análise imunoistoquímica após terapia fotodinâmica com cloro

0
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MAIARA DE MORAES
ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA APÓS
TERAPIA FOTODINÂMICA COM CLOROALUMÍNIO FTALOCIANINA EM TECIDOS
GENGIVAIS DE HUMANOS
Natal/RN
2014
1
MAIARA DE MORAES
ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA APÓS
TERAPIA FOTODINÂMICA COM CLOROALUMÍNIO FTALOCIANINA EM TECIDOS
GENGIVAIS DE HUMANOS
Natal/RN
2014
2
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA APÓS TERAPIA
FOTODINÂMICA COM CLORO-ALUMÍNIO
FTALOCIANINA EM TECIDOS GENGIVAIS DE
HUMANOS
Tese
apresentada
ao
Colegiado
do
Programa de Pós-Graduação em Patologia
Oral do Departamento de Odontologia da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, como parte dos requisitos ao título
de Doutora em Patologia Oral.
Orientador: Prof. Dr. Antonio de Lisboa Lopes Costa
Natal/RN
2014
3
Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia
Biblioteca Setorial de Odontologia “Prof. Alberto Moreira Campos”.
Moraes, Maiara de.
ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA APÓS TERAPIA FOTODINÂMICA COM CLOROALUMÍNIO FTALOCIANINA EM TECIDOS GENGIVAIS DE HUMANOS
Maiara de Moraes. – Natal, RN, 2014.
128 f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Antonio de Lisboa Lopes Costa
Tese (Doutorado em Patologia Oral) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Centro de Ciências da Saúde. Departamento de Odontologia. Programa de Pós-Graduação
em Patologia Oral.
1. Fotoquimioterapia – Tese. 2. Osteoprotegerina – Tese. 3. ligante RANK – Tese. 4.
Fármacos Fotossensibilizantes – Tese. 5. Fator A de Crescimento do Endotélio Vascular –
Tese. I. Costa, Antonio de Lisboa. II. Título.
RN/UF/BSO/2014
BlackD73
4
5
DEDICATÓRIAS
6
Com muito amor
Dedico esta trabalho...
À MINHA FAMÍLIA, POR TODO O AMOR E INCENTIVO DURANTE TODA A
MINHA VIDA!
Ao meu querido companheiro, Luciano Ribeiro Falcão, que me
acompanhou e ajudou a superar todas as adversidades do dia-a-dia.
Obrigado pelo amor, compreensão, apoio e cumplicidade!
Aos meus queridos pais, Vicente Fernando de Moraes e Maria Eunice de
Moraes, exemplos de pessoas, pelos ensinamentos, pelos valores que me
ensinaram a cultivar, pelo caminho que me orientaram a seguir, por
estarem sempre ao meu lado e simplesmente pelo amor incondicional que
sempre me dedicaram. Não sei como agradecer pela família maravilhosa,
pela educação e por tudo que vocês me proporcionaram. Vocês são tudo
para mim!
7
Ao meu filho, Luca de Moraes Ohashi, que acompanhou desde pequenino
toda minha trajetória acadêmica e que mesmo estando distante soube
compreender a minha luta por um futuro melhor. Obrigada por entender
os momentos de renúncias que juntos fizemos... Férias com horas de
estudo, correria de aulas. Obrigada meu grande amor pela sua
compreensão e apoio!
Amo-te muito!
A minha filha, Niara de Moraes Ribeiro Falcão, que chegou ao mundo
quase no fim do meu doutorado e que hoje me acompanha neste
momento especial.
8
AGRADECIMENTOS
9
AGRADECIMENTOS
Para concretização deste estudo foi necessário um esforço contínuo e
empenho pessoal que apenas foi possível de concretizar com a colaboração
e apoio de algumas pessoas para as quais aqui fica o meu agradecimento.
A toda minha família pelo apoio e vibração positiva durante toda
minha caminhada.
Aos meus Pacientes, que acreditaram no meu trabalho e, sobretudo
confiaram em mim ao se disponibilizarem em participar da pesquisa. Sem
vocês, este trabalho não teria sido realizado. Muito obrigado!
Ao meu companheiro, Luciano Ribeiro Falcão, o meu agradecimento
especial, essencialmente neste último ano que foi para nós de muitas
mudanças e batalhas. Obrigada por ter entrado na minha vida e ter me
proporcionado momentos de aprendizado e alegria. Obrigada pelo apoio,
paciência, companheirismo e pela enorme ajuda com palavras e conselhos
sempre positivos.
Ao meu sogro, Heriberto Falcão, e sogra, Carolina Falcão, pelo apoio
e acolhida!
Aos meus amigos e irmãos de Natal, Luciane Laroque, Weliton Silva,
Swami Nunes, Kendy Laroque, Gilmar Garcia, Henrique Wanderley,
10
Denise Lopes, Antônio Ciríaco pela amizade, companheirismo, momentos
de descontração e desabafos. Por estarem ao meu lado!
Ao meu querido orientador, Dr. Antonio de Lisboa Lopes Costa, por
todo o apoio que tem me dado desde o início do meu ingresso no
Programa de Pós-graduação em Patologia Oral. Obrigada por ter
acreditado e confiado em mim durante todo meu trajeto. Por ser uma
pessoa amiga, compreensiva e humana. Meu agradecimento especial!
A Faculdade de Odontologia, da Universidade Federal do Rio Grande
do Norte, pelo incentivo e por todas as oportunidades recebidas durante a
pós-graduação.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Patologia Oral,
Dra. Lélia Batista Souza, Dra. Roseana Freitas, Dra. Lélia Maria Queiroz,
Dr. Leão Pereira Pinto, Dr. Hébel Galvão, Dra. Márcia Miguel, Dra. Éricka
Janine, Dra. Ana Miryam por toda contribuição, pela disponibilidade,
pelos conhecimentos transmitidos, pelo apoio e incentivo na busca da
ciência e principalmente pela amizade.
Ao professor Dr. Leão Pereira Pinto e o Prof. Dr. Bruno Cesar de
Vasconcelos Gurgel pela enorme contribuição nos ajustes do projeto de
pesquisa.
Ao professor Dr. Ricardo Bentes Azevedo, pela imensa ajuda,
compromisso, presteza e pela disponibilidade em colaborar com a
pesquisa.
11
Ao meu colega e, hoje, professor da Universidade de Brasília, João
Paulo Figueiró Longo, pela sua disposição e colaboração essencial neste
trabalho.
Ao professor e amigo, Ranke dos Santos Silva, do Departamento de
Morfologia da UFRN, e a professora Aurigena de Antunes Araújo pela
amizade, companheirismo, ensinamentos, presteza e pela disponibilidade
em colaborar em todos os momentos.
A Universidade de Brasília, por todas as oportunidades recebidas
durante minha vida acadêmica e por todo apoio na pesquisa.
Aos colegas e amigos que fiz ao longo desses quatro anos de
doutorado:
Meus colegas de turma, em especial, Felipe Rodrigues de Matos e
Emeline Lima, com os quais construí um laço de amizade que se solidifica
a cada dia, obrigada por tudo! Emeline, uma pessoa maravilhosa e muito
prestativa, sua calma me inspira, Keila Martha de Amorim, Fernando
Nóbrega, Joabe Santos, Cynthia Helena, todos, exemplo de seriedade e
dedicação, com quem pude aprender muitos ensinamentos e pude
desfrutar momentos inesquecíveis de muita descontração e alegrias. Aos
colegas e hoje professores, Águida Gomes Henriques, Valéria Santos, Pedro
Paulo Santos, Manuel Górdon, e Cassiano Nonaka. A todos vocês, meu
muito obrigada, porque vocês contribuíram diretamente na minha
jornada! Cada um de vocês, a sua maneira, contribuiu enormemente para
12
a minha trajetória no doutorado. Alegrando a sala de microscopia com
conversas e momentos de descontração bem como, pelos conhecimentos
compartilhados e pela presteza em ajudar.
A querida, Roseane Carvalho de Vasconcelos, que com sua alegria e
disposição recheou meus momentos experimentais de muita alegria e que
possibilitou o aprendizado da importância do trabalho em equipe, da
colaboração e de como é importante estarmos rodeados de pessoas
cooperativas e de astral. Obrigada Rose, você é uma guerreira, além de
parceira e amiga!
Aos amigos e colegas do Doutorado, Denise Hélen de Oliveira, Ana
Luiza Leite, Maria Luiza Diniz, Tiago João, Luciana, Natália Barbosa,
Bárbara Monteiro, Stefânia Jerônimo, Clarissa Demeda, Edilmar Moura,
Conceição Aparecida, Emília Beatriz, Adriana Costa, José Nazareno, Melka
Sá, Rodrigo Gadelha e Jamile Moura. Cada um contribuiu de alguma
forma com meu aperfeiçoamento no Programa de Pós- Graduação. Em
especial as “xuxus” por estarem sempre presentes com um sorriso no
rosto, dispostas a ajudar, dignas de pessoas de um bom relacionamento e
por toda gentileza e disponibilidade.
Aos alunos da Graduação; em especial, Michel Alves, que sempre se
disponibilizou como auxiliar na pesquisa.
13
A funcionária do programa de Pós-Graduação em Farmacologia,
Dona Neida, pela sua especial colaboração em parte do meu projeto.
Obrigada Dona Neida! Você é uma fofa!
Aos
funcionários
da
Patologia
Oral,
Hévio
Lucena
(enorme
colaborador dessa pesquisa, principalmente no desenvolvimento da técnica
de imunoistoquímica), Sandovânia Oliveira, a Sandrinha, (que ajudou
muito em toda parte laboratorial da pesquisa, sempre com seu jeitinho
alegre de ser), Ricardo Silva (que muito contribui no preparo das nossas
soluções, sempre disposto a colaborar), Graça Galvão, Graçinha, (que com
sua simpatia esteve sempre disponível, um amor de pessoa que levarei em
meu coração), Lourdinha (com seu humor, alegrando nossos “intervalos”
com um cafezinho) e Idelzuíte (pela solicitude). Obrigada a todos vocês
pelos momentos vividos e pelas gentilezas!
Aos funcionários das Clínicas de Estomatologia, de Cirurgia Oral e
de Radiologia Odontológica, sempre muito prestativos!
Aos funcionários da Faculdade de Odontologia, meu muito obrigada
por tudo!
Aos professores das Clínicas Integradas, que cederam espaço e que
proporcionaram momentos de agradável convivência, pelos ensinamentos
e pelo incentivo.
14
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, através do
Programa de Pós-Graduação em Patologia oral, por todo o investimento
e confiança depositado em meus trabalhos.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) e ao Instituto de Nanociência e Tecnologia - Nanobiotecnologia
pelos auxílios financeiros que possibilitaram a realização deste trabalho.
E, por fim a todos que não citei o nome, mas que foram
importantes para a conquista do meu Doutorado.
15
AOS MESTRES
“Não basta ensinar ao homem uma especialidade, porque se tornará assim uma máquina
utilizável e não uma personalidade. É necessário que adquira um sentimento, senso prático
daquilo que vale a pena ser empreendido, daquilo que é belo, do que é moralmente correto.”
(Paulo Freire)
AOS PESQUISADORES
Vós, investigadores, não deveis confiar em autores que, apenas pelo
emprego da imaginação, se fazem intérpretes entre a natureza e o homem, mas somente
naqueles que exercitaram seu intelecto com os resultados dos seus experimentos.“
(Leonardo da Vinci)
AOS COLEGAS E FUTUROS ALUNOS
“Ninguém ignora tudo. Ninguém sabe tudo. Todos nós sabemos alguma coisa. Todos nós
ignoramos alguma coisa. Por isso aprendemos sempre.”
(Albert Einsten)
A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original.”
(Albert Einsten)
16
RESUMO
17
RESUMO
Embora a terapia fotodinâmica venha sendo utilizada como uma ferramenta útil nos últimos
30 anos em oncologia, poucos estudos clínicos em odontologia têm sido conduzidos. A
terapia fotodinâmica (TFD) utiliza fotossensibilizantes atóxicos e seletivos que são
administrados nas células alvo seguida de aplicação local de luz visível, produzindo espécies
reativas de oxigênio capazes de ocasionar morte celular por apoptose ou necrose, de afetar a
vascularidade local, além de exercer importantes efeitos no sistema imune. Novas gerações de
fármacos fotossensibilizantes, como as ftalocianinas nanoparticuladas tem apresentado
excelentes resultados na atividade antitumoral e antibacteriana. Neste contexto, o presente
trabalho realizou o primeiro protocolo clínico de aplicação local da nanoemulsão de cloroalumínio ftalocianina (AlClFc) seguida de irradiação em gengiva de humanos, e analisou
descritiva e comparativamente, por meio de imunoistoquímica, a expressão de RANK,
RANKL, OPG e VEGF em um modelo split-mouth. Oito voluntários saudáveis com
indicação clínica de exodontia foram incluídos no estudo. Sete dias antes da exodontia, foi
aplicado na gengiva dos participantes, 5µM de nanoemulsão de AlClFc seguida de irradiação
com laser diodo (660nm, 7J/cm2), o lado contralateral foi utilizado como controle. Os
espécimes teciduais foram removidos sete dias após a TFD e subdivididos em dois grupos
(grupo teste e grupo controle) para análise histológica e imunoistoquímica. Os pacientes
foram monitorados no dia aplicação, 7, 14 e 30 dias após a terapia para avaliação de efeitos
adversos da terapia. Alterações vasculares foram observadas nas amostras gengivais que
receberam a TFD. Áreas de edema e congestão vascular, além de intensa vascularização
foram visualizadas. Adicionalmente, focos de calcificação distrófica em região subepitelial
foram visualizados nos espécimes do grupo teste. Os resultados demonstraram um padrão
similar dos escores de imunomarcação de RANK, RANKL e VEGF entre os grupos teste e
controle, não havendo diferença estatística significante (p=0.317, p=0.777, p=0.814,
respectivamente). RANK e RANKL exibiram imunomarcação fraca ou ausente na maioria
dos espécimes analisados. Não houve imunomarcação para a OPG. O VEGF mostrou
imunomarcação moderada a forte nos espécimes do grupo teste. Adicionalmente, o estudo
clínico mostrou que a terapia foi bem tolerada por todos os pacientes. Os efeitos adversos
foram de curta duração e totalmente reversíveis. Tomados em conjunto, os resultados
apresentados neste estudo mostraram que o protocolo utilizado por nós, mediado por
nanoemulsão contendo AlClFc, é seguro para aplicação clínica em tecido gengival e, sugerem
uma forte imunomarcação para o VEGF após a terapia.
Palavras-chave: Fotoquimioterapia, osteoprotegerina, ligante RANK, Fator A de
Crescimento do Endotélio Vascular, Fármacos Fotossensibilizantes
18
ABSTRACT
19
ABSTRACT
Although photodynamic therapy have been used as a useful tool over the past 30 years in
oncology, few clinical trials have been conducted in dentistry. Photodynamic therapy (PDT)
uses non-toxic photosensitizers and selective which are administered in target cells followed
by local application of visible light, producing reactive oxygen species capable of causing cell
death by apoptosis or necrosis, injured the local vasculature, and exert important effects on
the immune system. New generations of photosensitizing agents, such as nanoparticulate
phthalocyanines, has shown excellent results in antitumor and antibacterial activity . In this
context, the present work constitutes the first clinical protocol of local application of
nanoemulsion chloro-aluminum phthalocyanine (AlClFc) followed by irradiation in human
gingiva, and analyzed descriptively and comparatively , by means of immunohistochemistry ,
the expression of RANK , RANKL , OPG and VEGF in a split -mouth model. Eight healthy
volunteers with clinical indication for extraction were included in the study . Seven days
before the extraction, was injected in the gingiva of participants, 5μM of nanoemulsion
AlClFc followed by irradiation with diode laser (660nm, 7J/cm2 ), the contralateral side was
used as control. Tissue specimens were removed seven days after the TFD is performed.
Tissues sample were divided into two groups (test and control groups) for histological and
immunohistochemical analysis. Patients were monitored at days, 0, 7, 14 and 30 to assess
adverse effects of the therapy. Vascular alterations were seen in gingival samples that
received PDT. Areas of edema and vascular congestion, and intense vascularization were
viewed . Additionally, dystrophic calcification in subepithelial region were observed in the
test group. The results showed a similar pattern of immunostaining scores of RANK, RANKL
and VEGF between the test and control groups, with no statistically significant difference (p =
0.317, p = 0.777, p = 0.814, respectively). RANK and RANKL exhibited weak or absent
immunostaining in most specimens analyzed. There was no immunostaining for OPG. VEGF
showed moderate to strong immunostaining in specimens from the test group. In addition, the
clinical study showed that therapy was well tolerated by all patients. Adverse effects were
short-time and completely reversible. Taken together, the results presented in this study
showed that PDT mediated by nanoemulsion containing AlClPc is safe for clinical application
in gingival tissue and suggests that a strong immunostaining for VEGF after therapy .
.
Keywords: Photochemotherapy, Photosensitizing Agents, RANK Ligand, Osteoprotegerin,
Vascular Endothelial Growth Factor A.
20
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
21
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Página
Figura 1
Mecanismo de ação da terapia fotodinâmica
39
Figura 2
Estrutura química da ftalocianina (Fonte: (O'CONNOR;
43
GALLAGHER; BYRNE, 2009))
Figura 3
Desenho do funcionamento da reação fotoquímica presente na
49
Terapia Fotodinâmica, onde está descrito a produção de radicais
livres após a excitação do fármaco fotossensibilizante (FS) com
irradiação a laser (LONGO; LOZZI; AZEVEDO, 2011)
Figura 4
Mecanismo de ação da TFD (adaptado de CASTANO; MROZ;
51
HAMBLIN, 2006)
Figura 5
Desfechos dos efeitos antitumorais da TFD (adaptado de
52
FIRCZUK; NOWIS; GOLAB, 2011)
Figura 6
Mecanismo de ativação leucocitária após TFD (adaptado de
53
CASTANO; MROZ; HAMBLIN, 2006)
Figura 7
Papel dos osteoblastos na diferenciação dos osteoclastos
56
(adaptado de BOYLE; SIMONETT; e LACEY, 2003).
Figura 8
Efeitos do VEGF na angiogênese e osteogênese (adaptado de
60
YANG et al., 2012)
Figura 9
Aspecto clínico das regiões submetidas à terapia fotodinâmica.
81
(A) No dia da aplicação do fármaco e irradiação; (B) 7 dias após
aplicação; (C) No dia da aplicação do fármaco e irradiação; (D) 7
dias após aplicação. Natal/RN, 2014.
Figura 10
Fotomicrografias de gengiva clinicamente saudável do grupo
83
teste.
Figura 10A
O destaque mostra coleções de células inflamatórias em tecido
83
conjuntivo fibrovascular (Pannoramic Viewer, H.E., 200µm).
Figura 10B
Detalhe de numerosos vasos sanguíneos congestos em região
83
subepitelial (Pannoramic Viewer, H.E., 100µm).
Figura 10C
As setas apontam a grande quantidade de vasos sanguíneos
presentes em região subepitelial, proliferação que contribui para a
83
22
inflamação crônica. (Pannoramic Viewer, H.E., 200µm).
Figura 10D
Tecido conjuntivo mixomatoso exibindo edema, infiltrado
83
inflamatório mononuclear, e numerosos vasos sanguíneos com
alguns brotamentos vasculares (Pannoramic Viewer, H.E.,
100µm).
Figura 10E
Manchas basofílicas em região subepitelial, compatíveis com o
83
processo de calcificação distrófica (Pannoramic Viewer, H.E.,
500µm). Detalhe da calcificação.
Figura 10F
Manchas basofílicas em região subepitelial, compatíveis com o
83
processo de calcificação distrófica. Asteriscos destacam as
calcificações vasculares (Pannoramic Viewer, H.E., 200µm).
Figura 11
Escores do infiltrado inflamatório para os grupos da pesquisa.
84
Natal, RN. 2014.
Figura 12
Fotomicrografia de gengiva clinicamente saudável evidenciando
85
a intensidade do infiltrado inflamatório. (A) Fraca, (B) Moderado
(C) Intenso (Pannoramic Viewer, H.E., 500µm).
Figura 13
Fotomicrografia demonstrando marcação fraca para RANK em
86
epitélio e tecido conjuntivo de gengiva clinicamente saudável.
Observar imunorreatividade em camada basal (Pannoramic
Viewer, LSAB, 200µm).
Figura 14
Fotomicrografia demonstrando marcação moderada para RANKL
87
em epitélio e tecido conjuntivo do grupo teste. Observar
imunorreatividade em camada suprabasal (Pannoramic Viewer,
LSAB, 500µm).
Figura 15
Fotomicrografia demonstrando marcação moderada para RANKL
87
em tecido conjuntivo do grupo teste. Observar imunorreatividade
em mononucleares. (Pannoramic Viewer, LSAB, 100µm).
Figura 16
Escores do RANK nos grupos da pesquisa. Natal, RN. 2014.
89
Figura 17
Escores do RANKL nos grupos da pesquisa. Natal, RN. 2014.
90
Figura 18
Fotomicrografia demonstrando marcação fraca para RANK em
90
epitélio e tecido conjuntivo de gengiva clinicamente saudável
(Pannoramic Viewer, LSAB, 200µm).
23
Figura 19
Fotomicrografia demonstrando marcação fraca para RANKL em
91
epitélio e tecido conjuntivo de gengiva clinicamente saudável
(Pannoramic Viewer, LSAB, 200µm).
Figura 20
Fotomicrografia demonstrando ausência de marcação para OPG
91
no grupo teste (Pannoramic Viewer, LSAB, 200µm).
Figura 21
Escores do VEGF nos grupos da pesquisa. Natal, RN. 2014.
93
Figura 22
Fotomicrografia demonstrando marcação moderada para VEGF
93
em camada basal e suprabasal do epitélio e tecido conjuntivo de
gengiva clinicamente saudável (grupo teste). (Pannoramic
Viewer, LSAB, 100µm).
Figura 23
Fotomicrografia demonstrando marcação moderada do VEGF em
94
células endoteliais e inflamatórias do tipo mononuclear em tecido
conjuntivo de gengiva clinicamente saudável (grupo teste).
(Pannoramic Viewer, LSAB, 200µm).
Figura 24
Fotomicrografia demonstrando marcação forte para VEGF em
camada basal e suprabasal do epitélio e tecido conjuntivo de
gengiva clinicamente saudável (grupo teste). (Pannoramic
Viewer, LSAB, 200µm).
94
24
LISTA DE QUADROS E TABELAS
25
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Página
Quadro 1
Grupos do estudo. Natal/RN, 2014.
Quadro 2
Parâmetros da irradiação utilizados no experimento. Natal/RN,
2014.
Quadro 3
66
69
Especificidade, recuperação antigênica, diluição, tempo de
incubação e fabricante dos anticorpos utilizados. Natal/RN,
2014.
Quadro 4
72
Metodologia proposta no experimento para os imunomarcadores
RANK, RANKL e OPG. (Legendas: P (escores percentuais), I
(intensidade de coloração), S (escores totais= P.I). Natal/RN,
2014.
Quadro 5
Elenco de variáveis dependentes e independentes analisadas no
estudo. Natal/RN, 2014.
Quadro 6
Tabela 1
76
Frequências referentes ao gênero, idade, cor de pele e local de
aplicação. Natal/RN, 2014.
Quadro 7
75
79
Avaliação dos efeitos adversos no grupo teste nos dias seguintes
à aplicação da terapia fotodinâmica. Natal/RN, 2014.
80
Distribuição dos escores da marcação imunoistoquímica para os
88
anticorpos anti-RANK, -RANKL e -OPG nos grupos da
pesquisa. Natal/RN, 2014.
Tabela 2
Parâmetros utilizados no cálculo do teste de Mann-Whitney para
95
a avaliação do dos escores de células imunorreativas para o
RANK, RANKL, OPGe VEGF e o grau da inflamação entre os
grupos da pesquisa. Natal/RN, 2014.
Tabela 3
Correlação dos escores de células imunorreativas para o RANK,
RANKL e VFGF e o grau da inflamação nos grupos da pesquisa.
Natal/RN, 2014.
96
26
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
27
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ALA
Ácido aminolevulínico
AlClFc
Cloro-alumínio ftalocianina
ALT
Do inglês Alanine transaminase
ERO
Espécies reativas de oxigênio
Fc
Ftalocianina
FS
Fotossensibilizante
G-CSF
Do inglês granulocyte colony-stimulating factor, traduzido como fator
estimulador de colônia granulocítica
GM-CSF
Do inglês granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, traduzido como
fator estimulador de colônia de granulócito-macrófago.
HpD
Derivados da hematoporfirina
ICAM-1
Moléculas de adesão intracelular
IL
Interleucinas
IL-1β
Interleucina-1beta
IL-6
Interleucina-6
IL-8
Interleucina-8
INF-γ
Do inglês Interferon gamma, traduzido como interferon gama
LSAB
Do inglês labeled streptavidin biotin, traduzido como conjugado
estreptoavidina-biotina.
MMPs
Do inglês matrix metalloproteinases, traduzido como metaloproteinases de
matriz.
mW
miliwatt
NF-Κb
Do inglês nuclear factor κB, traduzido como fator nuclear κB.
O2
Oxigênio diatômico ou oxigênio molecular ou oxigênio tripleto
OPG
Do inglês osteoprotegerin, traduzido como osteoprotegerina.
OPGL
Do inglês OPG ligand, traduzido como ligante da osteoprotegerina.
PGE2
Prostaglandina E2
PLGF
Do inglês plateled-derived growth factor, traduzido como fator de crescimento
derivado de plaquetas
RANK
Do inglês receptor activator of nuclear factor κB, traduzido como receptor
28
ativador do fator nuclear κB.
RANKL
Do inglês receptor activator of nuclear factor κB ligand, traduzido como
ligante do receptor ativador do fator nuclear κB.
RKT
Do inglês tyrosine kinase recptor, traduzido como receptor tirosina quinase
SISNEP
Sistema Nacional de Informações Sobre Ética em Pesquisa envolvendo Seres
Humanos
TBX
Tromboxano
TFD
Terapia fotodinâmica
TGP
Transaminase Glutâmico Pirúvica
TLR
Do inglês toll-like receptor, traduzido como receptor do tipo toll
TNF
Do inglês tumor necrosis factor, traduzido como fator de necrose tumoral.
TNFR
Do inglês tumor necrosis factor receptor, traduzido como receptor do fator de
necrose tumoral.
TNF-α
Do inglês tumor necrosis factor-α, traduzido como fator de necrose tumoral-α.
TRAF
Do inglês TNF receptor-associated factor, traduzido como fator associado ao
receptor do fator de necrose tumoral.
TRANCE Do inglês TNF-related activation-induced cytokine, traduzido como Citocina
Indutora de Ativação Relacionada ao TNF
TRIS-
Tris-hidroximetil-aminometano
HCL
VEGF
Do inglês vascular endotelial growth factor r, traduzido como receptor do fator
de crescimento endotelial vascular
VEGF-A
Refere-se a isoforma A do fator de crescimento endotelial vascular
VEGF-B
Refere-se a isoforma B do fator de crescimento endotelial vascular
VEGF-C
Refere-se a isoforma C do fator de crescimento endotelial vascular
VEGF-D
Refere-se a isoforma D do fator de crescimento endotelial vascular
VEGFR-1 Do inglês vascular endotelial growth factor receptor 1, traduzido como
receptor 1 do fator de crescimento endotelial vascular
VEGFR-2 Do inglês vascular endotelial growth factor receptor 2, traduzido como
receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular
VEGFR-3 Do inglês vascular endotelial growth factor receptor 3, traduzido como
receptor3 do fator de crescimento endotelial vascular
W
Watts
29
0S*
Fotossensiblizante no estdado fundamental
1O2
Oxigênio singlete
1S*
Fotossensibilizante no estado singlete
3S*
Fotossensibilizante no estado triplete
30
SUMÁRIO
31
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
LISTA DE QUADROS E TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Página
1 INTRODUÇÃO
34
2 REVISÃO DA LITERATURA
37
2.1 Terapia fotodinâmica
38
2.1.1 FÁRMACOS FOTOSSENSIBILIZANTES
40
2.1.1.1 FTALOCIANINAS
42
2.1.1.2 CLORO-ALUMÍNIO FTALOCIANINA
43
2.1.2 FONTES DE LUZ NA TERAPIA FOTODINÂMICA
44
2.1.3 PARÂMETROS DA LUZ LASER
46
2.1.4 MECANISMOS DE AÇÃO FOTOQUÍMICOS
48
2.1.5 MECANISMOS BIOLÓGICOS ENVOLVIDOS NA TFD
50
2.2. Citocinas e fatores estimuladores da reabsorção óssea
54
2.2.1 RANK, RANKL e OPG
56
2.2.2 FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR (VEGF)
58
3 PROPOSIÇÃO
63
4 MATERIAL E MÉTODOS
64
4.1 Considerações éticas
65
4.2 Caracterização do estudo
65
4.3 População
65
4.4 Amostra
66
4.4.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
66
4.5 Desenho experimental
67
4.6 Metodologia
67
4.6.1 FORMULAÇÃO DA NANOEMULSÃO DE CLORO-ALUMÍNIO
67
FTALOCIANINA
4.6.2 FONTE DE LASER
67
4.6.3 EXPERIMENTOS IN VIVO
68
32
4.6.3.1 AVALIAÇÃO PRÉ-TRATAMENTO
68
4.6.3.2 APLICAÇÃO DA CLORO-ALUMÍNIO FTALOCIANINA E
68
IRRADIAÇÃO
4.6.3.3 ANÁLISE DA TOLERABILIDADE E SEGURANÇA DO FÁRMACO
69
4.6.3.4 EXODONTIAS PÓS TFD
70
4.6.3.5 PROSERVAÇÃO DOS PACIENTES PÓS TFD
70
4.7 Estudo Morfológico
70
4.7.1 COLORAÇÃO PELO MÉTODO HEMATOXILINA-EOSINA
71
4.7.2 ANÁLISE MORFOLÓGICA
71
4.8 Estudo imunoistoquímico
72
4.8.1 COLORAÇÃO PELO MÉTODO IMUNOISTOQUÍMICO
72
4.8.2 ANÁLISE DAS CÉLULAS IMUNOMARCADAS
74
4.9 Elenco de variáveis
76
4.10 Processamento e análise dos dados
76
5 RESULTADOS
78
5.1 Análise descritiva dos participantes do estudo
79
5.2 Aplicação clínica da terapia fotodinâmica
79
5.3 Efeitos adversos da terapia fotodinâmica
80
5.4 Achados histológicos
82
5.4.3ANÁLISE DO INFILTRADO INFLAMATÓRIO
84
5.5 Resultados imunoistoquímicos
85
5.5.1 RANK, RANKL e OPG.
85
5.5.1.1 IMUNOLOCALIZAÇÃO
85
5.5.1.2 Análise dos escores de imunoexpressão para os anticorpos anti-RANK,
88
anti-RANKL e anti-OPG entre os grupos de estudo.
5.5.2 VEGF
92
5.5.2.1 IMUNOLOCALIZAÇÃO
92
5.5.2.2 ANÁLISE DOS ESCORES DE IMUNOEXPRESSÃO PARA O
92
ANTICORPO ANTI-VEGF ENTRE OS GRUPOS
5.6 Resultados estatísticos
95
5.6.1 ASSOCIAÇÃO DOS ESCORES DE IMUNOMARCAÇÃO DO RANK,
95
RANKL,OPG, VEGF E O GRAU DE INFLAMAÇÃO ENTRE OS GRUPOS
33
5.6.2 CORRELAÇÃO DOS ESCORES DE IMUNOMARCAÇÃO DE RANK,
96
RANKL, OPG E VEGF DE ACORDO COM O GRAU DE INFLAMAÇÃO
NOS GRUPOS
6 DISCUSSÃO
97
CONCLUSÕES
106
REFERÊNCIAS
108
APÊNDICES
118
ANEXOS
125
34
INTRODUÇÃO
35
1 INTRODUÇÃO
A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica promissora que vem
sendo utilizada em pesquisas e investigações clínicas para diversas doenças como tumores
malignos e não-malignos, periodontite, desordens potencialmente malignas e outras lesões
orais. Esta terapia não cirúrgica tem sido utilizada por ser minimamente invasiva e de fácil
execução; além de apresentar bons resultados (BROWN; BROWN; WALKER, 2004). O
princípio desta terapia consiste na administração de uma substância fotossensibilizante nas
células e tecidos seguida pela aplicação de irradiação a laser (laser de baixa intensidade). A
absorção de fótons pelo fármaco fotossensibilizante promove a sua transformação em uma
molécula extremamente instável, que reage com o oxigênio presente no meio celular e forma
íons peróxidos, superóxidos e radicais hidroxila que são extremamente citotóxicos
(CHONDROS et al., 2009; GURSOY et al., 2013; LUKSIENE, 2003).
Nos últimos anos, pesquisas sobre a ação da TFD têm sido largamente exploradas
principalmente no que diz respeito a vias de transdução de sinais, fatores transcricionais e
reguladores do ciclo celular, inflamação e apoptose. Os mecanismos associados à destruição
das células e tecidos com o uso desta terapia podem ser mediados por diversas vias de
sinalização que muitas vezes se sobrepõem. Morte celular, alterações da vascularização local,
e efeitos imunomodulatórios estão envolvidos na fotossensibilização e podem contribuir para
sua ação terapêutica (CASTANO; MROZ; HAMBLIN, 2006; GURSOY et al., 2013).
Numerosos fotossensibilizantes têm sido utilizados na fotoativação de sistemas
biológicos. O desenvolvimento de novos fármacos fotossensibilizantes para TFD é complexo
e requer testes experimentais pré-clínicos em várias etapas para posteriormente entrar nas
fases de pesquisa clínica. Estudos com a cloro-alumínio ftalocianina (AlClFc) tem
demonstrado que este fármaco mantém todas as suas propriedades fotofísicas e fotoquímicas
quando administrado in vitro e in vivo (NUNES et al., 2004; SEGUIER et al., 2010). Análise
da atividade mitocondrial e de organelas celulares (FERREIRA et al. 2004; TAMIETTI et al.,
2007); análise de viabilidade celular, citotoxicidade e potencial genotóxico em cultura de
células (TAPAJOS et al., 2008; MUEHLMANN et al., 2014); danos vasculares, necrose
tecidual (LONGO et al., 2009) e redução de metástases para linfonodos cervicais (BICALHO
et al., 2013) foram investigados em estudos pré-clínicos. Os resultados dos estudos descritos
acima apontam o uso da AlClFc como uma droga com eficaz atividade antitumoral.
36
Escassos estudos clínicos (SÉGUIER et al., 2010; LONGO et al., 2012) com a AlClFc
foram realizados e pouco se conhece sobre a segurança e uso em humanos. Deste modo, este
estudo é o primeiro a testar o fármaco associado em sistema nanoestruturado em gengiva de
humanos e investigar por meio de imunoistoquímica a presença de proteínas relacionadas com
o estímulo da reabsorção óssea, entre elas o receptor ativador nuclear kappa B (RANK) e seu
ligante (RANKL), a osteoprotegerina (OPG) e fator de crescimento endotelial vascular
(VEGF) em um modelo experimental do tipo split-mouth.
37
REVISÃO DA LITERATURA
38
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Terapia fotodinâmica (TFD)
A terapia fotodinâmica (TFD), também conhecida como foto quimioterapia, é uma
nova modalidade terapêutica, que vem sendo amplamente utilizada em diversas
especialidades da área da saúde . Ela encontra-se no rol de modalidades terapêuticas antitumorais, tendo sido aprovado seu uso clínico em vários países para tratamento de tumores em
fase inicial e tratamento sintomatológico paliativo em pacientes com tumores em fase
avançada (MILLA SANABRIA et al., 2013).
Os estudos com esta terapia remontam o século dezenove e, desde aquela época, os
relatos apontavam a combinação da luz com substâncias químicas na indução da morte
celular. Em 1900, Oscar Raab demonstrou que certos comprimentos de onda associados à
acridina eram letais para infusões de Paramecium. Três anos depois, Herman Von Tappeiner
e A. Jesionek trataram tumores de pele com eosina e luz branca descrevendo este fenômeno
como uma ‘ação fotodinâmica’. Já em 1913, Friedrich Meyer-Betz, um cientista alemão,
testou a TFD com uso de porfirinas na própria pele. Em 1960, iniciou-se o uso da TFD na
Clinica Mayo e descobriram sua utilização como ferramenta de diagnóstico. Em 1975,
pesquisas apontaram o uso da TFD na erradicação de tumores de mama e carcinoma de
bexiga em camundongos. Apenas em 1976, foi realizada a primeira triagem clínica em 5
pacientes com câncer de bexiga e, em 1978, Thomas Dougherty e et al. trataram 25 pacientes
com tumores de pele. Ambos obtiveram resultados promissores. Somente em 1999, foi
aprovada no Canadá a primeira droga (Porfimer Sodium – Photofrin®) para uso na TFD
(DOLMANS; FUKUMURA; JAIN, 2003).
Desde essa época, a TFD vem sendo utilizada no tratamento de tumores superficiais
localizados, principalmente, tumores de pele (VAN DONGEN; VISSER; VROUENRAETS,
2004; CAI et al., 2013) além de estar sendo recentemente testada para diversos tumores
primários, como por exemplo, o colangiocarcinoma (KNIEBUHLER et al., 2013); tumores
do trato urinário e digestivo (DOLMANS; FUKUMURA; JAIN, 2003; MILLA SANABRIA
et al., 2013); e o carcinoma de células escamosas (IKEDA et al., 2013; ZANGH, et al., 2012).
O princípio desta terapia consiste na utilização de uma substância fotossensibilizante
(FS) seguida por aplicação de irradiação a laser. A absorção de fótons pelo agente
39
sensibilizante promove a sua transformação em uma molécula extremamente instável que
reage com o oxigênio do meio celular formando espécies reativas de oxigênio (ERO)
extremamente tóxicas para as células, tecidos e microrganismos (LUKSIENE, 2003; PAZOS;
NADER, 2007). Durante este processo, o sensibilizante é regenerado de forma que sua
atuação seja catalítica, de maneira que vários ciclos de produção de espécies oxidativas
ocorram para cada molécula sensibilizante (BROWN; BROWN; WALKER, 2004).
O acúmulo seletivo do fotossensibilizante nas células tumorais parece estar
relacionado a dois mecanismos. O primeiro refere-se à natureza lipofílica dessas substâncias,
que ao serem administradas no organismo, se ligam a lipoproteínas plasmáticas carreadoras.
Como as células neoplásicas expressam receptores de lipoproteínas em grandes quantidades,
elas passam a internalizar quantidades maiores do sensibilizante que as células não tumorais.
O segundo mecanismo estaria relacionado ao pH ácido presente nos tecidos tumorais e que
favorece a absorção da droga pelas células neoplásicas (LUKSIENE, 2003).
Deste modo, a TFD envolve dois componentes atóxicos que combinados induzem
efeitos celulares e teciduais. O primeiro componente é o fotossensibilizante (FS) - uma
molécula fotossensível que se localiza em uma célula e/ou tecido alvo. O segundo
componente envolve a administração da luz, em comprimentos de onda específicos, que
ativam o agente sensibilizante culminando com a formação dos radicais livres citotóxicos
(Figura 1) (DOLMANS; FUKUMURA; JAIN, 2003).
Figura 1 Mecanismo de ação da terapia fotodinâmica (adaptado de DOLMANS; FUKUMURA;
JAIN, 2003).
40
Além de sua utilização na terapia anti-tumoral, microrganismos como bactérias,
fungos, vírus e protozoários podem ser eliminados pelas espécies de oxigênio formadas.
Infecções do herpes simples podem ser eficazmente tratadas com a terapia fotodinâmica
(GURSOY et al., 2013). Ademais, a TFD tem sido utilizada no tratamento de desordens
potencialmente malignas da mucosa oral (SAINI & POH, 2013) e na doença periodontal
(SGOLASTRA et al., 2013). Alguns estudos realizados em pacientes portadores de
leucoplasia oral e hiperplasia verrucosa oral mostraram resposta completa à terapia (SIERON
et al. 2001; SIERON et al. 2003; CHEN et al. 2005; YU et al. 2009).
As principais vantagens desta terapia incluem a excelente cicatrização e o baixo custo
(COPPER et al., 2007; GURSOY et al., 2013), além de ser minimamente invasiva, com
efeitos citotóxicos superiores comparados aos efeitos destrutivos, mantendo normais a matriz
extracelular e seu funcionamento (KARAKULLUKCU et al., 2011). A TFD oferece diversas
vantagens comparadas a tratamentos convencionais para o câncer, como baixa toxicidade
sistêmica, uma elevada seletividade para o tumor, poucos efeitos secundários, a possibilidade
de ciclos repetitivos de tratamento e a combinação com outras terapias, por exemplo,
quimioterapia e radioterapia (MILLA SANABRIA et al., 2013). Ademais, pode ser realizada
em ambiente ambulatorial, dispensando, em alguns casos, as internações hospitalares –
comuns e massacrantes no tratamento do câncer (HOPPER; NIZIOL; SIDHU, 2004).
Uma das limitações da terapia fotodinâmica é sua incapacidade de curar doença
disseminada e avançada porque a irradiação do corpo inteiro com doses adequadas não é
possível (BROWN; BROWN; WALKER, 2004). Todavia, essa terapia quando aplicada
localmente pode melhorar consideravelmente a qualidade de vida e a sobrevida do paciente
com doença avançada. Outra limitação é a falta de seletividade dos agentes
fotossensibilizantes, que pode causar toxicidade, além de outros incômodos, como dor e ardor
locais no momento da terapia (VAN DONGEN; VISSER; VROUENRAETS, 2004).
2.1.1 FÁRMACOS FOTOSSENSIBILIZANTES
Fármacos fotossensibilizantes são compostos atóxicos, inativos em seu estado
fundamental, que absorvem a luz dentro do espectro da luz visível (400-700nm) (JORI, 2006).
Os fotossensibilizantes podem ser injetados por via intravenosa, ingeridos oralmente, ou
aplicado topicamente (GURSOY et al., 2013). Ao serem expostos à radiação com
41
comprimentos de onda apropriados, suas moléculas são excitadas liberando espécies reativas
de oxigênio (GORMAN; BROWN; GRIFFITHS, 2006). As propriedades físico-químicas de
cada agente são importantes para a eficácia da fotossensibilização. A pureza química,
capacidade de se localizar especificamente no tecido neoplásico, curto intervalo de tempo
entre a administração da droga e seu acúmulo nos tecidos hiperproliferativos, rápida
eliminação dos tecidos normais, comprimento de onda de ativação com ótima penetração nos
tecidos, alto rendimento quântico para a geração de espécies oxidativas e ausência de
toxicidade são características desejáveis de um FS ideal (GURSOY et al., 2013; LUKSIENE,
2003).
Devido a natureza lipofílica de algumas das substâncias fotossensibilizantes, elas
tendem a se acumular nas membranas celulares. Na prática, estas substâncias não tendem a se
acumular no núcleo das células. Assim, a fotossensibilização tem geralmente um baixo
potencial de causar danos diretos ao DNA, mutações e carcinogênese. Já, os danos à
membrana plasmática podem ser observados poucos minutos após a exposição à luz. Este
dano é caracterizado por inchaço e saliências na membrana com ruptura e derramamento de
vesículas contendo enzimas marcadoras da membrana plasmática, enzimas citossólicas e
lisossomais, redução do transporte ativo, despolarização da membrana plasmática, inibição da
atividade enzimática, como Na+ K+ - trifosfatase adenosina (ATPase), um aumento de Ca2 +,
regulação ascendente e descendente de antígenos de superfície e outros (LUKSIENE, 2003).
Os fotossensibilizantes são geralmente classificados em porfirinas e não-porfirinas. As
preparações iniciais de fotossensibilizantes para TFD foram à base de uma complexa mistura
de porfirinas chamada de derivados da hematoporfirina (HpD) (BROWN; BROWN;
WALKER, 2004). A porfirina é o esqueleto básico para uma ampla variedade de derivados
sintetizados, como as benzoporfirinas, clorinas, ftalocianinas, entre outras. A molécula de
porfirina e suas variações são largamente encontradas nos seres vivos e diferem uma das
outras pela natureza das substituições nas posições 1-8 (O'CONNOR; GALLAGHER;
BYRNE, 2009). Os derivados das porfirinas são classificados ainda em primeira, segunda e
terceira gerações. A primeira geração inclui os HpD e o Photofrin. Os de segunda geração
surgiram posteriormente para eliminar alguns problemas como fotossensibilização prolongada
da pele e lenta penetração tecidual. E os de terceira geração são os associados à
nanopartículas (GURSOY et al., 2013; O'CONNOR; GALLAGHER; BYRNE, 2009).
42
2.1.1.1 FTALOCIANINAS
As ftalocialinas (Fc) foram descobertas em 1900 como impurezas em preparações
industriais de ftalamida e posteriormente identificadas como membros da família das
porfirinas, correspondendo ao grupo de fotossensibilizantes de segunda geração (GORMAN;
BROWN; GRIFFITHS, 2006; O'CONNOR; GALLAGHER; BYRNE, 2009). Existem
numerosos usos comerciais associados com as ftalocianinas como na indústria têxtil,
fotográfica e elétrica. Mais recentemente, ela tem atraído interesse na terapia fotodinâmica em
função de suas propriedades fotofísicas e fotoquímicas (NUNES; SGUILLA; TEDESCO,
2004; O'CONNOR; GALLAGHER; BYRNE, 2009). Elas formam quelatos com diversos íons
metálicos, sendo os mais fototóxicos os compostos com zinco e alumínio, pois alongam sua
meia-vida (VAN DONGEN; VISSER; VROUENRAETS, 2004).
As ftalocianinas mimetizam as porfirinas no seu núcleo central (unidade cíclica
tetrapirrólica), no entanto, são unidas por átomos de nitrogênio e possuem anéis benzênicos
sobre as unidades pirrólicas (Figura 2) que resultam em grande absorção na região do
vermelho do espectro visível (670-770nm). Comparadas aos fotossensibilizantes de primeira
geração, as ftalocianinas possuem muitas vantagens como alta absorção de luz (2x105M-1.cm1
) nos comprimentos de onda de 600 a 800nm e baixa toxicidade in vitro (GOMER, 1991).
Elas
podem
ser
moléculas
hidrofóbicas
(VAN
DONGEN;
VISSER;
VROUENRAETS, 2004), isto é, são insolúveis em água ou em solventes compatíveis com os
sistemas biológicos. Assim, são administradas in vivo por meio de sistemas de distribuição,
como os lipossomos e as nanoemulsões (NUNES; SGUILLA; TEDESCO, 2004). Esses
sistemas são utilizados em diversos tipos de aplicações, desde a veiculação de biomoléculas e
princípios ativos para o tratamento de doenças, até a administração de agentes antioxidantes e
substâncias exógenas de origem natural para tratamento estético ou cosmecêutico
(WEYENBERG et al., 2007). As propriedades fotofísicas das ftalocianinas são fortemente
dependentes do íon metálico central. As zinco e cloro-alumínio ftalocianinas são as que
apresentam as propriedades mais favoráveis (NUNES; SGUILLA; TEDESCO, 2004).
43
Figura 2 Estrutura química da ftalocianina (Fonte: (O'CONNOR; GALLAGHER; BYRNE, 2009))
2.1.1.2 CLORO-ALUMÍNIO FTALOCIANINA
A cloro-alumínio ftalocianina tem atraído interesse em função de sua alta absorção de
luz (2x105M-1cm-1) na luz vermelha intensa (650-700nm). Desde então, alguns estudos tem
avaliado os efeitos favoráveis deste fotossensibilizante em pesquisas pré-clínicas (LONGO et
al., 2009; NUNES; SGUILLA; TEDESCO, 2004; TAPAJOS et al., 2008) e pesquisas clínicas
(LONGO et al., 2012; SEGUIER et al., 2010). Tapajós et al. (2008) avaliaram o uso deste
fármaco em cultura de células de carcinoma oral. Seus resultados apontaram uma redução da
viabilidade celular, associado com alterações morfológicas com o predomínio do processo de
destruição das células neoplásicas pelo processo de necrose e ausência de genotoxicidade.
Longo et al. (2009) descreveram a utilização e eficácia desta terapia em tumores de Erlich
em camundongos, com o grupo teste apresentando 90% de necrose tumoral após 24 horas de
aplicação da terapia. Alterações macroscópicas, como degeneração da mucosa e formação de
ulcerações nas regiões que se submeteram a terapia, além de perda de peso nos animais
durante o experimento puderam ser evidenciadas. Seguier et al. (2010) avaliaram o efeito da
terapia fotodinâmica no infiltrado inflamatório e na organização da rede de colágeno na
periodontite crônica humana. Os autores encontraram um aumento da densidade de fibras
colágenas e uma redução específica no número de células apresentadoras de antígeno nos
tecidos após a TFD. Longo et al. (2012) mostraram que a terapia foi eficaz na redução da
carga microbiana em tecidos cariados com uma redução média de 82% do total das unidades
formadoras de colônias bacterianas nas cavidades tratadas após aplicação TFD, sem presença
de efeitos adversos durantes os procedimentos clínicos. Bicalho et al. (2013) demonstraram a
remissão completa de tumores em língua (tumores de Erlich) e, que a TFD foi capaz de
44
impedir a ocorrência de metástases regionais com aumento de sobrevida, exibindo apenas
redução do peso nos ratos submetidos à terapia como efeito adverso.
2.1.2 FONTES DE LUZ NA TERAPIA FOTODINÂMICA
Diversas fontes de luz podem ser usadas na TFD. As fontes de luz disponíveis para
TFD pertencem a três grandes grupos: as lâmpadas de amplo espectro, as lâmpadas de diodo e
os lasers. As fontes de luz não coerentes descritas em estudos clínicos em TFD incluem as
lâmpadas halógenas projetoras de diapositivos, as lâmpadas de diodo (LED) e, mais
recentemente, a luz intensa pulsada (LIP) (ZELICKSON, 2005).
A origem do vocábulo “laser” vem da sigla em inglês “Light Amplification by
Stimulated Emission of Radiation”, ou seja, amplificação da luz por emissão estimulada de
radiação. O príncipio básico do uso do laser é que a irradiação com comprimentos de onda
específicos e dependentes da energia aplicada tem a capacidade de alterar o comportamento
celular na ausência de aquecimento. Existem diferentes equipamentos que, ao emitirem
determinado tipo de energia, desencadeiam o efeito desejado sobre um tecido onde o mesmo
esteja sendo aplicado. O laser é uma luz pura, pois possui fótons com o mesmo comprimento
de onda e frequência, característica conhecida como monocromaticidade. Outra característica
é que os fótons são ditos coerentes, isto é, propagam-se na mesma direção no tempo e no
espaço. Além disso, são ditos unidirecionais, característica conhecida como colimação. O
laser apresenta um comprimento de onda específico, correspondente ao pico de absorção do
fotossensibilizante. Sua capacidade de emissão de luz monocromática de alta fluência,
associada à precisão do foco, permite tratar pequenas lesões com mínimo dano ao tecido ao
redor e em curto intervalo de tempo e tem sido utilizado para TFD. A classificação dos lasers
é baseada na interação do laser com o tecido biológico, sendo divididos em: lasers de baixa
intensidade (laser terapêutico, laserterapia, laser de baixa potência), e alta intensidade (laser
cirúrgico, ablativo, alta potência), que causa destruição celular por elevação da temperatura do
tecido (ação fototérmica) com desnaturação do conteúdo proteico celular com principais
diferenças relativas à potência e ao mecanismo de ação (DAMANTE, 2003; GENOVESE,
2007).
Os lasers terapêuticos mais comumente empregados são o Hélio-Neônio e o diodo.
Estes tipos de lasers não são capazes de causar mutações por ação direta sobre o DNA, pois a
45
energia desses fótons é muito fraca para causar ruptura das ligações covalentes das moléculas.
O DNA e o RNA não tem banda de absorção na região do espectro visível. As mutações
podem ser causadas por agentes secundários como as ERO, como o ânion superóxido, e o
peróxido de hidrogênio que são formados nas atividades normais mitocondriais. A ação
mutagênica ocorreria diretamente nessas áreas irradiadas pela ação das ERO (KARU, 2007).
A TFD requer uma fonte de luz de baixa potência, situada na porção do visível do
espectro eletromagnético e comprimento de onda específico ressonante ao sensibilizante
(GENOVESE, 2007). O surgimento dos lasers de diodo foi importante para o uso como
ferramenta clínica na TFD. Eles apresentam como vantagens maior penetração nos tecidos
biológicos, comprimentos de onda fixos ressonantes à região de absorção da maioria dos
sensibilizantes utilizados atualmente, atuam de forma contínua, além de serem de fácil
manuseio e de baixo custo (BROWN; BROWN; WALKER, 2004).
Na Odontologia, o sistema de entrega dos feixes de luz ao tecido alvo, mais
comumente utilizado, são os feixes de fibra óptica. Isto se deve ao seu fácil acesso à cavidade
bucal. Os elétrons em estado de equilíbrio passam por um estágio de excitação após o
estímulo externo. Para voltar ao estado de equilíbrio eles emitem um fóton, que é uma onda
de energia. Dentro do aparelho estes fótons se propagam num eixo entre os dois espelhos e
deixam a cavidade emitindo um feixe de luz (DAMANTE, 2003). As indicações clínicas do
laser têm sido para alívio da dor, reparação tecidual, redução do edema e hiperemia. Além
destas, outras indicações mais específicas são: síndrome da dor e disfunção da ATM; paralisia
facial de Bell; herpes simples; herpes zoster; hipersensibilidade dentinária; afta; alveolite;
anestesia; bioestimulação óssea; cárie; dor; edema; líquen plano, língua geográfica; lesão
traumática; nevralgia do trigêmeo; queilite angular e parestesia (ALMEIDA-LOPES &
MASSINI, 2003).
Os mecanismos de ação da laserterapia estão relacionados à mitocôndria, organela
responsável pela produção de ATP (trifosfato de adenosina) e pelo funcionamento celular. A
matriz mitocondrial produz enzimas essenciais para as reações usadas na geração de energia e
com partículas de síntese do ATP. Quando a célula precisa de energia, o ATP é convertido em
ADP (difosfato de adenosina), que libera energia para a célula. O incremento de ATP
mitocondrial que se produz após a irradiação com laser, favorece um grande número de
reações que intervém no metabolismo celular. O laser irá interferir no processo de troca
iônica, acelerando o incremento de ATP, sobretudo quando a célula está em desordem
funcional (KARU, 2007).
46
Entre os efeitos do laser terapêutico, podemos listar: bioestimulação tecidual, aumento
da síntese de DNA e RNA; incremento na formação do colágeno e substâncias precursoras;
incremento do nível de β-endorfina no líquido céfalo-espinhal; variações quantitativas no
nível de prostaglandinas; liberação de substância pré-formadas (acetilcolina e histamina);
ação nas glândulas secretoras; estimulação da microcirculação vascular; ação na substituição,
reparação, cicatrização de tecido epitelial, ósseo, nervoso e folículos pilosos; além de
estimular a formação de citocinas pró-inflamatórias (ALMEIDA-LOPES & MASSINI, 2003;
GENOVESE, 2007; KARU, 2007).
2.1.3 PARÂMETROS DA LUZ LASER
2.1.3.1 ENERGIA (E)
Representa a quantidade de luz que está sendo depositada no tecido (GENOVESE,
2007). Representada pela fórmula:
E (Joule) = Potência (Watts) X Tempo (segundos)
2.1.3.2 POTÊNCIA (POT)
É a energia capaz de provocar maior ou menor reação fotobiológica (GENOVESE,
2007), representada pela fórmula:
Pot (Watts) = E (Joule)/ Tempo (segundos)
2.1.3.3 IRRADIÂNCIA, DENSIDADE DE POTÊNCIA
É a potência óptica útil do laser, expressa em Watts (W), dividida pela área irradiada,
expressa em cm2.
É através do controle da irradiância que o operador pode gerar
fotoativação, no caso do laser terapêutico (GENOVESE, 2007).
47
Irradiância (W/cm2) = Pot (W)/Área (cm2)
2.1.3.4 FLUÊNCIA, DOSIMETRIA, DENSIDADE DE ENERGIA
É a taxa de energia que esta sendo aplicada nos tecidos biológicos, refere-se à unidade
de superfície irradiada. Expressa em J/cm2 (GENOVESE, 2007).
Fluência (J/cm2) = Irradiância (W/cm2) X Tempo (segundos)
2.1.3.5 COMPRIMENTO DE ONDA
Define a profundidade de penetração no tecido alvo. Diferentes comprimentos de onda
apresentam diferentes coeficientes de absorção para um mesmo tecido. Dependendo do
comprimento de onda o tecido absorve energia mais superficialmente ou profundamente,
agindo na intimidade tecidual, geralmente a nível celular (GENOVESE, 2007). Luz com
comprimento de onda de 635 nm é capaz de penetrar na pele em aproximadamente 6 mm,
comparando com 1 a 2 mm do comprimento de onda entre 400-500 nm. A profundidade
terapeuticamente efetiva, entretanto, parece estar próxima de 1- 3 mm, quando utilizamos 635
nm. Isso se deve à capacidade de produção de uma reação fotodinâmica, a qual dependerá da
dose de luz e, também, da quantidade de fotossensibilizante no tecido alvo (MORTON,
2004). Essa relação é dada por:
Comprimento de onda (nm) = Velocidade da luz no vácuo (m/s)/ Frequência (Hz)
48
2.1.4 MECANISMOS DE AÇÃO FOTOQUÍMICOS
O princípio básico da TFD é a geração de agentes citotóxicos por meio da interação
entre o FS e o laser. O mecanismo pelo qual o fármaco fotossensibilizante associado ao laser
de baixa intensidade causa dano celular ainda não se encontra bem estabelecido. Existem duas
hipóteses: 1) transferência direta de elétrons entre o sensibilizante e biomoléculas, e 2)
transferência de energia, pela excitação do FS, para as moléculas de oxigênio, gerando
oxigênio singleto (1O2). A absorção de fotóns pelo FS gera sua ativação, levando estas
moléculas a situações de grande instabilidade química, com uma mudança do padrão de
organização eletrônica normal. A tendência natural de toda molécula com algum grau de
excitação eletrônica é retornar ao seu estado fundamental, que é energeticamente o mais
favorável a qualquer molécula. O retorno à sua estabilidade é realizado pela emissão de
energia na mesma intensidade da energia de absorção do fóton pelo fármaco FS (LUKSIENE,
2003).
Quando estes fotossensibilizantes são irradiados com luz ultravioleta ou visível,
absorvem energia e passam a um estado excitado chamado de “singlet” ou singlete (1S*). Este
estado 1S* pode decair para o estado fundamental singlete (0S) com emissão de
fluorescência, ou cruzar para um estado “triplet” ou triplete excitado (3S*) (RONSEIN et al.,
2006). A interação da forma “triplet” com as biomoléculas presentes no meio pode dar origem
a dois tipos de reações: tipo I, que envolve transferência de elétrons e excitação, formando
ERO; e tipo II, que é mediado pelo processo de transferência de energia para o oxigênio
molecular e formação do oxigênio “singlet” ou oxigênio singleto (1O2) (AZARPAZHOOH et
al., 2010; DOLMANS; FUKUMURA; JAIN, 2003; GURSOY et al., 2013; RONSEIN et al.,
2006) (Figura 3). O fator que determina se a reação do tipo I ou a tipo II vai ocorrer, depende
da competição entre o substrato e o oxigênio molecular pelo estado triplet excitado do FS
(RONSEIN et al., 2006).
49
Figura 3 Desenho do funcionamento da reação fotoquímica presente na Terapia
Fotodinâmica, onde está descrito a produção de radicais livres após a excitação do
fármaco fotossensibilizante (FS) com irradiação com laser (LONGO; LOZZI;
AZEVEDO, 2011)
Oral cancer and photodynamic therapy as a treatment
Oral
cancer
anddephotodynamic
treatment
A geração
in situ
oxigênio singleto,therapy
pela via as
tipoa II,
desempenha papel central na
citotoxicidade fotodinâmica por causa da interação altamente eficiente destas espécies com
diferentes biomoléculas, presentes no meio celular (CARVALHO et al., 2011; GURSOY et
al., 2013; LUKSIENE, 2003; MROZ; HAMBLIN, 2011). Mitocôndrias, lisossomos e
membranas plasmáticas são alguns dos alvos da TFD (GOMER et al., 2006).
As ERO, formadas nestas reações, são radicais livres com alta energia e podem reagir
com praticamente qualquer molécula, levando a modificações químicas que impedem seu
funcionamento normal, eliminando assim células com alta atividade proliferativa por meio de
dano à membrana, ao DNA ou a outras estruturas celulares, e também por afetar componentes
da matriz extracelular (MEC) (PAZOS; NADER, 2007).
O estresse oxidativo resultante da desregulação do equilíbrio redox em células e
tecidos está associado com um aumento geral nos níveis de ERO. ERO são representados,
principalmente, pelo ânion radical superóxido (O2-), peróxido de hidrogênio (H2O2) e o
radical hidroxila (OH-) nas células. ERO são produzidos em células em vários locais,
incluindo a membrana plasmática, mitocôndria, retículo endoplasmático e o citoplasma.
Vários complexos enzimáticos são responsáveis pela produção de ERO, incluindo a NADPH
oxidase, citocromo P450, xantina oxidase, oxidase de monoamina, da ciclo-oxigenase e
lipoxigenase. As maiores quantidades de ERO são produzidas nas mitocôndrias através da
50
transferência de elétrons desemparelhados da cadeia respiratória de O2. Isto resulta em
formação de O2-, que é então convertido em H2O2 na matriz mitocondrial e no citosol
(WAUQUIER et al., 2009).
Efeitos deletérios do estresse oxidativo resultam de danos às estruturas celulares e
disfunções por causa de oxidações de lipídios e proteínas. Além disso, ERO alteram a
integridade do DNA nuclear e mitocondrial, aumentando o risco de mutações. Quando os
mecanismos de reparo do DNA estão sobrecarregados, as células entram em apoptose ou
necrose, o que pode levar a danos nos tecidos (WAUQUIER et al., 2009). Os radicais de
oxigênio podem lesar diferentes sítios celulares por meio da oxidação de lipoproteínas de
membrana, crosslinks de proteínas e ácidos nucléicos, culminando com distúrbios na função
celular normal e consequente morte celular (FIEDLER; ECKL; KRAMMER, 1996).
2.1.5 MECANISMOS BIOLÓGICOS ENVOLVIDOS NA TFD
O principal agente citotóxico responsável pelos efeitos biológicos do processo de fotooxidação é o oxigênio singleto. O grande aporte de ERO, após a terapia fotodinâmica,
promove uma série de alterações nas células. Dolmans e et al. (2003) descreveram três
mecanismos biológicos principais pelos quais a TFD medeia a destruição celular: a)
destruição direta pelas ERO; b) alteração da vascularização tumoral, gerando áreas de hipóxia
e, c) a ativação do sistema imunológico (Figura 4).
51
Figura 4 Mecanismo de ação da TFD (adaptado de CASTANO; MROZ; HAMBLIN, 2006).
A TFD aproveita a energia da luz para causar dano e destruir o tecido alvo (BROWN
et al., 2004). A morte celular após fotossensibilização pode derivar de mecanismos de
apoptose e/ou necrose, dependendo das estruturas celulares afetadas e da intensidade do
estímulo agressor. Quando o sensibilizante localiza-se nas mitocôndrias ocorre morte por
apoptose, quando localiza-se em lissosomos e membranas celulares ocasiona morte por
necrose (CASTANO; MROZ; HAMBLIN, 2006; LUKSIENE, 2003). Além dos efeitos
citotóxicos diretos de morte celular, efeitos indiretos, como: dano vascular; indução de reação
inflamatória aguda e, desenvolvimento de resposta imune específica, devem ser considerados
no uso da TFD (BROWN; BROWN; WALKER, 2004; CHEN et al., 2005; FIRCZUK;
NOWIS; GOLAB, 2011; CASTANO, MROZ; HAMBLIN, 2006; MROZ; HAMBLIN, 2011;
PAZOS; NADER, 2007) (Figura 5).
52
Figura 5 Desfechos dos efeitos antitumorais da TFD (adaptado de FIRCZUK; NOWIS; GOLAB,
2011).
A TFD ocasiona dano às células endoteliais com liberação de fatores de coagulação e
agregação plaquetária. Após a TFD, as principais alterações vasculares descritas são a
trombose e a oclusão da microvasculatura que, por sua vez, promovem a diminuição e o
colapso do fluxo sanguíneo com consequente hipóxia tecidual (FIRCZUK; NOWIS; GOLAB,
2011; KRAMMER, 2001). Isto é acompanhado por ativação da cascata do complemento,
aumento da permeabilidade dos vasos, liberação de moléculas vasoativas (tromboxano,
leucotrienos, fator de ativação de plaquetas e óxido nítrico), mediadores pró-inflamatórios e
expressão de moléculas de adesão indutíveis que participam do recrutamento e ativação de
leucócitos. O dano vascular é um evento inicial que precipita outras reações inflamatórias
(FIRCZUK; NOWIS; GOLAB, 2011; MROZ; HAMBLIN, 2011). A eficácia da TFD parece
estar fortemente relacionada com o grau e a natureza da inflamação. Ela induz tanto
inflamação local como sistêmica, a qual é caracterizada por duas etapas: 1) o rápido influxo
de neutrófilos e 2) um aumento da expressão de citocinas pró-inflamatórias (por exemplo,
interleucinas [IL] -6) (GOLLNICK, 2012).
O estímulo leucocitário após a TFD leva à liberação de mediadores inflamatórios
como citocinas, fatores de crescimento, componentes do sistema complemento e proteínas da
fase aguda da inflamação (Figura 6) (BRACKETT; GOLLNICK, 2011; GOLLNICK, 2012;
LUKSIENE, 2003). O fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), interleucina-1beta (IL-1β) e a
interleucina-6 (IL-6), produzidas pelas células do estroma e macrófagos após estímulo,
53
favorecem a expressão de moléculas de adesão vascular, incluindo a E-selectina, moléculas de
adesão intracelular (ICAM -1), assim como a síntese de quimiocinas como a interleucina-8
(IL-8) (GOLLNICK et al., 2003). A TFD pode também ajudar na maturação e ativação das
células dendríticas e, aumentar a sua capacidade de ativar os gânglios linfáticos e apresentar
antígenos aos linfócitos T naive (MROZ; HAMBLIN, 2011). A imunidade inata e a resposta
imune adquirida são ativadas pela TFD (BRACKETT; GOLLNICK, 2011; GOLLNICK,
2012; LUKSIENE, 2003).
Figura 6 Mecanismo de ativação leucocitária após TFD (adaptado de CASTANO; MROZ;
HAMBLIN, 2006) (TBX = Tromboxano; DC = célula dendrítica; EC = célula endotelial; PDT =
terapia fotodinâmica).
A inflamação aguda é uma consequência dos efeitos citotóxicos diretos às células
dentro das áreas iluminadas, que incluem também as células endoteliais e mesenquimais. A
complexa reação inflamatória é uma resposta do hospedeiro para restaurar a integridade
tecidual por meio da remoção de células mortas ou danificadas, para restabelecer a
vascularização normal e, para acelerar a cura e manter a homeostase tecidual (FIRCZUK;
NOWIS; GOLAB, 2011).
Diversos estudos apontam o uso dos lasers de baixa intensidade na remodelação
tecidual (ALMEIDA-LOPES & MASSINI, 2003; GENOVESE, 2007; KARU, 2007. Estudos
in vitro utilizando lasers de baixa intensidade demonstram a formação de matriz óssea em
54
culturas de osteoblastos e, ainda a proliferação e maturação de osteoblastos (STEIN et al.,
2005). Além disso, estudos experimentais in vivo sugerem que a terapia fotodinâmica acelera
a cicatrização óssea em defeitos e fraturas, e também a osteointegração de implantes dentários
(FARIA et al., 2014). O estresse oxidativo que ocorre após a fotossensibilização pode levar à
diferenciação osteblástica (GARRETT et al., 1990; RUTAULT et al. 1999; MODY et al.,
2001)
2.2 Citocinas e fatores estimuladores da reabsorção óssea
Um dos mecanismos biológicos relacionados com o uso da TFD é a ativação do
sistema imune. Com o colapso vascular ocasionado pela TFD, ocorre um estímulo
leucocitário que favorece a liberação de citocinas e fatores de crescimento. Desse modo, se as
células alvo não são destruídas pelo efeito citotóxico da TFD, o estresse oxidativo leva à
transcrição e translação de várias respostas ao estresse e genes de citocinas. Citocinas são
pequenas proteínas secretadas que regulam o desenvolvimento e diferenciação das células do
sangue e controlam a atividade dos linfócitos durante a resposta imune. A liberação de várias
citocinas - interleucinas (IL-1ß, IL-2,-6,-8,-10) – e fatores de crescimento, como o fator de
necrose tumoral-alfa (TNF-α), tem sido descritas na modulação da TFD (PAZOS; NADER,
2007).
Muitas destas citocinas são cruciais para diferenciação e maturação do osteoclasto, que
é a célula responsável pela reabsorção óssea fisiológica e patológica. Dentre estas, podemos
citar as interleucinas (IL-1, IL-3, IL-6, IL-11), TNF-α e fator estimulador de colônias de
macrófagos e granulócitos (GM-CSF) (KATAGIRI; TAKAHASI, 2002; KAWASHIMA et
al, 2007). Todos estes fatores atuam pela estimulação das células progenitoras de osteoclastos
ou participando em um sistema parácrino, no qual os osteoblastos e células da medula óssea
estão fortemente envolvidos por meio de mediadores que incluem o receptor ativador do fator
nuclear kappa B (RANK), o seu ligante (RANKL) e a osteoprotegerina (OPG) (YANG et al.,
2012).
Dependendo de sua concentração, as ERO podem ter efeitos benéficos ou deletérios
nos tecidos. Evidências acumuladas sugerem que a biologia óssea é particularmente afetada
pela regulação do equilíbrio redox. Produção de ERO está envolvida na homeostase do tecido
mineralizado e contribui muito na remodelação do osso por promover a reabsorção óssea. O
55
status do estresse oxidativo depende do balanço entre atividades enzimáticas oxidantes e antioxidantes. Falhas na defesa anti-oxidante aumentam o estresse oxidativo o que induz a perda
óssea modulada por uma via de sinalização dependente do TNF-α. Deste modo, evidências
apontam uma correlação negativa entre a produção de ERO e a saúde do osso, promovendo
diretamente a osteooclastogênese e, ainda induzindo apoptose, e redução da diferenciação e
atividade de osteoblastos, enquanto estimula a produção de RANKL (WAUQUIER et al.,
2009).
As células do tecido ósseo podem ser agrupadas em duas séries diferentes: células de
linhagem osteoblástica, responsáveis pelo processo de formação e mineralização da matriz
óssea, e células de linhagem osteoclástica, relacionadas com a sua reabsorção. O processo de
diferenciação das células de linhagem osteoclástica está muito controlado pelos osteoblastos
através do eixo RANKL/RANK/OPG. O equilíbrio entre formação e reabsorção óssea está na
dependência das flutuações locais do rácio RANKL/OPG. Os tipos celulares responsáveis por
estas múltiplas atividades incluem não só células específicas do tecido ósseo como também
células do sistema imunitário e células endoteliais (HOFBAUER; HEUFEULDER, 2001).
O osteoblasto é uma célula mononucleada, derivada de células osteoprogenitoras
localizadas no periósteo e na medula óssea, responsável pela formação dos ossos. Os
osteoblastos e as células do estroma da medula óssea suportam o desenvolvimento de
osteoclastos por meio do mecanismo de interação célula-célula com progenitores
osteoclásticos (YANG et al., 2012). As células osteoprogenitoras são atraídas da medula
óssea para o sangue por quimiocinas e nele circulam até serem atraídas de volta ao tecido
ósseo, por fatores liberados em sítios de reabsorção (chamadas de unidades remodeladoras do
osso), e se diferenciarem em osteoclastos (BOYCE, 2013).
Os osteoblastos secretam três moléculas de sinalização que regulam a diferenciação
dos osteoclastos. A primeira, o fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF), liga-se
a um receptor no macrófago, induzindo-o a se tornar um precursor de osteoclasto em
proliferação, e isto induz a expressão do RANK nessa célula. Outra molécula sinalizadora do
osteoblasto, o RANKL, se liga ao RANK dos precursores osteoclásticos, induzindo-os a se
fundir uns aos outros e formar osteoclastos multinucleados, ativando-os e aumentado a
reabsorção óssea. A terceira molécula de sinalização, a OPG, um membro da família do
receptor do fator de necrose tumoral (TNFR), pode servir como uma isca por sua interação
com o RANKL, impedindo que ele forme uma ligação com o macrófago via RANK e,
consequentemente, inibindo a formação de osteoclastos (GARTNER & HIATT, 2007)
(Figura 7).
56
Figura 7 Papel dos osteoblastos na diferenciação dos osteoclastos (adaptado de BOYLE;
SIMONETT; e LACEY, 2003).
2.2.1 RANK, RANKL e OPG
RANK, RANKL e OPG regulam o metabolismo ósseo e a atividade osteoclástica.
RANK é um receptor transmembrana (de superfície celular) do tipo 1 da família do TNF que
está presente em células precursoras de osteoclastos, células dendríticas, fibroblastos e células
T. RANK humano é um peptídeo de 616 aminoácidos. A ativação do RANK pelo RANKL é
seguida por sua interação com membros da família dos receptores associados ao TNF
(TRAF), ativação do NF-кB e c-Fos que estão relacionados com o processo de maturação
osteoclástica (KHOSLA, 2001; WRIGHT et al., 2009; BOYCE, 2013).
RANKL é um peptídeo de 317 aminoácidos da família do TNF expresso de forma
distinta como uma citocina de membrana celular ou liberado como fator solúvel por diversos
tipos celulares, como linfócitos T, B, condroblastos e osteoblastos (HOFBAUER, 2006;
BOYCE et al, 2008; TYROVOLA, 2008; WRIGHT et al., 2009; BOYCE, 2013). RANKL,
também denominado ligante da osteoprotegerina (OPGL), ODF ou citocina indutora de
ativação relacionado ao TNF (TRANCE), atua como ligante da OPG, desempenha atividade
imuno-modulatória e é capaz de ativar a osteoclastogênese quando se associa ao RANK. A
57
expressão de RANKL em osteoblastos humanos é estimulada por várias citocinas como IL-1,
TNF-α e IL-11 (WRIGHT et al., 2009). A OPG é um peptídeo de 380 aminoácidos que
pertence à família de receptores do TNF, e em contraste com todos os outros receptores TNF
carecem de domínios citoplasmáticos e de membrana e são secretados como proteínas
solúveis por osteoblastos e células mesenquimais da medula óssea (KHOSLA, 2001,
TYROVOLA et al., 2008). A OPG atua como receptor inibitório por se ligar com alta
afinidade ao RANKL impedindo sua interação com o RANK. A expressão e secreção de OPG
por osteoblastos e células do estroma são moduladas por IL-1, TNF-α e TGF-β (WRIGHT et
al., 2009).
Os osteoblastos possuem várias moléculas específicas em sua membrana plasmática,
das quais, as mais significativas são as integrinas e os receptores para o paratormônio.
Quando tal hormônio se liga a estes receptores, ele estimula os osteoblastos a secretarem
RANKL, um fator que induz a diferenciação dos pré-osteoclastos em osteoclastos
(GARTNER & HIATT, 2007). Um aumento da produção de RANKL por células
osteoblásticas leva a diferenciação, ativação e sobrevivência de osteoclastos, o que resulta no
aumento da reabsorção óssea. Isto, junto com o envolvimento do receptor inibitório OPG é
considerado como um mecanismo fundamental no controle da remodelação óssea.
Funcionalmente, a ligação do RANKL ao RANK resulta na rápida diferenciação de
precursores osteoclásticos em osteoclastos maduros e reabsorção óssea. OPG neutraliza
RANKL, inibindo a diferenciação, função e sobrevivência dos osteoclastos (DE MORAES et
al. 2011).
Chuang et al. (2009) avaliaram a expressão de RANK, RANKL e OPG em carcinoma
de células escamosas e utilizaram mucosa oral normal como controle. Na mucosa oral normal,
estes autores demonstraram forte imunomarcação citoplasmática de RANKL limitado às
células epiteliais da camada basal. Em contraste, houve uma completa ausência de
imunomarcação para RANK e OPG em todo o tecido da mucosa oral normal. Giannopoulou
et al. (2012) avaliaram a expressão de RANK, RANKL e OPG em tecido gengival de 14
pacientes com periodontite crônica. Ausência de marcação para RANKL foi observada no
epitélio oral e no epitélio da bolsa periodontal. OPG também foi negativamente expresso em
todo o epitélio. RANK mostrou coloração moderada a forte, principalmente na camada basal e
suprabasal do epitélio oral e da bolsa periodontal. Na maioria dos casos, mais de 60% do
infiltrado celular inflamatório foi imunomarcado para RANK e RANKL. A OPG marcou as
células inflamatórias em menos de metade dos casos avaliados.
58
Poucos estudos avaliam a presença de fatores reguladores da osteoclastogênese
(RANK, RANKL e OPG) após terapia fotodinâmica. Em Odontologia, os estudos se
restringem à doença periodontal. Garcia et al. (2011, 2013) mostraram que ratos tratados com
TFD exibiram fraca imunorreatividade para o RANKL 7 dias após a terapia e forte
imunorreatividade para osteoprotegerina 15 dias pós-terapia. Oliveira et al. (2009) mostraram
ligeira elevação do RANKL 1 dia após a terapia e poucas alterações nos dias subsequentes à
terapia. Carvalho et al. (2011) observaram redução da perda óssea, por meio de análise
histomorfológica em ratos, e redução na expressão de TNF-α, pela metodologia ELISA.
Oliveira et al. (2009) avaliaram o perfil de citocinas no fluido crevicular de pacientes com
periodontite agressiva, após realização de TFD, e mostraram redução progressiva do TNF-alfa
após 30 dias; o RANKL mostrou ligeira elevação 1 dia após a terapia e poucas alterações nos
dias subsequentes. Nenhuma alteração no processo de cicatrização e ausência de
complicações, como abscessos ou infecções, foram relatados por estes autores.
2.2.2 FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR (VEGF)
O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um regulador positivo da
angiogênese. Ele foi identificado pela primeira vez por Ferrara e Henzel (1989) como um
fator de crescimento específico das células endoteliais, sendo produzido por outros diversos
tipos de células, incluindo fibroblastos, células de músculo liso, condrócitos hipertróficos e
osteoblastos (DAI & RABIE, 2007; YANG et al., 2012). A família VEGF é composta por
sete membros, nomeados de fator de crescimento placentário, VEGF-A,-B,-C,-D,-E e -F.
Estas glicoproteínas pertencem à uma superfamília que incluem os fatores de crescimento
derivados de plaquetas (PDGF) Esta família regula a angiogênese e linfangiogênese durante o
desenvolvimento e crescimento tumoral. Todos eles compartilham uma estrutura comum de
oito resíduos de cisteína espaçadas caracteristicamente em um domínio de homologia VEGF
A (YANG et al., 2012).
Estas glicoproteínas se ligam com diferentes especificidades aos seus receptores, em
um padrão que se sobrepõem, a três diferentes, mas estruturalmente relacionados, receptores
tirosina quinase (RKT): VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR) E VEGFR-3 (Flt-4). O VEGFR1 é fundamental para o desenvolvimento das células hematopoiéticas e se liga ao VEGF-A,
VEGF-B e PLGF. O VEGFR-2 é essencial para o desenvolvimento das células endoteliais
59
vasculares e se liga ao VEGF-A, VEGF-C e VEGF-D. O VEGFR-3 está relacionado com o
desenvolvimento do endotélio linfático e se liga ao VEGF-C e VEGF-D. O VEGF-A é a
forma mais abundante e é, portanto, utilizado em estudos de investigação dos efeitos
biológicos do VEGF.
O VEGF é comumente referido como VEGF-A. Ele está
principalmente relacionado à angiogênese, enquanto o VEGF-C e o VEGF-D estão mais
envolvidos na linfangiogênese (COSTA; SOARES;SCHMITT, 2004;YANG et al., 2012).
A angiogênese é um fenômeno modulado por diversas citocinas e fatores de
crescimento e o VEGF tem um papel muito importante, pois é um potente e seletivo fator
mitogênico para o endotélio. Embora desempenhe um papel fundamental na formação de
novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes, este fator também está envolvido no
crescimento de ossos longos e do côndilo mandibular (DAI & RABIE, 2007; YANG et al.,
2012). VEGF desempenha um papel atrativo para osteoblastos e células progenitoras
mesenquimais, além de contribuir para o processo de diferenciação destas células (YANG et
al., 2012). Assim, além de ser um fator de angiogênese, VEGF também influencia a biologia
óssea.
Estudos apontam que as vias que ativam o VEGF também estão envolvidas na indução
do RANKL, promovendo assim a osteoclastogênese (DAI & RABIE, 2007; HENRIKSEN et
al., 2003). O VEGF está envolvido na migração, diferenciação e atividade dos osteoclastos e
tem sido apontado como um fator importante para o recrutamento e sobrevivência de
osteoclastos maduros (ENGSIG et al., 2000; GUAN et al., 2009; NAKAGAWA et al., 2000).
Ademais, através de diversos mecanismos, como por exemplo, a ativação de proteases, o
VEGF contribui para a degradação da matriz extracelular (ENGSIG et al., 2000). Niida et al.
(1999) acreditam que o VEGF pode substituir o M-CSF no suporte da reabsorção óssea
osteoclástica. Min et al. (2003) demonstraram que o RANKL possui atividade angiogênica e
que o VEGF correlaciona-se positivamente com o RANK e aumenta a resposta angiogênica
das células endoteliais ao RANKL.
No desenvolvimento e na regeneração do osso, a angiogênese e a reabsorção óssea são
dois processos essenciais e que estão intimamente associados, o que sugere um mediador
comum para estes dois eventos biológicos. No processo de ossificação endocondral, o
aparecimento de osteoclastos próximos à cartilagem hipertrófica coincide com a invasão e
formação de novos vasos sanguíneos. O VEGF tem sido apontado como fator indutor da
migração, invasão e ativação dos osteoclastos. Estes papéis desempenhados pelo VEGF são
fundamentais no processo de reparo e remodelação óssea (GUAN et al., 2009; YANG et al.,
2012). VEGF favorece a neovascularização, que por sua vez aumenta o número de células
60
mesenquimais no tecido conjuntivo perivascular. VEGF também estimula a secreção de
fatores de crescimento e citocinas pelas células endoteliais, o que influencia a diferenciação
das células mesenquimais para a via osteogênica e à osteogênese (YANG et al., 2012) (Figura
8).
Figura 8 Efeitos do VEGF na angiogênese e osteogênese (adaptado de YANG et al., 2012).
Sabe-se que a TFD induz apoptose, reações inflamatórias, reações imunes específicas
e/ou não-específicas ao tumor e danos `a microvasculatura. Numerosos autores apontam uma
regulação ascendente do VEGF após a TFD. Sitink et al. (1998) relataram que o dano
induzido pela TFD na microvasculatura é facilmente observável histologicamente e está
associado com uma diminuição significativa do fluxo sanguíneo e grave hipóxia. Ferrario et
al. (2000) relataram que a redução da perfusão vascular, associada com a injúria mediada pela
TFD na microvasculatura, produziu hipóxia, o que, por sua vez, induziu a expressão do VEGF
através da ativação da fator indutor de hipóxia-1 (HIF-1). Segundo Yang. et al. (2012) e
Gomer et al., 2012) a tensão de oxigênio após a TFD pode induzir HIF-1. Nakagawa et al.
(2007) também acreditam que o estresse oxidativo ocasionado pela TFD pode levar a uma
resposta angiogênica via expressão de VEGF. Estes autores mostraram que a TFD induz a
expressão de VEGF em linhagem de células de carcinoma oral humano. Othani et al. (2008)
acreditam que o aumento da expressão de VEGF após TFD em experimento com cultura de
61
células está correlacionado com recorrência tumoral. Seus resultados imunoistoquímicos
demonstraram que o VEGF foi induzido nos tumores de pulmão após a TFD. Giannopoulou
et al. (2012) realizaram análise do perfil de citocinas em periodontite agressiva evidenciando
aumentos dos níveis do VEGF no fluido crevicular gengival e redução progressiva nos níveis
de IL-1, G-CSF e MG-CSF nos dias subsequentes à terapia.
A relação entre a TFD e a expressão de citocinas, tais como VEGF, é ainda
controversa. Em mucosa oral normal, Carlile et al. (2001) observaram imunomarcação para o
VEGF em todas as camadas do epitélio, preferencialmente nas camadas suprabasal.
Entretanto, Gandolfo et al. (2011) encontraram ausência de imunomarcação na maioria dos
casos avaliados.
62
PROPOSIÇÃO
63
3 PROPOSIÇÃO
O propósito deste estudo consistiu em analisar descritiva e comparativamente, por
meio de imunoistoquímica, a expressão de RANK, RANKL, OPG e VEGF em espécimes
gengivais clinicamente saudáveis que se submeteram ou não ao protocolo da terapia
fotodinâmica com nanoemulsão de cloro-alumínio ftalocianina com a finalidade de fornecer
subsídios para o uso futuro desta terapia. Ainda, pretende-se avaliar a tolerabilidade e a
segurança da aplicação do fármaco (cloro-alumínio ftalocianina) nos tecidos gengivais,
estabelecendo os principais efeitos colaterais.
64
MATERIAL E MÉTODOS
65
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Considerações éticas
A presente pesquisa foi registrada no Sistema Nacional de Informações Sobre Ética
em Pesquisa envolvendo Seres Humanos (SISNEP) e submetida à análise de seu conteúdo
pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(CEP/UFRN), de acordo com a Resolução 196/96 do CNS e a Resolução nº 251, de 07 de
agosto de 1997. Conforme parecer n 207/2012 e número de CAAE 0156.0.051.000-11, seu
protocolo foi aprovado (ANEXO A). Consentimento informado foi obtido de todos os
pacientes alocados para o presente estudo (APÊNDICE A).
4.2 Caracterização do estudo
O presente estudo caracterizou-se por ser um estudo clínico (Fase I) prospectivo não
randomizado do tipo split-mouth para avaliar a aplicação clínica do fármaco
fotossensibilizante cloro-alumínio ftalocianina e a imunoexpressão dos anticorpos antiRANK, -RANKL, -OPG, e -VEGF após a terapia fotodinâmica.
4.3 População
A população deste estudo foi constituída por pacientes que procuraram atendimento
nas Clínicas de Cirurgia da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande
no Norte no período de abril de 2012 a agosto de 2013, Natal-RN, Brasil.
66
4.4 Amostra
Foram incluídos na amostra: pacientes saudáveis com presença de pelo menos um par
de dentes contralaterais na mesma arcada superior ou inferior (17-27; 16-26; 15-25; 14-24;
37-47; 36-46; etc.) com indicação clínica de exodontia; homens e mulheres acima dos 18
anos; e pacientes do sexo feminino que não estavam grávidas e que executavam eficiente
controle de natalidade. Um total de 8 pacientes voluntários sistemicamente saudáveis
concordaram em participar do protocolo da pesquisa clínica e foram incluídos neste estudo.
4.4.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
A amostra consistiu de espécimes teciduais gengivais clinicamente saudáveis
(ausência de sangramento gengival à sondagem periodontal) dos pacientes participantes. Os
espécimes gengivais foram subdivididos em dois grupos conforme Quadro 1:
QUADRO 1 – Grupos de estudo. Natal/RN, 2014.
Espécimes teciduais gengivais no lado onde houve
GRUPO TESTE (n=8)
aplicação do fármaco fotossensibilizante e irradiação.
GRUPO CONTROLE (n=8)
Espécimes teciduais gengivais no lado contralateral onde
não foi realizada terapia.
67
4.5 Desenho experimental
4.6 Metodologia
4.6.1
FORMULAÇÃO
DA
NANOEMULSÃO
DE
CLORO-ALUMÍNIO
FTALOCIANINA
Amostras de ftalocianinas nanoparticuladas na concentração de 5μM, gentilmente
cedidas pelo Prof. Dr. Ricardo Bentes de Azevedo – UnB/Brasília, foram utilizadas no
experimento.
4.6.2 FONTE DE LASER
Laser Diodo (Bio Wave Dual LLLT Kondortech), comprimento de onda de 660nm,
acoplado a fibra ótica, com potência de 30mW.
68
4.6.3 EXPERIMENTOS IN VIVO
4.6.3.1 AVALIAÇÃO PRÉ-TRATAMENTO
Os dados clínicos foram coletados por meio de anamnese e entrevista do paciente feita
na primeira visita (APÊNDICE B). O exame físico consistiu de exame intra-oral completo e
exame clínico detalhado. A pesquisa de história clínica e médica pregressa consistiram em
informações sobre doenças pré-existentes; tratamento prévio; medicações em uso e solicitação
de exames laboratoriais complementares e exames radiográficos. Ademais, informações sobre
o estado imunológico, presença ou ausência de gravidez, status da menopausa, utilização de
métodos contraceptivos e/ou presença de doenças coronarianas, renais ou hepáticas.
Os seguintes exames laboratoriais foram requisitados: hemograma completo, glicemia
em jejum, perfil lipídico (colesterol total e frações; e triglicerídeos), hepatograma
(transaminase
glutâmico-oxalacética
(SGOT/AST);
transaminase
pirúvica
glutâmica
(SGTP/ALT); gamaglutamiltranspeptidase (GGT); fosfatase alcalina e níveis séricos de
bilirrubina total e frações) e análise da função renal (níveis de uréia e creatinina sérica).
4.6.3.2 APLICAÇÃO DA CLORO-ALUMÍNIO FTALOCIANINA E IRRADIAÇÃO
Sete dias antes do procedimento de exodontia, foi realizada a aplicação do fármaco na
região selecionada de forma aleatória.
Para o grupo teste, o tratamento consistiu na injeção em região de papila interdental
(região de gengiva marginal mesial ou distal – comprimento aproximado de uma face
dentária), sem anestesia local, de 40 µl (0.04ml) de nanoemulsão contendo cloro-alumínio
ftalocianina (com um tempo mínimo de injeção da droga de 5 min cm auxílio de seringa de
insulina de 1ml. Quinze minutos após a aplicação foram realizadas as irradiações com o laser
diodo (Bio Wave Dual LLLT Kondortech), 30mW de potência, área da ponteira de 0.03cm2,
tamanho do feixe no alvo 1.0 cm2, comprimento de onda de 660nm e densidade de energia de
7J/cm2, no modo contínuo (LONGO et al., 2009). A sessão foi realizada com aplicação do
laser diodo durante 236s (aproximadamente 4 minutos, para atingir a energia descrita acima),
69
com interrupções periódicas em três tempos (78s - 78s - 80s) (YU et al., 2009). O quadro 2
ilustra os parâmetros de irradiação utilizados no experimento. Para aplicar o laser, a sonda de
irradiação foi posicionada de forma perpendicular sobre o tecido a uma distância aproximada
de 0,5cm. Para o grupo controle não houve intervenção terapêutica.
QUADRO 2 – Parâmetros da irradiação utilizados no experimento. Natal/RN, 2014.
PARAMÊTROS
Potência (mW)
GRUPO TESTE
30mW
0.03W/cm2
660nm
7J/cm2
236s
50/60Hz
Densidade de potência (W/cm2)
Comprimento de onda (nm)
Densidade de energia (J/cm2)
Tempo de irradiação (s)
Frequência (Hz)
No intervalo de tempo entre a injeção do fotossensibilizante e a aplicação do laser
foram avaliadas as principais necessidades odontológicas dos pacientes com a realização de
procedimentos clínicos básicos (como instrução de higiene oral e profilaxia), desde que
indicados pelo cirurgião-dentista.
Antes dos procedimentos todos os pacientes foram orientados da possibilidade de
efeitos adversos na região que recebeu a TFD e, a cada retorno do paciente anotação a
respeito de efeitos como dor, edema, disfagia, eritema, reação alérgica ou outros sintomas não
esperados foram devidamente registrados.
4.6.3.3
ANÁLISE
DA
TOLERABILIDADE
E
SEGURANÇA
DA
APLICAÇÃO DO FÁRMACO
Durante a aplicação e irradiação foi avaliada a presença de dor e edema na mucosa. A
avaliação da dor foi realizada por meio de uma escala de dor de 4 pontos (0 = ausência, 1 =
leve, 2 = moderada e 3 = severa) e para o edema, avaliação clínica (descrita pelo investigador
como presença ou ausência). Efeitos adversos, incluindo prurido, ardor, eritema, púrpura,
70
bolhas e/ou crostas foram registrados em escalas de avaliação (0-3, como descrito acima) nas
consultas seguintes à aplicação (7, 14 e 30 dias) (ALEXIADES-ARMENAKAS &
GERONEMUS, 2003) (APÊNDICE C).
4.6.3.4 EXODONTIAS PÓS TFD
Uma semana após os procedimentos de aplicação da TFD, foram realizadas as
exodontias, levando em consideração todos os procedimentos de biossegurança necessários, e
coleta dos espécimes gengivais cm dimensão aproximada de 3cm com uso de lâmina de
bisturi esterilizada nº 15. Os espécimes gengivais obtidos foram imersos imediatamente em
frascos separados contendo formol a 10% e enviados para análise morfológica.
4.6.3.5 PROSERVAÇÃO DOS PACIENTES PÓS TFD
A proservação consistiu em intervalos fixos (7, 14 e 30 dias) de consultas de retorno,
onde foram avaliados: os efeitos adversos, o relato de intercorrências, complicações e
presença de dor no período pós-TFD; a eficácia do protocolo medicamentoso para fins de
analgesia; além de relatos do paciente frente à terapêutica empregada.
Em todas as consultas de retorno dos pacientes as informações foram anotadas em
prontuário odontológico. Os retornos foram conduzidos pelo investigador do estudo (autor) ou
membros da equipe de trabalho.
4.7 Estudo morfológico
Os espécimes gengivais obtidos (grupo teste; grupo controle) foram encaminhados ao
Serviço de Anatomia Patológica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte para
processamento histológico e confecção dos blocos em parafina.
71
4.7.1 COLORAÇÃO PELO MÉTODO HEMATOXILINA-EOSINA
Os blocos de parafina das amostras cirúrgicas obtidas foram submetidos a cortes
histológicos de 5μm de espessura montados em lâminas histológicas e corados pela técnica
da hematoxilina-eosina (H.E), sendo avaliados em microscopia de luz quanto as
características morfológicas. A técnica de coloração pela H.E que foi utilizada seguiu o
seguinte protocolo:
1) Xilol I (15 minutos)
2) Xilol II (15 minutos)
3) Álcool etílico absoluto I (3 minutos)
4) Álcool etílico absoluto II (3 minutos)
5) Álcool etílico absoluto III (3 minutos)
6) Água corrente (3 minutos)
7) Hematoxilina de Harris (2 a 5 minutos)
8) Água corrente (3 minutos)
9) Eosina de Lison (1 a 2 minutos)
10) Álcool etílico absoluto I (2 minutos)
11) Álcool etílico absoluto II (2 minutos)
12) Álcool etílico absoluto III (2 minutos)
13) Xilol I (3 minutos)
14) Xilol II (3 minutos)
15) Xilol III (3 minutos)
16) Montagem das lâminas em Permount® (Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ, USA)
4.7.2 ANÁLISE MORFOLÓGICA
Para a análise do infiltrado inflamatório as secções foram examinadas em microscópio
de luz OLYMPUS® (Tóquio, Japão) cm delineamento ceg. Em um aumento de ×100, cada
espécime foi graduado em: Grau 1 (leve), células inflamatórias dispersas em região
subepitelial, atingindo o campo superior do campo, próximo ao epitélio; Grau 2 (moderado),
72
células inflamatórias presentes até 2/3 na lâmina própria; e Grau 3 (intenso), as células
inflamatórias compreendem mais de 2/3 da profundidade do espécime. A gradação de cada
amostra foi baseada na condição inflamatória a partir da margem da junção epitélio-tecido
conjuntivo e procedendo gradualmente mais profundamente na lâmina própria (adaptação de
Tsai et al., 2004). No tecido conjuntivo foram avaliados, ainda, a integridade tecidual,
ausência ou presença de necrose tecidual e oclusão vascular.
4.8 Estudo imunoistoquímico
Para o estudo imunoistoquímico, os espécimes emblocados em parafina foram
submetidos a cortes de 3μm de espessura e montados em lâminas de vidro previamente
preparadas com adesivo à base de organosilano (3-aminopropyltriethoxi-silano, Sigma
Chemical Co, St Louis, MO, USA). O material foi submetido ao método da imunoperoxidase
pela técnica da estreptoavidina-biotina (LSAB- Labeled Streptavidin Biotin), utilizando
anticorpos policlonais anti-RANK, anti-RANKL, anti-OPG e anti-VEGF (QUADRO 3).
Como controle positivo para os anticorpos –RANK, RANKL, -OPG foram utilizados cortes
histológicos de lesões centrais de células gigantes e para o –VEGF foi utilizado cortes de rim
humano normal. Para o controle negativo foi feita a omissão do anticorpo primário com a
substituição deste por albumina de soro bovino a 1% em solução tampão.
QUADRO 3 – Especificidade, recuperação antigênica, diluição, tempo de incubação e
fabricante dos anticorpos utilizados. Natal/RN, 2014. † Santa Cruz Biotechnology®
Especificidade
Clone
Recuperação antigênica
Diluição Tempo de incubação
Anti-RANKL
N-19†
Citrato pH6.0 Pascal
1/100
60’
Anti-RANK
C-20†
Citrato pH6.0 Pascal
1/100
60’
Anti-OPG
Citrato pH6.0 Pascal
1/100
60’
N-20†
Anti-VEGF
C-1† Tripsina 0,1% pH 7.9, 37°C, 60 min 1/600
Overnight (18h)
4.8.1 COLORAÇÃO PELO MÉTODO IMUNOISTOQUÍMICO
A técnica que foi utilizada seguiu o seguinte protocolo:
73
1) Desparafinização: 2 banhos em xilol, ambos por 10 minutos à temperatura ambiente (TA);
2) Reidratação em cadeia descendente de etanóis:
- álcool etílico absoluto I (5 minutos) TA;
- álcool etílico absoluto II (5 minutos) TA;
- álcool etílico absoluto III (5 minutos) TA;
- álcool etílico absoluto IV (5 minutos) TA;
- álcool etílico 95°GL (5 minutos) TA;
- álcool etílico 80°GL (5 minutos) TA;
3) Remoção de pigmentos formólicos com hidróxido de amônia a 10% em etanol 95° por 10
minutos, à temperatura ambiente;
4) Lavagem em água corrente por 10 minutos;
5) Duas passagens em água destilada por 5 minutos cada;
6) Recuperação dos sítios antigênicos (QUADRO 3);
7) Lavagem em água corrente por 10 minutos e 2 passagens em água destilada por 5 minutos
cada;
8) Duas incubações dos cortes, pelo período de 10 minutos cada, em solução de peróxido de
hidrogênio 10 volumes, em uma proporção de 1/1 para bloqueio da peroxidase endógena
tecidual;
9) Lavagem em água corrente por 10 minutos e 2 passagens em água destilada por 5 minutos
cada;
10) Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl (tris-hidroximetilaminometano, Sigma Chemical, St Louis, MO, USA) pH 7,4 por 5 minutos cada;
11) Incubação dos cortes com os anticorpos primários (QUADRO 3) diluídos em solução
diluente Dako (Antibody diluent with background reducing components; Dako, A/S,
Glostrup, Dinamarca);
12) Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 por 5 minutos cada;
13) Incubação com o anticorpo secundário biotinilado (Biotinylated link universal, Dako
North America, Carpinteria, CA, USA + System-HRP) durante 30 minutos - TA;
14) Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 por 5 minutos cada;
15) Incubação com o complexo estreptoavidina-biotina HRP (DAKO, A/S, Glostrup,
Dinamarca) durante 30 minutos, à temperatura ambiente;
16) Imersão em TRIS-HCl pH 7,4, duas trocas de 5 minutos cada;
74
17) Aplicação do agente cromógeno diaminobenzidina 25 a 30 mg (3,3-diaminobenzidina,
Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA), diluída em 100 ml TRIS-HCl pH 7,4, acrescida de
1,2 ml de peróxido de hidrogênio 10 volumes durante 3 minutos na câmara escura;
18) Lavagem em água corrente por 10 minutos;
19) Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);
20) Contracoloração com hematoxilina de Mayer por 10 minutos à temperatura ambiente;
21) Lavagem em água corrente – 10 minutos;
22) Duas passagens em água destilada por 5 minutos cada;
23) Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:
- álcool etílico 80°GL (2 minutos) TA;
- álcool etílico 95°GL (2 minutos) TA;
- álcool etílico absoluto I (5 minutos) TA;
- álcool etílico absoluto II (5 minutos) TA;
- álcool etílico absoluto III (5 minutos) TA;
24) Diafanização em dois banhos de xilol: xilol 1 (2 minutos) e xilol 2 (2 minutos);
25) Montagem da lamínula em resina Permount ® (Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ, USA).
4.8.2 ANÁLISE DAS CÉLULAS IMUNOMARCADAS
Para análise imunoistoquímica dos antígenos em todos os espécimes incluídos na
amostra, o parâmetro consistiu na positividade da marcação, sendo consideradas positivas as
células que exibiram coloração acastanhada ou amarelada no núcleo ou no citoplasma. Após
tratamento imunoistoquímico, as células imunorreativas foram cegamente analisadas por dois
observadores calibrados em dias diferentes. Destaca-se que a análise imunoistoquímica foi
realizada sem que os examinadores tivessem conhecimento do grupo de estudo.
A análise dos imunomarcadores RANK, RANKL e OPG foi realizada de acordo com
o método proposto por Chuang e colaboradores (2009), com algumas modificações. Neste
método, os escores percentuais de imunomarcação positiva (P) foram classificados como: 0
(<1%); 1 (1-24%); 2 (25-49%); 3 (50-74%); e 4 (75-100%), enquanto os escores de
intensidade de coloração (I) foram classificados como 0, sem coloração; 1, cor amarelo-claro
(coloração fraca); 2, cor marrom (coloração moderada); e 3, cor marrom escuro (coloração
forte). Os escores totais (S) foram designados como P × I para cada seção. A modificação
75
proposta foi realizada após a tomada dos escores totais. Para cada caso, foi realizada uma
estratificação dos escores totais utilizando os seguintes parâmetros: 0 (ausência), 1 e 2 (fraca);
3, 4 e 6 (moderada); e 8, 9 e 12 (forte). O quadro 4 ilustra a metodologia da análise
imunoistoquímica realizada no experimento para os marcadores RANK, RANKL e OPG.
QUADRO 4 – Metodologia proposta no experimento para os imunomarcadores RANK,
RANKL e OPG. Legendas: P (escores percentuais), I (intensidade de coloração), S (escores
totais= P × I). Natal/RN, 2014.
P
I
S = P×I
PARÂMETRO
0 (<1%)
0, sem coloração
0
0 (0= Ausência)
1 (1-24%) 1, cor amarelo-claro (coloração fraca)
1
1 e 2 (1=Fraca)
2 (25-49%) 2, cor marrom (coloração forte moderado)
2
3 (50-74%) 3, cor marrom escuro (coloração forte)
3
3, 4 e 6 (2=Moderada)
4 (75-100%
4
6
8
8, 9 e 12 (3=Forte)
9
12
A análise da imunomarcação para o VEGF foi realizada de acordo com (i) a presença
de marcação e (ii) a intensidade da marcação (1 = fraca, 2 = moderada, 3 = forte), como
realizado pelo Moriyama e colaboradores (1997). A intensidade da marcação de VEGF foi
avaliada de acordo com a coloração de diaminobenzidina (DAB) sob microscopia de luz.
Quando a intensidade de coloração observada foi idêntica a das células endoteliais ao
espécime foi atribuído grau 2. Para a marcação mais fraca ou mais forte do que à das células
endoteliais na amostra foi atribuída uma pontuação de 1 ou 3, respectivamente. Slides sem
imunomarcação foram marcados com 0 (ausência de imunomarcação).
Deste modo, obtivemos um parâmetro final de avaliação para todos imunomarcadores
utilizados no experimento (RANK, RANKL, OPG e VEGF) com o seguinte escore final:
(0) Ausência de imunomarcação;
(1) Fraca;
(2) Moderada;
(3) Forte.
As lâminas imunomarcadas foram escaneadas utilizando-se o equipamento
Pannoramic MIDI 3DHISTECH (3DHISTECH Ltd, Hungria). Posteriormente, foram
76
analisadas, quantificadas e fotografadas com o software de microscopia virtual Pannoramic
Viewer, versão 1.15.2 (© Copyright 2013 3DHISTECH Ltd, Hungria).
4.9 Elenco de variáveis
QUADRO 5 - Elenco de variáveis dependentes e independentes analisadas no estudo.
Natal/RN, 2014.
VARIÁVEL
Imunodetecção
proteínas
DESCRIÇÃO
das
CLASSIFICACÃO
Expressão imunoistoquímica
0- AUSÊNCIA, 1 - FRACA, 2 das proteínas RANK,
Variável dependente
MODERADA, 3 - FORTE
RANKL, OPG E VEGF
Grau do infiltrado
inflamatório
Grau da inflamação
Variável dependente
Avaliação clínica dos
Efeitos da aplicação efeitos: edema, dor, prurido,
Variável dependente
clínica do fármaco
ardor, eritema, púrpura,
bolhas e/ou crostas
Terapia Fotodinâmica
CATEGORIAS/ ESCALA DE
MEDIDAS
Aplicação da terapia
Variável independente
fotodinâmica com AlClFc
1 - FRACO, 2 - MODERADO, 3 INTENSO
0 - AUSÊNCIA, 1- LEVE, 2 MODERADA, 3 - SEVERA
1 - GRUPO TESTE, 2- GRUPO
CONTROLE
4.10 Processamento e análise dos dados
Os resultados obtidos foram digitados em planilhas eletrônicas Excel (Microsoft
Office 2007 for Windows), transferidos para o programa SPSS (Statistical for Social Science
version 17.0 for Windows- SPSS Inc. Chicago, Illinois, 2007) e submetidos à estatística
descritiva e inferencial.
77
Em virtude da ausência de distribuição normal, para análise da associação dos
escores de imunomarcação do RANK, RANKL, OPG e VEGF e o grau de inflamação entre
os grupos da pesquisa foi realizado o teste de Mann-Whitney. Para análise da correlação entre
os escores de imunomarcação e o grau de inflamação nos grupos foi realizado o teste de
correlação de Spermann.
Para todos os testes estatísticos utilizados foi estabelecido o nível de significância
de 5% (p ≤ 0,05).
78
RESULTADOS
79
5 RESULTADOS
5.1 Análise descritiva dos participantes do estudo
Um total de 18 voluntários aceitou, inicialmente, participar da pesquisa. Entretanto,
houve perda de 10 participantes durante o estudo clínico, pelos seguintes motivos: desistência
da participação (n=3), exames complementares fora do padrão de normalidade (n=3), perda
do acompanhamento (n=2), e presença de doenças crônicas descobertas nos exames préoperatórios (n=2). Deste modo, um total de 8 pacientes (n=8) satisfizeram os critérios
estabelecidos e completaram o protocolo da pesquisa clínica. As características dos pacientes
da amostra incluída no estudo e o ponto de aplicação do fármaco para cada caso encontram-se
dispostos no Quadro 5.
QUADRO 6- Frequências referentes ao gênero, cor de pele, idade e local de aplicação.
Natal/RN, 2014.
Amostra (n=8)
Gênero
Cor de pele
Idade
Local de aplicação
1
F
Leucoderma
23
GENGIVA MARGINAL MESIAL (25)
2
F
Feoderma
40
GENGIVA MARGINAL MESIAL (36)
3
M
Leucoderma
22
GENGIVA MARGINAL DISTAL (46)
4
M
Feoderma
43
GENGIVA MARGINAL MESIAL (13)
5
M
Leucoderma
48
GENGIVA MARGINAL MESIAL (34)
6
F
Feoderma
31
GENGIVA MARGINAL DISTAL (48)
7
F
Melanoderma
63
GENGIVA MARGINAL DISTAL (46)
8
F
Leucoderma
61
GENGIVA MARGINAL MESIAL (21)
5.2 Aplicação clínica da terapia fotodinâmica
Durante a aplicação da AlClFc foi observado que o sensibilizante é de fácil aplicação
e manuseio. O fármaco foi aplicado sem haver intercorrências, com ausência de sinais clínicos
de deterioração da mucosa; sendo que dois dos oito participantes (n=2; 25%) queixaram-se de
presença de dor no momento da administração do fármaco ambas categorizadas como 1, leve.
80
Em apenas 1 caso foi observado edema no momento da aplicação do fármaco (n=1; 12,5%).
Durante a exposição à fonte de luz dois pacientes queixaram-se de uma leve sensação de
queimação (ardor).
5.3 Efeitos adversos da terapia fotodinâmica
A terapia foi bem tolerada pela maioria dos pacientes. A avaliação descritiva dos
efeitos adversos, incluindo prurido (A), ardor (B), eritema (C), púrpura (D), bolhas (E) e/ou
crostas (F) foram registrados em escalas de avaliação (0-3, 0 = ausência, 1 = leve, 2 =
moderada e 3 = severa) nas consultas seguintes à aplicação (7, 14 e 30 dias). Os resultados
encontram-se dispostos no Quadro 6.
Os principais efeitos adversos pós-terapia foram
presença de ardor e eritema localizado. Em todos os participantes, quatorze dias após a
aplicação da terapia, ainda foi evidenciada a presença de edema e eritema (C). Observou-se
que todos esses eventos foram de curta duração e totalmente reversíveis. Não foi observada a
presença de bolhas, crostas e púrpura nos espécimes analisados. Não foi observado a presença
de disfagia e reações alérgicas
QUADRO 7– Avaliação dos efeitos adversos no grupo teste nos dias seguintes à aplicação da
terapia fotodinâmica. Legendas: Escala de avaliação: (A) Prurido (B) Ardor (C) Eritema (D)
Bolhas (E) Crostas (F) Púrpura; 0 = ausência, 1 = leve, 2 = moderada e 3 = severa.
Escala de avaliação
GRUPO TESTE
7 dias
14 dias
30 dias
(n=8)
A B C D E F A B C D E F A B C D E F
1
0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2
0 0 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3
1 1 0 0 0 0 2 2 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0
4
0 1 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 1 0 0 0
5
0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
6
1 1 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 1 0 0 0
7
0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
8
81
A figura 9, a seguir, ilustra os locais de aplicação da TFD em dois dos participantes da
pesquisa no dia da aplicação da terapia (A) e 14 dias após a aplicação da terapia (B).
Figura 9 Aspecto clínico das regiões submetidas à terapia fotodinâmica. (A) No dia da
aplicação do fármaco e irradiação; (B) 7 dias após aplicação; (C) No dia da aplicação do
fármaco e irradiação; (D) 7 dias após aplicação, observe eritema. Natal/RN, 2014.
82
5.4 Achados histológicos
A análise histológica de todos os espécimes incluídos no estudo mostrou a presença de
tecido epitelial de revestimento do tipo pavimentoso estratificado com graus variados de
ceratinização, acantose, hiperplasia, além de alterações degenerativas como exocitose,
espongiose e degeneração hidrópica. O tecido conjuntivo vascularizado apresentou-se de
densidade variada e contendo infiltrado de células inflamatórias, predominantemente do tipo
mononuclear (Figura 10A). Em algumas das amostras foi possível observar a presença de
tecido muscular e tecido nervoso. Os espécimes exibiram uma boa integridade tecidual. Não
se observou a presença de necrose tecidual nos espécimes analisados.
Na análise histológica do grupo teste, observou-se a presença de espécimes contendo
coleções de células inflamatórias, com predomínio de mononucleares, além de áreas de edema
e congestão vascular (Figura 10B, 10C, 10D), caracterizando uma reação exsudativa.
Alterações vasculares foram observadas nas amostras gengivais que receberam a TFD. Em
dois casos pode-se observar histologicamente a presença de numerosos e diminutos vasos
sanguíneos em região subepitelial (Figura 10C), além de aparência histológica de numerosos
brotamentos vasculares (Figura 10D) característicos do processo de neoangiogênese.
Visualizou-se ainda a presença de intenso extravasamento de líquido intersticial e de
precipitado plasmático no interior dos vasos sanguíneos.
Em três casos, foi visualizada a presença de um material amorfo, acelular, bem
delimitado, basofílico (Figura 10E, 10F) e em proximidade com os vasos sanguíneos
compatível com o processo de calcificação distrófica. Estes achados estavam nas adjacências
de regiões com intenso extravasamento hemorrágico e congestão vascular e localização
subepitelial. Nos espécimes do grupo controle foi detectado tecido epitelial e conjuntivo
dentro dos padrões de normalidade.
83
Figura 10 Fotomicrografias de gengiva clinicamente saudável do grupo teste. A- O
destaque mostra coleções de células inflamatórias em tecido conjuntivo fibrovascular
(Pannoramic Viewer, H.E., 200µm). ,B- Detalhe de numerosos vasos sanguíneos congestos
em região subepitelial (Pannoramic Viewer, H.E., 100µm). C- Grande quantidade de vasos
sanguíneos presentes em região subepitelial, proliferação que contribui para a inflamação
crônica. (Pannoramic Viewer, H.E., 200µm). D- Tecido conjuntivo mixomatoso exibindo
edema, infiltrado inflamatório mononuclear, e numerosos vasos sanguíneos com alguns
brotamentos vasculares (Pannoramic Viewer, H.E., 100µm). E-F- Manchas basofílicas em
região subepitelial, compatíveis com o processo de calcificação distrófica. E – Detalhe da
calcificação (Pannoramic Viewer, H.E., 500µm). F-Asteriscos destacam as calcificações
vasculares (Pannoramic Viewer, H.E., 200µm).
84
5.4.3ANÁLISE DO INFILTRADO INFLAMATÓRIO
A análise descritiva do infiltrado inflamatório das amostras de tecido gengival no que
diz respeito à distribuição do infiltrado por terços, classificando a intensidade do infiltrado
inflamatório em leve, moderado e intenso, bem como a associação com o grupo de estudo,
podem ser observadas na Figura 11.
Figura 11 Escores do infiltrado inflamatório para os grupos da pesquisa. Natal, RN. 2014.
Legendas: Eixo X – Grupos da pesquisa; Eixo Y - Grau de inflamação (1) leve, (2) moderado,
(3) intenso.
A análise de frequências demonstrou no grupo teste o grau de inflamação leve (n=3;
37,5%), intenso (n=3; 37,5%) e moderado (n=2; 25%). Para o grupo controle metade das
amostras analisadas exibiu grau leve (n=4; 50%), seguida de 3/8 (37,5%) com grau moderado
e 1/8 (12,5%) com grau intenso. A figura 16, a seguir, ilustram os graus de inflamação dos
espécimes avaliados.
85
Figura 12 Fotomicrografia de gengiva clinicamente saudável evidenciando a intensidade do
infiltrado inflamatório. (A) Fraca; grupo teste (B) Moderado; grupo controle (C) Intenso;
grupo teste (Pannoramic Viewer, H.E., 500µm).
5.5 Resultados imunoistoquímicos
5.5.1 RANK, RANKL e OPG.
5.5.1.1 IMUNOLOCALIZAÇÃO
A análise da expressão de RANK e RANKL demonstrou um padrão de
imunorreatividade citoplasmática. A OPG não foi imunomarcada nas células dos espécimes
avaliados.
86
No tecido epitelial, o RANK exibiu marcação distribuída em camada basal e
suprabasal, com predomínio da imunorreatividade no estrato basal (Figura 13). No tecido
conjuntivo a imunomarcação foi focal e distribuída em células inflamatórias do tipo
mononuclear.
O RANKL exibiu predominantemente imunorreatividade na camada suprabasal do
epitélio (Figura 14). No tecido conjuntivo, similar à marcação para RANK, exibiu
imunorreatividade em células inflamatórias do tipo mononuclear como linfócitos, plasmócitos
e macrófagos (Figura 15).
As figuras 13 a 15, a seguir, ilustram a imunorreatividade dos marcadores.
Figura 13 Fotomicrografia demonstrando marcação fraca para RANK em epitélio e tecido
conjuntivo de gengiva clinicamente saudável. Observar imunorreatividade em camada basal
no grupo controle (Pannoramic Viewer, LSAB, 200µm).
87
Figura 14 Fotomicrografia demonstrando marcação moderada para RANKL em epitélio e
tecido conjuntivo do grupo teste. Observar imunorreatividade em camada suprabasal
(Pannoramic Viewer, LSAB, 500µm).
Figura 15 Fotomicrografia demonstrando marcação moderada para RANKL em tecido
conjuntivo do grupo teste. Observar imunorreatividade em mononucleares. (Pannoramic
Viewer, LSAB, 100µm).
88
5.5.1.2 ANÁLISE DOS ESCORES DE IMUNOEXPRESSÃO PARA OS ANTICORPOS ANTIRANK, ANTI-RANKL E ANTI-OPG ENTRE OS GRUPOS DE ESTUDO.
Na tabela 1 observam-se os dados referentes à análise descritiva das variáveis
quantitativas RANK, RANKL e OPG, com base nos parâmetros de análise imunoistoquímica
para tais anticorpos.
Tabela 1 Distribuição dos escores da marcação imunoistoquímica para os anticorpos antiRANK, -RANKL e -OPG nos grupos da pesquisa. Natal/RN, 2014.
RANK
RANKL
OPG
Amostra GRUPOS P I S =P× I
PF P I S =P× I PF P I S =P× I
PF
1
0 0
0
0
0
0 0 1
0 0 0
0
1
2
1 2
2
1
0
1 1 1
1 0 0
0
1
2 1
2
0
0
1 0 0
0 0 0
0
2
2
2 1
2
1
0
1 1 1
1 0 0
0
1
0 0
0
0
0
0 0 0
0 0 0
0
3
2
0 0
0
0
0
0 0 1
0 0 0
0
1
0 0
0
1
0
0 1 1
1 0 0
0
4
2
0 0
0
4
0
0 2 2
2 0 0
0
1
0 0
0
1
0
0 1 1
1 0 1
0
5
2
1 2
2
0
0
1 0 0
0 0 0
0
1
1 1
1
2
0
1 1 1
1 0 0
0
6
2
0 0
0
4
0
0 2 2
2 0 0
0
1
0 0
0
2
0
0 2 1
1 0 0
0
7
2
1 1
1
1
0
1 1 1
1 0 1
0
1
0 0
0
4
0
0 2 2
2 0 0
0
8
2
0 1
0
0
0
0 0 1
0 0 0
0
Legendas: Grupos (1 – teste; 2 controle), P (escores percentuais), I (intensidade de coloração),
S (escores totais= P × I) e PF (Parâmetro Final: (0)Ausência; (1)Fraca; (2)Moderada;
(3)Forte). Natal/RN, 2014.
Analisando a tabela 1 pode-se observar que:
89
O RANK e o RANKL exibiram imunomarcação fraca ou ausente na maioria dos
espécimes analisados (Figura 16 e 17). Não houve imunomarcação para a OPG nos
espécimes.
Em relação à imunoexpressão de RANK, o grupo teste mostrou ausência de marcação
(n=6; 75%) e escore 1 (n=2; 25%). No grupo controle, metade dos casos (n=4; 50%) exibiram
ausência de imunomarcação (n=4; 50%) e a outra metade escore 1 (n=4; 50%).
Figura 16 Escores do RANK nos grupos da pesquisa. Natal, RN. 2014. Legendas: (0)
ausência de imunomarcação; (1) fraca; (2) moderada; (3) forte).
Para RANKL, ausência de imunomarcação (n=3; 37,5%), escore 1 (n=4; 50%) e
escore 2 (n=1; 12,5%) no grupo teste. No grupo controle, ausência (n=3; 37,5%), escore 1
(n=3; 37,5%) e escore 2 (n=2; 25%).
90
Figura 17 Escores do RANKL nos grupos da pesquisa. Natal, RN. 2014. Legendas: (0)
ausência de imunomarcação; (1) fraca; (2) moderada; (3) forte).
As figuras de 18 a 20, a seguir, ilustram a imunomarcação fraca do RANK e do
RANKL, e ausência para OPG nos espécimes avaliados.
Figura 18 Fotomicrografia demonstrando marcação fraca para RANK em epitélio e tecido
conjuntivo de gengiva clinicamente saudável (Pannoramic Viewer, LSAB, 200µm).
91
Figura 19 Fotomicrografia demonstrando marcação fraca para RANKL em epitélio e tecido
conjuntivo de gengiva clinicamente saudável (Pannoramic Viewer, LSAB, 200µm).
Figura 20 Fotomicrografia demonstrando ausência de marcação para OPG no grupo teste
(Pannoramic Viewer, LSAB, 200µm).
92
5.5.2 VEGF
5.5.2.1 IMUNOLOCALIZAÇÃO
O biomarcador VEGF exibiu um padrão de imunorreatividade nuclear e
citoplasmática. A imunoexpressão foi visualizada em células endoteliais, células epiteliais,
fibroblastos e células inflamatórias. No epitélio houve predomínio de marcação nuclear em
camada basal e suprabasal, enquanto que no tecido conjuntivo a marcação foi citoplasmática
em células, como: fibroblastos, mononucleares e endoteliais. Quando presentes, músculos e
vasos sanguíneos ocasionalmente associados, também mostraram coloração positiva.
5.5.2.2 ANÁLISE
DOS ESCORES DE IMUNOEXPRESSÃO PARA O ANTICORPO ANTI-
VEGF ENTRE OS GRUPOS DO ESTUDO.
A análise descritiva das amostras de tecido gengival no que diz respeito aos escores de
imunomarcação para o VEGF, classificando-a pela imunopositividade e intensidade da
coloração em fraca, moderada e forte, bem como a associação com o grupo de estudo, podem
ser observadas na Figura 21.
No grupo teste, a análise de frequências mostrou escore 1 (n=1; 12,5%), escore 2 (n=3;
37,5%) e escore 3 (n=4; 50%). No grupo controle, observou-se predomínio de escore 2 (n=5;
62,5%) seguido de escore 3 (n=3; 37,5%).
93
Figura 21 Escores do VEGF nos grupos da pesquisa. Natal, RN. 2014. Legendas: (0)
ausência de imunomarcação; (1) fraca; (2) moderada; (3) forte.
As figuras de 22 e 24, a seguir, ilustram a imunomarcação forte e moderada do VEGF
nos espécimes avaliados.
Figura 22 Fotomicrografia demonstrando marcação moderada para VEGF em camada basal e
suprabasal do epitélio e tecido conjuntivo de gengiva clinicamente saudável (grupo teste).
(Pannoramic Viewer, LSAB, 200µm).
94
Figura 23 Fotomicrografia demonstrando marcação moderada do VEGF em células
endoteliais e inflamatórias do tipo mononuclear em tecido conjuntivo de gengiva clinicamente
saudável (grupo teste). (Pannoramic Viewer, LSAB, 200µm).
Figura 24 Fotomicrografia demonstrando marcação forte para VEGF em camada basal e
suprabasal do epitélio e tecido conjuntivo de gengiva clinicamente saudável (grupo teste).
(Pannoramic Viewer, LSAB, 200µm).
95
5.6 Resultados estatísticos
5.6.1 ASSOCIAÇÃO DOS ESCORES DE IMUNOMARCAÇÃO DO RANK,
RANKL, OPG, VEGF E O GRAU DE INFLAMAÇÃO ENTRE OS GRUPOS DA
PESQUISA
A análise dos escores entre os grupos da pesquisa foi realizada de acordo com o teste
não paramétrico de Mann- Whitney. Ao comparar as médias dos escores do grupo teste e
grupo controle para RANK, RANKL, VEGF e o grau de inflamação não se observaram
diferenças significativas (p=0,317; p=0,777, p=0,814 e p = 0,399, respectivamente) (Tabela 2)
entre a expressão destes marcadores e os grupos de estudo.
Tabela 2 Parâmetros utilizados no cálculo do teste de Mann-Whitney para a avaliação do dos
escores de células imunorreativas para o RANK, RANKL, OPG e VEGF e o grau da
inflamação entre os grupos da pesquisa. Natal/RN, 2014.
Marcador
Grupo
n
Média
Média
dos
postos
GT
GC
8
8
0
,5
GT
GC
8
8
GT
GC
8
8
U
P value
7,50
9,50
24
0,317
1,0
1,0
8,19
8,81
29,5
0,777
2,5
2,5
8,25
8,75
30
0,814
24,5
0,399
RANK
RANKL
VEGF
Grau da
inflamação
GT
8
2
9,44
GC
8
1,5
7,56
Legenda: GT – grupo teste; GC – grupo controle,
96
5,6,2 CORRELAÇÃO DOS ESCORES DE IMUNOMARCAÇÃO DE RANK,
RANKL, OPG E VEGF DE ACORDO COM O GRAU DE INFLAMAÇÃO NOS GRUPOS
DA PESQUISA,
A correlação dos escores de imunomarcação de RANK, RANKL, OPG e VEGF e o
grau de inflamação nos grupos da pesquisa foi realizada de acordo com o teste de Correlação
de Spearman, Ao correlacionar os escores nos grupo teste e no grupo controle, não foram
observadas diferenças estatísticas significantes (Tabela 3),
Tabela 3 Correlação dos escores de células imunorreativas para o RANK, RANKL e VEGF
e o grau da inflamação nos grupos da pesquisa, Natal/RN, 2014,
Marcador
RANK × Inflamação
Grupo
Coeficiente de
correlação
P value
GT
GC
,667
,299
0,071
GT
GC
,173
,600
0,683
RANKL× Inflamação
VEGF × Inflamação
GT
,380
GC
,538
Legenda: GT – grupo teste; GC – grupo controle,
0,354
97
DISCUSSÃO
98
6 DISCUSSÃO
A TFD emerge como uma terapia promissora tendo em vista suas propriedades não
supressoras, reduzida toxicidade e sua fácil aplicação. Seu uso clínico em Odontologia tem
sido pouco avaliado e a maioria dos estudos encontra-se restrita à terapia fotodinâmica
antimicrobiana. A cloro-alumínio ftalocianina nanoparticulada foi recentemente descrita
(MUEHLMANN et al., 2014) e estudos tem demonstrado eficientes propriedades
antitumorais para este sensibilizante (BICALHO et al., 2013; LONGO et al., 2009;
TAPAJOS et al., 2008; PORTILHO et al., 2013). Neste contexto, este estudo realizou a
terapia fotodinâmica em tecido gengival de um limitado número de pacientes saudáveis
utilizando a nanoemulsão de AlClFc e mostrou a imunodetecção dos marcadores RANK,
RANKL, OPG e VEGF nas regiões submetidas ou não à terapia. A fase clínica de um estudo
clínico é subdividida em quatro subfases. Nos estudos clínicos de fase I testa-se o
medicamento pela primeira vez. O objetivo principal é avaliar a segurança do produto
investigado. Nesta fase a medicação é testada em pequenos grupos (10–30 pessoas),
geralmente, de voluntários sadios. Neste sentido justifica-se a reduzida amostra do estudo.
Os únicos estudos (SEGUIER et al. 2010; LONGO et al. 2012) que aplicaram o
fármaco utilizado no presente estudo avaliaram os efeitos em tecidos doentes, como a gengiva
na periodontite crônica e as cavidades cariadas na cárie humana. Ambos os estudos não
descreveram efeitos adversos durantes os procedimentos clínicos da terapia. A ausência de
efeitos secundários nos oito voluntários participantes desta pesquisa em comparação com
outros protocolos de TFD, especialmente com a utilização do ácido aminolevulínico (ALA)
que é doloroso e requer uso de anestésicos locais (CHEN et al., 2005; CHEN et al., 2005b;
SIERON et al., 2003), pode ser benéfica. Entretanto, o uso da nanoemulsão de AlClFc em
doses repetidas ainda necessita ser melhor avaliado, já que com dose única os efeitos adversos
(eritema e edema) foram de curta duração e totalmente reversíveis. A presença de eritema e
edema, 14 dias após a terapia, pode estar relacionada com o efeito local da cirurgia de
exodontia que por si só leva a efeitos inflamatórios na região de extração.
As amostras incluídas no estudo com aspecto clínico saudável apresentaram graus
variados de inflamação, corroborando os achados de outros estudos onde se observou
infiltrado de leve a intenso em espécimes de gengiva saudável (BEZERRA, 2011;
VASCONCELOS, 2012) e confirmando que nem sempre um tecido saudável denota um
99
tecido histologicamente “livre” de células inflamatórias; focos de células inflamatórias como
linfócitos e plasmócitos são praticamente constantes em gengiva saudável.
Vários estudos revelam que a TFD tem um impacto significativo sobre os neutrófilos
(BRACKETT; GOLLNICK, 2011; GOLLNICK, 2012; LUKSIENE, 2003), outros descrevem
efeitos imunossupressores da TFD (CASTANO; MROZ; HAMBLIN, 2006; MROZ;
HAMBLIN, 2011). A inflamação aguda, entretanto, ocorre em maior frequência nos casos de
necrose tecidual, o que não foi visualizado em nossos espécimes submetidos à TFD. Estudos
prévios apontam um aumento nas citocinas pró-inflamatórias após a TFD (GOLLNICK et al.,
2003; GOLLNICK, 2012; MROZ; HAMBLIN, 2011; DOMINGUEZ, et al., 2010). Em
contrapartida, dois estudos em humanos apontam uma regulação negativa no perfil de
citocinas pró- inflamatórias após a TFD, entre elas destacam-se as interleucinas (IL-1ß, -8) e o
TNF-α (DE OLIVEIRA et al., 2009; GIANNOPOULOU et al. 2012). Algumas destas
citocinas, como a IL-1 e TNF-α, participam do processo de diferenciação e maturação do
osteoclasto, que é a célula responsável pela reabsorção óssea. Essas citocinas atuam pelo
estímulo de células progenitoras de osteoclastos ou por meio de um sistema parácrino, no qual
os osteoblastos e células da medula óssea estão fortemente envolvidos por meio de
mediadores que incluem o receptor ativador do fator nuclear kappa B (RANK), o seu ligante
(RANKL) e a osteoprotegerina (OPG) (BOYCE; XING, 2008; HOFBAUER, 2006;
KHOSLA, 2001; WRIGHT et al., 2009; YANG et al., 2012). Neste contexto, esperava-se que
com a aplicação do fármaco e irradiação houvesse regulação negativa do RANK, RANKL e
OPG, já que outros estudos encontraram níveis reduzidos de citocinas pró-reabsorção (como o
TNF- α e a IL-1) após a TFD (CARVALHO et al., 2011; DE OLIVEIRA et al., 2009; DE
OLIVEIRA et al., 2011; GIANNOPOULOU et al. 2012). Além disso, Wauquier et al. (2009)
apontam que a geração de espécies reativas de oxigênio funciona como um modulador chave
da função das células do osso e, que o status oxidativo influencia diretamente a fisiopatologia
dos tecidos mineralizados. Desta maneira, tentamos demonstrar a influência da TFD, uma
terapia envolvida com o estresse oxidativo, na imunoexpressão de RANK, RANKL e OPG.
Ademais, Seguier et al. (2010) mostraram que a terapia com a nanoemulsão de AlClFc
foi capaz de reduzir o número de células CD45+, CD8+, CD4+ e células de Langerhans CD
1+ na gengiva de pacientes com periodontite crônica. Embora muitas citocinas e fatores de
crescimento (como IL-1, -6 e TNF-α) liberados pelas células inflamatórias possam influenciar
a expressão de outras proteínas tais, como os fatores relacionados com a osteoclastogênese e o
VEGF, nosso estudo não encontrou correlações entre o grau de inflamação dos espécimes e a
imunoexpressão dos marcadores.
100
Os principais tipos de células que expressaram imunorreatividade para as proteínas
RANK e RANKL foram células com características de células da linhagem monocíticamacrofágica, fibroblastos, células epiteliais e linfócitos conforme já citado por outros autores
(DE MORAES et al., 2011, DE MORAES et al., 2013; GARCIA et al., 2011; GARCIA et
al., 2013; HOFBAUER, 2006; KHOSLA, 2001). Em consonância com o estudo de Chuang et
al. (2009) que avaliaram a expressão de RANK, RANKL e OPG em mucosa oral normal foi
visualizada imunorreatividade citoplasmática para RANKL em células epiteliais da camada
basal e completa ausência para OPG. Em contraste, houve imunomarcação para RANK em
células epiteliais da camada basal e células mononucleares. Giannopoulou et al. (2012)
encontraram ausência de marcação epitelial para RANKL e OPG em tecido gengival de
pacientes com periodontite crônica. Já, para o RANK demonstraram coloração moderada a
forte, principalmente na camada basal e suprabasal do epitélio, e imunomarcação para RANK
e RANKL no infiltrado inflamatório, corroborando os nossos achados relativos à
imunomarcação.
A expressão de RANKL e OPG é altamente regulada por estímulos locais e
sistêmicos, incluindo hormônios, mediadores inflamatórios, produtos bacterianos e drogas
imunossupressoras. IL-1 β e TNF- α induzem a expressão de ambos, RANKL e OPG
(WRIGHT et al., 2009; BOYCE, 2013). Poucos estudos avaliam a presença de fatores
reguladores da osteoclastogênese (RANK, RANKL e OPG) após terapia fotodinâmica em
humanos. Em Odontologia, os estudos se restringem à doença periodontal (ANDRADE et al.,
2013; DE OLIVEIRA et al., 2009; DE OLIVEIRA et al., 2011; GARCIA et al., 2011;
GARCIA et al., 2013) e os agentes sensibilizantes utilizados exibem atividade antibacteriana.
Em consonância com os resultados dos estudos de Garcia et al. (2011, 2013), encontrou-se
fraca imunorreatividade para RANKL 7 dias após a terapia. Para a OPG, estes autores
encontraram forte imunorreatividade após 15 dias, o que não foi observado por nós (completa
ausência de imunorreatividade para OPG). De Oliveira et al. (2009) apontam um aumento
inicial nos níveis de RANKL, seguido de redução nos dias subsequentes à terapia, um achado
que está de acordo com a suposição elaborada por nós de que haveria uma redução nos níveis
dos marcadores após a TFD. Os espécimes do grupo teste, em sua maioria, exibiram similar
ou fraca imunorreatividade para RANK e RANKL comparado com os do grupo controle,
corroborando os achados descritos acima. Andrade et al. (2013) encontraram uma regulação
positiva dos níveis de RNAm da OPG e da relação OPG/RANKL nos espécimes submetidos à
TFD, indicando uma tendência para uma maior formação óssea nos sítios onde houve
101
associação do tratamento periodontal conservador à TFD. Em contrapartida, De Oliveira et al.
(2011) encontraram níveis reduzidos de RNAm das citocinas RANKL e OPG após TFD.
Vários protocolos de TFD têm sido relatados na literatura (tipos diferentes de
fotossensibilizantes, a sua concentração e duração de aplicação, tipos de fontes de luz com
diferentes comprimentos de onda, densidade de potência, energia e também a duração de
aplicação de luz), o que torna as comparações diretas entre os estudos muito difíceis e, impede
conclusões definitivas sobre os reais benefícios clínicos da TFD. Neste contexto, os estudos
que avaliaram os fatores reguladores da reabsorção óssea pós-TFD usam agentes
sensibilizantes com atividade antibacteriana, o que diferencia do agente utilizado por nós, que
além de exibir atividade antibacteriana, possui atividade antitumoral. Ademais, diferenças
entre os resultados encontrados podem estar relacionadas com o uso de diferentes técnicas e
de metodologias divergentes utilizadas pelos diversos autores e no tipo de amostra utilizada
em cada estudo.
A atividade fotodinâmica do fotossensibilizante é baseada em reações foto-oxidantes
que provocam alterações bioquímicas e morfológicas nas células alvo. Quando uma molécula
da droga fotossensibilizante absorve fótons a partir de uma fonte de luz ressonante para a
banda de absorbância do sensibilizante, ela se transforma a partir do seu estado fundamental
em um estado excitado. Dependendo da estrutura da molécula e do seu ambiente, ela pode
perder a sua energia, através de um processo eletrônico ou físico e retornar seu estado
fundamental, ou cruzar para um estado “triplet” ou triplete excitado (3S*). A interação da
forma “triplet” com as biomoléculas presentes no meio pode dar origem a dois tipos de
reações: tipo I, que envolve transferência de elétrons e excitação, formando espécies reativas
de oxigênio (ERO); e tipo II, que é mediado pelo processo de transferência de energia para o
oxigênio molecular e formação do oxigênio “singlet” ou oxigênio singleto (1O2)
(DOLMANS; FUKUMURA; JAIN, 2003; GURSOY et al., 2013; RONSEIN et al., 2006). A
geração in situ de oxigênio singleto, pela via tipo II, desempenha papel central na
citotoxicidade fotodinâmica por causa da interação altamente eficiente destas espécies com
diferentes biomoléculas, presentes no meio celular (CARVALHO et al., 2011; GURSOY et
al., 2013; LUKSIENE, 2003; MROZ; HAMBLIN, 2011). Deste modo, os efeitos biológicos
da TFD podem ser diretos, por meio das ERO, ou indiretos, por meio de alterações da
vascularização local e ativação do sistema imune. A ftalocianina utilizada pertence à segunda
geração de sensibilizantes com importante produção de espécies reativas de oxigênio,
principalmente o oxigênio singlet (MUEHLMANN et al., 2014; LONGO et al., 2009;
LONGO et al., 2012; TAPAJÓS et al., 2008).
102
Observações microscópicas de reações vasculares primárias no grupo teste incluindo
congestão vascular, trombose e edema foram visualizados, um achado encontrado por outros
autores (BOBROV et al. 2007; DOLMANS et al., 2002; LONGO et al., 2009; MAAS et al.,
2012). Embora alguns autores apontem a presença de áreas de necrose (BOBROV et al. 2007;
TAPAJÓS et al., 2008; LONGO et al., 2009; PORTILHO et al., 2013) em tumores tratados
após a TFD, este achado não foi observado em nossas amostras submetidas à TFD, isto talvez
seja explicado pela alta seletividade do fármaco estudado às células tumorais, o que
contribuiu para a destruição tumoral nos estudos onde a necrose foi visualizada.
O estresse oxidativo é reconhecidamente um dos principais contribuintes para a
resposta imune (CASTANO; MROZ; HAMBLIN, 2006). A liberação de citocinas próinflamatórias após a TFD pode ativar fatores transcricionais como o fator nuclear Kappa B e
outros fatores de crescimento, tais como o VEGF. As ERO formadas após a TFD levam ao
estresso oxidativo, hipóxia tecidual e ativação de HIF-1, que em contrapartida induzem o
VEGF (FERRARIO et al., 2004; NAKAGAWA et al., 2007; SITINK, et al., 1998; YANG et
al., 2012). O achado encontrado neste estudo, onde quatro casos do grupo teste exibiram forte
imunomarcação para VEGF comparados ao grupo controle, sugere que a intervenção
terapêutica possa ter induzido a hipóxia tecidual estimulando o aumento dessa proteína. A
hipóxia é reconhecidamente um potente fator angiogênico. A queda nos níveis circulantes de
oxigênio, nos momentos iniciais da TFD, age como um estímulo para as células endoteliais
liberarem o HIF que induz a expressão do VEGF; um potente estimulador de mitoses para as
células endoteliais (FERRARIO et al., 2000; NAKAGAWA et al., 2007; YANG et al., 2012).
Alguns autores (BHUVANESWARI; TONG, 2010; FERRARIO et al., 2000;
NAKAGAWA et al., 2007; OTHANI et al., 2008; UEHARA, 2001; YANG et al., 2012)
apontam uma regulação positiva do VEGF após a TFD. Alguns fotossensibilizantes também
têm demonstrado esta regulação positiva para o VEGF. Os agentes sensibilizantes utilizados
nos estudos que exploram este imunomarcador exibem atividade antitumoral, uma vez que o
VEGF tem sido implicado na recorrência tumoral. O porfímero de sódio (Photofrin®)
mostrou-se um forte ativador de VEGF dentro do microambiente tumoral em modelo animal
(GOMER et al., 2006). Uehara et al. (2001) demonstraram um aumento do VEGF nas
primeiras 6h pós-TFD com oligômeros de hematoporfirinas. Nakagawa et al. (2007)
utilizaram um novo fármaco mono-L-aspartil clorina e6 (NP6e) e observaram indução do
RNAm do VEGF 24h pós TFD em linhagens celulares de carcinoma de células escamosas.
Othani et al. (2008) também utilizaram o NP6e e encontraram expressão de VEGF em
tumores de pulmão in vivo e in vitro; houve uma regulação ascendente para o VEGF após 12
103
horas da TFD. Jiang et al. (2008) apontam um aumento do VEGF após TFD em gliobastoma
e ressaltam a importância de uma terapia anti-angiogênica combinada à TFD. Por outro lado,
He et al. (2008) realizaram análise imunoistoquímica após 6h da TFD com ALA em câncer
cervical e encontraram regulação descendente do VEGF nos grupos que se submeteram a
TFD. Sharwani et al. (2006) aplicaram meta-tetrahidroxifenil clorina (m-THPC; Foscan®) e
laser em linhagens celulares derivadas de carcinoma de células escamosas e encontraram
redução dos níveis de VEGF 24 horas pós TFD. Muito provavelmente a forte imunoexpressão
de VEGF nos espécimes do nosso estudo foi o que promoveu o aumento da vascularização ou
da neoangiogênese, similar ao observado pelos autores.
A relação entre os efeitos da TFD e a expressão de citocinas, tais como VEGF, é ainda
controversa. Adicionalmente, é importante destacar que o tempo requerido para que haja
estímulo para a expressão do VEGF nas células endoteliais pode variar e os resultados
também podem variar em função dos fotossensibilizantes utilizados, do seu efeito terapêutico
e do protocolo utilizado para TFD. A nossa amostra foi removida para análise histológica e
imunoistoquímica após 7 dias da realização da TFD e, conforme citado acima a maioria dos
autores encontraram regulação ascendente; embora nem todos tenham citado o tempo entre a
aplicação da terapia e a remoção dos espécimes para análise. Com os resultados do presente
estudo não podemos afirmar que já havia uma regulação ascendente para o VEGF, embora
tenha sido encontrada moderada a forte imunomarcação nos casos avaliados, principalmente
no grupo teste. É importante considerar que o aumento na expressão de VEGF contribui para
a angiogênese e em modelos tumorais essa superexpressão pode contribuir para a recorrência
tumoral. Neste sentido, Gomer et al. (2012) sugerem o uso de inibidor do VEGF, como o
bevacizumab (Avastin), em combinação com a TFD.
Na mucosa oral normal, em consonância com os achados de Carlile et al. (2001) que
apontam imunoexpressão para o VEGF em todas as camadas do epitélio, preferencialmente
nas camadas suprabasal, nós também visualizamos imunomarcação nas camadas basal e
suprabasal. Em contrapartida, Gandolfo et al. (2011) encontraram ausência de
imunomarcação para o VEGF na maioria dos casos, um achado que não foi encontrado por
nós em nenhum de nossos espécimes.
Um achado histológico observado nos espécimes do grupo teste, e que merece
destaque, foi a presença de material basofílico, amorfo e acelular compatível com o processo
de calcificação distrófica. Estas alterações encontravam-se em região subepitelial e, em
proximidade com os vasos sanguíneos. Acreditamos que o estresse oxidativo, ocasionado pela
TFD, pode ter levado à esta deposição tecidual anormal. Estas deposições, geralmente,
104
ocorrem em tecido que estão morrendo ou sofrendo degeneração, e são chamadas de
calcificação distrófica. Este tipo de calcificação é encontrado em áreas de necrose (KUMAR
et al., 2010), e este fato merece atenção uma vez que o fármaco do estudo exibe propriedades
antitumorais, dentre elas a morte celular por necrose (BICALHO et al., 2013; LONGO et al.,
2009; TAPAJOS et al., 2008; PORTILHO et al., 2013).
A calcificação vascular é um processo de biomineralização ativa que ocorre em
situações patológicas e fisiológicas. Este processo é mediado por células, resultado do
desequilíbrio de fatores promotores e inibidores da mineralização. À microscopia óptica
verifica-se acidofilia inicial, com aparecimento de grumos basófilos irregulares (muitas vezes
confundidos com bactérias) que confluem ou crescem formando grânulos maiores, às vezes
fragmentados devido à microtomia, similar ao observado nos espécimes avaliados. Apesar de
se constituírem em um capítulo à parte dentro da patologia geral, as calcificações patológicas
ocorrem em concomitância com vários processos gerais, como as necroses e degenerações e
podem estar presentes em virtualmente qualquer lesão crônica. A calcificação distrófica ou
local pode ocorrer quando tecidos necróticos e isquêmicos estão presentes e não há
suprimento sanguíneo suficiente no tecido envolvido, o que pode ter acontecido nas regiões
que se submeterem à terapia. Este tipo de calcificação não produz sinais e sintomas, porém
induz, ocasionalmente, ao edema e ulceração nos tecidos (LIBERMAN et al., 2013; MODY
et al., 2001; MCCARTY, DINICOLANTONIO, 2014). Embora clinicamente não tenhamos
observado alterações degenerativas na mucosa submetida à TFD, visualizamos nos espécimes
alterações histológicas compatíveis com processos de neoangiogênese, oclusão vascular e a
formação das calcificações.
Na patogenia da calcificação distrófica, a via comum final é a formação do mineral
fosfato de cálcio cristalino na forma de apatita. Segundo Kumar et al. (2010) o cálcio fica
concentrado em vesículas ligadas à membrana; quando ocorre lesão na membrana celular, os
íons se ligam aos fosfolipídios de membrana e se associam ao fosfato. O ciclo de ligação do
cálcio com o fosfato se repete, elevando as concentrações locais e produzindo um depósito
perto da membrana. A calcificação distrófica é considerada um sinal de alerta de lesão celular
prévia (KUMAR et al., 2010). Deste modo, podemos sugerir que a aplicação da TFD na
gengiva dos pacientes foi capaz de lesionar a mucosa irradiada, especificamente as
membranas das células endoteliais, o que poderia explicar o aparecimento destas calcificações
nos nossos espécimes.
Evidências apontam que o VEGF é capaz de promover a ossificação seja por induzir
neovascularização ou por afetar diretamente as células ósseas. No desenvolvimento e na
105
regeneração do osso, a angiogênese e a reabsorção óssea, são dois processos essenciais e que
estão intimamente associados, o que sugere um mediador comum para estes dois eventos
biológicos. Neste contexto, o VEGF surge como um possível estimulador por meio da
secreção de fatores de crescimento e citocinas pelas células endoteliais, o que influenciaria a
diferenciação de células mesenquimais para a via osteogênica e à osteogênese. (DAI &
RABIE, 2007; YANG et al., 2012). O aumento do VEGF nas regiões submetidas à TFD
poderia favorecer a mudança de fenótipo de célula endotelial para célula osteoblástica e
assim, haver deposição de minerais e formação de calcificações. Estudos prévios têm sugerido
que o estresse oxidativo pode mediar diferenciação celular em vários tipos de células como
células dendríticas do sangue periférico e osteoclastos (GARRETT et al., 1990; RUTAULT et
al. 1999). Mody et al. (2001) demonstraram que células vasculares submetidas a agentes
oxidativos, como a xantina oxidase, produziam fosfatase alcalina e, deste modo defendem que
o estresse oxidativo favorece a diferenciação osteoblástica destas células.
Estudos clínicos têm ajudado a esclarecer melhor o papel do microambiente tecidual
no complexo organismo humano e, desta forma, na capacidade de resposta a tratamentos tais
como a TFD. Este estudo foi realizado a partir de observações clínicas da evolução pósaplicação deste novo fármaco em tecido gengival de humanos, constatando um fenômeno que
não poderia ter sido observado em estudos in vitro e in vivo. Dos achados histológicos
visualizados no grupo teste a presença de numerosos e diminutos vasos sanguíneos e a
presença de calcificações vasculares sugerem que a TFD produziu respostas celulares com
angiogênese e degeneração celular, respectivamente. É provável que o período experimental
de uma semana entre o tratamento clínico por TFD e a biópsia gengival seja insuficiente para
se evidenciar eventuais alterações na imunoexpressão de todos os imunomarcadores do
estudo. Deste modo, testes mais sensíveis devem ser realizados para se quantificar as
proteínas após a TFD.
106
CONCLUSÕES
107
7 CONCLUSÕES
Diante deste experimento podemos concluir que:
1) Não há evidências que comprovem uma diferença entre os imunomarcadores e os
grupos do estudo.
2) Não há evidências que comprovem uma correlação dos imunomarcadores e o grau de
inflamação nos grupos do estudo.
3) Existem evidências que sugerem uma forte imunorreatividade para o VEGF nos
espécimes submetidos à TFD.
4) Dentro das limitações do estudo podemos sugerir que as mudanças produzidas pela
TFD no microambiente tecidual por meio de hipóxia e produção de ERO são capazes
de produzir uma resposta celular, neste caso com a angiogênese.
5) Estudos adicionais serão necessários para entender as diferenças e/ou semelhanças nos
perfis de citocinas nos tecidos saudáveis e nos submetidos à TFD.
6) A TFD com a cloro-alumínio ftalocianina nanoparticulada na concentração de 5µM
pode ser utilizada com segurança em aplicação local, com pouco ou nenhum efeito
colateral. No entanto, deve ser avaliada ainda a dose tolerada pelos indivíduos.
108
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118
APÊNDICES
119
APÊNDICES
APÊNDICE A - Termo de consentimento livre e esclarecido
Este é um convite para você participar da pesquisa “AVALIAÇÃO DA
IMUNOEXPRESSÃO DE FATORES ESTIMULADORES DA REABSORÇÃO ÓSSEA
E DE PROTEÍNAS APOPTÓTICAS APÓS TERAPIA FOTODINÂMICA COM
CLORO-ALUMÍNIO FTALOCIANINA EM TECIDOS GENGIVAIS DE HUMANOS”
que é coordenada pelo Prof. Dr. Antonio de Lisboa Lopes Costa e Prof. Dr. Ricardo Bentes de
Azevedo. Sua participação é voluntária, o que significa que você poderá desistir a qualquer
momento, retirando seu consentimento, sem que isso lhe traga nenhum prejuízo ou
penalidade.
Este é um estudo experimental para avaliar a resposta do medicamento cloroalumínio ftalocianina (AlClF) associado à terapia fotodinâmica (laser) em tecido da gengiva.
Este medicamento será injetado na sua gengiva e em seguida será realizada aplicação do laser.
Esta terapia busca novas alternativas para o tratamento de lesões orais pré-malignas, doença
periodontal e para o câncer para, assim, estabelecer medidas que possam contribuir para a
melhoria dos tratamentos atuais. Caso decida aceitar o convite, o (a) senhor (a) permitirá a
realização de exame clínico periodontal detalhado e exames complementares, responderá a
uma ficha de pré-tratamento, e caso seja selecionado para o estudo receberá instruções e
orientações sobre a terapia. Posteriormente, será agendado seu atendimento para realização da
terapia e acompanhamento. Caso o Sr.(a) não tenha interesse em participar do projeto de
pesquisa, o Sr.(a) receberá tratamento periodontal sem nenhum ônus ou prejuízo no
tratamento.
O seu tratamento ocorrerá apenas após a entrega dos resultados dos exames de
sangue que serão realizados no Laboratório de Análises Clínicas do Departamento de
Farmácia da UFRN. Caso seus exames estejam dentro dos padrões de normalidade, você
poderá participar do estudo. A terapia será realizada em ambiente ambulatorial (Clínica de
Odontologia). Todos os procedimentos de biossegurança serão devidamente aplicados em
todas as fases do estudo. Durante a aplicação do medicamento e laser pode haver ligeira
sensibilidade, vermelhidão e ardor na região. As áreas que receberão a aplicação da terapia
são as regiões com doença periodontal avançada e com indicação clínica de exodontia. Até o
120
momento, a literatura não descreve grandes efeitos colaterais adversos evidentes após a
aplicação da terapia. Você receberá instruções relativas à exposição ao sol e medicação para a
dor no pós-tratamento. Após a aplicação da terapia, agendaremos uma nova consulta para
realização da retirada dos dentes com indicação clínica, acompanhamento e coleta das
amostras da sua gengiva para utilização em nosso estudo. Este tecido gengival será enviado ao
laboratório da Disciplina de Patologia Oral e utilizado para confecção de lâminas para o
estudo.
Todas as informações obtidas serão sigilosas e seu nome não será identificado
em nenhum momento. Os dados serão guardados em local seguro e a divulgação dos
resultados será feita de forma a não identificar os voluntários. Os riscos de sua participação no
estudo são mínimos, desde que você cumpra todas as recomendações e orientações fornecidas
por nós, dentre eles a proteção solar nos 3 dias subsequentes a terapia. Os benefícios desta
pesquisa incluem a descoberta de um tratamento para pacientes portadores de câncer oral,
doenças bacterianas e ainda, para o entendimento dos mecanismos associados a esta terapia.
Este estudo clínico será importante fonte de informação sobre os efeitos do medicamento em
mucosa oral humana e também de seus efeitos colaterais, que denota a segurança do
medicamento, especialmente para a indicação clínica à qual se destina.
Se você tiver algum gasto que seja devido à sua participação na pesquisa, você
será ressarcido, caso solicite. Em qualquer momento, se você sofrer algum dano
comprovadamente decorrente desta pesquisa, você terá direito à indenização. O pesquisador e
a instituição sediadora assumem toda a responsabilidade para com o paciente, desde a
assistência farmacêutica até a médica em caso de ocorrência de eventos adversos.
Você ficará com uma cópia deste Termo e toda a dúvida que você tiver a
respeito desta pesquisa, poderá perguntar diretamente para os pesquisadores responsáveis, no
Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande Norte Av. Senador
Salgado Filho, 1787 – Lagoa Nova – Natal – RN; Fone/ Fax: (84) 3215-4138.
121
Consentimento Livre e Esclarecido
Eu,__________________________________________________, declaro que compreendi os
objetivos desta pesquisa, como ela será realizada, os riscos e benefícios envolvidos e
concordo em participar voluntariamente da pesquisa:
“AVALIAÇÃO DA IMUNOEXPRESSÃO DE FATORES ESTIMULADORES DA
REABSORÇÃO ÓSSEA E DE PROTEÍNAS APOPTÓTICAS APÓS TERAPIA
FOTODINÂMICA COM CLORO-ALUMÍNIO FTALOCIANINA EM TECIDOS
GENGIVAIS DE HUMANOS”
__________________________________________________
Assinatura do Participante
__________________________________________________
Pesquisador (a) responsável
Telefones para contato: (84) 96072202, (84) 87275237
122
APÊNDICE B - Avaliação pré-tratamento
FICHA PARA COLETA DE DADOS CLÍNICOS
Idade: _____________ (anos)
Sexo: ( ) 1- masc; 2 - fem; 9 - não info.
Hábito comportamental: (
) 1- fuma; 2- bebe; 3 - fuma e bebe; 4 - não possui
nenhum hábito; 9 - não info.
História médica pregressa:
Doenças pré-existentes:
Tratamentos prévios:
Medicações em uso:
ANAMNESE
( )TABAGISMO
( ) ETILISMO
( ) HIPERTENSÃO
( )DOENÇA CARDÍACA
( ) DIABETES
( ) ALERGIA:_______
( )DOENÇA PULMONAR
( ) GRAVIDEZ
( )USOU ANTIBIÓTICO NOS ÚLTIMOS 6 MESES
( )OUTROS:_______________________________________________________
PROCEDIMENTOS (
) EXODONTIA
Resultados dos exames laboratoriais de rotina:
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
____________________________________________________________
Necessidades Odontológicas:
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
_______________________________________________________
Informações sobre o estado imunológico; utilização de métodos contraceptivos; doenças
renais ou hepáticas.
123
Data, ___/___/_____
Profissional:________________________ Paciente:___________________________
APÊNDICE C - Avaliação do tratamento
PROTOCOLO: Injeção em região de papila interdental (mesial ou distal) de 40 µl
(0.04ml) de nanoemulsão de cloro-alumínio ftalocianina (com um tempo mínimo de
injeção da droga de 5 min); e, 15minutos após a administração da droga, irradiação com
laser diodo de baixa potência (660nm), em uma energia total de 100J/cm2.
PROCEDIMENTOS REALIZADOS
SESSÃO INICIAL
Data:_____/_________/_______ Grupo: ( ) 0- teste; 1 – controle.
Densidade Energética:_______________
Ponto de aplicação:_____________________________________________________
Fotossensibilizador utilizado (e forma):_____________________________________
Na aplicação: (
) dor ( ) edema
ESCALAS: (0 = ausência de dor; 1 = leve; 2 = moderada; e 3 = severa)
( 0) presença de edema; ou (1) ausência de edema
Profissional:________________________ Paciente:___________________________
EXODONTIA
Data:_____/_________/_______ Grupo: ( ) 0- teste; 1 – controle.
7 dias após a aplicação: (
) dor ( ) prurido (
) ardor ( ) eritema (
) bolhas ( )
crostas ( ) púrpura
ESCALAS: (0 = ausência; 1 = leve; 2 = moderada; e 3 = severa)
Efeitos
adversos:__________________________________________
(edema,
disfagia,
reação alérgica).
Profissional:________________________ Paciente:___________________________
124
PROSERVAÇÃO
Data:_____/_________/_______ Grupo: ( ) 0- teste; 1 – controle.
14 dias após a aplicação: (
) dor ( ) prurido (
) ardor ( ) eritema (
) bolhas ( )
crostas ( ) púrpura
ESCALAS: (0 = ausência; 1 = leve; 2 = moderada; e 3 = severa)
Efeitos
adversos:__________________________________________
(edema,
disfagia,
reação alérgica).
Profissional:________________________ Paciente:___________________________
Data:_____/_________/_______ Grupo: ( ) 0- teste; 1 – controle.
30 dias após a aplicação: (
) dor ( ) prurido (
) ardor ( ) eritema (
) bolhas ( )
crostas ( ) púrpura
ESCALAS: (0 = ausência; 1 = leve; 2 = moderada; e 3 = severa)
Efeitos
adversos:__________________________________________
(edema,
disfagia,
reação alérgica).
Profissional:________________________ Paciente:___________________________
GRUPO TESTE
(n=8)
Escala de avaliação
7 dias
14 dias
30 dias
A B C D E F A B C D E F A B C D E F
1
2
3
4
5
6
7
8
Legendas: (A) Prurido (B) Ardor (C) Eritema (D) Bolhas (E) Crostas (F) Púrpura. Escala de
avaliação: 0 = ausência, 1 = leve, 2 = moderada e 3 = severa
125
ANEX OS
126
ANEXO
ANEXO A Documento de aprovação do projeto de pesquisa (228/2012) pelo Comitê de Ética
em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
127