ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DA BETA

ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DA BETALAPACHONA NA CRIPTOCOCOSE
EXPERIMENTAL

Caroline Medeiros 1, Patrícia Oliveira 1, Suanni Lemos 1, Odinilson Brandão 2, André Leal 1, Nicodemos Pontes-Filho 3,
Celso Camara4 , Vitor Lima-Filho 5 , Rejane Neves 6 .
Introdução
Criptococose é uma micose oportunista sistêmica,
que se destaca em imunossuprimidos sendo a meningite
e meningoencefalite as manifestações clínicas mais
freqüentes. Apresenta como agentes etiológicos
espécies de Cryptococcus, sobretudo C. neoformans,
levedura capsulada de distribuição mundial [1]. A alta
taxa de mortalidade em pacientes imunocomprometidos
que apresentam criptococose justifica a necessidade do
diagnóstico e tratamento precoces. Considerando a
debilidade imunológica, efeitos tóxicos e recidivas
produzidos pelo tempo prolongado de tratamento com
anfotericina B, novas opções terapêuticas são
imperativas, sugerindo a utilização de produtos naturais
ou substâncias derivadas com potenciais propriedades
antifúngicas no tratamento da doença [2]. O objetivo
deste estudo foi avaliar a eficácia terapêutica da Betalapachona
na
criptococose
disseminada
em
camundongos Suiços imunossuprimidos.
Material e métodos
Obtenção do isolado
Todos os ensaios foram desenvolvidos com a
amostra URM5811 de C. neoformans var. neoformans
da Coleção de Culturas Micoteca-URM da
Universidade Federal de Pernambuco. A amostra foi
obtida a partir de líquido céfalo-raquidiano (LCR) de
paciente portador do Vírus da Imunodeficiência
Humana (HIV).
Teste de sensibilidade antifúngica in vitro
Os testes in vitro foram conduzidos de acordo com
método de referência preconizado pelo Clinical
Laboratory Standard Institute (CLSI) [3].
Animais
Camundongos Suíços, machos e adultos, pesando
aproximadamente 30g foram mantidos em gaiolas com
água e ração (Purina, Paulínea, SP, Brasil) ad libidum.
Os camundongos foram manejados como recomendado
para seguindo a política procedimentos experimentais
institucional preconizada pelo Comitê de Ética em
Experimentação Animal sob número de protocolo
013968/2007-1.
Imunossupressão
O protocolo de imunossupressão foi adaptado de
Capilla [4]. Foi administrado 5mg/camundongo de
dexametasona® (Teuto) intraperitonealmente três dias
consecutivos e, em seguida, a cada intervalo de quatro
dias até o final de cada experimento.
Infecção
experimental
e
Tratamento
da
Criptococose disseminada
Camundongos foram infectados com 0,2 mL (106
céls/mL) de C. neoformans var. neoformans URM5811
uma semana após a imunossupressão pela veia caudal.
Após sete dias da infecção, 0,2 mL de ß-lapachona (10
mg/Kg) e anfotericina B (0,5 mg/Kg) foram
separadamente administrados diariamente em seis
animais durante uma semana e para 10 animais durante
duas semanas. Tampão fosfato foi administrado no
grupo controle. Sinais clínicos e mortalidade foram
avaliados diariamente após o início do tratamento. Os
animais sobreviventes foram sacrificados e removidos
assepticamente sangue, baço, fígado, pulmão e cérebro
para exame direto, contagem de unidades formadoras
de colônias (UFC) e realização de exames histológicos.
Contagem de C. neoformans nos órgãos
Uma alíquota de sangue foi coletada por punção
cardíaca nos camundongos sob anestesia. O baço,
fígado, pulmão e cérebro foram pesados e macerados
em PBS (1:10 ou 1:1000, m/v). Todas as amostras
foram submetidas a diluições seriadas e 0,1 mL foram
plaqueados na superfície do meio ágar Sabouraund
adicionado de cloranfenicol (50mg/ml) contido em
placas. As colônias foram contadas após incubação a
37°C por 24-72 horas e os resultados expressos como
UFC/g de órgão ou mL de sangue.
Exame histológico
Amostras de tecidos dos órgãos submetidos à
infecção por C. neoformans foram fixados em
1. Mestre em Biologia de Fungos- Departamento de Micologia, Universidade Federal de Pernambuco, E-mail: [email protected]
2. Biomédico pela Universidade Federal de Pernambuco- UFPE.
3. Professor Adjunto do Departamento de Patologia, UFPE, Av. Prof. Nelson Chaves, s/n, Cidade Universitária, CEP 50670-420.
4. Professor do Departamento de Química, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Campus Dois Irmãos, Recife-Pernambuco, CEP 52171-900
5. Professor adjunto do Departamento de Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Campus Dois Irmãos, CEP 52171-900
6. Professor Adjunto do Departamento de Micologia, UFPE, Av. Prof. Nelson Chaves, s/n, Cidade Universitária, CEP 50670-420.
Apoio financeiro: CAPES e CNPq.
formaldeído 10% em PBS e processados por
embebição em parafina para realização do exame
histológico utilizando hemtoxilina-eosina (HE).
Análise estatística
A significância estatística das contagens de UFC foi
avaliada por meio do teste t Student ou ANOVA. O
nível de significância foi determinado como P< 0,05.
Resultados
A amostra URM5811 de C. neoformans foi sensível a
ß-lapachona
e
anfotericina
B
apresentando
Concentração Mínima Inibitória (CMI) de 4mg/L e 0,5
mg/L respectivamente, a Concentração Mínima
Fungicida (CMF) para ß-lapachona foi 64μg/mL.
A infecção experimental resultou em criptococose
disseminada em camundongos imunossuprimidos,
como mostrado pelas altas contagens de UFC no baço,
fígado, pulmão e cérebro no 14º dia pós-infecção
(P<0,05). As contagens mais elevadas de C.
neoformans foram verificadas nos pulmões e no
cérebro variando de 105 a 106 UFC/g de órgão, não
sendo detectado no sangue. A microscopia direta
mostrou em todos os órgãos, células capsuladas típicas
e leveduras filamentosas pleomórficas no cérebro (Fig.
1A e 2B). O exame histológico revelou a presença de
infiltrados inflamatórios disseminados em todos os
órgãos (Fig. 1C e 1D).
O tratamento da criptococose disseminada após sete
dias de infecção utilizando ß-lapachona (10mg/kg) em
camundongos IS diminuiu significativamente a
população de C. neoformans no baço, fígado e
pulmões, quando comparado ao grupo tratado com
anfotericina B (P<0,05). A levedura foi eliminada do
baço e fígado, com redução de aproximadamente 104
vezes sua população nos pulmões e cérebro 14 dias
após a infecção, comparando-se ao grupo tratado com
anfotericina B (P<0,05). Os efeitos protetores
produzidos pelos grupos tratados a foram similares.
Todavia, alguns animais não sobreviveram até o 14º
dia. As análises histológicas dos órgãos (Fig. 1E, 1F,
1G, 1H, 1I, 1F) mostram áreas de necrose liquefativa e
infiltrados celulares em menor proporção em relação ao
grupo controle, sendo tais alterações menos frequentes
à medida que se prolonga o tempo de tratamento. É
importante salientar que não houve diferença entre as
alterações histológicas observadas nos diferentes
grupos tratados.
Discussão
O número de paciente com HIV/AIDS em muitas
regiões do planeta tem sido responsável pelo número
de casos de criptococose devido à característica
oportunista dessa micose associada às condições do
paciente [5].
Atualmente,
pacientes
imunossuprimidos
e
imunocompetentes têm sido tratados de maneira similar
para criptococose por meio do uso de anfotericina
B/fluconazol [6]. Contudo, independentemente do
esquema terapêutico adotado, fica claro que a faixa
limitada de escolhas terapêuticas é a principal
responsável pela letalidade desta doença nestes
pacientes. Este fato reforça a necessidade da busca por
novos agentes antifúngicos que atuem adequadamente
em vários aspectos no tratamento da criptococose [4].
ß-lapachona tem sido citada como uma potencial
droga anticâncer e antimicrobianas [7]. Os mecanismos
de ação parecem conduzir a alterações na fosforilação
oxidativa e/ou inibição no transporte de elétrons na
célula [6]. Até o momento, apenas um trabalho relata a
susceptibilidade da ß-lapachona frente a C.
neoformans. Entretanto, o método utilizado pelos
autores não foi um método reprodutível de referência
[7].
A severidade do C. neoformans em modelos
experimentais varia entre as linhagens de
camundongos. Além disso, a amostra fúngica e o
tamanho do inóculo podem afetar a incidência de sinais
clínicos e a taxa de mortalidade [4].
O tratamento experimental na criptococose
disseminada tem sido proposto por muitos
pesquisadores.
Kakeya [8] relataram que a
administração de 4mg/Kg de um novo polieno SPK843, aumentou a sobrevivência e diminuiu a
colonização dos órgãos por C. neoformas.
Esta é a primeira vez que foi demonstrada a potente
atividade antifúngica da ß-lapachona in vitro e
aplicação in vivo na criptococose disseminada.
Agradecimentos
Laboratório de Micologia Médica - UFPE; Laboratório
de Microbiologia e Imunologia - UFRPE
Referências
[1] Khanna N, Chandramuki A, Desai A. Cryptococcosis in the
immunocompromised host with special reference to AIDS. Indian J
Chest Dis Allied Sci 2000; 42(4):311-315.
[2] Mondello F, De Bernardis F, Girolamo A. In vitro and in vivo
activity of tea tree oil against azole-susceptible and -resistant human
pathogenic yeasts. J Antimicrob Chemother 2003; 51(5):1223-1229.
[3] National Committee for Clinical Laboratory Standards.
Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility
Testing of Yeasts-Third Edition: Approved Standard M27-A3. CLSI,
NCCLS, Villanova,PA, USA, 2002.
[4] Capilla J, Maffei CM, Clemons KV. Experimental systemic
infection with Cryptococcus neoformans var. grubii and
Cryptococcus gattii in normal and immunodeficient mice. Med
Mycol 2006 Nov; 44(7):601-610.
[5] Schop J. Protective Immunity Against Cryptococcus neoformans
infection. Med J Microbiol 2007; 10(1):35-4
[6] Blanco E, Bey EA, Dong Y et al. β-Lapachone-containing
PEG–PLA polymer micelles as novel nanotherapeutics against
NQO1-overexpressing tumor cells. J Cont Release 2007; 122:365–
374.
[7] Guiraud P, Steiman R, Campos-Tanaki G et al. Comparison of
antimicrobial and antifungal activities of lapachol and betapapachone. Plant Med 1994; 60:373-374.
[8] Kakeya H, Miyazaki Y, Senda H . Efficacy of SPK-843, a novel
polyene antifungal, in a murine model of systemic cryptococcosis.
Antimicrob
Agents
Chemother
2008;
52(5):1871–1872.
Figura 1. Camundongos Suíços imunossuprimidos inoculados com C. neoformans URM5811. (A) Célulade levedura vista ao
exame microscópico direto no pulmão, (B) Filamentos pleomórficos de C. neoformans; (C) e (D) preparações histológicas do pulmão
e cérebro, respectivamente, coradas por HE onde é visualizada C. neoformans. Aumento total: 400X. Dano histológico no cérebro de
camundongos Suíços imunossuprimidos infectados por C. neoformans amostra URM5811 e tratados com beta-lapachona. Lâminas
(D), (E) e (F) mostram animais infectados tratados com solução salina, beta-lapachona e anfotericina B, respectivamente, durante
sete dias, coradas por HE. As laminas (G), (H) e (I) mostram animais infectados tratados com solução salina, beta-lapachona e
anfotericina B, respectivamente, durante quatorze dias utilizando a mesma coloração. Aumento total: 100 X.