Prática Eletroforese de Aminoácidos

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS DE JABOTICABAL
MÉT. PURIF. ANÁL. PROTEÍNAS – CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – 1o SEMESTRE, 2016
AULA PRÁTICA 1 – AMINOÁCIDOS
Eletroforese em papel
Conceito
A eletroforese é um método de separação de substâncias baseado na mobilidade das
mesmas, quando submetidas a um campo elétrico. Qualquer composto que possua carga elétrica
líquida em um determinado pH pode ser separado por meio desta técnica. Nesta aula, faremos
uso da técnica da eletroforese em papel para separação e identificação de aminoácidos.
Quando os aminoácidos, em um determinado valor de pH, são submetidos a um campo
elétrico, eles separam-se de acordo com as cargas elétricas líquidas no pH usado. Os
aminoácidos que são cátions nesse pH migrarão em direção ao cátodo ou pólo negativo; os
aminoácidos aniônicos migrarão para o ânodo ou pólo positivo; os aminoácidos com carga líquida
zero permanecerão na origem.
Procedimento
1. Numerar 4 tiras de papel cromatográfico (jamais tocá-las com os dedos, use as pinças para
manusear o papel) de 1 a 4, marcando as extremidades das tiras a lápis com os sinais + e -.
2. Marcar, também a lápis, o centro de cada tira.
3. Nas tiras de 1 a 4, anotar, respectivamente, os símbolos Gly, Lys, Asp e SD (solução
desconhecida).
4. Colocar 500 ml do tampão acetato de sódio (25 mM, pH 5,4) em cada uma das câmaras
laterais da cuba de eletroforese e 500 ml de água destilada na câmara central.
5. Umedecer as tiras de papel com a solução tampão, e secá-las levemente entre duas folhas de
papel mata-borrão.
6. Colocar no centro de cada tira, respectivamente, uma microgota das soluções dos aminoácidos
glicina (Gly), lisina (Lys), ácido aspártico (Asp) e da solução de composição desconhecida (SD).
7. Colocar as tiras de papel na câmara eletroforética, com a extremidade marcada com o sinal +
do lado do pólo positivo.
8. Ligar os polos da fonte à cuba e aplicar uma diferença de potencial de cerca de 300 V (± 5 mA).
9. Deixar correr por 1 hora.
10. Desligar o sistema, retirar as tiras de papel e secá-las em estufa a 60oC.
11. Pulverizar as tiras de papel com a solução de ninhidrina e colocá-las em estufa a 60oC até o
aparecimento da cor.
Para o relatório (que deve ser entregue no começo da próxima aula!!!):
a. Faça um esquema (desenhe) do resultado obtido em cada tira de papel e explique-os.
b. O que você pode concluir sobre a composição da solução desconhecida?
c. Quais as cargas líquidas dos aminoácidos estudados, ao se usar solução tampão pH 5,4?
d. Qual seria o resultado se o experimento tivesse sido conduzido em pH 1,0?
e. Qual seria o resultado se o experimento tivesse sido conduzido em pH 12?
f. Qual a função da solução de ninhidrina na eletroforese em papel aqui realizada?
OBS.: Por favor, escreva o relatório com suas próprias palavras. Suas respostas às questões
serão anuladas se houver qualquer evidência de cópia (plágio).
Dicas para escrever o relatório:
Questão a. Esta questão deverá ser muito bem explicada e valerá 3,5 pontos (total do relatório =
10). Para explicar os resultados obtidos, examine o estado de protonação dos aminoácidos (a
presença ou ausência de H+ associados aos aminoácidos) usados no experimento, em pH 5,4.
Comparar o ponto isoelétrico (pI) de cada aminoácido com o pH da solução irá ajudá-lo a explicar
porque certos aminoácidos correram para o polo negativo, outros para o polo positivo e outros não
correm. Lembre-se que qualquer composto que possua carga elétrica líquida (positiva ou
negativa) em um determinado pH pode ser separado por eletroforese. As páginas 81-83 (Capítulo
3) do livro Lehninger, 4a. Edição, ajudará você entender cargas de aminoácidos.
Questão b. Compare o padrão eletroforético dos aminoácidos Gly, Lys e Asp com o padrão
eletroforético obtido na solução desconhecida. Se o padrão eletroforético é o mesmo, pode ser
que os aminoácidos sejam os mesmos (ou muito semelhantes/do mesmo grupo)? O padrão
eletroforético refere-se a como certos compostos correm em uma dada eletroforese: correm para
o polo positivo, para o polo negativo, correm muito ou pouco (ou seja, distanciam-se mais ou
menos da região neutra?)?
Questão c. Carga líquida é simplesmente: positiva, negativa ou neutra. Você pode obter esta
resposta no livro ou na internet.
Questões d/e. Pense sobre a disponibilidade de prótons (H+) em uma solução ácida (pH 1,0) e
em uma solução básica (pH 12). Se a disponibilidade de prótons é maior, a chance dos
aminoácidos estarem protonados é maior ou menor? Se o aminoácido está protonado, sua carga
líquida é positiva ou negativa?
Questão f. Você pode obter esta resposta na internet. Por favor, responda esta questão no
contexto desta aula prática. Se você responder que ninhidrina pode ser usada para detectar
impressões digitais, sem explicar o porquê e sem relacionar sua resposta com o tema da aula
prática, sua nota será prejudicada.