11-096 DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE CÓRNEAS

9º Congresso Latino-Americano de Orgãos Artificiais e Biomateriais
13º Congresso da Sociedade Latino Americana de Biomateriais, Orgãos Artificiais e Engenharia de Tecidos - SLABO
24 a 27 de Agosto de 2016, Foz do Iguaçu, PR
11-096
DESENVOLVIMENTO
E
CARACTERI ZAÇÃO
DE
CÓRNEAS
HUMANAS
DESCELULARI ZADAS E RECELULARI ZAÇÃO COM CÉLULAS-TRONCO VISANDO
REGENERAÇÃO DO EPITÉLIO CORNEANO
Martins, T.M.(1)Cunha, P.d.(2)Rodrigues, M.A.(3)Carvalho, J.L.(4)Gomes, D.A.(5)Goes, A.M.(6)
Universidade Federal de Minas Gerais(1); Universidade Federal de Minas Gerais(2);
Universidade Federal de Minas Gerais(3); Universidade Católica de Brasília(4); Universidade
Federal de Minas Gerais(5); Universidade Federal de Minas Gerais(6);
A córnea pode ser afetada por uma série de doenças, como lesões ulcerativas, ceratocone,
leucoma, infecções, dentre várias outras. Essas doenças levam à sua opacificação, deficiência
visual e até mesmo à cegueira, sendo as doenças corneanas consideradas a quarta causa de
cegueira no mundo. O único tratamento, no momento, para a maioria dessas doenças consiste
no transplante de córnea. Entretanto, esse procedimento apresenta algumas desvantagens
dentre as quais as duas mais relevantes são: o risco de rejeição do enxerto levando à falência
do transplante e a escassez de doadores resultando em longa fila de espera. No Brasi l, em
setembro de 2015, a lista nacional de espera por um transplante de córnea era de 10.419
pacientes, sendo excedida apenas pela lista de espera por transplante renal, segundo dados da
Associação Brasileira de Transplante de Órgãos. Nesse contexto, o desenvolvimento de córneas
artificiais com base em métodos de descelularização representa uma alternativa promissora para
contornar os problemas relacionados ao transplante de córnea. Dessa forma, o objetivo do
presente projeto é desenvolver e caracterizar córneas humanas descelularizadas, avaliar a
integridade e biocompatibilidade destas após o processo de descelularização e promover a
reconstrução do epitélio corneano utilizando células -tronco humanas. Para tanto, botões córneo esclerais inviáveis para transplante foram obtidos do Banco de Olhos do MG
Transplantes/Fundação Hospitalar do Estado de Minas Gerais de acordo com as normas
aprovadas pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais (CAAE:
49967715.0.0000.5149). As córneas foram descelularizadas por dois diferentes métodos: 1)
tratamento com NaCl, 2) tratamento com NaCl + Nucleases. A total remoção dos componentes
celulares assim como a integridade da membrana basal e do estroma das CDs foram avaliadas
por meio de análises histológicas (coloração com hematoxilina eosina - H&E, ácido periódico e
reagente de Schiff - PAS e Alcian Blue), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e
transmissão (MET), quantificação de DNA genômico, avaliação da expressão de colágeno tipo I,
colágeno tipo IV, fibronectina e laminina por imunofluorescência e marcação nuclear com a sonda
Hoechst. Posteriormente, as CDs foram recelularizadas com células -tronco embrionárias
humanas (hESCs) ou células-tronco de pluripotência induzida (hiPSCs) e a biocompatibilidade
das CDs foi avaliada por meio do ensaio de Calceína-AM. Paralelamente, foi feito um estudo da
capacidade das hESCs e hiPSCs em se diferenciar em células epiteliais da córnea quando
cultivadas na presença de meio de cultura indutor. A fim de avaliar o comprometimento das
hESCs e hiPSCs com a linhagem de células epiteliais da córnea, foram feitas análises da
expressão relativa de transcritos gênicos relacionados a essa linhagem (p63, Pax6, citoqueratina
3 e 12) por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR). Os resultados
demonstraram que o tratamento apenas com NaCl resultou em remoção incompleta dos
componentes celulares. Em contraste, verificou-se completa remoção das células, núcleos,
debris celulares e DNA nas córneas submetidas ao tratamento com NaCl + Nucleases. Além
disso, esse tratamento preservou a composição protéica e a estrutura da membrana basal das
CDs como revelado pela coloração com PAS, detecção da expressão de colágeno tipo IV,
fibronectina e laminina por imunofluorescência. Análises das micrografias de transmissão
revelaram a similaridade ultraestrutural das membranas basais das CDs e córneas controles
(CCs). A preservação do conteúdo de glicosaminoglicanos presentes no estroma corneano foi
comprovada por meio da coloração com Alcian Blue. A integridade do estroma das CDs também
foi comprovada pela detecção da expressão de colágeno tipo I e por MET. Análises das
micrografias de transmissão demonstraram a preservação da estrutura, orientação, distribuição
e distanciamento das fibras colágenas presentes no estroma das CDs, que apresentam
ultraestrutura similar àquelas encontradas nas CCs, indicando que não ocorreram mudanças na
organização lamelar do estroma corneano após tratamento das córneas com NaCl + Nucleases.
A partir do ensaio de Calceína-AM, foi possível demonstrar que as hESCs e hiPSCs foram
capazes de aderir à membrana basal das CDs e mantiveram-se viáveis. Análises por MEV
também demonstraram que as células estavam bem aderidas e distribuídas pela superfície da
membrana basal das CDs. Análises por qPCR revelaram que as hESCs e hiPSCs apresentaram
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9º Congresso Latino-Americano de Orgãos Artificiais e Biomateriais
13º Congresso da Sociedade Latino Americana de Biomateriais, Orgãos Artificiais e Engenharia de Tecidos - SLABO
24 a 27 de Agosto de 2016, Foz do Iguaçu, PR
aumento na expressão gênica de p63, Pax6, citoqueratina 3 e 12 após cultivo em meio indutor
da diferenciação em células do epitélio corneano. Os achados do presente estudo demonstraram
que o tratamento das córneas humanas com NaCl + Nucleases resultou em uma matriz
completamente descelularizada e biocompatível com propriedades estruturais e funcionais
preservadas com potencial aplicação na engenharia de tecidos da córnea.
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