Obtenção de plantas transgênicas contendo o cassete de super

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51º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 51º Congresso Brasileiro de Genética • 7 a 10 de setembro de 2005
Hotel Monte Real • Águas de Lindóia • São Paulo • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 85-89109-05-4
[email protected]
Palavras-chave: Reparo por Excisão de Bases, AP endonuclease, Cana-de-açúcar
Cardoso, CQ; Medeiros, SRB; Agnez-Lima, LF; Scortecci, KC
Laboratório de Biologia Molecular e Genômica, Depto de Biologia Celular e Genética – UFRN.
Obtenção de plantas transgênicas
contendo o cassete de super-expressão
do cDNA scARP1 de cana-de-açúcar
As AP endonucleases são enzimas que participam do Reparo por Excisão de Bases, onde reconhecem e clivam
os sítios abásicos (sítios AP) gerados pela ação de agentes mutagênicos e das N-glicosilases. Sua ação está bem
caracterizada em E.coli, leveduras e humanos, entretanto, em plantas não é muito conhecida. No genoma da
cana-de-açúcar foram encontradas duas seqüências com alta identidade a AP endonuclease: scARP1 e scARP3.
O resultado de uma análise filogenética realizada propõe que as duas seqüências sejam codificadas por dois
genes diferentes e que um deles poderia ser uma duplicação originada em monocotiledôneas. Assim sendo, o
objetivo deste trabalho é caracterizar a função do cDNA scARP1 através da construção de cassetes de superexpressão e transformação de plantas: cana-de-açúcar (monocotiledônea), Arabidopsis thaliana e Nicotina tabacum
(dicotiledôneas). Inicialmente, foi realizada uma clonagem deste cDNA em dois vetores de super-expressão, o
pAHC17, vetor para monocotiledôneas, contendo o promotor forte do gene Ubiquitina, e o pKCS19, vetor
para dicotiledôneas, possuindo como promotor forte o do vírus CaMV35S. Para o vetor pAHC17 foram obtidas
as construções nas orientações sense e anti-sense, e para o vetor pKCS19, na orientação sense. Em seguida,
para o vetor pKCS19, foi realizada a subclonagem do cassete de expressão (CaMV35S+scARP1) para o vetor
binário de Agrobacterium pPZP211. Para realizar essa clonagem, o vetor binário foi digerido com a endonuclease
de restrição BamHI, tratado com a enzima de modificação T4 DNA polimerase, para criar pontas cegas e,
posteriormente, tratado com a enzima de modificação fosfatase alcalina, para remover o grupo fosfato 5`,
impedindo a recircularização do vetor. O cassete de expressão scARP1 foi digerido com as endonucleases de
restrição NotI e SalI, tratado com T4 DNA polimerase e ligado ao vetor com T4 DNA ligase. Essa construção
foi transformada por eletroporação em E. coli, onde foram realizadas extrações de DNA e PCRs para confirmar
a subclonagem. Posteriormente, a construção foi transformada por conjugação para a Agrobacterium tumenfaciens.
De posse da Agrobacterium tumenfaciens contendo a seqüência de super-expressão, as plantas de Nicotina tabacum
foram transformadas por inoculação dos discos foliares e as plantas de Arabidopsis thaliana por infiltração dos
botões florais. A transformação da cana-de-açúcar foi realizada por bombardeamento pelo CTC. A presença
do cassete de super-expressão nas plantas de Nicotina tabacum foi confirmada em 4 plantas, por PCR. Foram
obtidas 4 plantas de cana-de-açúcar, as quais foi realizada uma RT-PCR para verificar a expressão do cassete.
Nossos resultados mostraram que na planta contendo a construção em orientação sense há um pequeno
aumento da expressão, e nas plantas com a orientação anti-sense, por haver variação na expressão, esta será
analisada minuciosamente. A obtenção destas plantas com super-expressão de scARP1 permitirá analisar seu
desenvolvimento, na presença ou ausência de agentes mutagênicos.
Auxílio Financeiro: PADCT/CNPq, SINTEC/RN, Banco do Nordeste.
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