Texto Completo - Apresentação

CENTRO UNIVERSITÁRIO FRANCISCANO
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
ÁREA DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS
Curso de Mestrado em Nanociências
GRACIELA SCHNEIDER VITALIS
UTILIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE CLOREXIDINA COMO
ALTERNATIVA DE MEDICAÇÃO INTRACANAL.
Santa Maria, RS
2012
GRACIELA SCHNEIDER VITALIS
UTILIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE CLOREXIDINA COMO
ALTERNATIVA DE MEDICAÇÃO INTRACANAL.
Dissertação apresentado ao Curso de Mestrado
em Nanociências do Centro Universitário
Franciscano de Santa Maria como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em
Nanociências.
Orientador(a): Prof(a). Dr(a). RENATA PLATCHECK RAFFIN
Santa Maria, RS
2012
“Se vi mais longe foi por ter me apoiado em ombros gigantes”
Isaac Newton
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais pela oportunidade e valorização do estudo, pela dedicação a
mim prestada, e apoio em cada decisão tomada.
Ao meu grande marido, Carlos F. Brilhante Wolle, pelo amor eterno, palavras de
incentivo, colaboração, dedicação e paciência, muita paciência. Sem o teu apoio seria
impossível realizar qualquer sonho.
Ao meu filho Érico, que me ensinou o que é o verdadeiro amor, e a importância que
tem um simples e sincero sorriso.
Às pessoas que de uma forma ou outra, me deram suporte para estar ausente, me
substituindo em afazeres diários, fazendo com que, mesmo a distancia, eu tivesse confiança e
serenidade para saber que meu filho estava bem. Em especial à Jussara.
Ao meu irmão Alex e minha cunhada Maitê, pelo companheirismo, dedicação e todo
apoio desprendido a minha família.
Ao meu sogro, cunhados, concunhadas e sobrinhos, pelos fins de semana de
descontração e momentos de alegria. Em especial à Luciana, por ter se mostrado forte e
segura nos momentos em que tudo parece ruir.
Aos meus amigos, que por hora, um pouco afastados devido às circunstâncias, nunca
deixaram de estar ao meu lado. Em especial a Mariana Sudati Rodrigues, pela cumplicidade e
dedicação à nossa amizade.
Aos meus colegas de mestrado, que foram muitos, pelo companheirismo, ajuda mútua
e horas descontraídas no laboratório, em especial à Michelli, Ricardo, Delita, Fran e Ana.
À Gabi Farias, pela amizade, oportunidade de convívio e muita ajuda no laboratório.
À Isabel Roggia e Gabi Moraes, pelo apoio e auxílio nas horas de maior sufoco,
sempre dispostas a nos ajudar.
A aluna Camilla Filippi, pela dedicação e auxílio no laboratório de microbiologia.
Aos professores Roberto Christ e Sandra Cadore pela colaboração a este trabalho.
À professora Patrícia Gomes pela dedicação e carinho com que trata a docência.
Aos demais professores do Mestrado em Nanociência, por todo conhecimento
ofertado, colaborando para o meu crescimento pessoal e profissional.
Ao Anderson Veras Maciel pela receptividade e disposição.
À Karla, Gustavo, Madjer, Micheline e Fernanda Corrêa, pelo auxílio e colaboração.
À PUCRS e UFPEL pela oportunidade de trabalhar com pessoas dedicadas e dispostas
a colaborar para o desenvolvimento deste trabalho, em especial ao Juliano Soares, Luciana
Zollmann, Professora Dra. Adriana Etges e Silvana Pereira de Souza.
Às pessoas que nasceram com o dom de fazer da docência a sua profissão, me fazendo
entender que pesquisa não se faz sozinho, e que o conhecimento é uma troca de experiência:
Professora Solange Fagan, que foi a grande incentivadora desta “louca aventura”, pela
amizade e doação ao meio acadêmico.
Professora Maria Martha Campos, pelo exemplo, incentivo, acolhimento e
colaboração.
E à professora, e minha orientadora, Renata Raffin, pela coragem de ter aceitado o
desafio de me orientar, dedicando a mim muita paciência, conhecimento, palavras de
incentivo e amizade. O que me possibilitou desvendar os mistérios de se fazer pesquisa,
servindo de exemplo e estímulo à docência.
Muito Obrigada!
RESUMO
A medicação intracanal tem por objetivo eliminar os microrganismos presentes no
interior do sistema de canais radiculares, possibilitando o reparo dos tecidos perirradiculares
danificados pela ação microbiana. Apesar dos inúmeros medicamentos utilizados, ainda não
existe um fármaco ideal. Assim, este estudo visa desenvolver e caracterizar nanopartículas
contendo clorexidina, avaliar seu processo de degradação na associação com a pasta de
hidróxido de cálcio e analisar sua eficácia através de testes in vitro e in vivo. Foram
desenvolvidas e caracterizadas nanopartículas lipídicas sólidas contendo clorexidina nas
concentrações de 0,2 e 0,5 %, na forma de suspensão e gel, apresentando valores de tamanho
médio de partícula de 88,5 nm e 84,6 nm, respectivamente. As amostras foram armazenadas
por 90 dias mantendo-se estáveis em temperatura ambiente e geladeira, porém instáveis em
estufa a 40°C. O doseamento da clorexidina livre associada à pasta de hidróxido de cálcio
mostrou uma redução de 33 % de fármaco após 14 dias de análise, já a clorexidina
nanoencapsulada sofreu degradação de apenas 10 % do seu total. O teste de difusão em ágar
frente à C. albicans e E. faecalis, pelo período de 72 h, mostrou halos de inibição de menor
tamanho, porém com aumento crescente. Apesar deste resultado aparentemente desfavorável,
a concentração inibitória mínima mostrou valores iguais para as nanopartículas em
comparação ao fármaco livre frente aos mesmos microrganismos. Para observar a penetração
das nanopartículas no interior dos túbulos dentinários foi utilizado como método de análise a
microscopia eletrônica de varredura associada à energia dispersiva de raios X, através da
identificação de átomos de cloro. Esta técnica permitiu observar a presença das nanopartículas
no interior dos túbulos e depositadas sobre a superfície dentinária. No teste in vivo em ratos,
foi possível observar, radiograficamente e histologicamente, a ação das nanopartículas
lipídicas de clorexidina, inclusive da associação à pasta de hidróxido de cálcio, melhorando as
propriedades microbianas da mistura. Os resultados sugerem que a clorexidina pode ser
associada a nanopartículas lipídicas sólidas, mantendo a ação antimicrobiana da clorexidina,
possibilitando seu uso como medicação intracanal em Odontologia e auxiliando na
preservação do fármaco quando em associação com a pasta de hidróxido de cálcio evitando
sua degradação pelo elevado valor de pH.
Palavras-chave: clorexidina, hidróxido de cálcio, medicação intracanal, nanopartículas
lipídicas sólidas.
ABSTRACT
Intracanal medication aims to eliminate micro-organisms present within the system of
canals, making the repair of tissues damaged by microbial action. Despite the numerous drugs
used, there is not an ideal drug. This study aimed to develop and characterize nanoparticles
containing chlorhexidine. Furthermore, it aimed to evaluate its degradation when associated to
calcium hydroxide, and to analyze their performance in vitro and in vivo. Solid lipid
nanoparticles containing chlorhexidine were developed and characterized in concentrations of
0.2 and 0.5 % chlorhexidine (suspension and gel), showing average particle size values of
88.5 nm and 84.6 nm, respectively. The samples were stored for 90 days and remained stable
at 5°C and room temperature, but unstable at 40°C. The free chlorhexidine concentration
reduced in 33% when associated to calcium hydroxide after 14 days of analysis. O the other
hand, nanoencapsulated chlorhexidine degraded only 10 % at the same conditions. The agar
diffusion test against C. albicans and E. faecalis, for 72 h, showed smaller zone of inhibition
but they increased size. Despite this seemed unfavorable, the MIC result showed equal values
for chlorhexidine in free form and in nanoparticles. To verify the penetration of nanoparticles
in the dentin tubules, SEM/EDS was used, through the identification of chlorine atoms,
allowing the observation of nanoparticles in the interior of dentin tubules and deposited on the
dentin surface. In the in vivo test using rats, it was able to observe, histologically and
radiographically, the effect of the lipid nanoparticles, including when associated to calcium
hydroxide, improving the antimicrobial properties of the association. These results suggest
that chlorhexidine can be associated to solid lipid nanoparticles, keeping its antimicrobial
effect, enabling its use as intracanal medication in dentistry, and assisting in the preservation
of the drug when in association with calcium hydroxide paste to avoid their degradation by
high pH value.
Keywords:
nanoparticles.
calcium
hydroxide,
chlorhexidine,
intracanal
medication,
solid
lipid
LISTA DE ABREVIATURAS
ACN – Acetonitrila;
ANOVA – Análise de Variância;
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária;
ATCC – American Type Culture Collection;
B&B – Microscopia óptica Brown e Brenn
BHI – Brain Heart Infusion;
BV – Balão volumétrico;
CA – Acetato de clorexidina;
CDA – Diacetato de clorexidina;
CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais;
CIM- Concentração inibitória mínima;
CL – Clorexidina;
CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência;
COBEA – Conselho Brasileiro de Experimentação Animal;
DMSO – Dimetil sulfóxido;
DP – Desvio Padrão;
DPR – Desvio Padrão Relativo;
EDS – Espectrometria dispersiva de raios-X;
EDTA – Ácido Etilenodiaminotetracético;
ES – Estufa;
GE – Geladeira;
HCA – Pasta de hidróxido de cálcio;
IARC – International Agency of Research on Cancer;
IPD – Índice de polidispersão;
LPS – Lipopolissacarídeo;
MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura;
MET – Microscopia Eletrônica de Transmissão;
MFA – Microscopia de Força Atômica;
MHA – Agar Muller-Hinton;
MMT – montmotilonita;
NBR - Nanopartículas Lipídicas Sólidas sem o fármaco;
NC – Nanocápsulas;
NCL – Nanopartículas Lipídicas Sólidas de Clorexidina;
PCL – Poli (ε-caprolactona);
PLGA – Poli (L-ácido láctici-co-ácido glicólico);
PUCRS – Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul;
TA – Temperatura ambiente;
UFC – unidades formadoras de colônia;
UFPEL – Universidade Federal de Pelotas;
UFRGS – Universidade Federal do Rio grande do Sul;
UNIFRA – Centro Universitário Franciscano.
SUMÁRIO
LISTA DAS FIGURAS .......................................................................................................... 15
LISTAS DAS TABELAS ....................................................................................................... 18
1.
INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 18
1.1. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 19
2. REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................................ 20
2.1. A ESTRUTURA DENTÁRIA .......................................................................................... 20
2.2. O TRATAMENTO ENDODÔNTICO .............................................................................. 23
2.3. A CLOREXIDINA ............................................................................................................ 26
2.4. AS NANOPARTÍCULAS ................................................................................................. 32
3. METODOLOGIA............................................................................................................... 37
3.1. DESENVOLVIMENTO DE NANOPARTÍCULAS CONTENDO CLOREXIDINA ..... 37
3.1.1. Teste de solubilidade ...................................................................................................... 37
3.1.2. Preparo das suspensões contendo nanocápsulas de clorexidina ..................................... 37
3.1.3. Preparo das suspensões contendo nanopartículas lipídicas sólidas de clorexidina. ....... 38
3.1.4. Preparo dos géis contendo NCL. .................................................................................... 40
3.2. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS ........................................................ 41
3.2.1. Determinação do potencial zeta...................................................................................... 41
3.2.2. Determinação do índice de polidispersão e diâmetro das partículas .............................. 41
3.2.3. Determinação do pH ....................................................................................................... 41
3.2.4. Validação da metodologia para doseamento da clorexidina .......................................... 42
3.2.4.1. Métodos Cromatográficos ........................................................................................... 42
3.2.4.2. Preparo das amostras para o doseamento da clorexidina ............................................ 42
3.3. DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE DAS SUSPENSÕES E GÉIS CONTENDO
NCL............. ............................................................................................................................. 43
3.4. ENSAIO MICROBIOLÓGICO ........................................................................................ 43
3.4.1. Preparo da suspensão microbiana ................................................................................... 43
3.4.2. Concentração inibitória mínima ..................................................................................... 44
3.4.3 Teste de difusão em ágar com cilindro de aço inoxidável ............................................... 46
3.5. AVALIAÇÃO IN VITRO DA DEGRADAÇÃO DA CLOREXIDINA QUANDO
ASSOCIADA À PASTA DE HIDRÓXIDO DE CÁLCIO ..................................................... 47
3.5.1. Divisão dos grupos ......................................................................................................... 47
3.5.2. Preparo das amostras ...................................................................................................... 48
3.5.3. Determinação do pH ....................................................................................................... 49
3.5.4. Doseamento da clorexidina ............................................................................................ 49
3.6. PROFUNDIDADE DE PENETRAÇÃO NOS TÚBULOS DENTINÁRIOS .................. 50
3.6.1. Obtenção dos dentes humanos ........................................................................................ 50
3.6.2. Preparo das amostras ...................................................................................................... 50
3.7. ESTUDO IN VIVO ............................................................................................................ 52
3.7.1. Distribuição dos grupos e cálculo do tamanho da amostra ............................................ 53
3.7.2. Indução das lesões periapicais ....................................................................................... 54
3.7.3. Instrumentação e preenchimento do canal..................................................................... 54
3.7.4. Exame radiográfico......................................................................................................... 54
3.7.5. Análise histológica ......................................................................................................... 55
3.7.6. Análise Estatística .......................................................................................................... 56
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 57
4.1. PREPARO DAS NANOPARTÍCULAS CONTENDO CLOREXIDINA ........................ 57
4.1.1. Teste de solubilidade ...................................................................................................... 57
4.1.2. Preparo das nanocápsulas poliméricas de clorexidina.................................................... 57
4.1.3. Preparo das NCL ............................................................................................................ 58
4.2. CARACTERIZAÇÃO DAS NCL ..................................................................................... 59
4.3. DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE DAS SUSPENSÕES E GÉIS CONTENDO
NCL.... ...................................................................................................................................... 64
4.3.1. Diâmetro médio das partículas e índice de polidispersão............................................... 64
4.3.2. Análise do pH e doseamento .......................................................................................... 68
4.4. AVALIAÇÃO IN VITRO DA DEGRADAÇÃO DA CLOREXIDINA ASSOCIADA À
PASTA DE HIDRÓXIDO DE CÁLCIO ................................................................................. 71
4.4.1. Análise do pH ................................................................................................................. 72
4.4.2. Doseamento .................................................................................................................... 73
4.5. ANÁLISE MICROBIOLÓGICA ...................................................................................... 75
4.5.1. Teste de difusão em ágar ................................................................................................ 75
4.5.2. Concentração inibitória mínima (CIM) .......................................................................... 77
4.6. PENETRAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS NOS TÚBULOS DENTINÁRIOS .......... 78
4.7. ESTUDO IN VIVO EM RATOS ....................................................................................... 84
4.7.1. Análise radiográfica ........................................................................................................ 84
4.7.2. Análise histológica ......................................................................................................... 87
5. CONCLUSÃO..................................................................................................................... 92
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 94
ANEXOS ............................................................................................................................... 108
ANEXO 1 – Validação da metodologia analítica para doseamento da clorexidina nas
suspensões e géis de nanopartículas. ................................................................................... 108
1. Especificidade..................................................................................................................... 108
2. Linearidade ......................................................................................................................... 109
3. Precisão e repetibilidade ..................................................................................................... 110
4. Exatidão .............................................................................................................................. 111
ANEXO 2 – Carta de aprovação pelo comitê de ética para realização do experimento em
ratos..... .................................................................................................................................. 113
ANEXO 3 – Carta de aprovação do comitê de ética para estudo utilizando dentes
humanos................................................................................................................................. 114
LISTA DAS FIGURAS
Figura
1:
Estrutura
dentária
e
sua
divisão
morfológica.
http://dentistaemcuritiba.wordpress.com/2010/01/10/dentista-em-curitiba-tratamento-decanal/ ......................................................................................................................................... 20
Figura 2: Estrutura dentária, em destaque a presença dos túbulos dentinários. ....................... 21
Figura 3: Estrutura dentária com presença de cárie e contaminação do tecido pulpar. ............ 21
Figura 4: Micrografias mostrando a presença de E. faecalis no interior dos túbulos dentinários
de dentes bovinos. Microscopia eletrônica de varredura (Hapassalo e Orstavik, 1987). ......... 22
Figura 5: Infecção dos túbulos dentinários de dentes bovinos por E. faecalis. B&B stain
microscopia óptica (Hapassalo e Orstavik, 1987). ................................................................... 22
Figura 6: Esquema didático demonstrando a sequência de procedimento do tratamento
endodôntico: preparo biomecânico, conometria e obturação. .................................................. 23
Figura 8: Estrutura química da clorexidina .............................................................................. 26
Figura 9: Representação esquemática de (a) nanocápsulas e (b) nanoesferas; e B.
Representação esquemática de nanopartículas lipídicas sólidas (STROHER, ARMIJO e
RAFFIN, 2010). ........................................................................................................................ 33
Figura 10: Método de obtenção de nanopartículas lipídicas sólidas contendo clorexidina por
altas taxas de cisalhamento. A) Fase oleosa; B) Fase aquosa; C) Ultra-Turrax ....................... 40
Figura 11: Fluxograma ilustrativo da microdiluição para determinação da CIM. ................... 45
Figura 12: Placas de 96 poços para microdiluição e definição das CIMs. ............................... 45
Figura 13: Desenho ilustrativo dos procedimentos realizados para o teste de difusão em ágar
com cilindros de aço inoxidável. .............................................................................................. 46
Figura 14: Esquema de distribuição das amostras na placa petri. ............................................ 47
Figura 15: Etapas realizadas para o preparo das amostras. A) e B) A associação dos géis à
pasta de hidróxido de cálcio foi feita na proporção 1:1, em peso; C) Mistura dos géis; D) Géis
armazenados em recipiente e ambiente apropriado. ................................................................. 48
Figura 16: Preparo das amostras para análise em CLAE. A) Géis e pastas foram pesados em
um balão volumétrico de 10 mL; B) Os balões foram agitados no vortex por 5 minutos; C)
Géis levados para sonicar por 15 minutos; D) O conteúdo dos balões foi transferido para
tubos de ensaios e depois para centrífuga por 15 min. ............................................................. 49
Figura 17: Etapas realizadas para o processo de análise das nanopartículas lipídicas no interior
do elemento dentário. A) Padronização das amostras; B) confecção de sulcos para o processo
de clivagem; C) Clivagem da estrutura dentária; D) Dessecador utilizado para o processo de
desidratação das amostras; E) Amostras fixadas em stub e metalizadas com ouro; F)
MEV/EDS utilizado para registro das micrografias e espectros. ............................................. 52
Figura 18: Fluxograma das etapas para o estudo in vivo. ......................................................... 56
Figura 19: Distribuição do tamanho médio das partículas (nm) inicial das suspensões
contendo NCL 0,2 % (linha vermelha); 0,5 % (linha verde) e NBR (linha azul). ................... 60
Figura 20: Valores referentes a sobreposição dos gráficos do potencial zeta (mV) (A) da
suspensão e gel de NCL 0,2 %; (B) da suspensão e gel NCL 0,5 %; (C) suspensão e gel NBR;
e (D) suspensão e gel do fármaco livre. As linhas vermelhas representam o potencial zeta
inicial, e as linhas verdes após os 90 dias. ................................................................................ 62
Figura 21: Valores referentes a sobreposição dos gráficos do tamanho médio das partículas
(nm) (A) da suspensão e gel de NCL 0,2 %; (B) da suspensão e gel de NCL 0,5 %; (C)
suspensão e gel de NBR. As linhas vermelhas representam as suspensões e as linhas verdes os
géis. ........................................................................................................................................... 63
Figura 22: Sobreposição dos gráficos do tamanho médio de partícula das suspensões de NCLs
(A) 0,2% e (B) 0,5% no tempo 0 (linhas vermelhas) e após 90 dias de armazenamento em TA
(linhas verdes), GE (linhas azuis) e ES (linhas pretas)............................................................. 65
Figura 23: Sobreposição dos gráficos do tamanho médio de partícula das suspensões NBRs no
tempo 0 (linha vermelha) e após 90 dias de armazenamento em TA (linha verde), GE (linha
azul) e ES (linha preta). ............................................................................................................ 66
Figura 24: Sobreposição dos gráficos do tamanho médio das partículas dos géis de NCLs (A)
0,2 % e (B) 0,5 % no tempo 0 (linhas vermelhas) e após 90 dias de armazenamento em TA
(linhas azuis), GE (linhas verdes) e ES (linhas pretas) ............................................................ 67
Figura 25: Proliferação fúngica nas amostras dos géis de NBRs armazenadas em GE e ES. .. 68
Figura 26: Sobreposição dos gráficos do tamanho médio das partículas dos géis de NBRs no
tempo 0 (linha vermelha) e após 90 dias de armazenamento em TA (linha verde). ................ 68
Figura 27: Sobreposição de cromatogramas correspondente ao gel de NCL 0,5 % (linha preta)
e NCL 0,5 % HCA após 2 (linha vermelha) e 14 dias (linha rosa). ......................................... 74
Figura 28: Placas após o período de 72 horas para análise do diâmetro com paquímetro
digital. ....................................................................................................................................... 76
Figura 29: Micrografia eletrônica da exposição dos túbulos dentinários após o processo de
remoção da smear layer nas amostras do grupo controle......................................................... 79
Figura 30: Microscopia eletrônica de varredura. A) Micrografia eletrônica da deposição das
NCL sobre a superfície dentária. B) Micrografia eletrônica da presença de NCL no interior
dos túbulos dentinários. ............................................................................................................ 80
Figura 31: A) Micrografia da estrutura dentária com a suspensão de NCL depositada (1) sobre
a luz do canal e (2) no interior dos túbulos dentinários. B) Espectro do EDS mostrando
presença de cloro (1) na superfície dentária e em menor quantidade de átomos cloro (2) no
interior dos túbulos dentinários. ............................................................................................... 81
Figura 32: Micrografias de NCL obliterando a entrada dos túbulos dentinários (A) em gel e
(B) em suspensão. ..................................................................................................................... 82
Figura 33: Micrografia dos túbulos dentinários. A) em gel. B) em suspensão. ....................... 82
Figura 34: A) Micrografia de NCL na superfície dentária e no interior dos túbulos dentinários
e B) seus respectivos espectros em EDS. ................................................................................. 83
Figura 35: A) Micrografia da região apical do canal radicular e mínima presença de
NCLsobre a superfície dentinária, confirmada B) pelo espectro do EDS que identificou
pequena quantidade de cloro. ................................................................................................... 83
Figura 36: Imagens radiográficas representativas das lesões periapicais em ratos após a
utilização de medicação intracanal de acordo com cada grupo: (A) Controle; (B) Gel CL 0,5
%; (C) Gel NCL 0,5 %; (D) Gel NBR; (E) Gel CL 0,5 % HCA; (F) Gel NCL 0,5 % HCA; (G)
HCA. ......................................................................................................................................... 85
Figura 37: Gráfico referente às áreas de radiolucidez das lesões periapicais a partir das
imagens radiográficas após o tratamento com diferentes medicações intracanal. ................... 86
Figura 38: Imagens das lâminas histológicas representativas das lesões periapicais em ratos
após a utilização de medicação intracanal de acordo com cada grupo: (A) Controle; (B) Gel
CL 0,5 %; (C) Gel NCL 0,5 %; (D) Gel NBR; (E) Gel CL 0,5 % HCA; (F) Gel NCL 0,5 %
HCA; (G) HCA......................................................................................................................... 88
Figura 39: Gráfico referente aos escores do infiltrado inflamatório a partir da análise
histopatológica .......................................................................................................................... 89
Figura 40: Sobreposição de cromatogramas: linha azul correspondente a nanopartícula
lipídica sem a presença de fármaco; linha preta correspondente ao hidróxido de cálcio e linha
vermelha correspondente amostra padrão de clorexidina....................................................... 108
Figura 41: Curva padrão da clorexidina obtida por CLAE. ................................................... 110
Figura 42: Fluxograma do teste de exatidão. .......................................................................... 111
LISTAS DAS TABELAS
Tabela 1: Componentes utilizados na fase orgânica para o preparo das suspensões contendo
nanocápsulas de clorexidina. .................................................................................................... 38
Tabela 2: Componentes da fase oleosa utilizados no preparo de suspensões contendo NCL. . 39
Tabela 3: Divisão dos grupos de acordo com a medicação testada para determinação da CIM.
.................................................................................................................................................. 44
Tabela 4: Divisão dos grupos de acordo com a formulação. .................................................... 47
Tabela 5: Distribuição dos grupos. ........................................................................................... 51
Tabela 6: Distribuição dos animais nos diferentes grupos experimentais. ............................... 53
Tabela 7: Composição das nanocápsulas poliméricas alterada por este estudo. ...................... 58
Tabela 8: Valores referentes à caracterização físico-química das suspensões contendo NCL
0,2 e 0,5 % e NBR, e do fármaco livre um dia após sua obtenção (+DP). ............................... 59
Tabela 9: Valores referentes à caracterização físico-química dos géis contendo NCL 0,2 e 0,5
% e NBR, e fármaco livre um dia após sua obtenção (+DP). .................................................. 61
Tabela 10: Diâmetro médio das partículas e IPD das suspensões de NCLs 0,2 e 0,5 % e NBR
(+DP). ....................................................................................................................................... 65
Tabela 11: Diâmetro médio das partículas e IPD dos géis de NCLs 0,2 e 0,5 % e NBR (+DP).
.................................................................................................................................................. 67
Tabela 12: Média do pH e doseamento das suspensões de NCLs 0,2 e 0,5 %, NBR e CL
(+DP). ....................................................................................................................................... 69
Tabela 13: Média do pH e doseamento dos géis de NCLs 0,2 e 0,5 %, NBR e CL (+DP). ..... 70
Tabela 14: pH inicial e final de cada formulação. .................................................................... 72
Tabela 15: Concentração inicial (%) de fármaco e após o período de 14 dias nos diferentes
grupos, e sua redução neste período. ........................................................................................ 74
Tabela 16: Média dos halos de inibição (mm) + DP da solução de CL e das NCL. ................ 76
Tabela 17: CIM de acordo com a formulação e o tipo de microrganismo. .............................. 77
Tabela 18: Análise quantitativa do espectro do EDS detectando o cloro. ................................ 81
Tabela 19: Análise quantitativa do espectro do EDS detectando o cloro. ................................ 83
Tabela 20: Análise quantitativa do espectro do EDS detectando o cloro. ................................ 84
18
1. INTRODUÇÃO
A estrutura dentária é formada por esmalte, dentina e cemento. A dentina é composta
por inúmeros túbulos dentinários que possuem diâmetro variando de 2,5 µm (próximo à
polpa) a 1 µm (na junção dentina-esmalte e cemento-dentina) totalizando aproximadamente
15.000 túbulos em 1 mm2 de dentina próximo à junção cemento-dentina. Pela presença de
cáries, fraturas ou desgastes da estrutura dentária, os microrganismos podem penetrar,
multiplicar-se e invadir numerosos túbulos expostos (COHEN e BURNS, 1998) e, devido ao
diâmetro, podem alcançar uma profundidade de 200 µm nas áreas cervical e média da raiz, e
cerca de 60 µm na região apical (LOVE, 1996).
As bactérias que penetram nos túbulos dentinários são a principal causa das
inflamações pulpares e periapicais. Devido a isso, o objetivo do tratamento endodôntico é
eliminá-las dos canais radiculares, para possibilitar a resolução e o reparo dos tecidos
perirradiculares danificados pela ação bacteriana (COHEN e BURNS, 1998).
Para auxiliar no processo de desinfecção do canal principal e seus túbulos dentinários
são utilizados agentes químicos, como soluções irrigadoras, e medicamentos intracanal
(LEONARDO, 2008).
O uso de medicações intracanal tem sido defendido por alguns autores (HELING et al,
1992; EVANS et al, 2003; SIRÉN et al, 2004, VIANNA et al, 2004; SOARES et al, 2006;
LEONARDO, 2008) por reduzir o número de microrganismos que resistiram ao preparo
biomecânico, tornando o sistema de canais radiculares um meio impróprio para o seu
desenvolvimento e proliferação.
Dentre as alternativas de medicação intracanal, encontra-se a clorexidina, que vem
sendo amplamente pesquisada devido a inúmeras qualidades que apresenta, como ação
antimicrobiana imediata e amplo espectro antimicrobiano sobre bactérias Gram-positivas,
Gram-negativas, anaeróbicas facultativas e aeróbias, além de atuar também em leveduras e
fungos (HENNESSEY, 1973; SEN, SAFAVI, SPANGBERG, 1999).
Para potencializar os benefícios da clorexidina, podemos buscar auxílio na
nanotecnologia, através de sistemas de liberação controlada de fármacos, que apresentam
diversas vantagens sobre o sistema de administração convencional. Dentre as vantagens,
destacam-se a maior eficácia terapêutica, proporcionada pela liberação progressiva e
controlada do fármaco a partir da nanopartícula e, a diminuição significativa da toxicidade por
19
utilizar menor concentração do fármaco e possuir maior tempo de ação. Além disso, esse
sistema evita a instabilidade e decomposição do fármaco (bio-inativação prematura); além de
possibilitar a penetração mais profunda nos tecidos em decorrência do seu reduzido tamanho
(NHUNG et al, 2007).
1.1. OBJETIVOS
Apesar dos inúmeros medicamentos utilizados entre as sessões do tratamento
endodôntico, ainda não existe um fármaco ideal. Desta forma, este estudo visa: (i)
desenvolver e caracterizar nanopartículas contendo clorexidina, bem como avaliar sua
estabilidade; (ii) avaliar in vitro o processo de degradação da clorexidina livre e na forma de
nanopartícula após seu mistura com pasta de hidróxido de cálcio; (iii) avaliar a ação
antimicrobiana in vitro em cepas de Enterococcus faecalis e Candida albicans, e suas
respectivas concentrações inibitórias mínimas; (iv) avaliar in vitro a penetração das
nanopartículas no interior dos túbulos dentinários de dentes humanos extraídos e, por fim, (v)
avaliar sua ação como medicação intracanal in vivo em dentes de ratos com lesão periapical, a
partir da análise da resposta histológica e radiográfica, colaborando com o desenvolvimento
de medicamentos mais modernos, completos, eficientes e com menores efeitos indesejáveis.
20
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1. A ESTRUTURA DENTÁRIA
A estrutura dentária (Figura 1) é composta por uma porção coronária e uma porção
radicular. A porção mais interna apresenta uma câmara pulpar que é preenchida por um feixe
vásculo-nervoso chamado de polpa. Na porção coronária, a dentina é recoberta pelo esmalte, e
na porção radicular, a dentina é recoberta pelo cemento.
Figura 1: Estrutura dentária e sua divisão morfológica.
http://dentistaemcuritiba.wordpress.com/2010/01/10/dentista-em-curitiba-tratamento-de-canal/
A dentina apresenta vários túbulos dentinários em toda sua extensão, que são
preenchidos por prolongamentos de células especializadas, os odontoblastos (BHASKAR,
1989). O número de túbulos dentinários aumenta consideravelmente da parte média até
próximo à polpa (MARSHALL et al, 1997). Assim como seu diâmetro, que pode chegar a
2,5 µm próximo à polpa, enquanto que na junção esmalte-dentina é de 0,8 µm.
Schilke e colaboradores (2000) estudaram o número e o diâmetro dos túbulos
dentinários em humanos e encontraram na camada de dentina mais profunda,
aproximadamente, 21.343 túbulos/mm2 com diâmetro médio de 2,90 µm, e na porção média
21
da dentina cerca de 18.781 túbulos/mm2 com diâmetro médio de 2,65 µm, confirmando que
quanto mais próximo a polpa, maior é o diâmetro e quantidade de túbulos dentinários
presentes (MARSHALL et al, 1997) (Figura 2) .
Figura 2: Estrutura dentária, em destaque a presença dos túbulos dentinários.
http://periodontiaonline.blogspot.com/2011/03/sensibilidade-dental-uma-luz-no-fim-do.html
Muitos destes túbulos dentinários podem ficar expostos devido à presença de cáries
(Figura 3), fraturas ou desgastes da estrutura dentária. Quando expostos, microrganismos
podem penetrar para o seu interior colonizando toda esta região (COHEN e BURNS, 1998).
Figura 3: Estrutura dentária com presença de cárie e contaminação do tecido pulpar.
http://sites.amarillasinternet.com/sorridente/servicos.html
22
Como os túbulos apresentam diâmetro muito maior que os microrganismos, estes
podem alcançar grandes profundidades de penetração. Haapasalo e Orstavik (1987) foram os
primeiros pesquisadores a introduzir um modelo para infecção e desinfecção da dentina
radicular, in vitro, através de cilindros de dentina obtidos de raízes de incisivos bovinos
contaminados por Enterococcus faecalis (E. faecalis) pelo período de 21 dias. Os autores
analisaram sua penetração nos túbulos dentinários através da microscopia eletrônica de
varredura (Figura 4) e óptica após coloração específica (Brown e Brenn) e, observaram, que
na infecção leve, a profundidade de penetração foi de 300 – 400 µm, na infecção moderada de
400 – 500 µm, e em infecção severa chegou a 800 – 1000 µm (Figura 5).
Figura 4: Micrografias mostrando a presença de E. faecalis no interior dos túbulos dentinários de dentes
bovinos. Microscopia eletrônica de varredura (Hapassalo e Orstavik, 1987).
Figura 5: Infecção dos túbulos dentinários de dentes bovinos por E. faecalis. B&B stain microscopia
óptica (Hapassalo e Orstavik, 1987).
Estes microrganismos que penetram nos túbulos dentinários são a principal causa das
inflamações e infecções pulpares e periapicais.
23
2.2. O TRATAMENTO ENDODÔNTICO
As alterações sistêmicas são consideradas um grande problema de saúde no Brasil e
também no mundo. No entanto, algumas complicações odontológicas podem intervir na
condição da saúde geral do paciente, principalmente se ele apresentar alterações
cardiovasculares, diabetes mellitus, entre outros, devendo ser a prevenção o melhor
tratamento. Portanto, mais do que necessário, é importante eliminar riscos de complicações e
melhorar qualitativamente a vida do paciente (GROSSI et al, 1997).
Desta forma, o tratamento endodôntico tem por objetivo eliminar os microrganismos
presentes no sistema de canais radiculares, remover o tecido pulpar desintegrado que pode
servir como substrato para o crescimento microbiano, preencher e vedar o espaço endodôntico
com material inerte, estável e compatível, impedindo a recolonização bacteriana, evitando a
periodontite apical (PINHEIRO et al, 2009; RICUCCI et al, 2009, SINGLA et al, 2009)
(Figura 6).
Figura 6: Esquema didático demonstrando a sequência de procedimento do tratamento endodôntico:
preparo biomecânico, conometria e obturação.
http://drarebecamoura.blogspot.com/2010/12/desmistificando-o-tratamento-de-canal.html
Para obtenção de sucesso no tratamento, a desinfecção do sistema de canais
radiculares com a presença de processo infeccioso é fundamental na terapia endodôntica. A
anatomia do canal radicular é complexa, contendo muitas ramificações e irregularidades
morfológicas, proporcionando um ambiente favorável para a colonização de microrganismos,
dificultando o processo de desinfecção (LEE et al, 2008; MILLER e BAUMGARTNER,
2010).
24
A morfologia complexa do sistema de canais radiculares determina áreas inacessíveis
do preparo biomecânico como canais laterais, acessórios, secundários, intercondutos, deltas
apicais e túbulos dentinários, contribuindo para a permanência de microrganismos nessas
regiões (LIN et al., 1991; SIQUEIRA; UZEDA; FONSECA, 1996).
Uma redução significativa no número de microrganismos presentes no canal principal
se obtém pela da ação dos efeitos químicos e mecânicos da irrigação e da instrumentação
(SJOGREN et al, 1990; HOLLAND, SOARES, SOARES, 1992; TROPE, DELANO,
ORSTAVIK, 1999).
O hipoclorito de sódio é a solução irrigante mais comum usada em endodontia desde
1900. Pode ser utilizado sozinho ou em combinação com uma solução quelante, como o ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA), que reduz as bactérias e elimina a lama dentinária (smear
layer) aderida às paredes do canal radicular, promovendo um aumento da permeabilidade e
melhorando o selamento das obturações (AKISUE et al, 2010; DEWSNUP et al, 2010).
Um estudo publicado por Schlafer e colaboradores (2010) assegura que não é possível
acessar os canais laterais e suas ramificações apicais com a instrumentação mecânica. Por
isso, usam-se métodos de desinfecção química que têm efeito bactericida, para complementar
o método mecânico. Conforme Akisue e colaboradores (2010), a utilização de hipoclorito de
sódio em um intervalo de concentrações de 0,5 % a 5,25 % é um eficaz agente
antimicrobiano. Porém, em baixas concentrações, é ineficaz contra microrganismos
específicos e, em altas concentrações, tem pouca biocompatibilidade, causando inflamação
periapical.
Com tal complexidade, alguns microrganismos permanecem viáveis nestas regiões de
difícil acesso (SJOGREN et al, 1990; HOLLAND, SOARES, SOARES, 1992; TROPE,
DELANO, ORSTAVIK, 1999), apresentando um rápido crescimento quando o canal é
deixado vazio, sem uma medicação intracanal entre as sessões (SJOGREN et al, 1991;
TROPE, BERGENHOLTZ, 2002).
Por se tornar um auxiliar importante, a medicação intracanal deve possuir ação
antimicrobiana com potencial para eliminar microrganismos remanescentes ao preparo
químico-mecânico; promover a reparação dos tecidos periapicais (SJOGREN et al, 1990;
HOLLAND, SOARES, SOARES, 1992; TROPE, DELANO, ORSTAVIK, 1999); funcionar
como uma barreira física, impedindo o suprimento de substrato, ocupando espaço a fim de
limitar a multiplicação microbiana (CHONG, PITT FORD, 1992). Além disso, deve reduzir a
25
inflamação periapical; apresentar capacidade de solubilizar matéria orgânica, pois a
permanência de resíduos pode funcionar como reservatório de microrganismos (LOPES,
SIQUEIRA, 2004);
ter a capacidade de
neutralizar produtos
tóxicos
como o
lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano, que é uma endotoxina que exerce importante papel na
etiopatogenia das doenças da polpa e dos tecidos perirradiculares (TANOMARU et al, 2003).
Ainda, eliminar o exsudato persistente; não provocar agressão aos tecidos periapicais;
estimular o reparo por tecido mineralizado e, combater à reabsorção dentinária (LOPES,
SIQUEIRA, 2004).
Dentre as substâncias de escolha está o hidróxido de cálcio, que foi introduzido
inicialmente como um agente de capeamento pulpar em 1930, e, desde então, tem sido usado
na terapia endodôntica como medicação intracanal (KRITHIKADATTA et al, 2007;
SIQUEIRA et al, 2007; TURK et al, 2009). O hidróxido de cálcio tem recebido destaque
especial por apresentar certa atividade antimicrobiana, capacidade de neutralizar toxinas,
manter o selamento temporário do canal e estimular a reparação dos tecidos localizados na
região periapical (ESTRELA et al, 1999). Porém, o tempo necessário para que o hidróxido de
cálcio desempenhe suas propriedades é de pelo menos duas semanas (NERWICH, FIDGOR,
MESSER, 1993; TAKAHASHI et al, 1996) e, ainda, deve ocorrer a manutenção de altas
concentrações de hidroxila para que mantenha o pH em níveis extremamente elevados
(ESTRELA et al, 1999; SJOGREN et al, 1991).
Além disso, o hidróxido de cálcio não consegue eliminar os microrganismos que se
encontram mais profundamente nos túbulos dentinários ou no sistema de canais radiculares
devido a sua baixa solubilidade ou capacidade de difusão (ESTRELA et al, 1999; ERCAN et
al; 2007), ou seja, não age quando não há contato direto com o microrganismo e os sítios mais
distantes acabam por não ter uma elevação significativa do pH (ESTRELA et al, 1995; 1999;
2001).
Para complementar a ação do hidróxido de cálcio, o uso da clorexidina tem sido
sugerido por diversos autores (HELING et al, 1992; EVANS et al, 2003; SIRÉN et al, 2004,
SOARES et al, 2006; LEE et al, 2008).
Um estudo publicado em 2008 por Lee e colaboradores descreve que o hidróxido de
cálcio é um excelente agente antimicrobiano para canais radiculares infectados; porém, é
menos eficaz frente a E. faecalis e C. albicans, microrganismos frequentemente isolados nos
casos de infecções persistentes de canais radiculares, havendo a necessidade de utilizar
medicação intracanal alternativa, como a clorexidina, que possui capacidade de adsorção à
26
dentina, facilitando a erradicação da flora resistente à terapia. Para que haja a máxima
atividade antimicrobiana, a superfície da infecção dentinária deve ser exposta a uma solução
concentrada de clorexidina por um período suficiente.
Siqueira e Sen (2004) referem que medicamentos como a clorexidina e o hidróxido de
cálcio em associações têm potencial para serem utilizados como medicamentos intracanal em
suspeita de infecção fúngica e bacteriana. Para Turk e colaboradores (2008), a combinação
desses antimicrobianos melhora as suas atividades e o equilíbrio de suas deficiências contra
infecções polimicrobianas.
2.3. A CLOREXIDINA
Em 1940, nos laboratórios de pesquisa da “Imperial Chemical Industries Ltda.”,
Macclesfield, Inglaterra, a clorexidina foi desenvolvida para ser utilizada como um agente
antiviral; porém, foi abandonada devido à sua ineficiência. Anos mais tarde, foi redescoberta
devido à sua eficácia antibacteriana (ZEHNDER et al, 2006) (Figura 7).
Figura 7: Estrutura química da clorexidina
Fonte: PUBCHEM, 2008.
A clorexidina é representada pela fórmula molecular de C22H30Cl2N10, com massa
molar de 505,4 g/mol (PUBCHEM, 2008).
A clorexidina é composta estruturalmente por dois anéis clorofenólicos nas
extremidades, ligados a um grupamento bisguanida de cada lado, conectados por uma cadeia
central de hexametileno (DENTON, 1991). Esta bibisguanida catiônica é uma base forte, mais
27
estável na forma de sal, sendo praticamente insolúvel em água. Os sais originalmente
produzidos foram o acetato de clorexidina e cloridrato de clorexidina, mas devido a sua baixa
solubilidade em água foram substituídos, com o passar do tempo, pelo sal atualmente usado, o
gluconato de clorexidina (ZAMANY et al, 2003; ZEHNDER, 2006).
As soluções aquosas de clorexidina são mais estáveis em valores de pH de 5 a 8.
Acima deste valor, ocorre precipitação da clorexidina, enquanto que em pH ácido, há redução
da sua atividade, devido à perda da estabilidade da solução. Em pH fisiológico, exerce
excelente atividade antimicrobiana, proporcionada pela liberação das moléculas de carga
positiva (PARSONS et al, 1980; RINGEL et al, 1982) .
O efeito antimicrobiano da clorexidina se dá pela atração e adsorção das moléculas
catiônicas da clorexidina à superfície celular dos microrganismos (que é carregada
negativamente). Esta interação promove a alteração da permeabilidade da membrana celular,
resultando na perda dos componentes intracelulares e no desequilíbrio osmótico da célula
(HENNESSEY, 1973; DELANY et al, 1982; GOMES et al, 2006). Em pH neutro, é
rapidamente adsorvida à superfície celular dos microrganismos, fazendo com que a
concentração de moléculas livres de clorexidina na solução seja baixa (DAVIES, 1973;
BONESVOLL et al, 1974).
Além da atividade antimicrobiana de amplo espectro, a clorexidina apresenta a
característica de substantividade, que é a atividade resultante da adsorção e da subsequente
liberação da clorexidina, pela sua capacidade de ligação de forma reversível às superfícies
dentais (especificamente na hidroxiapatita, presente no esmalte e dentina) e mucinas salivares,
sendo lentamente liberada para o ambiente à medida que sua concentração no meio decresce
permitindo, desse modo, um tempo de atuação prolongado, prevenindo a colonização
bacteriana e o desenvolvimento do biofilme (BASRANI et al, 2002; GOMES et al, 2006;
SOARES et al, 2007).
A sua substantividade foi observada mantendo sua ação antimicrobiana pelo período
de 48 h (SCHAFER e BOSSMANN, 2005) e 72 horas (SIRÉN et al, 2004) após ser removida
do canal radicular, o que não ocorre com os demais desinfetantes que rapidamente se dissipam
e não apresentam efeito antimicrobiano residual. Porém, quanto maior o contato com os
tecidos periapicais, dependendo da sua concentração, maior serão os efeitos tóxicos sobre
estes tecidos.
28
Hoje em dia, o digluconato de clorexidina é amplamente utilizado nas áreas médica,
odontológica, veterinária e alimentar. Na odontologia, sua aplicação ocorre há alguns anos
como um potente agente anti-séptico utilizado principalmente como agente ativo de
enxaguatórios bucais, agindo no controle da placa bacteriana e no tratamento de infecções
periodontais.
Na endodontia, tem sido proposto na forma de líquido ou gel, em diferentes
concentrações, tanto como agente irrigante durante o preparo químico-mecânico (PARSONS
et al, 1980; DELANY et al, 1982; JEANSONNE e WHITE, 1994; LEONARDO et al, 1999;
FERRAZ et al, 2001; ZAMANY et al, 2003; ERCAN et al, 2006), quanto como medicação
intracanal (HELING et al, 1992; SIQUEIRA e UZEDA, 1997; LINDKOG et al, 1998;
GOMES et al, 2003; SOARES et al, 2007; VIANNA et al, 2007).
Alguns estudos demonstraram que a atividade antimicrobiana da clorexidina líquida é
igual ou superior ao gel quando o contato direto foi adotado como metodologia (FERRAZ et
al, 2001; GOMES et al, 2001; VIANNA et al, 2004). Por outro lado, a clorexidina em gel
facilita a instrumentação, melhorando a capacidade dos instrumentos em eliminar tecidos
orgânicos, compensando sua capacidade de dissolvê-lo e diminuindo a formação de smear
layer (FERRAZ et al, 2001). A smear layer foi definida por Sen e colaboradores (1995) como
sendo uma camada amorfa, irregular e granular, composta por restos e raspas de dentina,
remanescentes de tecido pulpar e bactérias, que acabam se depositando e obturando a entrada
dos túbulos dentinários prejudicando a ação dos agentes irrigantes e medicação intracanal.
A clorexidina apresenta amplo espectro de ação sobre linhagens Gram-positivas e
negativas (HENNESSEY, 1973), mas de fundamental importância é sua ação sobre a espécie
Gram-positiva E. faecalis (BASRANI et al, 2002) e ao fungo C. albicans (WALTIMO et al,
1999, PAQUETTE et al, 2007), devido à relação destes microrganismos com o insucesso
endodôntico, por persistirem ao protocolo químico-mecânico convencional de desinfecção do
canal radicular.
Apesar de todas estas qualidades, o digluconato de clorexidina pode ser inativado por
compostos aniônicos (PRADO et al, 2004) e não atua, significantemente, na neutralização do
LPS bacteriano, mesmo em concentrações mais elevadas.
A concentração de clorexidina (na forma de digluconato) normalmente utilizada varia
entre 0,12 e 2,0 %; porém, em concentrações iguais ou inferiores a 0,25 % é menos agressiva
exibindo reações inflamatórias mais brandas, não provocando necrose tecidual nem edema
29
persistente. Em concentrações iguais ou maiores a 0,5 % produz necrose tecidual e exacerba o
processo inflamatório retardando o processo de reparação tecidual do periodonto apical
(PRADO et al, 2004; FARIA et al, 2007). Isso se deve a formação da para-cloroanilina, que
é um subproduto gerado a partir da hidrólise da clorexidina em função do tempo, do pH e do
aquecimento. É uma amina aromática que tem se mostrado tóxica para humanos provocando
hemólise, metahemoglobinemia e cianose (BASRANI et al, 2007). Além disso, a paracloroanilina faz parte do Grupo 2B da IARC (International Agency of Research on Cancer)
formado por substâncias que possuem possível ação carcinogênica em humanos (IARC,
1997b).
Um maior interesse pela utilização da clorexidina como agente de desinfecção dos
canais radiculares surgiu para incrementar as propriedades antimicrobianas do hidróxido de
cálcio, já que alguns microrganismos têm mostrado capacidade de sobrevivência ao pH
elevado, principalmente o E. faecalis e C. albicans. A adição da clorexidina poderia
proporcionar maior atividade antimicrobiana e conferir maior substantividade à formulação
(TANOMARU et al., 2002).
Evans e colaboradores (2003) compararam o efeito antimicrobiano da pasta de
hidróxido de cálcio e da sua associação com clorexidina 2 % utilizando um modelo
experimental in vitro. Incisivos bovinos foram padronizados e contaminados com E. faecalis
por 1 semana. Após este período, as raspas de dentina foram coletadas e semeadas em ágar
BHI. A contagem das unidades formadoras de colônia foi feita após a incubação e revelaram
que a associação do hidróxido de cálcio com clorexidina foi significantemente mais eficaz na
eliminação de E. faecalis que o uso isolado de hidróxido de cálcio.
Basrani e colaboradores (2003) utilizaram diferentes modelos experimentais para
avaliar o desempenho antimicrobiano da clorexidina (0,2 e 2 % líquida ou gel) e hidróxido de
cálcio (isolado ou em associação à clorexidina gel a 0,2 %) contra E. faecalis através do teste
de difusão em ágar por 48 horas e pelo método de desinfecção da dentina radicular humana in
vitro após 7 dias da aplicação das medicações. Tanto o teste de difusão em ágar como o teste
de desinfecção da dentina radicular, mostrou uma superioridade da clorexidina gel 2 % e da
solução de clorexidina 2 % sem diferença estatística entre elas. O hidróxido de cálcio
apresentou os piores resultados, confirmando que a clorexidina é mais efetiva para eliminação
do E. faecalis in vitro.
Basrani, Ghanem e Tjaderhane (2004) avaliaram a associação entre o hidróxido de
cálcio e a clorexidina com o objetivo de determinar se as propriedades físico-químicas da
30
formulação seriam adequadas para uma boa medicação intracanal. Os resultados mostraram
que a clorexidina não afetou o elevado pH do hidróxido de cálcio, nem sua radiopacidade e
tempo de trabalho; porém, diminuiu a tensão superficial e aumentou a viscosidade do
hidróxido de cálcio, confirmando que a associação das duas medicações apresenta
propriedades físico-químicas satisfatórias.
Schafer e Bossmann (2005) analisaram a eficácia antimicrobiana da clorexidina e do
hidróxido de cálcio contra E. faecalis in vitro. Para isso, 40 dentes humanos foram
padronizados, esterilizados e infectados com E. faecalis por 9 dias. Após este período, foi
feita a divisão em 4 grupos para preenchimento do canal com as seguintes medicações: pasta
de hidróxido de cálcio, solução de clorexidina 2 %, associação de hidróxido de cálcio à
solução de clorexidina 2 % numa proporção 1:1, e água destilada. Tais medicações
permaneceram no interior do canal radicular por 3 dias, para posterior coleta das raspas de
dentina, que foram levadas para análise microbiológica. Como resultados, a clorexidina 2 %
foi significantemente mais eficaz que a pasta de hidróxido de cálcio e a associação de ambos,
e não foi observado aumento na eficácia antimicrobiana do hidróxido de cálcio associado à
clorexidina 2 %.
Barbin e colaboradores (2008) analisaram quimicamente a presença de paracloroanilina, por meio da espectrometria de massas e cromatografia líquida, na solução de
clorexidina 0,2 % isolada ou em associação com o hidróxido de cálcio. As análises foram
realizadas em seguida ao preparo das amostras e após o período de 7 e 14 dias. Na solução de
clorexidina foi encontrada a presença de para-cloroanilina após os 14 dias. Quando em
associação com hidróxido de cálcio, houve decomposição total da clorexidina em diferentes
compostos, porém, não foi demonstrada a presença de para-cloroanilina.
Para avaliar se a associação entre o hidróxido de cálcio e a clorexidina 0,4 % afetava o
desenvolvimento do fenótipo osteogênico in vitro, da Silva e colaboradores (2008) analisaram
a morfologia e a atividade celular, a atividade da enzima fosfatase alcalina, teor de proteína
total, imunolocalização de sialoproteína no tecido ósseo e a formação de nódulos
mineralizados. Os resultados mostraram que a associação entre a pasta de hidróxido de cálcio
e clorexidina 0,4 % não afetou o desenvolvimento do fenótipo osteogênico.
Delgado e colaboradores (2010) avaliaram a eficácia do hidróxido de cálcio e do gel
de clorexidina 2 % contra E. faecalis presentes nos túbulos dentinários in vitro. Foram
utilizados 60 dentes humanos. Estes foram contaminados e, posteriormente, tratados com
hidróxido de cálcio, gel de clorexidina 2 %, associação do hidróxido de cálcio com o gel de
31
clorexidina 2 % e salina como grupo controle. As amostras de dentinas foram obtidas nas
profundidades de 0 – 100 e de 100 – 200 µm. Estas foram levadas para contagem de unidade
formadora de colônias (UFC) e para análise da viabilidade bacteriana através da microscopia
de fluorescência. Como resultados, tanto a clorexidina como o hidróxido de cálcio
apresentaram ação antimicrobiana contra o E. faecalis, porém, a clorexidina apresentou maior
atividade antimicrobiana quando comparada com o hidróxido de cálcio, e a clorexidina
associada com o hidróxido de cálcio teve uma ação semelhante a clorexidina isolada.
Vaghela e colaboradores (2011) avaliaram eficácia antimicrobiana no processo de
desinfecção de túbulos dentinários utilizando como veículos para o hidróxido de cálcio o
propilenoglicol e iodofórmio em óleo de silicone em comparação ao gel de clorexidina a 2 %
conta E. faecalis e C. albicans. O estudo in vitro utilizou blocos de dentes humanos e as
raspas de dentina foram removidas numa profundidade de 200 µm e 400 µm. Como grupo
controle foi utilizado salina. O gel de clorexidina a 2 % apresentou uma efetividade
antibacteriana e antifúngica superior aos demais grupos. O tipo de veículo alterou as
propriedades antimicrobianas do hidróxido de cálcio: quando associado ao propilenoglicol, o
hidróxido de cálcio teve maior ação antibacteriana contra o E. faecalis, e quando associado ao
iodofórmio com óleo de silicone, o hidróxido de cálcio apresentou uma maior ação
antifúngica contra C. albicans.
Kayaoglu e colaboradores (2011) compararam a atividade antibacteriana da própolis
com clorexidina a 2 % e o hidróxido de cálcio em um estudo in vitro contra E. faecalis. As
raspas de dentina foram coletadas nos tempos de 1 e 7 dias após o uso da medicação
intracanal e concluíram que a clorexidina foi desinfetante mais potente nos dois tempos e que
a ação antibacteriana do própolis foi semelhante ao hidróxido de cálcio.
Com o objetivo de avaliar a influência do gel de clorexidina a 2 % sobre a o pH, a
liberação de cálcio e a capacidade de redução de endotoxinas da pasta de hidróxido de cálcio,
Signoretti e colaboradores (2011) realizaram um estudo, com duração de 30 dias, onde o
grupo I era formado por hidróxido de cálcio em solução salina, grupo II hidróxido de cálcio
associado a clorexidina 2 % e grupo III formado por clorexidina 2 %. O grupo I e II
apresentaram um pH alcalino durante todo o estudo porém, o grupo I apresentou maior valor
de pH que o grupo II após os 30 dias. Em relação à liberação de cálcio, o grupo II liberou
mais cálcio que o grupo I após 15 dias. E o grupo II e III apresentou uma maior redução de
endotoxinas quando comparado ao grupo I. Foi observado que, in vitro, a adição da
clorexidina não interfere nas propriedades químicas do hidróxido de cálcio e que nenhuma das
32
pastas avaliadas pode reduzir completamente o teor de endotoxinas; porém, a adição de
clorexidina ao hidróxido de cálcio, aumentou a redução de endotoxinas em comparação ao
uso isolado.
2.4. AS NANOPARTÍCULAS
São sistemas de liberação controlada de fármacos e apresentam como principais
vantagens ao sistema de dosagem convencional, a maior eficiência terapêutica pela liberação
progressiva e controlada do fármaco encapsulado, necessidade de menor concentração do
mesmo e, por isso, diminuição significativa da toxicidade e, promoção de um maior tempo de
ação (NHUNG et al, 2007).
As nanopartículas lábeis podem-se apresentar na forma de lipossomas, nanoemulsões,
nanopartículas poliméricas (nanoesferas e nanocápsulas), e nanopartículas lipídicas sólidas.
As nanopartículas poliméricas são carreadores de fármacos, que apresentam tamanho
inferior a 1 µm, e são compostas, principalmente, por polímeros biodegradáveis. Podem ser
nanocápsulas ou nanoesferas que diferem entre si pela sua composição e organização
estrutural (SCHAFFAZICK et al, 2003) como mostra a Figura 8A.
As nanoesferas não apresentam óleo em sua composição e, por isso, não apresentam
um núcleo oleoso definido e, sim, um sistema monolítico em que o fármaco encontra-se
homogeneamente disperso ou solubilizado no interior da matriz polimérica (SCHAFFAZICK
et al, 2003). As nanocápsulas são sistemas nanovesiculares apresentando um núcleo oleoso
rodeado por uma matriz polimérica. A cavidade pode conter um composto ativo líquido ou
sólido ou uma dispersão molecular (FESSI et al, 1989). Este reservatório pode ser lipofílico
ou hidrofílico de acordo com a forma de obtenção e material utilizado. Também podem conter
o composto ativo na sua superfície ou difundido na matriz polimérica (KHOEE e
YAGHOOBIAN, 2009).
33
A
B
Figura 8: Representação esquemática de (a) nanocápsulas e (b) nanoesferas; e B. Representação
1
2
esquemática de nanopartículas lipídicas sólidas (STROHER, ARMIJO e RAFFIN, 2010).
As nanopartículas lipídicas sólidas foram desenvolvidas no início da década de 1990
como um sistema de transporte alternativo ao sistema tradicional existente, como emulsões,
lipossomas e nanopartículas poliméricas (MULLER et al, 2000; MEHNERT e MADER,
2001; MULLER et al, 2002; ALHAJ et al, 2008).
Apresentam como principais vantagens sua estabilidade química, proteção do
composto ativo contra degradação, liberação controlada, excelente tolerância, e produção em
larga escala favorável (ALHAJ et al, 2008), além de poder ser utilizados tanto com fármacos
hidrofóbicos como hidrofílicos (MULLER et al, 2000).
Muitos métodos têm sido desenvolvidos para preparar as nanopartículas lipídicas
sólidas, tais como alta pressão de homogenização (SIEKMANN, WESTESEN, 1994;
LANDER et al, 2000; LIPPACHER et al, 2002, LIPPACHER et al, 2004), solvente ou
emulsificação por evaporação (SIEKMANN, WESTESEN, 1994), ultra-som ou altas taxas de
cisalhamento e pelo método de difusão do solvente (HU et al, 2005; 2006).
As nanopartículas lipídicas com partículas sólidas na sua matriz (Figura 8B) são
derivadas a partir de emulsões óleo/água mediante a simples substituição de lipídios líquidos
por lipídios sólidos à temperatura ambiente (MULLER et al, 2007).
Durante o processo de produção, os lipídios são fundidos e o fármaco dissolvido nesta
fase oleosa, que posteriormente, é dispersa em uma solução aquosa surfactante. A préemulsão obtida é homogenizada a alta pressão produzindo uma nanoemulsão quente
óleo/água. Após o resfriamento, gotas se cristalizam formando nanopartículas lipídicas com
partículas de matriz sólida (MULLER et al, 2007).
Ao se preparar uma nanopartícula lipídica sólida apenas com lipídios sólidos, as
partículas da matriz tendem a formar um cristal perfeito deixando um espaço limitado para
34
acomodar o fármaco, isto limita a capacidade de armazenamento, podendo levar à expulsão
do composto ativo da matriz lipídica durante o armazenamento (BUNJES, WESTESEN e
KOCH, 1996).
Já a utilização da mistura de lipídios sólidos e líquidos faz com que ocorra a formação
de partículas de matriz com imperfeições, proporcionando mais espaços para acomodar o
composto ativo proporcionando um aumento na quantidade de composto no interior da matriz
durante o armazenamento. Poderia se afirmar que a perfeição do sistema é sua imperfeição na
matriz cristalina (MULLER et al, 2007).
O uso da clorexidina em nanopartículas foi descrito primeiramente por Lboutounne e
colaboradores (2002) trabalho no qual foi realizada a encapsulação da clorexidina base em
nanocápsulas de poli-ε-caprolactona e sua atividade bactericida residual avaliada, in vivo,
como agente antiséptico comparando um detergente desinfetante de clorexidina ao que
apresentava nanocápsulas de clorexidina, obtendo como resultado uma ação bactericida
sustentada por mais de 8 horas do detergente que continha nanocápsulas de clorexidina.
Nhung e colaboradores (2007) compararam a ação do gel de nanocápsulas de
clorexidina (Nanochlorex) com 2-propanol 60 % (v/v) e gel à base de etanol 62 % (v/v)
(Purrell) como agente antiséptico sob a flora da pele de residentes e confirmou ação imediata
e sustentada do efeito bactericida do Nanochlorex constituindo-se como um meio promissor
de desinfecção e higienização das mãos em diversos procedimentos.
Meng e colaboradores (2009) tiveram como objetivo elaborar um composto formado
por acetato de clorexidina (CA) intercalado com cristais de montmorilonita (MMT). No
estudo de liberação, apresentou um efeito burst inicial nas primeiras 24 horas e continuou seu
processo de liberação até 72 horas. A atividade antibacteriana foi analisada pelo método da
zona inibitória contra Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa e os resultados
indicaram forte atividade antibacteriana contra bactérias Gram positivas e Gram negativas.
Assim, concluíram que o MMT poderia ser sugerido como um carreador de entrega
controlada de fármacos.
Huynh e colaboradores (2010) desenvolveram um sistema de liberação controlada de
diacetato de clorexidina (CDA) a base de poliuretano em dois formatos, em filmes ou em
sanduíches de poliuretano, obtidos através da evaporação do solvente. A liberação de CDA foi
dependente da concentração inicial de fármaco, da estrutura do sistema (filme ou sanduíche) e
da natureza do meio de liberação (água destilada ou solução aquosa de NaCl a 0,9 %). A taxa
35
de liberação foi significantemente menor em solução fisiológica. Para CDA-filme, a liberação
se prolongou por até 11 dias e, em CDA-sanduíche, por até 29 dias. O estudo antibacteriano
foi realizado com CDA-filme em Staphylococcus aureus e Staphylococccus epidermidis
permanecendo com atividade antibacteriana por 35 dias.
Musial e colaboradores (2010) observaram a liberação de clorexidina quando
associada à metilcelulose e poli(ácido acrílico) como carreadores poliméricos, na forma de
gel. As taxas de liberação e concentração de clorexidina foram comparadas com sua
respectiva viscosidade, pH e condutividade nas temperaturas de 22 °C, 32 °C (como
temperatura corporal de referência) e 42 °C . Em observação em MEV, com auxílio do EDS,
os átomos de cloro foram identificados e co-relacionados com a presença de clorexidina, desta
forma a distribuição da clorexidina na matriz polimérica se mostrou mais homogeneamente
dispersa na matriz de poli(ácido acrílico). A taxa de liberação de clorexidina no sistema de
metilcelulose foi afetada pela temperatura, quanto maior o aumento da temperatura, maior a
taxa de liberação da clorexidina. Em poli(ácido cítrico), a temperatura não influenciou
significantemente na liberação do fármaco. Ao final de 10 h, teve-se um aumento em torno de
35 % da taxa de liberação no sistema de metilcelulose enquanto que na poli(ácido cítrico) o
aumento foi de apenas 0,5 %.
Na Odontologia, alguns estudos utilizando nanopartículas vêm sendo realizados.
Bouillaguet e colaboradores (2006) testaram a citotoxicidade de três diferentes cimentos
endodônticos: AH Plus, Epiphany e GuttaFlow (que apresenta nanopartículas de prata na sua
composição), em culturas celulares através do ensaio MTT, e os resultados mostraram que a
maioria dos materiais apresentavam riscos significativos. Após o período de 72 h, o
GuttaFlow se apresentou significativamente menos tóxico que o AH Plus e Epiphany, porém
sua toxicidade aumentavam com o tempo e isso poderia estar atribuído à liberação de
partículas de prata.
Com o objetivo de investigar a atividade antimicrobiana e a eficácia de impedimento
de formação do biofilme no processo de desinfecção de canais radiculares pelo uso de
nanopartículas associadas ao cimento de óxido de zinco e eugenol, Kishen e colaboradores
(2008) numa primeira etapa, avaliaram as propriedades físicas e antimicrobianas de três
diferentes tipos de nanopartículas: nanopartículas de óxido de zinco, nanopartículas de
quitosana e nanopartículas de óxido de zinco com revestimento de múltiplas camadas de
quitosana. A ação antimicrobiana das nanopartículas de quitosana apresentou maior atividade,
porém, diminuída quando adicionado ao cimento de óxido de zinco e eugenol. As
36
nanopartículas de óxido de zinco, ao contrário, apresentavam menor ação antimicrobiana, mas
em associação ao cimento de óxido de zinco e eugenol, apresentaram maior atividade
antimicrobiana. A adição de nanopartículas de óxido de zinco e de quitosana aumentou a
atividade antimicrobiana do cimento de óxido de zinco e eugenol. Em uma segunda etapa, o
efeito das nanopartículas na aderência de E. faecalis na parede da dentina foi avaliada e os
resultados mostraram que o tratamento com as nanopartículas reduziram, significantemente, a
adesão do E. faecalis na dentina e que a adição de nanopartículas de óxido de zinco e
nanopartículas de quitosana inibiriam a recolonização microbiana e formação de biofilme,
melhorando a capacidade antimicrobiana dos cimentos endodônticos.
Gomes Filho e colaboradores (2010) realizaram o primeiro estudo para avaliar o uso
de nanopartículas de prata como agente irrigante. O trabalho teve como objetivo analisar a
resposta tecidual, em ratos, frente a implantes de tubos de polietileno preenchidos com
esponja de fibrina embebidas em 1 mL de dispersão de 47 ppm de nanopartículas de prata, 23
ppm de nanopartículas de prata, e hipoclorito de sódio a 2,5 %. A análise foi feita em 7, 15,
30, 60 e 90 dias, sendo que, para cada período, 6 ratos foram sacrificados e os implantes e
tecidos adjacentes removidos, fixados e preparados para análise em microscopia óptica. Os
resultados obtidos mostraram que ambos os materiais provocaram reações moderadas em 7
dias. Após os 15 dias, a resposta inflamatória das nanopartículas de prata a 23 ppm e o
hipoclorito de sódio a 2,5 % foram semelhantes ao grupo controle e, aos 30 dias, as
nanopartículas de prata a 47 ppm foram semelhantes ao controle. A partir disto, concluíram
que a dispersão de nanopartículas de prata foi biocompatível, especialmente em concentrações
mais baixa.
Pagonis e colaboradores (2010) avaliaram, in vitro, a ação de nanopartículas de poli
(L-ácido láctico-co-ácido glicólico), PLGA, contendo azul de metileno sob ação de luz
vermelha de comprimento de onda correspondente a 665 nm frente a E. faecalis. Utilizaram
blocos de dentes humanos extraídos contaminados com E. faecalis divididos em três grupos: o
grupo I não recebeu tratamento com nanopartículas de azul de metileno nem aplicação de luz;
o grupo II foi tratada apenas com nanopartículas de azul de metileno e, o grupo III que
recebeu tratamento com nanopartículas de azul de metileno seguida de aplicação de luz. O
sinergismo da luz com as nanopartículas de azul de metileno promoveu uma redução
significativa das unidades formadoras de colônia, sendo a utilização de nanopartículas de
PLGA como meio de carreador de fármacos fotoativados um coadjuvante promissor no
tratamento antimicrobiano de canais radiculares.
37
3. METODOLOGIA
3.1. DESENVOLVIMENTO DE NANOPARTÍCULAS CONTENDO CLOREXIDINA
Todo o processo de desenvolvimento, caracterização e teste de estabilidade foram
realizados no laboratório de Nanotecnologia do Centro Universitário Franciscano (UNIFRA).
3.1.1. Teste de solubilidade
Um teste piloto foi realizado visando avaliar a solubilidade da clorexidina na fase
orgânica da suspensão coloidal (sem a presença do polímero), bem como nos componentes da
referida fase oleosa, seguindo a metodologia descrita na Farmacopéia Brasileira (4a edição).
Para isso, foram testados diferentes tensoativos, entre eles o monoestearato de sorbitano,
monoleato de sorbitano e lecitina; diferentes óleos, triglicerídio de ácidos cáprico/caprílico,
cocoato de butilenoglicol, óleo de oliva e óleo de melaleuca; e, também, diferentes polímeros,
a poli-ε-caprolactona e o Eudragit L100. A solubilidade da clorexidina em diferentes lipídios
também foi avaliada, dentre eles a manteiga de karité em diferentes concentrações (5, 7 e 10
%), álcool cetílico, ácido esteárico e monoestearato de glicerila.
3.1.2. Preparo das suspensões contendo nanocápsulas de clorexidina
Para o preparo das suspensões de nanocápsulas de clorexidina, tentou-se reproduzir o
método de obtenção descrito por Lboutounne e colaboradores (2002).
A partir da adaptação da metodologia de Lboutounne e colaboradores (2002), alguns
componentes da fase orgânica foram substituídos, como mostra a Tabela 1, enquanto que os
componentes da fase aquosa mantiveram-se os mesmos, água (53 mL) e polissorbato 80
(0,0766 mg). As suspensões contendo nanocápsulas de clorexidina foram obtidas pelo método
de deposição interfacial de polímeros pré-formados, descrito por Fessi e colaboradores
(1989).
38
Tabela 1: Componentes utilizados na fase orgânica para o preparo das suspensões contendo nanocápsulas
de clorexidina.
Componentes
Tensoativo
Quantidade
monoestearato de sorbitano
0,0766 g
monoleato de sorbitano
lecitina
Polímero
poli-ε-caprolactona
0,1 g
Eudragit L100
27 mL
Acetona
triglicerídio de ácido cáprico/ caprílico
Óleo
0,31 g
cocoato de butilenoglicol
óleo de oliva
óleo de melaleuca
Clorexidina
0,2 %
0,02 g
1%
0,1 g
2%
0,2 g
Os componentes da fase orgânica e aquosa foram mensurados e colocados em
diferentes béqueres. Ambos foram vedados com parafilme para evitar a evaporação da
acetona e da água e mantidos sob constante agitação magnética e em banho-maria a 40 °C
pelo tempo de 30 minutos para a completa dissolução de seus componentes.
A seguir, a fase orgânica foi vertida lentamente com auxílio de um funil na fase
aquosa. A mistura formada permaneceu sob as mesmas condições de temperatura e agitação
por mais 10 minutos e levada para o rota-evaporador, a 100 rpm, para eliminação do excesso
de água e do solvente orgânico até obtenção do volume final desejado de 10 mL de suspensão.
As concentrações de clorexidina avaliadas foram de 0,2, 1 e 2 % (m/v).
3.1.3. Preparo das suspensões contendo nanopartículas lipídicas sólidas de clorexidina.
As suspensões contendo nanopartículas lipídicas sólidas de clorexidina (NCL) foram
obtidas por um método inédito utilizando apenas alta taxa de cisalhamento.
A composição da fase aquosa manteve-se a mesma, água (90 mL) e polissorbato 80 (3
g). Na fase oleosa alguns componentes foram testados com o objetivo de obter NCL com melhores
39
características físico-químicas. Os componentes utilizados na fase oleosa estão descritos na
Tabela 2.
Tabela 2: Componentes da fase oleosa utilizados no preparo de suspensões contendo NCL.
Componentes
Tensoativo
Óleo
Quantidade
monoleato de sorbitano
2g
manteiga de karité
5g
álcool cetílico
ácido esteárico
monoestearato de glicerila
Clorexidina
0,2 %
0,2 g
0,5 %
0,5 g
1%
1g
2%
2g
Os componentes da fase oleosa foram pesados e colocados em banho-maria a 40 °C
até completa fusão da manteiga de karité. A fase aquosa foi pesada e colocada sob constante
agitação magnética, à temperatura de 55 °C, até que todos os componentes estivessem
solubilizados.
A fase aquosa foi vertida sobre a fase oleosa. A mistura foi levada ao Ultra-Turrax
pelo tempo de 20 minutos e com agitação de 24.000 rpm (Figura 09).
40
A
C
B
Figura 9: Método de obtenção de nanopartículas lipídicas sólidas contendo clorexidina por altas
taxas de cisalhamento. A) Fase oleosa; B) Fase aquosa; C) Ultra-Turrax
O volume final da suspensão foi de 100 mL e diferentes concentrações de clorexidina
foram utilizadas (0,2; 0,5; 1,0 e 2,0 % m/v). Para efeito comparativo, foram preparadas
suspensões brancas (NBR), sem a adição de clorexidina, sendo estas preparadas através do
mesmo método.
3.1.4. Preparo dos géis contendo NCL.
Os géis foram preparados a partir da adição de hidroxietilcelulose a 1,5 % (m/v) às
suspensões. A mistura foi levada mantida por 24 h a 5 °C para completa hidratação da
hidroxietilcelulose e formação do gel.
Para obtenção do gel contendo clorexidina livre (CL), fez-se primeiramente o gel,
adicionando a hidroxietilcelulose à água e, após 24 h, o fármaco disperso em polissorbato 80
foi acrescentado ao gel.
41
3.2. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS
As suspensões e géis contendo NCL foram caracterizadas com relação à determinação
do pH, diâmetro médio das partículas, índice de polidispersão, potencial zeta, teor de fármaco
e taxa de associação.
3.2.1. Determinação do potencial zeta
O potencial zeta das suspensões e géis de NCL foi avaliado através de eletroforese em
Zetasizer nano-ZS modelo ZEN 3600, Malvern Instruments, após diluição (500 vezes, v/v)
em solução de NaCl 10 mM previamente filtrada através de membrana 0,45 µm Chromafil
Xtra RC-45/25 (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Duren, Alemanha). Os resultados
foram obtidos através dos valores da média de três amostras diferentes.
3.2.2. Determinação do índice de polidispersão e diâmetro das partículas
A determinação do diâmetro médio e do índice de polidispersão das nanopartículas nas
suspensões e géis foi realizada através de espalhamento de luz dinâmico (Zetasizer nano-ZS
modelo ZEN 3600, Malvern Instruments), após sua diluição (500 vezes, v/v) em água. Os
resultados foram determinados através dos valores da média de três amostras diferentes.
3.2.3. Determinação do pH
O pH das suspensões e géis das NCL foi verificado em um potenciômetro (Digimed)
previamente calibrado com solução tampão pH 4,0 e 7,0 e as medidas realizadas diretamente
nas suspensões e géis. Os resultados foram expressos através da média de três amostras
diferentes.
42
3.2.4. Validação da metodologia para doseamento da clorexidina
As análises foram realizadas através de cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE), avaliando-se parâmetros como linearidade, precisão, repetibilidade e exatidão
(ANEXO 1). A determinação destes parâmetros para doseamento da clorexidina foram
realizados de acordo com a Resolução n° 899 de 29 de maio de 2003 do Ministério da Saúde
(BRASIL, 2003).
3.2.4.1. Métodos Cromatográficos
As análises foram realizadas por CLAE, através da modificação da fase móvel descrita
por Chiapetta e colaboradores (2008) para quantificação da clorexidina.
Utilizou-se um cromatógrafo líquido YL-Clarity, modelo L9100 CLAE System,
equipado com bomba modelo YL9110, detector de arranjo de diodo modelo YL9160, Coluna
cromatográfica - Lichropher 100 RP – 18 (250 mm, 4,0 mm, 5 µm) – Merck.
A fase móvel utilizada foi constituída de acetonitrila, tampão fosfato monobásico de
sódio 0,03 M e trietilamina em uma proporção de 80:20:0,1 (v/v), com pH aparente de 2,0
ajustado usando ácido fosfórico.
As condições para injeção da amostra foram de volume de injeção de 20 µL e fluxo de
1,0 mL/min, temperatura de forno de 40°C, comprimento de onda de 260 nm, apresentando
um tempo de retenção de 3,3 minutos.
3.2.4.2. Preparo das amostras para o doseamento da clorexidina
Para a extração da clorexidina das suspensões e géis, as amostras foram colocadas em
balões volumétricos de 10 mL e seu volume completado com fase móvel resultando numa
concentração de 10 µg/mL. Os balões contendo os géis foram agitados no vórtex por 5
minutos, mantidos em ultrassom por 15 minutos e, após isso, o conteúdo dos balões foram
transferidos pra tubos de ensaios, os quais foram levados para ultracentrifugar por 15 minutos
a 3.500 rpm. As amostras de todos os balões foram filtradas com uma membrana de 0,45 µm
43
Chromafil Xtra RC-45/25 (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Duren, Alemanha) e
analisadas em CLAE conforme descrito acima.
3.3. DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE DAS SUSPENSÕES E GÉIS CONTENDO
NCL
As suspensões e géis de NCL 0,2 e 0,5 %, juntamente com o NBR e CL foram
submetidos ao estudo de estabilidade. Foram armazenadas em temperatura ambiente (25 ± 2
°C), geladeira (4 ± 2 °C) e estufa (40 ± 2 °C) por 90 dias. Os parâmetros analisados foram:
características organolépticas (aparência, cor e odor), pH, teor e viscosidade. Foram
determinados ainda o diâmetro médio das nanopartículas, índice de polidispersão e potencial
zeta. As leituras foram realizadas nos tempos 0 e 90 dias.
3.4. ENSAIO MICROBIOLÓGICO
Os ensaios microbiológicos foram realizados no laboratório de microbiologia da
UNIFRA. Para tal, foram utilizadas cepas dos microrganismos Candida albicans (ATCC
90028) e Enterococcus faecalis (ATCC 29212) obtidas da Americam Type Culture Collection
(ATCC).
3.4.1. Preparo da suspensão microbiana
As cepas de C.albicans foram semeadas em meio contendo ágar Sabouraud Dextrose
incubadas em estufa microbiológica a 37 °C por 24 h. O E. faecalis foi semeado em meio ágar
Brain Heart Infusion (BHI) a 37° C por 24 h (VALERA et al, 2009). Após a incubação, as
suspensões com os microrganismos em solução fisiológica estéril foram preparadas com uma
turvação de 0,5 na escala Mac Farland, equivalente a 1,5x108 UFC/mL.
44
3.4.2. Concentração inibitória mínima
A Concentração Inibitória Mínima (CIM) é a menor concentração de um agente
antimicrobiano capaz de impedir, in vitro, o crescimento visível de determinado
microrganismo a partir de testes de sensibilidade por diluição em ágar ou caldo (ANDREWS,
2001). A CIM deve ser única para uma mesma substância, considerando-se o mesmo
microrganismo, porém pode variar dependendo do microrganismo analisado.
A CIM foi determinada por meio da técnica de microdiluição em caldo MuellerHinton (Difco) para E. faecalis e C. albicans e o ensaio foi realizado em placas de 96 poços
de microdiluição nos grupos descritos na Tabela 3.
Tabela 3: Divisão dos grupos de acordo com a medicação testada para determinação da CIM.
Grupos
Medicação
Suspensão de clorexidina 0,5%
Suspensão CL 0,5 %
Suspensão NCL 0,5 %
Suspensão de nanopartículas lipídicas de clorexidina 0,5%
Gel de clorexidina a 0,5%
Gel CL 0,5 %
Gel NCL 0,5 %
Gel de nanopartículas lipídicas de clorexidina a 0,5%
Gel de nanopartículas sem fármaco (branco)
Gel NBR
Gel CL 0,5 % HCA
Gel NCL 0,5 % HCA
Gel de clorexidina a 0,5% + pasta de hidróxido de cálcio
Gel de nanopartículas lipídicas de clorexidina a 0,5% + pasta de
hidróxido de cálcio
Pasta de hidróxido de cálcio
HCA
O inóculo foi preparado no mesmo meio a uma densidade ajustada para 0,5 da escala
McFarland (1,5 x 108 UFC/mL) e diluída numa proporção de 1:10. No poço número 1, havia
100 % da suspensão, pasta ou associação. Para o poço de número 2, foi adicionado 50 % da
quantidade presente do poço 1 reduzindo a concentração do fármaco em 50 %, e assim
sucessivamente até antigir a concentração de fármaco que permitiu o crescimento microbiano,
a concentração de fármaco presente no poço anterior a este foi considerada a CIM, como pode
ser visto no fluxograma da Figura 10.
45
100 µL da formulação
100 µL de meio+
10 µL de inóculo
100 µL
100 µL
100 µL
100 µL de meio+
10 µL de inóculo
100 µL de meio+
10 µL de inóculo
100 µL de meio+
10 µL de inóculo
Poço n°1
Poço n°2
Poço n°3
Poço n°N
Concentração = X
concentração = X/2
concentração = X/4
concentração = X/?
Figura 10: Fluxograma ilustrativo da microdiluição para determinação da CIM.
Para cada formulação, a primeira concentração partiu de 50 % da concentração total
do fármaco presente na suspensão, gel ou associação. Para as suspensões e géis CL e NCL 0,5
%, o CIM foi avaliado a partir da concentração de 2,5 mg/mL. Para a mistura NCL 0,5 %
HCA a concentração partiu de 1,25 mg/mL.
As bandejas (Figura 11) foram incubadas a 37 °C e as CIMs foram registradas após 24
h de incubação para a forma livre de clorexidina e 72 h para as formulações compostas por
nanopartículas. O teste foi feito em triplicata e o 2,3,5–cloreto de trifeniltetrazólio foi usado
como indicador de crescimento bacteriano.
Figura 11: Placas de 96 poços para microdiluição e definição das CIMs.
46
3.4.3 Teste de difusão em ágar com cilindro de aço inoxidável
Para o teste de difusão em ágar utilizando os cilindros de aço inoxidáveis, foram
utilizadas 9 placas Petri. Para cada placa, foram aplicados 15 mL de ágar Mueller-Hinton
(MHA) para formar uma camada base (Figura 12) e, depois de solidificado, acrescentados 5
mL de meio MHA para formar a camada de superfície, contendo o inóculo do microrganismo
numa proporção de 50 mL de meio MHA para 1 mL de suspensão de inóculo, na temperatura
ideal de 45 °C.
100 µL da formulação
5 mL de meio MHA + inóculo
15 mL de meio MHA
Figura 12: Desenho ilustrativo dos procedimentos realizados para o teste de difusão em ágar com cilindros
de aço inoxidável.
Foram colocados 6 cilindros (8,0 x 1,0 x 10 mm; diâmetro interno = 6 mm) de aço
inoxidável estéreis por placa após a solidificação do meio e adicionados 100 µL de cada
formulação em cada cilindro, em triplicata (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1988).
As placas foram incubadas a 37 ºC e os diâmetros dos halos de inibição foram
medidos com auxílio de paquímetro digital, em milímetros, nos tempos de 24, 48 e 72 h e sua
potência calculada.
Cada cepa microbiana foi avaliada contra as seguintes formulações: P1= CL 0,2 %; P2
= CL 0,5 %; P3 = propilenoglicol; A1 = NCL 0,2 %; A2 = NCL 0,5 %; A3 = NBR,
distribuídas na placa de Petri conforma Figura 13.
As amostras padrão (P1 e P2) foram feitas a partir da diluição de clorexidina 99,9 %
(Sigma-Aldrich) em solução de dimetil sulfóxido (DMSO) (Nuclear) de forma a atingir a
concentração desejada de clorexidina equivalente a concentração presente nas NCLs.
47
P1
A3
P2
A2
P3
A1
Figura 13: Esquema de distribuição das amostras na placa petri.
3.5. AVALIAÇÃO IN VITRO DA DEGRADAÇÃO DA CLOREXIDINA QUANDO
ASSOCIADA À PASTA DE HIDRÓXIDO DE CÁLCIO
A degradação da clorexidina livre e em nanopartículas associada ou não à pasta de
hidróxido de cálcio foi avaliada no laboratório de Nanotecnologia da UNIFRA através da
quantificação de clorexidina por CLAE e análise do pH.
3.5.1. Divisão dos grupos
Para avaliar a degradação da clorexidina, os grupos para análise foram divididos de
acordo com a Tabela 4.
Tabela 4: Divisão dos grupos de acordo com a formulação.
Grupos
Gel CL 0,5 %
Gel NCL 0,5 %
Gel NBR
Gel CL 0,5 % HCA
Gel NCL 0,5 % HCA
Medicação
Gel de clorexidina a 0,5%
Gel de nanopartículas lipídicas de clorexidina a 0,5%
Gel de nanopartículas sem fármaco (branco)
Gel de clorexidina a 0,5% + pasta de hidróxido de cálcio
Gel de nanopartículas lipídicas de clorexidina a 0,5% + pasta de hidróxido
de cálcio
HCA
Pasta de hidróxido de cálcio
48
3.5.2. Preparo das amostras
A associação dos géis à pasta de hidróxido de cálcio (Calen) foi feita na proporção 1:1
(m/m), sobre placa de vidro com auxílio de um espátula plástica e armazenado recipiente e
ambiente apropriado, visando evitar sua degradação precoce (Figura 14).
A
B
C
D
Figura 14: Etapas realizadas para o preparo das amostras. A) e B) A associação dos géis à pasta de
hidróxido de cálcio foi feita na proporção 1:1, em peso; C) Mistura dos géis; D) Géis armazenados em
recipiente e ambiente apropriado.
49
3.5.3. Determinação do pH
O pH foi verificado, em função do tempo, em um pHmetro (Digimed) previamente
calibrado com solução tampão pH 4,0 e 7,0 e as medidas realizadas a partir da diluição de
0,01 g da amostra em 10 mL de água.
3.5.4. Doseamento da clorexidina
Para o doseamento da clorexidina incorporada ao gel e à pasta de hidróxido de cálcio,
as amostras foram pesadas de acordo com a concentração, de forma a se obter uma
concentração final para análise de 20 µg/mL.
Os géis e pastas foram pesados em um balão volumétrico de 10 mL e o volume
completado com a fase móvel (Figura 15). Os balões foram agitados no vortex por 5 minutos,
mantidos em banho de ultrassom por 15 minutos e, após isso, o conteúdo dos balões foi
transferido para tubos de ensaios, os quais foram levados para centrifugar por 15 minutos a
3.500 rpm. O sobrenadante das amostras foi filtrado em membrana (0,45 µm poro) e
analisadas em CLAE.
A
B
C
D
Figura 15: Preparo das amostras para análise em CLAE. A) Géis e pastas foram pesados em um balão
volumétrico de 10 mL; B) Os balões foram agitados no vortex por 5 minutos; C) Géis levados para sonicar
por 15 minutos; D) O conteúdo dos balões foi transferido para tubos de ensaios e depois para centrífuga
por 15 min.
50
3.6. PROFUNDIDADE DE PENETRAÇÃO NOS TÚBULOS DENTINÁRIOS
3.6.1. Obtenção dos dentes humanos
Para a avaliação da profundidade de penetração das nanopartículas nos túbulos
dentinários foram utilizados nove dentes humanos extraídos cedidos pelo Banco de Dentes da
Faculdade de Odontologia da UNIFRA. Sua utilização foi aprovada pelo Comitê de Ética em
Pesquisa em Seres Humanos da mesma instituição sob parecer de n0 335.2010.2.
Os elementos apresentavam ápice radicular completo, raiz única e reta e foram
armazenados em solução fisiológica a 0,9 %, a fim de permanecerem constantemente
hidratados.
3.6.2. Preparo das amostras
Os elementos foram seccionados transversalmente no limite amelocementário com
auxílio de um disco diamantado duplo (K. G. Sorensen, São Paulo, SP - Brasil) e sua
superfície externa impermeabilizada com uma camada de adesivo epóxi Araldite
(BRASCOLA – São Bernardo do Campo, SP).
O canal foi localizado com auxílio da lima tipo K-file nº 10 (DENTSPLY Ind. Com.
Ltda. – Petrópolis, RJ), a qual percorreu todo interior do canal até a sua visualização no
forame apical para determinar o comprimento real da raiz. O comprimento real de trabalho foi
estabelecido 1 mm aquém do comprimento real da raiz.
O preparo biomecânico foi feito com limas K-file 1ª série (#15 - #40) (DENTSPLY
Ind. Com. Ltda. – Petrópolis, RJ) e o soro fisiológico 0,9 % foi utilizado como irrigante a
cada troca de instrumento.
Ao final do preparo, o canal foi irrigado com 10 mL de solução de EDTA a 17 % para
remoção da smear layer. Os canais foram secos com cone de papel absorvente (TANARI Ind.
Ltda. – Manacapuru, AM) de diâmetro compatível com o canal principal. Nos grupos nos
51
quais foi utilizada medicação, estas foram introduzidas no interior do canal com auxílio de
agulha e seringa até o completo extravasamento da medicação pela região apical.
O excesso de material foi removido das duas extremidades e o acesso coronário e
apical foram selados com cimento provisório (COLTOSOL – Vigodent Indústria e Comércio
– Bonsucesso / RJ - Brasil).
No grupo controle, o canal permaneceu vazio e suas extremidades seladas com
cimento provisório. As amostras foram distribuídas em três grupos com três elementos em
cada grupo, como mostra na Tabela 5.
Tabela 5: Distribuição dos grupos.
Grupos
Medicamento
Amostras (n)
Controle
Sem medicação
3
Suspensão de nanopartículas de clorexidina a 0,5%
3
Gel de nanopartículas de clorexidina a 0,5%
3
Suspensão NCL 0,5 %
Gel NCL 0,5 %
O medicamento permaneceu no interior do canal por um período de 15 dias; após isso,
fez-se a remoção do cimento provisório e a raiz foi irrigada com soro fisiológico a 0,9 % para
a remoção dos restos dos medicamentos.
Foram confeccionados sulcos longitudinais de orientação na face mesial e na face
distal das raízes com disco diamantado duplo (K. G. SORENSEN, São Paulo, SP - Brasil) em
baixa rotação para posterior clivagem dos elementos. As amostras foram levadas para o
interior de um dessecador para o processo de desidratação da estrutura dentária, onde
permaneceu em vácuo por um período de 10 dias.
As amostras prontas foram fixadas em stub, metalizadas com ouro e analisadas em
microscopia eletrônica de varredura (MEV) com voltagem de 10 kV no centro de microscopia
da UFRGS (Jeol Scanning Microscope JSM-5800, Japan) para análise da penetração das
nanopartículas de clorexidina no interior dos túbulos dentinários.
Na Figura 16, podemos observar toda a sequência da metodologia de forma resumida.
52
A
B
E
C
D
F
Figura 16: Etapas realizadas para o processo de análise das nanopartículas lipídicas no interior do
elemento dentário. A) Padronização das amostras; B) confecção de sulcos para o processo de clivagem; C)
Clivagem da estrutura dentária; D) Dessecador utilizado para o processo de desidratação das amostras;
E) Amostras fixadas em stub e metalizadas com ouro; F) MEV/EDS utilizado para registro das
micrografias e espectros.
Foi utilizado como método auxiliar ao MEV, a espectrometria de energia dispersiva de
raios-X (EDS), técnica na qual a amostra é bombardeada por elétrons e a energia dos átomos
presentes é detectada e a concentração do átomo expresso em um espectro. O átomo de
interesse foi o cloro por estar presente na composição química da clorexidina, assim como
Musial e colaboradores (2010) que utilizaram o EDS para localizar átomos de cloro e, assim,
identificar a presença de clorexidina em nanocápsulas de metilcelulose e poli(ácido acrílico).
3.7. ESTUDO IN VIVO
Para realização do estudo in vivo, foram utilizados ratos machos Wistar,
imunocompetentes, pesando 300 – 350 g (N = 8 por grupo; N total = 56) provenientes do
Biotério da Universidade Federal de Pelotas (UFPEL; Pelotas, RS). Os animais foram
mantidos no Vivário da PUCRS, em estantes ventiladas, equipadas com filtros de entrada e
53
saída de ar, com temperatura controlada (22  1 oC) e ciclo claro-escuro de 12 h. Os animais
receberam ração peletizada e água filtrada ad libitum.
Os procedimentos experimentais seguiram as recomendações para o cuidado com
animais de laboratório e normas éticas para a experimentação em animais conscientes, do
Guia de Uso e Cuidado com Animais Laboratoriais do National Institutes of Health (NIH) dos
Estados Unidos da América, que são adotadas pelo Conselho Brasileiro de Experimentação
Animal (COBEA). Foram respeitados os preceitos apresentados na Lei No 11.794, de 9 de
outubro de 2008 e os protocolos experimentais foram submetidos à apreciação do Comitê de
Ética para o Uso de Animais (CEUA) da PUCRS sob numero 10/0021.
Para a realização dos procedimentos odontológicos, os animais foram anestesiados
pela administração intraperitoneal da associação de xilazina (10 mg/kg) e quetamina (100
mg/kg). Foi realizada a administração do fármaco analgésico Paracetamol 80 mg/kg, 2 vezes
ao dia, via oral durante todo o experimento. No período de tempo adequado, a eutanásia foi
realizada por anestesia profunda com isofluorano. Depois da eutanásia, as amostras
pertinentes ao estudo foram coletadas e o lixo biológico foi destinado ao setor de descarte da
PUCRS.
3.7.1. Distribuição dos grupos e cálculo do tamanho da amostra
Os grupos foram distribuídos de acordo com a medicação utilizada, como descrito na
Tabela 6.
Tabela 6: Distribuição dos animais nos diferentes grupos experimentais.
Grupos
Medicação
Amostras (n)
Propilenoglicol
8
Gel de clorexidina a 0,5%
8
Gel de nanopartículas lipídicas de clorexidina a 0,5%
8
Gel de nanopartículas sem fármaco (branco)
8
Gel CL 0,5 % HCA
Gel de clorexidina a 0,5% + pasta de hidróxido de cálcio
8
Gel NCL 0,5 %
Gel de nanopartículas lipídicas de clorexidina a 0,5% +
8
Controle
Gel CL 0,5 %
Gel NCL 0,5 %
Gel NBR
HCA
pasta de hidróxido de cálcio
HCA
Pasta de hidróxido de cálcio
8
54
3.7.2. Indução das lesões periapicais
Com o objetivo de induzir lesões periapicais, os animais foram anestesiados através da
mistura de xilazina e quetamina, como descrito acima. Após a confirmação da anestesia,
foram realizadas aberturas coronárias nos primeiros molares inferiores, com brocas
diamantadas esféricas de alta rotação (1/2 mm de diâmetro), sob irrigação constante. Após a
remoção da polpa coronária, a cavidade pulpar ficou exposta ao meio bucal por um período de
21 dias, para a indução de lesão periapical (IWAMA et al, 2003).
3.7.3. Instrumentação e preenchimento do canal
Decorridos 21 dias da indução das lesões periapicais, os animais foram novamente
anestesiados. O preparo do canal radicular foi realizado pela técnica escalonada, utilizando-se
limas K-file de número 08, 10, 15, 20 e 25, sucessivamente, em um comprimento de trabalho
de 4 mm, determinado de acordo com o tamanho médio das raízes de molares inferiores de
rato. Hipoclorito de sódio a 1 %, em um volume de 200 L, foi utilizado como solução
irrigante. A secagem do canal foi feita com cones de papel (TANARI Ind. Ltda –
Manacapuru, AM) de calibre 25, esterilizados e o preenchimento com a medicação intracanal
foi realizado com auxílio de seringa e agulha de insulina, conforme a descrição anterior, até o
comprimento de trabalho. Após a colocação da medicação intracanal, as cavidades foram
seladas com amálgama de prata e, os ratos permaneceram pelo período de 30 dias com a
medicação intracanal (adaptado de WAGNER et al, 2011) para posterior eutanásia e
realização das análises descritas a seguir.
3.7.4. Exame radiográfico
Após a eutanásia, as mandíbulas foram removidas cirurgicamente, dissecadas, fixadas
em solução tamponada de formalina 10 % e levadas para a avaliação radiográfica das
alterações periapicais. Utilizou-se um aparelho de Raio X (DABI-ATLANTE, Ribeirao Preto,
55
SP, Brazil) com sensor digital (KODAK Dental System, modelo RVG 6100 Digital
Radiography System) e armazenadas com resolução de 1 Megabit, e salvo em formato JPEG.
As radiografias foram realizadas de forma padronizada seguindo os seguintes
parâmetros: a região do primeiro molar inferior deveria formar angulo perpendicular ao raioX, a potencia utilizada foi de 70 kvp, com distância foco/filme de 30cm e tempo de exposição
constante de 0,2 s.
A área da lesão radiolúcida periapical foi medida com o auxilio do programa Adobe®
Photoshop® CS4, versão 11.0 (WOLLE et al, 2012).
3.7.5. Análise histológica
A análise histológica foi realizada no Laboratório de Patologia da UFPEL.
As mandíbulas permaneceram armazenadas em solução tamponada de formalina 10 %
até seu processo de descalcificação em solução de EDTA a 5 % (pH 7,4), durante 30 dias,
sendo a solução renovada a cada dois dias, para corte das peças.
Para análise histopatológica, blocos de parafina contendo as mandíbulas foram
seccionados seriadamente, com espessura média de 6 m no plano vestíbulo-lingual. Todas as
secções foram coradas com hematoxilina e eosina, observadas em microscópio óptico com
aumento de 100 e 400 vezes.
A intensidade do infiltrado inflamatório foi classificada, conforme descrito por
Armada-Dias e colaboradores (2006), com os seguintes escores: ausente (0), discreto (1),
moderado (2) ou severo (3).
A Figura 17 representa um fluxograma das atividades para realização etapa in vivo.
56
Figura 17: Fluxograma das etapas para o estudo in vivo.
3.7.6. Análise Estatística
A análise estatística dos resultados foi realizada por meio de análise de variância
(ANOVA) de uma via, seguida pelo teste de Fisher (α=0,05) + DP.
57
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. PREPARO DAS NANOPARTÍCULAS CONTENDO CLOREXIDINA
4.1.1. Teste de solubilidade
A partir do teste de solubilidade, foi possível observar que a clorexidina não era
solúvel em triglicerídio de ácidos cáprico/caprílico. De todos os diferentes óleos testados,
como descrito no item 3.3.1., o cocoato de butilenoglicol foi o óleo que melhor solubilizou a
clorexidina, sendo então, o óleo de escolha para o preparo das nanocápsulas de clorexidina.
Para avaliar a solubilidade da clorexidina em diferentes lipídios (descritos no item
3.3.1) que poderiam compor a fase oleosa para obtenção das nanopartículas lipídicas sólidas,
observou-se que a manteiga de karité melhor solubilizou a clorexidina e, dentre as
concentrações avaliadas, a de 5 % apresentou melhor desempenho, já que nas concentrações
de 7 % e 10 % era visível um excesso de óleo no sobrenadante.
4.1.2. Preparo das nanocápsulas poliméricas de clorexidina
Neste estudo, tentou-se reproduzir o método de obtenção de nanocápsulas contendo
clorexidina descrita por Lboutounne e coloraboradores (2002), sendo testadas as
concentrações de clorexidina 1 % e 0,25 %. Alguns componentes da formulação original de
Lboutounne e colaboradores (2002) foram substituídos devido à indisponibilidade dos
mesmos e as concentrações de clorexidina base variaram de 0,2 até 2 %.
Sem obter sucesso, as proporções foram alteradas, como mostra a Tabela 7.
58
Tabela 7: Composição das nanocápsulas poliméricas alterada por este estudo.
Fase orgânica
Quantidade
Fase aquosa
Quantidade
PCL
100 mg
Água
53 mL
Monoestarato de sorbitano
76,6 mg
Polissorbato 80
76,6 mg
Acetona
27 mL
Cocoato de butilenoglicol
310 mg
Clorexidina
2%
200 mg
1%
100 mg
0,5 %
50 mg
0,2 %
20 mg
Volume final = 10 mL
Assim que as formulações eram rotaevaporadas, observava-se a precipitação do
fármaco nas paredes do balão em todas as concentrações, além de tamanho de partículas
elevado (700 nm) e não contínuo, chegando à escala de micrômetros, valores bem diferentes
dos encontrados por Lboutounne e colaboradores (2002) que foram em torno de 230 nm.
O tensoativo foi substituído por monoleato de sorbitano e lecitina. Mesmo assim, o
fármaco continuou se depositando e o tamanho das partículas não foi compatível com o
desejado.
Como este estudo não conseguiu reproduzir o método de obtenção de nanocápsulas
contendo clorexidina, alternativas de nanocarreadores como nanoesferas e nanopartículas
lipídicas sólidas foram testados.
Para obtenção de nanoesferas contendo clorexidina, o óleo foi eliminado e, desta
forma, conseguiu-se um tamanho médio de partículas em torno de 300 nm, mas ainda
permanecia depositada no fundo do balão uma película, parecendo ser o polímero,
impossibilitando sua utilização no estudo.
4.1.3. Preparo das NCL
Para definir a concentração ideal de fármaco, as NCL foram obtidas com 0,2; 0,5, 1 e
2 % de clorexidina. Nas concentrações de 1 e 2 %, houve grande deposição do fármaco e o
tamanho das partículas não era uniforme. Optou-se pela concentração de 0,5 % para a
realização dos testes microbiológicos, in vitro nos dentes humanos, e in vivo em ratos.
59
4.2. CARACTERIZAÇÃO DAS NCL
As características físico-químicas das suspensões e géis das NCLs 0,2 e 0,5 % e NBR
foram avaliadas através da determinação da distribuição do diâmetro médio das partículas,
índice de polidispersão, potencial zeta, pH e teor do ativo.
As suspensões e géis contendo NBRs serviram como controle do experimento. A
caracterização físico-química das mesmas é de suma importância, pois através delas pode-se
avaliar se houve alterações no comportamento destes sistemas com a incorporação do
fármaco. Da mesma maneira, procedeu-se ao estudo da formulação de CL livre (não
encapsulada).
Na Tabela 8, encontra-se descrita a caracterização físico-química das suspensões de
NCLs nas concentrações de 0,2 e 0,5 %; NBR; e na forma livre. Podemos observar que as
NCLs 0,2 e 0,5 %, não apresentaram diferença estatística entre si. Já a formulação com o
fármaco livre apresentou diferença estatística na maioria dos parâmetros analisados quando
comparado com os demais grupos.
Tabela 8: Valores referentes à caracterização físico-química das suspensões contendo NCL 0,2 e 0,5 % e
NBR, e do fármaco livre um dia após sua obtenção (+DP).
Doseamento
Potencial
(%)
zeta (mV)
a
Diâmetro
pH
(nm)
88,5 ± 2,8a
8,4 ± 0,0a
95,0 ± 3,1
NCL 0,5 %
94,2 ± 2,7a
-13,5 ± 2,3b
0,245 ± 0,010a
84,6 ± 1,3a
8,7 ± 0,0a,c
--
-16,9 ± 0,2c
0,229 ± 0,014a
124,3 ± 2,0b
7,2 ± 0,4b
109,6 ± 2,5a
-0,02 ± 0,52d
0,548 ± 0,081b
323,5 ± 44,6c
9,1 ± 0,0c
CL livre
0,249 ± 0,003
a
NCL 0,2 %
NBR
-5,2 ± 0,4
a
IPD
a-b-c-d: as médias com as letras diferentes dentro da mesma coluna apresentaram diferença significativa entre si
(p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
O doseamento não apresentou diferença estatística entre as NCLs 0,2 e 0,5 % em
relação ao livre, não havendo degradação do fármaco durante o processo de produção das
nanopartículas, mesmo empregando alta taxa de cisalhamento por um tempo prolongado. O
potencial zeta foi o parâmetro no qual todos os grupos apresentaram-se estatisticamente
60
diferentes, sendo o potencial zeta reduzido quanto maior a concentração de clorexidina na
formulação, mostrando a forte influência da carga do fármaco na formulação final.
As formulações nanoparticuladas não apresentaram diferença significativa em relação
ao índice de polidispersão, demonstrando que a adição de fármaco na formulação não alterou
a monodispersibilidade das formulações, sendo todos na faixa de 0,2 e adequados para
aplicação farmacêutica (SCHAFFAZICK et al, 2003). O IPD apresentou diferença estatística
das nanopartículas em relação ao fármaco livre, verificando-se a importância do lipídeo
estruturante (manteiga de karité) nas formulações.
Na Figura 18, podemos observar o gráfico que expõe o diâmetro médio das partículas.
Os valores foram bastante semelhante entre as NCLs 0,2 e 0,5 %, 88,5 + 2,8 nm e 84,6 + 1,3
nm, respectivamente. Houve uma pequena diferença, porém estatisticamente significante, no
tamanho das nanopartículas, nas duas concentrações, em relação às NBR, pois estas
apresentaram valores de 124,3 + 2,0 nm. O fármaco livre apresentou os maiores valores de
tamanho de partículas, por volta de 323,5 nm com um valor bastante elevado de DP (44,6),
indicando uma média de tamanho de partícula não uniforme.
Figura 18: Distribuição do tamanho médio das partículas (nm) inicial das suspensões contendo NCL 0,2
% (linha vermelha); 0,5 % (linha verde) e NBR (linha azul).
Os valores de pH das NCLs 0,2 e 0,5 % não apresentaram diferença entre si e foram
superiores a 8,4. Já a NBR apresentou o menor valor de pH, 7,2, e o fármaco livre o maior
valor, 9,1. Este resultado corrobora com os dados já descritos acima demonstrando uma forte
influência do fármaco na formulação de nanopartículas.
Após a incorporação das suspensões de nanopartículas ao gel de hidroxietilcelulose,
uma nova coleta de dados foi realizada e expressa na Tabela 9. Assim como ocorreu com as
61
suspensões, o gel com o fármaco livre apresentou diferença estatística com os demais grupos
na maioria dos parâmetros analisados.
Tabela 9: Valores referentes à caracterização físico-química dos géis contendo NCL 0,2 e 0,5 % e NBR, e
fármaco livre um dia após sua obtenção (+DP).
Doseamento
Potencial
(%)
zeta (mV)
NCL 0,2 %
93,6+0,3
a
-3,21+0,32
NCL 0,5 %
95,4+0,1a
NBR
CL livre
a
IPD
Diâmetro
pH
(nm)
a
91,7+0,4a
8,1+0,1a
0,97+1,11b
0,260+0,004a
92,7+0,8a
8,5+0,1b
--
-15,13+0,35c
0,230+0,012a
120,5+0,8a
6,1+0,1c
108,3+0,7a
-0,07+0,46d
0,554+0,066b
374,6+26,9b
9,0+0,1d
0,254+0,003
a-b-c-d: as médias com as letras diferentes dentro da mesma coluna apresentaram diferença significativa entre si
(p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
O doseamento do gel livre apresentou o maior valor, porém não foi estatisticamente
diferente dos valores encontrados para os géis nas concentrações 0,2 e 0,5 %, que também não
apresentaram diferença estatística entre si e refletiram a concentração da suspensão usada
como base para seu preparo, demonstrando que seu processo de produção não causou
degradação do fármaco.
O potencial zeta foi o parâmetro em que, novamente, todos os grupos apresentaram-se
estatisticamente diferentes, podendo ser influenciado pelo
dispersante, pelo pH,
condutividade, concentração dos componentes presentes na formulação, inclusive o princípio
ativo e pela força iônica do meio (TEIXEIRA, 2010). Provavelmente, a ação do fármaco
esteja interferindo nestes valores já que os valores das suspensões nas duas concentrações
encontraram próxima aos valores do fármaco livre como foi descrito na Tabela 9 e nos
gráficos representados pela Figura 19.
62
A
C
B
D
Figura 19: Valores referentes a sobreposição dos gráficos do potencial zeta (mV) (A) da suspensão e gel de
NCL 0,2 %; (B) da suspensão e gel NCL 0,5 %; (C) suspensão e gel NBR; e (D) suspensão e gel do
fármaco livre. As linhas vermelhas representam o potencial zeta inicial, e as linhas verdes após os 90 dias.
As nanocápsulas de clorexidina descritas no trabalho de Nhung e colaboradores (2007)
apresentaram valores de potencial zeta de +34 + 9 mV. Este valor positivo pode estar
relacionado, segundo o autor, pela clorexidina adsorvida na interface ao redor da parte externa
do polímero ou incorporada na parte externa do polímero, pois as formulações sem o fármaco
apresentaram valores negativos, típicos de formulações nas quais estão presentes PCL,
fosfolipídios e tensoativos não iônicos como o polissorbato 80 e monoestarato de sorbitano
(SCHAFFAZICK et al, 2003). As formulações de NCL não tinham a presença da PCL e, ao
analisarmos os valores do potencial zeta da NBR, observamos que apresentaram valores
negativos, provavelmente pela presença dos demais compostos citados acima. Baseado no
pequeno aumento de potencial zeta visto no presente trabalho e na discussão de Nhung e
colaboradores (2007), podemos inferir que as NCL devem possuir uma menor concentração
de fármaco em sua superfície que as nanocápsulas desenvolvidas anteriormente.
Da mesma maneira vista para as suspensões, o gel com fármaco livre apresentou o
maior valor de IPD, acima de 0,5, demonstrando uma não uniformidade das partículas. Os
grupos das NCL apresentaram valores semelhantes e próximos do ideal, em torno de 0,2. Ao
compararmos os valores do IPD dos géis com as suspensões, verificamos que seus valores
apresentaram pouca variação, não sendo de grande relevância e indicando uma
63
homogeneidade na distribuição do tamanho das partículas, prevendo uma boa estabilidade das
suspensões e géis.
O diâmetro médio das partículas das formulações dos géis não apresentou diferença
estatística entre os grupos das NCL, apesar do branco apresentar uma média de tamanho de
120,5 + 0,8 nm, um pouco superior às NCL 0,2 e 0,5 % que foram, respectivamente, 91,7 +
0,4 nm e 92,7 + 0,8 nm. Já a formulação com o fármaco livre apresentou valor bastante
superior, 374,6 + 26,9 nm. Se comparados estes valores médios de diâmetro das partículas dos
géis com os das suspensões, podemos verificar que, em todos os grupos, a adição ao gel de
hidroxietilcelulose não interferiu de forma significativa nestes valores, podendo ser observado
nos gráficos representados pela Figura 20.
B
A
C
Figura 20: Valores referentes a sobreposição dos gráficos do tamanho médio das partículas (nm) (A) da
suspensão e gel de NCL 0,2 %; (B) da suspensão e gel de NCL 0,5 %; (C) suspensão e gel de NBR. As
linhas vermelhas representam as suspensões e as linhas verdes os géis.
Os valores médios de diâmetro de partícula das nanocápsulas de clorexidina descritos
por Nhung e colaboradores (2007) foram de 285 + 13 nm, valores superiores aos encontrados
neste estudo para NCL; porém, compatíveis com os valores encontrados para este tipo de
nanopartícula utilizada. No caso das nanocápsulas, sua utilização era para a via tópica e este
diâmetro de partícula é considerado adequado. Por outro lado, no presente trabalho, a via de
administração é intracanal, sendo interessante obtermos o menor tamanho de partícula
possível a fim de elas alcancem toda a extensão dos canalículos dentinários.
64
Houve uma diferença significativa nos valores de pH entre todos os grupos dos géis. O
menor valor de pH foi encontrado no gel de NBR, e o maior valor nos géis de CL livre,
respectivamente de 6,1 e 9,0. Os valores do pH das suspensões Não foram afetados por sua
adição no gel.
4.3. DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE DAS SUSPENSÕES E GÉIS CONTENDO
NCL
A análise da estabilidade é um processo importante para identificar fatores
relacionados à formulação, à fabricação, condições de armazenamento ou ambientais, que
podem, de alguma forma, influenciar na estabilidade do produto (BRASIL, 2004), a fim de
assegurar a qualidade das formulações.
Os estudos realizados para a determinação da estabilidade das suspensões e após
incorporação no gel, levaram em consideração a determinação do diâmetro das partículas, pH,
índice de polidispersão, potencial zeta e teor do ativo.
As formulações contendo NBR foram avaliadas como controle do experimento e a
caracterização físico-química das mesmas foi de suma importância para avaliar se houve
alterações no comportamento destes sistemas após a incorporação do fármaco
nanoestruturado. Assim como, a comparação foi realizada com o fármaco livre. Para este
estudo, uma única suspensão de cada tipo foi preparada e dividida nas diferentes condições de
armazenamento para que não houvesse diferença inicial entre os parâmetros.
4.3.1. Diâmetro médio das partículas e índice de polidispersão
Como já foi resultado anteriormente, a análise do tamanho de partícula e do índice de
polidispersão em função do tempo são parâmetros importantes que devem ser observados
tanto na caracterização físico-química, como também, nos testes de estabilidade, pois
alterações em seus valores podem indicar sedimentação do sistema (GUTERRES et al, 1995),
o que interferiria diretamente no processo de estabilidade das suspensões e géis.
65
A Tabela 10 expressa os valores do diâmetro médio das partículas e IPD das
suspensões de NCL 0,2 e 0,5 %, e NBR, respectivamente, no tempo de 0 dias e após o
armazenamento em TA, GE e ES pelo período de 90 dias.
Tabela 10: Diâmetro médio das partículas e IPD das suspensões de NCLs 0,2 e 0,5 % e NBR (+DP).
Tempo (dias)
NCL 0,2 %
NCL 0,5 %
NBR
88,5+2,8a-d
84,6+1,3a
124,3+2,0b-d-e
GE
97,2+8,9a-b-d
85,5+2,8a
124,8+1,0b-d-e
TA
87,7+1,9a-d
81,2+3,6a
121,9+1,4d-e
ES
196,6+21,3c
197,8+25,7c
129,3+5,2e
0,249+0,003a-d-e
0,245+0,010a-d-e
0,229+0,014d-e-f
GE
0,324+0,057b
0,293+0,031a-b-d
0,219+0,010e-f
TA
0,315+0,086a-b
0,262+0,030a-d-e
0,223+0,007e-f
ES
0,056+0,012c
0,059+0,024c
0,168+0,011f
0
Tamanho (nm)
90
0
IPD
90
a-b-c-d-e-f: as médias com as letras diferentes para o mesmo parâmetro apresentaram diferença significativa
entre si (p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
Analisando os valores expressos na Tabela anterior, podemos observar que os grupos
das nanopartículas lipídicas, apresentaram-se estáveis, com alterações não significantes do
tamanho médio das partículas e IPD, quando armazenadas em TA ou GE.
Ao serem submetidas a uma temperatura de 40 °C (estufa) pelo período de 90 dias, as
suspensões de NCLs 0,2 e 0,5 % apresentaram grandes alterações, com aumento do tamanho
médio de partícula e redução do IPD. Isso pode ser claramente visto na Figura 21A e B,
respectivamente, onde os gráficos sobrepostos das amostras armazenadas em TA, GE e ES
nos mostram a comparação do tamanho das partículas e IPD.
A
B
Figura 21: Sobreposição dos gráficos do tamanho médio de partícula das suspensões de NCLs (A) 0,2% e
(B) 0,5% no tempo 0 (linhas vermelhas) e após 90 dias de armazenamento em TA (linhas verdes), GE
(linhas azuis) e ES (linhas pretas).
66
Os gráficos das amostras armazenadas na ES das suspensões de NCLs 0,2 e 0,5 % são
completamente diferente dos demais, evidenciando o processo de agregação das partículas e
decomposição dos demais componentes devido a manutenção por um longo período em
temperaturas elevadas.
A manteiga de karité, cujo ponto de fusão é entre 34 e 42 °C pode estar fundindo
durante o armazenamento a 40 °C e sua recristalização não forma mais as nanopartículas de
tamanho originais, dando também margem à maior degradação do fármaco. Este fenômeno de
coalescência deve ocorrer apenas quando há uma fusão parcial da manteiga, pois nas outras
temperaturas de armazenamento o sistema mostrou-se estável e adequado.
Nas suspensões NBRs, os valores mantiveram-se estáveis independentes da
temperatura de armazenamento como visto anteriormente na Tabela 10 e na Figura 22,
exposta a seguir. A única diferença significativa ocorreu com o IPD das amostras
armazenadas em ES, assim como ocorreu com as NCLs 0,2 e 0,5 %, havendo diminuição do
valor, apesar de menor proporção.
Figura 22: Sobreposição dos gráficos do tamanho médio de partícula das suspensões NBRs no tempo 0
(linha vermelha) e após 90 dias de armazenamento em TA (linha verde), GE (linha azul) e ES (linha
preta).
As suspensões de fármaco livre apresentaram alterações no tamanho médio das
partículas independentemente da condição de armazenamento, inclusive, as amostras
armazenadas em ES estavam visivelmente alteradas, com mudança na coloração e odor,
ficando inviáveis para análise.
Podemos observar na Tabela 11 os valores do diâmetro médio das partículas e IPD
dos géis de NCLs 0,2 e 0,5 % e NBR, respectivamente, no tempo de 0 dias e após o
armazenamento em TA, GE e ES pelo período de 90 dias.
67
Tabela 11: Diâmetro médio das partículas e IPD dos géis de NCLs 0,2 e 0,5 % e NBR (+DP).
Tempo (dias)
NCL 0,2 %
NCL 0,5 %
NBR
91,7+0,4a-b-c
92,7+0,8a-b-c
124,3+2,0a-b-c-d
GE
90,2+1,0a-c
82,9+2,1c
Fungou
TA
82,7+0,5a-c
101,2+6,0a-b-c
146,6+0,9d
ES
141,7+3,6b-d
183,9+1,9a-b-c
Fungou
0
Tamanho (nm)
90
0
IPD
90
0,254+0,003
a-b
0,260+0,004
a-b
0,229+0,014a-b
GE
0,323+0,075b-c
0,219+0,012a
Fungou
TA
0,227+0,017a
0,199+0,009a
0,398+0,014c-d
ES
0,358+0,052c-d
0,441+0,020d
Fungou
a-b-c-d: as médias com as letras diferentes para o mesmo parâmetro apresentaram diferença significativa entre si
(p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
As formulações de NCLs 0,2 e 0,5 % na forma de gel apresentaram alterações
significantes do tamanho médio das partículas e do IPD quando as amostras foram
armazenadas a uma temperatura de 40 °C pelo período de 90 dias, como se pode ver na
Tabela 11. A Figura 23A e B, respectivamente, mostram a sobreposição dos gráficos do
tamanho das partículas e IPD das amostras armazenadas em TA, GE e ES.
A
B
Figura 23: Sobreposição dos gráficos do tamanho médio das partículas dos géis de NCLs (A) 0,2 % e (B)
0,5 % no tempo 0 (linhas vermelhas) e após 90 dias de armazenamento em TA (linhas azuis), GE (linhas
verdes) e ES (linhas pretas) .
Nos géis de NBRs, como mostrou a Tabela 11, foi possível observar um aumento
significativo no tamanho das partículas e também no IPD das amostras armazenadas em TA.
Já nas amostras armazenadas em GE e ES, houve a proliferação de fungos, como se observa
na Figura 24. Isso ocorreu por não ter sido feita a adição de conservante às formulações
devido à ação bactericida da clorexidina, mantendo-se o branco também sem adição de
conservantes, já que este poderia comprometer a comparação dos parâmetros físico-químicos
68
entre as formulações. Desta forma, foi inviável a análise destas amostras, por isso, a Figura 25
expressa apenas a comparação dos gráficos da TA com o inicial.
Figura 24: Proliferação fúngica nas amostras dos géis de NBRs armazenadas em GE e ES.
Figura 25: Sobreposição dos gráficos do tamanho médio das partículas dos géis de NBRs no tempo 0
(linha vermelha) e após 90 dias de armazenamento em TA (linha verde).
O gel de CL livre apresentou redução do diâmetro de partícula após o período de 90
dias. Quando armazenada em TA, houve redução significativa do valor de IPD, já quando
armazenada em GE, houve um aumento do valor.
4.3.2. Análise do pH e doseamento
A análise do pH em função do tempo de armazenamento pode nos fornecer
informações importantes sobre a estabilidade das formulações, incluindo aquelas que contem
nanopartículas lipídicas, já que a alteração de seus valores pode estar relacionado diretamente
com a degradação de componentes presentes na formulação.
A Tabela 12 expõe os valores do pH e da quantidade de fármaco presentes nas
suspensões em estudo após o armazenamento por 90 dias em TA, GE e ES.
69
Tabela 12: Média do pH e doseamento das suspensões de NCLs 0,2 e 0,5 %, NBR e CL (+DP).
Tempo
NCL 0,2 %
NCL 0,5 %
NBR
CL
8,4+0,0a
8,7+0,0a
7,2+0,4a
9,1+0,0a
GE
7,6+0,1c
7,3+0,5b
6,7+0,2c
7,6+0,1b
TA
6,7+0,0b
7,0+0,3b
6,1+0,1b
7,3+0,1b
ES
5,7+0,6d
5,9+0,4c
5,2+0,2d
5,7+0,1c
95,0+3,1a
94,2+2,7a
-------
109,6+2,5a
GE
89,7+3,3a
86,4+8,0a
-------
95,7+3,5a
TA
84,5+1,2a
87,1+0,9a
-------
93,6+0,0a
ES
62,4+7,0b
71,1+5,9b
-------
75,4+3,2b
(dias)
0
pH
90
0
Doseamento (%)
90
a-b-c-d: as médias com as letras diferentes para o mesmo parâmetro apresentaram diferença significativa entre si
(p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
Ao analisarmos os valores do pH inicial e após o período de 90 dias de
armazenamento das NCLs 0,2 e 0,5 %, podemos observar que houve uma redução do valor do
pH inicial semelhante nas duas concentrações, nas diferentes formas de armazenamento, não
havendo diferença significante entre os dois grupos. Porém, ao compararmos a forma de
armazenamento entre si, observamos que em ambas as suspensões, houve uma maior variação
de pH nas amostras armazenadas em ES, passando de 8,4 para 5,7 nas suspensões de NCLs
0,2 %, e 8,7 para 5,9 nas suspensões de NCLs 0,5 %. Esta alteração de pH se deve,
principalmente à degradação do fármaco e à desestabilização dos sistemas pela temperatura.
Esta alteração de pH também ocorreu nas suspensões de NBR, demonstrando não ser um
efeito apenas da degradação do fármaco mas também fortemente da desestabilização do
sistema.
Porém, a maior variação do pH inicial e após os 90 dias encontra-se nas amostras das
suspensões de fármaco livre armazenadas em ES, onde o pH partiu de 9,1 para 5,7. E
novamente, os valores menos equidistantes foram encontrados nas amostras armazenadas em
GE, onde os valores passaram para 7,6. Essa variação de pH vem acompanhada pela
degradação da formulação, incluindo a clorexidina, composto ativo que também sofre redução
nos seus valores de doseamento, pois assim como o pH, as amostras armazenadas na ES
apresentaram a maior variação da porcentagem de quantificação, passando de 95 % para 62,4
% nas suspensões de NCLs 0,2 %; 94,2 % para 71,1 % nas NCLs 0,5 % e 109,6 % para 75,4
70
% nas suspensões de CL livre. As suspensões de CL livre apresentaram uma maior
degradação do composto ativo nas três formas de armazenamento quando comparadas com as
suspensões de nanopartículas. Assim como as suspensões foram avaliadas, os géis tiveram
seus valores de pH e doseamento expressos na Tabela 13.
Tabela 13: Média do pH e doseamento dos géis de NCLs 0,2 e 0,5 %, NBR e CL (+DP).
Tempo
NCL 0,2 %
NCL 0,5 %
NBR
CL
8,1+0,1a
8,5+0,1a
6,1+0,1a
9,0+0,1a
GE
7,7+0,2a
7,8+0,5a-b
Fungou
8,5+0,0a-b
TA
7,0+0,3b
7,6+0,2b
3,4+0,3b
8,1+0,2b
ES
4,4+0,2c
5,5+0,0c
Fungou
Secou
93,6+0,3a
95,4+0,1a
-------
-------
GE
86,3+10,2a
95,5+3,8a
-------
-------
TA
60,7+1,1b
82,5+1,3a
-------
-------
-------
-------
-------
(dias)
0
pH
90
0
Doseamento (%)
90
ES
a
85,46+0,0
a-b: as médias com as letras diferentes para o mesmo parâmetro apresentaram diferença significativa entre si
(p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
Os géis de NCLs 0,2 e 0,5 % apresentaram menores variações de pH quando
armazenados em TA e GE e, ao serem comparados com as suspensões nas mesmas formas de
armazenamento, mantiveram a maior variação nas amostras armazenadas em ES, passando de
8,1 para 4,4 e 8,5 para 5,5, respectivamente.
Nos géis de NBRs, apenas foi possível fazer análise das amostras armazenadas em
TA, na qual o valor inicial de pH passou de 6,1 para 3,4. Nas amostras armazenadas em GE e
ES, houve proliferação de fungos, sendo inviável a análise. Talvez, em TA também tenha
ocorrido contaminação microbiológica, mesmo que ainda imperceptível, podendo ser a causa
de tamanha alteração no pH.
Devido a isso, o doseamento do teor do fármaco foi realizado apenas nas amostras de
NCL 0,2 % armazenadas em ES, apresentando uma variação inferior que as amostras
armazenadas em TA e GE, corroborando com os dados de pH, diâmetro de índice de
polidispersão.
Após o período de 90 dias, podemos concluir que as suspensões e os géis de NCLs 0,2
e 0,5 % mantiveram-se estáveis quando armazenados em TA ou em GE. Já as formulações
71
armazenadas em ES apresentaram diferença significativa no tamanho das partículas e/ou do
índice de polidispersão, pH e teor de fármaco, sendo recomendada a manutenção destes
produtos em temperatura máxima de 25 °C.
O fármaco livre, tanto na forma de suspensão ou gel, apresentou valores imprecisos,
contraditórios, e ao ser armazenado em ES, sofreu total alteração, sendo inviável sua análise,
demonstrando que esta forma farmacêutica não é adequada para veiculação da clorexidina.
4.4. AVALIAÇÃO IN VITRO DA DEGRADAÇÃO DA CLOREXIDINA ASSOCIADA À
PASTA DE HIDRÓXIDO DE CÁLCIO
No momento que se tem a ideia de associar fármacos com o intuito de um
complementar o outro, é de fundamental importância que eles não interfiram na ação
individual de cada um. Além disso, toda vez que uma mistura de substâncias para uso clínico
é elaborada, a análise deste produto resultante deveria ser realizada com o intuito de controlar
seus efeitos benéficos ou deletérios.
Como já foi descrito na literatura (ZERELLA et al, 2005; BARBIN, et al, 2008), a
associação da clorexidina e pasta de hidróxido de cálcio tem grandes benefícios, porém pode
ocorrer a precipitação da clorexidina devido ao elevado pH do hidróxido de cálcio. Com isso,
além de prejudicar a ação individual de cada um dos fármacos, pode ocorrer a formação de
subprodutos, que podem vir a ser tóxicos. Yeung e colaboradores (2007) chegam a afirmar
que os subprodutos da clorexidina formados da sua degradação em elevado pH seriam os
responsáveis pelo efeito antimicrobiano persistente, devido a uma ação pró-oxidante destes
subprodutos.
Como forma de observação desta alteração química gerada pela mistura da CL com a
pasta de HCA, Barbin e colaboradores (2008) utilizaram a espectrometria de massa e CLAE.
Em nosso estudo, este acompanhamento foi realizado através da análise da variação do pH,
que também foi utilizado como método complementar no estudo de estabilidade das
formulações elaboradas neste trabalho, e CLAE.
O HCA, o gel de CL livre e o gel de NCL foi analisado de forma isolada e em
associação pelo período de 14 dias, tempo clínico utilizado entre as sessões de tratamento
endodôntico quando utilizado como medicação a pasta de HCA.
72
4.4.1. Análise do pH
Para uma efetiva ação antimicrobiana do HCA e de seus demais benefícios, é
necessário que ele mantenha elevados níveis de pH. Esse efeito antimicrobiano do HCA está
ligado diretamente à elevação do pH resultante da dissociação, em meio aquoso, dos íons
hidroxila e íons cálcio (ESTRELA, et al, 1995; FAVA e SAUNDERS, 1999). Desta forma, a
adição de CL à pasta de HCA não deve alterar essa propriedade, assim como, a adição da
pasta à CL não deveria causar nenhum tipo de alteração da CL.
Observando os valores do pH (Tabela 14), no tempo inicial e após o período de 14
dias de cada formulação, podemos verificar que a pasta de HCA apresentou um pH acima de
12 durante todo o período de análise. O gel de CL livre apresentou valor médio bastante
inferior à pasta, em torno de 6,7. O gel de NCL apresentou um valor pH um pouco superior ao
gel livre, acima de 7.
Ao se analisar os valores do pH da CL 0,5 % HCA, podemos observar que não houve
alteração significativa do pH da pasta, pois o pH manteve-se elevado, acima de 12 para a
associação com gel livre e acima de 11,9 para associação com gel de nanopartículas.
Tabela 14: pH inicial e final de cada formulação.
Grupos
Valores de pH
Inicial
Após 14 dias
Gel CL 0,5 %
6,78 + 0,09
7,14 + 0,07
Gel CL 0,5 % HCA
12,19 + 0,03
12,13 + 0,05
Gel NCL 0,5 %
7,15 + 0,04
7,20 + 0,05
Gel NCL 0,5 % HCA
11,25 + 0,04
11,90 + 0,07
HCA
12,15 + 0,06
12,58 + 0,06
A adição do gel de CL livre à pasta do HCA não alterou o pH do HCA, bem como foi
relatado por Basrani, Ghanen e Tjaderhane (2004) que comprovaram o mesmo efeito no seu
estudo.
Signoretti e colaboradores (2011) também encontraram valores de pH da associação
da pasta de HCA com a CL em torno de 12, indo de encontro com nossos resultados, o que
nos faz concluir que a adição do gel de CL, aparentemente, não interferiu nas propriedades
73
físico-químicas da pasta de HCA, já que o pH é um parâmetro de grande importância durante
a análise da estabilidade desta substância.
Em relação ao gel contendo NCL, ainda não há descrição na literatura. Porém,
partindo do mesmo princípio do qual não houve a alteração do pH da pasta após sua
associação, é possível concluir que a composição das NCL também não interferiu nas
propriedades do HCA.
Ao analisarmos os valores do pH da CL livre e em nanopartículas, podemos observar
que houve um aumento bastante significante após a associação deste géis com a pasta de
HCA. Este aumento do pH, como já foi relatado, poderia provocar algum tipo de alteração na
CL, por isso, segue a análise do teor do ativo.
4.4.2. Doseamento
Na Tabela 15, podemos observar o teor de fármaco, expresso em porcentagem, inicial
e após o período de 14 dias de cada formulação. A diferença da concentração inicial e final foi
realizada como forma de estabelecer a porcentagem de redução de fármaco neste período.
A quantidade de redução de fármaco no gel de CL livre foi de 2,2 % e do gel de NCL,
0,3 %, diferença esta não significante, podendo ter sido ocasionada até mesmo durante o
processo de manipulação e preparo das formulações para o doseamento em CLAE.
Já no gel de CL 0,5 % HCA esta diferença foi bastante considerável, apresentando
uma redução de 33,1 % da quantidade de fármaco inicial após o período de 14 dias, enquanto
que, no gel de NCL 0,5 % HCA, esta redução foi de apenas 10,3 %, ou seja, o fármaco livre
degradou três vezes mais que o fármaco em nanopartícula quando em associação com a pasta
de HCA.
74
Tabela 15: Concentração inicial (%) de fármaco e após o período de 14 dias nos diferentes grupos, e sua
redução neste período.
Grupos
Concentração em %
Inicial
Após 14 dias
Redução
Gel CL 0,5 %
81,7 %
79,5 %
2,2 %
Gel CL 0,5 % HCA
78,8 %
45,7 %
33,1 %
Gel NCL 0,5 %
94,2 %
93,9 %
0,3 %
Gel NCL 0,5 % HCA
94,8 %
84,5 %
10,3 %
Ao observarmos a sobreposição dos cromatogramas (Figura 26) referentes ao gel de
NCL e NCL 0,5 % HCA em diferentes dias de análise, podemos ver que, mesmo após 14
dias, não se observa nenhum produto de degradação.
Figura 26: Sobreposição de cromatogramas correspondente ao gel de NCL 0,5 % (linha preta) e NCL 0,5
% HCA após 2 (linha vermelha) e 14 dias (linha rosa).
A proteção do fármaco pelos sistemas de nanocarreadores vem sendo pesquisada por
diversos autores e é considerada uma das grandes vantagens sobre os sistemas de entrega de
fármacos convencional (NHUNG et al, 2007). A proteção do fármaco pode se dar frente a
altas temperaturas, alteração do pH, agentes químicos, ou qualquer outro fator que possa
provocar a degradação prematura do fármaco.
Diferentes fármacos foram encapsulados com o objetivo de promover sua proteção. O
diazepan é um exemplo de fármaco que, quando administrado por via oral, sofre hidrólise
ácida e metabolismo hepático. Foi encapsulado em nanopartículas lipídicas sólidas
(ABDELBARY et al, 2009) com o intuito de reduzir sua degradação. Outro fármaco que
também pode ser citado é a vimpocetina (LUO et al, 2006), utilizada no tratamento de
distúrbios circulatórios cerebrovasculares, que apresenta baixa absorção oral, sendo
75
rapidamente metabolizada e eliminada do organismo; quando encapsulado em nanopartículas
lipídicas sólidas, o fármaco apresenta-se protegido da ação química dos ácidos presentes no
sistema digestivo.
Neste estudo, podemos comprovar a proteção da clorexidina, quando apresentada em
nanopartículas, após a associação com a pasta de hidróxido de cálcio e a degradação da
clorexidina na forma livre após a mesma associação. Porém, ao contrário de Barbin e
colaboradores (2008), não foi comprovada a degradação total do fármaco logo após a mistura,
e sim uma redução acelerada, mas gradual, com o passar do tempo da clorexidina.
4.5. ANÁLISE MICROBIOLÓGICA
4.5.1. Teste de difusão em ágar
Para o teste de difusão em ágar, optou-se pelo uso de cilindros de aço inoxidável, já
que os discos de papel poderiam reter as nanopartículas, dificultando sua difusão.
Os testes foram realizados em triplicata para cada microrganismo, com um ensaio de
três pontos para uma maior validação, no qual foram utilizadas duas diferentes concentrações
para o padrão: solução de CL 0,2 e 0,5 % e amostra: suspensão de NCL 0,2 e 0,5 %. Como
grupos controle foram utilizados o propilenoglicol e NBR.
Como as nanopartículas liberam lentamente o fármaco, espera-se uma ação inicial
mais lenta e, por isso, os halos de inibição foram medidos por um maior período de tempo,
iniciando em 24, 48 e, por último, 72 h (Figura 27).
76
Figura 27: Placas após o período de 72 horas para análise do diâmetro com paquímetro digital.
Na Tabela 16, encontram-se as médias dos halos de inibição de acordo com o
microrganismo, tempo e concentração.
Tabela 16: Média dos halos de inibição (mm) + DP da solução de CL e das NCL.
Candida albicans
Concentrações
Enterococcus faecalis
24 h
48 h
72 h
24 h
48 h
72 h
P1
20,4+0,8a
21,5+0,9a
22,6+1,9a-b
19,8+0,7a-b
19,5+0,4a-b
20,6+1,4a-b
P2
22,3+0,1a-b
22,6+0,9a-b
25,2+0,8b
21,2+0,9a
21,7+0,8a
18,9+0,3b
P3
0
0
0
0
0
0
A1
13,5+0,6c
14,85+0,9c
15,5+0,8d
9,5+0,3c
10,5+0,6c
15,3+0,6d
A2
14,4+0,8c
15,3+1,7c
15,8+1,3d
10,7+0,8c
11,6+0,1c
17,0+0,6b-d
A3
0
0
0
0
0
0
P1: CL 0,2 %; P2: CL 0,5 %; P3: propilenoglicol; A1: NCL 0,2 %; A2: NCL 0,5 %; A3: NBR.
a-b-c-d: as médias com as letras diferentes para o mesmo microrganismo apresentaram diferença significativa
entre si (p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
Observando os valores dos halos de inibição da CL livre, podemos verificar que não
houve diferença significativa em relação à concentração utilizada e o tempo de ação. Porém,
os padrões apresentaram valores de halos de inibição maiores que os das NCL, nas duas
concentrações. Os halos de inibição foram maiores para C. albicans do que E. faecalis.
As suspensões de nanopartículas também não apresentaram diferença significativa no
tamanho do halo de inibição entre as concentrações testadas, sendo os valores menores que a
forma livre, mas crescente com o passar do tempo, enquanto que na forma livre toda sua ação
77
ocorre praticamente nas primeiras 24 horas. Este resultado que vem de encontro com o que é
descrito na literatura (SCHAFFAZICK, 2003; NHUNG et al, 2007; ALHAJ et al, 2008) como
sendo uma vantagem dos sistemas carreadores de fármaco a lenta liberação do fármaco,
fazendo com que haja uma manutenção de concentração de fármaco com o passar do tempo.
Apesar das medidas dos halos de inibição das nanopartículas terem sido de menor
expressão, o estudo foi importante para comprovar que a nanoencapsulação da clorexidina
não afeta sua atividade antimicrobiana. As nanopartículas mostraram um aumento gradual do
halo de inibição de acordo com o tempo de exposição, confirmando a liberação lenta do
fármaco.
4.5.2. Concentração inibitória mínima (CIM)
As CIMs foram descritas na Tabela 17 de acordo com o tipo de formulação e o tipo de
microrganismo testado.
Tabela 17: CIM de acordo com a formulação e o tipo de microrganismo.
Grupos
CIM
Candida albicans
Enterococcus faecalis
Suspensão CL 0,5 %
1,46 µg/mL
1,46 µg/mL
Suspensão NCL 0,5 %
1,46 µg/mL
1,46 µg/mL
Gel NCL 0,5 %
1,46 µg/mL
1,46 µg/mL
Gel CL 0,5 % HCA
5,8 µg/mL
5,8 µg/mL
Gel NCL 0,5 % HCA
1,46 µg/mL
2,9 µg/mL
HCA
46,8 µg/mL
5,8 µg/mL
Na literatura, podemos encontrar diversos autores que relatam a CIM da clorexidina
(RUSSEL et al, 1993; ESTRELA et al, 2003; AMORIM et al, 2004; LOFTI et al, 2011) e do
hidróxido de cálcio (ESTRELA et al, 2003; PALLOTTA et al, 2007), porém, devido à grande
diferença nas metodologias, os valores não são exatamente os mesmos.
Em nosso estudo, o maior valor de CIM foi do grupo HCA, que, contra o E. faecalis
foi de 5,8 µg/mL, e para C. albicans 46,8 µg/mL. Estes dados confirmam a afirmação feita
por alguns autores (EVANS et al, 2003; SOARES et al, 2006; LEE et al, 2008) que o HCA é
78
menos efetivo contra E. faecalis e, principalmente, contra C. albicans, já que a CIM
encontrada foi quase 10 vezes maior do que do mesmo medicamento contra o E. faecalis e 32
vezes maior que o valor apresentado pela clorexidina.
A CIM da CL livre, em nanopartículas ou nanopartículas em gel apresentou o mesmo
valor de 1,46 µg/mL, tanto para E. faecalis, quanto para C. albicans. Russel e colaboradores,
em 1993, relataram valores da CIM da clorexidina contra o E. faecalis, variando de 1 µg/mL a
2,5 µg/mL. Já Amorim e colaboradores (2004) relataram valor de 3,33 µg/mL contra E.
faecalis e 4 µg/mL contra C. albicans, valores superiores aos encontrados pelo nosso estudo.
No momento em que a HCA foi adicionada a CL, podemos observar um aumento
significante do valor da CIM, passando de 1,46 µg/mL para 5,8 µg/mL, tanto para E. faecalis,
quanto para C. albicans, representando um aumento de duas vezes na concentração de
clorexidina necessária para apresentar a mesma ação antimicrobiana. No grupo do E. faecalis,
este valor de 5,8 µg/mL seria o equivalente ao valor do HCA, fazendo com que a ação da
clorexidina, tenha sido praticamente anulada, já que os valores da CIM foram os mesmos.
Este resultado está relacionado com o que foi descrito por Barbin e colaboradores (2008) e
também comprovado por este estudo, com resultados descritos no item 4.4, no qual foi feita a
análise da degradação da clorexidina na associação com o HCA, ficando evidente a
degradação da clorexidina, fato este que causaria a diminuição da sua ação antimicrobiana.
Porém, ao adicionarmos as NCLs com a HCA, podemos observar que a CIM contra o
E. faecalis passou de 1,46 µg/mL para 2,9 µg/mL e, contra C. albicans, o valor permaneceu o
mesmo. Provavelmente, isso se deva à proteção do fármaco pelas nanopartículas lipídicas,
evitando a degradação da clorexidina causada pelo elevado pH do HCA, mantendo seu efeito
antimicrobiano.
4.6. PENETRAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS NOS TÚBULOS DENTINÁRIOS
A presença e a profundidade de penetração das NCL no interior dos túbulos
dentinários teve como método de análise o uso de imagens por microscopia eletrônica de
varredura (MEV) e o espectro fornecido pela energia dispersiva de raios-X (EDS).
Para análise de MEV, é necessário um processo de desidratação da amostra para
realização das imagens. A técnica usual é composta pela imersão dos elementos dentários em
79
concentrações crescentes de etanol ou acetona (PAGONIS et al, 2010). Porém as
nanopartículas lipídicas são decompostas na presença de solventes. Como alternativa, a
desidratação das amostras foi realizada com auxílio de um dessecador, à vácuo, pelo período
de 10 dias.
Como já foi relatado por Sen e colaboradores (1995), a smear layer acaba se
depositando e obliterando a entrada dos túbulos dentinários prejudicando a ação dos agentes
irrigantes e da medicação intracanal. Para a remoção desta lama dentinária, seguiu-se parte
das recomendações feitas por Perez e colaboradores (1993), que seria um banho ultrassônico
em EDTA 17 % por 10 minutos, seguido de hipoclorito de sódio a 5,25 % por mais 10
minutos. A etapa do hipoclorito de sódio a 5,25% não foi realizada, porque utilizamos como
método de análise o EDS, e como o objetivo era identificar átomos de cloro presentes na
clorexidina, o cloro do hipoclorito de sódio poderia interferir no resultado, pois não seria
possível identificar se o cloro seria originário da clorexidina ou do hipoclorito.
Mesmo com o protocolo alterado, a remoção da smear layer foi efetiva e os túbulos
dentinários do grupo controle, no qual não foi utilizado medicamento, ficaram expostos, como
mostra a Figura 28, favorecendo a livre penetração das NCL.
Figura 28: Micrografia eletrônica da exposição dos túbulos dentinários após o processo de remoção da
smear layer nas amostras do grupo controle.
Foi possível observar nas imagens obtidas pelo MEV a presença das nanopartículas
lipídicas na superfície da estrutura dentária e dentro dos túbulos dentinários, como se pode
observar na Figura 29, assim como Pagonis e colaboradores (2010), que também relataram a
80
presença de nanopartículas de azul de metileno no interior dos túbulos dentinários através do
mesmo método de análise.
A
A
B
B
Figura 29: Microscopia eletrônica de varredura. A) Micrografia eletrônica da deposição das NCL sobre a
superfície dentária. B) Micrografia eletrônica da presença de NCL no interior dos túbulos dentinários.
Musial e colaboradores (2010) utilizaram como método de identificação da clorexidina
e a forma como esta estava distribuída na matriz polimérica de nanocápsulas, a porcentagem
atômica de cloro identificado pelos espectros do sistema EDS associado ao MEV. Da mesma
forma, o EDS foi utilizado em nosso estudo para identificar a presença de átomos de cloro e,
desta forma, localizar as prováveis NCL.
Com isso, podemos observar na Figura 30 a provável presença de NCL sobre a
superfície dentária e mais profundamente no interior dos túbulos dentinários, através da
confirmação pela análise quantitativa dos átomos de cloro realizado pelo EDS (Tabela 18).
81
A
B
1
1
2
2
Figura 30: A) Micrografia da estrutura dentária com a suspensão de NCL depositada (1) sobre a luz do
canal e (2) no interior dos túbulos dentinários. B) Espectro do EDS mostrando presença de cloro (1) na
superfície dentária e em menor quantidade de átomos cloro (2) no interior dos túbulos dentinários.
Tabela 18: Análise quantitativa do espectro do EDS detectando o cloro.
% dos átomos
C-K
O-K
Ponto 1 (pt1)
59.33
11.29
Ponto 2 (pt2)
48.88
14.35
Mg-K
0.37
Si-K
0.42
P-K
Cl-K
Ca-K
Zn-L
Au-M
4.47
3.48
9.14
7.87
4.42
11.51
0.68
19.86
0.96
2.96
A Figura 31 ilustra a presença de NCL obliterando a entrada dos túbulos dentinários,
sendo observado tanto na formulação gel, quanto na suspensão. Desta forma, podemos inferir
que a forma de apresentação não interferiu no processo de deposição das nanopartículas.
82
A
B
Figura 31: Micrografias de NCL obliterando a entrada dos túbulos dentinários (A) em gel e (B) em
suspensão.
As NCLs em gel tendem a se depositar mais na superfície da estrutura, provavelmente
pela maior tensão superficial e viscosidade do gel, enquanto que na forma de suspensão, as
nanopartículas apresentam uma maior profundidade de penetração para o interior dos túbulos,
como podemos observar na Figura 32.
A
B
Figura 32: Micrografia dos túbulos dentinários. A) em gel. B) em suspensão.
Utilizando o EDS, podemos evidenciar pelo espectro a presença de átomos de cloro na
superfície dentinária em uma quantidade superior há observada no interior dos túbulos
dentinários. Isto pode estar relacionado à menor quantidade de NCL no interior dos túbulos
dentinários e, consequentemente, menor detecção de átomos de cloro pelo EDS, como pode
ser observado na Figura 33 e Tabela 19.
83
B
A
1
2
Figura 33: A) Micrografia de NCL na superfície dentária e no interior dos túbulos dentinários e B) seus
respectivos espectros em EDS.
Tabela 19: Análise quantitativa do espectro do EDS detectando o cloro.
% de átomos
C-K
O-K
Ponto 1 (pt1)
75.86
6.80
Ponto 2 (pt2)
18.58
Mg-K
P-K
0.74
24.82
Cl-K
Ca-K
Zn-L
Au-M
2.98
1.70
7.32
5.35
0.98
48.59
1.14
5.16
Nas regiões onde há presença de pequena quantidade de NCL, o sinal no espectro
relativo ao cloro também é diminuído. Isso acontece na região apical do canal radicular, como
é possível observar na Figura 34 e Tabela 20.
A
B
Figura 34: A) Micrografia da região apical do canal radicular e mínima presença de NCLsobre a
superfície dentinária, confirmada B) pelo espectro do EDS que identificou pequena quantidade de cloro.
84
Tabela 20: Análise quantitativa do espectro do EDS detectando o cloro.
% átomos
C-K
O-K
Na-K
P-K
Cl-K
Ca-K
Zn-L
Au-M
Base(18)_pt1
68.34
10.13
0.10
3.28
0.23
16.48
0.06
1.38
Com base nos resultados encontrados neste estudo, a metodologia utilizando MEV,
mostrou-se adequada para a observação e identificação das NCLs na forma de suspensão e em
gel, assim como Pagonis e colaboradores (2010) também utilizaram a MEV para identificar
nanopartículas, porém de azul de metileno, no interior de túbulos dentinários. O uso do EDS
foi proposto como forma de completar esta avaliação identificando átomos para a qualificação
das imagens, assim como Musial e colaboradores (2010) também o fizeram.
Na literatura, podemos observar outros métodos obtenção de informações relativas à
forma e ao tamanho das nanopartículas, como a microscopia eletrônica de transmissão (MET)
(HALL et al., 2007), ou ainda a microscopia de força atômica (MFA) (SCHFFAZICK et al.,
2003).
4.7. ESTUDO IN VIVO EM RATOS
4.7.1. Análise radiográfica
A análise radiográfica forneceu imagens nas quais podemos observar uma área
radiolúcida na região periapical da raiz mesial do primeiro molar inferior sugestiva de
periodontite apical. A Figura 35 apresenta as imagens radiográficas representativas das lesões
periapicais após a utilização das medicações intracanal. A Figura 36A ilustra o grupo
controle, no qual foi utilizado o propilenoglicol. A área radiolúcida mostra-se visivelmente
maior que os demais grupos, demonstrando a maior área afetada. Já nas imagens da Figura
36B, C e F podemos observar lesões de menor tamanho, sugestivas de reparo na região apical
após o uso da medicação intracanal do gel CL 0,5 %, gel NCL 0,5 % e sua associação com
HCA, respectivamente.
85
A
B
C
D
E
F
G
Figura 35: Imagens radiográficas representativas das lesões periapicais em ratos após a utilização de
medicação intracanal de acordo com cada grupo: (A) Controle; (B) Gel CL 0,5 %; (C) Gel NCL 0,5 %;
(D) Gel NBR; (E) Gel CL 0,5 % HCA; (F) Gel NCL 0,5 % HCA; (G) HCA.
Após a mensuração do tamanho das áreas das lesões, os valores da média foram
expostos no gráfico da Figura 36.
86
Pixels / pol
150000
100000
a-c
c-d-f
50000
f
d-e-f
b-d-e b-d-e
e
C
A
H
H
+
%
%
0,
5
C
L
N
C
L
0,
5
C
C
A
A
C
+
H
N
on
tr
ol
e
C
L
0,
5
N
%
C
L
0,
5
%
B
R
0
a-b-c-d-e-f: os grupos com as letras diferentes apresentaram diferença significativa entre si (p<0,05) de acordo
com o teste de Fisher.
Figura 36: Gráfico referente às áreas de radiolucidez das lesões periapicais a partir das imagens
radiográficas após o tratamento com diferentes medicações intracanal.
O grupo controle, com lesões de maior tamanho, apresentou diferença estatística com
a maioria dos grupos, exceto com o grupo das nanopartículas sem o fármaco. Este resultado já
era esperado e reflete o teste in vitro, no qual foram medidos os halos de inibição, as NBR,
assim como o propilenoglicol, não apresentaram ação antimicrobiana contra o E. faecalis e C.
albicans.
Os grupos do gel CL 0,5 %, gel NCL 0,5 % e NCL 0,5 % HCA promoveram maior
reparo da região periapical, não apresentando diferença estatística entre si, fornecendo
imagens radiográficas com lesões de menor tamanho.
Quando comparado o grupo do gel CL 0,5 % HCA e o grupo do gel NCL 0,5 % HCA
verificamos que não houve diferença significativa entre o tamanho das lesões. Mesmo assim,
é possível observar através do gráfico que a média do tamanho das lesões do gel de NCL 0,5
% HCA são menores e tendem a apresentar um resultado mais favorável, sendo confirmado
pela análise histológica, na qual foi possível observar diferença estatística. Talvez, o valor de
DP elevado do grupo CL 0,5 % HCA, tenha influenciado de forma negativa no resultado.
Quando comparados os grupos do gel CL 0,5 % e CL 0,5 % HCA podemos observar,
na Figura 38, uma diferença nas médias do tamanho das lesões, mesmo que não significativa,
porém, demonstra uma tendência da CL associada ao HCA apresentar lesões de maior
tamanho, o que também é observado na literatura com o trabalho de Evans e colaboradores
87
(2003) afirmando que a eficiência antimicrobiana da CL associada ao HCA seria menor que a
CL. A presença da lesão maior indicaria uma diminuição da ação antimicrobiana da CL
quando em associação com o HCA devido a uma provável degradação durante a mistura
causado pelos elevados valores do pH do HCA estudos in vitro nos itens 4.4 e 4.5, e em
trabalhos já realizados por outros autores sobre este processo de degradação, como Zerella e
colaboradores (2005) e Barbin e colaboradores (2008).
Já o grupo do gel NCL 0,5 % HCA apresentou valores médios de tamanho de lesão
similares ao grupo do gel NCL; porém, com valores de coeficiente de variação (CV) de 13 %,
enquanto o grupo de NCL apresentou um valor de CV de 28 %. Além disso, foi possível
observar a manutenção da ação antimicrobiana da clorexidina independente da sua associação
com HCA apesar dos seus elevados valores de pH. Isso nos faz acreditar que a presença do
invólucro lipídico protegeu a clorexidina deste processo de degradação, novamente
confirmando o que foi visto no estudo in vitro que avaliou a degradação da clorexidina após
esta associação com seus resultados descritos no item 4.4. e 4.5.
Também foi possível observar que o gel CL 0,5 % HCA não apresentou diferença
estatística com o HCA. Porém quando o HCA é comparado com o gel de NCL 0,5 % HCA
podemos observar diferença estatística, o que é de grande relevância clínica, podendo estar
relacionado com a uniformidade dos resultados.
4.7.2. Análise histológica
A partir da análise das imagens expressas pelas lâminas histológicas (Figura 37), a
intensidade do infiltrado inflamatório recebeu escores conforme classificação descrita por
Armada-Dias e colaboradores (2006): ausente (0), discreto (1), moderado (2) ou severo (3).
88
A
B
C
D
E
F
G
Figura 37: Imagens das lâminas histológicas representativas das lesões periapicais em ratos após a
utilização de medicação intracanal de acordo com cada grupo: (A) Controle; (B) Gel CL 0,5 %; (C) Gel
NCL 0,5 %; (D) Gel NBR; (E) Gel CL 0,5 % HCA; (F) Gel NCL 0,5 % HCA; (G) HCA.
89
Após a soma dos escores, a análise estatística e o resultado da comparação entre os
grupos e suas médias foram expressos na Figura 38 na forma de gráfico.
Escore inflamatório
4
3
a-d-g
d-e-g
g
e-g
2
b-c-e-f c-e-f-g
f
1
C
A
H
H
+
%
%
0,
5
C
L
N
C
L
0,
5
C
C
A
A
C
+
H
N
on
tr
ol
e
C
L
0,
5
N
%
C
L
0,
5
%
B
R
0
a-b-c-d-e-f-g: os grupos com as letras diferentes apresentaram diferença significativa entre si (p<0,05) de acordo
com o teste de Fisher.
Figura 38: Gráfico referente aos escores do infiltrado inflamatório a partir da análise histopatológica
da reação ao tratamento com diferentes medicações intracanal.
Analisando as lâminas histológicas, podemos observar que os maiores valores de
escores estavam presentes no grupo controle, com presença de infiltrado inflamatório intenso
e formação de abscesso perirradicular, apresentando diferença significativa com a maioria dos
grupos. Apesar de não haver diferença significativa com o grupo do gel NBR e HCA, não se
observa nestes grupos a formação de abscesso perirradicular, apenas um considerável
infiltrado inflamatório. Wagner e colaboradores (2011) também relataram a presença de
reabsorção óssea periapical com a formação de abscesso após a análise das lâminas
histológicas no mesmo grupo controle, confirmando a presença do intenso infiltrado
inflamatório.
O grupo do gel NCL 0,5 % HCA, seguido do gel de CL e NCL, apresentaram os mais
baixos valores de escores e, não apresentaram diferença estatística entre si. É possível
observar uma redução no infiltrado inflamatório e a presença de áreas de neovascularização,
significando reparo da região, apesar de não haver neoformação óssea.
90
Observando mais especificamente o grupo CL e NCL, não houve diferença
significativa entre eles tanto na análise histológica, como na radiográfica, não refletindo os
resultados obtidos no teste microbiológico com os cilindros de aço, no qual foi relatada a
diferença entre os halos de inibição com os menores valores apresentados pelo grupo NCL
num período de análise de 72 h. Provavelmente, este período de 72 h ainda não é suficiente
para a completa liberação da clorexidina, pois como já descrito, os sistema carreadores
apresentam a característica de liberação lenta e controlada, configurando um tempo
inadequado para a avaliação da ação das nanopartículas.
Quando comparado o grupo gel CL 0,5 % HCA e o grupo gel NCL 0,5 % HCA, é
observada uma diferença significativa na presença de infiltrado inflamatório, refletindo um
maior valor de escores para o grupo na qual a CL não estava em nanopartículas. Isto pode ter
ocorrido devido ao processo de degradação sofrido pela CL frente aos elevados valores de pH
do HCA, confirmando clinicamente o que foi descrito por este trabalho nos estudos in vitro
nos itens 4.4 e 4.5, e em trabalhos já realizados por outros autores sobre este processo de
degradação, como Zerella e colaboradores (2005) e Barbin e colaboradores (2008). Isto nos
leva a crer que no grupo NCL 0,5 % HCA, a CL presente conseguiu atingir todo seu potencial
antimicrobiano já que estava protegida pela nanopartícula lipídica, apresentando assim,
melhores resultados de reparo na região periapical.
O grupo do gel NBR não apresentou diferença estatística com o grupo controle, CL
0,5 % HCA e HCA. Este resultado não corrobora os dados do teste microbiológico utilizando
os cilindros de aço para análise dos halos de inibição, pois neste teste este grupo não
apresentou nenhuma ação contra E. faecalis e C. albicans. Talvez a redução da lesão seja pelo
processo de instrumentação e irrigação defendido por alguns autores como suficiente para o
reparo da região apical, além disso, a composição das NCL poderia reduzir a reação
inflamatória no tecido periapical, permitindo algum tipo de reparo. Esta redução pode ser
causada pela manteiga de karité que possui emolientes e antioxidantes que podem reduzir o
processo inflamatório.
O grupo do HCA não apresentou diferença estatística com o grupo controle, já Wagner
e colaboradores (2011) observaram esta diferença em seu estudo, talvez a presença de maiores
valores de DP neste estudo tenha contribuído para tal resultado, já que os valores da média
dos escores apresentam diferença.
Analisando as imagens fornecidas pelo gráfico da Figura 39, observamos uma
semelhança grande com o gráfico da Figura 37 da análise radiográfica. Ao analisarmos a
91
significância estatística, podemos verificar que também há concordância na maioria das
comparações dos resultados entre os grupos. Apenas houve diferença da análise histológica e
radiográfica entre o grupo das nanopartículas lipídicas de clorexidina comparado com o grupo
da clorexidina associada à pasta de hidróxido de cálcio, onde radiograficamente houve
diferença significante e histologicamente não houve diferença.
Esta semelhança nos induz a acreditar que as imagens radiográficas representam
claramente o que está acontecendo histologicamente, pois o processo de reparo tecidual pode
ser observado com a neoformação óssea e reparo da região periapical através da diminuição
do tamanho da lesão na imagem radiográfica.
92
5. CONCLUSÃO
A partir dos objetivos e resultados deste estudo, podemos concluir que:

Foi possível desenvolver e caracterizar nanopartículas lipídicas sólidas contendo
clorexidina de forma satisfatória nas concentrações de 0,2 e 0,5 %.

A adição do gel à suspensão de nanopartículas lipídicas sólidas contendo clorexidina
não interferiu nas características e ação antimicrobiana da formulação.

Foi possível observar a estabilidade das formulações de nanopartículas lipídicas
contendo clorexidina quando armazenadas em temperatura ambiente e em geladeira.
As amostras armazenadas em estufa sofreram processo de degradação tanto na forma
de suspensão quanto em gel.

A clorexidina livre apresentou-se instável após o período do teste de estabilidade em
todas as temperaturas avaliadas.

O teste in vitro com o gel de clorexidina 0,5 % associado à pasta de hidróxido de
cálcio e o gel de nanopartículas lipídicas contendo clorexidina 0,5 % associada à pasta
de hidróxido de cálcio confirmou o processo de degradação da clorexidina decorrente
do elevado pH da pasta. Já a clorexidina nanoencapsulada foi protegida pela camada
de lipídios, amenizando este processo de degradação.

A avaliação por microscopia eletrônica de varredura associada à difração de raio X
confirmou a presença de átomos de cloro na superfície da estrutura dentinária e,
também, no interior dos túbulos dentinários, sendo um indício forte da presença de
nanopartículas lipídicas contendo clorexidina sobre na luz do canal, agindo de forma
efetiva como medicação intracanal, já que há penetração destas para o interior dos
túbulos dentinários.

Os testes microbiológicos de difusão em ágar revelaram halos de inibição das
nanopartículas lipídicas contendo clorexidina menores que da clorexidina livre, porém,
pode-se comprovar que a ação antimicrobiana da clorexidina não foi afetada pelo
casulo lipídico, pois os valores de concentração inibitória mínima das nanopartículas e
da forma livre para C. albicans e E. faecalis foram os mesmos. Foi possível evidenciar
a liberação lenta e gradual da clorexidina presente nas nanopartículas lipídicas
93
contendo clorexidina, aumentando os halos de inibição com o passar do tempo
devendo, por este motivo, ter um tempo de análise maior.

A avaliação in vivo, em ratos, mostrou radiograficamente e histologicamente o
excelente desempenho do grupo formado pelas nanopartículas lipídicas contendo
clorexidina 0,5 % associadas à pasta de hidróxido de cálcio, que não apresentou
diferença estatística em relação ao grupo da clorexidina livre, porém, revelou um
desempenho significativamente superior quando comparado com o grupo da
clorexidina 0,5 % associado à pasta de hidróxido de cálcio. Assim, podemos observar
que a ação da clorexidina é prejudicada pelo elevado pH da pasta de hidróxido de
cálcio e quando protegida na forma de nanopartícula, mantém seu desempenho
antimicrobiano, somando a mistura todos os benefícios fornecidos pela pasta de
hidróxido de cálcio.
94
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Characterization. AAPS PharmSciTech, v. 10, n. 1, march, 2009.
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108
ANEXOS
ANEXO 1 – Validação da metodologia analítica para doseamento da clorexidina nas
suspensões e géis de nanopartículas.
1. Especificidade
É a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto em presença
de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradação e componentes da
matriz. Nos métodos cromatográficos, precauções necessárias para garantir a pureza dos picos
devem ser levadas em consideração (ANVISA, 2003).
Neste estudo, como método de garantir a pureza do pico, amostras de nanopartículas
sem o fármaco foram injetadas no CLAE, assim como a pasta de hidróxido de cálcio pura,
confrontando os cromatogramas expressos pelos pontos da curva analítica, como mostra a
Figura 39.
Podemos observar que não há presença de picos na suspensão sem o fármaco e nem na
pasta de hidróxido de cálcio, o que nos faz verificar que nenhum componente que faz parte
das suas composições está interferindo na formação do pico presente na amostra padrão.
Figura 39: Sobreposição de cromatogramas: linha azul correspondente a nanopartícula lipídica sem a
presença de fármaco; linha preta correspondente ao hidróxido de cálcio e linha vermelha correspondente
amostra padrão de clorexidina.
109
O cromatograma exibe um pico em 3,3 minutos, após análise da amostra de
clorexidina, o que representa que 3,3 minutos é o tempo de retenção da clorexidina e será
utilizado para determinação da presença de clorexidina nas amostras de suspensões e géis.
2. Linearidade
Para a construção da curva analítica, foi pesado o equivalente a 0,01 g de clorexidina,
o qual foi colocado em um balão volumétrico de 10 mL, sendo o volume completado com
acetonitrila (1 mg/mL). A partir desta solução mãe, a curva analítica foi construída nas
concentrações de 10, 15, 20, 25 e 30 µg/mL, utilizando-se fase móvel como solvente.
Após as diluições, as amostras foram filtradas com uma membrana de 0,45 µm
Chromafil Xtra RC-45/25 (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Duren, Alemanha) e
analisadas em CLAE.
O procedimento foi feito em triplicata. As áreas médias, correspondentes a três
determinações para cada concentração de clorexidina, foram plotadas no eixo das ordenadas e
as concentrações (µg/mL), no eixo das abscissas, e a curva então obtida.
Como é possível visualizar no gráfico da Figura 40, a curva padrão da clorexidina
apresentou regressão linear significativa (p<0,05), não havendo desvio significativo de
linearidade (p>0,05). A equação da reta para o método foi: y = 82,38x + 28,962; onde x é a
concentração em μg/mL e y a área, apresentando um coeficiente de correlação de 0,9963.
Os parâmetros de validação determinados apresentaram linearidade, exibindo um
coeficiente de correlação superior aos limites preconizados de 0,99. Isto permite uma
estimativa da qualidade da curva analítica obtida, sendo que quanto mais próximo de 1,0,
menor a dispersão do conjunto de pontos experimentais (ANVISA, 2003a).
Esta curva foi utilizada para realizar o doseamento da clorexidina nas suspensões e
géis contendo o fármaco na forma livre ou nanoestruturada.
Área
110
Concentração (µg/mL)
Figura 40: Curva padrão da clorexidina obtida por CLAE.
3. Precisão e repetibilidade
A precisão do método foi avaliada através do desvio padrão relativo (DPR) obtido pela
determinação da clorexidina na suspensão contendo nanopartículas lipídicas a 0,5 %,
avaliando-se a repetibilidade e a precisão intermediária do método.
A repetibilidade do método foi obtida através de seis repetições, na concentração de
trabalho de 10 µg/mL, no mesmo dia e nas mesmas condições experimentais. Porém, a
precisão intermediária foi avaliada em três dias e por dois analistas diferentes. Precisão é
definida como a avaliação da proximidade dos resultados obtidos, em uma série de medidas,
de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra e é avaliada em três níveis: a
repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade (ANVISA, 2003).
Segundo a ANVISA (2003), a repetibilidade (precisão intra-corrida) é a concordância
entre os resultados dentro de um curto período de tempo com o mesmo analista e mesma
instrumentação. A precisão intermediária (precisão inter-corridas) é a concordância entre os
resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes
e/ou equipamentos diferentes. A reprodutibilidade (precisão inter-laboratorial) é a
concordância entre os resultados obtidos em laboratórios diferentes e não foi realizada neste
estudo.
A precisão de um método analítico pode ser expressa como desvio padrão relativo
(DPR) ou coeficiente de variação (CV %) de uma série de medidas, não se admitindo valores
superiores a 5 % (ANVISA, 2003).
111
O resultado do DPR da repetibilidade foi de 2,8 + 0,3 % e da precisão intermediária de
2,2 + 0,4 %, valores estes inferiores a 5 %, podendo ser considerado um método preciso.
4. Exatidão
Para o teste de exatidão, a solução padrão foi adicionada a amostra de forma a se obter
três concentrações finais diferentes. Para isso, 0,01 g de clorexidina foram colocados em um
balão volumétrico de 10 mL e seu volume foi completado com acetonitrila para obtenção de
uma solução padrão de concentração de 1 mg/mL.
Em três balões volumétricos diferentes, de 10 mL cada, foram colocados 20 µL da
suspensão de nanopartícula lipídica a 0,5% de clorexidina, mais 50 µL da suspensão mãe no
balão 1, 100 µL no balão 2 e 150 µL no balão 3, obtendo-se uma concentração final de 15
µg/mL, 20 µg/mL e 25 µg/mL, respectivamente. A Figura 41 ilustra o procedimento descrito
acima. Todos os balões tiveram seu volume completado com fase móvel e a concentração de
clorexidina analisada em CLAE. O procedimento foi realizado em triplicata.
Suspensão padrão
50 µl
concentração final:
20 µl
Suspensão nanopartícula
lipídica sólida 0,5%
100 µl
20 µl
150 µl
20 µl
bv.10 mL
bv.10 mL
bv.10 mL
15 µg/mL
20 µg/mL
25 µg/mL
Figura 41: Fluxograma do teste de exatidão.
112
A exatidão é expressa pela relação entre a concentração média determinada
experimentalmente e a concentração teórica correspondente. Para a concentração de 15
µg/mL a exatidão foi de 103,5 + 0,6 %; 20 µg/mL de 101,8 + 0,3 % e 25 µg/mL 103,8 + 1,7
%. Valores estes que consideram o método exato.
113
ANEXO 2 – Carta de aprovação pelo comitê de ética para realização do experimento em
ratos.
114
ANEXO 3 – Carta de aprovação do comitê de ética para estudo utilizando dentes
humanos.