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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRO-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA Participação do CD40-L Solúvel (sCD40-L) na resposta microbicida de macrófagos infectados por Leishmania chagasi. ALINE SILVA BARRETO SÃO CRISTÓVÃO 2014 ALINE SILVA BARRETO Participação do CD40L Solúvel (sCD40-L) na resposta microbicida de macrófagos infectados por Leishmania chagasi. Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Biologia Parasitária da Universidade Federal de Sergipe como requisito para a obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária. Orientadora: Profa. Dra.Tatiana Rodrigues de Moura SÃO RISTÓVÃO 2014 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE B273p Barreto, Aline Silva Participação do CD40L solúvel (sCD40-L) na resposta microbicida de macrófagos infectados por Leishmania chagasi / Aline Silva Barreto ; orientadora Tatiana Rodrigues de Moura. – São Cristóvão, 2014. 45 f. Dissertação (mestrado em Biologia Universidade Federal de Sergipe, 2014. Parasitária) – 1. Leishmaniose visceral. 3. Macrófagos. 3. Ligante CD40L. I. Moura, Tatiana Rodrigues de, orient. II. Título. CDU 616.993.161 FOLHA DE APROVAÇÃO Aline Silva Barreto Participação do CD40L solúvel (sCD40-L) na resposta microbicida de macrófagos infectados por leishmania chagasi. Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Biologia Parasitária da Universidade Federal de Sergipe como requisito para a obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária. Área de Concentração: Biologia Parasitária Orientadora: Profª Drª Tatiana Rodrigues de Moura Aprovada em 10/05/2014 Banca Examinadora Prof. Dr. Paulo de Tarso Leopoldo Instituição: Departamento de Morfologia – Universidade Federal de Sergipe Profª. Dr.Maria Jania Teixeira Instituição: Departamento de Patologia e Medicina Legal – Universidade Federal do Ceará Profª Drª Tatiana Rodrigues de Moura Instituição: Departamento de Morfologia – Universidade Federal de Sergipe Profª Drª Tatiana Rodrigues de Moura iii EPÍGRAFE “Pegue um sorriso e doe-o a quem jamais o teve. Pegue um raio de sol faça-o voar lá onde reina noite. eDescubra uma fonte e faça abanhar-se quem vive no lodo. Pegue uma lágrima e ponha-a no rosto de quem jamais chorou. Pegue a coragem e ponha-a no ânimo de quem não sabe lutar. Descubra a vida e narre-a a quem não sabe entendê-la. Pegue a esperança e viva na sua luz. Pegue a bondade e doe-a a quem não sabe doar. Descubra o amor e faça-o conhecer ao mundo." Mahatma Gandhi iv Dedico este trabalho a todos aqueles que lutam por uma sociedade mais justa e livre de preconceitos, onde o amor e o respeito ao próximo prevalecem acima de tudo. v AGRADECIMENTOS A Deus, presença constante em minha vida, renovando a fé e a esperança de que o amanhã será sempre um dia melhor. À minha família, especialmente a minha mãe, exemplo de força e determinação que me ensinou a lutar para conquistar os meus objetivos, sempre respeitando o próximo. Aos professores do Laboratório de Biologia Molecular: Amélia Ribeiro de Jesus, Roque Pacheco de Almeida, Paulo de Tarso Leopoldo e especialmente a Profa. Tatiana Rodrigues de Moura que tornou possível a concretização de um mais um objetivo em vida. A doutoranda Fabrícia Alvisi de Oliveira, essencial para a realização dessa pesquisa, bem como as alunas de iniciação científica Talita Rebeca e Lays Bonfim que trabalharam conosco durante todo esse tempo. Aos colegas do Laboratório de Biologia Molecular, em especial Márcio Bezerra Santos, Meiryelle Lima, Luana Serafim, Mônica Rueda e Suely Carvalho, por compartilharem comigo momentos felizes, mas sobretudo os momentos mais difíceis em minha vida. Aos colegas do Mestrado em Biologia Parasitária, pelo espírito de coletividade, sempre ajudando uns aos outros. vi RESUMO BARRETO, A. S. Participação do CD40L Solúvel (sCD40L) na resposta microbicida de macrófagos infectados por Leishmania chagasi. Biologia Parasitária-UFS, 2014. A Leishmaniose Visceral (LV) é uma doença grave e endêmica no Brasil, sendo mais prevalente em áreas urbanas. A patologia da LV está associada a uma menor produção de IFN-Ȗ por células T e ao aumento da produção de IL-10, que suprime a ativação dos macrófagos e promove o desenvolvimento da doença. Células T ativadas podem expressar CD40L que interagem com o CD40 expresso em células apresentadoras de antígeno (APC), essa interação é importante para a ativação de APCs e produção de citocinas inflamatórias, quimiocinas, óxido nítrico (NO) e metaloproteinases, desencadeando uma resposta protetora em modelos experimentais de LV. Dados do nosso grupo demostraram que pacientes com LV apresentam baixos níveis séricos de sCD40L antes do tratamento e que esses níveis aumentam no decorrer do mesmo, atingindo títulos próximos aos valores encontrados no controle endêmico, sugerindo um efeito protetor dessa molécula. Neste trabalho avaliamos a participação do sCD40L presente no soro na resposta microbicida de macrófagos infectados por Leishmania chagasi. Para isso, macrófagos humanos obtidos a partir de PBMC foram infectados com promastigotas de Leishmania chagasi na presença de soro contendo altos títulos de sCD40L, com e sem adição de anticorpo de bloqueio, anti-CD40L. Avaliamos a resposta microbicida a partir do número de macrófagos infectados e a quantidade de parasitos intracelulares. Observamos que houve uma redução de 43% do percentual de macrófagos infectados e de 58% do número de parasitos intracelulares quando comparado ao meio (p=0.01), sendo esse efeito foi revertido com o bloqueio do sCD40L, pois ocorreu um aumento de 24% do percentual de macrófagos infectados e de 33% do número de amastigotas. A partir dos resultados obtidos concluimos que o sCD40L está relacionado ao desenvolvimento de uma resposta imunológica protetora por ativar mecanismos microbicidas dos macrófagos para o controle da infecção por L. chagasi. Palavras-chave: Leishmaniose Visceral – Macrófago – Ligante de CD40. vii ABSTRACT BARRETO, A. S. Involvement of soluble CD40L (sCD40L) in the microbicidal response in macrophages infected with Leishmania chagasi. Parasitic Biology-UFS, 2014. Visceral Leishmaniasis (VL) is a severe desease, endemic in the Brazil, with a tendency to be more prevalent in urban areas. The pathology of VL is associated with a reduced production of IFN-Ȗ by T-cells and the increased production of IL-10, which suppresses the activation of macrophages and promotes development of the disease. Activated T cells can express CD40L interacting with CD40 expressed on antigen presenting cells (APC), this interaction is important for the activation of APCs and production of inflammatory cytokines, chemokines, nitric oxide (NO) and metalloproteinases, triggering a protective response in experimental models of LV. Data from our group showed that VL patients have low serum levels of sCD40L before treatment and that these levels increase over the same, titles reaching close to those found in endemic control, suggesting a protective effect of this molecule. In this work we evaluated the participation of sCD40L in modulating the immune response of macrophages infected with Leishmania chagasi. In this work we evaluated the participation of sCD40L in modulating the immune response of macrophages infected with Leishmania chagasi. For this, human macrophages were infected with promastigotes of Leishmania chagasi in the presence of serum containing high titers of sCD40L with and without addition of blocking antibody, anti-CD40L. After 72 hours, the microbicidal response was evaluated by number of infected macrophages and the number of intracellular parasites We observed that there was a 43% reduction in the percentage of infected macrophages and 58% of the number of intracellular parasites when compared to the medium (P = 0.01) and this effect was reversed by the blockade of sCD40L, because there was a 24% increase in the percentage of infected macrophages and 33% of the number of amastigotes. From the results we can conclude that the sCD40Lestá related to development of a protective immune response by activating microbicidal mechanisms of macrophages to control infection by L. chagasi. Keywords: Visceral Leishmaniasis - Macrophage - CD40 Ligand. viii LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS APCs Células apresentadoras de antígeno CCL2 Ligante de quimiocina (C-C motif) 2 CCR2 Receptor de quimiocina C-C do tipo 2 CR1 Receptor para complemento tipo 1 CR3 Receptor para complemento tipo 3 C3b Receptor para complemento fração 3b DC Célula dendrítica DTH Hiersensibilidade tipo tardio ERK1/2 Cinase regulada por sinais extracelulares Gp63 Glicoproteína 63 HIV Vírus da imunodeficiência humana H2O2 Peróxido de hidrogênio IgG Imunoglobulina G iNOS Óxido nítrico sintase induzível IL-1ȕ Interleucina-1ȕ ix IL-2 Interleucina-2 IL-4 Interleucina-4 IL-6 Interleucina-6 IL-10 Interleucina-10 IL-12 Interleucina-12 IFN-Ȗ Interferon gama LC Leishmaniose Cutânea LCD Leishmaniose Cutâneo Disseminada LM Leishmaniose Mucosa LPG Lipofosfoglicano LV Leishmaniose visceral MHCII Complexo principal de histocompatibilidade classe 2 MP1 Macrophage inflammatory protein NK Célula natural killer NO Óxido Nítrico O2- Ânion superóxido x PBMC Células mononucleares de sangue periférico PMN Polimorfonucleares p38MAP Proteína cinase ativada por mitógeno 38 ROS Espécies reativas do oxigênio rCD40L CD40L recombinante SBF Soro bovino fetal sCD40L CD40L solúvel TCR Receptor de célula T TGF-ȕ Fator de transformação do crescimento-ȕ Th Célula T helper TNF-α Fator de necrose tumoral- alfa TLR2 Receptor semelhante a toll 2 TLR4 Receptor semelhante a toll 4 TLR9 Receptor semelhante a toll 9 WHO Organização Mundial de Saúde (World Health Organization) xi LISTA DE FIGURAS Figura 1. Distribuição da Leishmaniose Visceral ao redor do mundo. Fonte: CHAPUIS et al., 2007 04 Figura 2. Ciclo de vida de Leishmania chagasi . O parasito Leishmania apresenta-se sob duas formas: promastigota extracelular no flebotomíneo e amastigota intracelular nos macrófagos do hospedeiro vertebrado. Após a inoculação das formas promastigotas, ocorre a migração dessas para as células mononucleares e órgãos viscerais do hospedeiro vertebrado onde se tranformam em amastigotas e ocasionam o desenvolvimento da doença. Fonte: Adaptado de dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/Leishmaniasis.htm. 06 Figura 3. Sinalização recíproca do CD40-CD40L. A interação entre a APC e a células T, na presença de uma forte coestimulação CD40-CD40L induz a produção das citocinas IL-12, IFN-Ȗ e IL-2 que promovem desenvolvimento de uma resposta protetora do tipo Th1 e ativação de macrófagos. Caso, na interação APC-célula T, a coestimulação CD40-CD40L seja fraca ocorre a produção de citocinas anti-inflamatórias TGF-ȕ, IL-10 e o desenvolvimento de uma resposta imunológica supressora do tipo Th2, com a inibição da ativação dos macrófagos. Fonte: Adaptado de Mathur ET al., (2006). 10 Figura 4. Soro de pacientes com LV suprime a resposta de macrófagos infecatdos por L. chagasi. Macrófagos humanos obtidos de PBMC de doadores sadios foram infectados com promastigostas de L. chagasi e posteriormente incubados por 72 horas com 20% de soro de indivíduos assintomáticos (n=2) ou 20% de soro de pacientes com LV (n=3). Para análise estatística foi utilizado o Mann Whitney test e o valor considerado significativo quando p < 0.05. 18 Figura 5. sCD40L contribui para o controle da infecção por L. chagasi em macrófagos humanos. Macrófagos humanos obtidos de PBMC de doadores sadios foram infectados com promastigostas de L. chagasi e posteriormente incubados com 20% de SBF ou 20% de soro com altos títulos de sCD40L e tratados com anti-CD40L ou isotipo controle do anticorpo (n=14) . Foi utilizado * Mann Whitney e **Wilcoxon signed rank test e o valor considerado significativo quando p<0.05. 19 xii Figura 6. Curva dose-resposta do rCD40L. Macrófagos humanos obtidos de PBMC de doadores sadios foram infectados com L. chagasi e incubados por 72 com diferentes concentrações do rCD40L. (A) Porcentagem de macrófagos infectados e (B) número de parasitos intracelulares. 20 Figura 7. rCD40L não altera a captura de L.chagasi nas primeiras 2 horas de infecção. Macrófagos humanos obtidos de PBMC de doadores sadios foram infectados com L. chagasi e incubados por 2 horas na presença de 20% de SBF, rCD40L e rCD40L + Anti-CD40L. (A) Porcentagem de macrófagos infectados e (B) número de parasitos intracelulares 21 12 SUMÁRIO 1.INTRODUÇÃO 13 2.REVISÃO DA LITERATURA 15 2. 1.Aspectos Biológicos e Epidemiológicos da Leishmaniose Visceral (LV) 15 2. 2.Ciclo de vida de Leishmania sp. 17 2. 3.Imunobiologia da Leishmaniose Visceral 18 2. 4.Manifestações clínicas da Leishmaniose Visceral 20 2. 5.Caracterização do CD40L e do CD40L solúvel (sCD40L) 21 2.6.Tratamento da Leishmaniose Visceral 23 3. OBJETIVOS 25 3.1.Objetivo Geral 25 3.2.Objetivos Específicos 25 4. MATERIAIS E MÉTODOS 26 4.1. Desenho experimental do estudo 26 4.2. Obtenção de Células Mononucleares de Sangue Periférico (PBMC) 27 4.3. Seleção do soro contendo altos títulos de sCD40L 27 4.4. Padronização do CD40L recombinante (rCD40L) 28 4.5. Infecção de macrófagos humanos com Leishmania chagasi 28 4.6. Aspectos Éticos 28 4.7. Análise Estatística 29 5. RESULTADOS 30 6. DISCUSSÃO 34 7. CONCLUSÃO 37 REFERÊNCIAS 38 13 1. INTRODUÇÃO A Leishmaniose Visceral (LV) é uma doença parasitária grave, de evolução crônica, causada por um protozoário intracelular obrigatório, pertencente ao complexo Leishmania donavani. Esta parasitose é endêmica em 98 países distribuídos em regiões tropicais, subtropicais e Sul da Europa (NEVES et al., 2006; PRIANTE E GOTO, 2009; AMÓRA et al., 2006, KARAGIANNIS-VOULES et al, 2013). É caracterizada por febre irregular, perda de peso, anemia, hepatoesplenomegalia, e pancitopenia (PASSOS et al., 2005). No Brasil a LV é ocasionada pelo parasito Leishmania chagasi (NEVES et al., 2006). A Leishmania infecta as células do sistema fagocítico mononuclear, em especial os macrófagos, principais células envolvidas nos mecanismos de defesa imunológica inata que atuam na fagocitose e destruição do parasita mediada por intermediários reativos do oxigênio e do nitrogênio, ou podem ainda atuar em conjunto com as células dendríticas (células apresentadoras de antígeno profissionais- APCs) na apresentação de antígeno aos linfócitos T virgens, ativando a imunidade adaptativa. As interações das APCs com as células T ocorrem através de ligações do complexo principal de histocompatibilidade de classe II (MHC II) presente nas APCs com o receptor de células T (TCR), além de outras moléculas coestimulatórias, dentre as quais, CD28-B7.1/2 e CD40-CD40L (ABBAS, 2012). A interação CD40- CD40L é requerida para a produção de IL-12 e IFN-Ȗ, promovendo a ativação e maturação de células dendríticas e macrófagos (ABBAS, 2012), que são células envolvidas na apresentação de antígeno e no controle da infecção por parasitos do gênero Leishmania. O CD40 é um membro da superfamília de receptores TNF expresso em APCs e em várias células não hematopoiéticas, possui como forma ligante o CD154 ou CD40L presente em células T (SUBAUSTE, 1999) e assim como outras proteínas transmembranas possui uma forma solúvel, o sCD40L, proveniente de sua clivagem e que é capaz de se ligar ao CD40 ( GRAF et al., 1995). Em modelos experimentais de Leishmaniose Visceral, a ausência do CD40L é favorável à infecção, e a falha nesta proteína aumenta a replicação de parasitas que sobrevivem após o tratamento (NUNES et al., 2005). Recentemente, Oliveira et al., (2013) demostraram que pacientes portadores da forma assintomática da LV, com teste cutâneo positivo (DTH+) para antígeno de leishmania, bem como os pacientes após o tratamento, 14 apresentam altos títulos de CD40L solúvel (sCD40L) no soro. e esses valores de sCD40L apresentaram correlacao negativa com o tamanho do baço , sendo sugerido pelo autor, como marcador de cura clinica. Nesse tabalho pretendemos avaliar se o desenvolvimento de uma resposta imunológica protetora nesses indivíduos pode estar associado a participação do sCD40L na ativação dos mecanismos microbicidas de macrófagos infectados por Leishmania chagasi. 15 2. REVISÃO DA LITERATURA As leishmanioses compreendem um grupo de doenças ocasionadas por parasitas pertencentes ao gênero Leishmania, apresentando um amplo espectro clínico de manifestações, que podem variar de lesões cutâneas, tais como: Leishmaniose Cutânea (LC), Leishmaniose Mucosa (LM), Leishmaniose Cutâneo Disseminada (LCD), Leishmaniose Difusa (LD) ou pode acometer os órgãos viscerais, a Leishmaniose Visceral (LV) (GOTO et al., 2011), sendo esta última considerada a forma mais grave da doença. Os fatores relacionados ao desenvolvimento das diferentes formas clínicas das leishmanioses, compreendem a espécie de Leishmania, o vetor envolvido na transmissão e a resposta imunológica desenvolvida pelo hospedeiro. 2. 1 Aspectos Biológicos e Epidemiológicos da Leishmaniose Visceral A LV é uma zoonose causada por um parasita intracelular obrigatório da ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, gênero Leishmania, subgênero Leishmania e as espécies são pertencentes ao complexo Leishmania donovani, dentre as quais estão Leishmania donovani (L. donovani) de ocorrência no subcontinente indiano, na Ásia e África, Leishmania infantum (L. infantum), na região mediterrânea, na região sudeste e central da Ásia e Leishmania chagasi (L. chagasi) na América do Sul (MURRAY et al., 2005; WILSON et al., 2005; MEDEIROS et al., 2007; ELSHAFIE et al., 2011). Embora apresentem diferenças no nome e origem geográfica, dados moleculares sugerem que L. infantum e L. chagasi podem ser atualmente, a mesma espécie (MAURICIO et al., 2000; DANTASTORRES, 2006). A Leishmaniose Visceral (LV), popularmente conhecida como calazar, é uma doença tropical negligenciada que apresenta elevados índices de letalidade quando não tratada. Representa um grave problema de saúde pública mundial, pois segundo Alvar e colaboradores (2012) é a segunda no ranking de mortalidade e a quarta em morbidade entre as doenças tropicais negligenciadas. Esta parasitose apresenta uma maior prevalência em crianças na faixa etária de zero a nove anos de idade (representando cerca de 80% dos casos detectados), provenientes de regiões onde a pobreza e a desnutrição são comuns (CALDAS et al., 2001, PEDROSA & ROCHA, 2004). 16 Antigamente conhecida como uma endemia rural, atualmente a LV encontra-se em expansão e urbanização, devido a fatores como: o crescimento desordenado dos grandes centros urbanos, a migração de pessoas de áreas endêmicas para estas cidades, além de mudanças ambientais como o desmatamento, presença do vetor Lutzomyia longipalpis e de animais doméstico, ausência de saneamento básico, de moradia e alimentação adequada (WHO, 2010; BARATA et al., 2013). Segundo Griensven & Diro (2012) outro fator que tem contribuído substancialmente para a expansão da LV em áreas endêmicas é a co-infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), que vem apresentando um aumento do número de casos no Brasil, em países da África, Sudeste da Europa e Sul da Ásia, (De la Loma et al., 1985). A LV é endêmica em países distribuídos em regiões tropicais, subtropicais e estima-se que, por ano, ocorram entre 200 a 400 mil novos casos da doença, com a ocorrência de 20.000 a 40.000 mortes (SUBAUSTE, 2009; KARAGIANNIS-VOULES et al., 2013; SAPORITO et al., 2013). Apesar de apresentar ampla distribuição geográfica, 90% dos casos da doença concentram-se em países como a Índia, Nepal, Sudão, Bangladesh, Etiópia e Brasil (ROCHA E PEDROSA, 2004; MALAFAIA, 2009; WHO, 2010), como pode ser visto na Figura 1. Figura 1. Distribuição da Leishmaniose Visceral ao redor do mundo. Fonte: CHAPUIS et al., 2007 No Brasil, o primeiro registro da Leishmaniose Visceral humana, ocorreu no estado de Sergipe, no ano de 1934 (CHAGAS, 1936 apud TAVARES, 1999). Enquanto na década de 90, os casos autóctones de leishmaniose visceral já haviam sido notificados em 67 dos 75 municípios sergipanos (TAVARES & TAVARES, 1999). Com a migração das pessoas de 17 áreas endêmicas do nordeste para os grandes centros urbanos, levando muitas vezes animais infectados, associado às condições necessárias para a manutenção da doença tais como a presença do vetor e a moradia em regiões de periferia (geralmente um ambiente silvestre desmatado), proporcionou a dispersão da doença para as demais regiões do país (COSTA et al., 2005). Atualmente 26 estados da federação e o Distrito Federal possuem registro de casos da leishmaniose visceral (KARAGIANNIS-VOULES et al., 2013). 2.2 Ciclo de vida de Leishmania chagasi A LV é transmitida por vetores pertencentes à ordem Diptera, família Psychodidae e gênero Phlebotominae (BARATA et al., 2013), sendo o gênero Phlebotomus no velho mundo (Europe, Asia, e Africa), e Lutzomyia no novo mundo (America) (SAPORITO et al., 2013). No Brasil a doença é transmitida pelo vetor Lutzomyia longipalpis, no entanto, estudos recentes têm apontado Lutzomyia cruzi como vetor no estado do Mato Grosso (COSTA et al., 2005). O agente etiológico da LV nas Américas é L. chagasi, que apresenta ciclo de vida do tipo heteroxênico, ou seja, uma forma promastigota flagelada extracelular no intestino do vetor invertebrado (flebotomíneo) e a forma amastigota intracelular em mamíferos infectados (hospedeiro vertebrado) (MAROVICH et al., 2000; MURRAY et al., 2005; HSIAO et al., 2008; STÄGER et al., 2010; PALETTA-SILVA & MEYER-FERNANDES, 2012 ). O ciclo de vida de L. chagasi inicia quando a fêmea do flebotomíneo Lutzomyia longipalpis infectada com L. chagasi realiza repasto sanguíneo em hospedeiro vertebrado sadio e inocula a forma promastigota metacíclica infectante nesse hospedeiro (CHAPUIS et al., 2007, COLLIN et al., 2009). A forma promastigota, por sua vez, infecta as células do sistema fagocítico mononuclear, em especial os macrófagos, onde sofrem uma alteração morfológica para a forma amastigota (LIESE et al., 2008), que após sucessivas multiplicações por divisão binária rompem o macrófago com consequente liberação das amastigotas, disseminando a infecção para as células vizinhas. O ciclo continua, quando o flebotomíneo ao exercer repasto sanguíneo em hospedeiro vertebrado infectado, ingere formas amastigotas que ao chegarem no intestino do vetor se diferenciam em formas promastigotas metacíclicas infectantes (HORTA et al., 2012) e migram para a probóscida desse inseto (Figura 2). 18 Figura 2. Ciclo de vida de Leishmania chagasi . O parasito Leishmania apresenta-se sob duas formas: promastigota extracelular no flebotomíneo e amastigota intracelular nos macrófagos do hospedeiro vertebrado. Após a inoculação das formas promastigotas, ocorre a migração dessas para as células mononucleares e órgãos viscerais do hospedeiro vertebrado onde se tranformam em amastigotas e ocasionam o desenvolvimento da doença. Fonte: Adaptado de dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/Leishmaniasis.htm. 2. 3 Imunobiologia da Leishmaniose Visceral A resposta imune na LV tem início desde o momento da inoculação das formas promastigotas infectantes juntamente com componentes presentes na saliva de Lutzomyia longipalpis, como substâncias que inibem a agregação plaquetária, e a coagulação sanguínea (Maxidilan), além de moléculas inflamatórias e imunomodulatórias, que têm importante papel no estabelecimento da infecção por L. chagasi (RIBEIRO, 1995; TITTUS et al., 2006). Uma vez a Leishmania spp. Inoculada no organismo do hospedeiro vertebrado, os neutrófilos são as primeiras células da resposta imunológica a migrarem para o local da infecção na tentativa de combater o agente infeccioso (RIBEIRO-GOMES & SACKS, 2012). Os neutrófilos infectados atuam na secreção de MIP-1 e consequentemente no recrutamento de macrófagos para o local da infecção (THALHOFER., et al 2011). Com a chegada dos macrófagos, ocorre a fagocitose das células infectadas ou de corpos apoptóticos que podem inibir a ativação dos macrófagos infectados na fase inflamatória inicial. (RIBEIRO-GOMES & SACKS, 2012), sugerindo que a Leishmania spp. utiliza PMN como 19 um mecanismo para entrar de forma silenciosa nos macrófagos (van ZANDBERGEN et al., 2004). Os macrófagos também podem fazer o reconhecimento e a fagocitose da leishmania através da proteína lipofosfoglicano (LPG) e da glicoproteína gp63 presentes em sua membrana (SHIO et al., 2012; GOTO, 2004) e se ligam a receptores de fragmento do complemento (CR1, CR3 e C3b) (SARAH et al., 2004) e a receptores de reconhecimento padrão, como os receptores do tipo TOLL, tais como TLR2, TLR4 e TLR9 (CEZÁRIO et al., 2011), presentes tanto na membrana, quanto no citoplasma e no núcleo destas células. Após o processo de fagocitose da leishmania, os macrófagos e células dendríticas, principais células apresentadoras de antígeno (APC), interagem inicialmente com os linfócitos T virgens, por meio das ligações MHCII-TCR e moléculas co-estimulatórias tais como B7.1/B7.2-CD28 e CD40-CD40L (ABBAS, 2012). A partir dessas interações, as células T virgens sofrem diferenciação em células T auxiliares (em inglês T helper) e produzem citocinas que irão determinar se a resposta imunológica será do tipo Th1 ou Th2 (ABBAS, 2012), indicando um perfil de resistência ou susceptibilidade para a LV respectivamente (ELSHAFIE et al., 2011). A resposta Th1 é uma resposta imunológica protetora e está associada com a produção de citocinas pro-inflamatórias como: interleucina 1ȕ (IL-1ȕ), fator de necrose tumoral α (TNF- α), interleucina 1β (IL-12) e interferon-Ȗ (IFN-Ȗ), que modulam a infecção por induzir um potente mecanismo leishmanicida dos fagócitos (SHARMA & SINGH, 2009), em especial dos macrófagos, que são as principais células envolvidas no controle da infecção por L. major, L. tropica e L. donovani (McDOWELL et al., 2012). Os macrófagos podem ser ativados por diferentes sinais que levam à ativação clássica mediada por produtos da resposta Th1 e células NK, tais como as citocinas IL-1ȕ, TNF- α, IFN-α e particularmente o IFN-Ȗ, que induz a expressão de óxido nítrico sintase induzida (INOS ou NOS), enzima que cataliza L-arginina para gerar óxido nítrico (NO) (ALEXANDER & BRYSON, 2005; KUMAR et al., 2012; LIU & UZONNA, 2012). Pode ainda ocorrer a produção de intermediários reativos do oxigênio (ROIs), tais como peróxido de hidrogênio (H2O2) e ânion superóxido (O2-) que degradam e eliminam o parasito (LIESE et al., 1990; ZANOVELLO, 2005; SHIO et al., 2012). Por outro lado, quando os macrófagos ativados não produzem uma resposta protetora do tipo Th1, ocorre o desenvolvimento da LV ativa e o prodomínio de uma resposta do tipo Th2 (HAILU et al., 2005; HORTA et al., 2012). A resposta Th2 é caracterizada pelo desenvolvimento de resposta imune humoral com a elevada produção de anticorpos e pela 20 produção de citocinas anti-inflamatórias, dentre as quais destacam-se a IL-4, IL-10 e TGF-ȕ que estão envolvidos na desativação de monócitos e macrófagos, na inibição da produção de radicais livres de oxigênio e nitrogênio, exercendo atividade antimicrobicida e contribuindo para a progressão das formas mais severas da LV em pacientes infectados (HAILU et al., 2005; NYLÉN et al., 2007; ANSARI et al., 2008; SHARMA & SINGH 2009; FRADE et al., 2011; KUMAR & NYLÉN, 2012). Entretanto, estudos recentes mostram que na LV ativa ocorre a produção de ambas as citocinas pro-inflamatórias (IFN-Ȗ, TNF-α e IL-12) e anti-inflamatórias (IL-4, IL-10) (GOTO & PRIANTE, 2009; COSTA et al 2012), além de células Th1 produzindo ambas IFNȖ e IL-10 (OWENS et al., 2012). 2.4 Manifestações clínicas da Leishmaniose Visceral Dependendo da resposta imunológica e das manifestações clínicas desenvolvidas pelo indivíduo, a LV apresenta-se nas formas assintomática, oligossintomática e doença progressiva. A infecção assintomática é evidenciada por positividade para o teste cutâneo de hipersensibilidade do tipo tardio (DTH+) para antígenos de leishmania (FRADE et al., 2011) e as células mononucleares de sangue periférico destes indivíduos e dos que apresentam infecção subclínica respondem para o antígeno de Leishmania com produção e proliferação de IL-2, IFN-Ȗ e IL-12 (WILSON et al 2005), caracterizando uma resposta imune protetora do tipo Th1. Por outro lado, a LV ativa, ou doença progressiva, é caracterizada por uma diminuição da resposta imune celular ao antígeno de Leishmania, associada à elevada detecção de interleucina 10 (IL-10) em células TCD4+CD25-FoxP3- e no plasma, promovendo a diferenciação e expansão das células CD4+ para o subtipo T helper 2 (Th2) (NYLEN et al., 2007), favorecendo desta forma a proliferação do parasita e a gravidade da doença e ocasionando a inibição da interleucina 12 (IL-12), principal citocina envolvida no controle da infecção de macrófagos infectados e na diferenciação de células TCD4+ para o subtipo Th1 (NYLEN et al., 2007). A apresentação clínica clássica da LV inclui sintomas como febre e perda de peso (ocasionado pela produção elevada de TNF-α, também conhecido como caquexina), palidez (causado por hemólise, mecanismos auto-imunes e hemorragias), esplenomegalia, hepatomegalia (ocasionado por hiperplasia e hipertrofia das células de Kupffer, muitas das 21 quais contendo amastigotas, além de um infiltrado de macrófagos, linfócitos T CD4 e T CD8, e outras células do plasma sem diferenciação epitelóide) (DUARTE & CORBERTT, 1987; ENGEWERDA et al., 2004; DUARTE et al., 2004). Pode ainda ocorrer, epistaxe, sangramento gengival, petéquias, taquicardia, tosse seca e menos frequentemente desconforto abdominal e diarreia (ocorre devido ao acometimento do intestino via linfonodos mesentéricos) (PASTORINO et al., 2002; GRIENSVEN & DIRO, 2012). As alterações laboratoriais incluem anemia que está associada com as altas concentrações de IgG presente nas hemácias de pacientes com LV (CARVALHO et al., 1986), também pode ocorrer hemorragias devido a trombocitopenia, trombocitopenia e neutropenia são usualmente vistos refletindo supressão da medula óssea e sequestro esplênico. Ocorre também hipergamaglobulinemia e linfadenomegalia (ORTEGA, 2003; PASTORINO et al., 2002; GRIENSVEN & DIRO, 2012). 2. 5 Caracterização do CD40L e do CD40L solúvel (sCD40L) O desenvolvimento de uma resposta imunológica protetora ou supressora na Leishmaniose Visceral depende da interação entre moléculas coestimulatórias presentes nas APCs e em células T, dentre as quais destacam-se CD40-CD40L. CD40L é uma glicoproteínaproteína transmembrana de 39 kD pertencente a superfamília de receptores TNF-α (ZHANG et al., 2012), expresso em células T e que interage com o CD40 presente em células dendríticas e macrófagos e linfócitos B. A interação CD40CD40L promove a ativação das células apresentadoras de antígeno (APCs), aumento da expressão de moléculas coestimulatórias, proliferação de células B, diferenciação e mudança de isotipo de anticorpos (SCHONBECK et al., 2001), atuando como um importante regulador central de ambas as respostas imunológicas celular e humoral (GURUNATHAN et al., 1998). A interação CD40-CD40L pode participar da polarização para uma resposta Th1 ou Th2. Uma forte interação CD40-CD40L ativa proteinocinases que são ativadas por mitógeno p38 (p38MAP) e induz a produção de citocinas pro-inflamatórias (IL-12 e TNF-α), proporcionando a diferenciação de T auxiliares efetoras (TCD4+) no subtipo Th1, que atuam na proteção do hospedeiro (MATHUR et al., 2006). No entanto, se as sinalizações entre CD40-CD40L forem fracas, ocorre a ativação de proteinocinase ativadas por receptor extracelular (ERK1 e ERK2), induzindo a produção de altos níveis da citocina antiinflamatória IL-10 e também TGF-ȕ, ocasionando a diferenciação de células T auxiliares 22 efetoras (TCD4+) no subtipo Th2 e a progressão da doença, como pode ser observado na Figura 3 (MATHUR, et al., 2006) Ativação e desativação de macrófagos Figura 3. Sinalização recíproca do CD40-CD40L. A interação entre a APC e a células T, na presença de uma forte coestimulação CD40-CD40L induz a produção das citocinas IL-12, IFN-Ȗ e IL-2 que promovem desenvolvmento de uma resposta protetora do tipo Th1 e ativação de macrófagos. Caso na interação APC-célula T a coestimulação CD40-CD40L seja fraca ocorre a produção de citocinas anti-inflamatórias TGF-ȕ, IL-10 e o desenvolvimento de uma resposta imunológica supressora do tipo Th2, com a inibição da ativação dos macrófagos. Fonte: Adaptado de MATHUR, et al., 2006. O CD40L assim como a maioria das proteínas de nosso organismo, possui uma forma solúvel que é proveniente de sua clivagem, o CD40L solúvel (sCD40L), uma proteína de 18kDa (AUKRUST et al., 2004; BILGIR et al., 2012) que tem sido identificada como biologicamente ativa em experimentos in vivo e in vitro (YACOUB et al., 2010). O sCD40L é um trímero funcional que pode executar funções semelhantes às do CD40L ligante de membrana, mas com menor força de sinalização podendo ser proveniente de dois tipos de células: plaquetas e Células T (ELGUETA et al., 2009). A interação do sCD40L com células apresentadoras de antígeno (células dendríticas, macrófagos e células B) expressando CD40, pode formar um ciclo de dano tecidual em síndromes inflamatórias agudas e crônicas ou proporcionar uma amplificação da resposta inflamatória via aumento da produção de espécies reativas de oxigênio em doenças ocasionadas por por patógenos intracelulares (RIZV et al., 2008). 23 Estudos clínicos recentes demostram que o sCD40L é um poderoso marcador bioquímico da atividade inflamatória trombótica em pacientes com síndromes coronárias agudas (HEESCHEN et al., 2003; BILGIR et al., 2012) e também está associado a doenças degenerativas como o Alzheimer, onde a interação do sCD40L com o CD40 de micróglias pode produzir substancias neurotóxicas como TNF-α que promove distrofia e demência (TOWN et al., 2001). Altos níveis de sCD40L no soro de pacientes com câncer têm sido associados com a supressão da resposta imunológica por induzir a diferenciação de células T regulatórias in vitro (HUANG et al., 2012; SCHLOM et al., 2013). Estudos experimentais in vivo e in vitro demostram que o sCD40L recombinante (rsCD40L) atua de forma efetora no controle de infecções causadas por protozoários intracelulares como Trypanosoma cruzi (HABIB et al., 2007), Plasmodium falciparum (MUKHERJEE & CHAUHAN 2008), Toxoplasma gondii (SUBAUSTE et al., 1999) e Micobacterium tuberculosis (SANTEM et al., 2003). O rsCD40L induz a ativação de macrófagos para que estes produzam intermediários reativos do nitrogênio (NO) e oxigênio (O2-), ativação de linfócitos citotóxicos TCD8+ e estimula a produção de citocinas proinflamatórias como IL-12, IFN-Ȗ (SUBAUSTE et al., 1999; HABIB et al., 2007; MUKHERJEE & CHAUHAN, 2008). 2. 6. Tratamento da Leishmaniose Visceral Os antimoniais pentavalentes são as drogas de primeira escolha no tratamento da LV há mais 70 anos em vários países do mundo. Somente nos anos 80 foi introduzida a anfotericina convencional e posteriormente as suas formulações lipídicas, pricipalmente a anfotericina B lipossomal (MONGE-MAILLO & LÓPEZ-VÉLEZ, 2013). Os antimoniais são drogas tóxicas com frequentes efeitos colaterais adversos, às vezes com risco de morte, incluindo arritmia cardíaca e pancreatite aguda. Enquanto que a amphoterin B Liposomal é considerada por muitos especialistas como a melhor droga existente contra VL (CHAPUIS, 2007), porém apresenta alto custo, o que restringe o seu uso para uma pequena parcela dos acometidos pela patologia (PALUMBO, 2008). A utilização de antimoniais e da anfotericina convencional como drogas padrão no tratamento da LV está ameaçada pelo desenvolvimento de resistência a esses medicamentos (CROFT et al., 2006). A situação é particularmente grave em Bihar, na Índia, onde mais de 24 60% de pacientes com LV não respondem à primeira linha de terapia antimonial tradicional (BHANDARI et al., 2012). Apesar do aumento dos casos de resistência à terapia medicamentosa utilizada no tratamento da LV, estudos evidenciam que uma vez curados, os pacientes desenvolvem uma resposta imunológica celular protetora do tipo Th1, evitando a reinfecção (CARVALHO et al., 1985), o que sugere a possibilidade da criação de uma vacina (GOTO et al 2011). Os indivíduos assintomáticos para LV, também desenvolvem uma resposta celular do tipo Th1, caracterizada pela produção de citocinas proinflamatórias, como IL-12 e IFN-Ȗ (FRADE et al 2011), mediada pela interação das moléculas coestimulatórias CD40-CD40L (MATHUR, et al., 2006). Estudos realizados por de Oliveira e colaboradores (2013) têm demonstrado que os pacientes com LV apresentam um aumento da produção da forma solúvel do CD40L (sCD40L) ao longo do tratamento, bem como uma redução do tamanho do baço e da carga parasitária, estando portanto associado com a cura clínica da doença. Dessa forma se faz necessário compreender qual a participação do sCD40L na infecção por L.chagasi, pois a elucidação dos mecanismos de ativação e supressão da resposta imunológica e da interação parasito-hospedeiro é de grande importância para o desenvolvimento de novas imunoterapias e imunoprofilaxias, beneficiando principalmente as populações residentes em áreas onde a doença é endêmica. 25 3. OBJETIVOS 3.1. OBJETIVO GERAL Avaliar a participação do sCD40L presente no soro de pacientes na resposta microbicida em macrófagos infectados por L. Chagasi 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Avaliar se o sCD40L ativa a resposta microbicida de macrófagos infectados por L. chagasi. Verificar se o bloqueio do sCD40L restaura a infecção e a carga parasitária em macrófagos infectados por L. chagasi. Avaliar o efeito de diferentes concentrações do rCD40L em macrófagos infectados por L. chagasi. 26 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Desenho experimental do estudo Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de doadores sadios. Após 7 dias Infecção de Mφ com L. chagasi (1célula: 10 parasitos) *Soros com altos títulos de sCD40L *Soros com altos títulos de sCD40L + anti- CD40L Incubação por 72 horas Avaliação da taxa de infecção e o do número de parasitas intracelulares *CD40L recombinante (rCD40L) em diferentes concentrações. 27 4.2. Obtenção de Células Mononucleares de Sangue Periférico (PBMC) Inicialmente foram obtidas células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de doadores sadios a partir do sangue heparinizado diluído 1:2 em salina a 0,9%, através de um gradiente de densidade pelo Ficoll-Hipaque (Pharmacia AB, Upsalla, Sweden), numa proporção de 3ml para cada 10ml de sangue e a centrifugação a 1500rpm por 35 minutos à temperatura ambiente. O anel de células mononucleares foi aspirado da interface e as células lavadas 2 vezes com salina 0,9% a 1250rpm por 10 minutos e o pellet ressuspenso em meio de cultura RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, New York, USA). Posteriormente essas células foram plaqueadas em lâminas LabTek na concentração 3x106 células/poço e incubadas por 2 horas em estufa BOD 5% CO2 a 37ºC e após esse período as células não aderentes foram lavadas 3x com solução salina 0,9% e novamente incubadas por 7 dias, tempo necessário para a diferenciação em macrófagos. 4.3 Seleção do soro contendo altos títulos de sCD40L Foram selecionados quatorze soros contendo altos títulos elevados de sCD40L (os valores do sCD40L no soro apresentaram uma média de 53.97pg/ml ± 37,06 DP), provenientes de pacientes após o tratamento da LV e também de indivíduos assintomáticos, conforme as tabelas abaixo: Tabela 1. Níveis de sCD40L no soro de indivíduos assintomáticos e pós-tratamento da LV. Pacientes Níveis sCD40L Dia do tratamento Paciente 1 70.328pg/ml D180 Paciente 2 54.905pg/ml D360 Paciente 3 40.791pg/ml D360 Paciente 4 54.905pg/ml D60 Paciente 5 30.526pg/ml D180 Paciente 6 10.010pg/ml D60 Paciente 7 27.604pg/ml D360 Paciente 8 24.249pg/ml D60 Paciente 9 120.937pg/ml D45 Paciente 10 145.551pg/ml D60 Paciente 11 46.458pg/ml D30 Paciente 12 46.810pg/ml D30 DTH+ 1 DTH+ 2 46.458pg/ml 36.114pg/ml 28 4.4. Padronização do CD40L recombinante (rCD40L) Realizamos uma curva dose resposta para avaliar se o efeito do rCD40L era dependente da dose utilizada. Para isso, foram adicionadas diferentes concentrações do rCD40L (4, 10, 25, 50, 100, 500 e 2000ng/ml), na cultura de macrófagos infectados e incubamos por de 72 horas. Para avaliar o efeito do rCD40L no período de duas horas de infecção, utilizamos somente a concentração de 2000ng de rCD40L. 4.5. Infecção de macrófagos humanos com Leishmania chagasi Os macrófagos de doadores humanos foram infectados com promastigostas de Leishmania chagasi (cepas LVHSE17) em fase estacionária de crescimento em uma razão de 1 macrófago:10 parasitos em meio RPMI 1640 (Invitrogem) Suplementado com 10% de SBF, L-glutamina 2mM, penicilina 100U/ml e estreptomicina 100µl/ml (Sigma), denominado RPMI completo. Após 2 horas de incubação a 37ºC e 5 % CO2, os parasitos não fagocitados pelos macrófagos foram removidos por lavagem com salina mais 10% SBF. Em seguida, adicionamos à cultura dos macrófagos infectados, 20% desse soro mais o isotipo do anticorpo anti-CD40L (10µg/ml). Para avaliar se o bloqueio do sCD40L reverteria a ação do sCD40L na resposta microbicida utilizamos anticorpo anti-CD40L (10µg/ml ), como controle do soro dos pacientes com altos títulos sCD40L, utilizamos uma cultura com 20% de soro bovino fetal (SBF). Ou adicionamos a cultura crescentes concentraçoes de rCD40L (descritas acima no item 4.5). Posteriormente, as culturas foram incubadas em estufa CO2 5% a 37ºC em diferentes tempos de infecção (2 e 72 horas). A capacidade microbicida foi determinada a partir da avaliação do número de macrófagos infectados e do número de parasitas intracelulares. Para tanto, lâminas LabTek foram coradas com Panótipo rápido e posteriormente, 100 células foram analisadas em objetivas de imersão (1000x). 4.6. Aspectos Éticos Este projeto envolve pesquisa com seres humanos e segue as instruções da resolução 196/96, sendo que uma parte do soro de pacientes com LV está incluída no projeto que foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa do Hospital Universitário da 29 Universidade Federal de Sergipe (CAAE-0151.0.107.000.07). Além disso, parte do projeto que envolve pesquisa para obtenção de células de pacientes normais foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa do Hospital Universitário da Universidade Federal de Sergipe (CAAE-0123.0.107.000.11). 4.7. Análise Estatística Os resultados obtidos após a execução dos objetivos 1 e 2 foram avaliados quanto às diferenças estatísticas utilizando diferentes testes. Para comparações entre dois grupos foi utilizado Mann-Whitney test e para análise de dados pareados foi utilizado Wilcoxon signed rank test, ambos realizados no Software GraphPad Prism 5, com intervalo de significância de 95%, sendo os valores considerados estatisticamente significativos quando p < 0,05. 30 5. RESULTADOS Pacientes com LV ativa e indivíduos assintomáticos apresentam diferentes concentrações de proteínas plasmáticas em seu soro (de OLIVEIRA et al 2013). Dessa forma, avaliamos se o fator de proteção contra o parasito presente no soro destes pacientes é capaz de modular a infecção de macrófagos por L. chagasi. Para isso, realizamos infecção de macrófagos humanos de doadores sadios com Leishmania chagasi e em seguida adicionamos nessas culturas o soro de pacientes com LV ativa ou o soro de indivíduos assintomáticos. Como observamos na figura 4(a e b), a infecção foi de 10% nos macrófagos incubados com o soro de pacientes com LV ativa, enquanto que nos macrófagos cultivados na presença de soro de pacientes assintomáticos, a infecção foi de 5%, ou seja, houve uma redução de 50% da taxa de macrófagos infectados e também do número de parasitos intracelulares, o que % M infectados 50 a) 40 *p = 0.0199 30 20 10 0 LV Assintomático Número Amastigotas/100 M sugere a existência de um fator de proteção que atua no combate à infecção por L. chagasi. 50 b) 40 *p = 0.015 30 20 10 0 LV Assintomático Figura 4. Soro de pacientes com LV suprime a resposta de macrófagos infecatdos por L. chagasi. Macrófagos humanos obtidos de PBMC de doadores sadios foram infectados com promastigostas de L. chagasi e posteriormente incubados por 72 horas com 20% de soro de indivíduos assintomáticos (n=2) ou 20% de soro de pacientes com LV (n=3). Para análise estatística foi utilizado o Mann Whitney test e o valor considerado significativo quando p < 0.05. Uma vez que o soro de indivíduos assintomáticos adicionado à cultura de macrófagos infectados por L. chagasi foi capaz de reduzir de forma significativa a infecção e de acordo com Oliveira et al., (2013) o soro de indivíduos assintomáticos, bem como o soro pacientes após o tratamento da LV, possui altos títulos da molécula sCD40L, avaliamos se a redução da infecção dos macrófagos tinha a participação do sCD40L. Utilizamos diferentes tempos de 31 infecção, dentre os quais optamos pelo tempo de 72 horas, conforme descrito por Nylén et al., (2007), que avaliou o efeito imunosupressor do soro com altos títulos de IL-10 (provenientes de pacientes com LV) na infecção por L. donovani. Além do número restrito de soros contendo altos títulos de sCD40L disponível para a realização dos experimentos. Como pode ser observado na figura 5(a e b), no grupo Meio a infecção de macrófagos foi de aproximadamente 28% e o número de parasitos intracelulares em torno de 55%. No entanto, quando adicionamos soro com altos títulos de sCD40L na cultura, houve uma redução do percentual de macrófagos infectados (43% p=0.01) e o número de parasitos intracelulares quando comparado ao meio (58% p=0.01). Foi observado ainda que o bloqueio do sCD40L com o anti-CD40L, conseguiu reverter a infecção, pois houve uma elevação da taxa de macrófagos infectados (24% p=0.03), bem como do número de parasitas intracelulares a) 40 % M infectados *p = 0.01 30 **p = 0.03 20 10 0 Meio sCD40L sCD40L + anti-CD40 Número Amastigotas/100 M (33% p=0.02). b) 100 80 *p = 0.01 60 **p = 0.02 40 20 0 Meio sCD40L sCD40L + anti-CD40 Figura 5. sCD40L contribui para o controle da infecção por L. chagasi em macrófagos humanos. Macrófagos humanos obtidos de PBMC de doadores sadios foram infectados com promastigostas de L. chagasi e posteriormente incubados com 20% de SBF ou 20% de soro com altos títulos de sCD40L e tratados com anti-CD40L ou isotipo controle do anticorpo (n=14) . Foi utilizado * Mann Whitney e **Wilcoxon signed rank test e o valor considerado significativo quando p<0.05. Como observado acima, o sCD40L é uma molécula que participa do controle da infecção por L.chagasi e os soros dos pacientes apresentam diferentes concentrações dessa molécula, por isso decidimos avaliar se o seu efeito protetor sofria variação em função da concentração, bem como queriamos estabelecer uma concentração de rCD40L que possa ser usada nos experientos futuros. Para isso, utilizamos CD40L recombinante (rCD40L) que apresenta efeito similar à molécula acima citada e fizemos uma curva dose resposta com concentrações que variaram de 4ng/ml a 2000ng/ml. Como observamos na figura 6(a e b), 32 quanto maior é a dose do rCD40L, menor é a taxa de infecção dos macrófagos e do número de amastigotas. No entanto, vale salientar que a partir da concentração de 100ng/ml de rCD40L os níveis de infecção se mantêm estáveis, o que indica que em determinado ponto o rCD40L apresenta o seu limiar de ação, provavelmente pela saturação do receptor. a) 40 % M infectados p = 0.007 p = 0.024 30 p = 0.006 20 10 0 Número Amastigotas/100 M rCD40L 80 b) p =0.026 60 p =0.005 40 20 0 rCD40L Figura 6. Curva dose-resposta do rCD40L. Macrófagos humanos obtidos de PBMC de doadores sadios foram infectados com L.chagasi e incubados por 72 com diferentes concentrações do rCD40L. (A) Porcentagem de macrófagos infectados e (B) número de parasitos intracelulares. 33 Por fim decidimos avaliar se a presença do rCD40L modulava a captação de Leishmania por macrófagos. Para isso, infectamos macrófagos de doadores sadios com promastigotas de L. chagasi, duas horas após a infecção os parasitos que estavam fora das células foram removidos por lavagem e em seguida, adicionamos rCD40L (2µg/ml), rCD40L + anti-CD40L ( 2µ g/ml) ou 20% de SBF(condição meio) e incubamos por mais duas horas para avaliar a infecção. Foi observado que a porcentagem de macrófagos infectados foi de aproximadamente 70% (Figura 7a) e o número de parasitos intracelulares foi próximo a 200 (Figura 7b) em todas as condições avaliadas: meio, rCD40L, rCD40L + anti-CD40L. O que demonstrou que o rCD40L não interferiu na captaçãodo parasito pelo macrófago. Número M infectados 100 a) 80 60 40 20 0 Meio Amastigotas/100 M 300 rCD40L rCD40L + anti-CD40L b) 200 100 0 Meio rCD40L rCD40L + anti-CD40L Figura 7. rCD40L não altera a captura de L.chagasi nas primeiras 2 horas de infecção. Macrófagos humanos obtidos de PBMC de doadores sadios foram infectados com L. chagasi e incubados por 2 horas na presença de 20% de SBF, rCD40L e rCD40L + Anti-CD40L. (A) Porcentagem de macrófagos infectados e (B) número de parasitos intracelulares. 34 6. DISCUSSÃO O sCD40L é uma molécula amplamente investigada em doenças cardiovasculares, onde atua como um bom marcador de risco cardiovascular. No entanto a realização de estudos que avaliem o papel dessa molécula em doenças parasitárias infecciosas é escassa. Recentemente, Oliveira e colaboradores (2013) demonstraram que o soro de indivíduos assintomáticos e de pacientes após o tratamento da LV, possui altos títulos de citocinas proinflamatórias e também de moléculas coestimulatórias, dentre as quais o sCD40L. Nesse trabalho foi observado que sCD40L presente no soro de pacientes com LV está relacionado ao desenvolvimento de uma resposta imunológica protetora por ativar mecanismos microbicidas de macrófagos para o controle da infecção por L. chagasi. Inicialmente, foi demonstrado que o soro de indivíduos assintomáticos adicionados à cultura de macrófagos infectados com L. chagasi controlou de forma mais eficente a infecção, do que o soro de pacientes com leishmaniose visceral ativa. Resultado semelhante foi observado em estudo realizado por Nylén et al (2007) e Singh et al (2012), onde macrófagos humanos infectados com L. donovani e incubados com soro de indivíduos provenientes de áreas endêmicas (EC) apresentaram uma redução da carga parasitária quando comparados aos monócitos de pacientes incubados com o soro de pacientes com LV. Um dos fatores associados ao desenvolvimento de uma resposta protetora menos eficiente nos indivíduos com LV pode está associada com imunossupressão mediada pelo soro, uma vez que estudos clínicos têm demonstrado que o soro de indivíduos com LV ativa possui altos níveis da citocina IL-10 (BARRAL ET al., 1988; NYLÉN et al., 2007), que atua na inibição da produção de IL-12 e também inibe a ativação de macrófagos. Todavia, o soro dos controles endêmicos de LV possuem elevados níveis de moléculas coestimulatórias, citocinas como TNF-α e principalmente o IFN-Ȗ, que estão associados ao desenvolvimento de uma resposta imunológica do tipo protetora na LV (GAUTAM et al., 2011; SINGH et al., 2012), por promover a ativação dos mecanismos microbicidas dos macrófagos Apesar da realização de numerosos estudos in vitro e in vivo demonstrarem o papel protetor da interação CD40-CD40L na infecção por Leishmania spp., a partir da utilização de proteínas recombinantes (SHU et al., 1995; CAMPBELL et al., 1995; ZHOU & SEDER, 1998, McDOWELL et al., 2002, MURRAY et al., 2003; SUBAUSTE et al., 2009), esse estudo é 35 o primeiro a utilizar o soro com altos títulos de sCD40L provenientes de pacientes, para avaliar a sua ação em macrófagos infectados por L. chagasi. No presente estudo, demonstrou-se que o sCD40L, uma molécula coestimulatória presente em altos níveis no soro de indivíduos assintomáticos e de pacientes após o tratamento da LV, tem a capacidade de ativar os mecanismos microbicidas dos macrófagos, reduzindo a infecção por L. chagasi. Trabalhos com rCD40L descrevem sua participacao na ativacao da resposta microbicida e Th1. McDOWELLet al., (2002), reportaram que macrófagos murinos infectados com L. major, na presença de CD40L recombinante (rCD40L) apresentaram uma redução da taxa de infecção e do número de parasitos intracelulares por macrófago.Habib et al., 2007, também demostraram que na infecção experimental in vivo por T. cruzi o rCD40L promoveu um decréscimo da parasitemia e aumento da sobrevida dos camundongos, sugerindo capacidade protetora. Samten e colaboradores (2003) e Klug-Micu e colaboradores (2013) demonstraram que a infecção de monócitos humanos por Mycobacterium tuberculosis na presença de rCD40L evidenciam o aumento da capacidade funcional de linfóticos T citotóxicos CD8+, a partir da produção das citocinas proinflamatórias IL-12 e IL-18, com do decréscimo da parasitemia. Nos estudos acima descritos , a principal via de ativação dos macrófagos foi a partir da citocina IFN-Ȗ produzida pelas células T, resultando na morte do parasita através da produção de espécies reativas do nitrogênio e oxigênio. Apesar de estudos demonstrarem que a interação CD40-CD40L controla a fusão do vacúolo com o lisossomo no macrófago aumentando a captação de Toxoplasma gondii, via ativação da cascata de sinalização de receptores TNF-α (SUBAUSTE, 2009) , em nosso estudo não foi observado aumento da captura de L. chagasi e ativação dos mecanismos microbicidas dos macrófagos no período inicial da infecção, pois a entrada do parasita nas primeiras 2 horas foi semelhante independente da presenca do sCD40L e o controle da infeccao foi mais tardio, no período de 72 horas. Para uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na ativação dos macrófagos a partir do sCD40L se faz necessário a realização de dosagem de citocinas, para averiguar se estão sendo produzidas as citocinas proinflamatórias IL-12 e IFN-Ȗ que induzem o desenvolvimento de uma resposta protetora do padrão Th1, ou se estão sendo produzidas citocinas regulatórias e anti-inflamatórias IL-10 e TGF-ȕ respectivamente, que culminam com o desevolvimento da doença. Pois essa é a primeira vez que a molécula de sCD40L 36 proveniente do soro de pacientes pós-tratamento e de indivíduos assintomáticos da LV foi utilizada demonstrando a sua ação protetora no controle da infecção por L. chagasi. Em resumo, nossos estudos indicam que o sCD40L promove o aumento da atividade microbicida em macrófagos infectados por L. chagasi. Porém, os mecanismos que estão envolvidos na morte do parasito precisam ser melhor estudados . 37 7. CONCLUSÃO A partir dos resultados obtidos, sugerimos que o sCD40L presente no soro de pacientes assintomátcos e pós- tratamento da LV está relacionado ao desenvolvimento de uma resposta imunológica protetora por ativar mecanismos microbicidas dos macrófagos para o controle da infecção por L. chagasi. 38 REFERÊNCIAS ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S. Imunologia Celular e Molecular. 7ª edição. Rio de Janeiro: Elsevier, 2012. ALEXANDER, J. & BRYSON, K. T helper (h)1/Th2 and Leishmania: paradox rather than paradigm. Immunology Letters. Vol 99: 17–23, 2005. ALVAR, J.; VELEZ, I. D.; BERN, C.; et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. Vol.7, 2012. AMÓRA, S. S. A; SANTOS, M. J. P; ALVES, N. D; et al. Fatores relacionados com a positividade de cães para leishmaniose visceral em área endêmica do Estado do Rio Grande do Norte, Brasil. Revista Ciência Rural. V.36: 1854-1859, 2006. ANDRADE, R. M.; PORTILLO J. A. 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