefrina, catalisada por uma fenoloxidase, a lacase. O fungo capta
precursores dopaminicos do ambiente extracelular que pode ocorrer tanto no meio
ambiente como durante a infecção (NOSANCHUK; CASADEVALL, 2003).
Figura 3: Síntese de melanina utilizando L-3,4-dihidroxifenilalanina como substrato.
L-3,4-dihidroxifenilalanina
HO
HO
DOPAQUINONA
O
(L-DOPA)
COO
COOH
NH2
FENOL
OXIDASE
(LACASE)
NH3
O
DOPACROMO
O
COO
N
H
O
POLIMERIZAÇÃO
HO
HO
COOH
HO
N
H
HO
N
H
MELANINA
Fonte: WAKAMATSU; ITO, 2002 com modificações.
Assim como a cápsula de polissacarídeos, a presença de melanina é essencial para
a virulência de leveduras do complexo C. neoformans (MANDAL et al., 2007). Durante
o processo infeccioso, a melanina interfere na formação da resposta efetiva mediada por
células. Inoculação de melanina de C. neoformans em animais como camundongos pode
estimular a produção de granulomas no processo de infecção (VAN-DUIN et al., 2002;
IKEDA et al., 2003; MEDNICK et al., 2005; NOSANCHUK; CASADEVALL, 2006;
MANDAL et al., 2007; SCHIAVE et al., 2009).
No meio ambiente a melanização é importante para a sobrevivência do fungo,
uma vez que protege este microrganismo de condições ambientais adversas, como
temperaturas extremas, predação por microrganismos, radiação ultravioleta e ação de
metais pesados. A melanina, portanto, tem um papel protetor para C. neoformans, no
hospedeiro e no ambiente (URÁN; CANO, 2008).
Dois genes codificam a lacase no genoma de C. neoformans, LAC1 e LAC2.
Linhagens mutantes para LAC1 (lac1) foram analisadas em modelos de infecção
experimental, e mostraram-se menos virulentas quando comparadas a linhagens
selvagens (SALAS et al., 1996). Além disto, não ocorre expressão significativa do gene
6
LAC2 em relação ao LAC1 e a geração de mutantes nulos para o gene LAC2 não
resulta na redução da virulência em camundongos (ZHU; WILLIAMSON, 2004).
1.1.3.
Tratamento da criptococose
De acordo com as nomas da Sociedade de Doenças Infecciosas da América
(IDSA), a prescrição para o tratamento da criptococose varia, de acordo com o local da
infecção, gravidade da doença e imunidade do hospedeiro (SAAG et al., 2000;
PERFECT et al., 2010). A classe de medicamentos utilizados para tratar a criptococose
é composta por antifúngicos polieno, anfotericina B e nistatina (SANGLARD et al.,
2009).
Anfotericina B é usado como o padrão ouro para o tratamento de várias micoses
sistêmicas, incluindo a criptococose. Seu mecanismo de ação está relacionado com a
presença de anel macrolídeos, o que torna esse fármaco hidrofóbico e capaz de liga-se a
esteróis, principal ergosterol da membrana da célula fúngica, alterando a sua
permeabilidade, permitindo a saída de nutrientes essenciais que leva à morte celular.
Anfotericina B também pode ser utilizada em associação com 5-fluorcitosina no
tratamento de infecções criptocócicas disseminadas (SANGLARD et al., 2009).
Antifúngicos da classe dos azólicos, também são utilizados no tratamento de
criptococose e atuam na inibição da biossíntese do ergosterol, principal constituinte da
membrana citoplasmática, através do bloqueio da enzima 14-α-demetilase, presente no
citocromo P-450 da célula fúngica (SANGLARD, 2002).
Fluconazol e itraconazol são administrados normalmente quando as lesões são
cutâneas. Este tratamento é indicado, tanto em indivíduos imunocompetentes, como
imunocomprometidos (BIVANCO et al., 2006; PERFECT et al., 2010).
7
1.2.
1.2.1.
Dermatófitos
Caracteristicas gerais
Os dermatófitos são importantes agentes zoonóticos e constituem um grupo de
fungos que, em vida parasitária, têm a capacidade de invadir tecidos queratinizados tais
como cabelos, unhas e células epiteliais de humanos e outros animais, causando
infecções denominadas dermatofitoses. Os agentes etiológicos destas infecções são
constituídos pelos gêneros Trichophyton, Microsporum e Epidermophyton pertencentes
ao filo Ascomycota. Macroscopicamente as colônias de dermatófitos se apresentam
como algodonosas e pulvurulentas, de cores variadas e a microscopia da colônia
apresenta hifas finas septadas, hialinas e presença de macroconídios e/ou microconídios
como elementos de frutificação de acordo com a espécie (WHITE et al., 2008; LEITE
JR et al., 2014; NENOFF et al., 2014; BADALI et al., 2015).
As espécies de dermatófitos são classificadas de acordo com o habitat natural em
antropofílico (parasitas exclusivos da espécie humana), zoofílicos (próprios de animais
domésticos ou silvestres) e geofílicos (têm o solo como reservatório). Há algumas
diferenças quanto à clínica causada por estes fungos, sendo que as espécies zoofílicas e
geofílicas apresentam infecção inflamatória mais grave, resistindo a terapia de rotina e
com grande tendência à recidiva. As espécies antropofílicas, embora normalmente de
terapia eficaz, são responsáveis pela maior quantidade das dermatofitoses humanas
notificadas, totalizando cerca de 70% (WHITE et al., 2008).
1.2.2.
Manifestações clínicas
A infecção por dermatófitos ocorre pela produção de enzimas proteolíticas
secretoras que promovem uma resposta inflamatória no hospedeiro e resulta em uma
série de sintomas clínicos, característicos das dermatofitoses (LIU et al., 2001). Enzimas
dermatofíticas têm sido caracterizadas bioquimicamente e molecularmente a partir de
várias espécies de dermatófitos capazes de infectar o hospedeiro (KAUFMAN et al.,
2007; MONOD, 2008).
Após a contaminação do tecido, os dermatófitos obtêm nutrientes para seu
desenvolvimento e sobrevivência, utilizando as macromoléculas presentes no tecido
hospedeiro (fonte de carbono, nitrogênio, fósforo e enxofre), as quais são absorvidas,
após a sua degradação em compostos menores. A quebra dessas moléculas é promovida
8
por enzimas hidrolíticas secretadas, que apresentam especificidade por diferentes
substratos (PERES et al., 2010). A secreção de diversas enzimas como proteases,
lipases, elastases, colagenases, fosfatases e esterases, é um fator importante durante o
processo infeccioso (BROUTA et al., 2002; VERMOUT et al., 2008; LENG et al.,
2009) sendo as enzimas consideradas fatores de virulência dos dermatofitos,
possibilitando a invasão desses patógenos (PERES et al., 2010).
O mecanismo de ação de algumas enzimas é bem conhecido. As queratinases e
proteases produzidas pelos dermatófitos digerem a queratina possibilitando a invasão da
pele além de liberarem antígenos fúngicos que podem induzir hipersensibilidade. As
elastases e as lipases estão relacionadas com enfermidades agudas e crônicas,
respectivamente (MONOD, 2008; GIUDICE et al., 2012).
As dermatofitoses recebem a denominação genérica de tinhas ou tinea em latim,
acrescido da região do corpo acometida (WEITZMAN; SUMMERBELL, 1995;
SANTOS et al., 2002). Tinea capitis é caracterizada pela invasão do couro cabeludo,
usualmente causada por espécies dos gêneros Microsporum e Trichophyton (DE
KOMAID; KESTELMAN, 2002). As lesões produzidas por estes dois gêneros podem
variar desde a formação de eritema, com poucas áreas descamativas, à formação de
reações inflamatórias e, ainda, produção de lesões extensas de descamação e alopécia,
acompanhadas por febre e linfadenopatia (GHANNOUM et al., 2003). Nas lesões
descamativas, onde o folículo piloso é tonsurado, os gêneros de dermatófitos mostram
quadros clínicos diferentes. Nas tineas produzidas por Microsporum, as lesões são
únicas, enquanto naquelas causadas por Trichophyton, observa-se a formação de
múltiplas áreas de alopécia (AQUINO; LIMA, 2002).
Nas lesões denominadas “Kerion Celsi”, há um processo inflamatório intenso,
com pústulas, secreção purulenta, alopecia e formação de cicatrizes (FULLER et al.,
2014). Esta foliculite supurativa tem como agentes os fungos zoofílicos, como T.
mentagrophytes (Figura 5) e T. verrucosum e, ainda fungos geofílicos, como M.
gypseum e M. fulvum. Uma forma clínica grave, denominada tinea favosa, pode ocorrer
quando algumas espécies de dermatófitos, como T. schoenleinii e M. gypseum, invadem
o couro cabeludo, levando à formação de uma crosta em forma de favo de mel,
decorrente de uma massa densa de micélio e restos de tecido epitelial, com atrofia da
pele e alopécia cicatricial (WEITZMAN; SUMMERBELL, 1995; AQUINO; LIMA
2002).
9
A tinea corporis tem localização em pele glabra, preferencialmente nos braços,
face e tronco (GOLDSTEIN et al., 2000). Causam lesões eritematodescamativas,
circinadas, isoladas ou confluentes, de crescimento centrífugo, onde se observa
vesículas ou pústulas em suas bordas (WEINSTEIN; BERMAN, 2002). T. rubrum
(Figura 4) e T. mentagrophytes têm sido descritos como os principais agentes de tinea
corporis (AMEEN, 2010).
Características semelhantes ao quadro de tinea corporis são encontradas quando
os dermatófitos atingem a região crural (coxas, períneo, nádegas e região pubiana),
sendo nestes casos denominadas de tinea cruris. Estes locais são mais propícios à
infecção por fungos, devido a constante maceração da pele, pela sudorese intensa ou por
banhos prolongados, que favorecem à implantação destes microrganismos (HAINER,
2003). E. floccosum (Figura 8), espécie antropofílica é o agente mais comumente
identificado nos casos de tinea cruris (WEITZMAN; SUMMERBELL, 1995; SANTOS
et al., 2002).
Tinea pedis ou pé-de-atleta, a forma clínica mais frequentemente observada em
todo mundo caracteriza-se por lesões inflamatórias com numerosas vesículas plantares e
interdigitais. Nos espaços interdigitais formam-se fissuras e a pele macerada predispõe
às infecções secundárias, acentuando o caráter inflamatório das lesões. T.
mentagrophytes tem sido isolado frequentemente nestas lesões (GOLDSTEIN et al.,
2000; KORTING et al., 2001; OGASAWARA et al., 2003; ZAIAS; REBELL, 2003). A
forma crônica da doença, com lesões na planta e nas bordas dos pés, sob a forma
eritematodescamativa tem como causa predominante T. rubrum (HAINER, 2003). A
sudação, umidade, calçados não higienizados adequadamente e o descuido na higiene da
pele, constituem fatores que auxiliam a implantação e o crescimento dos fungos nesta
região (GOLDSTEIN et al., 2000).
A invasão das unhas por dermatófitos, denominada tinea unguium, se caracteriza
por ser uma infecção normalmente crônica. A manifestação clínica das lesões ungueais
pode ocorrer pela formação de manchas na placa das unhas, ou pode produzir lesões nas
margens lateral e distal, caracterizando-se por uma unha opaca, esbranquiçada e
espessa, com acúmulo de queratina subungueal. As unhas das mãos são comumente
parasitadas por T. rubrum, enquanto nas unhas dos pés, T. rubrum, T. mentagrophytes e
E. floccosum são frequentemente observados (HUANG et al., 2004).
10
Os dermatófitos mais frequentemente isolados como causadores de infecção,
como T.rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans (Figura 6), M. cannis (Figura 7) e E.
floccosum são mostrados nas Figuras 4, 5, 6, 7 e 8.
Figura 4: Trichophyton rubrum. A - colônias algodonosas brancas de reverso com
pigmento avermelhado. B - hifas septadas hialinas e microconídios dispostos em acladio
(400x).
Fonte: Acervo do autor, 2012
Figura 5: Trichophyton mentagrophytes var. mentagrophytes. A - colônia pulvurulenta
branco-amarelada. B - hifas em espiral e microconídios agrupados (400x).
Fonte: Acervo do autor, 2012
11
Figura 6: Trichophyton tonsurans. A: colônias pregueadas, algodonosas de coloração
branca a amarelada. B - hifas septadas hialinas e microconídios piriformes (400x).
A
B
Fonte: Acervo do autor, 2012
Figura 7: Microsporum cannis. A - colônia algodonosas. B- Aspecto microscópico:
hifas septadas hialinas e macroconídios septados, parede rugosa e extremidades afiladas
(400x).
A
B
Fonte: Acervo do autor, 2012
Figura 8: Epidermophyton floccosum. A colônias rugosas no centro e lisas na periferia,
pulvurulentas, verde-acastanhada. B - hifas septadas hialinas e macroconídios em forma
de raquete dispostos em cachos (400x).
A
B
Fonte: Acervo do autor, 2012
12
1.2.3.
Tratamento das dermatofitoses
As dermatofitoses são infecções fúngicas superficiais de difícil tratamento e,
mesmo nos casos em que a medicação é adequada ao agente etiológico identificado,
nem sempre a sua eficácia é comprovada, sendo frequentes as recidivas (JOISH;
ARMSTRONG, 2002; COLELLA et al., 2006; BITENCOURT et al., 2014). Terapias
tópicas e orais são utilizadas para dermatofitoses (GUPTA; TU, 2006; GARMENDIA et
al., 2008; KAUR et al., 2008).
Dentre os principais medicamentos tópicos podemos citar o ciclopirox e a
amorolfina (GUPTA et al., 2004; FINCH; WARSHAW, 2007; SHIRWAIKAR et al.,
2008), enquanto para os antifúngicos de uso oral,os compostos do grupo das alilaminas,
como a terbinafina, e dos triazois, como itraconazol e fluconazol. Estes fármacos orais
resultaram em uma medida de grande importância, pois se utiliza um menor período de
duração do tratamento, levando a um aumento do índice de cura e redução das
recorrências (FINCH; WARSHAW, 2007; SEEBACHER et al., 2007; KAUR et al.,
2008; NEGRONI. 2008).
A dificuldade de cura, necessidade de um tempo prolongado de tratamento,
constantes recidivas, associadas ao alto custo dos medicamentos são fatores que
propiciam o aumento das infecções fúngicas e consequentemente a busca por novas
terapias.
1.3.
Flavonóides
Os flavonóides, compostos orgânicos heterocíclicos presentes em frutas, vegetais
e produtos relacionados, como própolis, mel, chá e vinho constituem um dos maiores
grupos de fitonutrientes que proporcionam efeitos benéficos à saúde. O termo é
derivado da palavra latina "flavus", que significa amarelo (FLORA et al.. 1998; KHAN
et al.. 2013). Cerca de 8000 estruturas de flavonóides (PIETTA, 2000), sendo 4000 de
origem natural são conhecidas (MCPHAIL et al., 2003). A característica estrutural
básica de compostos flavonóides é o 2-fenil-benzo[α]pirano ou núcleo flavona, que
consiste em dois anéis de benzeno ligados através de um anel heterocíclico pirano
conforme mostrado na Figura 9 (CUSHNIE; LAMB, 2005; GHASEMZADEH;
GHASEMZADEH, 2011). Uma grande diversidade estrutural de flavonóides ocorre
13
pelas modificações destes compostos como: hidroxilação, metilação, acilação ou
glicosilação (KOES et al., 1994).
Figura 9: Estrutura de flavonoíde, contendo anéis benzenos (A e B) ligados ao anel
pirano (C).
Fonte: CUSHNIE; LAMB, 2005.
Ampla gama de atividades biológicas, incluindo antialérgica, antibacteriana,
antidiabética,
anti-inflamatória,
antiviral,
antiproliferativa,
antimutagênica,
antitrombótica, anticarcinogênica, hepatoprotetora estrogênica, inseticida e antioxidante
têm sido demonstrada por diferentes pesquisadores (ORHAN et al., 2010; CUSHNIE;
LAMB, 2011; PROCHAZKOVA et al., 2011; SERRA et al., 2012). É bem conhecido
que a dieta rica em flavonóides está correlacionada com o aumento da longevidade e
redução da incidência de doenças cardiovasculares (BURR, 1995).
Em infecções microbianas causando lesões em plantas, há fortes indicações de
que os compostos fenólicos, presentes nestas plantas, sejam capazes de auxiliar como
agente terapêutico. (FULLERTON et al., 2011) A atividade destes compostos pode
estar relacionada à sua capacidade de associar à proteínas extracelulares e solúveis
formando complexos com paredes de células do microorganismo (FULLERTON et al.,
2011). Alguns flavonóides rompem a membrana microbiana, sendo que a sua ação pode
estar relacionada à inibição da síntese de ácido nucleico, alteração da função da
membrana citoplasmática ou ainda podem agir sobre o metabolismo energético
(CUSHNIE; LAMB, 2005; FULLERTON et al., 2011).
Experimentos in vitro constatam a eficácia antimicrobiana de flavonóides contra
uma ampla variedade de microrganismos (ORHAN et al., 2010; HENDRA et al., 2011).
Hendra et al. (2011) mostraram que os flavonóides kaempferol, miricetina, naringina e
14
rutina extraídos da Phaleria macrocarpa apresentaram ação antimicrobiana contra
bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e fungos filamentosos.
Os flavonóides têm ainda recebido considerável atenção como possíveis fontes de
novos agentes terapêuticos para infecções virais. Quercetina, fisetina, morina, rutina,
dihidroquercetina, dihidrofisetina (fustin), leucocianidina, cloreto de pelargonidina,
catequina, apigenina, naringenina, genisteina, silimarina e silibinina, apresentam
atividade inibitória para uma variedade de vírus, incluindo o vírus da herpes simples
(HSV), vírus sincicial respiratório (VSR), poliovírus, vírus Sindbis, HSV-1, para
influenza-3 e DENV-2 (CUSHNIE; LAMB, 2005; OZCELIK et al., 2011; ZANDI et
al., 2011; LIN et al., 2012; KHAN et al., 2013).
Estes flavonóides pertencem à família dos compostos polifenólicos de ocorrência
natural
com
atividades
anticancerígenas,
antimicrobianas
e anti-inflamatórias
cardiovasculares, merecendo destaque a fisetina que tem sido largamente encontrada em
diferentes alimentos possuindo um espectro significativo de ações bioquímicas e
farmacológicas (MANTHEY et al., 2001; BENAVENTE-GARCÍA; CASTILHO, 2008;
ORHAN et al., 2010; ZHEN et al., 2012).
1.4.
Fisetina
Fisetina 3,3’,4’,7-tetrahidroxiflavona, (Figura 10) flavonóide natural encontrado
em frutas e legumes, como morango, maçã, caqui, uva, kiwi, jatobá, cebola, pepino em
concentrações que variam de 2-160 µg/g, pertence ao subgrupo flavonol (ARAI et al.,
2000; SYED et al., 2011; ADHAMI et al., 2012). Em experimentos realizados in vivo, a
administração sistêmica em camundongos mostrou que a fisetina possui atividade
antitumoral em vários tipos de câncer, incluindo o de próstata, teratocarcinoma e
carcinoma pulmonar (KHAN et al., 2008; TOUIL et al., 2011a; TRIPATHI et al.,
2011).
Fisetina apresenta capacidade de promover a diferenciação de células nervosas e
pode prevenir, retardar ou reduzir os déficits relacionados ao envelhecimento na função
cerebral (SAGARA et al., 2004; MAHER, 2009). Esta atividade neuroprotetora ocorre
provavelmente pela inibição da atividade isoforma da monoamina oxidase (MAO) em
células gliais C6. A disfunção da MAO está relacionada a vários distúrbios psiquiátricos
e relacionados com a idade, como a depressão e a doença de Parkinson (NISHIOKA et
al., 2011; ZHEN et al., 2012). Há indicações de que o efeito antidepressivo da fisetina
15
envolve a regulação dos níveis de serotonina e noradrenalina centrais (ZHEN et al.,
2012).
A capacidade deste flavonóide para eliminar os radicais livres contribui para a sua
atividade antioxidante e os seus efeitos biológicos e anti-inflamatórios (PARK et al.,
2007; TOUIL et al., 2011a; KHAN et al., 2013). Inibe a produçao de proteína quinase C
(PKC), que está envolvida numa grande variedade de atividades celulares, que incluem
mitogênese, processos secretórios, e funcionamento de células inflamatórias e de
linfócitos T (MIDDLETON et al., 2000).
Figura 10: Estrutura da fisetina.
Fonte: KHAN et al., 2008
Fisetina não apresenta toxicidade em ratos, o que constitui uma vantagem notável
sobre os medicamentos seletivos que são utilizados para o tratamento de câncer (SYED
et al., 2011; TOUIL et al., 2011b; PAL et al., 2013). Em animais experimentais, fisetina
mostra-se com boa absorção, sendo detectada em bom nível no soro de ratos (SHIA et
al., 2008, TOUIL et al., 2011a; PAL et al., 2013).
Fisetina mostra potencial antimicrobiano, o que tem sido demonstrado pela
inibição de formação de biofilme de Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae
e efeito inibitório de crescimento in vitro de S. aureus, Staphylococcus albus, Bacillus
cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa (NARAYANA et
al., 2001; TAECHOWISAN et al., 2014). A atividade do composto fisetina contra
isolados do complexo de espécies C. neoformans e de dermatófitos apresentaram largo
espectro, como evidenciado pelos valores de CIM demonstrado em experimentos
anteriores (COSTA et al. 2014).
16
1.5.
Ensaios de segurança para a avaliação de um fármaco
Todo e qualquer composto passa por amplo e rigoroso processo de avaliação de
segurança para que seja caracterizado como um fármaco (OSORIO-DE-CASTRO et al.,
2004). Os testes efetuados envolvem uma sequência de experimentos e caracterização,
denominados triagem de protótipos nos quais são utilizados diversos ensaios biológicos
em nível molecular, celular, orgânico e de animais para definir a atividade e a
seletividade do futuro fármaco.
Em geral, busca-se do composto uma ampla variedade de ações, estabelecendo o
seu mecanismo e seletividade. Desta forma efeitos tóxicos inesperados e ações
terapêuticas não previstas podem ser descobertos (BARREIRO, 2002).
Os candidatos a fármacos que apresentam bons resultados nos procedimentos
iniciais de triagem e ainda caracteriza-se como de poder farmacológico são
cuidadosamente avaliados por meio de testes pré-clínicos quanto aos riscos potenciais
(BERKOWITZ, 2006). Sistemas in vitro e in vivo são usados para a obtenção do maior
conhecimento acerca das propriedades e dos efeitos adversos do fármaco em
desenvolvimento (FERREIRA et al., 2009).
Os testes de toxicidade celular (in vitro) fornecem as primeiras informações sobre
resposta biológica dos compostos em células de mamíferos, podendo ser descartados,
devido à sua citotoxicidade (FLINT et al., 2000).
Os testes in vivo realizados em seguida, submete o composto a experimentos que
envolvem a detecção de toxicidade a curto e longo prazo em animais, o que permite que
suas propriedades farmacológicas possam ser definidas dentro de uma relação doseresposta (FERREIRA et al., 2009). Segundo Grahame-Smith e Aronson (2004) a
duração do teste pré-clínico toxicológico deve ser semelhante ao tempo da provável
duração do uso terapêutico. Testes relacionados com a estabilidade do composto e
possibilidade de produção em larga escala fazem parte destes ensaios.
17
2. JUSTIFICATIVA
Dentre os fungos causadores de patologia humana, os pertencentes ao complexo
de espécies Cryptococcus neoformans e os dermatófitos são responsáveis por
importantes
infecções
tanto
em
pacientes
imunocomprometidos
quanto
em
imunocompetentes. Estes fungos causam infecções recidivantes e nem sempre a
terapêutica usada, apresenta resposta eficaz, além de apresentarem diversos efeitos
colaterais (BOUCHER et al., 2004).
Diante do aumento das infecções causadas por estes fungos e do desenvolvimento
de resistência aos antifúngicos por algumas espécies naturalmente sensíveis, estratégias
para o desenvolvimento de novos antifúngicos que atuem em diferentes alvos ou que
ajam com menor toxicidade ao organismo do hospedeiro são consideradas emergentes.
Ensaios previamente realizados com fisetina apresentaram bons resultados com
relação à suscetibilidade e citotoxicidade in vitro. O composto inibiu o crescimento de
fungos do complexo Crytocococus e de dermatófitos em concentrações baixas,
consideradas de relevância quando se analisa os compostos de potencial eficácia
(KUETE, 2010). Índice de citotoxicidade da fisetina para fibroblastos de mamíferos
menores do que a concentração inibitória mínima, revelando a sua baixa toxicidade foi
de grande importância para a escolha deste composto.
Os resultados encontrados incentivaram novas pesquisas acerca da ação do
composto fisetina sobre os fungos do complexo de espécies Cryptococcus neoformans e
de dermatófitos, além da realização de testes de segurança para a comprovação de sua
baixa toxicidade.
A ação da fisetina em células do complexo C. neoformans, avaliada pelo
doseamento de ergosterol permite a medida da sensibilidade da biossíntese do ergosterol
em isolados de fungos. Vários antifúngicos têm a sua ação sobre este principal
constituinte da membrana citoplasmática constituindo, portanto um forte entendimento
da ação dos compostos.
Levando em consideração as características da célula fúngica, uma das formas de
se verificar o seu mecanismo de ação é a determinação do conteúdo em ácidos
nucléicos, a taxa de respiração, a atividade enzimática intracelular e a integridade da
membrana citoplasmática ou da parede, além da viabilidade da célula. Através do
citômetro de fluxo é possível a análise destes parâmetros (CZECHOWSKA et al.,
2008).
18
A estrutura celular de um fungo visualizada por microscopia óptica ou eletrônica é
uma característica que deve ser considerada importante quando na presença de um
fármaco. Os compostos antimicrobianos podem alterar a estrutura da célula, podendo
desta maneira proporcionar informações sobre seu mecanismo de ação (MARTINELLI;
SANTOS, 2010). p
A segurança do uso de medicamento é uma regra imposta para a sua fabricação.
Da mesma forma todos os compostos devem ser exaustivamente estudados antes de
serem taxados como de potencial medicamentoso.
O sistema de formação e desenvolvimento das células sanguíneas a partir de um
precursor comum pluripotente, a hematopoiese, pode ser alterada sob a ação de
medicamentos. A avaliação da formação de colônias de granulócitos e macrófagos a
partir de unidades formadoras de colônias (UFC) através da estimulação destas células
por fator de crescimento específico e os efeitos tóxicos de xenobióticos sobre os
progenitores de medula óssea da série granulocítica/macrofágica podem ser analisados
pela avaliação da mielotoxicidade realizada em animais como os camundongos
(PARCHMENT, 1998).
A atividade hemolítica sobre células sanguíneas sadias também constitui uma
forma de avaliar se a substância é capaz de causar lesões na membrana plasmática
dos eritrócitos, uma estrutura que pode sofrer mudanças significativas na sua
interação com fármacos seja pela formação de poros ou pela ruptura total.
A linhagem celular humana HepG2, derivada de um carcinoma hepático é um
sistema modelo bem reconhecido e frequentemente utilizado para investigar a função
das células do fígado in vitro (BOKHARI et al., 2007). Como o fígado é o principal
órgão envolvido no metabolismo e no processamento de xenobióticos, linhagem de
células HepG2 é muitas vezes utilizada como ferramenta para a pesquisa da toxicidade
de fármacos e compostos que podem afetar a função de células do fígado (MERSCHSUNDERMANN et al., 2004). Esta linhagem celular apresenta muitas propriedades
semelhantes às dos hepatócitos, incluindo a secreção de produtos de genes específicos
(Rollier et al. 1993), a polaridade da membrana plasmática (MAURICE et al., 1988) e o
fator de regulação de crescimento da mobilidade celular (TAJIMA et al., 1992). Por tal
semelhança, a torna um modelo útil para estudos com fármacos quimioterápicos (ARCE
et al., 2005).
Baseados nesta exposição, o trabalho constou com os objetivos abaixo
mencionados.
19
3. OBJETIVOS
3.1.
Geral
1- Avaliar a atividade biológica do composto fisetina.
3.2.
Específicos
1- Determinar o mecanismo de ação, como doseamento de ergosterol, viabilidade e
metabolismo de células do complexo C. neoformans na presença de fisetina.
2- Avaliar as alterações morfológicas de leveduras do complexo C. neoformans e de um
grupo de fungos filamentosos denominados dermatófitos na presença de fisetina.
3- Avaliar a toxicidade do composto fisetina in vitro e in vivo.
20
4. MÉTODO(S)
4.1. Isolados
Este trabalho foi realizado com quatro isolados: C.neoformans ATTC 28957, C.
gattii ATCC 24065, Trichophyton mentagrophytes ATCC 20972 e uma amostra clínica
de Trichophyton rubrum obtida das unhas de paciente do Hospital das Clínicas da
Universidade Federal de Goiás. Os isolados clínicos foram provenientes de trabalhos
aprovados no comitê de ética do Hospital das Clínicas (nº 065/2008) e do Hospital de
Doenças Tropicais (nº 007/2004).
4.2. Mecanismos de Ação de fisetina sobre os fungos
4.2.1.
Doseamento de Ergosterol
Com o objetivo de determinar a ação da fisetina em células do complexo C.
neoformans foi usada a levedura C. gattii ATCC 24065 que foi analisada com relação
ao conteúdo de ergosterol. O teste de doseamento de ergosterol mede a sensibilidade da
biossíntese deste esterol em isolados de fungos sob o efeito de um determinado
composto.
Para a realização de sua dosagem, o ergosterol foi extraído conforme o método de
doseamento de esterol (MDE) descrito por Arthington-Skaggs (1999) com algumas
modificações. A suspensão de células fúngicas contendo uma concentração de 1 x
107UFC,
obtidas de colônias crescidas em ágar Sabouraud dextrose (Difco®
Laboratories, EUA), foi inoculada em erlenmeyers contendo 30 mL de caldo Sabouraud
dextrose na presença do composto ou de itraconazol (controle positivo) em
concentrações de inibição do microrganismo (128 µg/mL para fisetina e de 0,25 µg/mL
para itraconazol) e em concentração sub-inibitória correspondente a 1/2xCIM e
incubadas em agitador Orbital por 72 horas em agitação de 200 rpm e a uma
temperatura de 35ºC. O mesmo procedimento foi usado para o controle negativo sem
adição do composto. A suspensão de células obtidas foi transferida para tubos falcon e
centrifugada a 3700 rpm durante 10 min. O sobrenadante foi descartado e as células
foram lavadas com água destilada. O pellet obtido foi pesado e o sedimento seco
21
adicionado de 3 ml de solução alcoólica de potássio (25g de hidróxido de potássio, 35
ml de água destilada e álcool 100% qsp 100 ml). A suspensão das células obtida foi
submetida a agitação por 1 min e em seguida incubada em banho maria a 85°C por 4
horas. Após o resfriamento a temperatura ambiente (24ºC), o esterol foi extraído pela
adição de uma mistura de 1 mL de água destilada estéril e 3 mL de n-heptano seguida
de agitação vigorosa em vórtex por 3 minutos. Uma alíquota de 200µL da solução foi
diluída em 800µL em etanol P.A. e analisada em espectrofotômetro Varian Cary 50 Bio
spectrophotometer UV-visible em um intervalo de comprimento de onda (λ) de 200 a
350 nm. Os experimentos foram realizados em triplicata.
O conteúdo de ergosterol foi calculado de acordo com a porcentagem do peso
seco das células usando-se a equação:
% ergosterol + % 24(28) DHE = [(A281.5/290)xF]/ massa pellet
sendo que
% 24(28) DHE = [A230/518 xF]/massa pellet
% ergosterol = [% ergosterol +% 24(28) DHE] - 24(28) DHE
onde F é fator de diluição em etanol e 290 e 518 são os valores de E (em %/ cm)
determinado pelo ergosterol cristalino e 24(28) DHE.
4.2.2.
fluxo
Determinação da viabilidade e do metabolismo celular por citometria de
Para determinação da viabilidade e do metabolismo da célula fúngica sob a ação
do composto fisetina, foi utilizada a metodologia proposta por Pina-Vaz et al. (2005) e
Pinto et al. (2009) com modificações.
A amostra C. gattii ATCC 24065 (uma alçada da colônia) crescida em ágar
Sabouraud dextrose, foi inoculada em caldo Sabouraud dextrose (Difco® Laboratories,
EUA), e incubada overnight em agitação de 200 rpm, a uma temperatura de 35°C. Em
seguida as células foram centrifugadas por 10 minutos a 3000 rpm e lavadas com
solução PBS suplementada com 2% de glicose (pH 7,0) e ajustadas em câmara de
neubauer de tal modo a se obter uma concentração de 106 células/mL.
O composto fisetina foi preparado em meio de caldo RPMI sem bicarbonato de
sódio (Sigma Chemical Co) em concentrações de duas vezes o valor da 2xCIM (256
22
µg/mL), 1xCIM (128 µg/mL) e 1/2xCIM (64 µg/mL) (COSTA et al. 2014). Este
composto, nas diferentes concentrações foi incubado com a suspensão de leveduras em
estufa a 35ºC durante um período de 2hora. Após a incubação, as células tratadas foram
lavadas e ressuspensas em solução PBS suplementada com 2% de glicose e dois
marcadores: 1 µg/mL iodeto de propidio (PI) (o qual permite a observação de lesão de
membrana) ou 0,5 µM de FUN-1(2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo-1,3-thiazol2-yl)-methyli-dene) (sonda que mostra a atividade metabólica celular) em soluçãotampão Hepes (ácido N-(2-hidroxietilo)-piperazina-N'-2-etanesulfónico) (pH 7,2) para
marcação. Estas células foram mantidas em estufa a 35°C por 30 minutos na ausência
de luz.
O iodeto de propídio (PI) é um marcador de integridade de membrana, sendo
capaz de atravessar membranas lesionadas. Quando no meio intracelular, se liga aos
ácidos nucléicos emitindo fluorescência vermelha. Em células com membrana íntegra
este marcador não consegue penetrar e não apresenta fluorescência (PINA-VAZ et al.,
2001; VALE-SILVA et al., 2006). FUN-1 é uma sonda fluorescente que permeia a
membrana fluindo livremente para o interior da célula e inicialmente aparece no
citoplasma como uma fluorescencia difusa brilhante verde/amarelada. Em células
normais fúngicas, FUN-1 é metabolicamente convertido em estruturas intravacuolares
laranja/vermelho. No entanto, em células com alterações metabólicas, o corante
permanece difuso no citoplasma, indicando assim, uma desordem metabólica no estado
de vitalidade das células (MILLARD et al., 1997).
Foram usados como controle, amostras não tratadas com marcador (controle de
autofluorescência), amostras tratadas com o marcador, mas não submetida a nenhum
tratamento antifúngico (controle marcado), Anfotericina B (controle de lesão de
membrana) e azida sódica (controle de alteração metabólica).
Os resultados obtidos, levando-se em consideração a compensação negativa com a
autofluorescência das células fúngicas, foram analisados em citômetro Accuri C6
(Becton Dickinson Biosciences) de laser azul de argônio com um comprimento de onda
de 488 nm.
23
4.2.3.
Características morfológicas por microscopia eletrônica de varredura
A avaliação da interferência da fisetina sobre a morfologia dos fungos foi
verificada usando-se microscopia eletrônica de varredura de acordo com a metodologia
proposta por Faganello et al. (2006).
As amostras de C. neoformans ATCC 28957, C. gattii ATTC 24065, T.
mentagrophytes ATCC 20972 e amostra clínica de T. rubrum foram inoculadas em
placas de petri contendo meio de ágar Sabouraud dextrose (Difco ® Laboratories, EUA),
acrescido de 128 µg/mL (correspondente a 1xCIM) de fisetina. Para controle negativo,
utilizou-se o mesmo meio de cultura sem adição de composto. Após 48 horas para o
crescimento de leveduras, e de 5 dias para os dermatófitos, foi retirado da placa de petri
o meio contendo as colônias, o que foi caracterizado como pequenos blocos da amostra
fúngica. Estes blocos foram imersos em eppendorfs com fixador (2% de glutaraldeído,
2% de paraformaldeído em 0,1M de tampão cacodilato de sódio a pH 7,2 acrescido de
3% de sacarose) e mantidos overnight a 4°C. Em seguida, foram realizadas três
lavagens de 15 minutos cada, usando tampão cacodilato e pós-fixados em tetróxido de
ósmio a 1% e mantidos em geladeira, com ausência de luz por 1 hora. Após este período
as amostras foram novamente lavadas por duas vezes com tampão cacodilato. Após a
lavagem, as amostras foram desidratadas em uma série gradual de etanol (30% a 100%)
por 15 minutos cada e secadas no aparelho de ponto critico em CO2 por 40 minutos.
Posteriormente as amostras foram fixadas em um porta amostra (stub) com auxílio da
fita de carbono dupla-face, revestida com carbono e posteriormente analisadas em
microscópio eletrônico de varredura (Esquema 1).
Esquema 1. Processamento das amostras fúngicas para análise de alterações
morfológicas por microscopia eletrônica de varredura.
24
4.3.
Ensaios de toxicidade de fisetina
4.3.1.
Animais
Foi utilizado um total de nove (9) camundongos provenientes do Biotério Central
da Universidade Federal de Goiás (UFG), divididos para três tipos de experimentos
diferentes: potencial hemolítico, mielotoxicidade e toxicidade oral aguda. A comissão
de ética no uso de animais (CEUA) da UFG com protocolo nº 076/14 aprovou o
referido trabalho.
4.3.1.1
Avaliação do potencial hemolítico
A avaliação do potencial hemolítico da fisetina sobre eritrócitos de camundongos
foi realizada de acordo com a metodologia proposta por Santos Junior et al. (2010)
modificada por Gaeti et al. (2015). O sangue de camundongos foi coletado
previamente por punção cardíaca e lavado com salina (NaCl 0,85% + CaCl2 10mM,
pH 7,4) 3 vezes, por centrifugação de 10 minutos, a 2000 rpm. Em seguida foi feita
uma solução de eritrócitos (SE) a 2% em soro fisiológico. Em placas de
microtitulação de 96 poços, 100µl da suspensão de eritrócitos foi incubada com
diferentes concentrações crescentes de fisetina diluída em RPMI (Sigma Chemical Co)
(0,78; 1,56; 3,12; 6,25; 12,5; 25; 50; 100 e 200 µg/mL) por 1 hora sob agitação mecânica
constante à temperatura ambiente (25 ± 2°C), utilizando um agitador de placas de
microtitulação (Orbit P4 digital, Labnet, NJ, EUA). Em seguida, a placa de
microtitulação foi centrifugada a 1500 rpm por 10 minutos, o sobrenadante
removido e a hemoglobina analisada por espectrofotometria a um λ de 540 nm. Foram
realizados vários controles: controle negativo contendo solução salina; controle do
veículo da fisetina (RPMI e DMSO) e controle positivo com 0,5% de triton X-100 para
se obter 100% de hemólise (Esquema 2).
Os dados foram analisados pelo programa GraphPad prism (versão 5.0 para
Windows XP, Graph Pad Software, San Diego, California). A avaliação da hemólise
foi realizada a partir de três experimentos independentes e em octuplicata. Os
resultados foram apresentados em porcentagem (graficamente) levando-se em
consideração as médias ± desvio-padrão dos valores obtidos por espectrofotometria em
relação ao controle positivo (Triton X-100).
25
Esquema 2: Processo da análise da atividade hemolítica de fisetina sobre eritrócitos.
4.3.1.2
Análise de mielotoxicidade de fisetina
A avaliação da mielotoxicidade foi realizada de acordo com os procedimentos
realizados por Da Mota et al. (2012). Os animais foram anestesiados subcutaneamente
com 10 mg/Kg de Xilazina e 100 mg/Kg de ketamina e, após constatação de ausência de
reflexo das patas, eutanasiados por deslocamento cervical (HUBRECHT; KIRKWOOD,
2010). O fêmur foi exposto e removido na extremidade distal por deslocamento da
cartilagem e na extremidade proximal por corte dos ligamentos.
As células da medula óssea obtidas do fêmur foram transferidas, com auxílio de
agulha e seringa para um tubo contendo meio RPMI (Sigma Chemical Co) e
centrifugadas a 1500 rpm por 10 minutos. O sobrenadante obtido foi descartado e o
pellet suspenso em 1mL de meio RPMI. Em placas de petri de 35 mm foram
adicionados 200 µL de fator de crescimento (GM-CSF-M), 100 µL de fisetina em
diferentes concentrações (200; 100; 50; 25; 12,5; 6,25 µg/mL) e 1700µL de meio ágar
DMEM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) com células de medula óssea [20% de
26
SFB (Invitrogen, Eugene, OR, EUA), 30% DMEM 2x, 50% ágar ágar de tal modo a se
obter concentração celular de 1x105céls/mL]. Foram realizados controles: negativo
(fator de crescimento + meio ágar DMEM com células de medula óssea), positivo com
itraconazol em um concentração de 0,607mg/L, correspondente a concentração
inibitória de 50% das células de murinos (BENKOŐ et al., 1999), do veículo da fisetina
(DMSO+RPMI). As placas foram homogeneizadas e armazenadas em estufa de CO2 a
37°C por 7 dias. Após este período, foi realizada a contagem das colônias de
granulócitos (tipo compacta com um núcleo denso e um halo periférico ou do tipo
difusa/espalhada não apresentando núcleo aparente são consideradas como normais de
acordo com Pessina et al. (2000)). O teste foi realizado em três experimentos
independentes (lupa Leica NZ6, 3,2x).
Os dados foram expressos como médias ± desvio-padrão das colônias obtidas e
analisados utilizando o programa Graph pad prism (versão 5.00 para Windows XP,
Graph Pad Software, San Diego, Califórnia, EUA). A mielotoxicidade foi analisada por
análise de variância (one-way ANOVA) e posteriormente por teste de Tukey. As médias
foram consideradas estatisticamente significativas quando p<0,05.
4.3.1.3
Toxicidade Oral Aguda da fisetina
A toxicidade oral aguda foi realizada de acordo com o preconizado no guia
OECD (2001). O guia determina as doses a serem utilizadas e o número de animais
do mesmo sexo por dose como mostrado no Esquema 3.
A fisetina, suspensa em óleo vegetal comestível (óleo de girassol) numa dose
de 2000 mg/Kg, definida a partir de dados obtidos in vitro no teste de incorporação
do vermelho neutro com células basais 3T3 (COSTA et al. 2014), foi administrada
após restrição de alimentação por duas horas, oralmente, por gavagem, em
camundongos Swiss fêmeas. Os animais foram observados continuamente durante 4 h
(10min., 30 min., 1h, 2h, 4h) e diariamente por 14 dias para verificação de qualquer
alteração no comportamento geral ou nas atividades fisiológicas, como: perda de
peso e alteração no consumo alimentar, efeitos produzidos pela substância sobre o
estado de consciência, disposição, atividade e coordenação do sistema motor e
tônus muscular, atividade do sistema nervoso central e autônomo do animal. No
décimo quinto dia, os animais foram eutanasiados, a necropsia realizada e os rins e
figado coletados para análise histológica. Este experimento foi realizado duas vezes e
27
assim estimada a categoria toxicológica da fisetina definida pelo guia.
Dependendo do estado moribundo ou morte dos animais submetidos às
diferentes doses, a toxicidade é classificada em 5 categorias: classe 5: 2000 mg/Kg
≤ DL50 ≤ 5000 mg/Kg (dose de 2000mg/Kg) -morte de 0 a 1 animal;, classe 4:
300 ≤ DL50 < 2000 mg/Kg (dose de 300mg/Kg) morte de 0 a 1 animal; classe
3: 50 mg/Kg ≤ DL50 < 300 mg/Kg (dose de 50 mg/Kg) morte de 0 a 1 animal;
classe 2: 5 mg/Kg ≤ DL50 < 50 mg/Kg (5mg/Kg)  morte de 0 a 1 animal e
classe 1 quando ocorre de 2 a 3 mortes dos animais tratados com a dose de 5
mg/Kg caracterizando uma amostra altamente tóxica (Esquema 3).
Esquema 3: Procedimento para classificação da toxicidade oral aguda segundo
as doses iniciais preconizada por Organisation for Economic Co-operation and
Development (OECD) guidelines 423, 2001.
4.3.2. Hepatotoxicidade
4.3.2.1 Avaliação da viabilidade mitocondrial de células HepG2
Para a avaliação da citotoxicidade de fisetina sobre as células de carcinoma
hepatocelular humano (HepG2), foi empregado o método de redução do tetrazolium
adaptado de Mosmann (1983), que avalia a atividade mitocondrial de células viáveis
(FERNANDES et al., 2015). As células de HepG2 foram cultivadas em Dulbecco`s
modified Eagle`s medium (DMEM – 1640 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA)
28
suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB - Invitrogen, Eugene, OR, EUA) e
benzilpenicilina (100 000 UI/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) e mantidas em
frascos de cultura de células a 37ºC em estufa de CO2 a 5% e 90% de umidade. O meio
de cultura foi retirado das garrafas e as células foram lavadas com 10mL de PBS.Estas
células foram submetidas à tripsinização [2 mL de solução contendo PBS e tripsina
(1:1)], incubadas em estufa celular por 3 minutos, a tripsina foi inativada usando-se 10
mL de meio completo (DMEM + 10% SFB). e transferidas para um tubo de polietileno.
Em seguida foi realizada centrifugação a 1500 rpm por 5 minutos e o precipitado celular
ressuspendido em 1 mL de meio completo. Uma alíquota de 20 µL foi diluída em 180
µL de corante azul tripano para monitorar a viabilidade celular, que foi visualizada por
microscopia óptica, sendo as células viáveis contadas em câmara de neubauer.
Uma quantidade de 100 µL (por orifício) da suspensão de células contendo 1x106
células/mL viáveis foi distribuída em placa de microtitulação 96 orifícios e mantidas
por 24h a 37ºC em estufa celular (CO2 a 5% e 90% de umidade). Em seguida estas
células foram incubadas com oito diferentes concentrações de fisetina (3,125; 6,25;
12,5; 25; 50; 100; 200; 400 µg/mL) diluídas em meio DMEM suplementado com 2% de
SFB. Após incubação de 21 h em estufa celular, 10 µL de solução de MTT (SigmaAldrich, St. Louis, MO, EUA) foram adicionados em cada orifício da placa, incubado
por mais 3 h em estufa celular, completando um tempo de exposição total de 24 h.
Posteriormente, o sobrenadante da placa foi retirado, e 100 µL de DMSO (SigmaAldrich, St. Louis, MO, EUA) foram adicionados a cada orifício. A placa foi agitada
mecanicamente por 20 minutos para promover a solubilização dos cristais de formazana
produzidos. [O sal de MTT (brometo de 3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) é
clivado pela succinato desidrogenase, enzima ativa em células vivas, produzindo cristais
azuis de formazana. A quantidade desses cristais formados é diretamente proporcional
ao número de células viáveis (MOSMANN, 1983)]. A leitura da placa foi realizada em
espectrofotômetro Multiskan Spectrum Thermo Scientific® com λ de 560 nm. A
absorbância obtida das células-controle (células Hep 2 viáveis e meio completo com
ausência de fisetina) foi considerada como 100% de viabilidade celular. O mesmo
procedimento foi realizado usando-se o itraconazol em concentrações de 3,125; 6,25;
12,5; 25; 50; 100; 200; 400 µg/mL. Foram realizados três experimentos independentes e
para cada concentração de fisetina utilizou-se seis orifícios independentes (Esquema 4).
Os resultados foram analisados pela média das leituras de densidade óptica de
cada diluição e comparados com a média do controle negativo de células (100%),
29
obtendo-se a porcentagem de sobrevida das células em cada diluição, que foram
expressos graficamente.
Os dados foram analisados estatisticamente usando software GraphPad Prism 5.0
obtendo uma curva, na qual pode ser encontrado o índice de citotoxicidade IC50%
(concentração do composto que destrói metade da população celular).
Esquema 4: Representação esquemática dos orifícios da placa de microtitulação
após formação de monocamada de células HepG2 e adição de concentrações
crescentes de fisetina para o ensaio de redução de MTT.
4.3.2.2
Avaliação da morfologia de células HepG2 com corante Giemsa
As alterações morfológicas ocorridas em células HepG2 tratadas com fisetina
foram avaliadas por microscopia óptica através da coloração de May-Grunwald-Giemsa
(Rosenfeld, 1947). Suspensão de células HepG2 contendo 1x106 UFC/mL em meio
completo (DMEM + 10% SFB) foi distribuída nos orifícios (6) de placa de cultura
celular e mantidas por 24h a 37ºC em estufa de CO2 a 5% e 90% de umidade. A cada
30
um dos orifícios contendo as células HepG2 foram acrescentados fisetina em uma
concentração de 12,7 µg/mL, correspondente a IC 50%, e incubadas por 24 horas. Após
este período o meio de cultura foi retirado, as células lavadas por duas vezes com PBS e
fixadas com 400µL de metanol por 2 minutos. O metanol foi retirado, adicionou-se 400
μL de solução de uso do corante Giemsa, por 10 minutos e os orifícios foram lavados
com H2O deionizada, mantendo-se a placa em estufa de secagem. As células foram
observadas em microscópio óptico invertido (AxioScope A1 Carl ZEISS, Gottingen,
Germany, aumento de 100x) e fotografadas com AxioCam MRc Carl Zeiss e software
AxioVs40 V 4.7.2.0 Carl Zeis. O mesmo procedimento foi realizado usando-se o
itraconazol à uma concentrações de 150 µg/mL (IC 50%). O experimento foi realizado
em triplicata.
4.3.2.3
Avaliação da morfologia nuclear de células HepG2 com corante Hoechst
33342
A morfologia nuclear foi avaliada pela integridade da cromatina ou a
fragmentação/condensação nuclear conforme descrito por Sandhu et al. (1985).
O corante Hoechst 33342 (Invitrogen, Eugene, OR, USA) é DNA fluorescente,
permeável à célula, que se liga preferencialmente às bases adenina-timina do DNA.
Suspensão de células contendo 1x106 UFC/mL em meio completo (DMEM + 10%
SFB) foi distribuída em placa de petri de 35 mm e mantida por 24h a 37ºC em estufa de
CO2 a 5% e 90% de umidade. Em seguida, a esta suspensão foi adicionado fisetina em
uma concentração de 12,7 µg/mL (IC50%), diluída em meio DMEM e incubada por
24h. As células foram então fixadas com metanol por 5 minutos e lavadas com PBS T20
(PBS + 0,05% Tween 20) por duas vezes. Uma quantidade de 500 μL de solução de uso
de corante Hoechst 33342 (10 μg/mL, diluído em PBS e estocado a -20ºC) foi
adicionado à placa de petri, por 20 minutos ao abrigo da luz, e em seguida lavado com
PBS. A morfologia nuclear foi observada em microscópio de fluorescência (Leica DMI
4000 B®, Solms, Alemanha 40X) e fotografada com Leica DCF 340 FX®. O mesmo
procedimento foi realizado usando-se itraconazol à uma concentrações de 150 µg/mL
(IC 50%). O experimento foi realizado em triplicata.
31
4.3.2.4 Análise da viabilidade, apoptose e necrose de células HepG2 por
externalização da fosfatidilserina
Para este experimento as células HepG2 (diluídas em DMEM) em uma
concentração de 1x106 células/mL foram incubadas com fisetina (diluída em caldo
RPMI) a uma concentração de 12,7 (IC 50%) µg/mL por 24 horas em frasco de
cultura celular de 25cm2. Em seguida foram lavadas com PBS, centrifugadas a 1500
rpm por 10 minutos e ressuspendidas a 1:10 com tampão de ligação diluído (10
mmol/L de HEPES/NaOH; 140 mmol/L de NaCl a 2,5 mmol/L de CaCl2). Uma
quantidade de 100 µL da solução contendo 1x105 células/mL foi transferida para um
tubo de cultura de 5 mL e adicionado de 5 µL de anexina V
(proteína com capacidade de se ligar com alta afinidade a fosfolipídeos de carga
negativa da superfície celular, como a fosfatidilserina) conjugada com o fluorocromo
FITC (substância usada para identificação de células apoptóticas) e adição de 5 µl de
iodeto de propídio (fluorocromo que possibilita separar as células viáveis e aquelas nos
diferentes estágios da apoptose). A mistura foi vortexada suavemente e incubada
durante 15 min à temperatura ambiente (25°C) no escuro. Após esse período foi
adicionado 400 µl de tampão de ligação 1x a cada tubo e realizada a leitura em
citômetro de fluxo. As células que não perderam a integridade da membrana excluem o
PI e não são marcadas com anexina V-FITC, as células em apoptose recente são
marcadas com anexina V-FITC, aquelas em apoptose tardia apresentam dupla
fluorescência, enquanto as células necróticas apresentam apenas marcação com PI.
Células HepG2 não marcadas, células marcadas com anexina V-FITC (sem PI), células
marcadas com PI (sem anexina V-FITC) foram usadas como controle. Os resultados
foram apresentados em gráficos de dot-plot (gate de 10.000 eventos) e de porcentagem
dos estágios da célula HepG2. O mesmo procedimento foi realizado usando-se
itraconazol à uma concentrações de 150 µg/mL (IC 50%). O experimento foi realizado
em triplicata seguindo o protocolo do fabricante (BD Pharmingen™).
32
5. RESULTADOS
5.1. Mecanismos de Ação de fisetina sobre os fungos
5.1.1. Doseamento de Ergosterol
O ergosterol extraído das células fungicas e seus perfis espectrais determinados
com λ variando de 200 a 350 nm mostrou que no controle, células de C. gattii sem
adição de fisteina, há uma produção máxima de ergosterol no valor de 0,0099392217
em comprimento de onda de 280nm como mostrado na Figura abaixo.
Figura 11: Curva espectrofotométrica obtida em diferentes comprimentos de onda de
células não tratadas de Cryptococcus gattii.
Quando as células de C. gattii foram submetidas à ação de fisetina ou de
itraconazol foi observado uma redução de produção de ergosterol. Em concentração
correspondente a ½ CIM a produção foi maior do que em CIM tanto para fisetina como
para itraconazol, antifúngico que age na síntese de ergosterol. No pico de λ 280nm, os
valores percentuais de ergosterol para ½ CIM e CIM de itraconazol foram
0,0076724239% e 0,0060706995% respectivamente, enquanto que em ½ CIM e 1XCIM
de fisetina foram 0,007784923% e 0,0074109407% respectivamente. Desta forma
quando se comparou os valores obtidos com as células controle, verificou-se uma
redução de 25,4% do conteúdo de ergosterol na 1XCIM (128µg/mL) e de 21,6% na ½
CIM (64 µg/mL) causado pela fisetina para as células de C. gattii. Com relação ao
itraconazol a redução foi de 38,9% na 1XCIM (0,25 µg/mL) e de 22,8% na ½ CIM
(0,125µg/mL).
A curva espectrofotométrica da produção de ergosterol em absorbância em
diferentes comprimentos de onda (200 a 350 nm) por células de C. gattii na presença de
itraconazol e de fisetina em concentrações de ½ CIM e em 1XCIM, é mostrada na
Figura 12.
33
Figura 12: Curva de espectrofotometria de células de Cryptococcus gattii (controle) e
em contato com ½ CIM e CIM de itraconazol (A) e de fisetina (B).
5.1.2.
Citometria de Fluxo
O mecanismo de ação da fisetina utilizando-se citometria de fluxo com os
marcadores Iodeto de Propidio (PI) e FUN-1(2-chloro-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo1,3-thiazol-2-yl)-methylidene) mostrou que células fúngicas controles, sem adição de
fisetina, estavam metabolicamente ativas e sem alteração de membrana como
visualizado na Figura 13.
Figura 13: Histogramas mostrando o controle da célula fúngica sem adição de fisetina.
A-controle de viabilidade de FUN-1. B- controle de viabilidade de PI.
Cm = controle marcado; Ct Af = controle de autofluorescência.
Os resultados evidenciaram que o composto fisetina foi capaz de reduzir o
metabolismo das células fúngicas de acordo com a concentração, havendo 51% de
redução do número de células viáveis em ½ CIM (64 µg/mL), de 72,4% na CIM de
128µg/mL e de 76,3% em 2 x CIM (256µg/mL) como mostrado na Figura 14.
34
Figura 14: Fluorescência com o marcador FUN-1 sobre células de Cryptococcus gattii
ATCC 24065 tratadas com fisetina (em vermelho), e sem tratamento (em preto)
A=tratadas com 2x CIM de fisetina (redução de 76,3%), B= tratadas com 1xCIM de
fisetina (redução de 72,4%) e C= tratadas com ½ CIM de fisetina (redução de 51%).
A
B
C
O marcador fluorescente PI tem a capacidade de penetrar no meio citoplasmático
de células que sofreram lesão na membrana celular, ligando-se no meio intracelular a
ácido nucleico e corando as células mortas pela emissão de fluorescência vermelha. A
alteração de lesão observada foi muito reduzida, mostrando que este composto não foi
capaz de destruir estas células. A alteração celular marcada com o PI pode ser
visualizada na Figura 15.
Figura 15: Fluorescência com o marcador PI sobre células de Cryptococcus gattii
ATCC 24065 tratadas com fisetina (em vermelho), e sem tratamento (em preto). A=2x
CIM de fisetina (23,9%), B=1x CIM de fisetina (23,8%), C=½ CIM de fisetina (22,7%).
A
A
B
C
35
5.1.3. Características morfológicas por microscopia eletrônica de varredura
As células de C. neoformans e de C. gattii (controle) apresentaram formas
tipicamente globulares, apesar de algumas delas terem perdido sua integridade devido
ao processo de preparação das amostras (desidratação) e pela formação de vácuo no
interior da câmera do microscópio como evidenciado na Figura 16 (A e C). As células
tratadas com fisetina apresentaram alterações estruturais e morfológicas importantes
quando comparadas ao grupo controle. Observou-se que as células fúngicas murcharam
e suas cápsulas tornaram-se com um aspecto rugoso, mas não se verificou lise da
membrana. Estas características são mostradas na Figura 16 (B e D).
Figura 16: Células do complexo Cryptococcus neoformans em microscopia de
varredura. Sem tratamento mostrando-se íntegras, (A e C) e tratadas com fisetina,
evidenciando-se leveduras murchas com cápsulas rugosas (B e D).
As imagens de microscopia eletrônica de varredura de T. mentagrophytes e T.
rubrum não tratadas apresentaram estruturas típicas, com hifas íntegras, filamentos de
largura uniformes, cilíndricas e aparência exterior lisa como observado na Figura 17 (A
e C). Grande quantidade de conídios foi verificada no isolado de T. mentagrophytes
ATCC 20972 (Figura 17 A). As amostras de microscopia de varredura de T.
mentagrophytes e T. rubrum não tratadas apresentaram estruturas típicas, com hifas
íntegras, filamentos de largura uniformes, cilíndricas e aparência exterior lisa como
36
observado na Figura 17 (A e C). Grande quantidade de conídios foi verificada no
isolado de T. mentagrophytes ATCC 20972 (Figura 17 A). As amostras de dermatófitos
tratadas com fisetina apresentaram hifas de espessura não uniforme e com rugosidade,
como visualizado na Figura 17 (B e D). T. mentagrophytes ATCC 20972 tratado com
fisetina mostrou-se com poucos conidios (Figura 17 B).
Figura 17: Microscopia de varredura de Trichophyton mentagrophytes e de
Trichophyton rubrum. Filamentos e conídios de dermatófitos não tratados com fisetina
(A e C). Tratados com fisetina (B e D).
5.2.
5.2.1.
Ensaios de segurança de fisetina
Potencial hemolítico
Na análise da placa de cultura visualizada a olho nu (Figura 8) não se evidencia
hemólise nas diferentes concentrações de fisetina (0,78 a 200 μg/ml), mesmo em valores
acima da CIM (128 μg/ml).
A citotoxicidade de fisetina evidenciada pelo seu potencial de causar lesões na
membrana plasmática do eritrócito pela formação de poros ou pela ruptura total, ou seja,
a hemólise mostrou-se com valores abaixo de 1%. Estes valores foram obtidos pela
análise da hemólise verificados pelas médias dos experimentos de acordo com a leitura
espectrofotométrica (Figura 9).
37
Figura 18: Placa de microtitulação mostrando a avaliação do potencial hemolítico de
fisetina em diferentes concentrações sobre os eritrócitos.
Controle negativo (solução salina); controle positivo (triton X-100); controle do veículo
(RPMI e DMSO).
Figura 19: Percentual de hemólise em eritrócitos de camundongos Swiss após
tratamento com fisetina.
*Cada ponto representa média ± desvio-padrão da média de três experimentos em oito
replicatas.
38
5.2.2.
Mielotoxicidade
Os
efeitos
do
composto
fisetina
em
células
progenitoras
de
granulócitos/macrófagos de medula óssea de camundongo são apresentados nas Figuras
10 e 11. A exposição à fisetina nas concentrações testadas (200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25
µg/mL) não provocou alterações de quantidade e tamanho das colônias de células
progenitoras de granulócitos/macrófagos de medula óssea quando comparadas com o
controle. As células tratadas com Itraconazol apresentaram uma redução significativa de
58,9% (p<0001) em relação ao controle. A comparação de fisetina e de itraconazol
mostrou que a alteração produzida pela fisetina nas quatro menores concentrações, foi
significativamente menor (p<0,001) do que aquelas causadas pelo itraconazol na
concentração testada (0,607 µg/mL).
Figura 20: Efeito da fisetina sobre a formação de colônias de UFC-GM da medula
óssea de camundongos. Quantificação de colônias em percentual de crescimento em
relação ao grupo controle (100% de crescimento).
***p<0.0001 vs. Controle; ##p<0.001 e #p<0.05 vs. Itraconazol.
39
Figura 21: Colônias UFC-GM de medula óssea de camundongo. A – difusa/espalhada
(controle). B – Compacta (controle). C – Difusa espalhada [Tratada com o veículo de
diluição da fisetina (DMSO+RPMI)]. D – Compacta e reduzida (tratada com
itraconazol. E – Colônia difusa /espalhada semelhante ao controle (tratada com fisetina
a 6,25µg/mL). F – Colônia compacta semelhante ao controle (tratada com fisetina
200µg/mL). Fotomicrografia em lupa 3,2x. Barra:100 pixel.
5.2.3.
Toxicidade Oral Aguda
Na dose de 2000mg/Kg de fisetina não foram verificados efeitos tóxicos,
evidenciados pela ausência de sinais de toxicidade ou mortalidade nos animais durante
o período de estudo (14 dias). Não houve perda de peso, alterações de consumo de
comida ou alterações macroscópicas nas vísceras dos animais tratados, inclusive nos
principais órgãos metabolizadores (rins e fígado) de xenobióticos (Figura 22).
Figura 22: Rins e fígado de camundongo submetido à administração oral de fisetina
sem alterações macroscopicamente visíveis (Análise de toxicidade aguda).
40
5.2.4. Hepatotoxicidade in vitro
5.2.4.1
Avaliação da viabilidade mitocondrial de células HepG2
Os resutados encontrados usando MTT, quando comparados com o valor
correspondente à IC50% de fisetina de 12,7 µg/mL (44 µM) revelaram efeito citotóxico
para as células de HepG2. Baixas concentrações de fisetina 3,25 e 12,5 µg/mL não
mostraram diferenças na viabilidade comparada ao controle. Entretanto a viabilidade de
HepG2 foi significantemente inibida por fisetina em concentrações de 25 a 400 µg/mL.
A redução da viabilidade foi dose dependente, a medida que aumentava a concentração
de fisetina, a redução de viabilidade de células aumentava mostrando que a fisetina foi
citotóxica para células HepG2 como mostrado na Figura 23. Assim, fisetina alterou o
metabolismo de células HepG2.
Figura 23: Curva da viabilidade mitocondrial de carcinoma hepatocelular humano
HepG2 após exposição à diferentes concentrações de fisetina e itraconazol.
5.2.4.2
Morfologia celular com corante Giemsa
A exposição de células HepG2 de carcinoma hepático a fisetina causaram pouca
alteração morfológica. Verificou-se pequena redução do tamanho da célula, sem
agregação citoplasmática ou desintegração nuclear. Quando se realizou a análise com
itraconazol verificou-se que um grande número de células apresentava-se de tamanho
reduzido. A morfologia destas células tratadas com fisetina ou itraconazol é mostrada na
Figura 24.
41
Figura 24: Células de carcinoma hepático humano HepG2. A - Sem tratamento. BTratadas com itraconazol a 229 µM. C- Tratadas com fisetina a 44 µM (12 µg/mL).
Fotomicrografia em microscópio invertido 100x.
5.2.4.3
Morfologia nuclear com corante Hoechst 33342
Os núcleos uniformes de material genético distribuídos de forma homogênea no
interior das células de carcinoma hepático humano (HepG2) visualizados no controle
destas células foram alterados quando submetidos à tratamento com itraconazol ou com
fisetina. A exposição ao antifúngico itraconazol resultou em células com o núcleo
contraído (picnótico), enquanto que nas células tratadas com fisetina verificou-se a
fragmentação da cromatina sugerindo apoptose. A Figura 25 mostra a morfologia de
núcleos das células HepG2 corados com Hoechst 33342 na presença de fisetina e de
itraconazol.
Figura 25: Microscopia de fluorescência de células HepG2 coradas por Hoechst 33342.
A-controle B- tratadas com itraconazol (229 µM) e C-fisetina (12 µg/mL). Células
com compactação do núcleo
células com fragmentação da cromatina. Microscopia
de fluorescência 40x.
5.2.4.4
Análise da viabilidade, apoptose e necrose de células HepG2 por
externalização da fosfatidilserina
As células HepG2 tratadas com fisetina na concentração de 44 µM mostraram alta
viabilidade, reduzido número de células em apoptose recente e praticamente não se
42
verificou apoptose tardia ou necrose. Cerca de 90%, das células analisadas não
mostraram marcação com os fluorocromos (anexina V-FITC ou PI), e marcação com
anexina V-FITC foi verificada em aproximadamente 5%.
Na análise de comparação com o itraconazol em concentração de 229 µM,
verificou-se que células tratadas com este antifúngico apresentaram uma viabilidade de
cerca de 60% (Anexina V FITC e PI negativos), apoptose recente de  32% (marcação
com Anexina-V FITC), apoptose tardia  4% (dupla marcação com os fluorocromos) e
necrose  2% (marcação com PI). A análise realizada pelo citômetro de fluxo e os
percentuais obtidos da viabilidade celular e apoptose das células HepG2 sob a ação de
fisetina e de itraconazol encontram-se nas Figura 26 e 27.
Figura 26: Análise por citometria de fluxo da externalização de fosfatidilserina em
células HepG2 tratadas com fisetina e itraconazol. Representação do dot plot do ensaio.
(A - não tratadas; (B)- Tratadas com 229 µM de itraconazol; (C) tratadas com 44,6 µM
de fisetina.
43
Figura 27: Comparação do percentual (média ± DP de duas experiências
independentes) de células HepG2 viáveis, em apoptose e em necrose tratadas com
fisetina e com itraconazol.
44
6. ARTIGO
Artigo 1 – Fisetin as a promising antifungal agent against Cryptococcus neoformans
species complex
45
7. DISCUSSÃO
Uma extensiva região da América do Sul é constituída pelo Cerrado que cobre
mais de 2 milhões de quilômetros quadrados do Brasil. Esta região brasileira possui
aproximadamente 10000 espécies de plantas, 4400 são endêmicas no Brasil (KLINK;
MACHADO, 2005) e muitas apresentam importantes propriedades medicinais (SOUZA
et al., 2002). Muitos medicamentos utilizados na terapêutica convencional podem ser
originados de produtos naturais incluindo as plantas. Produtos naturais constituem uma
fonte de diversidade química e são considerados como importantes agentes terapêuticos
para muitas infecções causadas por diferentes microrganismos (SILVA JÚNIOR et al.,
2009).
Metabólitos secundários são compostos encontrados nos vegetais e que
normalmente apresenta potencial bioativo. As vias metabólicas secundárias vegetais dão
origem a diversas classes de compostos, tais como, alcalóides, flavonóides,
isoflavonóides, taninos, cumarinas, glicosídeos terpenóides e poliacetilenos, que por
vezes, são específicos de determinadas famílias, gêneros ou espécies (COWAN, 1999).
Dentre estes metabólitos, os flavonoides e ácidos fenólicos são fortes candidatos
para o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos. Os flavonóides constituem
uma gama de substâncias que possuem papel importante na proteção de sistemas
biológicos contra efeitos prejudiciais de processos oxidativos nas macromoléculas de
carboidratos, proteínas, lipídios e DNA. Os flavonóides extraídos do chá, cacau,
chocolate, frutas, outrod vegetais e vinhos são compostos antioxidantes que auxiliam na
redução da incidência de acidentes vascular cerebral, problemas cardíacos, diabetes e
câncer (GHASEMZADEH; GHASEMZADEH, 2011).
Fisetina, flavonóide de ocorrência natural, abundante em morangos, outras frutas
como o caqui, jatobá e outros vegetais com atividades antioxidantes, anti-inflamatórias
e neuroprotetora (ISHIGE et al., 2001; BRASH; HAVRE, 2002) constituiu o objeto de
nosso estudo.
Em experimentos realizados previamente por nosso grupo (COSTA et al., 2014)
verificamos a ação de fisetina obtida de Hymenaea courbaril L. (jatobá) sobre os fungos
filamentosos como os dermatófitos e sobre leveduras pertencentes ao gênero
Cryptococcus. A determinação do mecanismo de ação de um composto sobre o
microrganismo torna-se de grande importância para a explicação do seu efeito
antimicrobiano. Assim, analisamos se a fisetina foi capaz de inibir o teor de ergosterol
46
de células de C. neoformans e se afetou sua viabilidade e metabolismo. Da mesma
forma, avaliamos também a capacidade deste flavonóide na alteração da morfologia de
leveduras do complexo de espécies de C. neoformans e de alguns dermatófitos.
A menor quantidade de ergosterol observada em nosso estudo com isolados do
complexo de espécies de C. neoformans, na presença de fisetina em concentração
inibitória (38,9%) e sub-inibitória (22,8%) comparado com o controle, revelou que este
composto prejudica consideravelmente a biossíntese de ergosterol. Este componente é o
principal constituinte da membrana da célula fúngica (RODRIGUEZ et al., 1985). É
bem conhecido que os agentes antifúngicos azólicos atuam interrompendo o processo
normal da biossíntese de esteróis através da inibição da enzima 14-α-demetilase
impedindo a conversão do lanosterol em ergosterol (SANGLARD, 2002). Segundo
Bitencourt et al. (2013), o flavonóide quercetina causou uma redução considerável na
quantidade de ergosterol. Assim, a dosagem no teor de ergosterol parece ser relevante,
sugerindo pelos resultados encontrados que um dos alvos de fisetina em sua ação
antifungica possa ser este componente.
Os efeitos antimicrobianos atribuídos a alguns flavonóides podem resultar de
alterações no metabolismo das células alvo (CUSHNIE; LAMB, 2005). As alterações
na membrana das células fúngicas induzidas por fisetina verificadas por citometria de
fluxo mostraram baixa penetração de PI (permite a verificação da viabilidade resultando
em um aumento na fluorescência vermelha) em concentrações 2x superior à CIM,
sugerindo que este composto é capaz de produzir restritas lesões na membrana da célula
alvo. Outras plantas estudadas têm mostrado resultados adversos. Silva et al. (2014),
avaliaram o mecanismo de ação dos flavonóides catequina hidratada, quercetina
hidratada ou epigalocatequina em ação sinérgica com fluconazol contra cepas de
Candida tropicalis resistentes ao fluconazol. As células de levedura tratadas com
fluconazol em combinação com os flavonóides após 24 horas de exposição mostraram
um aumento significativo na população com danos na membrana em comparação com a
população com dano da membrana no grupo controle.
O aumento da intensidade de fluorescência obtida com FUN-1, que indica
difusão do corante no citoplasma das células fúngicas, mostrou que as células foram
danificadas no seu metabolismo, evidenciando alteração no estado de vitalidade
metabólica das células sugerindo que ação da fisetina ocorre por desequilíbrio
metabólico da célula alvo. Estes resultados de citometria de fluxo mostraram que os
efeitos de deficiência metabólica da célula causados por fisetina foram mais
47
evidenciados do que lesão da membrana celular. Experimentos realizados com o triazól
fluconazol, antifúngico largamente conhecido como fungistático (PINA-VAZ et al.,
2001), mostram semelhança nos resultados obtidos com fisetina com relação à
citometria de fluxo sugerindo que este composto é um agente fungistático. A
incorporação de PI produzindo intensa coloração na célula como ocorre com alguns
medicamentos como o ibuprofeno sugere efeito fungicida (PINA-VAZ et al., 2000).
A visualização da ultraestrutura da superfície das células realizadas por
microscopia eletrônica de varredura com retração de citoplasma e formação de muitas
pequenas saliências mostrou que a fisetina é capaz de alterar a morfologia das células do
complexo de espécies C. neoformans. Embora haja diferentes técnicas de microscopia
utilizadas como uma ferramenta para avaliar o efeito de compostos sobre
microrganismos e identificar possíveis alterações morfológicas em sua superfície celular
ou em organelas (ADADE; SOUTO-PADRÓN, 2010), é difícil de explicar o modo de
ação de qualquer composto na morfogênese de células fungicas relacionados com a ação
de inibição do crescimento. De acordo com Sharma e Tripathi (2008) modificações
induzidas pelo óleo essencial podem estar relacionadas com a interferência de
componentes do óleo em reações enzimáticas relacionadas à síntese da parede, o que
afeta a morfogênese dos fungos e o seu crescimento. Hammer et al. (2004) descreveram
que as células do microrganismo tratadas com o óleo de Melaleuca alternifolia alteram
a permeabilidade da membrana celular acarretando extravazamento do seu conteúdo. As
alterações morfológicas obtidas, associadas aos resultados de citometria de fluxo como
previamente exposto acima podem ser explicadas de forma semelhante aos de Park et al.
(2009), que verificaram que a atividade de citral, eugenol e α-terpinol pode ocorrer no
metabolismo da célula fúngica, resultando na destruição de organelas do citoplasma e
consequentes mudanças na morfologia da membrana celular.
Apresentação de hifas com larguras não uniformes e com maior rugosidade em T.
rubrum, e redução considerável da quantidade de conídios em T. mentagrophytes
mostraram que fisetina foi capaz de assim como para as leveduras de alterar a
ultraestrutura dos fungos filamentosos. Similar aos nossos resultados o óleo essencial de
Cymbopogon winterianus apresentaram efeitos inibitórios sobre a germinação dos
conídios com larga inibição conidial em T. rubrum e T. mentagrophytes (PEREIRA et
al., 2011a; PEREIRA et al., 2011b). As hifas são consideradas de extrema importância
na virulência dos fungos filamentosos, já que a penetração dos dermatófitos em
camadas mais internas da pele é relacionada à facilidade de penetração e maiores danos
48
na pele do hospedeiro (PEREIRA et al., 2011a). Além disso, a interferência de fisetina
na conidiogênese de dermatófitos verificada em nosso trabalho mostra que a patogenia
pode ser reduzida com este composto, pois a germinação de conídios é um fator
relacionado à gravidade do processo infeccioso.
Compreender o mecanismo de ação de cada antifúngico representa um
importante passo para seu uso e tratamento adequado da micose, podendo assim,
auxiliar na redução de sua toxicidade.
Estudos para avaliação das propriedades biológicas de extratos vegetais são de
extrema importância, porém, para avaliação da segurança de seu uso como
medicamentos, a avaliação da toxicidade, estudos farmacológicos pré-clínicos e clínicos
são indispensáveis para a garantia da eficácia do tratamento (LAPA et al., 2007).
A toxicidade durante o desenvolvimento pré-clínico de um fármaco está
direcionada para medula óssea, para a linhagem de células como linfócitos, neutrófilos,
megacariócitos, ou eritrócitos, levando-se em consideração a dosagem e o nível
plasmático adquirido pelo fármaco (PESSINA et al., 2003).
Apesar da escassez de artigos relatando ensaios de segurança de compostos com
atividade antifúngica, a avaliação da toxicidade in vitro é importante para definir a
citotoxicidade basal, ou seja, a habilidade intrínseca de um composto causar alterações e
morte celular como consequências de dano das funções celulares básicas, além de
apresentar boa reprodutibilidade, fácil execução, baixo custo relativo e reduzir o uso de
animais utilizados nos testes de toxicidade (ROGERO et al., 2003; VALADARES,
2006).
A indução de hemólise e danos a células basais representam fatores limitantes
para o desenvolvimento de fármacos (ISHIHARA et al., 2002). A fisetina, composto
estudado em nosso trabalho demonstrou em todas as concentrações testadas, carência de
hemólise em células eritrocíticas, sugerindo que os flavonoides, um dos grandes
constituintes das plantas desempenha esta função como ocorreu em trabalhos de Zhu et
al. (2002), Cesquini et al. (2003) e Hou et al. (2004) que verificaram efeitos protetores
de flavonóides contra danos oxidativos em membranas destas células animais. A
citotoxicidade in vitro de extratos e compostos extraídos de plantas sobre a membrana
dos glóbulos vermelhos tem sido estudada ao longo do tempo e correlacionada com os
seus constituintes (SHARMA; SHARMA, 2001). A avalição da hemólise é uma técnica
eficiente e de baixo custo que pode mostrar o efeito de xenobióticos em concentrações
crescentes quando colocadas em contato com células sanguíneas. A estabilidade
49
mecânica da membrana do eritrócito é um bom indicador de toxicidade de substâncias
vegetais com potencial farmacológico (AKI; YAMAMOTO, 1991; SHARMA;
SHARMA, 2001). Uma possível explicação da ação de flavonoides reside
provavelmente na ligação destes constituintes à membrana de eritrócitos, inibindo a
peroxidação lipídica e ao mesmo tempo, aumentando a sua integridade contra lise
hipotônica (CHAUDHURI et al. 2007).
O efeito agudo de uma substância em células progenitoras de medula óssea, tais
como granulócitos-macrófagos (CFU-GM), eritróides (CFU-E), e megacariócitos (CFU
MK) têm sido estudados como forma de segurança pré-clínica em candidatos a
fármacos (DELDAR, 1994; DELDAR; STEVENS, 1993), sendo que a quantificação de
células progenitoras que sobrevivem em função do nível de exposição sob diferentes
concentrações do composto teste representa uma forma eficaz de reconhecimento da
segurança deste composto (PESSINA et al., 2003; METCALF, 1984). A análise
clonogênica de CFU-GM usada nesse trabalho confirma ou detecta o risco de um
xenobiótico induzir danos à medula óssea, propiciando informações toxicológicas
humana nos estágios investigativos iniciais. Desta forma, a quantidade de células
progenitoras de granulócitos/macrófagos acima de 70% em todas as concentrações de
fisetina testadas e uma viabilidade menor destas células quando se usou itraconazol
(60%) como controle, mostra que o composto tem um reduzido efeito tóxico sobre estas
células. Antifungal azólicos têm sido relatados como inibidores da formação de
macrófagos in vitro (MEEKER et al., 1983). De acordo com Parchment et al. (1993),
experimentos realizados com agentes anti-neoplásicos usados em modelos animais
apresentam uma redução de progenitores de granulócitos-macrófagos (CFU-GM) e
consequentemente na contagem de neutrófilos absoluto (CNA). Produtos tóxicos
determinam a redução de progenitores de medula óssea e o limiar de neutrófilos. Desta
forma, testes de toxicologia in vitro como o CFU-GM podem prever os níveis de
exposição de xenobióticos que causam neutropenia clínica após exposição aguda
(PESSINA et al., 2001). Problemas graves relacionados ao uso de fitoterápicos têm sido
observados na população que acredita que produtos oriundos de plantas são isentos de
toxicidade. Assim, a análise de segurança do composto para uso medicinal faz-se
extremamente necessária.
Os dados obtidos com a análise clonogênica são úteis para direcionar as
próximas etapas da investigação toxicológico-terapêutica de novas substâncias
(VALADARES, 2004). Motivos éticos fazem com que estes estudos em humanos sejam
50
limitados (WHO, 1993). O potencial tóxico em órgãos específicos, a letalidade, a
toxicocinética e a relação dose resposta de uma determinada substância pode ser obtida
pela verificação da dose letal aguda em animais experimentais. A avaliação da
toxicidade aguda tem como critério inicial a detecção da dose letal mediana (DL50), que
representa a morte de 50% dos animais tratados com uma substância durante um
determinado período. A fisetina, estudada em nosso trabalho não se mostrou tóxica para
animais, quando realizamos o ensaio de toxicidade letal aguda usando uma dose
máxima de acordo com a DL50 preconizada pelo OECD de 2000 mg/Kg.
Ausência de mortes, de alterações no comportamento e de morfologia
macroscópica nos rins e fígado, os principais órgãos metabolizadores de fármacos,
observados quando se usou a técnica de toxicidade oral aguda mostra que fisetina é
um composto isento de toxicidade. Similar aos nossos resultados, Maher e
colaboradores (2010) verificaram que ratos alimentados com 500 ppm de fisetina por
vários meses não apresentaram indícios de toxicidade. Produtos naturais, a maioria das
vezes apresenta ausência ou reduzida toxicidade. Experimentos realizados com produtos
naturais e atividade antifúngica têm confirmado esta afirmativa. Ekeanyanwu & Njoku
(2014) avaliaram a toxicidade da fração rica em flavonóides de Monodora tenuifolia em
ratos, administrando oralmente diferentes concentrações durante um período de 28 dias
e observaram que não houve mortalidade até a dose de 5000 mg/kg. Medicamentos
usados para tratamento de infecções fúngicas têm ao contrário do nosso composto,
diversos efeitos tóxicos. Efeitos adversos dos antifúngicos azólicos como intolerância
gastrintestinal, hepatotoxicidade e hipersensibilidade, podendo, em doses elevadas,
ocasionar ginecomastia e irregularidades menstruais, além de serem teratogênicas são
frequentemente relatados. Entretanto, experimentos com derivados azólicos em animais
indicaram ausência de toxicidade aguda. Kan e Bennet (1988) verificaram que
itraconazol, produzia ataxia em animais com esporotricose sistêmica, mas em animais
saudáveis não mostrou evidências de ataxia ou outros efeitos adversos, sugerindo que a
ataxia evidenciada em animais não saudáveis ocorreu pela infecção e não pelo uso de
medicamentos.
Os efeitos de itraconazol em doses elevadas de 100 mg/kg em 10 ratos Wistar
administrado oralmente uma vez ao dia durante 30 dias, mostrou que as enzimas
hepáticas e hemograma foram compatíveis aos índices fisiológicos dos animais,
enquanto a histopatologia não revelou nenhuma anormalidade, concluindo-se que
mesmo em altas dosagens este antifúngico não mostrou toxicidade para o fígado
51
(MEINERZ et al., 2007). O achado deste último trabalho contradiz ao que ocorre em
humanos, onde o aumento temporário das enzimas hepáticas é um dos efeitos colaterais
mais frequentes, sendo geralmente, reversível e transitório, mas seu uso em altas doses
por um período prolongado aumenta a eliminação do fármaco no soro, o que pode
contribuir para a toxicidade hepática (AMICHAI; GRUNWALD, 1998; MEINERZ et
al., 2007).
Ensaios que demonstrem a toxicidade dos compostos candidatos a novos fármacos
em células específicas contribuem para a seleção desses protótipos. Martinez-Rossi et
al. (2008) destacaram em seu trabalho que para o desenvolvimento de novos fármacos
antifúngicos, é necessário que para que um antifúngico seja eficiente deve atuar com
maior especificidade nos fungos e desencadear baixa toxicidade para o organismo do
hospedeiro. Neste trabalho, a avaliação de citotoxicidade foi verificada sobre células
HepG2 e a ação citotóxica de fisetina em diferentes concentrações do composto com
24h de incubação mostrando viabilidade celular com uma variação de 65,9% a 18,5%
em concentrações de 3,12 a 400μg/mL de fisetina, respectivamente,obtidas pelo método
de MTT sugeriu que a ação deste flavonóide sobre a linhagem celular HepG2 é
concentração-dependente. Na avaliação de citotoxicidade com flavonoides prenilados
em células de hepatoma humano HepG2, foi demonstrado que os flavonóides
papiriflavonol A, kuraridin, soforaflavanone D e soforaisoflavanone A apresentou baixa
citotoxicidade (Sohn et al., 2004). Além de isso, similarmente aos nossos resultados,
estes flavonóides apresentaram forte atividade antimicrobiana. Entretanto, resultados de
citotóxicidade de prociadina A2, um flavonóide extraído de Litchi chinensis Sonn.,
demostrou elevada atividade citotóxica na maior concetração testada, demonstrando
uma citotoxicidade dependente da concentração (Wen et al. 2014).
A
morte
celular
é
responsável
pelo
seu
equilíbrio
no
organismo
contrabalanceando a sua proliferação. A morte da célula ocorre por necrose e apoptose
sendo que a necrose ocorre naturalmente, com a morte acidental de células, iniciada por
perturbações externas como traumas físicos, estresse químico ou hipóxia tecidual,
caracterizando-se morfologicamente por inchaço, seguida por lise celular e
desencadeando uma resposta inflamatória (VAN DER MEER et al., 2010). A apoptose
representa a morte celular programada sendo considerada como uma via fisiológica,
necessária para o desenvolvimento de órgãos e manutenção da homeostase, tendo como
características o encolhimento celular, a condensação da cromatina, desintegração
nuclear, externalização de fosfatidilserina, formação de vesículas e corpos apoptóticos
52
que são fagocitados evitando a reação inflamatória (WYLLIE et al., 1980; VAN DER
MEER et al., 2010).
As raras alterações morfológicas de HepG2 na presença de fisetina observadas
em nossos resultados com a coloração de May-Grunwald-Giemsa e Hoechst 33342,
sugerem que os efeitos citotóxicos foram induzidos no início da incubação com o
composto. A concentração de fisetina utilizada para análise morfológica na linhagem
celular HepG2 (12,7 µg/mL) demonstrou a indução de alterações na morfologia
compatíveis com a morte celular por apoptose, observando-se células com encolhimento
celular, condensação da cromatina e desintegração nuclear. Da mesma forma, o método
de externalização de fosfatidilserina detectando poucas células em apoptose por meio da
ligação da anexina V-FITC, medida através de citômetro de fluxo com alteração celular
compatível com apoptose recente comprova os resultados de coloração com MayGrunwald-Giemsa e Hoechst 33342.
A fim de verificar se o efeito inibitório do flavonóide quercetina sobre células
HepG2 foi devido à morte celular por apoptose, eventos apoptóticos através da
coloração Hoechst 33258 foram investigados e após 24h de exposição à diferentes
concentrações, observous-se um aumento da permeabilidade da membrana celular,e,
ainda, condensação nuclear (Zhao et al. 2014).
Os resultados obtidos com fisetina mostrando citotoxicidade para as células
HepG2, não mostram que o composto é citotóxico para todas as células do organismo,
pois apesar de HepG2 ser um grupo celular padrão na determinação de novos fármacos
metabolizados no fígado, a alta toxicidade de fisetina a esta linhagem tumoral, faz com
que essa metodologia de avaliação hepatotóxica possa ser questionada para células
hepáticas normais, colocando essa linhagem de carcinoma hepático apenas como um
importante avaliador antitumoral. Na análise de toxicidade oral aguda realizada com
fisetina em animais experimentais, os nossos resultados mostraram que fígado e rins se
apresentavam sem alterações macroscopicamente visíveis.
Concluindo, embora vários outros testes de citotoxicidade e mecanismo de ação
devam ser realizados para a introdução de fisetina como um novo fármaco, os resultados
apresentados mostram um perfil favorável para conduzir ao estudo e desenvolvimento
desta substância no tratamento de criptococose e dermatofitose.
53
8. CONCLUSÕES
1. A reduçao de ergosterol verificada na presença de fisetina faz pressupor que
provavelmente este composto atue na biossintese de pricipal constituinte da
membrana citoplasmática de espécies do complexo C. neoformans
2. A citometria de fluxo mostrou que a fisetina reduziu a viabilidade das células
metabólicamente ativas, com pouca ação na membrana de espécies do complexo
C. neoformans
3. A reduzida lesão da membrana, não representa carência de atividade nesta
estrutura, pois a síntese de ergosterol foi bastante reduzida na presença de
fisetina;
4. Alterações morfológicas como retração do citoplasma celular de espécies do
complexo C. neoformans e modificações nas hifas que se tornaram de
espessuras não uniformes e rugosas, além da redução acentuada de conídios
observados nas espécies de Trichophyton, explicam a sua ação na inibição de
crescimento destes fungos.
5. Na análise de segurança de fisetina, pode ser verificado que:
a) O potencial hemolítico do composto é muito baixo, visto que mesmo em
concentrações elevadas (>128 µg/mL) não foi capaz de lesionar a membrana
plasmática do eritrócito de camundongos, ou seja, produzir a hemólise.
b) Da mesma forma, a fisetina pode ser usada sem danos para a medula óssea nas
concentrações de até 200 µg/mL. Esta concentração inibiu o crescimento de
fungos, mas não interferiu na produção de células progenitoras de granulócitos e
macrófagos.
c) Em animais tratados com fisetina em concentrações de até 2000 mg, o composto
não produziu efeitos tóxicos, como alterações de comportamento e
anormalidades macroscópicas de órgãos como fígado e rins determinando desta
forma a segurança do uso do composto administrado por via oral.
d) Na análise de HepG2, células derivadas de carcinoma hepático, uteis na pesquisa
de toxicidade de substancias que podem afetar a função de células do fígado,
principal órgão envolvido no metabolismo de compostos, pode-se concluir que:
D1 – As raras alterações morfológicas de HepG2 na presença de fisetina
observadas em nossos resultados com a coloração de May-GrunwaldGiemsa e Hoechst 33342, sugerem que os efeitos citotóxicos foram
54
induzidos no início da incubação com o composto mostrando a indução
de alterações compatíveis com a morte celular por apoptose.
D2 – Da mesma forma, o método de externalização de fosfatidilserina
detectando poucas células em apoptose por meio da ligação da anexina
V-FITC, com alteração celular compatível com apoptose recente
comprova os resultados de coloração com May-Grunwald-Giemsa e
Hoechst 33342.
6. Embora vários outros testes de citotoxicidade e mecanismo de ação devam ser
realizados para a introdução de fisetina como um novo fármaco, os resultados
apresentados mostram um perfil favorável para conduzir ao estudo e
desenvolvimento
desta
substância
no
tratamento
de
criptococose
e
dermatofitose.
55
9. REFERÊNCIAS
ABEGG, M. A. et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii isolated from
the
excreta
of
psittaciformes
in
a
southern
Brazilian
zoological
garden. Mycopathologia, v. 161, n. 2, p. 83-91, 2006.
ADADE, C. M.; SOUTO-PADRÓN, T. Contributions of ultrastructural studies to the
cell biology of trypanosmatids: targets for anti-parasitic drugs. The Open Parasitology
Journal, v. 4, n. 1, 2010.
ADHAMI, V. M. et al. Dietary flavonoid fisetin: a novel dual inhibitor of PI3K/Akt and
mTOR for prostate cancer management. Biochemical pharmacology, v. 84, n. 10, p.
1277-1281, 2012
AKI, H.; YAMAMOTO, M. Drug binding to human erythrocytes in the process of ionic
drug-induced
hemolysis:
flow
microcalorimetric
approaches.
Biochemical
pharmacology, v. 41, n. 1, p. 133-138, 1991.
AMEEN, M. Epidemiology of superficial fungal infections. Clinics in dermatology, v.
28, n. 2, p. 197-201, 2010
AMICHAI, B.; GRUNWALD, M. H. Adverse drug reactions of the new oral antifungal
agents–terbinafine,
fluconazole,
and
itraconazole.
International
journal
of
dermatology, v. 37, n. 6, p. 410-415, 1998.
AQUINO, P. M. L. P.; LIMA, E. O. Estudo retrospectivo de 145 casos de Tinea capitis
na população de João Pessoa-Paraíba. Rev. bras. anal. clin, v. 34, n. 4, p. 229-231,
2002.
ARAI, Y. et al. Dietary intakes of flavonols, flavones and isoflavones by Japanese
women and the inverse correlation between quercetin intake and plasma LDL
cholesterol concentration. The Journal of nutrition, v. 130, n. 9, p. 2243-2250, 2000.
56
ARCE, F. et al. Apoptotic events induced by naturally occurring retinoids ATRA and
13-cis retinoic acid on human hepatoma cell lines Hep3B and HepG2. Cancer letters,
v. 229, n. 2, p. 271-281, 2005.
ARTHINGTON-SKAGGS, B. A. et al. Quantitation of ergosterol content: novel
method for determination of fluconazole susceptibility of Candida albicans. Journal of
Clinical Microbiology, v. 37, n. 10, p. 3332-3337, 1999.
BADALI, H. et al. In vitro susceptibility patterns of clinically important Trichophyton
and Epidermophyton species against nine antifungal drugs. Mycoses, v. 58, n. 5, p. 303307, 2015.
BARREIRO, E. J. Estratégia de simplificação molecular no planejamento racional de
fármacos: a descoberta de novo agente cardioativo. Química Nova, v. 25, n. 6/B, p.
1172-1180, 2002.
BARTLETT, K. H.; KIDD, S. E.; KRONSTAD, J. W. The emergence of Cryptococcus
gattii in British Columbia and the Pacific Northwest. Current infectious disease
reports, v. 10, n. 1, p. 58-65, 2008.
BENAVENTE-GARCIA, O.; CASTILLO, J. Update on uses and properties of citrus
flavonoids: new findings in anticancer, cardiovascular, and anti-inflammatory
activity. Journal of agricultural and food chemistry, v. 56, n. 15, p. 6185-6205, 2008.
BERKOWITZ, B. A. Avaliação Básica e Clínica de Novas Drogas. In: Katzung, B.G.
Farmacologia Básica & Clínica. Guanabara Koogan 9ª ed., p. 53-61. 2006.
BIEN, C. M. et al. Cryptococcus neoformans Site‐2 protease is required for virulence
and survival in the presence of azole drugs. Molecular microbiology, v. 74, n. 3, p.
672-690, 2009.
BITENCOURT, T. A. et al. Antifungal activity of flavonoids and modulation of
expression of genes of fatty acid synthesis in the dermatophyte Trichophyton rubrum.
BMC Proceedings. v. 8, n. 4, p. 1-2. 2014.
57
BITENCOURT, T. A. et al. Trans-chalcone and quercetin down-regulate fatty acid
synthase gene expression and reduce ergosterol content in the human pathogenic
dermatophyte Trichophyton rubrum. BMC complementary and alternative medicine,
v. 13, n. 1, p. 229, 2013.
BIVANCO, F. C.; MACHADO, C. D. A. S.; MARTINS, E. L. Criptococose
cutânea. Arq. méd. ABC, v. 31, n. 2, p. 102-109, 2006.
BOKHARI, M. et al. Culture of HepG2 liver cells on three dimensional polystyrene
scaffolds enhances cell structure and function during toxicological challenge. Journal
of anatomy, v. 211, n. 4, p. 567-576, 2007.
BOSE,
I.
et
al.
A
yeast
under
cover:
the
capsule
of
Cryptococcus
neoformans. Eukaryotic cell, v. 2, n. 4, p. 655-663, 2003.
BOUCHER, H. W. et al. Newer systemic antifungal agents. Drugs, v. 64, n. 18, p.
1997-2020, 2004.
BRASH, D. E.; HAVRE, P. A. New careers for antioxidants. Proceedings of the
National Academy of Sciences, v. 99, n. 22, p. 13969-13971, 2002.
BROUTA, F. et al. Secreted metalloprotease gene family of Microsporum
canis. Infection and immunity, v. 70, n. 10, p. 5676-5683, 2002.
BURR, M. L. Explaining the French paradox. In: Debates and Dilemmas in
Promoting Health. Macmillan Education UK, 1997. p. 127-132.
CASADEVALL, A.; PERFECT, J. R. Cryptococcus neoformans. Washington, DC:
ASM press, 1998.
CESQUINI, M. et al. t-BOOH-induced oxidative damage in sickle red blood cells and
the role of flavonoids. Biomedicine & pharmacotherapy, v. 57, n. 3, p. 124-129,
2003.
58
CHANG, Y. C.; KWON-CHUNG, K. J. Isolation of the third capsule-associated gene,
CAP60, required for virulence in Cryptococcus neoformans.Infection and Immunity,
v. 66, n. 5, p. 2230-2236, 1998.
CHAUDHURI, S. et al. Interaction of flavonoids with red blood cell membrane lipids
and proteins: antioxidant and antihemolytic effects. International Journal of
Biological Macromolecules, v. 41, n. 1, p. 42-48, 2007.
CHERNIAK, R.; SUNDSTROM, J. B. Polysaccharide antigens of the capsule of
Cryptococcus neoformans. Infection and immunity, v. 62, n. 5, p. 1507-1512, 1994.
COELHO, C.; BOCCA, A. L.; CASADEVALL, A. The intracellular life of
Cryptococcus neoformans. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease, v.
9, p. 219-238, 2014.
COLELLA, M. T. et al. Susceptibilidad antifúngica en dermatofitos.Kasmera, v. 34, n.
2, 2006.
COLOM, M. F. et al. First case of human cryptococcosis due to Cryptococcus
neoformans var. gattii in Spain. Journal of clinical microbiology, v. 43, n. 7, p. 35483550, 2005.
COSTA, M. P. et al. Antifungal and cytotoxicity activities of the fresh xylem sap of
Hymenaea courbaril L. and its major constituent fisetin. BMC complementary and
alternative medicine, v. 14, n. 1, p. 1, 2014.
COWAN, M. M. Plant products as antimicrobial agents. Clinical microbiology
reviews, v. 12, n. 4, p. 564-582, 1999.
CRUZ, M. C.; FOX, D. S.; HEITMAN, J. Calcineurin is required for hyphal elongation
during mating and haploid fruiting in Cryptococcus neoformans. The EMBO journal,
v. 20, n. 5, p. 1020-1032, 2001.
59
CUSHNIE, T. T.; LAMB, A. J. Antimicrobial activity of flavonoids. International
journal of antimicrobial agents, v. 26, n. 5, p. 343-356, 2005.
CUSHNIE, T. T.; LAMB, A. J. Recent advances in understanding the antibacterial
properties of flavonoids. International journal of antimicrobial agents, v. 38, n. 2, p.
99-107, 2011.
CZECHOWSKA, K.; JOHNSON, D. R.; VAN DER MEER, Jan Roelof. Use of flow
cytometric methods for single-cell analysis in environmental microbiology. Current
opinion in microbiology, v. 11, n. 3, p. 205-212, 2008.
DA MOTA, M. F. et al. Investigation of Ehrlich ascites tumor cell death mechanisms
induced by Synadenium umbellatum Pax. Journal of ethnopharmacology, v. 139, n. 2,
p. 319-329, 2012.
DA SILVA, C. R. et al. Synergistic effect of the flavonoid catechin, quercetin, or
epigallocatechin gallate with fluconazole induces apoptosis in Candida tropicalis
resistant to fluconazole. Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 58, n. 3, p. 14681478, 2014.
DE GARCIA, V. et al. Cryptococcus species (Tremellales) from glacial biomes in the
southern (Patagonia) and northern (Svalbard) hemispheres. FEMS microbiology
ecology, v. 82, n. 2, p. 523-539, 2012.
DE KOMAID, A. V. G.; KESTELMAN, I. Borges De. Unusual presentation of
Microsporum canis in human hair. Medical mycology, v. 40, n. 4, p. 419-423, 2002.
DELDAR, A. Drug-induced blood disorders: review of pathogenetic mechanisms and
utilisation of bone marrow cell culture technology as an investigative approach. Curr
Topics Vet Res, v. 1, p. 83-101, 1994.
DELDAR, A.; STEVENS, C. E. Development and application of in vitro models of
hematopoiesis to drug development. Toxicologic pathology, v. 21, n. 2, p. 231-240,
1993.
60
DOERING, T. L. How sweet it is! Cell wall biogenesis and polysaccharide capsule
formation in Cryptococcus neoformans. Annual review of microbiology, v. 63, p. 223,
2009.
ELLERBROEK, P. M. et al. Effects of the Capsular Polysaccharides of Cryptococcus
neoformans
on
Phagocyte
Migration
and
Inflammatory Mediators
[General
Articles]. Current medicinal chemistry, v. 11, n. 2, p. 253-266, 2004.
EKEANYANWU, R. C.; NJOKU, O. U. Acute and subacute oral toxicity study on the
flavonoid rich fraction of Monodora tenuifolia seed in albino rats. Asian Pacific
journal of tropical biomedicine, v. 4, n. 3, p. 194-202, 2014.
FAGANELLO, J. et al. An alternative method to prepare samples of the pathogenic
yeast Cryptococcus neoformans for scanning electron microscopy analysis. Journal of
microbiological methods, v. 64, n. 3, p. 416-419, 2006.
FERNANDES, T. O. et al. Campomanesia adamantium (Myrtaceae) fruits protect
HEPG2 cells against carbon tetrachloride-induced toxicity. Toxicology Reports, v. 2, p.
184-193, 2015.
FERREIRA, F. G. et al. Fármacos: do desenvolvimento à retirada do mercado. Revista
Eletrônica de Farmácia, v. 6, n. 1, 2009.
FINCH, J. J.; WARSHAW, E. M. Toenail onychomycosis: current and future treatment
options. Dermatologic therapy, v. 20, n. 1, p. 31-46, 2007.
FIRACATIVE, C.; TRILLES, L.; MEYER, W. MALDI-TOF MS enables the rapid
identification of the major molecular types within the Cryptococcus neoformans/C.
gattii species complex. PLoS One, v. 7, n. 5, p. e37566, 2012.
FLINT, S. J. et al. Principles of Virology: Molecular Biology, Patogenesis and. ASM
Press. Washington DC USA, 2000.
61
FLORA, K. et al. Milk thistle (Silybum marianum) for the therapy of liver disease. The
American journal of gastroenterology, v. 93, n. 2, p. 139-143, 1998.
FOX, D. S. et al. Calcineurin regulatory subunit is essential for virulence and mediates
interactions
with
FKBP12–FK506
in
Cryptococcus
neoformans. Molecular
microbiology, v. 39, n. 4, p. 835-849, 2001.
FULLER, L. C. et al. British Association of Dermatologists' guidelines for the
management of tinea capitis 2014. British Journal of Dermatology, v. 171, n. 3, p.
454-463, 2014.
FULLERTON, M. et al. Determination of antimicrobial activity of sorrel (Hibiscus
sabdariffa) on Esherichia coli O157: H7 isolated from food, veterinary, and clinical
samples. Journal of medicinal food, v. 14, n. 9, p. 950-956, 2011.
GAETI, M. P. et al. Liposomal entrapment of 4-nerolidylcatechol: impact on
phospholipid dynamics, drug stability and bioactivity. Journal of nanoscience and
nanotechnology, v. 15, n. 1, p. 838-847, 2015.
GARMENDIA, J. L.; VIEDMA, P. I.; ARZA, J. M. Onicomicosis: diagnóstico y
tratamiento. Información Terapéutica del Sistema Nacional de Salud, v. 32, n. 3, p.
83-92, 2008.
GATES, M. A.; THORKILDSON, P.; KOZEL, T. R. Molecular architecture of the
Cryptococcus neoformans capsule. Molecular microbiology, v. 52, n. 1, p. 13-24,
2004.
GHANNOUM, M. et al. Tinea capitis in Cleveland: survey of elementary school
students. Journal of the American Academy of Dermatology, v. 48, n. 2, p. 189-193,
2003.
GHASEMZADEH, A.; GHASEMZADEH, N.. Flavonoids and phenolic acids: Role
and biochemical activity in plants and human. Journal of medicinal plants research,
v. 5, n. 31, p. 6697-6703, 2011.
62
GIUDICE, M. C. et al. Isolation of Microsporum gypseum in soil samples from
different geographical regions of Brazil, evaluation of the extracellular proteolytic
enzymes activities (keratinase and elastase) and molecular sequencing of selected
strains. Brazilian Journal of Microbiology, v. 43, n. 3, p. 895-902, 2012.
GOLDSTEIN, A. O. et al. Mycotic infections. Effective management of conditions
involving the skin, hair, and nails. Geriatrics, v. 55, n. 5, p. 40-2, 45-7, 51-2, 2000.
GRAHAME-SMITH, D. G.; ARONSON, J. K. Tratado de farmacologia clínica e
farmacoterapia. 2004.
GULLO, F. P. et al. Cryptococcosis: epidemiology, fungal resistance, and new
alternatives for treatment. European journal of clinical microbiology & infectious
diseases, v. 32, n. 11, p. 1377-1391, 2013.
GUPTA, A. K.; RYDER, J. E.; SKINNER, A. R. Treatment of onychomycosis: pros
and cons of antifungal agents. Journal of Cutaneous Medicine and Surgery:
Incorporating Medical and Surgical Dermatology, v. 8, n. 1, p. 25-30, 2004.
GUPTA, A. K.; TU, Linh Q. Therapies for onychomycosis: a review. Dermatologic
clinics, v. 24, n. 3, p. 375-379, 2006.
HAINER, B. L. Dermatophyte infections. American family physician, v. 67, n. 1, p.
101-108, 2003.
HALLIDAY, C. L.; CARTER, D. A. Clonal reproduction and limited dispersal in an
environmental population of Cryptococcus neoformans var. gattii isolates from
Australia. Journal of clinical microbiology, v. 41, n. 2, p. 703-711, 2003.
HAMILTON, A. J.; GOMEZ, B. L. Melanins in fungal pathogens. Journal of medical
microbiology, v. 51, n. 3, p. 189, 2002.
63
HAMMER, K. A.; CARSON, C. F.; RILEY, T. V. Antifungal effects of Melaleuca
alternifolia (tea tree) oil and its components on Candida albicans, Candida glabrata
and Saccharomyces cerevisiae. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 53, n. 6,
p. 1081-1085, 2004.
HEISS, C. et al. The structure of Cryptococcus neoformans galactoxylomannan contains
β-D-glucuronic acid. Carbohydrate research, v. 344, n. 7, p. 915-920, 2009.
HENDRA, R. et al. Flavonoid analyses and antimicrobial activity of various parts of
Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl fruit. International journal of molecular
sciences, v. 12, n. 6, p. 3422-3431, 2011.
HOLE, C. R. et al. Mechanisms of dendritic cell lysosomal killing of Cryptococcus.
Scientific reports, v. 2, 2012.
HOU, L. et al. Inhibition of free radical initiated peroxidation of human erythrocyte
ghosts by flavonols and their glycosides. Organic & biomolecular chemistry, v. 2, n.
9, p. 1419-1423, 2004.
HUANG, D. B. et al. Therapy of common superficial fungal infections. Dermatologic
therapy, v. 17, n. 6, p. 517-522, 2004.
HUBRECHT, R. C.; KIRKWOOD, J. (Ed.). The UFAW handbook on the care and
management of laboratory and other research animals. John Wiley & Sons, 2010.
IDNURM, Alexander et al. Deciphering the model pathogenic fungus Cryptococcus
neoformans. Nature Reviews Microbiology, v. 3, n. 10, p. 753-764, 2005.
IKEDA, R. et al. Effects of melanin upon susceptibility of Cryptococcus to antifungals.
Microbiology and immunology, v. 47, n. 4, p. 271-277, 2003.
IKEDA, R. et al. Laccase and melanization in clinically important Cryptococcus species
other than Cryptococcus neoformans. Journal of clinical microbiology, v. 40, n. 4, p.
1214-1218, 2002.
64
ISHIGE, K.; SCHUBERT, D.; SAGARA, Y. Flavonoids protect neuronal cells from
oxidative stress by three distinct mechanisms. Free Radical Biology and Medicine, v.
30, n. 4, p. 433-446, 2001.
ISHIHARA, K. et al. Stabilized liposomes with phospholipid polymers and their
interactions with blood cells. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 25, n. 4, p.
325-333, 2002.
JAIN, N. et al. Molecular epidemiology of clinical Cryptococcus neoformans strains
from India. Journal of Clinical Microbiology, v. 43, n. 11, p. 5733-5742, 2005.
JOISH, V. N.; ARMSTRONG, E. P. Newer drugs and overall costs of treating
onychomycosis. Revista iberoamericana de micología, v. 19, n. 3, p. 130-132, 2002.
KAUFMAN, Gil et al. Infection stages of the dermatophyte pathogen Trichophyton:
microscopic characterization and proteolytic enzymes. Medical Mycology, v. 45, n. 2,
p. 149-155, 2007.
KAUR, R. et al. Onychomycosis-epidemiology, diagnosis and management. Indian
Journal of Medical Microbiology, v. 26, n. 2, p. 108-116, 2008.
KHAN, N. et al. A novel dietary flavonoid fisetin inhibits androgen receptor signaling
and tumor growth in athymic nude mice. Cancer research, v. 68, n. 20, p. 8555-8563,
2008.
KHAN, N. et al. Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion. Antioxidants &
redox signaling, v. 19, n. 2, p. 151-162, 2013.
KIDD, S. E. et al. Characterization of environmental sources of the human and animal
pathogen Cryptococcus gattii in British Columbia, Canada, and the Pacific Northwest of
the United States. Applied and environmental microbiology, v. 73, n. 5, p. 14331443, 2007.
65
KLINK, C. A.; MACHADO, R. B. A conservação do Cerrado brasileiro.
Megadiversidade, v. 1, n. 1, p. 147-155, 2005.
KOBAYASHI, C. C. B. A. et al. Characterization of Cryptococcus neoformans isolated
from urban environmental sources in Goiânia, Goiás State, Brazil. Revista do Instituto
de Medicina Tropical de São Paulo, v. 47, n. 4, p. 203-207, 2005.
KOES, R. E.; QUATTROCCHIO, F.; MOL, J. N. M. The flavonoid biosynthetic
pathway in plants: function and evolution. BioEssays, v. 16, n. 2, p. 123-132, 1994.
KORTING, H. C. et al. One week terbinafine 1% cream (Lamisil®) once daily is
effective in the treatment of interdigital tinea pedis: a vehicle controlled study. Medical
mycology, v. 39, n. 4, p. 335-340, 2001.
KUETE, Victor. Potential of Cameroonian plants and derived products against
microbial infections: a review. Planta medica, v. 76, n. 14, p. 1479-1491, 2010.
KWON-CHUNG, K. J.; RHODES, J. C. Encapsulation and melanin formation as
indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infection and Immunity, v. 51, n.
1, p. 218-223, 1986.
LAGROU, K. et al. Zoonotic transmission of Cryptococcus neoformans from a magpie
to an immunocompetent patient. Journal of internal medicine, v. 257, n. 4, p. 385-388,
2005.
LAPA, A. J. et al. Toxicologia de plantas medicinais. In: SIMOES, C.M.O. (Org.).
Farmacognosia: da Planta ao medicamento. 6ª ed. Florianópolis: UFSC, Porto
Alegre: UFRGS; p. 247-262, 2007
LEITE JR, D. P. et al. Dermatophytosis in military in the central-west region of Brazil:
literature review. Mycopathologia, v. 177, n. 1-2, p. 65-74, 2014.
66
LENG, W. et al. Expression dynamics of secreted protease genes in Trichophyton
rubrum induced by key host's proteinaceous components. Medical mycology, v. 47, n.
7, p. 759-765, 2009.
LESTER, S. J. et al. Cryptococcosis: update and emergence of Cryptococcus gattii.
Veterinary Clinical Pathology, v. 40, n. 1, p. 4-17, 2011.
LIN, X. Cryptococcus neoformans: morphogenesis, infection, and evolution. Infection,
Genetics and Evolution, v. 9, n. 4, p. 401-416, 2009.
LIN, X.; HEITMAN, J. The biology of the Cryptococcus neoformans species complex.
Annu. Rev. Microbiol., v. 60, p. 69-105, 2006.
LIN, Y. et al. Fisetin and rutin as 3C protease inhibitors of enterovirus A71. Journal of
virological methods, v. 182, n. 1, p. 93-98, 2012.
LIU, D. et al. A specific PCR assay for the dermatophyte fungus Microsporum canis.
Medical mycology, v. 39, n. 2, p. 215-219, 2001.
LUGARINI, C. et al. Cryptococcus neoformans isolated from Passerine and Psittacine
bird excreta in the state of Paraná, Brazil. Mycopathologia, v. 166, n. 2, p. 61-69, 2008.
MACDOUGALL, L. et al. Spread of Cryptococcus gattii in British Columbia, Canada,
and detection in the Pacific Northwest, USA. Emerging infectious diseases, v. 13, n. 1,
p. 42, 2007.
MAHER, P. et al. ERK activation by the polyphenols fisetin and resveratrol provides
neuroprotection in multiple models of Huntington's disease. Human molecular
genetics, p. ddq460, 2010.
MAHER, P. Modulation of multiple pathways involved in the maintenance of neuronal
function during aging by fisetin. Genes & nutrition, v. 4, n. 4, p. 297-307, 2009.
67
MANDAL, P. et al. Differences in the cell wall architecture of melanin lacking and
melanin producing Cryptococcus neoformans clinical isolates from India: an electron
microscopic study. Brazilian Journal of Microbiology, v. 38, n. 4, p. 662-666, 2007.
MANTHEY, J. A.; GUTHRIE, N.; GROHMANN, K. Biological properties of citrus
flavonoids pertaining to cancer and inflammation. Current medicinal chemistry, v. 8,
n. 2, p. 135-153, 2001.
MARTINELLI, P. R. P.; SANTOS, J. M. Microscopia eletrônica de varredura de
fungos nematófagos associados a Tylenchulus semipenetrans e Pratylenchus Jaehni.
Bioscience Journal, p. 809-816, 2010.
MARTINEZ-ROSSI, N. M.; PERES, N. T. A.; ROSSI, A. Antifungal resistance
mechanisms in dermatophytes. Mycopathologia, v. 166, n. 5-6, p. 369-383, 2008.
MAURICE, M. et al. Formation of plasma membrane domains in rat hepatocytes and
hepatoma cell lines in culture. Journal of cell science, v. 90, n. 1, p. 79-92, 1988.
MCFADDEN, D.; ZARAGOZA, O.; CASADEVALL, A. The capsular dynamics of
Cryptococcus neoformans. Trends in microbiology, v. 14, n. 11, p. 497-505, 2006.
MCPHAIL, D. B. et al. Kinetic and stoichiometric assessment of the antioxidant
activity of flavonoids by electron spin resonance spectroscopy. Journal of agricultural
and food chemistry, v. 51, n. 6, p. 1684-1690, 2003.
MEDNICK, A. J.; NOSANCHUK, J. D.; CASADEVALL, A. Melanization of
Cryptococcus neoformans affects lung inflammatory responses during cryptococcal
infection. Infection and immunity, v. 73, n. 4, p. 2012-2019, 2005.
MEEKER, T. C. et al. Toxicity of amphotericin B, miconazole, and ketoconazole to
human granulocyte progenitor cells in vitro. Antimicrobial agents and chemotherapy,
v. 23, n. 1, p. 169-171, 1983.
68
MEINERZ, A. R. M. et al. Effects of high doses of terbinafine and itraconazole in
Wistar rats. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 43, n. 1, p. 105-109,
2007.
MERSCH-SUNDERMANN, V. et al. Use of a human-derived liver cell line for the
detection of cytoprotective, antigenotoxic and cogenotoxic agents. Toxicology, v. 198,
n. 1, p. 329-340, 2004.
METCALF, D. The basic biology of hematopoiesis. The Haematopoietic Colony
Stimulating Factors, p. 1-26, 1984.
MIDDLETON, E.; KANDASWAMI, C.; THEOHARIDES, T. C. The effects of plant
flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart disease, and
cancer. Pharmacological reviews, v. 52, n. 4, p. 673-751, 2000.
MILLARD, Paul J. et al. Development of the FUN-1 family of fluorescent probes for
vacuole labeling and viability testing of yeasts. Applied and Environmental
Microbiology, v. 63, n. 7, p. 2897-2905, 1997.
MONOD, M. Secreted proteases from dermatophytes. Mycopathologia, v. 166, n. 5-6,
p. 285-294, 2008.
MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application
to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of immunological methods, v. 65, n.
1-2, p. 55-63, 1983.
NARAYANA, K. R. et al. Bioflavonoids classification, pharmacological, biochemical
effects and therapeutic potential. Indian journal of pharmacology, v. 33, n. 1, p. 2-16,
2001.
NEGRONI, R. Tratamiento de las onicomicosis. Revista de Patologia Tropical, v. 37,
n. 2, p. 89-110, 2008.
69
NENOFF, P. et al. Mycology–an update part 2: dermatomycoses: clinical picture and
diagnostics. JDDG: Journal der Deutschen Dermatologischen Gesellschaft, v. 12, n.
9, p. 749-777, 2014.
NISHIKAWA, M. M. et al. Serotyping of 467 Cryptococcus neoformans isolates from
clinical and environmental sources in Brazil: analysis of host and regional patterns.
Journal of Clinical Microbiology, v. 41, n. 1, p. 73-77, 2003.
NISHIOKA, S. A. et al. O papel do polimorfismo funcional VNTR da região promotora
do gene MAOA nos transtornos psiquiátricos. Rev. Psiquiatr Clin, v. 38, p. 34-42,
2011.
NOSANCHUK, J. D. et al. Evidence of zoonotic transmission of Cryptococcus
neoformans from a pet cockatoo to an immunocompromised patient. Annals of
Internal Medicine, v. 132, n. 3, p. 205-208, 2000.
NOSANCHUK, J. D.; CASADEVALL, A. Budding of melanized Cryptococcus
neoformans in the presence or absence of L-dopa. Microbiology, v. 149, n. 7, p. 19451951, 2003.
NOSANCHUK, J. D.; CASADEVALL, A. Impact of melanin on microbial virulence
and clinical resistance to antimicrobial compounds. Antimicrobial agents and
chemotherapy, v. 50, n. 11, p. 3519-3528, 2006.
OECD T. 423: Acute oral toxicity-acute toxic class method. OECD Guidelines for the
Testing of Chemicals, p. 1-14, 2001.
OGASAWARA, Y. et al. Clinical and mycological study of occult tinea pedis and tinea
unguium in dermatological patients from Tokyo. Mycoses, v. 46, n. 3‐4, p. 114-119,
2003.
OKABAYASHI, K.; HASEGAWA, A.; WATANABE, Ti. Microreview: capsuleassociated genes of Cryptococcus neoformans. Mycopathologia, v. 163, n. 1, p. 1-8,
2007.
70
O'MEARA, T. R.; ALSPAUGH, J. A. The Cryptococcus neoformans capsule: a sword
and a shield. Clinical microbiology reviews, v. 25, n. 3, p. 387-408, 2012.
ORHAN, D. D. et al. Antibacterial, antifungal, and antiviral activities of some
flavonoids. Microbiological research, v. 165, n. 6, p. 496-504, 2010.
OSORIO-DE-CASTRO, C. G. S.; PAUMGARTTEN, F. J. R.; SILVER, L. D. O uso de
medicamentos na gravidez. Ciência & Saúde Coletiva, v. 9, n. 4, p. 987-996, 2004.
ÖZÇELIK, B.; KARTAL, M.; ORHAN, I. Cytotoxicity, antiviral and antimicrobial
activities of alkaloids, flavonoids, and phenolic acids. Pharmaceutical biology, v. 49,
n. 4, p. 396-402, 2011.
PAL, H. C. et al. Fisetin inhibits growth, induces G2/M arrest and apoptosis of human
epidermoid carcinoma A431 cells: role of mitochondrial membrane potential disruption
and consequent caspases activation. Experimental dermatology, v. 22, n. 7, p. 470475, 2013.
PARCHMENT, R. E. Alternative testing systems for evaluating noncarcinogenic,
hematologic toxicity. Environmental health perspectives, v. 106, n. Suppl 2, p. 541,
1998.
PARCHMENT, R. E.; HUANG, M.; ERICKSON-MILLER, C. L. Roles for in vitro
myelotoxicity tests in preclinical drug development and clinical trial planning.
Toxicologic pathology, v. 21, n. 2, p. 241-250, 1993.
PARK, H. H. et al. Anti-inflammatory activity of fisetin in human mast cells (HMC-1).
Pharmacological research, v. 55, n. 1, p. 31-37, 2007.
PARK, M. J. et al. Effect of citral, eugenol, nerolidol and α-terpineol on the
ultrastructural changes of Trichophyton mentagrophytes. Fitoterapia, v. 80, n. 5, p.
290-296, 2009.
71
PEREIRA, F. O. et al. Effects of Cymbopogon winterianus Jowitt ex Bor essential oil
on the growth and morphogenesis of Trichophyton mentagrophytes. Brazilian Journal
of Pharmaceutical Sciences, v. 47, n. 1, p. 145-153, 2011a.
PEREIRA, F. O. et al. Growth inhibition and morphological alterations of Trichophyton
rubrum induced by essential oil from Cymbopogon winterianus Jowitt ex Bor.
Brazilian Journal of Microbiology, v. 42, n. 1, p. 233-242, 2011b.
PERES, N. T. A. et al. Dermatófitos: interação patógeno-hospedeiro e resistência a
antifúngicos. An Bras Dermatol, v. 85, n. 5, p. 657-67, 2010.
PERFECT, J. R. et al. Clinical practice guidelines for the management of cryptococcal
disease: 2010 update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical infectious
diseases, v. 50, n. 3, p. 291-322, 2010.
PESSINA, A. et al. Application of the CFU-GM assay to predict acute drug-induced
neutropenia: an international blind trial to validate a prediction model for the maximum
tolerated dose (MTD) of myelosuppressive xenobiotics. Toxicological sciences, v. 75,
n. 2, p. 355-367, 2003.
PESSINA, A. et al. Prevalidation of a model for predicting acute neutropenia by colony
forming unit granulocyte/macrophage (CFU-GM) assay. Toxicology in vitro, v. 15, n.
6, p. 729-740, 2001.
PIETRELLA, D. et al. Mannoproteins from Cryptococcus neoformans promote
dendritic cell maturation and activation. Infection and immunity, v. 73, n. 2, p. 820827, 2005.
PIETTA, P. G. Flavonoids as antioxidants. Journal of natural products, v. 63, n. 7, p.
1035-1042, 2000.
PINA-VAZ, C. et al. Antifungal activity of local anesthetics against Candida species.
Infectious diseases in obstetrics and gynecology, v. 8, n. 3-4, p. 124-137, 2000.
72
PINA-VAZ, C. et al. Comparison of two probes for testing susceptibilities of
pathogenic yeasts to voriconazole, itraconazole, and caspofungin by flow cytometry.
Journal of clinical microbiology, v. 43, n. 9, p. 4674-4679, 2005.
PINA‐VAZ, C. et al. Cytometric approach for a rapid evaluation of susceptibility of
Candida strains to antifungals. Clinical microbiology and infection, v. 7, n. 11, p. 609618, 2001.
PINTO, E. et al. Antifungal activity of the clove essential oil from Syzygium
aromaticum on Candida, Aspergillus and dermatophyte species. Journal of medical
microbiology, v. 58, n. 11, p. 1454-1462, 2009.
PLONKA, P. M.; GRABACKA, M. Melanin synthesis in microorganismsbiotechnological and medical aspects. Acta Biochimica Polonica, v. 53, n. 3, p. 429443, 2006.
PRATES, R. A. et al. Photodynamic therapy can kill Cryptococcus neoformans in in
vitro and in vivo models. In: SPIE BiOS: Biomedical Optics. International Society for
Optics and Photonics, p. 71650H-71650H-7, 2009.
PROCHÁZKOVÁ, D.; BOUŠOVÁ, I.; WILHELMOVÁ, N. Antioxidant and
prooxidant properties of flavonoids. Fitoterapia, v. 82, n. 4, p. 513-523, 2011.
RAMOS, C. L. et al. Chitin-like molecules associate with Cryptococcus neoformans
glucuronoxylomannan to form a glycan complex with previously unknown properties.
Eukaryotic cell, v. 11, n. 9, p. 1086-1094, 2012.
REFOJO, N. et al. Isolation of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii from
trunk hollows of living trees in Buenos Aires City, Argentina. Medical mycology, v.
47, n. 2, p. 177-184, 2009.
RODRIGUEZ, R. J. et al. Multiple functions for sterols in Saccharomyces cerevisiae.
Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism, v. 837, n. 3, p.
336-343, 1985.
73
ROGERO, S. O. et al. Teste in vitro de citotoxicidade: estudo comparativo entre duas
metodologias. Materials Research, v. 6, n. 3, p. 317-320, 2003.
ROLLIER, A. et al. Regulation of albumin gene expression in hepatoma cells of fetal
phenotype: dominant inhibition of HNF1 function and role of ubiquitous transcription
factors. Molecular biology of the cell, v. 4, n. 1, p. 59-69, 1993.
ROSENFELD, G. Corante pancrômico para hematologia e citologia clínica. Nova
combinação dos componentes do May-Grünwald e do Giemsa num só corante de
emprego rápido. Mem. Inst. Butantan, v. 20, p. 329-334, 1947.
SAAG, M. S. et al. Practice guidelines for the management of cryptococcal disease.
Clinical Infectious Diseases, v. 30, n. 4, p. 710-718, 2000.
SAGARA, Y.; VANHNASY, J.; MAHER, P. Induction of PC12 cell differentiation by
flavonoids is dependent upon extracellular signal‐regulated kinase activation. Journal
of neurochemistry, v. 90, n. 5, p. 1144-1155, 2004.
SALAS, S. D. et al. Effect of the laccase gene CNLAC1, on virulence of Cryptococcus
neoformans. The Journal of experimental medicine, v. 184, n. 2, p. 377-386, 1996.
SANDHU, L. C.; WARTERS, R. L.; DETHLEFSEN, L. A. Fluorescence studies of
Hoechst 33342 with supercoiled and relaxed plasmid pBR322 DNA. Cytometry, v. 6,
n. 3, p. 191-194, 1985.
SANGLARD, D. Importancia clínica de los mecanismos de resistencias a los
antifúngicos en las levaduras. Enferm Infecc Microbiol Clin, v. 20, n. 5, p. 225-34,
2002.
SANGLARD, D.; COSTE, A.; FERRARI, S. Antifungal drug resistance mechanisms in
fungal pathogens from the perspective of transcriptional gene regulation. FEMS yeast
research, v. 9, n. 7, p. 1029-1050, 2009.
74
SANTOS JÚNIOR, H. M. et al. Evaluation of native and exotic Brazilian plants for
anticancer activity. Journal of natural medicines, v. 64, n. 2, p. 231-238, 2010.
SANTOS, J. J.; COELHO, M. P. P.; NAPPI, B. P. Diagnóstico laboratorial das
dermatofitoses. Rev Bras Anal Clin, v. 34, p. 3-6, 2002.
SCHIAVE, L. A. et al. Variability in UVB tolerances of melanized and nonmelanized
cells of Cryptococcus neoformans and C. laurentii. Photochemistry and photobiology,
v. 85, n. 1, p. 205-213, 2009.
SEEBACHER, C. et al. Onychomycosis. Mycoses, v. 50, n. 4, p. 321-327, 2007.
SERRA, A. et al. Metabolic pathways of the colonic metabolism of flavonoids
(flavonols, flavones and flavanones) and phenolic acids. Food chemistry, v. 130, n. 2,
p. 383-393, 2012.
SHARMA, N.; TRIPATHI, A. Effects of Citrus sinensis (L.) Osbeck epicarp essential
oil on growth and morphogenesis of Aspergillus niger (L.) Van Tieghem.
Microbiological Research, v. 163, n. 3, p. 337-344, 2008.
SHARMA, P.; SHARMA, J. D. In vitro hemolysis of human erythrocytes—by plant
extracts with antiplasmodial activity. Journal of ethnopharmacology, v. 74, n. 3, p.
239-243, 2001.
SHIA, C. S. et al. Metabolism and pharmacokinetics of 3, 3′, 4′, 7-tetrahydroxyflavone
(fisetin), 5-hydroxyflavone, and 7-hydroxyflavone and antihemolysis effects of fisetin
and its serum metabolites. Journal of agricultural and food chemistry, v. 57, n. 1, p.
83-89, 2008.
SHIRWAIKAR, A. A. et al. Treatment of onychomycosis: an update. Indian journal of
pharmaceutical sciences, v. 70, n. 6, p. 710, 2008.
75
SHRESTHA, R. K. et al. Pneumonia due to Cryptococcus neoformans in a patient
receiving infliximab: possible zoonotic transmission from a pet cockatiel. Respiratory
care, v. 49, n. 6, p. 606-608, 2004.
SILVA JUNIOR, I. E. et al. Antimicrobial screening of some medicinal plants from
Mato Grosso Cerrado. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 19, n. 1B, p. 242-248,
2009.
SILVA RODRIGUES, G. D. et al. Tinea capitis em adulto por Trichophyton violaceum
no Brasil: relato de um caso e revisão da literatura. Anais brasileiros de dermatologia,
v. 83, n. 6, p. 544-548, 2008.
SINGER, L. M. et al. Antifungal drug susceptibility and phylogenetic diversity among
Cryptococcus isolates from dogs and cats in North America. Journal of clinical
microbiology, v. 52, n. 6, p. 2061-2070, 2014.
SOHN, H.-Y. et al. Antimicrobial and cytotoxic activity of 18 prenylated flavonoids
isolated from medicinal plants: Morus alba L., Morus mongolica Schneider,
Broussnetia papyrifera (L.) Vent, Sophora flavescens Ait and Echinosophora koreensis
Nakai. Phytomedicine, v. 11, n. 7, p. 666-672, 2004.
SOUZA, L. K. H. et al. Antifungal properties of Brazilian Cerrado plants. Brazilian
Journal of Microbiology, v. 33, n. 3, p. 247-249, 2002.
SRIKANTA, D.; SANTIAGO‐TIRADO, F. H.; DOERING, T. L. Cryptococcus
neoformans: historical curiosity to modern pathogen. Yeast, v. 31, n. 2, p. 47-60, 2014.
STEINBACH, W. J. et al. Harnessing calcineurin as a novel anti-infective agent against
invasive fungal infections. Nature Reviews Microbiology, v. 5, n. 6, p. 418-430, 2007.
SYED, D. N. et al. Inhibition of human melanoma cell growth by the dietary flavonoid
fisetin is associated with disruption of Wnt/β-catenin signaling and decreased Mitf
levels. Journal of Investigative Dermatology, v. 131, n. 6, p. 1291-1299, 2011.
76
TAECHOWISAN, T. et al. Antibacterial activity of new flavonoids from Streptomyces
sp. BT01; an endophyte in Boesenbergia rotunda (L.) Mansf. Journal of Applied
Pharmaceutical Science, v. 4, n. 4, p. 8, 2014.
TAJIMA, H.; MATSUMOTO, K.; NAKAMURA, T. Regulation of cell growth and
motility by hepatocyte growth factor and receptor expression in various cell species.
Experimental cell research, v. 202, n. 2, p. 423-431, 1992.
TINTELNOT, K. et al. Follow‐up of epidemiological data of cryptococcosis in Austria,
Germany and Switzerland with special focus on the characterization of clinical isolates.
Mycoses, v. 47, n. 11‐12, p. 455-464, 2004.
TOUIL, Y. S. et al. Improved antiangiogenic and antitumour activity of the combination
of the natural flavonoid fisetin and cyclophosphamide in Lewis lung carcinoma-bearing
mice. Cancer chemotherapy and pharmacology, v. 68, n. 2, p. 445-455, 2011a.
TOUIL, Y. S. et al. Fisetin disposition and metabolism in mice: Identification of
geraldol as an active metabolite. Biochemical pharmacology, v. 82, n. 11, p. 17311739, 2011b.
TRIPATHI, R. et al. Anticancer activity of a combination of cisplatin and fisetin in
embryonal carcinoma cells and xenograft tumors. Molecular cancer therapeutics, v.
10, n. 2, p. 255-268, 2011.
URÁN, M. E.; CANO, L. E. Melanina: implicaciones en la patogénesis de algunas
enfermedades y su capacidad de evadir la respuesta inmune del hospedero. Asociación
Colombiana de Infectología, v. 2, p. 2, 2008.
VAISHNAV. V. V. et al. Structural characterization of the galactoxylomannan of
Cryptococcus neoformans Cap67. Carbohydrate Research, v. 306, n. 1, p. 315-330,
1998.
VALADARES, M. C. Avaliação de toxicidade aguda: estratégias após a “era do teste
dl50”. Revista Eletrônica de Farmácia, v. 3, n. 2, 2007.
77
VALADARES, M. C. O uso de cultura clonal de precursores hematopoiéticos na
investigação do potencial mielossupressivo de novas substâncias. Revista Eletrônica
de Farmácia, v. 1, n. 2, 2004.
VALE-SILVA, L. A. et al. Investigation of the mechanism of action of 3-(4bromophenyl)-5-acyloxymethyl-2, 5-dihydrofuran-2-one against Candida albicans by
flow cytometry. Bioorganic & medicinal chemistry letters, v. 16, n. 9, p. 2492-2495,
2006.
VAN DER MEER, F. J. et al. Apoptosis-and necrosis-induced changes in light
attenuation measured by optical coherence tomography. Lasers in medical science, v.
25, n. 2, p. 259-267, 2010.
VAN DUIN, D. et al. Effects of voriconazole on Cryptococcus neoformans.
Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 48, n. 6, p. 2014-2020, 2004.
VAN DUIN, D.; CASADEVALL, A.; NOSANCHUK, J. D. Melanization of
Cryptococcus neoformans and Histoplasma capsulatum reduces their susceptibilities to
amphotericin B and caspofungin. Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 46, n.
11, p. 3394-3400, 2002.
VERMOUT, S. et al. Pathogenesis of dermatophytosis. Mycopathologia, v. 166, n. 5-6,
p. 267-275, 2008.
WAKAMATSU, K.; ITO, S. Advanced chemical methods in melanin determination.
Pigment Cell Research, v. 15, n. 3, p. 174-183, 2002.
WEINSTEIN, A.; BERMAN, B. Topical treatment of common superficial tinea
infections. American family physician, v. 65, n. 10, 2002.
WEITZMAN, I.; SUMMERBELL, R. C. The dermatophytes. Clinical microbiology
reviews, v. 8, n. 2, p. 240-259, 1995.
78
WEN, L. et al. Identification of flavonoids in litchi (Litchi chinensis Sonn.) leaf and
evaluation of anticancer activities. Journal of Functional Foods, v. 6, p. 555-563,
2014.
WHITE, T. C. et al. Generating and testing molecular hypotheses in the dermatophytes.
Eukaryotic cell, v. 7, n. 8, p. 1238-1245, 2008.
World Health Organization (WHO). Council for International Organizations of
Medical Sciences (CIOMS). International Ethical Guidelines for Biomedical
Research involving Humans Subjects. Genebra: WHO, 1993.
WU, S. Y. et al. Molecular characterisation of clinical Cryptococcus neoformans and
Cryptococcus gattii isolates from Sichuan province, China. Mycoses, v. 58, n. 5, p. 280287, 2015.
WYLLIE, A. H.; KERR, J. F. R.; CURRIE, A. R. Cell death: the significance of
apoptosis. International review of cytology, v. 68, p. 251-306, 1980.
YEAP, S. K. et al. Effect of Rhaphidophora korthalsii methanol extract on human
peripheral blood mononuclear cell (PBMC) proliferation and cytolytic activity toward
HepG2. Journal of ethnopharmacology, v. 114, n. 3, p. 406-411, 2007.
ZAIAS, N.; REBELL, G. Clinical and mycological status of the Trichophyton
mentagrophytes (interdigitale) syndrome of chronic dermatophytosis of the skin and
nails. International journal of dermatology, v. 42, n. 10, p. 779-788, 2003.
ZANDI, Keivan et al. In vitro antiviral activity of fisetin, rutin and naringenin against
dengue virus type-2. Journal of Medicinal Plants Research, v. 8, n. 23, p. 5534-5539,
2011.
ZARAGOZA, O. et al. "Capsule enlargement in Cryptococcus neoformans confers
resistance to oxidative stress suggesting a mechanism for intracellular survival."
Cellular microbiology, v. 10, n.10, p. 2043-2057, 2008.
79
ZARAGOZA, O. et al. The capsule of the fungal pathogen Cryptococcus neoformans.
Advances in applied microbiology, v. 68, p. 133-216, 2009.
ZHAO, P. et al. Quercetin induces HepG2 cell apoptosis by inhibiting fatty acid
biosynthesis. Oncology letters, v. 8, n. 2, p. 765-769, 2014.
ZHEN, L. et al. The antidepressant-like effect of fisetin involves the serotonergic and
noradrenergic system. Behavioural brain research, v. 228, n. 2, p. 359-366, 2012.
ZHU, Qin Yan et al. Inhibitory effects of cocoa flavanols and procyanidin oligomers on
free radical-induced erythrocyte hemolysis. Experimental Biology and Medicine, v.
227, n. 5, p. 321-329, 2002.
ZHU, X.; WILLIAMSON, P. R. Role of laccase in the biology and virulence of
Cryptococcus neoformans. FEMS yeast research, v. 5, n. 1, p. 1-10, 2004.
80
ANEXOS
Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética – Hospital das Clínicas - UFG
81
Anexo 2 – Parecer do Comitê de Ética – Hospital de Doenças
Tropicais de Goiás
9.1.
82
Anexo 3 – Parecer da Comissão de ética no uso de animais –
Universidade Federal de Goiás
83
84
85