Renata da Silva Galvão

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR HEITOR VIEIRA DOURADO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
INVESTIGAÇÃO DE MUTAÇÕES DE RESISTÊNCIA ASSOCIADAS AOS ANTIVIRAIS EM
ISOLADOS DE PACIENTES PORTADORES DO VÍRUS DA HEPATITE B NO ESTADO DO
AMAZONAS
RENATA DA SILVA GALVÃO
MANAUS
2013
II
RENATA DA SILVA GALVÃO
INVESTIGAÇÃO DE MUTAÇÕES DE RESISTÊNCIA ASSOCIADAS AOS ANTIVIRAIS EM
ISOLADOS DE PACIENTES PORTADORES DO VÍRUS DA HEPATITE B NO ESTADO DO
AMAZONAS
Dissertação apresentado ao Programa de PósGraduação em Medicina Tropical da Universidade do
Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação
de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para
obtenção de Título de Mestre em Doenças Tropicais e
Infecciosas.
Orientadora: Profª Cíntia Mara Costa de Oliveira
Co-Orientador: Profª Wornei Silva Miranda Braga
MANAUS
2013
Ficha Catalográfica
Galvão, Renata da Silva.
G182i
Investigação de mutações de resistência associadas
aos antivirais em isolados de pacientes portadores dos
vírus da hepatite B no Estado do Amazonas / Renata da
Silva Galvão. -- Manaus : Universidade do Estado do
Amazonas, Fundação de Medicina Tropical, 2013.
63 f. : il.
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Medicina Tropical – UEA/FMT e Fundação
de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado
(FMTHVD), 2013.
Orientador: Profa. Dra. Cintia Mara Costa de Oliveira.
Co-orientador: Prof. Dro. Wornei Silva Miranda Braga.
Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária da Escola Superior de Ciências da Saúde – UEA
Sheyla Lobo Mota.
1. Hepatite B – Mutação 2. Resistência – Virus – Hepatite B I.
Título.
III
FOLHA DE JULGAMENTO
INVESTIGAÇÃO DE MUTAÇÕES DE RESISTÊNCIA ASSOCIADAS AOS ANTIVIRAIS EM
ISOLADOS DE PACIENTES PORTADORES DO VÍRUS DA HEPATITE B NO ESTADO DO
AMAZONAS
RENATA DA SILVA GALVÃO
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças
Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em
Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação
de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”.
Banca Julgadora:
_____________________________________
Prof. Cintia Mara Costa de Oliveira, Dra
Presidente
________________________________
Prof. Cristovão Alves da Costa, Dr.
Membro
___________________________________
Prof. Wornei Silva Miranda Braga, Dr.
Membro
IV
DEDICATÓRIA
Ao Senhor Jesus, por que Dele, pra Ele e por Ele são todas as coisas.
V
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus pela oportunidade de realizar mais um sonho, por colocar na
minha vida pessoas maravilhosas para mi ajudar, e por estar comigo a todo instante, me
dando força, sabedoria e inteligência.
A minha família querida que é minha base. Agradeço a minha mãe Rosa Meire, pelas
constantes orações e pelo seu amor incondicional, compreensão e apoio. Aos meus irmãos
Renato, Leonardo e Paulo César, pelo apoio e incentivo. Ao meu padrasto Gotardo Barbosa,
pela dedicação e amizade.
Agradeço ao meu pai Julio César, in memorian, a quem prometi que chegaria até o fim deste
trabalho.
As minhas tias e meus pastores pelas orações e carinho.
A minha querida Orientadora Cíntia Mara, pelo incentivo, ensinamentos, amizade e
dedicação.
Ao meu co - orientador Dr.Wornei Braga, pelo apoio, orientações e contribuições neste
trabalho.
As minhas colaboradoras Márcia Castilho, Heline Lira, Joelma Martins e Suellen Silva, pela
ajuda no laboratório, pela amizade e incentivo.
As minhas amigas da Gerência de Virologia Liane Calado, Elizabeth Galusso, Karol Matos
pela amizade, incentivo para conclusão deste trabalho.
As meus amigos da Gerência de Patologia, Carlos, Sandra Caranhas, Sandra Heline,
Cristiana, Lilian, pelo apoio, incentivo e amizade.
Ao Dr.Araújo pelo seu apoio, pela oportunidade, pelas orientações e amizade.
A minha amiga Carolina Marinho que me ajudou e incentivou desde o principio.
Aos Pesquisadores Dr. Felipe Naveca e George do Instituto Leônidas Maria Deane –
Fiocruz/AM;
A Universidade do Estado do Amazonas em proporcionar o Curso de Pós-Graduação em
Medicina Tropical.
A Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado pela infra estrutura para
realização desde trabalho.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, pela bolsa de
estudo.
VI
EPÍGRAFE
E disse ao homem: Eis que o temor do Senhor
é a Sabedoria e o aparta-se do mal é a
Inteligência. (Jó 28:28)
VII
RESUMO
A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) representa um importante problema de Saúde
Pública mundial, um dos maiores desafios enfrentados durante o tratamento da infecção
crônica pelo VHB é o surgimento de vírus resistentes às drogas usadas. O surgimento de
mutações em regiões especificas do gene da DNA polimerase têm sido extensivamente
correlacionadas à resistência aos anti-virais, uma vez que possibilita o reaparecimento do
DNA do vírus no soro, principalmente em indivíduos submetidos a terapia prolongada.
Objetivo Geral: Neste estudo, nos propomos investigar mutações de resistência no gene da
transcripatase reversa (RT) do VHB e caracterizar os genótipos em amostras de pacientes
tratados e não tratados com antivirais, atendidos em uma Unidade Terciária de Saúde
referência da região norte do Brasil. Uma região de 600pb da RT foi amplificada pela PCR e
diretamente sequenciada. Resultados: Foram sequenciadas 113 amostras, destas quatro
(3,54%) apresentaram a mutação rtM204I tanto na região YMDD como no gene S ((1
(rtA80V/rtM204I), 2 (rtS202L/rtM204I), 4 (rtS202Q/rtM204I) e 13 (rtS202I/rtM204L)). Os
genótipos identificados foram A 71,68% (81/113), D 15,04% (17/1130) e F 13,28% (15/113).
Dos 26 pacientes que apresentaram mutações de resistência na região rt do VHB, 88,46%
eram pacientes não tratados. Verificou-se também que 8,8% das sequencias virais analisadas
apresentavam mutações de escape de vacina. Conclusão: Esses resultados mostram que
embora as estratégias de prevenção e controle sejam eficazes há necessidade de
investigação constante e exaustiva sobre epidemiologia molecular do VHB na região.
Palavras Chaves: Resistência, Hepatite B, Mutação, Genótipo.
VIII
ABSTRACT
Infections by Hepatitis B virus (HBV) continue to be a public health burden worldwide. One of
the biggest challenges occurring during the treatment of chronic HBV infections is the
emerging of resistant viruses to the drugs prescribed. The mutations that emerged in specific
regions of the gene coding for DNA polymerase were extensively correlated to resistance to
the antiviral drugs, since it enables the reappearance of viral DNA in serum, especially in
patients undergoing prolonged therapy. Objective: The aim of this study was to search for
mutations conferring for resistance to anti-viral drugs in the gene coding for reverse
transcriptase (RT) of the HBV and to denote the HBV genotypes in samples of patients with
HBV undergoing either treatment or not from the reference tertiary health unit of the North
Region of Brazil. A fragment of 600 base pairs of the gene RT was amplified and directly
sequenced. Results: A total of 113 samples was nucleotide sequenced. In four of these
samples, the mutation rtM204I (3,54%) was detected in the overlapping region known as the
YMDD of the gene S ((1 (rtA80V/rtM204I), 2 (rtS202L/rtM204I), 4 (rtS202Q/rtM204I) and 13
(rtS202I/rtM204L)). The HBV genotypes identified were the following: A 71,68% (81/113), D
15,04% (17/1130) and F 13,28% (15/113). Of the 26 patients presenting resistant mutations in
the RT region of the HBV, 88,46% are patients naïve of treatment. Of note, 8,8% of the
sequences analyzed showed escaped mutations to vaccine. Conclusion: This study
highlights that to have an efficient prevention and controls strategy, it is necessary to
continuously perform molecular epidemiology of the HBV in the region.
Key words: Resistence, Hepatitis B, Mutation, Genotype
IX
LISTA DE FIGURAS
Figura 1:
Estrutura do VHB (Partícula de Dane)........................................
2
Figura 2:
Genoma do Vírus da Hepatite B.................................................
3
Figura 3:
Países ou áreas de risco para Hepatite B...................................
4
Figura 4:
Diagrama esquemático da estrutura de leitura aberta de
polimerase do VHB ilustrando os quatro domínios funcionais e
os subdomínios 7 catalíticos A-G................................................ 11
Figura 5:
Mutações de resistência aos medicamentos utilizados para o
tratamento da hepatite B crônica................................................ 14
Figura 6:
Fluxograma do processamento das amostras no estudo........... 19
Figura 7:
Quadro de mutações analisadas no Genafor.............................
Figura 1:
Sequencias parciais de aminoácidos do gene S, região que
(Artigo)
codifica antígeno HBsAg, amostras identificadas de 001 a
23
010.............................................................................................. 34
Figura 2:
Reconstrução
filogenética
de
sequencias
nucleotidicas
(Artigo)
correspondente a 600 pb do gene de superfície do
VHB............................................................................................. 35
X
LISTA DE TABELAS
Tabela 1:
(Artigo)
Características da população do estudo..........................................................
Tabela 2:
(Artigo)
Caracterização de Mutações da Região da Polimerase(rt) e gene
Tabela 3:
(Artigo)
30
S.......................................................................................................................
32
Mutações na polimerase, região do YMDD e gene S do VHB.........................
33
XI
LISTA DE ABREVIATURAS
HBcAg
-
antígeno do core do vírus da hepatite B
HBeAg
-
antígeno e do vírus da hepatite B
HBsAg
-
antígeno de superfície do vírus da hepatite B
HBxAg
-
antígeno X do vírus da hepatite B
ALT(TGP)
-
alanina amino transferase
Anti- HBc
-
anticorpo contra o antígeno do core do vírus da hepatite B
Anti-HBe
-
anticorpo contra o antígeno e do vírus da hepatite B
Anti-HBs
-
anticorpo contra o antígeno de superfície do vírus da hepatite B
AST/TGO
-
aspartato amino transferase
dNTPs
-
trifosfato de desoxinucleotídeos
DNA
-
Ácido desoxirribonucleico
EcoRI
-
Enzima endonuclease
FMT-HVD
-
Fundação de Medicina Tropical – Heitor Vieira Dourado
gag
-
Proteína presente no genoma do vírus HIV
HCC
-
Hepatocarcinoma
HIV
-
Vírus da imunodeficiência humana
IgG
-
Imunoglobulina da classe G
IgM
-
Imunoglobulina da classe M
Kg
-
(= kbp) = kilo (quilo) pares de bases = 1.000 bp
LPDE
-
Laboratório de Pesquisa em Doenças Endêmicas
Mg
-
Miligrama
MgCl2
-
Cloreto de magnésio
mM
-
Milimolar
mL
-
Unidade de medida eme-ele
NB3
-
Laboratório Nível de segurança 3
XII
ng
-
Nanograma
pmol
-
Picomol
PCR
-
Reação em cadeia da polimerase
RNA
-
Ácido ribonucleico
U
-
Unidade
UI/L
-
Unidade internacional por litro
VHB
-
Vírus da Hepatite B
µL
-
Microlitro
XIII
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO................................................................................................... 01
1.1 O Vírus da Hepatite B.................................................................................... 01
1.2 Epidemiologia................................................................................................ 04
1.3 Genótipos, subgenótipos e subtipos do vírus da hepatite B ................... 05
1.4 Diagnóstico laboratorial da infecção do vírus da hepatite B.................... 07
1.5 Tratamento para Hepatite B.......................................................................... 08
1.6 Mutação do genoma do vírus da hepatite B............................................... 09
1.6.1Mutação na região da polimerase................................................................
09
1.6.2Resistência Moleculares aos Análogos e Nucleó(t)deos.............................
12
1.6.3Mecanismos moleculares de resistência a antivirais...................................
12
2.OBJETIVOS....................................................................................................... 16
2.1 Geral................................................................................................................ 16
2.2 Específicos..................................................................................................... 16
2. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................. 17
3.1Modelo de Estudo........................................................................................... 17
3.2 Local de Estudo............................................................................................. 17
3.3 Aspectos Éticos............................................................................................. 17
3.4 População de Estudo.................................................................................... 17
3.4.1Critérios de Inclusão...................................................................................... 18
3.4.2Critérios de Exclusão..................................................................................... 18
3.5Procedimento para seleção de pacientes.................................................... 18
3.6Processamento da Amostra no Estudo........................................................ 18
3.7Procedimentos de laboratório....................................................................... 19
3.7.1 Obtenção do DNA e Carga viral do VHB...................................................... 20
3.7.2 Reação da polimerização em cadeia............................................................ 20
3.7.3 Seqüenciamento........................................................................................... 21
3.8 Análise das seqüencias................................................................................ 21
3.9 Genotipagem.................................................................................................. 21
3.10 Análises de mutações de resistência antiviral......................................... 22
3.10.1HepSeq........................................................................................................ 22
XIV
3.10.2Genafor........................................................................................................ 22
3.11 Análises Estatística..................................................................................... 23
4. RESULTADOS.................................................................................................. 24
5.CONCLUSÃO..................................................................................................... 44
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................. 45
ANEXOS................................................................................................................ 51
ANEXO -1 Parecer aprovação Comitê de Ética
52
ANEXO -2 Termo de Consentimento Livre E Esclarecido
53
ANEXO -3 Questionário
55
ANEXO -4 Instruções ao Autor (Normas da Revista)
57
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 O Vírus da Hepatite B
O vírus da hepatite B é classificado como membro da família Hepadnaviridae e gênero
Orthohepadnavirus. Todos os membros da família são hepatotrópicos e compartilham
características estruturais e funcionais. Os demais membros do gênero Orthohepadnavirus
infectam mamíferos inferiores como marmotas, esquilos e macacos. Todos os hepadnavírus
apresentam uma gama de possíveis hospedeiros restrita, além do homem, o VHB somente é
transmissível aos chimpanzés. Os hepadnavírus podem incorporar seu genoma ao núcleo da
célula hospedeira, mas diferentemente dos retrovírus, tal permanência não constitui etapa
essencial da sua replicação.23,29,55
As demais características comuns aos hepadnavírus são
29,51
a) Possuem os menores
genomas virais de DNA conhecidos; b) Genoma constituído de DNA de fita dupla (3 a 3,3kb)
contendo região de fita simples de extensão variável e polaridade fixa; c) Replicação com
envolvimento de transcrição reversa; d) Partículas virais esféricas (40 a 47nm) e envelopadas,
com nucleocapsídeo de simetria icosaédrica; e)
Produção excessiva do antígeno de
superfície; f) Elevada concentração de partículas virais completas e incompletas no sangue e,
em menor concentração, em outros fluidos corpóreos; g) Atividade DNA polimerásica
associada ao vírion; h) Ocorrência freqüente de infecção persistente; i) Associação de
infecção crônica com desenvolvimento de Carcinoma Hepatocelular -HCC.
O VHB diferencia-se de outros vírus humanos por encontrar-se em vasto título de
partículas subvirais viral no soro dos indivíduos infectados. Estas partículas consistem
somente das proteínas superficiais do vírus e pequenas quantidades de lipídios, apresentamse esféricas (20 nm de diâmetro) ou filamentosas (20 nm de diâmetro e comprimento variável)
e podem ser encontradas em quantidades que podem atingir 10 14 partículas/mL (1 mg/mL). O
vírion apresenta-se esférico (partículas com 42 – 47nm) e possui uma bicamada superficial,
sendo a mais externa constituída pelo envelope viral e a mais interna pelo nucleocapsídeo
(Core), contendo uma DNA polimerase RNA dependente (ou seja, uma transcriptase
reversa)23,26(Figura 1)
2
Figura 1: Estrutura do VHB (Partícula de Dane). (adaptado de 2002 James A. Perkins apud
Almeida, 2007).
A microscopia eletrônica forneceu a visão inicial da estrutura do genoma do VHB. Nos
vírions, o genoma apresenta-se circular, constituído por uma fita circular parcialmente dupla
de DNA e associado a DNA polimerase. O VHB apresenta um dos menores genomas dentre
os vírus conhecidos (aproximadamente 3200 nucleotídeos) e a numeração da seqüência
nucleotídica baseia-se no sítio de clivagem da enzima de restrição EcoRI ou em sítios
homólogos, caso o sítio da EcoRI esteja ausente. Outros métodos de numeração também são
empregados, baseados no códon inicial da proteína Core ou na primeira base do RNA prégenômico22,26
O genoma, como encontrado nos vírions, é constituído de uma fita negativa (“antisense”) longa apresentando extremidades 5´ e 3´ definidas e redundância terminal de 7 a 9
bases, e uma fita positiva (“sense”) mais curta, com extensão variável. Em virtude do modo de
maturação do genoma, a porção N-terminal da polimerase viral é encontrada ligada à
extremidade 5´ da fita negativa. Portanto, a fita negativa não é covalentemente fechada. A
estrutura circular é mantido pelo pareamento de bases entre as fitas negativas e positivas. A
extremidade 5’ da fita positiva contém um trecho de RNA (18 nucleotídeos) derivado do RNA
pré-genômico e que representa o sítio de início de síntese da segunda fita de DNA. In vivo, as
3
partículas do VHB são secretadas das células infectadas antes que a fita dupla esteja
completa, restando uma região com 600 a 2100 nucleotídeos de DNA de fita simples nos
capsídeos maduros.22,26
Figura 2: Genoma do Vírus da Hepatite B.23
No genoma VHB são identificadas quatro fases de leitura aberta (ORF´s) definidas e
sobrepostas parcialmente, que resultam na transcrição e tradução de sete diferentes
proteínas, através da utilização de códons iniciais variáveis: S, C, P e X. O gene S, inclui a
região pré-S1, pré-S2 e S. Todos os pares de bases no genoma do VHB estão envolvidos na
codificação de, no mínimo, uma proteína viral: a região S codifica proteínas do antígeno de
superfície encontradas no envelope viral. O Gene C, constituído pela região pré-C e C, é
responsável por codificar os polipeptídios que constituem o nucleocapsídeo viral, antígenos
HBcAg e HBeAg. O Gene P codifica a DNA polimerase viral e o gene X codifica a proteína X
(HBx), que é um potente ativador de transcrição.28
A proteína X é imprescindível para replicação e disseminação in vivo do VHB, ela atua
como um transativador transcricional dos genes virais e uma variedade de genes do
hospedeiro. A modulação pela HBx de transcrição gênica afeta a replicação viral e a função
dos pontos de verificação do ciclo celular do hepatócito. A HBx está relacionada com a
patogenia do hepatocarcinoma em pacientes infectados com VHB.26,30
4
1.2
Epidemiologia
A infecção pelo VHB tem uma distribuição mundial. Estima-se que, atualmente, mais de
2 bilhões da população mundial tenha sido infectada. Destes, aproximadamente 360 milhões
são cronicamente infectadas e em risco de doença grave e morte por cirrose e carcinoma
hepatocelular, doenças que são estimados em causar 500.000 – 700.000 mortes a cada ano
no mundo. Os seres humanos são os únicos reservatórios do VHB. O vírus é altamente
contagioso e é transmitido por exposição percutânea e permucosa, exposição a sangue
infectado e outros fluidos corporais (isto é, fluido seminal e vaginal). Modos comuns de
transmissão incluem-mãe para o bebê, de criança para criança, práticas inseguras,
transfusões de sangue e contato sexual.64
Figura 3: Países ou áreas de risco para Hepatite B (World Health Organization 2012).
O período de incubação é de 75 dias, em média, mas podem variar de cerca de 30 a
180 dias. VHB pode ser detectado no soro 30-60 dias após a infecção e persistem por período
variável de tempo. Em áreas com alta prevalência de hepatite B (> 8% da população HBsAg
positivo), até 20% podem ser cronicamente infectadas. Com base nos critérios sorológicos,
alta prevalência de infecção crônica por VHB é encontrada em áreas sub-saariana, sudeste
da Ásia, no Mediterrâneo Oriental, sul e oeste da ilhas do Pacífico, Amazonia Ocidental e em
partes do Caribe.65,36
5
Hepatite crônica é moderadamente prevalente >2% a <8% da população HBsAgpositivo no centro-sul e ao sul-oeste da Ásia, leste e sul da Europa, Federação Russa e maior
parte da América Central e América do Sul. Na Austrália, Nova Zelândia, Europa setentrional
e ocidental, e América do Norte, a prevalência de infecção crônica por VHB é baixa (<2% da
população HBsAg-positivo). Em áreas de alta endemicidade, VHB é mais comumente
transmitido de mãe para filho no momento do nascimento, ou de pessoa para pessoa no início
da infância. Em países com baixa endemicidade do VHB, forma sexual e do uso de agulhas
contaminadas, especialmente entre usuários de drogas injetáveis, são as principais vias de
infecção. No entanto, a transmissão perinatal pode ser responsável por 15% das mortes
relacionadas com o VHB, mesmo em áreas de baixa endêmicidade.64,14,58,60
1.3 Genótipos, subgenótipos e subtipos do vírus da hepatite B
O desenvolvimento de vacinação, terapia antiviral e técnicas de biologia molecular
levaram ao surgimento e descoberta de variantes do VHB, as quais vêm demonstrando
importância clínica crescente. A variabilidade genética do VHB é observada tanto como uma
expressão da evolução dos genótipos virais, ou seja, o reflexo da divergência do genoma viral
na população portadora, quanto por meio do surgimento de mutações em cada indivíduo
isoladamente analisado.63,35
O antigéno de superfície da hepatite B (HBsAg) é uma lipoproteína do envelope viral
que é produzido em excesso visível e circula no sangue com forma esférica e de partículas
tubular de 22 nm de tamanho. O antigeno HBsAg inclui um epítopo neutralizante, chamado
“determinante”. Outros dois HBsAg determinantes, d/Y e W/R, têm sido descritos, definindo
outros quatro subtipos: adw, adr, ayw e ayr. Certas substituições de aminoácidos dentro deste
epítopo, particularmente na região dos aminoácidos 137-147, pode tornar um determinante
irreconhecível pelos testes de triagem comuns bem como por anticorpos induzidos pela
vacina.64
Apesar do genoma do VHB, ser constituído de DNA de fita dupla, é replicado através
de um RNA intermediário, tornando suscetível a elevada taxa de mutações. As polimerases
dos hepadnavírus não possuem a capacidade de verificação e excisão de bases incorporadas
erroneamente e apresentam taxas de mutação da ordem de 10 -4 a 10-5 substituições de
bases/sítio/ano, ou seja, similares à taxa do gene retroviral gag.24,32
6
Em 1988, Okamoto e colaboradores sugeriram que a variabilidade genética do VHB
poderia ser utilizada na geração de um sistema de classificação que substituísse ou
complementasse a classificação sorológica vigente. No presente, são reconhecidos dez
grupos genômicos (ou genótipos) do VHB, designados A-J, definidos arbitrariamente como
portadores de divergência nucleotídica completa superior a 8%.5,37,46,48,59,70,71 Diversos
estudos têm indicado padrões característicos quanto à distribuição geográfica dos genótipos
do VHB, os quais somente são conhecidos parcialmente devido ao número não representativo
de amostras de algumas partes do globo.
O genótipo A, além de pandêmico, é mais prevalente na América do Norte, Europa
(excetuando região Mediterrânea) e África Central e Meridional. Os genótipos B e C são
característicos dos países asiáticos. O genótipo D, apesar de mundialmente distribuído, é
mais prevalente na região Mediterrânea e Oriente Médio e o genótipo E predomina entre
portadores africanos.1,28,37,47 O genótipo F é considerado próprio dos residentes nas
Américas, verificando-se uma associação forte entre este genótipo e populações nativas das
Américas Central e do Sul. O genótipo F apresenta a mais elevada divergência entre todos os
genótipos21,47 Os genótipos descritos mais recentemente – G, H, I e J,70,71 foram encontrados
na América do Norte e França59 e América Central e México5 respectivamente.
No Brasil, os estudos de levantamento da distribuição regional dos genótipos do VHB
têm sido raros e com número reduzido de amostras. Os genótipos A, D e F foram descritos
entre portadores crônicos acompanhados ambulatorialmente no Rio de Janeiro e entre
pacientes submetidos à hemodiálise em Goiânia e Santa Catarina.43,44,61,62 Entre pacientes
paulistas, os genótipos A, D e F são encontrados, majoritariamente, em indivíduos de
ascendência ocidental, enquanto os portadores dos genótipos B ou C têm sido descritos entre
aqueles de origem asiática56
Entre indígenas da região Amazônica, apenas o genótipo F foi encontrado nas tribos
que não mantinham contato com não-índios, enquanto que o genótipo A foi encontrado nas
tribos com intenso contato com estes.12 Outros estudos conduzidos em portadores do HBsAg,
naturais da Amazônia brasileira, revelou maior prevalência do genótipo A, seguido do
genótipo F e, em menor freqüência o genótipo D e C.49,50,72
7
1.4 Diagnóstico laboratorial da infecção do vírus da hepatite B
Os testes de função hepática, especialmente os níveis séricos da ALT/TGP e AST/TGO
apesar de serem indicadores sensíveis do dano do parênquima hepático, não são específicos
para hepatite. Os exames específicos para o diagnóstico do tipo de infecção são os
sorológicos e os de biologia molecular.39
Para hepatite B aguda: o marcador sorológico HBsAg, é o primeiro que aparece no
curso da infecção e declina a níveis indetectáveis em até 24 semanas. O Anti-HBc IgM é
marcador de infecção recente, encontrado no soro até 32 semanas após a infecção. O AntiHBc Total é marcador presente nas infecções agudas pela presença de IgM e crônicas pela
presença de IgG, que indica contato prévio com vírus. O HBeAg é marcador de replicação
viral, sua positividade indica alta infecciosidade. O Anti-HBe surge após desaparecimento do
HBeAg, indica o fim da fase replicativa. Anti-HBs é o único anticorpo que confere imunidade
ao VHB, está presente no soro após o desaparecimento do HBsAg, sendo indicador de cura e
imunidade, está presente isoladamente em pessoas vacinadas. 39
Na Hepatite B crônica a interpretação dos marcadores sorológicos são: HBsAg,
presente por mais de 24 semanas, o HBeAg enquanto ocorrer alta replicação viral e o
anticopo Anti-HBe positivo, sua presença sugere redução ou ausência de replicação viral
exceto nas cepas com mutação pré-core (não produtoras de proteína “e”).39,8
O DNA do VHB pode ser detectado precocemente na fase aguda da hepatite viral B,
persistindo no soro em altos níveis nas hepatites crônicas acompanhado do HBsAg, e em
casos de hepatites fulminantes, quando o HBsAg estiver ausente (Silva e Carrilho, 2005). Os
testes de carga viral para o VHB podem ter o resultado relatado em números absolutos ou
log10. Sendo que o resultado do exame também pode ser relatado em cópias por mL de
amostra ou em unidades internacionais por mL (UI) de amostra.
As UI surgiram a partir da necessidade de padronização da quantificação, já que uma
amostra
apresentava
resultados
consistentemente
diferentes
quando
se
usavam
metodologias diferentes. Foram então introduzidos padrões de DNA-VHB da Organização
Mundial de Saúde. Desta forma são produzidos pelo National Institute for Biological Standards
8
and Control (NIBSC) controles feitos a partir de amostras positivas para o DNA-VHB com
títulos altos de vírus.53
1.5 Tratamento para Hepatite B
Até recentemente, as opções farmacológicas para o tratamento da hepatite B crônica
(HBC), preconizadas nos Protocolos Clínicos e Diretrizes Terapêuticas para Medicamentos de
Alto Custo do Ministério da Saúde, eram restritas ao interferon e à lamivudina. Atualmente,
três medicamentos antivirais (tenofovir, entecavir e adefovir) ampliam as alternativas de
tratamento para o controle da ação do VHB.40,41
No tratamento o principal objetivo é reduzir o risco de progressão da doença hepática e
de
seus
desfechos
primários,
especificamente
cirrose,
hepatocarcinoma
e,
conseqüentemente, o óbito. Desfechos substitutivos ou intermediários, tais como nível de
VHB-DNA, de enzimas hepáticas e marcadores sorológicos, estão validados e têm sido
utilizados como parâmetros para inferir a probabilidade de benefícios da terapêutica em longo
prazo, haja vista que a supressão da replicação viral de maneira sustentada e a redução da
atividade histológica diminuem o risco de cirrose e de hepatocarcinoma.41
O intérferon α (IFN α) foi à primeira droga aprovada para tratamento da infecção
crônica pelo VHB. O IFNα possui atividade antiviral e imunomoduladora e ambas as ações
mostram-se importantes no tratamento dessa virose. Realizou-se a maioria dos estudos
clínicos com essa medicação, embora o IFNβ, que possui efeito antiviral predominante,
também seja ativo. A terapia com IFNα deve ser considerada em pacientes com hepatite
crônica B, com evidências de replicação viral (HBeAg e VHB-DNA positivos) e doença
hepática ativa, (aminotranferases elevadas e atividade necroinflamatória à biópsia do
fígado).18
A Lamivudina foi o primeiro análogo nucleosídico utilizado no tratamento da hepatite
crônica B. A droga é utilizada por via oral na dose de 100 a 150mg/dia dependendo da
formulação empregada. Em pacientes HBeAg positivos, um ano de uso de lamivudina resulta
em melhora histológica (52% dos casos), queda do DNA-VHB sérico (44% dos casos),
soroconversão HBeAg para anti-HBe (17% dos casos) e normalização da ALT (41% dos
casos); se a droga é suspensa antes da soroconversão, todos os pacientes recidivam, com
9
retorno da replicação viral; portanto, tratamento a longo prazo é necessário na maioria dos
doentes.18
Assim como o HIV é resistente aos antivirais, o uso prolongado da lamivudina leva ao
desenvolvimento de VHB resistente. A freqüência de VHB resistente pode variar de 17-46%
no primeiro ano, até 67 a 75% no terceiro e quarto anos de tratamento contínuo. Apesar da
alta prevalência de VHB resistente à lamivudina, parece não haver maiores complicações em
pacientes imunocompetentes. Entretanto, o VHB resistente pode levar a uma hepatite grave
em pacientes co-infectados com HIV. Após transplante hepático, VHB resistente pode estar
associado à fibrose hepática e processo necroinflamatório importante. 27
A terapia combinada de duas drogas pode melhorar os efeitos antivirais, permitindo utilizar
doses menores e diminuindo os efeitos colaterais, e com possibilidade de menor ou retardo
do aparecimento de vírus resistentes. Pode ser usado simultâneo ou seqüencial, a escolha vai
depender do entendimento dos mecanismos de ação dos antivirais.18,33
As principais vantagens dos análogos de nucleosídeos/nucleotídeos são administração
oral e supressão expressiva da carga viral. Com relação aos demais parâmetros de avaliação,
são em geral, semelhantes ou levemente superiores à Lamivudina. Como desvantagens
ressaltam-se a indefinição da duração do tempo necessário para sustentar a resposta ao
tratamento. Além disso, o risco da resistência antiviral tem demonstrado aumento com a
duração da terapia antiviral.3
1.6 Mutação do genoma do vírus da hepatite B
1.6.1 Mutação na região da polimerase
A polimerase do VHB é uma proteína multifuncional que tem quatro domínios: uma região
de iniciação, uma região espaçadora de função desconhecida, uma região catalítica que
funciona como uma RNA-polimerase dependente de RNA-polimerase/DNA-polimerase e uma
região carboxi-terminal que possui a atividade da ribonuclease H (Figura 3A). Apesar da
estrutura cristalina da polimerase do VHB ser desconhecida, grande parte da sua estrutura foi
deduzida a partir da transcriptase reversa do vírus da imunodeficiência humana (HIV-1 RT),
com base na sua homologia. Independentemente das suas sequências de aminoácidos e
10
diferenças de estrutura do domínio, todas as polimerases parecem ter uma configuração com
a mão direita comum com o polegar, a palma da mão, e um domínio de dedos (Figura 3B). O
domínio de palma parece ser o local ativo e catalisa a reação de transferência de fosforilo, o
domínio de dedos facilita a interação com os dNTP de entrada, bem como a base de molde a
que se encontra emparelhado, e o domínio de polegar pode desempenhar um papel no
posicionamento do DNA duplex , processabilidade e translocatição. Análogos Nucleosídeos e
dNTPs se ligam em um local que está localizado no subdomínio palma ao lado o terminal = 3
do iniciador strand. Uma propriedade interessante da polimerase de VHB parece ser a sua
preferência por nucleótidos com a configuração L, em contraste com outras polimerases que
preferem nucleótidos com a configuração D.67
A região catalítica pode ser subdividida em sete domínios: A-G (Figura 3A). Comparando
o domínio A do HIV-1 RT que está em estreita proximidade com os dois aspártico de resíduos
de ácido do domínio C e forma parte integrante da ligação do dNTP. Resíduos neste domínio
estão envolvidos na coordenação da porção de entrada do trifosfato dNTP e os íons de
magnésio. Domínio B do VHB RT forma uma hélice com uma região do laço e está envolvida
no posicionamento da fita do inicio ao fim da região do domínio catalítico. O domínio C
contém uma sequência de 4 aminoácidos, tirosina, aspartato, metionina e aspartato (YMDD),
que é altamente conservada entre as polimerases virais/transcriptase reversa que se liga a
dois íons de magnésio e representa o local ativo das enzimas. No HIV-1 RT, resíduos dentro
do domínio D, pode contribuir para ligação local do dNTP e mutações neste domínio podem
afetar indiretamente a geometria do sitio de ligação do dNTP. O domínio E faz parte do sítio
de ligação do iniciador molde, entre a palma da mão e o polegar, posição rtM230 e rtG231. Os
resíduos de metionina e glicina presentes no domínio E são conservados em todos os
isolados do VHB. Domínios F e G são após do domínio A. Esta região pode estar envolvido
na interacção com o dNTP de entrada e também com o modelo de nucleótidos.
11
Figura 4. (A) Diagrama esquemático da estrutura de leitura aberta de polimerase do VHB ilustrando os
quatro domínios funcionais e os subdomínios 7 catalíticos A-G. (B) a estrutura proposta para a
polimerase de VHB com base no modelo de HIV-1 RT e adaptado de Das et al 68 Bartholomeusz.
Como ilustrado neste diagrama de fita, a polimerase do VHB tem uma configuração com a mão direita,
com o polegar, de palma, e domínios dedos. As posições aproximadas dos os domínios conservados
A-E são mostradas pelas fitas coloridas domínios A, C, D e talvez participam diretamente no dNTP de
ligação e catálise. Domínios B e E são envolvidos com um posicionamento preciso do iniciador-molde
em relação ao local ativo. (C) Localização das principais mutações da lamivudina em relação aos
domínios conservados. (D) Localização do adefovir e as mutações de tenofovir em relação aos
domínios conservados. (E) Localização das principais mutações de entecavir em relação aos domínios
conservados
12
1.6.2 Resistência Moleculares aos Análogos de Nucleos(t)ídeos
O VHB tem uma elevada taxa de replicação, com 1012 virions produzidos por dia e uma
taxa de mutação de aproximadamente 105 substituição/base/ciclo. Isso se traduz em cerca de
1010-11 mutações pontuais produzidos por dia em indivíduos com replicação ativa. Uma vez
que o genoma do VHB tem apenas 3200 pares de base, todas as alterações possíveis podem
ser produzidas em uma unica-base, por dia. A transcriptase reversa do VHB não têm uma
função de revisão para reparar os nucleótidos incorrectamente incorporados. Portanto, as
mutações podem ocorrer muito rapidamente. A probabilidade de uma mutação ser
selecionadas durante a terapia depende da capacidade que o fármaco tem para suprimir a
replicação viral. Por isso, um medicamento com atividade antiviral baixa, não exercem
pressão seletiva substancial sobre o vírus, e a probabilidade de resistência à droga não é alta.
Por outro lado, a supressão completa da replicação viral permite pouca oportunidade para
resistência a surgir devido a mutagénese é a replicação dependente.69
Os Análogos Nucleos(t)ídeos por afetar a cadeia de cccDNA de alguma forma importante
inibem a replicação viral, sem contudo, eliminar os vírus existentes. Por outro lado,
monoterapia que exerça modesta atividade antiviral e dirigidas a um único local alvo resulta
em maior probabilidade de seleção de resistência viral a drogas. O regime de tratamento ideal
deve ter atividades antivirais dirigidos a locais diferentes para reduzir o risco de seleção das
espécies resistentes a drogas. Resistência surge quando a replicação ocorre mesmo na
presença de drogas. Portanto, se nós podessemos conseguir a supressão completa da
replicação, a resistência não seria um problema. Outros fatores que contribuem para o
surgimento de resistência a fármacos são barreiras genética para o desenvolvimento de
mutações, o mecanismo de resistência à droga, o espaço a replicação viral e fatores
relacionados ao hospedeiro envolvidos no controle da replicação viral.69
1.6.3 Mecanismos Moleculares de Resistência às Drogas
O VHB é um vírus DNA pequeno, que apresenta relativamente poucos alvos
específicos para intervenções antivirais. No presente, o alvo de escolha é a proteína
polimerase, uma enzima que desempenha um papel essencial na replicação viral. Dentro de
suas quatro regiões funcionais, a resistência da droga a lamivudina está associada a
mutações na polimerase, isto é, no sitio conservado do domínio catalítico da transcriptase
13
reversa do gene P, localizado especificamente no locus de quatro aminoácidos consistindo de
tirosina-methionineaspartate aspartato, denominado o motivo YMDD. Nessa região a
lamivudina age na supressão da replicação viral. Dado que o VHB pode gerar até 1012
virions/dia
22,
e que a partir dessa pressão seletiva exercida pela administração de lamivudina
a longo prazo sobre o vírus favorece o surgimento de vírus mutantes.
Quando ocorrem mutações, a configuração do motivo YMDD do tipo selvagem altera
de tal forma que o medicamento já não exerce com sucesso sua ação inibitória no local. De
forma que ambas as estirpes do vírus (selvagem e resistente) preenchem o fígado infectado.
O HBV DNA e os níveis de ALT geralmente começam a recuperar, mas são geralmente mais
baixos em comparação com os níveis da linha de base, quando apenas o vírus de tipo
selvagem é encontrado. Três mutações chaves no gene da polimerase têm sido mostradas
conferindo resistência a lamivudina e adefovir dipivoxil (Figura 2), embora muitas outras
mutações também foram descritas. No que diz respeito à nomenclatura recentemente
adoptada para o VHB mutações na região da polimerase. Os dois primeiros incluem a
substituição de metionina (M), pelo aminoácidos isoleucina (I) ou valina (V) no motivo YMDD
(domínio C) na posição rtM204V/I. Na maioria dos casos, estas mutações no motivo YMDD
ocorrem em conjunto com uma mutação adicional de compensação no subdomínio B, isto é, a
substituição de uma leucina por metionina cerca de 20 aminoácidos a além do domínio de
YMDD na posição rtL180M. Finalmente, o mutante descoberto recentemente para adefovir
(rtN236T) está localizado antes do motivo YMDD no domínio D da polimerase viral.
Assumindo que a adesão do paciente ao tratamento acarreta resistência à terapia antiviral é
presentemente definido como (i) um aumento dos títulos de HBV DNA no soro durante a
terapia, depois de uma resposta virológica sustentada, e (ii) seleção de uma mutação no gene
da polimerase viral (motivo YMDD da polimerase do domínio C), que não pôde ser detectado
nos principais espécies virais antes da terapia, e que é não incluídos nas sequências
consenso de HBV de bancos de dados (isto é, resistência genotípica).67
A administração prolongada de lamivudina frequentemente provoca resistência viral
caracterizada por uma replicação viral em um paciente aderente. A incidência de resistência a
lamivudina é de 14% a 32% após 1 ano de tratamento, 38% após 2 anos, e 53% a 76% após
3 anos. As principais mutações associadas com resistência a lamivudina estão localizados no
domínio C do motivo YMDD. São rtM204V (sequência YVDD), rtM204I (YIDD) e os rtM204S,
mais recentemente identificado (YSDD).
14
Os VHB lamivudina mutantes resistentes com substituições de aminoácidos no motivo
YMDD aparecem para replicar de forma menos eficiente do que o vírus de tipo selvagem, in
vitro. No entanto, as substituições adicionais que são selecionadas simultanêamente com as
substituições de resistência à transcptase reversa na posição 204 do domínio C, tais como
rtL180M e rtV173L, localizadas no domínio B, pode compensar essa perda de eficiência da
replicação in vitro.17
O desenvolvimento de resistência ao adefovir no primeiro ano de tratamento é
excepcional, mas após 5 anos de uso da medicação, 29% desenvolvem mutações de
resistência (N236T e A181V/T), que se refletem por aumento dos níveis de DNA-VHB séricos
e da ALT.18
Figura 5: Mutações de resistência aos medicamentos utilizados para o tratamento da hepatite B crônica.33
Entecavir também mostrou-se ativo em pacientes portadores de VHB resistentes à
lamivudina; em um estudo que incluiu 181 pacientes portadores de VHB com mutações no
lócus YMDD da polimerase viral, usando diferentes doses (0,1; 0,5; e 1mg/dia) de entecavir,
foram testadas e comparadas com a lamivudina. Na semana 24 do tratamento o percentual
de pacientes com DNA-VHB indetectável foi 19% com 0,1mg/dia, 53% com 0,5mg/dia e 79%
com 1mg/dia comparado com 13% do grupo recebendo lamivudina. Portanto, 1mg/dia parece
ser a dose ideal para tratar cepas resistentes a lamivudina. Ao contrário do observado em
cepas sensíveis, resistência ao entecavir (9%) tem sido observada em pacientes com
mutantes resistentes a lamivudina (mutações nas posições 184, 202 e 250).18
Apesar do sucesso alcançado com a introdução dos programas de vacinação desde
1982, a infecção pelo vírus da hepatite B ainda representa uma das patologias infecciosas
mais desafiadoras à saúde pública mundial, causando elevados índices de morbidade e
15
mortalidade. A cada ano, estima-se que acima de um milhão de pessoas morrem em
decorrência de patologias relacionadas à evolução da infecção crônica pelo vírus B, sendo a
hepatite B considerada a sétima entre todas as causas de óbitos no mundo. A falta de
informações relativas ao tema dificulta, portanto, a definição de ações específicas nessa área
de atendimento clínico. A necessidade urgente de informações que subsidiem as intervenções
clínicas e terapêuticas necessárias a esse grupo de pacientes, justificou a realização desse
estudo que se propôs avaliar mutações de resistência na região da polimerase (domínio da
transcriptase reversa) do genoma do vírus da hepatite B em isolados de pacientes
procedentes da demanda espontânea da Fundação de Medicina Tropical – Heitor Vieira
Dourado.
16
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Investigar possíveis mutações associadas à resistência antiviral em portadores de
Hepatite B Crônica atendidos na a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado.
2.2 Específicos
- Pesquisar mutações no gene da polimerase relacionadas à resistência antiviral em
amostras de pacientes portadores de hepatite crônica pelo VHB;
- Caracterizar os genótipos do VHB em amostras de portadores de Hepatite B crônica;
- Verificar possíveis associações entre a pesquisa de mutações de resistência antiviral x
carga viral do VHB x genótipos do VHB.
17
3
MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Modelo de Estudo
Estudo do tipo descritivo que visou à investigação de mutações de resistência do VHB
associadas ao tratamento em portadores de hepatite B crônica.
3.2 Local de Estudo
O estudo foi conduzido na cidade de Manaus, capital do estado do Amazonas, na
Gerência de Virologia da Fundação de Medicina Tropical – Dr. Heitor Vieira Dourado (FMTHVD), uma unidade Terciária de saúde referência no atendimento das doenças infecciosas
e parasitárias, para a região Amazônica Ocidental brasileira e, especializada no
atendimento, diagnóstico e tratamento dos portadores de doenças hepáticas agudas e
crônicas, causadas pelos vírus das hepatites. Neste complexo está instalado o Laboratório
da Rede de Carga Viral da Hepatite B do programa Nacional de DST, AIDS e Hepatites
Virais do Ministério da Saúde, e ainda possui o Laboratório de Pesquisas em doenças
Endêmicas – LPDE.
3.3 Aspectos Éticos
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Fundação
de Medicina Tropical – HVD (Res. CNS196/96) processo n° 0019/2011-CEP/FMT-HVD. Com
o título “Caracterização genotípica do vírus da hepatite B e investigação de mutações de
resistência associadas aos antivirais em isolados de pacientes no Estado do
Amazonas”. (Anexo-1)
3.4 População de Estudo
A população alvo deste estudo foram indivíduos portadores de Hepatite B crônica que
fazem acompanhamento na FMT-HVD no ambulatório de DST, AIDS e Hepatites Virais e que
solicitaram exame de carga viral, no período de novembro de 2010 a dezembro de 2011.
18
3.4.1 Critérios de Inclusão
Foram utilizados os seguintes critérios:
- Pacientes que realizaram exames de carga viral;
- Ser portador do VHB independente do quadro clínico de infecção (cirrose hepática,
hepatocarcinoma ou portador assintomático);
- Pacientes em tratamento antiviral ou não;
- Concordaram com Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE).
3.4.2 Critérios de Exclusão
Foram excluídos desde estudo os indivíduos com as seguintes características:
- Co-infecções com os vírus: Hepatite D, Hepatite C, HIV;
- Carga Viral do VHB abaixo de 350 UI/mL;
- Amostra insuficiente;
- Não aceitaram participar do estudo.
3.5 Procedimento para seleção dos pacientes
Os pacientes foram convidados a participar do estudo no momento do atendimento
médico no ambulatório de hepatite da FMT-HVD. Após serem esclarecidos dos objetivos da
pesquisa, benefícios e confiabilidade dos registros e aceitarem participar do estudo,
assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo-2) e preencheram
um questionário padronizado e individual (Anexo-3). Outras informações complementares ao
estudo foram coletadas nos prontuários do banco de dados electrônico (I-Doctor).
3.6 Processamento das Amostras no Estudo
De acordo com os registros do Banco eletrônico I-Doctor, foi identificado 911 registros de
pacientes HBsAg positivo que realizaram o exame de Carga Viral no período de Novembro de
2010 á Dezembro de 2011. Utilizando os critérios de exclusão, 152/911 amostras de DNA
VHB foram submetidas a amplificação por PCR e semi-Nested PCR, destas 26 amostras
19
foram negativas e 126 amostras foram positivas e posteriormente sequenciadas. Segue
abaixo fluxograma do processamento das amostras:
N=911
Nov 2010 à Dez 2011
Critérios de
Exclusão
Co-Infecção
N= 275
Carga Viral<350 UI/mL
N=714
Não Encontrada
N=45
N=152
PCR e PCR
semi-Nested
TopTaq Master Mix
Eletroforese
1200pb/680pb
DNA-VHB (-)
N=26
DNA-VHB (+)
N=126
Sequenciamento
Direto
N=126
Análise
Filogenéticas e
mutações
ABI3130xl
N=113
Figura 6: Fluxograma do processamento das amostras no estudo.
3.7 Procedimentos de laboratório
Os procedimentos laboratoriais foram realizados no Laboratório da Gerência de Virologia
e Laboratório de Pesquisas de Doenças Endêmicas da FMT-HVD. Como técnica de detecção
molecular foi utilizada a reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando iniciadores
específicos para o VHB desenvolvidos e padronizados neste laboratório. Foram selecionados
os iniciadores 2821, 783 e P1 (Oliveira, 2007). Que amplificam o gene S completo e a região
20
de interesse do gene da polimerase (1.200 nucleotídeos). As características gerais do ensaio
são sumarizadas a seguir:
3.7.1 Obtenção do DNA e Carga viral do VHB
O DNA VHB utilizado neste estudo foi procedente da rotina do Laboratório da Rede de
Carga Viral da Hepatite B do Programa Nacional de DST, Aids e Hepatites Virais do Ministério
da Saúde da FMT-HVD. A extração do DNA foi realizada no sistema automatizado Cobas
AmpliPrep/TaqMan (CAP/CTM) v.2,0, Roche Diagnostic para processamento do exame de
carga viral do VHB.
3.7.2 Reação da polimerização em cadeia
O DNA viral foi amplificado pelo sistema de “semi-nested” PCR, sendo a primeira reação
de PCR realizada com 5 μL do DNA procedente do Cobas AmpliPrep/TaqMan, e os
iniciadores 2821 e 783. Na segunda PCR foi usado 1 L do produto da primeira reação com
os iniciadores P1-783. O fragmento resultante da primeira amplificação foi 1.200 pb,
corresponde ao gene S completo (regiões pré-S1, pré-S2 e S). O fragmento da segunda
amplificação corresponde a 680 pb (região da polimerase).
Os ensaios da PCR foram realizados em um volume final de 25 μL contendo: 12,5 μL
máster mix TopTaq (250U) (QIAGEN), 0,4pmol de cada iniciador e água RNase free para
completar o volume. As condições de amplificação foram: um ciclo de 94ºC – 5 minutos e 35
ciclos (94°C - 30 seg, 57,1°C – 2min, 72°C – 30 seg), seguidos de uma extensão final a 72°C
por 7 minutos, na primeira reação e na segunda reação, um ciclo de 94ºC – 2 minutos e 35
ciclos (94°C - 30 seg, 57,1°C – 30 seg, 72°C – 1 mim), seguidos de uma extensão final a 72°C
por 5 minutos, em termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient.. Os produtos amplificados
por PCR foram analisados por corrida eletroforética em gel de agarose 1,5%. O gel foi corado
por brometo de etídio (10 mg/ml), visualizado com luz ultravioleta e fotografado para
documentação.
21
3.7.3 Seqüenciamento
As reações de seqüenciamento foram realizadas utilizando 1-3 µL de produto de PCR,
0,33pmol do iniciador P1, 2,0 µL tampão 5x, 1,0 µL de Big Dye Terminator v.3.1 Cycle
Sequencing Kit (Applied Biosystems) e água para completar o volume final de 10µL. As
reações foram realizadas em termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient. Os produtos da
PCR foram purificados utilizando kit X-Terminator (Applied Biosystems), de acordo com as
recomendações do fabricante. O seqüenciamento genético realizado no equipamento DNA
Analyzer ABI 3130XL (Applied Biosystems).
3.8 Análise das seqüencias
A edição das seqüências nucleotídicas foi feita utilizando os algoritmos do pacote
BioEdit. As seqüenciada foram alinhadas com seqüências padrões obtidas no GenBank
(http.//www.ncbi.nlm.nih.gov).
A validação da qualidade e montagem das seqüências consenso foi realizada utilizando
o programa Phred-Phrap-Consed. Posteriormente, foi montada uma seqüência concenso das
fitas sense e anti-sense no programa Consed. As seqüência obtidas foi depositadas no
GenBank.
3.9 Genotipagem
Para caracterização dos genótipos do VHB as sequencias obtidas foram submetidas à
análise filogenética utilizando o programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis)
versão 5.0. Para construção da árvore filogenética adotando o método estatístico de
Neighbor-Joining incluindo as substituições do tipo transições + transversões. Para o teste de
confiabilidade da topologia da árvore filogenética foi adotado o método não paramétrico de
replicações Bootstrap com percentual mínimo de 50% e 500 replicações.
22
3.10 Análises de mutações de resistência antiviral
Para identificação de mutações de resistência aos antivirais as seqüência serão alinhadas
juntamente com seqüências de referência nos programas de analise filogenéticas virtuais
descritos abaixo:
3.10.1 HepSeq
HepSeq é um programa que foi desenvolvido especificamente para fenotipagem virtual de
isolados de VHB. Possui um grande banco de dado, globalmente disponível para um acesso
rápido, baseado em entrada de sequencias de ácidos nucleicos ou sequencias de
aminoácidos de isolados clínicos de VHB. Usuários registrados podem acessar o programa
on-line e introduzir as sequencias no web site: http://www.hepseq.org/Public/Web_Front/main.php
O Programa procura por homologia entre as sequencias de entrada com as outras já
armazenadas no banco de dados, correlacionando dados de fenotipagem, história clínicas, a
determinação do genótipo e subgenótipos, reportando quaisquer mutações descobertas,
destacando aqueles que já se sabem ter significados clínicos. O banco de dados atualmente
possui aproximadamente 3048 isolados clínicos de 2.924 pacientes e inclui mais de 3.743
sequencias diferentes de VHB em que aproximadamente 90.000 variações foram
identificadas. 66
3.10.2 GENAFOR
O nome completo é “Gesellsschaft für Forschung eV nachhaltige”, em inglês.
GENAFOR - Sociedade de Pesquisa sustentado. GENAFOR é uma sociedade científica sem
fins lucrativos, o chamado'''' eingetragener Verein (eV) sob a lei alemã. Foi fundada por
cientistas no ano de 2002 e está aberto a cientistas de todos os países que aceitam os seus
estatutos; estatutos oficiais do GENAFOR em alemão pode ser encontrado no web site:
http://www.genafor.org/about.php, sua sede encontra-se em Bonn, Alemanha. Ao submeter a
seguir uma sequência de DNA de HBV gene-pol / gene-superfície irá obter um alinhamento da
sequência com a sequência de consenso de HBV genótipo D, ou, alternativamente, a uma
sequência de consenso do respectivo genótipo, uma lista das mutações de acordo com
a transcriptase reversa do domínio pol gene e a SHB proteína da superfície do gene, e as
23
previsões de resistência fenotípica do vírus respectivo a cinco drogas anti-retrovirais.Fig
7 Nota que para previsões confiáveis as seqüências devem conter uma parte substancial do
domínio da RT, nenhuma decisão clínica deve ser baseado apenas no resultado do algoritmo
usado.
Figura 7: Resistência fenotípica do VHB a cinco drogas anti-retrovirais.e suas posições.
3.11 Análise Estatística

As possíveis associações entre os genótipos e as variáveis investigadas, e a presença
de mutações relacionadas à resistência antivirais foram analisadas em duas etapas:

Análise univariada – teste t de student e X²;

Análise multivariada – regressão múltipla foram estudadas as variáveis que
apresentaram p<0,20, pela análise univariada.
Obs. Os resultados serão apresentados em forma de artigo segundo formatação da revista.
24
4. RESULTADOS
Mem Inst Oswaldo Cruz
Caracterização genotípica e fenotípica do VHB
Caracterização genotípica e fenotípica do vírus da hepatite B em pacientes da Amazônia
Ocidental brasileira.
Renata da Silva Galvão1,2, Wornei Silva Miranda Braga1,2, Márcia da Costa Castilho1,2, Heline Lira
Vasconcelos2, Joelma Martins Rocha1, Suellen Silva e Silva 2, Cíntia Mara Costa de Oliveira1,2,3
Programa de Pós Graduação em Medicina Tropical, Universidade do Estado do Amazonas, Manaus,
AM, Brasil1 Gerência de Virologia, Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado,
Manaus, AM, Brasil2 Centro de Apoio Multidisciplinar, Universidade Federal do Amazonas, Manaus,
AM3.
RESUMO
A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) representa um importante problema de Saúde Pública
mundial, um dos maiores desafios enfrentados durante o tratamento da infecção crônica pelo VHB é o
surgimento de vírus resistentes às drogas usadas. O surgimento de mutações em regiões especificas do
gene da DNA polimerase têm sido extensivamente correlacionadas à resistência aos anti-virais, uma vez
que possibilita o reaparecimento do DNA do vírus no soro, principalmente em indivíduos submetidos a
terapia prolongada. Neste estudo, nos propomos investigar mutações de resistência no gene da
transcripatase reversa (RT) do VHB e caracterizar os genótipos em amostras de pacientes tratados e não
tratados com antivirais, atendidos em uma Unidade Terciária de Saúde referência da região norte do
Brasil. Uma região de 600pb da RT foi amplificada pela PCR e diretamente sequenciada. Foram
sequenciadas 113 amostras, destas quatro (3,54%) apresentaram a mutação rtM204I tanto na região
YMDD como no gene S ((1 (rtA80V/rtM204I), 2 (rtS202L/rtM204I), 4 (rtS202Q/rtM204I) and 13
(rtS202I/rtM204L)). Os genótipos identificados foram A 71,68% (81/113), D 15,04% (17/1130) e F
13,28% (15/113). Dos 26 pacientes que apresentaram mutações de resistência na região rt do VHB,
88,46% eram pacientes não tratados. Verificou-se também que 8,8% das sequencias virais analisadas
apresentavam mutações de escape de vacina. Esses resultados mostram que embora as estratégias de
prevenção e controle sejam eficazes há necessidade de investigação constante e exaustiva sobre
epidemiologia molecular do VHB na região.
Palavras Chaves: Hepatite B, Mutação, Resistência, Genótipo, Brasil.
Suporte financeiro: CAPES, CNPq, Departamento de DST, Aids e hepatites virais/MS.
Autor Correspondente: [email protected]
25
INTRODUÇÃO
Apesar do sucesso alcançado com a introdução dos programas de vacinação desde 1982, a
infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) ainda representa uma das patologias infecciosas mais
desafiadoras à saúde pública mundial, causando elevados índices de morbidade e mortalidade (Lok &
McMahon, 2007) (WHO, 2011).
O vírus da hepatite B tem elevada taxa de replicação, com 1012 virions produzidos por dia e uma
taxa de mutação de aproximadamente 105 substituição/base/ciclo. O equivalente a cerca de 1010-11
mutações pontuais produzidos por dia em indivíduos com replicação ativa (Sablon & Shapiro, 2005).
A replicação do VHB é um processo muito complexo, inclui um evento de transcrição reversa com
a produção de um RNA intermediário, chamada RNA pregenomico (pgRNA) (Gao & Hu, 2007).
Durante a síntese da fita negativa do DNA pela polimerase/transcrição reversa podem ocorrer erros
originando mutações do genoma viral, resultando na coexistência de espécies genéticas virais distintas
em indivíduos infectados (quasispecies) (Grimm, 2011). Como a enzima transcriptase reversa do VHB
não possui função revisora dos nucleotídeos incorretamente incorporados e seu genoma é muito
pequeno com cerca de 3200 nucleotídeos, todas as alterações possíveis podem ser produzidas em uma
única-base, por dia (Girones & Miller, 1989) (Ljunggren et al. 2002).
A polimerase do VHB é dividida em uma proteina terminal, uma região espaçadora (spacer),
transcriptase reversa (RT) e a Rnase H. Há tempos, combinações de mutações no gene da RT do VHB
têm sido extensivamente estudadas mostrando estreita relação com resistência às drogas antivirais
(Hussain & Lok, 1999; Zhao et a, 2012; Lee et al, 2014). As mutações de importancia clínica ocorrem
nos domínios B, C ou D da RT (Zoulim & Locanini, 2009; Kwon & Lok, 2011). A probabilidade de
uma mutação ser produzida durante a terapia antiviral depende da capacidade que o fármaco tem para
suprimir a replicação viral, portanto, um medicamento com atividade antiviral baixa, não exerce pressão
seletiva substancial sobre o vírus, e a probabilidade de resistência à droga é reduzida. Por outro lado, a
supressão completa da replicação viral não permite resistência devido à mutagénese ser replicação
26
dependente. Analagos núcleos(t)ide (NA) e Interferon são usados na inibição da replicaçao viral. No
entanto, tratamentos prolongados aumentam a chance de resistencia às drogas, podendo levar ao
fracasso do tratamento. A resistência virologica é definida com base no aumento de 1 Log (10 vezes) o
nível de DNA VHB no soro após 6 meses de tratamento. A lamivudina (LAM), adefovir (ADV),
telbivudina (LDT) e entecavir (ETV) ter sido amplamente usados, enquanto tenofovir e adefovir (TDF)
foram mais recentemente introduzidos (Chao & Hu, 2013; Soriano & McMahon, 2013). As mutações
rtM204I/rtM204V envolvem a substituição metionina para valina ou isoleucina isoladas (3) e rtM204Q
simultânea com rtM204I/V, rtA181T, rtL180M, rtT184I são as que aparecem com maior taxa de
incidência (Liu et al, 2014).
Estudos mostram que o uso de drogas análogos nucleos(t)ídeos inibem a replicação viral e o
risco de transmissão de VHB, mas não eliminam o vírus completamente. Monoterapias que exercem
modesta atividade antiviral resultam em maior probabilidade de seleção de virions resistentes às drogas.
Por outro lado, terapias com potentes drogas antivirais parecem reduzir o risco de seleção de espécies
resistentes (Sablon & Shapiro, 2005). Portanto, a determinação da atividade viral durante o regime de
tratamento é importante para avaliar a adesão ao tratamento e o risco de surgimento de populações de
vírus resistentes aos medicamentos.
Outro fator importante, é que durante a terapia de longo prazo, mutações podem ocorrer não só
no gene da polimerase, mas também no gene S, resultando no surgimento de mutantes na superfície da
proteína. Dois tipos de mutantes de superfície são reconhecidos. O primeiro como resultado de
substituições de aminoácidos, causando mutações de resistência primária e compensatória no gene da
polimerase e gene S, simultaneamente; o segundo tipo ocorre devido à supressão viral prolongada
levando a eliminação (seroclearance) do antígeno de superfície do VHB (HBsAg), podendo selecionar
mutantes de escape de vacina. O segundo tipo de mutantes não possuem mutações de resistência
primária do gene da polimerase. Algumas mutações no gene S relacionadas ao uso de drogas são
27
mutações nonsense e levam a truncagem das proteínas de superfície. Entre elas, a rtA181T/sW172 que
tem efeito negativo dominante na secreção, bem como um aumento do potencial oncogénico.
Devido às altas taxas de mutação no DNA-HBV, o vírus pode ser classificado 10 genótipos com
um padrão de divergência genômica intergrupo >8% considerando sequencias do genoma completo e
>4% em sequencias do gene S (Okamoto, 1988), (Arauz-Ruiz et al. 2002), (Tatematsu et al. 2009), (Yu,
2010). Baseados nessa taxa são conhecidos dez genótipos do VHB, designados A-J. Distribuídos de
acordo com as características geográficas da população, o genótipo A, é pandêmico, porém mais
prevalente na América do Norte, Europa (excetuando região Mediterrânea), África Central e Meridional;
os genótipos B e C são característicos dos países asiáticos; o genótipo D é mundialmente distribuído,
sendo mais prevalente na região Mediterrânea e Oriente Médio; o genótipo E predomina entre
portadores africanos (Kidd et al. 2002), (Magnius & Norder, 1995), (Norder, 1993); genótipo F
apresenta a mais elevada divergência entre todos os genótipos (França, 2004; Norder, 1993) sendo
considerado próprio das Américas, verificando-se uma associação forte entre este genótipo e populações
nativas da América Central e do Sul (Mello1 et al, 2013) ; os genótipos G e H são encontrados na
América do Norte e na França (Stuyver, 2000), América Central e México (Arauz, 2002); I e J foram
descritos na China e no Japão, respectivamente (Tatematsu, 2009) (Yu, 2010).
Os objetivos deste estudo foi caracterizar padrões de mutações, genótipos e sub-genótipos do VHB
em pacientes monoinfectados tratados e não trados com drogas antivirais.
MATERIAL E MÉTODOS
Pacientes- Foram incluídos no estudo pacientes de ambos os sexos, maiores de 18 anos, HBsAg
positivos, com e sem uso de medicamento antiviral e carga viral >superior a 350UI/mL, esse último
parâmetro foi estabelecido baseado na experiência previa do grupo na amplificação do genoma VHB.
Todos os pacientes foram referenciados do ambulatório de hepatites virais da Fundação de Medicina Dr.
Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), atendidos de acordo com o Protocolo Clínico e Terapêutico para
28
Tratamento da Hepatite B crônica e co-infecções (MS, 2009a). O estudo foi aprovado pelo Comitê de
Ética em Pesquisa da FMT-HVD, processo n° 0019/2011-CEP/FMT-HVD e conduzido no período de
novembro de 2010 a dezembro 2011. Os dados sócios demográficos referentes à idade, procedência e
gênero, bem como os dados clínicos, bioquímicos (níveis de ALT) e sorológicos, foram coletados no
banco dados eletrônico I-Doctor (FMT-HVD).
Extração do DNA-VHB - O DNA HBV utilizado neste estudo foi processado usando 650 µl de soro
no sistema automatizado COBAS® AmpliPrep Instrument (Roche Diagnostic, US-IVD).
Carga viral do VHB – Os resultados de quantificação dos níveis de HBV-DNA no soro foram
obtidos no Laboratório da Rede de Carga Viral de Hepatite B do Programa Nacional de DST, Aids e
Hepatites
Virais
do
Ministério
da
Saúde
instalado
na
FMT-HVD,
usando
COBAS®
AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV Test, v2.0 (Roche Diagnostic,USA), com intervalo de detecção
de 20 a 1.7E+08 IU/ml. Após quantificar os níveis de HBV-DNA os extraídos foram armazenados em
freezer -70oC para posterior análise por PCR convencional.
Amplificação do DNA BHV por PCR - Para amplificação da região S/Pol/Rt foram realizadas duas
reações de PCR, a primeira usando 5.0 μl do DNA e 0.4 pmol de cada um dos primers, sense 2821 (5'GGG TCA CCA TAT TCT TGG GAA CA-3’) e anti sense 783 (5’-CTC ACGATG CTG TAC
AGACTT-3’) (Dias et al. 2012) e a segunda usado 1.0 l do produto da primeira PCR e 0.4 pmol do
primer sense P1 (5’-TGCCTCTCACATCTCGTCAA-3’) (Oliveira et al. 2008) e do 783. Todos os
ensaios da PCR foram realizados usando 12.5 μl de TopTaq Máster mix kit (250U) (QIAGEN, GmbH) e
água Nuclease free (Ambion/Applied Biosystems, Brasil) para completar o volume final de 25 μl.
O tamanhos do amplicon da primeira reação equivale a 1.200 pb (regiões S-1/S-2/S/Pol/Rt) e 680 pb
(região S/Pol/Rt) na segunda reação.
As condições de amplificação foram: um ciclo de 94ºC por 5 min e 35 ciclos (94°C por 30 seg,
57.1°C por 2 min e 72°C por 30 seg) e extensão final a 72°C por 7 min. Na segunda reação foi usado um
ciclo de 94ºC por 2 min e 35 ciclos (94°C por 30 seg, 57.1°C por 30 seg, 72°C por 1 mim) e extensão
29
final a 72°C por 5 min. Os ensaios foram realizados em termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient
(Eppendorf, ). Os produtos da PCR foram analisados por corrida eletroforética em gel de agarose 1.5%
corado com brometo de etídio (0.1 µg/ml) e visualizado em luz ultravioleta.
Sequenciamento - As reações de sequenciamento foram realizadas usando 1-3 µl (20-30 ng) de
produto de PCR, 0.3 pmol do primer P1 ou 783, 2.0 µl tampão 5x, 1.0 µl de Big Dye Terminator v.3.1
Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems) e água para completar o volume final de 10 µl. Após
purificação da reação se sequenciamento com X-Terminator kit (Applied Biosystems, Foster City, CA,
USA) foi realizado sequenciamento pelo método de Sanger usando DNA Analyzer ABI 3130XL
(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Edição das sequências nucleotídicas – A análise das sequencias foi realizada usando os programas
BioEdit v.7.1.3.0 (Hall.2005) e MEGA v.6 (Kumar et al. 2013). Foram incluídas nessa análise
sequências padrões dos 10 diferentes genótipos do VHB (A-J) identificadas em diferentes países obtidas
no GenBank. A validação da qualidade e montagem das sequências consenso foi realizada utilizando o
programa Phred-Phrap-Consed.
Análise filogenética - A genotipagem foi realizada por reconstrução filogenética usando
sequências de referência de todos os genótipos obtidas no GenBank. Foi usado o método estatístico de
Neighbor-Joining (NJ) incluindo substituições do tipo transições + transversões. O teste de
confiabilidade da topologia da árvore filogenética foi estabelecido usando o método não paramétrico de
replicações bootstrap com percentual mínimo de 50% e 1000 replicações. A phylogenetic and molecular
evolutionary analyses were conducted using MEGA version 6 (Kumar et al. 2013).
Análises de mutações de resistência – A pesquisa de mutações de resistência aos antivirais e
escape de vacina foi realizada em programas de fenotipagem virtuais disponíveis no endereço
eletrônico: http://www.hepseq.org/Public/Web_Front/main.php e http://www.genafor.org/about.php.
Análise estatística - analisou-se a relação entre as características sócio epidemiológica dos
pacientes (sexo, idade e local de procedência), condições do fígado (hepatite crônica, cirrose e níveis de
30
Alamina Amino Transferase-ALT), características da infecção viral (antígenos HBsAg e HBeAg, níveis
de carga viral em log e UI) e características genéticas viral (polimorfismo, padrão de mutações nos
genes S e Pol/Rt e substituições de aminoácidos e se o paciente estava ou não em tratamento com
antivirais). As variáveis foram comparadas no programa SPSS aplicando o teste estatístico teste-t de
student e X².
RESULTADOS
Foram analisadas 113 amostras de pacientes HBsAg positivos e carga viral >300 UI/ml. A idade
desses pacientes variou entre 19 a 71 anos com média de 41,1 anos, desvio padrão 11,4 e mediana de 42
anos. Na Tabela 1 estão descritos os aspectos sociodemográficos e laboratoriais da população do estudo:
Tabela 1
Características da população do estudo
Sexo
M
F
Procedência
Manaus
Zona Rural
Cirrose
Sim
Não
Tratamento
Sim
Não
ALT
Normal
Alterada
HBeAg
Pos
Neg
Carga Viral (log)
≤10³
>10³ ~ ≤105
>105
Genótipo
A
D
F
N
%
64
45
56,6
43,4
103
10
91,2
8,8
8
102
7,1
90,3
12
101
10,6
89,4
86
25
76,1
22,1
12
99
10,6
89,4
21
73
18,6
64,6
19
16,8
81
17
15
71,7
15,0
13,3
31
Investigação de Mutações de resistência no gene da polimerase (rt) do VHB – Analise de 113
sequencias de VHB mostrou que 87/113 (76.99%) apresentavam tipo selvagem e 26/113 (23.01%)
apresentavam mutações no gene da polimerase associadas à resistência ao uso de antivirais. Na Tabela 2
estão descritos os dados referentes às características genotípicas, carga viral, uso de medicamentos,
resistências e possíveis resistências aos antivirais. A mutação rtM204I/Y/K/N/R/L foi frequente em
14/113 (12,39%) das sequências. Relacionando a variação de aminoácidos aos genótipos, obteve-se o
seguinte resultado: rtM204I/rtM204Y/rtM204L (genótipo F2), rtM204I/rtM204K e rtM204I/rtM204N
(genótipo A1), rtM204I/M204R (genótipo D3) e rtM204I/M204L (genótipo F2). A relação presença de
mutação versus uso de drogas antivirais, mostrou que das 14 sequências que tinham a mutação na
posição rt 204, 8 (57.14%) apresentavam resistência a lamivudine e telbivudine. A análise do perfil dos
pacientes portadores dessas cepas virais revelou que dois (2 e 26) estavam em tratamento com entecavir,
tinham alta carga viral (Log de 4.56 e 4.32, respectivamente) mas indicação de possível resistência a
essa droga. Outra mutação importante foi da posição S202A/I/AR/V isoladamente, presente em 4.42%
das sequências, isoladas de pacientes sem uso de antivirais, com carga viral muito alta, indicando um
perfil de possível resistência ao entecavir. A cepa isolada do paciente 09 apresentou três mutações
L80V/L180M/ A181G e pertencia ao genótipo A, o paciente não estava em tratamento, tinha resistência
a lamivudina e possível resistência a adefovir, telbivudine.
Mutações simultâneas tanto no gene rt quanto no gene S foram encontradas em cepas virais de
quatro pacientes 1 (rtS202L/rtM204I/sM133I=A1), 2 (rtA80V/rtM204I/sL109V), 14 (rtS202R/sQ129R)
e 21 (rtS202V/rtM204R/G145R), todos com indicação de possível resistência ao entecavir, sendo que o
paciente 2 estava em tratamento com entecavir. O paciente 21 apresentava carga viral alta com Log de
8.07 e estava infectado com genótipo D3.
32
Tabela 2
Caracterização de Mutações da Região da Polimerase(rt) e gene S.
Resistência
Possível Resistencia
S202L/M204I
Mutação
Gene S
M133I
Não
Carga Viral
UI/mL
1290
Lamivudine, Telbivudine
Entecavir
A80V/M204I
L109V
Lamivudine, Telbivudine
Entecavir
3,11
Entecavir
36300
4,56
D
A80V
-
-
Lamivudine, Telbivudine
Entecavir
3280
3,8
4
5
A1
D3
S202L/M204I
I233G
-
Lamivudine, Telbivudine
-
AUSENTE
Adefovir
Não
Não
1400
4270
3,15
3,63
6
7
A2
F2
S202A
M204Y
-
-
Entecavir
Lamivudine, Telbivudine, Entecavir
Não
Não
9050
4010
3,96
3,6
8
9
F2
A1
S202I
L80V/L180M/ A181G
-
Lamivudine
Entecavir
Adefovir, Telbivudine
Não
Não
991
1840
3
3,26
10
11
D3
D3
M204Y
S202A
-
-
Lamivudine, Telbivudine, Entecavir
Entecavir
Não
Não
14400
451
4,16
2,65
12
13
A1
D3
M204K
S202Q/M204I
-
Lamivudine, Telbivudine
Lamivudine, Telbivudine, Entecavir
Entecavir
Não
Não
808
1730
2,81
3,24
14
15
D1
A1
S202V
S202R
Q129R
-
-
Entecavir
Entecavir
Não
Não
2090
977
3,32
2,99
16
17
A1
A1
M204I
M204N
-
Lamivudine, Telbivudine
-
Entecavir
Lamivudine, Telbivudine, Entecavir
Não
Não
3540
3380
3,55
3,38
18
19
A1
A1
M204I
S202A
-
Lamivudine, Telbivudine
-
Entecavir
Entecavir
Não
Não
3670
25900
3,67
4,41
20
A1
M204I
-
Lamivudine, Telbivudine
Entecavir
Não
1100
3,04
21
22
23
D3
A
A1
S202R/M204R
A80V
A80V
G145R
-
-
Lamivudine, Telbivudine, Entecavir
Lamivudine, Telbivudine
Lamivudine, Telbivudine
Não
Não
Não
117000000
74700000
170000000
8,07
7,85
8,23
24
25
F2
A1
S202I/M204L
M204I
-
Lamivudine, Telbivudine
Lamivudine, Telbivudine, Entecavir
Entecavir
Não
Não
2860
5690
3,46
3,76
26
27
28
29
30
31
32
D3
F
F2
A1
A1
A1
A1
S202R/M204R
-
T140S
S132P
M133L
M133L
M133T
G130N
-
Lamivudine, Telbivudine, Entecavir
-
Entecavir
Não
Não
Não
Não
Não
Não
20900
7150
12500
4350
3860
375000
7140
4,32
3,85
4,1
3,64
3,86
5,57
3,85
Paciente
Genótipo
Mutação (rt)
1
A1
2
A1
3
Tratamento
Log
33
Mutações – Os resultados da análise de mutações no gene da polimerase e gene S foram
relacionados às variáveis: sexo, genótipo, ALT, carga viral, cirrose, HBeAg e tratamento estão descritos
na Tabela 3.
Tabela 3
Mutações na polimerase, região do YMDD e gene S do VHB
Polimerase
%
p
30,6
0,11
17,2
Mutações no VHB
YMDD
Gene S
%
p
%
p
10,2
8,2
0,58
1
14,1
9,4
A
D
F
Alterada
Normal
20,3
41,2
20
20
22,1
11,4
17,6
13,3
12
12,8
≤10³
>10³ ~ ≤105
19
26
Variaveis
Sexo
Genótipo
ALT
Carga Viral
Masculino
Feminino
5
Cirrose
HBeAg
Tratamento
>10
Sim
Não
Positivo
Negativo
Sim
Não
15,8
37,5
20,6
0
24,2
25
22,8
0,23
0,05
0,55
0,15
0,002
1
4,8
16,4
5,3
12,5
12,7
0
14,1
8,3
12,9
0,8
0,76
0,17
0,66
0,13
1
7,6
11,8
13,3
8
9,3
0
11
10,5
12,5
8,8
8,3
9,1
8,3
8,9
0,79
0,81
0,11
0,71
0,82
1
Polimerase/S
% p
4,1
1
3,1
2,5
11,8 0,3
0
8
0,43
2,3
0
4,1 0,42
5,3
12,5
0,47
2,9
0
0,58
4
8,3
0,36
3
Muta ções na região do “a” determinante do gene S, proteína de superfície SHBsAg (aa 124-147)
relacionadas a “escape mutante” da vacina contra o VHB foram encontradas em 10/113 (8,85%)
sequências descritas como de escape de vacina, detectadas nas posições sQ129R, genótipo D1; sG130N,
genótipo A1; sS132P genótipo F2; sM133T/L/I, genótipoA1; I140S, genótipo F; L109V, genótipo A1 e
a clássica mutação sG145R, genótipo D3.
A análise no programa Genafor identificou na sequência 009 e 004 as mutações sT140S e sL109V
também como mutação de escape de vacina.
34
As demais substituições de aminoácidos nas posições 122, 127, 128, 131, 134 e 143 da proteína
HBsAg são polimorfismos associados as mutações no gene rt e não apresentam relevância quanto ao
escape de vacina.
Figura 1- Sequências parciais de aminoácidos da região do Determinante “a”, os números de 01 a 010
são amostras de pacientes, alinhadas com duas sequências consenso obtidas no GenBank. Em destaque
as mutações de escape mutante de vacina.
Distribuição de genótipo e subgenótipos do VHB – A análise filogenética do fragmento de 600
pb do gene S, agrupou as 113 sequências em três diferentes genótipos A, D e F (Figura 2). O genótipo A
foi o mais frequente 71.68% (81/113), sendo identificados os subgenótipos A1 e A2, 15.04% (17/113)
foi genótipo D, subgenotipos D1, D2, D3 e D4 e o 13.28% (15/113) genótipo F, subgenótipos F1 e F2.
A árvore filogenética foi construída com 108 sequências, 5 foram excluídas da árvore por terem menos
de 600 pb, o genótipo dessas sequências bem como os subgenotipos foram caracterizados usando o
programa Genafor e HepSEQ-Research Database System.
35
53
A | X51970 USA
AM14694
AM43013
AM19035
AM5894
AM18642
AM51691
AM45776
AM55561
AMS6
A | AF043560 Arg
AM58754
AM450440
AM96306
AM48216
AM51940
AM53982
AM13881
AM59529
AM18625
AM18812
55
AM45704
59 AM30028
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AM57590
50
AM77826
A | GQ184323 Afr Sul
AMS13
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AM45040
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A | FJ692603 Hai
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A | EU185788 Arg
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D | AY902777 USA
D | JN664947 Ind
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AMS2
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D | DQ399006 Alem
AM37326
90
B Genotype
E Genotype
67
99
C Genotype
G Genotype
F | EU670261 Per
55
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F | AY090461 El Sal
AM20
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51
H Genotype
AM14934
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F | DQ899142 Ven
AM3340
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F | FJ589067 Col
AM93300
61
51
68
AF046996_Woolly_monkey
0.005
Figura 2- Reconstrução filogenética de sequencias nucleotidicas correspondente a 600 pb do gene de
superfície do VHB, usando o método estatístico de Neighbor-joining. O teste foi calculado usando o
método de Bootstrap baseado em 1000 replicações e o modelo de substituição nucleotítica Kimura 2parametros, incluindo substituições do tipo Transições + Transversões e parâmetro gama = 2.5 G.
36
DISCUSSÃO
De acordo com os resultados obtidos em nosso estudo, observou-se que a população em questão
apresentou média de idade de 41,1 anos e mediana de 42 anos, demonstrando a forma de transmissão
vertical ou perinatal como predominante. Observou-se também que embora com pouca diferença, a
maioria dos pacientes era do gênero masculino. Estudos anteriormente realizados nesta região também
mostram esse perfil (Fonseca 2007; Victoria, 2008; Dias, 2012).
Em relação ao local de procedência dos pacientes, sem por cento dos participantes era natural do
estado do Amazonas com somente 8,8% residentes nas zonas rurais dos municípios. Essa significativa
diferença deve-se provavelmente ao local de realização do estudo, pois todas as amostras foram da
demanda de uma unidade de saúde referência no atendimento e tratamento de portadores de hepatopatia
crônica localizada em Manaus, capital no estado.
Os achados sorológicos e clínico mostraram que 89,4% dos pacientes apresentavam o marcador
HBeAg negativo. Desses, 7,1% tinham cirrose hepática. Em um estudo realizado por Fonseca, 2007 a
incidência anual de cirrose hepática variou de 2% a 6% entre pacientes com hepatite crônica HBeAg
positivos e 8% a 10 % nos pacientes com HBeAg negativos. Segundo o autor essa alta incidência de
cirrose hepática nos pacientes com hepatite crônica HBeAg negativos ou hepatite crônica antiHBe positivo, está relacionada com a idade mais avançada dos pacientes (> 35 anos de idade), fator
também observado em nosso estudo.
O elevado percentual de pacientes com hepatopatia crônica, HBeAg negativo (89,4%),
encontrado em nosso estudo sugere a necessidade de investigação de mutações na regiões do pré-core
ou core-promoter do VHB, pois estes mesmos indivíduos podem estar infectados com cepas mutantes
que não expressão o marcador HBeAg (Lyra et al. 2008). Mutações na região core-promouter estão
também associados ao aumento dos níveis de HBV DNA (>2.000 UI/mL), elevado níveis séricos da
ALT, geralmente intercalados com períodos de normalidade e achados histológicos de necro-inflamação
37
no fígado, habitualmente em indivíduos mais velhos. Todas essas características foram observadas em
nossa população de estudo.
Em relação às mutações detectadas nas posições 80, 180, 181, 202, 204 e 233 no gene da
polimerase, estudos associam essas mutações à resistência aos análogos de núcleos(t)ídeos entecavir,
adefovir, telbivudine e lamivudina com índices de até 27,7% nos portadores assintomáticos e 26,9% nos
doentes com Hepatite B Crônica (Haddad et al. 2010, Panigrahi et al. 2013). Em nosso estudo, esse
índice em portadores de hepatite B crônica atingiu 23,01%. Desses, 7,96% apresentavam resistência aos
análogos lamivudina e telbivudine e/ou possível resistência a lamivudina, telbivudine e entecavir, sendo
que três deles estavam em tratamento com entecavir. Outro achado importante deste estudo foi em
relação ao grupo de pacientes não tratados, mas infectados com cepas resistentes ou com perfil de
possível resistência a lamivudina, telbivudine e entecavir, mostrando que as cepas mutantes estão
circulando e que um indivíduo pode ser infectado com uma cepa já resistente.
Por outro lado, estudos mostram que a mutação 204 no domínio YMDD geralmente causada pela
terapia com lamivudina também pode ocorrer espontaneamente em pacientes portadores de Hepatite B
crônica não tratados. Isso ocorre geralmente devido à incorporação aleatória de nucleótideos e falha na
atividade revisora da enzima transcriptase reversa do VHB durante o processo de replicação. As
substituições mais comuns são isoleucina (rtM204I, YIDD mutante) ou valina (rtM204V, YVDD
mutante) (Tan et al. 2012). Em nosso estudo, 15 (13,27%) pacientes que apresentavam cepas com
mutação de resistência na posição 204 não tinham sido submetido a nenhum tipo de tratamento com
drogas antivirais. Estudos indicam que a introdução de lamivudina (LAM) aumenta rapidamente o risco
de seleção de mutantes resistentes, podendo atingir índices de 80% de mutações de resistência no
domínio RT do VHB após quatro anos de tratamento (Locarnini & Yuen, 2010), como no Amazonas o
tratamento com LAM foi introduzido a mais de 10 anos fica difícil estabelecer se essas mutações são de
ocorrência natural ou se esses indivíduos foram infectados com cepas resistentes provenientes de
38
indivíduos submetidos a tratamento com LAM no passado. Até porque, estudos prévios mostram que o
padrão de infecção na população local é o intrafamiliar (Castilho et al. 2012).
Analisando a relação entre as substituições de aminoácidos no gene rt e os diferentes genótipos
identificados, verificamos que 41,2% das substituições ocorreram em sequencias do genótipo D
enquanto que sequências do genótipos A e F apresentaram percentuais de 20,3% e 20% substituições,
respectivamente. Resultados semelhantes foram obtidos em estudo realizado no sul do Brasil na cidade
de Ribeirão Preto, SP com 50 pacientes portadores de hepatite B crônicas em tratamento com
Lamivudina, com percentual de 26,6% de mutações no genótipo D e 20% em sequências do genótipo A
(Haddad et al. 2010). Mello e colaboradores analisaram amostras de soro de 129 pacientes HBsAgpositivos de diferentes estados brasileiros [Rio de Janeiro, Espírito Santo, Minas Gerais e Santa
Catarina] e também detectaram um maior número de mutações em isolados do genótipo D (Mello et al.
2012).
Em relação à caracterização de mutações escape mutante da vacina, encontrado em 8,85% (10/113)
das cepas virais. Não foi possível determinar se esses indivíduos foram infectados por transmissão
vertical de mães não vacinadas ou se por falha na vacina contra o VHB. Apesar da literatura afirmar que
o anticorpo policlonal recombinante gerado a partir da vacinação seja capaz de proteger os indivíduos
contra a infecção por VHB mutante SG145R (Locarine, 2008) o monitoramento continuo dessas
mutações é importante pelo potencial risco de surgimento de reservatórios de vírus mutantes na
população, podendo ser transmitido para seus descendentes. Além disso, conforme demonstrado no
estudo de Chang 2010, em longo prazo, evidencia-se uma ameaça potencial para o sucesso do programa
de vacinação.
A sobreposição da polimerase viral aos quadros de leitura das proteínas do envelope do VHB
resulta em mutações associadas à resistência antiviral e em alterações importantes para nos domínios
neutralizantes de anticorpos envolvidos na ligação do antígeno de superfície (HBsAg) do VHB e o
aparecimento de mutantes de escape de vacina associados à droga (ADAPVEMs). A importância do
39
ADAPVEMs para a saúde pública é considerável em termos de programas global de controle da hepatite
B para imunização infantil universal. A prevenção da resistência requer a adoção de estratégias que não
só controlem efetivamente replicação do VHB, mas também que evite o surgimento de ADAPVEMs
(Locarnini & Yuen, 2010; Tan et al. 2012). Portanto, de acordo com os resultados obtidos em nosso
estudo, isto é, maiores níveis de carga viral (>10³ ~ ≤105) em amostras com mutantes no gene da
polimerase, reforça-se a necessidade imediata de estratégias de controle efetivo da replicação do VHB
em prol do sucesso do programa de vacinação.
Em nosso estudo foram identificados três genotípicos A, D e F. O genótipo A foi predominante na
população, seguido dos genótipos D e F. Estudos anteriores realizados em populações da região norte do
Brasil (Oliveira, et al. 2008; Dias et al. 2012) (Castilho et al. 2012; Godoy et al. 2013) destacam o
genótipo A como o mais prevalente, seguido do genótipo F. Em outras regiões brasileiras o genótipo D
aparece como o segundo mais frequente acompanhado do C (Becker et al. 2010; Haddad et al. 2010;
Mello et al. 2012; Eloy et al. 2013; Araujo et al. 2013).
Em conclusão, este é o primeiro estudo a descrever o perfil de resistência antiviral em portadores
de hepatite B crônica correlacionando aos genótipos na região. As mutações de resistência encontradas
em pacientes naives mostra a necessidade de uma abordagem longitudinal para monitorar mutações de
resistência e realização de testes de genotipagem antes de iniciar a terapia antiviral dos pacientes.
AGRADECIMENTOS
Ao programa de pós-graduação de Medicina Tropical, a Fundação de Medicina Tropical Heitor Vieira
Dourado, a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e colaboradores.
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Mem Inst Oswaldo Cruz
44
5. CONCLUSÃO
De acordo com resultados obtidos concluiu-se que:
 Há evidencias de mutações de resistência antivirais no gene da polimerase do
VHB circulantes na região;
 Mutações de resistência foram identificadas em 22,8% dos pacientes que não
faziam uso de antivirais;
 Mutações de resistências foram identificadas em 14 sequencias do genótipo A, 8
do genótipo D e 3 do genótipo F;
 As mutações de resistências identificadas foram relacionadas aos antivirais
lamivudine e telbivudine;
 Foi também identificado mutações relacionadas a possível resistência à
entecavir e adefovir;
 Identificou-se o mesmo padrão genotípico de estudos anteriores, genótipos A, D,
F e C, com predominância do genótipo A;
 Os achados de mutação de resistência e escape de vacina demonstrou a
relevância dessa investigação, nos trazendo uma alerta, para maiores e
incessantes investigações.
45
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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51
ANEXOS
52
ANEXO – 1 Parecer de Aprovação Comitê De Ética
53
ANEXO – 2 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
54
55
ANEXO – 3 Questionário do Projeto
56
57
ANEXO - 4 Instruções aos autores da revista “Memórias do Instituto
Oswaldo Cruz”
INSTRUÇÕES AOS AUTORES
ISSN 0074-0276 versão
impressa
ISSN 1678-8060 versão on-line
Objetivos e política editorial
As Memórias do Instituto Oswaldo Cruz são uma revista multidisciplinar que
publica pesquisas originais relativas aos campos da medicina tropical
(incluindo patologia, epidemiologia de campo e estudos clínicos),
parasitologia
médica
e
veterinária
(protozoologia,
helmintologia,
entomologia e malacologia) e microbiologia médica (virologia, bacteriologia
e micologia). A revista aceita, especialmente, pesquisas básicas e aplicadas
em bioquímica, imunologia, biologia molecular e celular, fisiologia,
farmacologia e genética relacionada a essas áreas. Comunicações breves
são também consideradas. Artigos de revisão só quando solicitados. A
revista publica oito números regulares, constitutindo um por ano.
Ocasionalmente, trabalhos apresentados em simpósios ou congressos são
publicados como suplementos.
Os artigos apresentados devem ser escritos preferencialmente em inglês.
Quando neste idioma, para não causar atrasos na publicação sugerimos
que sejam checados por alguém que tenha o inglês como primeira língua e
que, preferencialmente, seja um cientista da área.
A submissão de um manuscrito às Memórias requer que este não tenha
sido publicado anteriormente (exceto na forma de resumo) e que não
esteja sendo considerado para publicação por outra revista. A veracidade
das informações e das citações bibliográficas é de responsabilidade
exclusiva dos autores.
Os manuscritos serão analisados por pelo menos dois pareceristas; a
aprovação dos trabalhos será baseada no conteúdo científico e na
apresentação.
Somente serão aceitas submissões eletrônicas dos artigos, no
seguinte
endereço:http://submission.scielo.br/index.php/mioc/login.
Por meio desse serviço você pode submeter o artigo e acompanhar o status
do mesmo durante todo o processo editorial. Garantindo rapidez e
seguranças na submissão do seu manuscrito e agilizando o processo de
58
avaliação.
O manuscrito deverá ser preparado de acordo com as Orientações aos
Autores.
Ao encaminhar um manuscrito para a revista, os autores devem estar
cientes de que, se aprovado para publicação, o copyright do artigo,
incluindo os direitos de reprodução em todas as mídias e formatos, deverá
ser concedido exclusivamente para as Memórias. A revista não recusará as
solicitações legítimas dos autores para reproduzir seus trabalhos.
Para maiores informações sobre o formato e o estilo da revista, favor
consultar um número recente da Revista ou entrar em contato com a
Editoria Científica pelos telefones (+55-21-2598.4335/2561-1442), fax
(+55-21-2280-5048),
ou
e-mail
([email protected] /[email protected]).
Formato e estilo
O manuscrito (incluindo tabelas e referências) deve ser preparado em um
software para edição de textos, em espaço duplo, fonte 12, paginado. As
margens devem ser de pelo menos 3 cm. As figuras deverão vir na extensão tiff,
com resolução mínima de 300 dpi. Tabelas e figuras deverão vir em documentos
separados.
Deve ser organizado de acordo com a seguinte ordem:
Título resumido: com até 40 caracteres (letras e espaços)
Título: com até 250 caracteres
Autores: sem títulos ou graduações
Afiliação institucional: endereço completo somente do autor correspondente
Resumo: com até 200 palavras (100 palavras no caso de comunicações breves).
Deve enfatizar novos e importantes aspectos do estudo ou observações.
Palavras-chave: devem ser fornecidos de 3 a 6 termos, de acordo com a lista
Medical Subject Headings (Mesh) do Index Medicus.
Notas de rodapé: indicando a fonte de financiamento e mudança de endereço
Introdução: deve determinar o propósito do estudo, oferecer um breve resumo
(e não uma revisão de literatura) dos trabalhos anteriores relevantes, e
especificar quais novos avanços foram alcançados através da pesquisa. A
introdução não deve incluir dados ou conclusões do trabalho em referência.
Materiais e Métodos: deve oferecer, de forma breve e clara, informações
suficientes para permitir que o estudo seja repetido por outros pesquisadores.
Técnicas padronizadas bastam ser referenciadas.
Ética: ao descrever experimentos relacionados a temas humanos, indicar se os
procedimentos seguidos estiveram de acordo com os padrões éticos do comitê
59
responsável por experimentos humanos (institucional ou regional) e de acordo
com a Declaração de Helsinki de 1975, revisada em 1983. Ao relatar
experimentos em animais, indicar se diretrizes de conselhos de pesquisa
institucionais ou nacionais, ou qualquer lei nacional relativa aos cuidados e ao
uso de animais de laboratório foram seguidas.
Resultados: devem oferecer uma descrição concisa das novas informações
descobertas, com o mínimo julgamento pessoal. Não repetir no texto todos os
dados contidos em tabelas e ilustrações.
Discussão: deve limitar-se ao significado de novas informações e relacionar as
novas descobertas ao conhecimento existente. Somente as citações
indispensáveis devem ser incluídas.
Agradecimentos: devem ser breves e concisos e se restringir ao absolutamente
necessário.
Referências: devem ser precisas. Somente as citações que aparecem no texto
devem ser referenciadas. Trabalhos não publicados, a não ser os já aceitos para
publicação, não devem ser citados. Trabalhos aceitos para publicação devem ser
citados como " in press "; nesse caso, uma carta de aceitação da revista deverá
ser fornecida. Dados não publicados devem ser citados somente no texto como "
unpublished observations "; nesse caso, uma carta com a permissão do autor
deve ser fornecida. As referências ao final do manuscrito devem ser organizadas
em ordem alfabética de acordo com o sobrenome do primeiro autor.
Os títulos de revistas devem ser abreviados de acordo com o estilo usado no
Index Medicus. Consultar:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=journals&TabCmd=Limits.
• No texto, usar o sobrenome do autor e a data:
Lutz (1910) ou (Lutz 1910).
Com dois autores, a forma é:
(Lutz & Neiva 1912) ou Lutz and Neiva (1912).
Quando há mais que dois autores, somente o primeiro é mencionado:
Lutz et al. (1910) ou (Lutz et al. 1910).
• Nas referências, usar os seguintes estilos:
Artigo de revista
Chagas C, Villela E 1922. Forma cardíaca da tripanosomiase americana. Mem
Inst Oswaldo Cruz 14: 15-61.
Livro ou Tese
Forattini OP 1973. Entomologia Médica. Psychodidae, Phlebotominae,
Leishmaniose, Bartonelose, Vol. IV, Edgard Blucher, São Paulo, 658 pp.
Morel CM 1983. Genes and Antigens of Parasites. A Laboratory Manual, 2nd ed.,
Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, xxii + 580 pp.
Mello-Silva CC 2005. Controle alternativo e alterações fisiológicas em
Biomphalaria glabrata (Say, 1818), hospedeiro intermediário de Schistosoma
mansoni Sambom, 1907 pela ação do látex de Euphorbia splendens var. hislopii
N.E.B (Euphorbiaceae), PhD Thesis, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro,
60
Seropédica, 85 pp.
Capítulo de livro
Cruz OG 1911. The prophylaxis of malaria in central and southern Brasil. In R
Ross, The Prevention of Malaria, John Murray, London, p. 390-398.
Artigo de revista na Internet
Abood S. Quality improvement initiative in nursing homes: the ANA acts in an
advisory role. Am J Nurs [serial on the Internet]. 2002 Jun [cited 2002 Aug
12];102(6):[about 3 p.]. Available from:
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Parte de uma base de dados na Internet
MeSH Browser [database on the Internet]. Bethesda (MD): National Library of
Medicine (US); 2002 - [cited 2003 Jun 10]. Meta-analysis; unique ID: D015201;
[about 3 p.]. Available from:
http://www.nlm.nih.gov/mesh/MBrowser.html Files updated weekly. Updated
June 15, 2005
• Ilustrações: figuras e tabelas devem ser compreensíveis sem a necessidade
de referência ao texto.
- Figuras: as fotografias devem ser bem nítidas, com alto contraste, ampliadas
em preto e branco em papel brilhante, se apresentadas lâminas, as figuras
devem ser numeradas consecutivamente em algarismos arábicos. As escalas
devem ser indicadas por uma linha ou barra na figura, e referenciadas, se
61
necessário, na legenda (por exemplo, bar = 1 mm etc.). Lâminas e gráficos
devem ajustar-se tanto em uma coluna (8 cm) ou na largura completa (16.5 cm)
da página, e devem ser menores que a página para permitir a inclusão da
legenda. As letras e números nas figuras devem ter tamanho legível após a
redução ou a impressão. Ilustrações coloridas somente podem ser aceitas se os
autores assumirem os custos. Por outro lado, uma fotografia colorida ilustra a
capa de cada fascículo de Memórias, e os autores são convidados a submeter
para consideração da revista ilustrações com legendas de seus manuscritos que
poderão vir a ilustrar a capa.
- Tabelas: devem complementar, e não duplicar, o texto. Elas devem ser
numeradas em algarismos romanos. Um título breve e descritivo deve constar no
alto de cada tabela, com quaisquer explicações ou notas de rodapé (identificadas
com letras a, b, c etc.) colocadas abaixo.
• Comunicações breves: devem ser breves e diretas. Seu objetivo é comunicar
com rapidez resultados ou técnicas particulares. As comunicações não devem
ocupar mais do que três páginas impressas, incluindo figuras e/ou tabelas. Não
devem conter referências em excesso. As referências devem ser citadas no final
do texto, usando o mesmo formato para artigos originais. Um resumo breve e
três palavras-chave devem ser apresentados.
• Formato alternativo: Os manuscritos podem ser submetidos seguindo os
"Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journals"
produzidos pelo International Committee of Medial Journal Editors, também
conhecidos como Vancouver Style. Nesse caso, os autores devem seguir as
diretrizes da quinta edição (Annals of Internal Medicine 1997; 126: 36-47, ou no
website http://www.acponline.org/journals/resource/unifreqr/htm), sendo
responsáveis por modificar o manuscrito onde diferir das instruções aqui
apresentadas, se o manuscrito for aceito para publicação. Os autores também
deverão seguir os Uniform Requirements para quaisquer outras diretrizes
omitidas nestas instruções.
Uma vez que um trabalho seja aceito para publicação, os autores devem enviar:
• uma declaração de affidavit fornecida pela produção editorial da revista,
assinada por todos os autores. Autores de diferentes países ou instituições
podem assinar em diferentes folhas que contenham a mesma declaração.
• uma declaração de copyright fornecida pela produção editorial da revista,
assinada pelo autor responsável pela correspondência.
•Taxas: a revista não cobra taxas para publicação.
•Provas: serão enviadas provas tipográficas aos autores para a correção de
erros de impressão. As provas devem retornar para a Produção Editorial na data
estipulada. Outras mudanças no manuscrito original não serão aceitas nesta
fase.