BENZO[b]PIRAZOLO[3,4-h]-[1,6] - início

Programa de Pós Graduação Em Química Orgânica
SÍNTESE E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL
DE DERIVADOS DO SISTEMA 1H-PIRAZOLO[3,4b]PIRIDINA E DOS SISTEMAS TETRACICLÍCOS 3HBENZO[b]PIRAZOLO[3,4-h]-[1,6]-NAFTIRIDINAS E 3HPIRIDO[2,3-b]PIRAZOLO[3,4-h]-[1,6]-NAFTIRIDINAS.
Alexandre Reis de Azevedo
Fevereiro de 2006
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Tese de doutorado
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA ORGÂNICA
SÍNTESE E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL
DE DERIVADOS DO SISTEMAS 1H-PIRAZOLO[3,4b]PIRIDINA E DOS SISTEMAS TETRACICLÍCOS 3HBENZO[b]PIRAZOLO[3,4-h]-[1,6]-NAFTIRIDINAS E 3HPIRIDO[2,3-b]PIRAZOLO[3,4-h]-[1,6]-NAFTIRIDINAS.
ALEXANDRE REIS DE AZEVEDO
SOB A ORIENTAÇÃO DAS PROFESSORAS
Dra. ALICE MARIA ROLIM BERNARDINO
Dra. IZABEL CRISTINA PALMER PAIXÃO FRUGULHETTI
Tese submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em
Química Orgânica.
Niterói, Rio de Janeiro
23 de Fevereiro de 2006
2
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Tese de doutorado
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA ORGÂNICA
ALEXANDRE REIS DE AZEVEDO
SÍNTESE E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DE
DERIVADOS DO SISTEMAS 1H-PIRAZOLO[3,4-b]PIRIDINA E DOS
SISTEMAS TETRACICLÍCOS 3H- BENZO[b]PIRAZOLO[3,4-h]-[1,6]NAFTIRIDINAS E 3H-PIRIDO[2,3-b]PIRAZOLO[3,4-h]-[1,6]NAFTIRIDINAS.
BANCA EXAMINADORA
Dra. Alice Maria Rolim Bernardino( IQ – UFF – Orientadora)
Dr. Moacyr Alcoforado Rebello ( IB - UFRJ )
Dr. Sergio Pinheiro ( IQ – UFF )
Dr. Mario Geraldo de Carvalho( IQ – UFRRJ)
Dr. Marcos Vinícius Nora de Souza ( FIOCRUZ)
Dr. Marcos Costa de Souza ( IQ – UFF – Suplente)
Dra. Izabel C.P.Paixão (IB – UFF – Orientadora - Suplente)
3
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Tese de doutorado
AGRADECIMENTOS
À Dra. Alice Maria Rolim Bernardino pela orientação, paciência,
carinho, atenção, compreensão e principalmente pela confiança depositada
em meu trabalho durante esses anos de convívio.
À Dra. Izabel C.P.P. Frugulhetti pela realização dos testes de
atividade antiviral, orientação e atenção durante o decorrer deste trabalho.
Aos Dr. Moacyr Alcoforado Rebello, Dra. Helena Carlos Castro e
Dr.Carlos Rangel pelas contribuições e participações ao longo deste
trabalho.
Ao Prof. Dr. Rodrigo Bagueira pela boa vontade em tentar realizar os
espectros de RMN 13C.
À Dra. Cecília M. B. V. de Souza pela ajuda na forma de fazer as
discussões de RMN.
Aos técnicos da ressonância magnética nuclear (Lívia e Rosana) e
laboratório de infra-vermelho (Vânia) pela realização dos espectros.
Aos professores da Pós-Graduação pela formação conseguida ao
longo desses anos dentro desta Universidade.
A Milene do laboratório de biologia celular e molecular que apesar
das dificuldades, conseguiu com muito esforço realizar os testes de
atividade antiviral.
Aos amigos do laboratório de síntese de heterociclos (LASINTHET),
Luiz, Júlio, Adriana e Maurício, que com certeza é a melhor equipe que um
profissional poderia ter para trabalhar.
Aos amigos de Pós-Graduação, Willian, Sandro e Angélica pelas
conversas, às vezes, desabafo ao longo desses anos de convívio.
Ao Rafael do Laboratório de Bioquímica e Modelagem Molecular
pela dedicação na realização dos testes de atividade antimicrobiana.
4
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À minha família, em especial aos meus pais Manuel e Marilda, que
me deram a oportunidade, através de muito sacrifício, para estar hoje
alcançando meus objetivos. Aos meus irmãos Marcelo e Luciana pelo
carinho sempre presente. Aos meus sobrinhos Ana Luiza e Lucas, pela
alegria nos momentos de convívio.
Dedico um agradecimento muito especial à minha companheira de
todas as horas Luciana (o amor da minha vida) pelo carinho, amor e
compreensão de sempre e principalmente pela possibilidade de realizar um
sonho que era de ser pai.
Ao meu filho Rafael que, sem dúvida alguma, foi a principal
“síntese” realizada em toda minha vida, que a cada dificuldade que
aparecesse, bastava fechar os olhos e seu sorriso encantador aparecia
fazendo com que todo esforço valesse a pena.
Por fim, agradeço à Deus por tudo o que tem acontecido em minha
vida.
5
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RESUMO
As infecções virais vêm ao longo dos anos causando uma série de
transtornos nas diferentes populações. A terapia para o tratamento destas
doenças esta baseada, principalmente, na utilização de medicamentos,
sendo na maioria dos casos obtidos sob a forma de produtos sintéticos. Este
trabalho descreve a síntese de 51 substâncias, derivadas dos sistemas 1Hpirazolo[3,4-b]piridina, 3H-benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina e de um
novo
sistema
3H-pirido[2,3-c]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina.
A
rota
escolhida para obtenção destes derivados, envolve a síntese da substância
chave 5-carboetoxi-4-cloro-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina, que após
reações de substituição nucleofílica, seguida de hidrólise e clorociclização,
forneceram os derivados tetracíclico (14a-m) e (15a-c).
Os derivados 4-(fenilamino)-5-carboetoxi-1H-pirazolo[3,4-b]piridina
(10a-m), 4-(piridilamino)-5-carboetoxi-1H-pirazolo[3,4-b]piridina (11a-e),
ácidos 4-(fenilamino)-1H-pirazolo[3,4-b]piridina-5-carboxílicos (12a-m),
ácidos 4-(piridilamino)-1H-pirazolo[3,4-b]piridina-5-carboxílicos (13a-d),
3H-Benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina
(14a-m)
b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina
foram
(15a-c),
e
3H-pirido[2,3-
avaliados
frente
a
replicação do vírus HSV-1, apresentando resultados de inibição em torno
de 90%, destacando os derivados 11d, 11e e 14j, que apresentaram índices
de seletividade de 100000, 10000 e 8571, respectivamente, que quando
comparados ao Aciclovir, 860, mostram-se muito superiores.
Os derivados 3H-Benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina (14a-m),
foram avaliados frente a enzima transcriptase reversa, que faz parte do
processo replicativo do vírus HIV-1, tendo os derivados 14d e 14h,
apresentado resultados de inibição desta enzima em torno de 41,55 e
43,70%, respectivamente.
6
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Os derivados ácidos 4-(fenilamino)-1H-pirazolo[3,4-b]piridina-5carboxílicos 12a
e 12f, foram avaliados frente a replicação do Vírus
Mayaro, apresentando resultados de inibição em torno de 90%.
Os
derivados
estudados
apresentaram
um
perfil
antiviral
significativo, o que significa uma grande contribuição na área científica
para as pesquisas em relação a estas doenças.
7
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ABSTRACT
Virus disorders come to long of the years causing a series of
upheavals in the different populations. The therapy for the treatment of
these illnesses this basing, mainly, in the medicine use and then are in the
majority of the cases gotten under the form of synthetic products. This
work describes the synthesis of 51 substances, derived from the 1Hpyrazolo[3,4-b]pyridine,
3H-benzo[b]pyrazolo[3,4-h]-1,6-naphthyridine
systems and of new a 3H-pyrido[2,3-c]pyrazolo[3,4-h]-1,6-naphthyridine
system.
The synthetic approach involved the preparation of key intermediate
4-chloro-5-carboethoxy-1-phenyl-1H-pyrazolo[3,4-b]pyridine,
that
after
nucleophilic reactions, followed of hydrolysis and chlorocyclization,
supplied the desired substances. The derivatives 4-(phenylamino)-5carboethoxy-1-phenyl-1H-pyrazolo[3,4-b]pyridine
(10a-m),
4-
(pyridilamino)-5-carboethoxy-1-phenyl-1H-pyrazolo[3,4-b]pyridine
(11a-
e),
4-(phenylamino)-1-phenyl-1H-pyrazolo[3,4-b]pyridine-5-carboxylic
acids (12a-m),
4-(pyridilamino)-1-phenyl-1H-pyrazolo[3,4-b]pyridine-5-
carboxylic acids (13a-d), 3H- benzo[b]pyrazolo[3,4-h]-1,6-naphthyridines
(14a-m) and 3H-pyrido[2,3-c]pyrazolo[3,4-h]-1,6-naphthyridines (15a-c),
had been evaluated front the replication of the HSV-1 virus, presenting
inhibition around 90%, detaching the derivatives 11d, 11e and 14j, that
they had presented resulted, SI of 100000, 10000 and 8571, respectively,
that when compared with the Acyclovir, 860, reveals very superior.
The evaluation of the activity against the enzime RT, that it is of
replication HIV-1 virus of the derivatives 3H-benzo[b]pyrazolo[3,4-h]-1,6naphthyridines (14a-m) indicated significant activity for the derivatives 14d
and 14h, around 41,55 and 43,70%, respectively.
8
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The
4-(phenylamino)-1-phenyl-1H-pyrazolo[3,4-b]pyridine-5-
carboxylic acids derivatives 12a e 12f had been evaluated front of the
Mayaro Virus, presenting inhibition resulted around 90%.
The studied derivatives had presented significant a antiviral activity
what it means a great contribution in the scientific area for the research in
relation to these illnesses.
9
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LISTA DE ABREVIATURAS
ACV – Aciclovir
AIDS – Síndrome da imunodeficiência adquirida
AMV – Vírus leucemia aviária
CC – Citotoxicidade
CDCl3 – Clorofórmio Deuterado
CMNT – Concentração máxima não-tóxica
DMEN – Meio de Dulbecco modificado por Eagle
DMF – Dimetilformamida
DMSO – Dimetilsulfóxido
DNA – Ácido desoxiribonucléico
EC – Efeito citopático
EDTA – ácido etilenodiaminatetracético
EM – Espectro de massas
FT-IV – Infra vermelho por transformada de Fourier
gP - Glicoproteínas
HETCOR – Correlação heteronuclear
HIV – Vírus da imunodeficiência
HSV – Herpes Simples
LDA – Lítio diisopropilamida
NBS – N-Bromosuccinamida
ND – Não-determinado
NNRTIs – Não-Nucleosídeos inibidores da transcriptase reversa
NRTIs – Nucleosídeos inibidores da transcriptase reversa
PBS – Solução salina de fosfato
PF – Ponto de fusão
Pis – Inibidores da protease
POCl3 – Oxicloreto de fósforo
RMN – Ressonância magnética nuclear
10
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RNA – Ácido Ribonucléico
RT – Transcriptase Reversa
SI – Índice de seletividade
TFA – ácido trifluoro-acético
THF – Tetraidrofurano
TMS – trimetilsilano
VERO – Rim de macaco verde africano
VP – Proteína Viral
VSV – Vírus da estomatite vesicular
11
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ÍNDICE
AGRADECIMENTOS.................................................................4
RESUMO.....................................................................................6
ABSTRACT .................................................................................8
LISTA DE ABREVIATURAS ...................................................10
1 – INTRODUÇÃO....................................................................13
2- OBJETIVOS..........................................................................45
3 - ESTRATÉGIA DE SÍNTESE..............................................49
4- RESULTADOS E DISCUSSÃO ...........................................62
5 – CONCLUSÕES..................................................................127
6- EXPERIMENTAL ..............................................................133
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................181
12
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1 – INTRODUÇÃO
13
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1.1 - SISTEMA NAFTIRIDINA
Os compostos heterocíclicos possuem grande importância devido
ao amplo espectro de atividades biológicas atribuídas a estes sistemas.1 Nas
últimas duas décadas, é permanentemente crescente o interesse nas
naftiridinas, e por isso, este sistema é bastante citado tanto quanto a sua
síntese quanto a sua atividade biológica.1,2,3
O sistema nafitiridina é formado por 4 isômeros I-IV, que
apresentam um anel π-deficiente o que o torna muito suscetível a sofrer
reações de substituição nucleofílica aromática. Apresentam menor caráter
básico porém menor basicidade do que os N-hetero-não aromáticos, isto se
deve ao par de elétrons está situado em orbital hibridizado sp2.
Estrutura 1: Isômeros do sistema naftiridina
N
N
N
I
N
II
1,6-Naftiridina
1,5-Naftiridina
N
N
III
1,7-Naftiridina
N
N
IV
1,8-Naftiridina
14
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Dentre os 4 isômeros o sistema [1,8]naftiridina é o mais citado na
literatura e um dos principais derivados deste sistema relatados é o ácido
nalidíxico V, por ser um agente antibacteriano que é extensivamente usado
no tratamento de infecções urinárias crônicas e ainda por ter sido de grande
importância para o desenvolvimento da classe de antimicrobianos
quinolônicos.4
Estrutura 2: Ácido nalidíxico
O
CO2H
H3C
N
N
V
C2H5
1.1.1 - Sistema [1,6]-naftiridinas - Importância
O interesse pelo sistema [1,6]-naftiridina VI vêm crescendo nos
últimos anos, o que pode ser comprovado com o número de trabalhos
publicados sobre este sistema, principalmente sobre sua química e
aplicações.5,6,7,8.
Estrutura 3: Sistema 1,6-naftiridina
5
4
4a
N6
3
2
7
N
1
8a
8
VI
15
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Derivados [1,6]-Nafitiridina substituídos, do tipo VII, vêm sendo
relatados
como
uma
nova
classe
de
compostos
inibidores
do
citomegalovirus9.
Estrutura 4: Atividade citomegalovirus
N
O
N
N
H
VII
R
R = OCH3, OCH(CH3)2
Derivados [1,6]-naftiridínicos do tipo VIII e IX que apresentaram
uma baixa citotoxidade e 95% de inibição em células infectadas pelo HIV1.10
Estrutura 5: Atividade anti-HIV-1
O
S
O
N
N
N
N
O
VIII
OH
N
O
OH
IX
16
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Derivados [1,6]-naftiridínicos do tipo X foram relatados com
excelente resultados quanto a atividade tumoral11 e são análogos de
derivados acridina XI, que recentemente foram apresentados como sendo
compostos promissores como antineoplásico devido a alta citotoxicidade
em células de adenocarcinoma e carcinoma de ovário.12
Estrutura 6: Atividade antineoplásica
NH(CH2)nR
NH(CH2)2N(CH3)2
X
X
N
N
N
CH3
CONH(CH2)2N(CH3)2
O
X
NH(CH2)nR
XI
X=H, OH, OCH3, NH2
n=2 ou 3
R1=R2=N(CH3)2, N(Et)2, NH(CH2)2OH, NH2
Derivados do tipo XII que foram apresentados com atividade
anticonvulsivante, no tratamento da eplepsia.13 .
Estrutura 7: Tratamentop da eplepsia
H3C
CH3
N
CF3
N
H
NHCO
OCH3
XII
17
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Derivados do tipo XIII que foram sintetizados como análogos da
cloroquina
XIV
com resultados
promissores
quanto
a
atividade
antimalarial.14
Estrutura 8: Atividade antimalarial
CH3
CH3
R
H
N
N
N
C2H5
R
N
C2H5
OH
Cl
Cl
N
N
XIV
XIII
Epifanio et. al. relataram o isolamento de derivados [1,6]naftiridínicos do tipo XV e XVI, a partir de produtos naturais (Sponge
Aaptos sp.). Estes derivados apresentaram atividade anti HSV, de 78 e 80%
respectivamente. 15
Estrutura 9: Atividade anti-HSV
OCH3
OCH3
O
H3CO
N
N
N
XV
N
XVI CH3
18
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1.2 - SISTEMA PIRAZOLO-PIRIDINA
O sistema pirazolo-piridina compreende cinco isômeros XVIIXXI e são relatados na literatura, devido à sua atividade biológica e
correlação estrutural com heterociclos importantes em processos vitais.
Estrutura 10: Isômeros do sistema pirazolo-piridina
N
N
N
N
N
N
H
N
N
N
H
[3,4-b]
H
[3,4-e]
XIX
XVIII
XVII
[4,3-c]
N
N
N
H
N
H
[4,3-b]
XX
N
[1,5-a]
XIX
1.2.1 – Sistema 1H-pirazolo[3,4-b]piridina
O primeiro relato do sistema 1H-pirazolo[3,4-b]piridina
XVII data de 1906, este possui relação estrutural com os indóis, azaindóis
e as bases purínicas do DNA e RNA, cujas importâncias biológicas são
muitos significativas. 16,1718,19,20.
Estrutura 11: Sistema 1H-pirazolo[3,4-b]piridina
3
4
3a
5
2 N
1N
H
6
7a
N
7
[3,4-b]
XVII
19
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Vários são os artigos da literatura que trata da química e das
aplicações
biológicas
do
sistema
1H-pirazolo[3,4-b]piridina,
com
atividades diversas como substâncias do tipo XXII que foram sintetizadas
como análogos do Alopurinol XXIII utilizado no tratamento clínico da
“gota”, como inibidor da Xantina Oxidase21 e na quimioterapia de alguns
tumores20,22, enquanto que compostos do tipo XXIV, apresentam atividade
ansiolítica e anticonvulsivante23.
Estrutura 12: Atividades antineoplásica, ansiolítica e
anticonvulsivante
O
O
R1
H
N
N
N
N
N
R2
N
H
N
H
H
H
XXII
XXIII
N
H
N
N
N
N
H
XXIV
20
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Derivados do tipo XXV e XXVI que foram identificados como
possíveis atividades antitrombóticas24 e substâncias do tipo XXV, que têm
se mostrado muito eficaz como um possível novo vasodilatador25.
Estrutura 13: Atividade antitrombolítica e vasodilatadora
O
O
N(R)2
N
O
S
OCH3
S
OCH3
N
N
N
N
N
XXV
N
XXVI
NO2
R1=R2=H, Et, -CH2(CH2)3CH2-
N
N
N
H
O
Cl
XXVII
21
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E mais recentemente, temos derivados do tipo XXVIII que
apresentam-se como potencial agente para tratamento da disfunção erétil.26
Estrutura 14: Tratamento da disfunção erétil
OCH3
Cl
O
N
N
N
N
N
H
N
XXVIII
Nosso grupo de pesquisa tem relatado a síntese e atividade de
derivados do sistema 1H-pirazolo[3,4-b]piridina, como derivados do tipo
XXIX, que foram capazes de inibir a atividade polimerásica das enzimas
trascriptase reversa (RT) do vírus HIV-tipo 1 e estas mesmas não foram
capazes de inibir a atividade polimarásica das enzimas DNA-polimerase
humana α e β27.
Estrutura 15: Atividade anti-HIV
R
H
N
CO2H
N
N
N
R1= H, p-NO2
XXIX
22
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Outros exemplos são os derivados do tipo XXX, que apresentam
atividade frente os vírus HSV e Vaccínia, bem como os derivados XXXI
que apresentaram atividade antileishmania. 28, 29
Estrutura 16: Atividades anti-HSV e Vaccínia
R
R3
H
N
CO2H
R4
H
R1
N
CO2Et
R2
N
N
N
R1= CH3, fenil
R2 = H, o-OCH3
p-OCH3,
XXX
N
N
R1
N
R1= CH3, Fenil
R2= fenil, CH3, H
R3 e R4 = H, o-OCH3
p-OCH3.
XXXI
23
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1.3 - SISTEMAS TETRACÍCLICOS
A literatura vêm relatando a síntese de diversos compostos tetracíclicos
com atividades diversas. Como derivados do tipo XXXII, XXXIII e
XXXIV que apresentam atividade antitumoral. 30, 31 e 32
Estrutura 17: sistemas tetracíclicos com atividade antitumoral
N
H3C
N
CH3
N
XXXII
N
R'
N
N
N
N(CH3)2
N
O
N
H
S
R
H
O
XXXIV
XXXIII
A literatura relata ainda derivados tetracíclicos do tipo XXXV, que
apresentam atividade antitripanossomicida. 33
Estrutura 18: Sistemas tetracíclicos com atividade
antitripanossomicida
Br
N
N
XXXV
24
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Derivados fenotiazínicos do tipo XXXVI e XXXVII são relatados
com resultados promissores, frente ao vírus HSV-1, quando utilizados em
sinergismo com o aciclovir.34
Estrutura 19: Derivados fenotiazínicos com atividade anti-HSV -1
H
N
N
S
S
O
XXXVII
XXXVI
Como parte dos trabalhos de síntese a partir do sistema 1Hpirazolo[3,4-b]piridina nosso grupo de pesquisa relatou recentemente a
síntese do sistema inédito Dipirazolo[4”,3”:5,6][4’,3’-e]Pirido[3,2-c]Piridazina
XXXVIII e do sistema 3H-benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina XXXIX
35,28
.
Estrutura 20: Sistemas tetracíclicos com atividade anti-HSV-1
R1
N
N
N
N
N
R2
N
N
N
N
XXXVIII
Cl XXXIXI
R1= H, CH3, fenil
R2 = H, p-metil, p-metoxi, p-nitro, p-cloro
25
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1.4 - ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL
1.4.1 - TIPOS DE VIRUS
Os vírus são definidos como agentes infectantes que só
possuem um dos ácido nucleícos: DNA ou RNA. Eles são capazes de
realizar sua própria reprodução em células hospedeiras, utilizando-se da
maioria dos seus mecanismos de síntese de macromoléculas. Normalmente,
destroem as células ao deixá-las ou então modificam o seu material
genético, causando um grande prejuízo nas funções vitais dos seres
humanos36,37. Atualmente, existe um número considerável de vírus que
provocam doenças específicas no ser humano e que causam desde a morte
até
enormes
prejuízos
econômicos
e
sociais
nos
países
mais
industrializados, por deixarem o paciente sem condições para o trabalho.
1.4.2 - HERPES VÍRUS
A família dos herpesvírus contém vários dos mais importantes
patógenos humanos. Do ponto de vista clínico, os herpes vírus exibem um
amplo espectro de doenças. A propriedade mais notável dos herpes vírus
consiste na capacidade de estabelecer infecções persistentes, pelo resto da
vida, em seus hospedeiros sofrendo reativação periódica. Sua frequente
reativação em pacientes imunossuprimidos está associada as graves
complicações em termos de saúde. Os herpes vírus possuem grande número
de genes, alguns dos quais se mostraram suscetíveis a quimioterapia
antiviral.
1.4.2.1
- ESTRUTURA E BIOLOGIA MOLECULAR DO
HSV-1
O vírus herpes simples humano é membro da família Herpesviridae,
subfamília Alphaherpesvirinae e gênero Simplexvirus. Os alfa-herpesvírus
26
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caracterizam-se por apresentarem um amplo espectro de hospedeiros, ciclo
reprodutivo curto, rápida propagação em culturas de células, eficiente lise
das células infectadas e capacidade de estabelecer infecções latentes
primariamente. Os vírus herpes simples humano são divididos em dois
sorotipos: vírus herpes simplex 1 (HSV-1) e vírus herpes simplex 2 (HSV2). Estes vírus possuem um cerne que contém o genoma constituído por
DNA dupla fita, linear, o qual se circulariza imediatamente no núcleo de
células infectadas na ausência de síntese protéica. O genoma dos HSV
codifica cerca de 70 proteínas, muitas das quais estão envolvidas na sua
expressão, replicação e empacotamento. Possui poliaminas (espermidinas e
esperminas), que neutralizam o DNA viral e lipídios (envelope) adquiridos
da membrana nuclear da célula hospedeira38. O DNA viral contém
aproximadamente 150 kilobases , sendo constituído por 2 segmentos, L
(longo)e S(curto), ligados covalentemente
e cada um é ladeado por
sequências invertidas e repetidas. Apesar da grande semelhança entre os
DNAs dos HSV-1 e HSV-2, equiparando-se em pares de bases, eles não
são idênticos. A porcentagem de homologia entre os genomas dos tipos 1 e
2 podem variar de acordo com o limite de determinação da técnica
empregada para tal. A análise do DNA viral, proveniente de diferentes
espécimes clínicos, utilizando enzimas de restrição tem demonstrado a
distinção entre HSV-1 e HSV-243. O empacotamento do DNA viral ocorre
no interior de uma estrutura protéica, o capsídeo, que confere a simetria
icosaédrica ao vírus. O capsídeo viral é circundado por um material
amorfo, firmemente aderente, denominado tegumento. O envelope viral
envolve, frouxamente, o capsídeo e o tegumento. O virion (partícula viral
completa)
apresenta
forma
esférica
ou
esfericoidal
e
mede
aproximadamente 150 nm de diâmetro39,40.
As glicoproteínas virais, projetadas em espículas no envelope
lipídico, medeiam a ligação do vírus à célula e induzem a resposta do
27
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Tese de doutorado
hospedeiro ao vírus. Oito glicoproteínas dos HSV têm sido designadas por
gB, gC, gD, gE, gG, gH, gL e gJ; gF tem sido demonstrada como uma
glicoproteína adicional do HSV-244.
As proteínas do capsídeo dos HSV, também induzem a produção de
anticorpos, detectadas pelas técnicas de fixação de complemento e
imunofluorescência. Cinco proteínas do capsídeo têm sido designadas por
VP5, VP19, VP23, VP24 e uma pequena proteína com peso molecular de
12 KDa. As proteínas associadas ao tegumento mantém estreita ligação
com o capsídeo viral e são aleatoriamente dispostas. Entre estas proteínas,
destacam-se a alfa-TIF (“alpha trans inductor factor) e a VHS (“virus host
shut-off) relacionadas à interrupção da síntese protéica celular do
hospedeiro e a VP1 (“virion protein 1”), relacionada ao complexo ternimal
do genoma viral41. Figura 1.
FIGURA 1: ESTRUTURA MORFOLOGICA DO HSV-1
28
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Tese de doutorado
1.4.2.2
- CICLO REPLICATIVO DOS HSV
As glicoproteínas
do envelope (gB,gD e gH) responsáveis pela
adsorção da partícula viral à célula hospedeira, induzem a fusão do
envelope viral com a membrana citoplasmática e o vírus inicia então, a
infecção na célula. O nucleocapsídeo associado à proteínas do tegumento
penetra no citoplasma e é conduzido ao poro nuclear através do
citoesqueleto. Após a translocação para o núcleo o DNA viral é liberado,
onde
imediatamente
circulariza-se,
dando
início
ao
processo
de
transcrição42.
A síntese de proteínas celulares é bloqueada por ação da proteína
VP1, associada ao complexo ligado à sequência terminal do DNA viral.
Proteínas virais da partícula e a RNA polimerase II celular transcrevem
regiões não contínuas do genoma viral (genes alfa) e cinco RNA
mensageiros são transcritos. Os genes alfa são responsáveis pelo início da
replicação e os 5 alfa RNA mensageiros são transportados para o
citoplasma e traduzidos em proteínas41. As proteínas iniciais alfa são
transportadas para o núcleo e permitem uma nova fase da transcrição, a
expressão do conjunto “ïnicial retardado” de genes denominados beta, que
são traduzidos em proteínas beta. Os genes beta são expressos na ausência
de proteínas alfa e sua ativação sinaliza o início da síntese do DNA viral. O
grupo de proteínas beta tem como principais representantes a DNA
polimerase e a timidina cinase, enzimas que participam da replicação do
DNA viral38. A estratégia de replicação viral utiliza um mecanismo de
“rolamento” ou “círculo rolante” que resultará em intermediários
replicativos, incluindo formas concataméricas circulares e formas circulares
lineares de DNA. As proteínas gama, compreendem as proteínas
estruturais, e são o último grupo de proteínas sintetizadas e formarão o
nucleocapsídeo viral.
29
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Tese de doutorado
O envelopamento da partícula viral ocorre, não só na lamela
interna da membrana nuclear, como também no citoplasma. A liberação
da partícula viral madura ocorre por “fagocitose reversa”ou por liberação
através dos poros das membranas do aparelho de Golgi43.
O ciclo replicativo do HSV tem a duração de aproximadamente 18
horas, produzindo partículas infecciosas e defectivas. Em culturas de
células, levam à formação de células aumentadas, arredondadas e
refringentes. O aparecimento de sincícios, mais provável em cultura
infectada com HSV-2, depende ainda da cepa viral, tipo celular e
condições de cultivo. Muitos tipos celulares em cultura suportam a
replicação dos HSV, sofrem extensos efeitos citopáticos e desenvolvem
corpúsculos de inclusão intranucleares, no entanto a resposta das células
varia com a amostra de vírus empregada. O metabolismo celular é
rapidamente bloqueado, a medida que começa a replicação viral e
finalmente a célula termina com a lise. Figura 2.
FIGURA 2: CICLO REPLICATIVO DO HSV-1
30
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1.4.3 - O VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA (HIV).
A síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), foi
identificada pela primeira vez em 1980, nos EUA. É uma doença fatal de
cura ainda não conhecida, que tem como agente etiológico o vírus da
imunodeficiência humana (HIV), isolado pela primeira vez em 1983 por
Montazier e Robert Gallo. O HIV pertence ao gênero Lentivírus da família
Retroviridae e vem sendo um dos principais alvos de estudos em diversas
partes do mundo devido a sua emergência como um dos mais importantes
agentes infecciosos deste século, sendo responsável por considerável
mortalidade e morbidade na população humana.44
1.4.3.1 - MORFOLOGIA E ESTRUTURA GENÔMICA DO HIV-1.
O
HIV-1
se
apresenta
sob
a
forma
esférica,
medindo
aproximadamente 110 nm de diâmetro. Estruturalmente, exibe uma região
mais densa, que corresponde ao nucleocapsídeo (“core vital”) envolvendo o
genoma, que é formado por duas fitas simples de RNA, mais enzimas
funcionais responsáveis pela retrotranscrição e inserção do provírus.45
Envolvendo externamente a região central, encontra-se um envoltório de
natureza lipoproteíca bilaminar, associado as glicoproteínas (gp 120 e gp
41) do envelope. Internamente, as proteínas que integram a matriz ( p17,
Kd 17) circundam o nucleocapsídeo, no qual se encontram duas fitas de
RNA e as enzimas trancriptase reversa, protease e a integrase.46 figura 3.
31
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Tese de doutorado
FIGURA 3: ESTRUTURA MORFOLOGICA DO HIV-1
1.4.3.2
- CICLO REPLICATIVO DO HIV-1.
O ciclo biológico do HIV-1 tem início com o acoplamento de
diferentes sítios da glicoproteína da partícula viral (gp 120) com os
receptores expressos na membrana da célula-alvo. Estes receptores são a
molécula de CD4 e os receptores de α e β-quimiocinas, CXCR4 e CCR5,
respectivamente.47
A proteína da superfície viral, gp 120, interage com a molécula CD4
e a ligação entre ambas induz mudanças conformacionais na estrutura do
envelope viral, e possibilita, deste modo a sua ligação com os receptores de
quimiocinas (CCR5 e CXCR4), formando um complexo ternário. Este
complexo induz a uma nova alteração na conformação das proteínas do
envelope viral, permitindo a participação da gp41, que se insere na
membrana plasmática através de um de seus sítios hidrofóbicos.48 Essas
32
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reações resultam na fusão do envelope viral com a membrana plasmática e
a introdução do nucleocapsídeo, contendo o genoma e enzimas virais, no
citoplasma da célula. Em seguida, a enzima transcriptase reversa transcreve
o RNA viral em uma fita dupla de DNA. A dupla fita de DNA viral,
juntamente com a enzima viral integrase, é então, transportada para o
núcleo da célula e, integrada ao genoma da célula hospedeira por ação
desta enzima, recebendo o nome de provírus.46 Durante processos de
ativação celular é desencadeada a produção de RNA mensageiroviral e,
consequentemente, a produção e a liberação de novos vírions pela célula
infectada. A face externa do envelope viral contém, além das glicoproteínas
gp120/41, outras proteínas oriundas da prórpia membrana das células
infectadas, como moléculas de adesão e de antígenos, que são adquiridas
durante o processo de brotamento viral.49
O ciclo completo de replicação viral é muito curto, com duração
aproximada de dois dias, sendo que cada partícula viral apresenta uma vida
média de seis dias e além disso, estima-se também que mais e 109
partículas virais são produzidas a cada dia50. Essa alta taxa de replicação
favorece o surgimento de um vasto repertório de variantes virais, pois os
erros cometidos pela enzima trascriptase reversa durante a transcrição do
RNA viral para DNA promovem mutações, que resultam no aparecimento
de diferentes fenótipos virais. Figura 4.
33
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FIGURA 4: CICLO REPLICATIVO DO HIV-1
1- Partícula Viral Completa (VIRION)
2- Adsorção
3- Penetração e Replicação
4- Interação do DNA Viral e
Transcrição
5- Automontagem e
TRANSCRIÇÃO
34
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1.4.4 - MORFOLOGIA E ESTRUTURA GENÔMICA DO VÍRUS
MAYARO.
O Vírus Mayaro é um arbovirus que pertence a família Togaviridae,
e ao gênero Alphavirus perpetuado na natureza pela habilidade em infectar
e replicar em células de vertebrados e invertebrados. Desde o seu primeiro
isolamento, em 1954 em Trinidad e Tobago, este vírus tem sido isolado no
Brasil, Bolívia e outros países, especialmente na fronteiras de colonização
na região Amazônica. As principais manifestações clinicas causadas pela
infecção pelo vírus Mayaro são: Febre acompanhada por dor de cabeça,
arrepio, náusea, fotofobia e mialgia.51,52.
1.4.4.1
- ESTRUTURA E BIOLOGIA MOLECULAR DO VÍRUS
MAYARO84
Os alfavírus são partículas de aproximadamente 70nm de
diâmetro, constituído de um nucleocapsídeo icosaédrico, rodeado por um
envelope lipídico. O nucleocapsídeo contém o RNA geômico de 42 S,
fita simples e polaridade positiva, de aproximadamente 11,7 kb, estando
associado a numerosas cópias de uma espécie de proteías. O envelope
consiste de uma bicamada lipídica na qual estão incrustadas múltiplas
cópias de duas glicoproteínas codificadas pelo vírus. A bicamada lipídica
é composta de lipídeos derivados da membrana plasmática da célula
hospedeira e sua composição é estreitamente aproximada à encontrada
nesta membrana.
35
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FIGURA 5: ESTRUTURA MORFOLOGICA DO VÍRUS MAYARO.
1.4.4.2 - CICLO REPLICATIVO DO HIV-1.85,86
A replicação se inicia com o reconhecimento e a ligação dos
alfavírus a receptores específicos da membrana plasmática através das
glicoproteínas da superfície da partícula. Após a sua aderência à membrana
da célula hospedeira os alfavírus são endocitados, permanecendo poucos
minutos dentro de vesículas endocíticas. Essa vesículas se fundem aos
endossomas ocorrendo em seguida a liberaçãodo nucleocapsídeo no
citoplasma, onde se desfaz liberando assim o RNA viral.
As proteínas estruturais são traduzidas em polissomas ligados à
membrana do retículo endoplasmático de tal forma que a proteína C
permanece no citoplasma enquanto as proteínas do envelope ficam
segregadas no interior do lúmen do retículo endoplasmático. Uma vez no
36
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interior do retículo são adicionadas cadeias de carboidratos às proteínas do
envelope, sendo as mesmas modificadas enquanto atravessam o complexo
de Golgi. As glicoproteínas do envelope viral chegam à membrana da
célula hospedeira transportadas por vesículas que se fundem á superfície
celular. O nucleocapsídeo adere à face citoplasmática da membrana e,
assumindo uma posição central, começa a brotar enquanto é envolvido pelo
envelope; quando inteiramente recoberta a partícula se solta da célula por
brotamento.
FIGURA 5.1: CICLO REPLICATIVO DO VÍRUS MAYARO.
37
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1.4.5 - FÁRMACOS UTILIZADOS NO TRATAMENTO DO HSV-1 E
HIV-1.
A maior dificuldade no desenvolvimento de fármacos antivirais tem
sido a problemática em se distinguir o mecanismo replicativo viral
daqueles do seu hospedeiro. Nas últimas décadas, esforços têm sido
dispendidos para a caracterização de sítios específicos da replicação viral,
possibilitando o desenvolvimento de fármacos direcionados a estes sítios.
Numerosos compostos químicos foram testados e avaliados quanto a sua
atividade antiviral, tendo vários deles sido aprovados para a profilaxia e
tratamento de quadros clínicos diversos relacionados às infecções virais,
para as quais não existem ainda vacinas disponíveis 53
O agente antiviral ideal deve interromper seletivamente alguma etapa
específica e essencial do ciclo de replicação, sem afetar de forma
significativa o metabolismo da célula hospedeira. Por esse motivo, torna-se
fundamental o estudo e a caracterização do vírus em questão, no que diz
respeito ao tipo de estrutura e genoma, sinais regulatórios, definição de
eventos bioquímicos e alterações funcionais da célula infectada 54
A dependência da maquinária da célula hospedeira para a replicação
viral dificulta a identificação de inibidores que eliminem o agente
patogênico sem causar efeitos colaterais. De um modo geral, os alvos da
terapia antiviral incluem entre outros aspectos, interferência na etapa de
adsorção, inibição dos processos de replicação, transcrição, tradução,
maturação e automontagem da partícula viral. Todas as etapas envolvem
um processo ativo e não possuem efeito no processo de latência viral55
Os vírus, por serem geneticamente simples, não possuem uma grande
variedade de mecanismos para o desenvolvimento de resistência a agentes
terapêuticos. Por outro lado, podem sofrer mutações muito rapidamente e
em conseqüência desenvolver resistência a um determinado fármaco.
38
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Tese de doutorado
Tratamento da herpes. 56,57,58
Atualmente os principais medicamento utilizado para tratamento do
vírus herpes estão divididos em 3 grupos. O primeiro é conhecido como
análogos nucleosídeos e são formados principalmente pelo aciclovir(ACV),
ganciclovir (GCV), penciclovir (PCV), brivudin (BVDU). O segundo
grupo conhecido como análogos nucleotídeos e apresenta como principal
componente o cidofovir (CDV) e o terceiro grupo conhecido como
análogos pirofosfatos apresenta como principal componente o foscarnet
(PFA).
Figura: 6 – Fármacos utilizados no tratamento do Vírus Herpes
O
O
O
N
N
H2N
N
N
N
HN
HN
H2N
HN
N
N
H 2N
HO
HO
N
N
HO
O
O
OH
OH
Aciclovir
Ganciclovir
Penciclovir
N
N
O
O
Br
H 2N
N
N
N
HN
O
HN
H3C
H 2N
N
O
H2N
N
N
HO
O
H2N
O
O
H3C
O
O
CH3
OH
O
H3C
Valaciclovir
Brivudin
Famciclovir
O
O
NH 2
I
CH3
HN
HN
H2N
N
N
H 2N
N
O
N
HO
O
HO
HO
O
O
O
HO
HO
OH
OH
Idoxuridina
Trifluridina
Cidofovir
39
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Tratamento da AIDS: 56,57, 58
Vários agentes Anti-HIV-1 foram desenvolvidos para atuar em
diferentes estágios o ciclo replicativo viral. Os inibidores da transcriptase
reversa análogos de nucleosídeos (NRTIs), agem como bloqueadores e
como substrato para a enzima transcriptase reversa do HIV-1, impedindo
a formação do DNA proviral. A segunda classe são os Nucleotídeos
inibidores da transcriptase reversa , a terceira inibidores da transcriptase
reversa análogos não nucleosídeos (NNRTIs). A quarta classe
compreende os inibidores da protease (PIs), que atuam inibindo a enzima
protease do HIV-1 e a quinta classe é a dos inibidores da peneração viral.
Figura: 7 - Inibidores da transcriptase reversa análogos nucleosídeos
O
O
CH3
HN
N
HN
O
HO
N
HO
O
HO
O
CH3
HN
HN
N
N
O
O
O
O
N
HO
N
O
O
N3
N3
Didanosina(ddI)
Zidovudina (AZT)
Stavudina(d4T)
Zalcitabina(ddC)
NH2
NH2
NH
HN
O
HO
N
H2N
HO
S
N
N
N
O
O
Lamivudina (3TC)
F
N
HN
O
HO
N
S
O
Abacavir (ABC)
Entricitabina
40
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Tese de doutorado
Figura: 8 - Inibidores da transcriptase reversa análogos nucleotídeos
NH2
N
N
N
N
O
(H3C)2HCOCOH2CO
O
P
O
(H3C)2HCOCOH2CO
O
CH3
Tenofovir disoproxil
Figura: 9 - Inibidores da transcriptase reversa análogos nãonucleosídeos
CH3
H
O
N
F3C
Cl
O
N
N
N
N
H
N
Nevirapina (NVP)
O
H
N
Efavirenz (EFV)
N
N
H3CO2S
N
O
Delavirdina (DLV)
41
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Tese de doutorado
Figura: 10 - Inibidores da protease (Pis)
H
N
N
H3C
O
O
NH
O
S
N
NH2
N
N
OH
O
O
CH3
OH
O
H
N
S
N
O
NH
H3C
OH
H
N
O
O
Riotonavir (RTV)
N
N
N
CH3
CH3
CH3
Saquinavir (SQV)
O
N
NH
H3C
NH
H3C
CH3
HO
CH3
CH3
Indinavir (IDV)
CH 3
H3C
CH3
CH3
S
CH 3
O
NH 2
NH
O
O
N
H
O
O
OH
. CH3SO2
HO
S
O
N
N
H
OH
Nelfinavir
N
O
OH
CH 3
Amprenavir
CH 3
N
CH3
H
O
OH
O
N
N
O
NH
OH
N
O
O
H3C
Lopinavir
O
H
N
N
H
CH3
OH
CH3
O
N
H
O
N
O
H
O
Atanavir
42
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Tese de doutorado
Figura:11 - Inibidores de fusão viral
ENFURVITIDE
43
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Tese de doutorado
A ciência vem tentando ao longo dos tempos soluções para diversas
necessidades do homem, uma dessas necessidades esta situada na área
médica. Diversas doenças vêm ao longo dos tempos causando inúmeros
prejuízos nas diferentes populações e civilizações o que levou ao
desenvolvimento de áreas da ciência que tem como objetivo combater estas
enfermidades. As doenças virais, como por exemplo a AIDS e mais
recentemente a gripe aviária, apresentam como principal característica a
diminuição da qualidade de vida do indivíduo e até mesmo a morte, pois os
vírus apresentam uma a capacidade de resistência muito grande aos
fármacos utilizados, devido o seu mecanismo de mutação. O tratamento
destas doenças com fármacos é o principal método utilizado na medicina
para o combate destas e de outras doenças. A Química sintética vêm como
uma alternativa sem “limites”, pois permite ao profissional desta área
planejar e obter, “qualquer” estrutura química desejada.
44
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Tese de doutorado
2- OBJETIVOS
45
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Tese de doutorado
Nosso grupo de pesquisas tem ao longo dos anos relatado a síntese e
atividade biológica de vários derivados do sistema 1H-pirazolo[3,4b]piridina27,
59
e de sistemas tetracíclicos60,
61
. Este trabalho de tese tem
como primeiro objetivo, sintetizar novos derivados deste sistema 1Hpirazolo[3,4-b]piridina 10a-m; 11a-e; 12a-m e 13a-d e avaliar a sua
atividade frente ao vírus HSV-1.
R1
R1
H
H
N
N
CO2Et
CO2Et
N
10a - R1= H
10b - R1= m-OCH3
10c - R1= p-OCH3
10d - R1= m-CH3
10e - R1= p-CH3
10f - R1= m-Cl
10g - R1= p-Cl
10h - R1= m-NO2
10i - R1 = p-NO2
10j - R1 = m-F
10k - R1 = p-F
10l - R1 = m-Br
10m - R1 = p-Br
N
N
N
R1
N
N
N
11a - R1= H
11b - R1= 3-CH3
11c - R1= 4-CH3
11d - R1= 5-CH3
11e - R1= 6-CH3
R1
H
H
N
N
CO2H
CO2H
N
N
N
N
12a - R1= H
12b - R1= m-OCH3
12c - R1= p-OCH3
12d - R1= m-CH3
12e - R1= p-CH3
12f - R1= m-Cl
12g - R1= p-Cl
12h - R1= m-NO2
12i - R1 = p-NO2
12j - R1 = m-F
12k - R1 = p-F
12l - R1 = m-Br
12m - R1 = p-Br
N
N
N
13a - R1= 3-CH3
13b - R1= 4-CH3
13c - R1= 5-CH3
13d - R1= 6-CH3
46
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Tese de doutorado
Outro objetivo deste trabalho é a síntese de derivados do sistema
tetracíclico 3H-Benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina (14a-m).
Este
sistema foi sintetizado primeiramente por nosso grupo de pesquisa e alguns
derivados apresentaram resultados promissores, frente o vírus HSV-1. 60, 61
N
N
N
R1
N
Cl
14a - R1= H
14b - R1= m-OCH3
14c - R1= p-OCH3
14d - R1= m-CH3
14e - R1= p-CH3
14f - R1= m-Cl
14g - R1= p-Cl
14h - R1= m-NO2
14i - R1 = p-NO2
14j - R1 = m-F
14k - R1 = p-F
14l - R1 = m-Br
14m - R1 = p-Br
Estes derivados serão testados quanto sua atividade antiviral, frente
aos vírus HSV-1 e HIV-1.
47
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Tese de doutorado
Dando continuidade a síntese de derivados tetracíclicos,35,
60, 61
este
trabalho tem ainda como objetivo obter um sistema inédito 3H-pirido[2,3b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridínas (15a-c) e avaliar sua atividade frente o
vírus HSV-1.
N
N
N
N
R1
N
Cl
15a - R1= 4-CH3
15b - R1= 5-CH3
15c - R1= 6-CH3
A partir de um trabalho de cooperação com o laboratório de
Microbiologia da UFRJ, os derivados ácidos 12a-m serão avaliados frente
ao vírus Mayaro, causador da febre Amazônica.
48
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3 - ESTRATÉGIA DE SÍNTESE
49
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Tese de doutorado
3- ESTRATÉGIA DE SÍNTESE
A estratégia de síntese dos derivados dos sistemas tetracíclicos 3HBenzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridinas 14 e 3H-Pirido[2,3-b]pirazolo[3,4h]-1,6-naftiridinas 15 remete a reações da literatura61, 62, 63, 64, 65 e pode ser
resumida na seguinte análise retrossintética. Esquema 1.
ESQUEMA 1: Retroanálise para a obtenção dos derivados 3HBenzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridinas
(XI)
e
3H-Pirido[2,3-
b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridinas (XII)
R1
R1
N
N
N
Cl
Cl
R1
R1
N
H
N
N
N
N
N
14
CO2H
H
N
N
N
N
CO2Et
N
15
N
N
N
12
N
13
IGF
IGF
R1
R1
H
H
N
N
CO2Et
CO2Et
N
Cl
CO2Et
N
N
N
N
AGF
AGF
N
10
N
N
N
N
11
7
R1 = H, m-OCH3, p-OCH3, m-CH3,
p-CH3, m-Cl, p-Cl, m-NO2, p-NO2, m-F,
p-F, m-Br, p-Br
R1= H, 3-CH3, 4-CH3, 5-CH3, 6-CH3
50
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Tese de doutorado
A partir dos derivados 3H-Benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridinas
14 e 3H-Pirido[2,3-b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridinas 15, por desconexão
de ligação C-C, remete-se aos derivados ácidos do sistema 1Hpirazolo[3,4-b]piridina do tipo 12 e 13, que após uma inversão de grupo
funcional, remete-se aos derivados ésteres do sistema 1H-pirazolo[3,4b]piridina do tipo 10 e 11, que por desconexão de ligação C-N, remete-se
ao derivado chave desta síntese o 5-carboetoxi-4-cloro-1-fenil-1Hpirazolo[3,4-b]piridina 7.
A literatura relata vários métodos de síntese do sistema 1Hpirazolo[3,4-b]piridina. Sendo este sistema chave para a síntese dos
derivados 14 e 15, portanto torna-se importante fazer uma revisão dos
métodos de síntese. Esses métodos baseiam-se principalmente nas reações
de piridinas e pirazoís substituídos e estão descritos a seguir:
Métodos de síntese do sistema 1H-Pirazolo[3,4-b]piridina
ü A partir de Piridinas Substituídas.
A literatura relata vários métodos de obtenção do sistema 1Hpirazolo[3,4-b]piridina66,, como o desenvolvimento de uma rota sintética de
alto rendimento para obtenção de derivados 3-amino-4-trifluorometil-6aril-pirazolo[3,4-b]piridinas 17 a partir do tratamento de 2-o-acetamido-3ciano-4-trifluorometil-6-aril-piridinas 16 com hidrato de hidrazina, sob
refluxo.67
Estrutura 21: Reações a partir de piridinas substituídas
CF3
CF3
CN
NH2NH2 . H2O
N
88-96%
Ar
N
16
OCH2CONH2
a) Ar = C6H5
b) Ar = p-CH3C6H4
c) Ar = p-OCH3C6H4
d) Ar = p-ClC6H4
Ar
N
N
17
H
51
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Tese de doutorado
A bromação regio seletiva na posição 3 de piridonas 18 envolvendo
NBS sob refluxo, obtêm-se os derivados do tipo 19. Subseqüente
tratamento destes derivados com POCl3 seguido por ciclização com hidrato
de hidrazina, produzem derivados do sistema 1H-pirazolo[3,4-b]piridina do
tipo 20 em excelentes rendimentos 68
Estrutura 22: Obtenção do derivado 20.
N
N
C
N
H
R
O
Br
C
NBS, DMF
refluxo
80%
18
N
H
O
19
R
a) POCl3, refluxo
100%
b) NH2NH2.H2O
NH2
Br
N
R= 3-o-CH3, 2-o-CH3, 4-o-CH3
N
H
R
N
H
20
Lavecchia, et. al relatam um procedimento modificado para obtenção
de derivados 3-aminopirazolo[3,4-b]piridinas 22. Este método consiste na
utilização de cobre como catalisador, e vêm como uma alternativa para um
melhor rendimento na obtenção de derivados deste tipo. Os materiais de
partida são derivados 2-cloronicotinonitrila 21 que reagem com excesso de
hidrazinas, e iodeto de cobre em o-fenantrolina e carbonato de césio em
52
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Tese de doutorado
dimetilformamida, por 12 horas a 800C, com rendimentos variando de 7392%.69
Estrutura 23: Obtenção do derivado 22
NH2
CN
CuI/o-fenantrolina
Cs2CO3
N
DMF
N
R
21
800C 12h
Cl
N
73-96%
NH2NH2.H20
N
22
R
R = Fenil, H, CH3
Dyck et. al. relatam a ciclização direta de derivados do tipo 23, com
hidrazinas substituídas em etanol, sob refluxo, como um método que
resulta exclusivamente na formação de derivados do sistema 1Hpirazolo[3,4-b]piridinas do tipo 24. Esta reação ocorre inicialmente pela
substituição do cloro pelo nitrogênio mais nucleofílico da hidrazina
substituída, seguida por ciclização e desidratação.70
Estrutura 24: Obtenção do derivado 24
R1
R2
R1
R2
N
O
N
R3 NHNH2
N
etanol, reflux.
H3C
N
Cl
23
H3C
R3
N
N
24
R1=R1=Pr
R3 = 2,4-diclorobenzeno
53
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Tese de doutorado
ü A partir de Pirazóis Substituídos.
A síntese de derivados do sistema 1H-pirazolo[3,4-b]piridina, a partir de
pirazóis geralmente são realizadas por reações de derivados 1,3 dicarbonil
com 5-aminopirazóis seguida de reação de ciclização.66,A literatura relata
uma série de exemplos deste tipo de reação, como por exemplo:
Compostos do tipo 29 do sistema 1H-pirazolo[3,4-b]piridina podem ser
obtidos a partir de derivados 5-aminopirazol do tipo 25 através da reação
de condensação seguida de ciclização com etoximetilenomalonato de
dietila, obtendo-se o derivado 26. Tratamento deste derivado com
oxicloreto de fósforo, obtêm-se o derivado 4-cloropirazolopiridina 27. A
seguir, introdução do substituinte 4-butoxi, via alcóxido, seguido por
hidrólise do grupamento éster, produzindo o ácido 28. A reação de
acoplamento do cloreto ácido com N,O-dimetilidroxiamina seguida pela
remoção do grupo PMB com TFA, produz 29. Tratamento de 29 com
excesso de composto organo lítio apropriado, fornece os derivados 30 em
bons rendimentos. 71
Estrutura 25: Obtenção do derivado 30.
OH
EtO
1) 2C CO2Et EtO2C
OEt
2) èter difenílico
NH2ClH
N
N
25
Cl
N
26
N
66%
N
N
PMB
EtO2C
POCl3, 1200C, 1h
N
N
27
PMB
PMB
nBuONa(3eq)
nBuOH, 650C, 3h
100%
O
O-nBu
O
H3CO
R
N
N
30
N
0
ArLi/THF -78 C
10-90%
H
R= 2-CH3, 3-CH3, 4-CH3, 2-F
O-nBu
O-nBu
HO2C
N
N
CH3
N
29
N
H
1) COCl2/cat DMF/CH2Cl2250C
(MeO)NH(Me)HCl, Et3N, 0-250C, 93%
2) TFA, 65 0C, 2.5h, 89%
N
N
28
N
PMB
PMB = p-metoxi-benzenoil
54
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Tese de doutorado
O Derivado 5-aminopirazol 31 reage com etoximetilenomalonato de
dietila com posterior ciclização utilizando oxicloreto de fosfóro, gerando o
derivado 32, que após reação de substituição nucleofílica seguida de
hidrólise, obtêm-se o derivado 33, em rendimentos satisfatórios de acordo
com o método descrito por HOHN et. al. 18
Estrutura 26: Obtenção do derivado 33
O
Cl
O
1) EtO2C
CO2Et
OEt
N
N
NH2
1200C, 5h
N
N
2) POCl3,1100C
N
2h, 55%
32
31
H3CO
H3CO
Cl
Cl
1)
/ Et3N/EtOH
NH2.HCl
2) NaOH, EtOH/H2O, 2h, 87%
O
NH
O
N
N
N
33
Abramov et. al. relataram a síntese de derivados 4-aril substituídos
do tipo 35 do sistema 1H-pirazolo[3,4-b]piridina, através de reações com
55
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Tese de doutorado
pentafluor aldeídos, e derivados 5-aminopirazóis 34 via ciclocondensação
[1+1] com rendimentos variando entre 55-87%. 72
Estrutura 27: Obtenção dos derivados 35
F
R1
F
F
F
R1
F
F
N
H2N
N
34
R
F
CHO
ACOH, xilenoF
Reflux
55-87%
N
35
N
N
F
R
R= NMe, NPh
R1 = Me, t-Bu, Ph
Ortiz, et. al. relataram a síntese de derivados do sistema 1Hpirazolo[3,4-b]piridina do tipo 37, via reação de cicloadição [4+2], por
irradiação em midroondas. Estes derivados são obtidos a partir de 5aminopirazóis do tipo 36, que reagem com nitro alcenos substituídos. Esta
técnica é o primeiro exemplo de uma reação de cicloadição [4+2] de um 2azadieno envolvendo o anel pirazólico via microondas, e tem como
principal atrativo, ocorrerem em menores tempos de reação quando
comparado com métodos tradicionais. Esses derivados foram obtidos com
rendimentos entre 32-57%.73
Estrutura 28: Obtenção dos derivados 37
Ar
N
N
N
Et
36
Ar
C6H4p-OCH3+
Microondas
7-10 min.1400C N
NO2
32-57%
Ar = fenil, 1-fenil-3-indol
N
N
C6H4p-OCH3
37
Et
56
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Quiroga et. al. relataram uma nova abordagem para obtenção de
novos 1,4-diaril-3-metil-4,5-diidropirazolo[3,4-b]piridin-6-onas 40, através
da reação de 5-aminopirazol 38 com derivados benzilidenos do ácido de
Meldrum 39, em nitrobenzeno, com tempo de reação variando de 20-30min
e rendimentos de 42-70%.74
Estrutura 29: Obtenção dos derivados 40.
O
O
H3 C
O
N
NH2
N
+
p-R1
CH3
C6H4CH
O
38
39
O
C6H4-R1-p
H3C
Ph-NO2,
20-30min, 42-70%
N
N
CH3
N
H
40
Um outro trabalho nesta área foi a síntese de derivados 6-amino-4aril-5-ciano[3,4-b]piridinas 43, a partir da reação de derivados arilidenos
do malonodinitrila 42 com 5-amino-pirazol 41. A reação ocorre quando
uma mistura equimolecular de 40 e 41 são colocadas sob refluxo por 1.5h,
através de uma adição seguida de ciclização. Os derivados são obtidos com
rendimentos de reação variando entre 63-82%.75
Estrutura 30: Obenção dos derivados 43
R
R
H3C
CN
N
NH2
N
41
H3C
+
NC
42
CN
Etanol, trietilamina
1.5 h, 63-82%
R=H, CH3O, Cl, NO2
NH2
N
N
N
43
57
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Tese de doutorado
A Segunda parte da síntese dos derivados 14 e 15, envolve a
formação de anel naftiridina, sendo de grande importância uma revisão de
métodos para sintéticos deste sistema.
Métodos de síntese do sistema 1,6-Naftiridinas
A literatura relata vários métodos de síntese deste sistema que serão
discutidos a seguir:
Vatsadze et. al. Relatam a síntese de derivados 5,6,7,8-tetraidro-1,6naftiridinas 45 através de reação de heterociclização a partir de dicetonas
1,5-dicarbonil do tipo 44, em cloridrato de hidroxilamina e etanol. Este
método é apresentado como uma alternativa para obtenção de derivados do
tipo 45, pois a técnica tradicional apresenta dificuldade no isolamento, já
que utiliza complicados métodos cromatográficos.76
Estrutura 31: Obenção dos derivados 45
Ph
O
Ph
N
O
Ph
NH2OH.HCl, EtOH, 700C.
R = Me, CH2Ph
N
Ph
N
45
44
R
R
Cywin et. al. relatam a síntese de derivados 1,6-naftiridinas do tipo
50. A síntese é iniciada quando derivados dos ácidos 2-metilnicotínico 46
são tratados com LDA em THF a –780C, através da formação de um
diânion. Subseqüente, a adição de uma nitrila do tipo 47 produz os
derivados 1,6-naftiridina 48. O Tratamento deste com
oxicloreto de
58
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fósforo a 1350C, resulta nos derivados 5-cloro-1,6-naftiridina 49, que após
reação com anilinas produzem os derivados do tipo 50.77
Estrutura 32: Obenção dos derivados 50
O
OH
R3
R3
OH
R2
N
47
CH3
N
LDA
THF
R7
NC
+
-780C
R2
N
R7
46
48
POCl3
100-1350C
Cl
NR'R''
R3
R3
N
R'R''NH
N
100-1400C
R2
N
R2
R7
N
R7
50
49
R2 = H, OH, CF3
R3 = H, Br, Ph
R7 = 4-MeOPh , t-Bu , 4-Me2NPh
Huang et. al. relataram a síntese de derivados 1,6-naftiridinas 52 a
partir de derivados imino-alcinos 51 por fechamento de anel através de uma
reação eletrofílica em presença de amônia e etanol.78
Estrutura 33: Obenção dos derivados 51
O
H
N
NH3, EtOH
N
N
50
R
R
51
R = H, Ph, n-Bu
59
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Tese de doutorado
Gaidarova et. al. relatam a síntese de derivados octaidro-1,6naftiridinas 55, através de reação de metalação de derivados 4piperidinoaminas 52, com excesso de LDA. A Alquilação dos derivados
obtidos
com
1,3-bromocloropropano
e
a
subseqüente
ciclização
intramolecular do intermediário 54, resulta nos derivados do tipo 55, com
rendimentos de 70-90%. 79
Estrutura 34: Obenção dos derivados 55
R2
+
R2
-
Li
N
R2
N
N
Cl(CH2)3Br,
-780C
LDA, THF
-300C, 30min.
N
N
R1
52
R1
Cl
53
N
R1
54
Refluxo, 4h
R2
N
R1=C6H5, CH3, CH2C6H5,
R2=CH3, CH2C6H5,COC6H5
N
R1
55
Ruchelman et. al. relataram a síntese de derivados 5H-dibenzo[c,h]1,6-naftiridin-6-onas 60, através da conversão de apropriadas 56 4aminoquinolinas substituídas 57 usando fenol na presença de aminas
primárias. Tratamento de 57 com ácido 4,5-dimetoxi-2-iodobenzóico 58
em cloreto de acido, obtêm-se os derivados iodo-benzamidas 59 que foram
ciclizados para os derivados 60 usando condições similares as descritas por
60
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Harayama et. al. para a preparação de alcalóides benzo[c]fenantiridinas 60,
sendo os derivados foram obtidos com rendimentos variando de 30-84%. 80
Estrutura 35: Obenção dos derivados 60
R
Cl
O
+ RNH2
O
H
N
O
C6H5OH, refluxo
1000C
N
O
N
56
57
O
HO
I
OCH3
58
OCH3
COCl2, CH2Cl2
O
N
R
OCH3
N
Pd(OAc)2, P(o-toluil)3
O
O
OCH3
N
OCH3
R
O
60
Ag2CO3, DMF
O
O
I
OCH3
59
N
61
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4- RESULTADOS E DISCUSSÃO
62
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SÍNTESE DOS DERIVADOS 3H-BENZO[b]PIRAZOLO[3,4-h]-1,6NAFTIRIDINAS 14 E 3H-PIRIDO[2,3-b]PIRAZOLO[3,4-h]-1,6NAFTIRIDINAS (15)
A síntese dos derivados 3H-Benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridinas
14 e 3H-pirido[2,3-b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridinas 15 pode ser dividida
em duas etapas. A primeira parte envolve a síntese do derivado 7.
Inicialmente obtêm-se o 5-amino-4-carboetoxi-1-fenil-1H-pirazol (3), que
sofre hidrólise e descarboxilação obtendo-se o intermediário 5-amino-1fenil-1H-pirazol. A condensação de 4 com etoximetilenomalonato de
dietila fornece o derivado α-carboetoxi-β(5-pirazolilamino)acrilato de etila,
que a seguir é submetido a uma reação de “clorociclização” com oxicloreto
de fósforo, obtendo-se assim o derivado 5-carboetoxi-4-cloro-1-fenil-1Hpirazolo[3,4-b]piridina (7). Esquema 2.
ESQUEMA 2: Esquema sintético para obtenção do derivado 5carboetoxi-4-cloro-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina (7).
Cl
CO2Et
EtO2C
N
N
N
NH2
H3PO4, 6h
EtO
N
NH2
EtO2C
CO2Et
H
5
CO2Et
CO2Et
POCl3
N
N
N
N
Etanol
N
N
H
3
4
6
7
A segunda parte envolve a síntese de derivados do sistema 3Hbenzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridinas (14) e do sistema inédito 3Hpirido[2,3-b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridinas (15). Estas foram realizadas a
partir do derivado 7, através de técnicas descritas na literatura. Esquemas 3
e 4.
63
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ESQUEMA 3: Esquema sintético para obtenção dos derivados 3HBenzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridinas 14(a-m).
R1
Cl
H
N
CO2Et
CO2Et
N
N
N
i
N
N
N
10
7
ii
R1
H
N
N
N
N
CO2H
iii
R1
N
N
N
Cl
14
N
12
NH2
8
i-
R1
, 1400C; 2-6h
ii : 1) NaOH 20%; Etanol/ refluxo
2) HCl 10%
iii : POCl3, refluxo, 6h
64
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ESQUEMA 4: Esquema sintético para obtenção dos derivados 3HPirido[2,3-b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridínas 15(a-e).
R1
Cl
H
N
CO2Et
N
CO2Et
N
N
N
i
N
N
N
11
7
ii
R1
H
N
N
N
N
N
CO2H
iii
R1
N
N
N
Cl
N
15
N
13
NH2
N
i-
9
R1
, 1400C; 2-6h
ii : 1) NaOH 20%; Etanol/ refluxo
2) HCl 10%
iii : POCl3, refluxo, 6h
65
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4.1 - PARTE 1: OBTENÇÃO DO DERIVADO 5-CARBOETOXI-4CLORO-1-FENIL-1H-PIRAZOLO[3,4-b]PIRIDINA (7).
4.1.1 - Síntese do derivado 5-amino-4-carboetoxi-1-fenil-1H-pirazol
(3).
A metodologia utilizada para obtenção do derivado 5-amino-1-fenil1H-pirazol,
consiste
na
reação
de
fenilidrazina
(1)
com
etoximetilenocianoacetato de etila (2), de acordo com método descrito na
literatura.62.Esquema 5.
Esquema 5 : Reação de Obtenção do derivado 5-amino-4-carboetoxi1-fenil-1H-pirazol (3)
CO2Et
NHNH2
CN
O
2
N
OCH2CH3
N
NH2
O
Etanol/refluxo
1
3
A
fenilidrazina
sofre
reação
de
condensação
com
etoximetilenocianoacetato de etila em uma reação de adição do tipo
Michael e posterior ciclização com a formação do anel pirazólico, pela
adição nucleofílica do grupo ciano. O esquema mecanístico para esta
reação pode ser descrito no esquema 6.
66
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ESQUEMA 6: Esquema mecanístico para a reação de obtenção do
intermediário 5-amino-4-carboetoxi-1-fenil-1H-pirazol
N
-
N
H
C
EtO
H
H
CO2Et
C
C
EtO
+
CO2Et
N+
-
CO2Et
N
H
NH
H
N
N
NH
NH
CO2Et
H N
+
H N
N
NHNH2
N
-
C
O
OCH2CH3
+
O
CO 2Et
N
N
NH2
CO 2Et
H N
N
NH
O produto foi obtido sob a forma de um sólido amarelo, com
rendimento de 70% e identificado por constantes físicas e FT-IV,
destacando as absorção em 3397-3130cm-1, referentes a deformações axiais
de grupo (NH2) e 1720 cm-1 referente a deformação axial de grupamento
carboetoxi. Tabela 1.
Tabela 1: Rendimento, ponto de fusão e principais dados de infravermelho do derivado 5-amino-4-carboetoxi-1-fenil-1H-pirazol
SUBST.
R1
REND.(%)
3
H
70
PF (0C) PF LIT (0C)
97
98
IV (cm-1).
3397-3130(νNH2);
1683(νC=O); 1658(δNH2)
67
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4.1.2 - Síntese do derivado 5-amino-1-fenil-1H-pirazol (4).
O derivado 5-amino-1-fenil-1H-pirazol foi obtido por reação de
hidrólise e descarboxilação do derivado 5-amino-4-carboetoxi-1-fenil-1Hpirazol, com ácido fosfórico 85%, conforme metologia descrita na literatura
62
. A reação de obtenção deste derivado está descrita no esquema 7.
Esquema 7 : Reação de Obtenção do derivado 5-amino-1-fenil-1Hpirazol (4)
CO2Et
N
N
N
NH2
H3PO4 85%
N
NH2
refluxo, 4h
4
3
O ácido fosfórico 85% é adicionado sob o derivado 5-amino-4carboetoxi-1-fenil-1H-pirazol (3), ocorrendo, primeiramente, uma reação
de
hidrólise
ácida,
obtendo-se
assim
um
intermediário
ácido.
Posteriormente ocorre a descarboxilação do intermediário ácido, por perda
de dióxido de carbono, que é favorecida por ligação de hidrogênio
intramolecular.
68
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O produto 4 foi obtido após recristalização, em etanol/água com
rendimento de 80% e identificado por ponto de fusão e métodos
espectroscópicos(FT-IV e RMN H1).
No espectro de IV, destaca-se as absorções em 3311 e 3202cm-1,
referente a deformações axiais de grupo (NH2) e o desaparecimento da
absorção característica de carbonila de éster, grupo este presente no
derivado 3. Os principais dados de rendimento, ponto de fusão e
espectrometria de FT-IV obtidos para o derivado 4 estão descritos na tabela
2.
Tabela 2: Rendimento, ponto de fusão e principais dados de infravermelho do derivado 5-amino-1-fenil-pirazol
SUBST.
R1
REND.(%)
PF (0C)
PF LIT (0C)
IV (cm-1).
4
H
80
66-8
66-8ref
3311 e 3202 (νNH2)
Os principais dados relacionados aos espectros de RMN
1
H
encontram-se relacionados na tabela 3 e estão de acordo com dados da
literatura 61
Os assinalamentos dos hidrogênios desta molécula foi efetuado com
base em valores dos deslocamentos químicos e na multiplicidade e
integração dos sinais. Pode-se destacar os sinais dubletos em 6.99 e
5.44ppm, referentes aos hidrogênios H3 e H4 do anel pirazólico.
69
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Tabela 3: Dados de RMN 1H (300MHz,CDCl3) de 4 obtidos por
experimentos de 1D(1H). Deslocamentos químicos (δ) relativos ao TMS.
3
4
N
2
N
5
NH2
1
1'
6'
2'
5'
3'
4'
C/H
δH (J,Hz)
3
4
2`, 6`
3`, 5`
4`
NH
6.99(d)
5.54(d)
7.50-7.30(m)
7.50-7.30(m)
7.50-7.30(m)
3.88(s)
70
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4.1.3 - Síntese dos α-carboetoxi-β(1-fenil-5-1H-pirazolilamino)acrilato
de etila (6).
A metodologia utilizada para obtenção dos derivado derivado αcarboetoxi-β(1-fenil-5-1H-pirazolilamino)acrilato de etila, consiste na
reação do derivado 5-amino-1-fenil-pirazol 4 com etoximetilenomalonato
de dietila 5, de acordo com método descrito na literatura.20Esquema 8.
ESQUEMA 8: Reação de Obtenção do derivado α-carboetoxi-β(1fenil-5-1H-pirazolilamino)acrilato de etila
EtO2C
N
EtO
N
NH2
EtO2C
CO2Et
H
5
CO2Et
N
N
N
Etanol
H
4
6
Mecanisticamente, este processo resulta do ataque nucleofílico do
grupo amino do derivado 4 sobre o etoximetilenomalonato de dietila 5 , em
uma reação do tipo Michael81. A proposta mecanística esta representada no
esquema 9.
71
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ESQUEMA 9: Esquema mecanístico para a reação de obtenção do
derivado α-carboetoxi-β(1-fenil-5-1H-pirazolilamino)acrilato de etila
O
O
O
CO2ET
N
O
N
N
O
NH2
O
+
N
N
H
H
H
O
-
O
O
H
+O
CO2ET
O
N
N
N
-ETOH
N
N
H
O
O
N
-
H
O
O
O derivado 6 foi obtido após recristalização, em etanol, com
rendimento de 85% e identificado por ponto de fusão e dados
espectroscópicos (FT-IV e RMN H1).
No espectro de IV pôde-se observar o aparecimento de duas
absorções característica de carbonila de éster em 1687 e 1641 cm-1 (νC=O)
e uma absorção em 3129 cm-1 (νNH) 3. Os principais dados de rendimento,
ponto de fusão e IV obtidos para o derivado 6 estão descritos na tabela 4.
72
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Tabela 4: Rendimento, ponto de fusão e principais dados de
Infravermelho
do
derivado
α-carboetoxi-β(1-fenil-5-1Hpirazolilamino)acrilato de etila
Subst. Rend. (%) PF (0C) PF lit (0C)
6
85
84-562
86
IV (cm-1).
3129 (νNH);1687 e 1641 (νC=O)
Os assinalamentos dos hidrogênios desta molécula foram efetuados
com base em valores dos deslocamentos químicos e na multiplicidade e
integração dos sinais. Pode-se destacar um singlete referente ao próton H4
do anel pirazólico em 6.22ppm, mais desblindado do que nas moléculas 4.
Tal fato pode ser explicado devido à possibilidade de ressônancia entre o
par de elétrons do nitrogênio e o grupamento acrilato. Destaca-se também
um dubleto em 8.22ppm característico do hidrogênio β e ainda um
quarteto, em 4.23ppm, referente aos hidrogênios do grupamento CH2 e um
tripleto, em 1.30ppm, referente aos hidrogênios do grupamento CH3
Tabela 5.
Tabela 5: Dados de RMN 1H (300MHz, CDCl3) de 6 obtidos por
experimentos de 1D(1H). Deslocamentos químicos (δ) relativos ao TMS.
EtO2C
3
4
CO2Et
N
2
N
5
1
1'
6'
N
H
2'
3'
5'
4'
C/H
3
4
β
2`, 6`
3`, 5`
4`
OCH2
CH2CH3
NH
δH (J,Hz)
6.22(s)
8.22(d, 12,9)
7.61-7.42(m)
7.61-7.42(m)
7.61-7.42(m)
4.23(q)
1.30(t)
11.05(d, 12.6)
73
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4.1.4 - Síntese de 5-carboetoxi-4-cloro-1-fenil-1H-pirazolo[3,4b]piridina (7).
A metodologia utilizada para obtenção do derivado 5-carboetoxi-4cloro-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina.,
clorociclização
do
derivado
consiste
na
reação
de
α-carboetoxi-β(1-fenil-5-1H-
pirazolilamino)acrilato de etila com oxicloreto de fosfóro, método de
Gould-Jacobs modificado.18,63Esquema 10.
ESQUEMA 10: Reação de Obtenção do derivado 5-carboetoxi-4-cloro1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina.
Cl
CO2Et
EtO2C
N
CO2Et
POCl3
N
N
refluxo, 6h
N
N
N
H
6
7
Mecanisticamente, este processo resulta do ataque nucleofílico da
carbonila do derivado 6 sobre o oxicloreto de fósforo (POCl3), seguida de
substituição aromática eletrofílica, resultando no derivado 7. Este processo
ocorre de forma similar à descrita por Vilmeier-Haack para formação de
amida cíclica.82Esquema 11.
74
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ESQUEMA 11: Esquema mecanístico para a reação de obtenção do
derivado 5-carboetoxi-4-cloro-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina.
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
P
P
O
Cl-
EtO
O
O
N
N
N
N
O
H
O
+
N
N
N
CO2Et
O
O
H
O
H
O
O
Cl
Cl
Cl
CO2Et
CO2Et
+
HCl
N
N
N
N
N
H
N
+
N
N
H
H
+
OEt
CO2Et
EtO
O
H
N
+
N
N
H
-EtOH
Cl
CO2Et
N
+
N
N
H
75
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O derivado 7 foi obtido após recristalização, em etanol, com
rendimento de 75% e identificado por ponto de fusão e métodos
espectroscópicos (FT-IV e RMN H1).
No espectro de IV ocorre o aparecimento de uma absorção
característica de grupo carbonila de éster em 1721 cm-1 (C=O) e o
desaparecimento da absorção em 3129 cm-1 referente ao grupo (NH). Os
principais dados obtidos para o derivado 7 estão descritos na tabela 6.
Tabela 6 : Rendimento, ponto de fusão e principais dados de
Infravermelho do derivado 4-cloro-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina.
Subst.
Rend.(%)
PF (0C)
PF lit (0C)
IV (cm1)
7
75
96-8
97-9
1721 (νC=O)
Os principais dados relacionados aos espectros de RMN de 1H
encontram-se relacionados na tabela 7 e estão de acordo com dados da
literatura61.
Os assinalamentos dos hidrogênios destas moléculas foram efetuados
com base em valores dos deslocamentos químicos e na multiplicidade e
integração dos sinais. Pode-se destacar, principalmente, um singlete
referente ao próton H6 do anel pirazólico em 9,11ppm. Pôde-se ainda
destacar, os sinais quarteto, em 4,47ppm referente aos hidrogênios do
grupamento CH2 e um tripleto, em 1,45ppm, referente aos hidrogênios do
grupamento CH3.
76
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Tabela 7: Dados de RMN 1H ( 300MHz, CDCl3) de 7 obtidos por
experimentos de 1D(1H). Deslocamentos químicos (δ) relativos ao TMS.
Cl
CO2Et
4
3a
3
5
6
N
2
N
7a
1
N
7
1'
6'
2'
3'
5'
4'
δH (J,Hz)
C/H
3
6
2’
3’
4’
OCH2
CH2CH3
8.37(s)
9.11(s)
8.20(d, 8.7)
7.54(dd, 7.5)
7.37(dd, 7.5)
4.47(q, 7.2)
1.45(t, 6.9)
77
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4.2 - PARTE 2: OBTENÇÃO DOS DERIVADOS DO SISTEMA 3HBENZO[b]PIRAZOLO[3,4-h]-1,6-NAFTIRIDINAS
SISTEMA
INÉDITO
(14a-m)
e
DO
3H-PIRIDO[2,3-b]PIRAZOLO[3,4-h]-1,6-
NAFTIRIDÍNAS (11a-c).
4.2.1 -
Síntese
b]piridina
da
4-(fenilamino)-5-carboetoxi-1H-pirazolo[3,4-
(10a-m)
e
4-(piridilamino)-5-carboetoxi-1H-
pirazolo[3,4-b]piridina (11a-e).
A metodologia utilizada para obtenção dos derivados 10 e 11
consiste na reação de derivado 4-cloro-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina 7
com derivados da anilina 8 e aminopiridinas 9, através de método descrito
na literatura.64,65 e pode ser descrito no esquema 12.
ESQUEMA 12: Reação de Obtenção dos derivados 4-(fenilamino)-5carboetoxi-1H-pirazolo[3,4-b]piridina (10a-m) e 4-(piridilamino)-5carboetoxi-1H-pirazolo[3,4-b]piridina (11a-e).
Cl
H2N
R1
R1
H
N
N
N 9
NH2
N
N
N
N
R1
8
R1
H
N
CO2Et
7
N
CO2Et
N
11
R1= H, 3-CH3 , 4-CH3 , 5-CH3 , 6-CH3
N
N
CO2Et
N
10
R1= H, m,p-OCH3, m,p-CH3, m,p-Cl, m,p-NO2
m,p-F, m,p-Br
78
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Mecanisticamente, esta reação ocorre a partir do ataque nucleofílico
das anilinas e amino-piridinas no carbono 4 do derivado clorado (7). O
ataque ocorre preferencialmente nesta posição, devido a presença de um
átomo de cloro neste carbono e o grupo carboetoxi na posição 5, deixando
o carbono 4 deficiente de elétrons.81 Esquema 13
ESQUEMA 13: Esquema mecanístico para a reação de obtenção dos
derivados 4-(fenilamino)-5-carboetoxi-1H-pirazolo[3,4-b]piridina (10am) e 4-(piridilamino)-5-carboetoxi-1H-pirazolo[3,4-b]piridina (11a-e).
NH2
Cl
CO2Et
Cl
R1
+
N
N
N
N
R1
N
H
H
N
N
N
N
-
H
-
H
R1
H
Cl
N
H
H
N
N+
CO2Et
+
-
N
H
Cl
CO2Et
Cl
+
CO2Et
CO2Et
N
N
N
N
N
N
79
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Os derivados ésteres foram obtidos, após recristalização em etanol,
com rendimento variando de 50 à 82% e identificados por ponto de fusão e
espectrometria no IV, RMN 1H , 13C e espectrometria de massas.
No espectro de FT-IV, pôde-se observar principalmente o
aparecimento de uma absorção em torno de 3200 cm-1, referente a
deformação axial de N-H e em torno de 1670 cm-1, referente a deformação
axial de C=O para todos os derivados. Os principais dados obtidos para o
derivado (10a-k e 11a-e) estão descritos na tabela 8.
Tabela 8: Rendimentos, pontos de fusão e principais absorções no
Infra-Vermelho
dos
derivados
4-(fenilamino)-5-carboetoxi-1H-
pirazolo[3,4-b]piridina (10a-m) e 4-(piridilamino)-5-carboetoxi-1Hpirazolo[3,4-b]piridina (11a-e).
PF (0C)
IV(cm-1)
H
Rend.
(%)
76
196-8
10b
m-OCH3
63
135-7
10c
p-OCH3
52
146-8
10d
m-CH3
67
187
10e
p-CH3
63
155-6
10f
m-Cl
68
182
10g
p-Cl
64
158-9
10h
m-NO2
60
172-4
10i
p- NO2
69
176-8
10j
m-F
82
206-8
3420(νNH);1678(νC=O);1590 e
1500(ν(C=C) e νC=N);1270 e 1066(νC-C)
3435(νNH);1678(νC=O);1586 e
1500(ν(C=C) e νC=N); 1270 e 1066(νC-C)
3435(νNH);1672(νC=O);1592 e
1512(ν(C=C) e νC=N); 1267 e 1066(νC-C)
3210(νNH);1680(νC=O);1584e
1506(ν(C=C) e νC=N); 1274 e 1066(νC-C)
3435(νNH);1678(νC=O);1596e
1499(ν(C=C) e νC=N); 1265 e 1065(νC-C)
3208(νNH);1681(νC=O);1592e
1505(ν(C=C) e νC=N); 1279 e 1067(νC-C)
3218(νNH);1681(νC=O);1589e
1516(ν(C=C) e νC=N); 1265 e 1066(νC-C)
3207(νNH);1681(νC=O);1590e
1513(ν(C=C) e νC=N); 1271 e 1075(νC-C)
3208(νNH);1681(νC=O);1590e
1513(ν(C=C) e νC=N); 1270 e 1091(νC-C)
3249(νNH);1676(νC=O);1593e
1506(ν(C=C) e νC=N); 1283 e 1091(νC-C)
Subst.
R2
10a
80
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10k
p-F
80
173-4
10l
m-Br
75
180-1
10m
p-Br
75
187-8
11a
H
65
135-4
11b
3-CH3
50
164-6
11c
4-CH3
50
193-4
11d
5-CH3
60
187-8
11e
6-CH3
60
190-1
3217(νNH);1683(νC=O);1590 e
1509(ν(C=C) e νC=N); 1290 e 1066(νC-C)
3224(νNH);1679(νC=O);1596 e
1504(ν(C=C) e νC=N); 1279 e 1066(νC-C)
3219(νNH);1683(νC=O);1593 e
1514(ν(C=C) e νC=N); 1280 e 1072(νC-C)
3110(νNH);1706(νC=O);1592 e
1500(ν(C=C) e νC=N); 1266 e 1083(νC-C)
3125(νNH);1693(νC=O);1594 e
1501(ν(C=C) e νC=N); 1294 e 1079(νC-C)
3110(νNH);1695(νC=O);1595 e
1501(ν(C=C) e νC=N); 1269 e 1078(νC-C)
3110(νNH);1696(νC=O);1593 e
1500(ν(C=C) e νC=N); 1270 e 1069(νC-C)
3161(νNH);1678(νC=O);1592 e
1504(ν(C=C) e νC=N); 1258 e 1085(νC-C)
Nos espectros de massas de alta resolução, pôde-se confirmar a
formação dos produtos com o aparecimento do íon molecular e fragmentos
com perda de M-45, correspondente à –OCH2CH3, para os derivados 10b,
10d, 10f, 10h, 10i, 10j, 10k, 10l, 10m e 11e. Tabela 9.
Esquema 14: Fragmentação proposta para os derivados (10a-k) e (11ad).
+
.
H
N
N
N
.
+
OCH2CH3
H
N
CO2Et
N
N
N
O
N
Nos espectros de RMN-1H destes produtos, os assinalamentos dos
hidrogênios
foram
efetuados
levando-se
em
consideração
as
multiplicidades dos sinais, constantes de acoplamento e integrações. As
tabela 9 e 10 mostram os assinalamentos dos átomos de hidrogênio destas
81
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substâncias. Para os derivados do tipo 10, destaca-se os sinais singletos em
torno de 6,90 e 9,05ppm , referentes aos hidrogênios H3 e H6. Observou-se
também, um sinal singleto em torno de 10,50 ppm referentes aos
hidrogênios do grupo amino. Para todos os derivados foi observado um
dubleto referente aos hidrogênios H-2`e 6`, em torno de 8,20 ppm. Para os
derivados 10b, 10c, 10e, 10h, 10f, 10i, 10l, foi observado ainda um tripleto
em torno de 7,45ppm, referente ao hidrogênio H-4`. Para os derivados 10a,
10d, 10g, 10j, 10k, 10m, este hidrogênio não pode ser evidenciado, pois
ocorre a formação de um multipleto. Para todos os derivados foi observado
um tripleto (1,43ppm) e um quarteto (4,43ppm) referentes aos hidrogênios
do grupo CH2-CH3 e OCH2-CH3 . O hidrogênio H-2``, foi identificado
como singleto, 7,51, 7,82 e 8,50ppm para os derivados 10b, 10l e 10h,
respectivamente e como dubleto, 7,22 e 7,74ppm para os derivados 10c e
10i, respectivamente. Para os demais hidrogênios não podem ser
evidenciados os respectivos sinais, pois ocorre a formação de um
multipleto. O hidrogênio H-4``, foi identificado como dubleto em 7,55 e
8,44ppm, respectivamente, para os derivados 10b e 10h e como multipleto
para os demais derivados. O hidrogênio H-5``, foi identificado como
tripleto em 7,60, 7,94 e 7,75ppm, para os derivados 10b, 10h e 10l e como
dubleto em 7,50 e
8,43ppm, para os derivados 10c e 10i e como
multipleto, para os demais derivados. Para os derivados 10b e 10c, pode ser
evidenciado a presença de um sinal em 3,90ppm, referente ao grupo ArOCH3, e para os derivados 10a e 10e, um sinal em 3,37ppm, referente ao
grupo Ar-CH3.
Para os derivados do tipo 11, destacam-se os sinais singletos 8,70,
9,40, 8,90, 8,30 e 7,86ppm , referentes aos hidrogênios
H3 para os
derivados 11a, 11b, 11c, 11d e 11e, respectivamente. Observou-se também,
um singleto em torno de 9,00 ppm para todos os derivados, referentes ao
próton H6. Para todos os derivados foi observado um dubleto referente aos
82
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Tese de doutorado
hidrogênios H2`e 6`, em torno de 8,20 ppm. Foi observado um duplo-dubleto,
referente aos prótons H3`e5`, em 7,55, 7,63, 7,33 e 7,42, para os derivados
11a, 11c, 11d e 11e, respectivamente. Foi observado um duplo-dubleto,
referente ao hidrogênio H4`, em 7,55, 7,63, 7,33 e 7,21, para os derivados
11a, 11c, 11d e 11e, respectivamente. Para o derivado 11b, este hidrogênio
não foi evidenciado, pois ocorre a formação de um multipleto.
O
hidrogênio H3`` foi identificado como duplo-dubleto, em 7,33 e 6,95ppm,
para os derivados 11d e 11e, respectivamente. Para os derivados 11a, 11b e
11c este hidrogênio não foi evidenciado, pois ocorre a formação de um
multipleto. O hidrogênio H4`` foi identificado como duplo-dubletos, em
7,52 e 7,62ppm, para os derivados 11d e 11e, respectivamente. Para os
derivados 11a, 11b e 11c este hidrogênio não foi evidenciado, pois ocorre a
formação de um multipleto. O hidrogênio H5`` foi identificado como duplodubleto, para os derivados 11a e 11e, respectivamente. Para os derivados
11b, 11c e 11d este hidrogênio não foi evidenciado, pois ocorre a formação
de um multipleto.O hidrogênio H6`` foi identificado como dubleto, em
8,00, 8,38 e 8,13ppm, para os derivados 11a, 11c e 11d, respectivamente.
Para os derivado 11b e 11e este hidrogênio não foi evidenciado, pois ocorre
a formação de um multipleto. Para todos os derivados foram observados
um tripleto (1,43ppm) e um quarteto (4,43ppm) referentes aos hidrogênios
do grupo CH2-CH3 e OCH2-CH3. Foi observado também, um singleto em
3,30ppm para os derivados 11b, 11c, 11d e 11e.
A partir do espectros de RMN
13
C-APT, foi possível identificar a
carbonila do grupo carboetoxi (COOEt), para todos os derivados, em torno
de 164ppm.
O espectro bidimencional de correlação heteronuclear (1Hx13CHETCOR-nJCH, n=1), associado às informações obtidas através da técnica
APT permitiram a identificação dos carbonos para os derivados do tipo 10,
destacando um sinal em torno de 164ppm referente ao carbono do grupo
83
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Tese de doutorado
carboetoxi (CO2Et) e os sinais em torno de 14,00 e 60,00ppm, referentes
aos carbonos dos grupos -CH3 e -CH2-, respectivamente. Para todos os
derivados foram observados os sinais em torno de 100,00 e 105ppm,
referentes aos carbonos C3a e C5, respectivamente. O carbono C3 apresentou
deslocamento químico em torno de 135ppm e o carbono C6 em torno de
153ppm. Pôde-se identificar para todos os derivados os carbonos C2’ e 6’ em
torno de 122ppm os carbonos C3’ e 5’ em torno de 131ppm e os carbonos C4’
em torno de 128ppm. O carbono C7a apresentou um deslocamento químico
em torno de 150ppm. O carbono C1’’ apresentou deslocamento químico em
torno de 158,00ppm. Os derivados 10b e 10c apresentaram ainda um sinal
em torno de 56ppm, referente ao carbono do grupamento Ar-OCH3. Os
derivados 10d e 10e apresentaram um sinal em torno de 21ppm referente
ao carbono Ar-CH3.
O espectro bidimencional de correlação heteronuclear (1Hx13CHETCOR-nJCH, n=1), associado às informações obtidas através da técnica
APT permitiram a identificação dos carbonos para os derivados do tipo 11,
destacando um sinal em torno de 166ppm referente ao carbono do grupo
carboetoxi (CO2Et) e os sinais em torno de 14,00 e 61,00ppm, referentes
aos carbonos dos grupos -CH3 e -CH2-, respectivamente. Para todos os
derivados foi observado os sinais em torno de 104,00 e 107ppm, referentes
aos carbonos C3a
e
C5, respectivamente. O carbono C3 apresentou
deslocamento químico em torno de 136ppm e o carbono C6 em torno de
152ppm. Pôde-se identificar para todos os derivados os carbonos C2’ e 6’ em
torno de 122ppm os carbonos C3’ e 5’ em torno de 130ppm e os carbonos C4’
em torno de 127ppm. O carbono C7a apresentou deslocamento químico em
torno de 150ppm. O carbono C1’’ apresentou deslocamento químico em
torno de 140,00ppm. Os derivados 11c, 11d e 11e apresentaram ainda um
sinal em torno de 24ppm, referente ao carbono do grupamento Ar-CH3. O
derivado 11b, não teve seu espectro realizado devido à sua solubilidade.
84
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Tese de doutorado
Tabela 9: Dados de RMN 1H (300MHz,DMSO) de 10a-m obtidos por
experimentos de 1D(1H). Deslocamentos químicos (δ) relativos ao TMS.
3``R
4``
1
2``
H
5``
3
2N
1``
6``
3a
N
N1
7a
10a - R 1= H
10b - R1= m-OCH3
10c - R 1= p-OCH3
10d - R1= m-CH3
10e - R 1= p-CH3
10f - R 1= m-Cl
10g - R1= p-Cl
10h - R1= m-NO2
10i - R1 = p-NO2
10j - R1 = m-F
10k - R1 = p-F
10l - R1 = m-Br
10m - R1 = p-Br
CO2Et
4
5
6
N
7
1`
6`
2`
5`
3`
4`
1
H
10a
10b
10c
10d
10e
10f
10g
10h
10i
10j
10k
10l
10m
3
6,81(s)
6,77(s)
6,60(s)
6,75(s)
6,73(s)
6,92(s)
6,94(s)
7,25(s)
7,18(s)
7,03(s)
6,81(s)
6,88(s)
6,88(s)
6
9,04(S)
8,95(s)
8,98(s)
9,03(s)
9,04(s)
9,03(s)
9,05(S)
9,13(s)
9,09(s)
9,13(s)
9,11(s)
8,99(s)
8,99(s)
2`e 6`
8,08(d, 8.7)
8,16
(d,8.7)
8,19
(d,8,7)
8,21
(d,8,7)
8,23
(d,8,7)
8,20
(d,8,7)
8,08(d, 8.7)
8,30
(d,8,7)
8,25
(d,8,7)
8,30
(d,8,7)
8,29
(d,8,7)
8,17
(d,8,7)
8,15
(d,8,7)
3`e 5`
7,51-7,26(m)
7,13
(dd,7.5)
7,63
(dd,7,5)
7,68-7,41
(m)
7,67
(dd,7,5)
7,68-7,56
(m)
7,51-7,25
(m)
7,74
(dd,7,5)
7,68
(dd,7,5)
7,77-7,53
(m)
7,77-7,56
(m)
7,64-7,57
(m)
7,60-7,50
(m)
4`
7,51-7,26
(m)
7,41
(dd,7.5)
7,45
(dd,7,5)
7,68-7,41
(m)
7,54-7,46
(m)
7,47
(dd,7,5)
7,51-7,25
(m)
7,55
(dd,7,5)
7,50
(dd,7,5)
7,77-7,53
(m)
7,77-7,56
(m)
7,43
(dd,7,5)
7,60-7,50
(m)
2``
7,51-7,26
(m)
7,51
(s)
7,22
(d,8,7)
7,68-7,41
(m)
7,54-7,46
(m)
7,68-7,56
(m)
7,51-7,25
(m)
8,50
(s)
7,74
(d,8,7)
7,77-7,53
(m)
7,77-7,56
(m)
7,82
(s)
7,60-7,50
(m)
3``
7,51-7,26
(m)
_
7,50
(d,8,7)
_
7,54-7,46
(m)
_
7,51-7,25
(m)
_
8,43
(d,8,7)
_
7,77-7,56
(m)
_
7,60-7,50
(m)
4``
7,51-7,26
(m)
7,55
(d,7.8)
_
7,68-7,41
(m)
_
7,68-7,56
(m)
_
8,44
(d,8,1)
_
7,77-7,53
(m)
_
7,64-7,57
(m)
-
5``
7,51-7,26
(m)
7,60
(dd,7,5)
7,22
(d,8,7)
7,68-7,41
(m)
7,54-7,46
(m)
7,73
(dd,8,7))
7,51-7,25
(m)
7,97
(dd,8,7)
8,43
(d,8,7)
7,77-7,53
(m)
7,77-7,56
(m)
7,75
(dd,7,5)
7,60-7,50
(m)
6``
7,51-7,26
(m)
7,53
(d,7,8)
7,22
(d,8,7)
7,68-7,41
(m)
7,54-7,46
(m)
7,68-7,56
(m)
7,51-7,25
(m)
8,10
(d,8,7)
7,74
(d,8,7)
7,77-7,53
(m)
7,77-7,56
(m)
7,75
(d,7,5)
7,60-7,50
(m)
CH2CH3
4,42(q, 7,1)
4,43
(q,7,0)
4,49
(q,7,2)
4,51
(q,7,2)
4,53
(q,7,2)
4,50
(q,7,2)
4,42(q, 7,1)
4,55
(q,7,2)
4,45
(q,7,2)
4,57
(q,7,5)
4,58
(q,7,5)
4,44
(q,7,5)
4,45
(q,7,5)
CH2CH3
1,42(t, 7,1)
1,43
(t,7,0)
1,48
(t,7,2)
1,51
(t,7,2)
1,53
(t,7,2)
1,47
(t,7,2)
1,42(t, 7.1)
1,55
(t,7,2)
1.46
(t,7,2)
1,55
(t,7,0)
1,50
(t,7,5)
1,44
(t,7,5)
1,40
(t,7,5)
N-H
10,61(s)
10,51(s)
10,46(s)
10,53(s)
10,52(s)
10,57(s)
10,51(s)
10,75(s)
10,67(s)
10,67(s)
10,62(s)
10,53(s)
10,50(s)
Ar-OCH3
-
3,86(s)
3,96(s)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ar-CH3
-
-
-
3,37(s)
3,38(s)
-
-
-
-
-
-
-
-
85
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Tese de doutorado
Tabela 10: Dados de RMN 1H ( 300MHz, DMSO) de 11a-e obtidos por
experimentos de 1D(1H). Deslocamentos químicos (δ) relativos ao TMS.
4``
R1 3``
5``
H
2``
N 1``
6``
3
2N
N
CO2Et
4
3a
5
6
N1
7a
7
1`
6`
N
11a - R1= H
11b - R1= 3-CH3
11c - R1= 4-CH3
11d - R1= 5-CH3
11e - R1= 6-CH3
2`
5`
3`
4`
1
H
3
6
2`e 6`
3`e 5`
4`
2``
3``
4``
5``
6``
CH2CH3
CH2CH3
N-H
Ar-CH3
11a
11b
11c
11d
11e
8,70 (s)
9,40 (s)
8,90 (s)
8,30 (s)
7,86 (s)
9,09 (s)
9,50 (s)
9,26 (s)
8,71 (s)
8,75 (s)
8,21(d, 2H, 7,5) 9,10 (d, 2H, 7,5) 8,38 (d, 2H, 7,5) 8,12 (d, 2H, 7,5) 8,03(d, 2H, 7,5)
7,73(dd, 2H,
8,30-7,20(m)
7,82(dd, 2H,
7,52(dd, 3H,
7,42(dd, 2H,
7,5)
7,5)
7,5)
7,5)
7,55(dd, 2H,
8,30-7,20(m)
7,63(dd, 2H,
7,33(dd, 2H,
7,5)
7,5)
7,5)
7,49-7,44(m)
7,33(dd, 2H,
6,95(dd,2H,7,5)
7,5)
7,49-7,44(m)
8,30-7,20(m)
7,52(dd, 3H,
7,5)
6,52(dd,1H,8,7)
8,30-7,20(m)
6,95(dd,2H,7,5)
8,00(d, 8,7)
8,30-7,20(m)
8,38(d,1H,7,5)
8,13(d,1H,7,5)
4,46(q,2H,7,0)
4,45(q,2H,7,0)
4,62(q,2H,7,0)
4,38(q,2H,7,0)
4,07(q,2H,7,0)
1,42(q,3H,7,0)
1,45(q,3H,7,0)
1,58(q,3H,7,0)
1,40(q,3H,7,0)
1,10(q,3H,7,0)
9,56 (s)
10,63 (s)
2,20 (s)
3,50 (s)
3,30 (s)
3,18 (s)
86
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Tese de doutorado
Tabela 11: Dados de RMN 13C( 75,00MHz, DMSO) de 10a-m obtidos
por experimentos de 1D(13C). Deslocamentos químicos (δ) relativos ao
TMS.
3``R
4``
1
2``
H
5``
3
1``
6``
3a
N
N1
7a
2N
CO2Et
4
5
6
N
7
1`
6`
2`
5`
10a - R 1= H
10b - R1= m-OCH3
10c - R 1= p-OCH3
10d - R1= m-CH3
10e - R 1= p-CH3
10f - R 1= m-Cl
10g - R1= p-Cl
10h - R1= m-NO2
10i - R1 = p-NO2
10j - R1 = m-F
10k - R1 = p-F
10l - R1 = m-Br
10m - R1 = p-Br
3`
4`
C
3
3a
4
5
6
7a
1’
2’, 6’
3’, 5’
4’
1’’
2’’
3’’
4’’
5’’
6’’
CO2Et
Ar-OCH3
Ar-CH3
CH2CH3
CH2CH3
10a
135,70
99,70
137,42
105,12
149,50
150,30
131,95
121,50
128,30
126,80
158,10
120,40
128,50
140,12
128,50
120,40
164,98
60,50
13,70
10b
135,81
98,10
137,35
101,69
147,49
149,91
131,86
118,64
127,88
126,31
157,65
120,23
148,50
109,82
123,55
110,98
164,64
57,93
69,48
11,40
10c
134,08
99,95
138.15
103,93
152,24
150,87
131,05
120,95
128,60
125,98
158,53
114,62
128,55
151,85
128,55
114,62
167,19
55,03
60,15
13,74
10d
135,50
101,10
138,40
105,15
153,02
152,98
133,01
122,01
128,70
126,15
158,10
120,50
129,00
138,50
124,00
120,50
166,95
21,70
61,60
15,10
10e
135,55
101,74
139,67
105,43
153,69
151,78
137,36
122,42
131,39
130,02
158,68
122,42
128,14
138,68
128,14
122,42
168,67
21,72
61,63
15,16
10f
133,94
101,52
138,32
104,41
152,29
152,09
133,59
121,12
130,41
128,65
158,80
124,88
149,19
140,44
127,06
126,12
167,09
60,34
13,76
10g
134.49
104.17
138.35
105.68
152.32
152.64
133.09
121.20
128.87
126.32
158.40
123.38
126.67
145.76
126.67
123.38
166.73
60.76
13.81
10h
134,88
102,72
138,88
105,26
153,02
152,60
133,27
122,10
129,49
126,94
158,91
120,98
148,91
140,93
121,97
120,98
167,61
61,21
14,50
10i
134,49
104,17
138,35
105,68
152,10
152,04
133,67
121,12
128,87
126,32
158,76
123,38
124,97
144,07
124,97
124,97
166,73
60,76
13,81
10j
134,20
104,01
138,40
105,70
153,01
152,10
135,00
121,07
128,06
127,00
158,70
123,20
148,00
142,12
120,30
112,65
167,00
60,50
13,50
10k
134.08
104.30
138.21
105.60
153.26
153.30
137.05
121.20
128.10
126.90
158.11
120.30
146.02
148.00
146.02
120.30
166.98
60.21
13.92
10l
134,76
102,02
138,98
104,99
153,03
133,09
121,83
129,17
126,84
158,00
120,02
150,11
139,05
121,00
120,02
167,89
61,09
14.48
10m
134,10
101,48
138,48
104,55
153,35
152,15
132,68
121,41
129,01
128,86
158,20
120,15
126,46
138,53
126,46
120,15
167,44
60,50
13,53
87
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Tese de doutorado
13
Tabela 12: Dados de RMN
C (75.00 MHz) de 11a-e obtidos por
experimentos de 1D(13C). Deslocamentos químicos (δ) relativos ao
TMS.
4``
R1 3``
5``
H
2``
N 1``
6``
3
2N
N
CO2Et
4
3a
5
6
N1
7a
N
7
1`
6`
11a - R1= H
11b - R1= 3-CH3
11c - R1= 4-CH3
11d - R1= 5-CH3
11e - R1= 6-CH3
2`
5`
3`
4`
C
3
3a
4
5
6
7a
1’
2’, 6’
3’, 5’
4’
2’’
3’’
4’’
5’’
6’’
CO2Et
Ar-CH3
CH2CH3
CH2CH3
11a
136,98
106,20
145,80
107,70
151,59
152,40
136,10
122,54
129,25
126,80
157,25
114,01
139,50
115,11
152,10
167,50
24,60
61,40
14,50
11c
135,16
101,20
145,40
103,40
152.44
152,39
139,00
122,21
130,09
127,89
157,50
117,83
139,13
120,34
152,12
164,25
21,90
62,52
14,82
11d
136,74
107,07
145,50
108,01
152,79
152,51
134,05
121,79
129,69
126,56
157,10
121,69
139,41
119,45
152,02
167,14
26,13
60,93
14,61
11e
139,11
105,09
145,70
107,07
152,56
152,51
136,84
121,56
129,42
126,66
157,17
112,79
139,39
119,66
151,74
167,80
23,92
61,18
14,27
88
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Tese de doutorado
4.2.2 - Síntese dos Ácidos 4-(fenilamino)-1H-pirazolo[3,4-b]piridina-5carboxílicos (12a-m) e dos ácidos 4-(piridilamino)-1Hpirazolo[3,4-b]piridina-5-carboxílicos (13a-d)
A metodologia utilizada para obtenção dos derivados 12 e 13
consiste na reação de hidrólise dos derivados 4-(fenilanino)-5-carboetoxi1H-pirazolo[3,4-b]piridina (10a-m) e 4-(piridilamino)-5-carboetoxi-1Hpirazolo[3,4-b]piridina (11a-e), através de método descrito na literatura.64 e
relacionado no esquema 15.
Esquema 15: Reação de Obtenção dos Ácidos 4-(fenilamino)-1Hpirazolo[3,4-b]piridina-5-carboxílicos
(12a-m)
e
dos
ácidos
4-
(piridilamino)-1H-pirazolo[3,4-b]piridina-5-carboxílicos (13a-d).
R1
R1
H
N
N
CO2Et
N
N
1)NaOH/EtOH
2)HCl
H
N
N
CO2Et
N
N
N
1)NaOH/EtOH
2)HCl
11
10
R1
R1
H
H
N
N
N
N
N
N
CO2H
CO2H
N
13
R,= 3-CH3 , 4-CH3, 5-CH3 , 6-CH3
N
N
12
R1= H, m,p-OCH3, m,p-CH3, m,p-Cl, m,p-NO2
m,p-F, m,p-Br
89
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Tese de doutorado
Os derivados ácidos foram obtidos, após precipitação com solução de
HCl (1:3), com rendimento variando de 90 à 99% e identificados por ponto
de fusão e espectrometria no IV, RMN 1H , 13C e espectrometria de massas.
No espectro de FT-IV, pôde-se observar principalmente, o
aparecimento de uma absorção larga em torno de 3400-2600 cm-1, referente
a deformação axial de O-H e outra absorção em torno de 1660 cm-1,
referente a deformação axial de C=O para todos os derivados. Os principais
dados obtidos para o derivado (12a-k e 13a-d), estão descritos na tabela 13.
Tabela 13: Rendimentos, pontos de fusão e principais dados de InfraVermelho
dos
derivados
Ácidos
b]piridina-5-carboxílicos (12a-m)
4-(fenilamino)-1H-pirazolo[3,4-
e 4-(piridilamino)-1H-pirazolo[3,4-
b]piridina-5-carboxílicos (13a-d).
Subst.
12a
R2
H
Rend. (%)
86
12b
m-OCH3
90
12c
p-OCH3
91
12d
m-CH3
90
12e
p-CH3
92
12f
m-Cl
93
12g
p-Cl
89
12h
m-NO2
90
12i
p-NO2
90
12j
m-F
93
12k
p-F
95
PF (0C)
IV(cm-1)
229
3435-2598(νOH); 1654(νC=O); 1590
e 1439(νC=C e νC=N)
235
3330-2590(νOH); 1654(νC=O); 1590
e 1270 (νC=C e νC=N)
261
3430-2588(νOH); 1654(νC=O); 1589
e 1439 (νC=C e νC=N)
237
3482-2592(νOH); 1650(νC=O); 1584
e 1434 (νC=C e νC=N)
254
3430-2603(νOH); 1654(νC=O); 1588
e 1438 (νC=C e νC=N)
236
3488-2766(νOH); 1649(νC=O); 1587
e 1434 (νC=C e νC=N)
268
3430-2603(νOH); 1654(νC=O); 1588
e 1441 (νC=C e νC=N)
255
3401-2603(νOH); 1674(νC=O); 1590
e 1439 (νC=C e νC=N)
256
3409-2603(νOH); 1678(νC=O); 1590
e 1460 (νC=C e νC=N)
224
3412-2586(νOH); 1675(νC=O); 1590
e 1412 (νC=C e νC=N)
232
3487-2586(νOH); 1649(νC=O); 1589
90
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Tese de doutorado
12l
m-Br
90
246
12m
p-Br
90
265
13a
3-CH3
85
252
13b
4-CH3
93
225
13c
5-CH3
80
> 300
13d
6-CH3
90
238
e 1461 (νC=C e νC=N)
3490-2580(νOH); 1650(νC=O); 1587
e 1460 (νC=C e νC=N)
3431-2580(νOH); 1651(νC=O); 1591
e 1442 (νC=C e νC=N)
3400-2500(νOH); 1678(νC=O); 1595
e 1465 (νC=C e νC=N)
3426-2600(νOH); 1678(νC=O); 1596
e 1439 (νC=C e νC=N)
3491-2580(νOH); 1674(νC=O); 1588
e 1409 (νC=C e νC=N)
3400-2580(νOH); 1679(νC=O); 1592
e 1457 (νC=C e νC=N)
Nos espectros de massas pôde-se confirmar a formação dos produtos
com o aparecimento do íon molecular e fragmentos com perda de M-17,
correspondente à –OH, para os derivados 12b, 12d, 12f, 12h, 12i, 12j, 12k,
12l, 12m e 13d. Esquema 16.
Esquema 16: Fragmentação proposta para os derivados (10a-k) e (11ad).
+
.
H
R1
N
N
N
.
OH
+
H
R1
N
CO2H
N
N
N
O
N
Nos espectros de RMN-1H destes produtos, os assinalamentos dos
hidrogênios
foram
efetuados
levando-se
em
consideração
as
91
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Tese de doutorado
multiplicidades dos sinais, constantes de acoplamento e integrações. As
tabelas 14 e 15 mostram os assinalamentos dos átomos de hidrogênio
destas substâncias. Para os derivados do tipo 12, destacam-se os sinais
singletos em torno de 6,90 e 9,05ppm , referentes aos hidrogênios H3 e H6.
Observou-se também, um sinal singleto em torno de 10,90 ppm referentes
aos hidrogênios do grupo amino. Para todos os derivados foram observados
um dubleto referente aos hidrogênios H2`,6`, em torno de 8,20 ppm. Para os
derivados 12b, 12c, 12d, 12f, 12g, 12h, 12i, 12j, 12k, 12l, 12m foram
observados ainda um duplodubleto em torno de 7,50ppm, referente ao
hidrogênio H4`. Para os derivados 12a e 12e este hidrogênio não pode ser
evidenciado, pois ocorre a formação de um multipleto. Para os derivados
12b, 12c, 12d, 12g, 12h, 12i, 12k e 12m, foram observados
um
duplodubleto, em torno de 7,60ppm, referente aos hidrogênios H3’,5’. Para
os derivados 12a, 12e, 12f, 12j e12l, não pode ser evidenciado, pois ocorre
a formação de um multipleto. O hidrogênio H2’’ , foi identificado como
singleto, em 7,79, 8,42 e 7,57ppm para os derivados 12f, 12h e 12l,
respectivamente como dubleto, em 7,28, 7,58, 7,74, 7,71 e 7,50ppm para os
derivados 12c, 12g, 12i, 12k e 12m, respectivamente. Para os derivados
12a, 12b, 12d, 12e e 12j este hidrogênio não pode ser evidenciado, pois
houve a formação de um multipleto. Foram identificados um dubleto,
referente aos hidrogênios H3’’,5’’ , em 7,56, 7.67, 8.40, 7.70 e 7.78ppm para
os derivados 12c, 12g, 12i, 12k, 12m, respectivamente. Para os derivados
12a, 12b, 12d, 12e, 12f, 12h, 12j, 12l, este hidrogênio não pôde ser
evidenciado pois houve a formação de um multipleto. Para os derivados
12l e 12m, foram observados um singleto em torno de 13ppm, referente ao
hidrogênio do grupo CO2H, no entanto para os demais derivados este sinal
não foi observado. Para os derivados 12b e 12c, foram observados um
singleto em torno de 4,00ppm referente aos hidrogênios do grupo OCH3 do
anel aromático e para os derivados 12d e 12e foi observado um singleto,
92
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Tese de doutorado
em torno de 2,40ppm, referente aos hidrogênios do grupo CH3 do anel
aromático.
Para os derivados do tipo 13, destacam-se os sinais singletos em
torno de 9,10ppm , referentes ao hidrogênio H6. Observou-se também um
sinal singleto em torno de 11,40 ppm referentes aos hidrogênios do grupo
ácido. Para todos os derivados foram observados um dubleto referente aos
hidrogênios H2`,6`, em torno de 8,20 ppm. Para todos os derivados foi
observado um dudplodubleto em torno de 7,50ppm, referente ao hidrogênio
H4`. Para todos os derivados foram observados um dudplodubleto em torno
de 7,65ppm referente aos hidrogênios H3’,5’. O hidrogênio H3’’ foi
identificado como singleto, em 7,95ppm para o derivado 13b e como
dubleto, em 7,90 e 7,22 para os derivados 13c e 13d, respectivamente. O
hidrogênio H4’’, foi identificado como dubleto em 7,36 e 7,42ppm para os
derivados 13a e 13c, respectivamente e como duplodubleto em 7,85ppm
para o derivado 13e. O hidrogênio H5’’foi identificado como duplodubleto
em 7,77ppm para o derivado 13a, e como dubleto em 7,70 e 7,20ppm para
os derivados 13b e 13d, respectivamente. O hidrogênio H6’’foi identificado
como dubleto em 8,35 e 8,34ppm para os derivado 13a e 13b,
respectivamente e como singleto 7,73 ppm para o derivado 13b.
O espectro bidimencional de correlação heteronuclear (1Hx13CHETCOR-nJCH, n=1), associado às informações obtidas através da técnica
APT permitiram a identificação dos carbonos para os derivados do tipo 12,
destacando um sinal em torno de 170ppm referente ao carbono do grupo
CO2H e os sinais em torno de 101 e 105ppm, referente aos carbonos C3a e
C5, respectivamente. Pôde-se identificar para todos os derivados os
carbonos C2’
e 6’
em torno de 122ppm os carbonos C3’
e 5’
em torno de
131ppm e os carbonos C4’ em torno de 129ppm. O carbono C6 e C3 pôde
ser identificado para todos os derivados, apresentando deslocamento
químico em torno de 153 e 135ppm, respectivamente. Os derivados 12b e
93
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Tese de doutorado
12c apresentaram ainda um sinal em torno de 56ppm, referente ao carbono
do grupamento Ar-OCH3. Os derivados 12d e 12e apresentaram um sinal
em torno de 21ppm referente ao carbono Ar-CH3.
O espectro bidimencional de correlação heteronuclear (1Hx13CHETCOR-nJCH, n=1), associado às informações obtidas através da técnica
APT e
13
C, permitiram a identificação dos carbonos para os derivados do
tipo 13, destacando um sinal em torno de 170ppm referente ao carbono do
grupo carboetoxi (CO2H) e os sinais em torno de. Para os derivados 13a e
13b, foram observados os sinais em torno de 101,00 e 105ppm, referentes
aos carbonos C3a
e
C5, respectivamente. O carbono C3 apresentou
deslocamento químico em torno de 133ppm e o carbono C6 em torno de
151ppm. Pôde-se os carbonos C2’ e 6’ em torno de 122ppm os carbonos C3’ e
5’
em torno de 127ppm e os carbonos C4’ em torno de 125ppm. O carbono
C7a foi identificado para o derivado 13b, e apresentou deslocamento
químico de 157ppm. O carbono C5’’, apresentou deslocamento químico em
119,50 e 115,86ppm, para os derivados 13a e 13b, respectivamente. Foi
identificado o carbono do grupo Ar-CH3 em torno de 20ppm para os
derivados 13a e 13b. Os derivados 13c e 13d, não tiveram seus espectros
realizados devido dificuldade de solubilidade.
94
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Tese de doutorado
Tabela 14: Dados de RMN 1H (300MHz, DMSO) de 12a-m obtidos por
experimentos de 1D(1H). Deslocamentos químicos (δ) relativos ao TMS.
3``R
1
2``
4``
H
1`` N
5``
CO2H
4
6``
3a
3
5
6
2N
N1
N
7a
7
1`
6`
2`
5`
3`
12a - R1= H
12b - R1= m-OCH3
12c - R1= p-OCH3
12d - R1= m-CH3
12e - R1= p-CH3
12f - R1= m-Cl
12g - R1= p-Cl
12h - R1= m-NO2
12i - R1 = p-NO2
12j - R1 = m-F
12k - R1 = p-F
12l - R1 = m-Br
12m - R1 = p-Br
4`
1
H
12a
12b
12c
12d
12e
12f
12g
12h
12i
12j
12k
12l
12m
3
7,01(s)
6,91(s)
6,70(s)
6,71(s)
6,67(s)
7,01(s)
6,87(s)
7,12(s)
7,16(s)
7,04(s)
6,82(s)
6,65(s)
6,87(s)
6
9,02(s)
9,05(s)
9,03(s)
8,95(s)
8,95(s)
9,07(s)
8,97(s)
9,04(s)
9,06(s)
9,08(s)
9,06(s)
8,72(s)
8,95(s)
2`e 6`
8,23(d, 8.1)
3`e 5`
7,86-7,45(m)
8,27
(d,7,5)
7,69
(dd,7,5)
7,51
(dd,7,5)
7,66-7,61
(m)
_
8,26
(d,7,5)
7,69
(dd,7,5)
7,51
(dd,7,5)
7,28
(d,8,7)
7,56
(s)
_
8,16
(d,7,5)
7,60
(dd,7,5)
7,52
(dd,7,5)
7,44-7,32
(m)
_
8,18
(d,7,5)
7,61-7,40
(m)
7,61-7,40
(m)
7,61-7,40
(m)
7,61-7,40
(m)
_
8,27
(d,7,5)
7,74-7,62
(m)
7,52
(dd,7,5)
7,79
(s)
_
8,17
(d,7,5)
7,61
(dd,7,5)
7,42
(dd,7,5)
7,58
(d,8,7)
7,67
(d,8,7)
_
8,22
(d,7,5)
7,65
(dd,7,5)
7,46
(dd,7,5)
8,42
(s)
_
8,23
(d,7,5)
7,65
(dd,7,5)
7,46
(dd,7,5)
7,74
(d,8,7)
8,40
(d,8,7)
_
8,28
(d,7,5)
7,79-7,54
(m)
7,49
(dd,7,5)
7,79-7,54
(m)
_
8,27
(d,7,5)
7,57
(dd,7,5)
7,52
(dd,7,5)
7,71
(d,8,1)
7,70
(dd,8,1)
_
7,93
(d,7,5)
7,50-7,31
(m)
7,17
(dd,7,5)
7,57
(s)
_
8,16
(d,7,5)
7,59
(dd,7,5)
7,40
(dd,7,5)
7,50
(d,8,7)
7,78
(d,8,7)
_
4`
7,86-7,45(m)
2``
7,86-7,45(m)
3``
7,86-7,45(m)
4``
7,86-7,45(m)
5``
7,86-7,45(m)
6``
7,86-7,45(m)
CO2H
-
7,66-7,61
(m)
7,66-7,61
(m)
7,66-7,61
(m)
-
N-H
10,78(s)
7,56
(d,8,7)
7,28
(d,8,7)
-
7,44-7,32
(m)
7,44-7,32
(m)
7,44-7,32
(m)
-
7,61-7,40
(m)
7,61-7,40
(m)
-
7,74-7,62
(m)
7,74-7,62
(m)
7,74-7,62
(m)
-
7,67
(d,8,7)
7,58
(d,8,7)
-
8,35
(d,8,7)
7,88
(d,8,7)
8,03
(d,8,7)
-
8,40
(d,8,7)
7,74
(d,8,7)
-
7,79-7,54
(m)
7,79-7,54
(m)
7,79-7,54
(m)
-
7,70
(dd,8,1)
7,71
(d,8,1)
-
7,50-7,31
(m)
7,50-7,31
(m)
7,50-7,31
(m)
12,90(s)
7,78
(d,8,7)
7,50
(d,8,7)
13,00(s)
10,88(s)
10,77(s)
10,81(s)
10,73(s)
10,92(s)
10,77(s)
10,99(s)
11,01(s)
10,98(s)
10,90(s)
10,57(s)
10,73(s)
Ar-OCH3
3,95(s)
4,02(s)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ar-CH3
-
-
2,21(s)
2,47(s)
-
-
-
-
-
-
-
-
95
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Tese de doutorado
Tabela 15: Dados de RMN 1H (300MHz, DMSO) de 13a-d obtidos por
experimentos de 1D(1H). Deslocamentos químicos (δ) relativos ao TMS.
4``
R1 3``
5``
H
2``
N 1``
6``
3
2N
N
CO2H
4
3a
5
6
N 1 7a N7
1`
6`
13a - R1= 3-CH3
13b - R1= 4-CH3
13c - R1= 5-CH3
13d - R1= 6-CH3
2`
5`
3`
4`
1
H
3
6
2`e 6`
3`e 5`
4`
3``
4``
5``
6``
CO2H
N-H
Ar-CH3
13a
8,86(s)
9,10(s)
8,25(d, 8,0)
7,65(dd, 7,5)
7,46(dd, 7,5)
7,36(d,7,5)
7,77(dd,7,5)
8,35(d,7,5)
11,45(s)
9,51(s)
3,31(s)
13b
8,81(s)
9,08(s)
8,23(d, 8,0)
7,61(dd, 7,5)
7,44(dd, 7,5)
7,95(s)
7,70(d,7,5)
8,43(d,7,5)
11,36(s)
9,46(s)
3,27(s)
13c
8,42(s)
9,07(s)
8,22(d, 8,0)
7,69(dd, 7,5)
7,51(dd, 7,5)
7,90(d,7,5)
7,42(d,7,5)
7,73(s)
11,37(s)
3,56(s)
13d
8,61(s)
9,06(s)
8,26(d, 8,0)
7,63(dd, 7,5)
7,43(dd, 7,5)
7,22(d,7,5)
7,85(dd,7,5)
7,20(d,7,5)
11,65(s)
3,45(s)
96
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Tese de doutorado
Tabela 16: Dados de RMN 13C (75.00 MHz,DMSO) de 12a-m obtidos
por experimentos de 1D(13C). Deslocamentos químicos (δ) relativos ao
TMS.
3``R
1
2``
4``
H
1`` N
5``
3
2N
CO2H
4
6``
3a
5
6
N1
7a
N
7
1`
6`
2`
5`
3`
12a - R1= H
12b - R1= m-OCH3
12c - R1= p-OCH3
12d - R1= m-CH3
12e - R1= p-CH3
12f - R1= m-Cl
12g - R1= p-Cl
12h - R1= m-NO2
12i - R1 = p-NO2
12j - R1 = m-F
12k - R1 = p-F
12l - R1 = m-Br
12m - R1 = p-Br
4`
C
3
3a
4
5
6
7a
1’
2’, 6’
3’, 5’
4’
1’’
12a
135,40
100,02
151,70
105,50
153,10
153,50
114,25
122,25
131,52
129,15
140,23
12b
139,32
101,84
151,19
105,08
153,77
153,05
114,38
122,04
131,31
129,73
140,76
12c
131,32
100,59
151,37
104,19
152,98
152,27
114,19
121,15
128,72
126,14
138,52
12d
138,99
101,46
151,11
104,79
153,36
152,61
124,42
127,89
130,08
129,43
140,03
12e
134,87
100,12
151,35
104,50
153,50
152,86
139,12
121,71
130,73
129,34
139,12
12f
132,99
100,53
148,63
103,27
151,62
150,89
120,13
125,20
130,01
127,77
139,33
12g
131,76
101,47
150,05
104,32
153,01
152,28
121,26
128,54
128,95
128,95
138,44
12h
138,21
102,14
148,85
104,31
152,71
152,02
120,21
126,11
132,08
130,58
148,16
12i
139,57
130,31
148,20
104,97
153,71
153,10
120,30
126,02
133,20
129,91
148,17
12j
134,89
102,39
150,46
105,06
153,63
152,97
115,08
121,94
129,61
126,98
141,40
12k
135,09
102,12
151,67
105,20
153,95
153,25
117,67
122,19
130,23
129,85
139,49
12l
134,48
102,08
150,07
104,79
153,34
152,66
120,50
125,94
130,55
129,60
141,04
12m
132,59
101,51
149,90
104,51
153,00
152,28
115,00
120,03
128,78
126,30
138,49
2’’
126,40
119,66
120,00
126,79
126,64
124,05
126,32
121,32
121,36
121,94
122,19
121,58
120,03
3’’
139,50
161,09
134,27
139,18
137,87
137,26
134,22
140,06
139,41
139,21
136,20
138,89
134,23
4’’
5’’
6’’
CO2H
Ar-OCH3
Ar-CH3
126,90
139,50
126,40
170,20
-
127,06
135,24
113,13
170,64
56,10
-
158,71
128,84
114,00
169,80
55,28
-
128,92
134,88
121,79
170,33
21,30
136,72
137,87
126,64
170,31
21,07
126,18
132,39
120,13
168,40
-
137,93
129,67
121,26
169,67
-
128,72
134,05
120,98
168,27
-
127,31
131,72
120,30
170,48
-
123,32
131,97
114,81
170,41
-
127,19
130,34
117,37
170,74
-
126,63
131,76
120,50
170,04
-
121,25
128,94
115,00
169,70
-
97
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Tese de doutorado
Tabela 17: Dados de RMN 13C (75.00 MHz, DMSO) de 13a-d obtidos
por experimentos de 1D(13C). Deslocamentos químicos (δ) relativos ao
TMS.
4``
R1 3``
5``
H
2``
N 1``
6``
3
2N
N
CO2H
4
3a
5
6
N1
7a
N
7
1`
6`
13a - R1= 3-CH3
13b - R1= 4-CH3
13c - R1= 5-CH3
13d - R1= 6-CH3
2`
5`
3`
4`
C
3
3a
4
5
6
7a
1’
2’, 6’
3’, 5’
4’
2’’
3’’
4’’
5’’
6’’
CO2H
Ar-CH3
13a
134,00
101,50
103,91
152,90
129,00
121,90
126,50
125,00
123,10
137,00
119,50
139,90
170,00
16,90
13b
132,46
100,76
141,50
106,90
150,36
157,82
127,96
122,45
127,43
125,64
112,11
145,40
115,86
143,58
21,50
98
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Tese de doutorado
4.2.3 - Sintese dos 3H-Benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina (14a-m)
e 3H-pirido[2,3-b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina (15a-c).
A metodologia utilizada para obtenção dos derivados 14 e 15,
consiste em uma reação de clorociclização dos derivados ácidos do tipo 12
e 13 utilizando oxicloreto de fósforo, através de método descrito na
literatura64 e pode ser descrito no esquema 17.
Esquema
17:
Reação
De
Obtenção
Benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridinas
dos
(14a-m)
derivados
e
3H-
3H-pirido[2,3-
b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridinas (15a-c).
R1
R1
H
H
N
N
N
N
N
N
13
CO2H
CO2H
N
N
N
12
N
N
N
N
N
N
N
N
Cl
15
R,= 4-CH3, 5-CH3, 6-CH3
N
Cl
14
R 1= H, m,p-OCH3, m,p-CH3, m,p-Cl, m,p-NO2
m,p-F, m,p-Br
Mecanisticamente, este processo resulta do ataque nucleofílico dos
derivados 12a-m e 13c-e, sobre o oxicloreto de fósforo (POCl3), ocorrendo
a formação de um intermediário do sistema 3H-Benzo[b]pirazolo[3,4-h1,6-naftiridina]naftiridina com um grupo carbonila. A seguir ocorre a
99
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Tese de doutorado
cloração pelo ataque nucleofílico do ânion cloreto formado no meio,
obtendo-se os derivados 3H-Benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina 14a-m
e 3H-pirido[2,3-b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridína 15a-c.81 Esquema 18.
ESQUEMA 18: Esquema mecanístico para a reação de obtenção dos
derivados 3H-Benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina (14a-m) e 3Hpirido[2,3-b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina (15a-c).
Ciclização
H
N
O
O
H
O
N
O
OPCl 2
N
+
N
N
OPCl 2
N
H
N
N
NH
-HCl
+ POCl3
OH
N
N
HCl
O
N
+
-HCl2PO2
H
H
N
N
O
O+
+
N
N
N
N
N
+
H
N
N
Cl-
H
H
N
-HCl
O
N
N
O
N
N
N
N
100
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Tese de doutorado
Cloração
H
H +
N
N
O
N
N
+ POCl3
N
-HCl
O
N
N
N
H
N
Cl-
Cl
N
PCl2
O
N
O
N
PCl2
O
N
OH
N
N
N
N
+
-
HCl2PO2
+
Cl
N
N
N
Os derivados tetracíclicos foram obtidos, após recristalização em
etanol, com rendimento variando de 50-70% e identificados por ponto de
fusão, IV, principalmente pelo desaparecimento da absorção característica
do grupamento (O-H). Os principais dados obtidos para o derivado (14a-m
e 15a-c). estão descritos na tabela 17.
101
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Tese de doutorado
TABELA 18: Rendimentos, pontos de fusão e principais dados de
Infra-Vermelho
dos
derivados
3H-Benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-
naftiridina (14a-m) e 3H-pirido[2,3-b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina
(15a-c).
Substância
14a
R2
H
Rend. (%)
70
PF (0C)
258-9
14b
m-OCH3
65
>300
14c
p-OCH3
70
>300
14d
m-CH3
65
>300
14e
p-CH3
69
> 300
14f
m-Cl
60
>300
14g
p-Cl
68
>300
14h
m-NO2
60
>300
14i
p-NO2
60
280
14j
m-F
60
275
14k
p-F
60
278
14l
m-Br
60
>300
14m
p-Br
60
>300
15a
4-CH3
60
230
15b
5-CH3
60
255
15c
6-CH3
50
247
IV(cm-1)
3084(νC-H); 1596 e
1502(νC=C e νC=N)
3083(νC-H); 1595 e
1504(νC=C e νC=N)
3084(νC-H); 1597 e
1503(νC=C e νC=N)
3083(νC-H); 1595 e
1503(νC=C e νC=N)
3084(νC-H); 1590 e
1503(νC=C e νC=N)
3082(νC-H); 1598 e
1503(νC=C e νC=N)
3084(νC-H); 1598 e
1503(νC=C e νC=N)
3084(νC-H); 1596 e
1503(νC=C e νC=N)
3100(νC-H); 1592 e
1500(νC=C e νC=N)
3100(νC-H); 1600 e
1503(νC=C e νC=N)
3051(νC-H); 1598 e
1503(νC=C e νC=N)
3052(νC-H); 1593 e
1503(νC=C e νC=N)
3085(νC-H); 1596 e
1501(νC=C e νC=N)
3084(νC-H); 1596 e
1502(νC=C e νC=N)
3084(νC-H); 1596 e
1502(νC=C e νC=N)
3084(νC-H); 1595 e
1503(νC=C e νC=N)
102
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Tese de doutorado
Nos espectros de massas pôde-se confirmar a formação dos produtos
com o aparecimento do íon molecular para os derivados 14a, 14b, 14c, 14f,
14h, 14k, 14l.
Nos espectros de RMN-1H destes produtos, os assinalamentos dos
hidrogênios
foram
efetuados
levando-se
em
consideração
as
multiplicidades dos sinais, constantes de acoplamento e integrações. As
tabelas 18 e 19 mostram os assinalamentos dos átomos de hidrogênio
destas substâncias. Para os derivados do tipo 14, destacam-se os sinais
singletos em torno de 9,00 e 9,40ppm , referentes aos hidrogênios H1 e H5 ,
respectivamente. Para os derivados 14b e 14c foram observados um
singleto, em torno de 4,00ppm referentes aos hidrogênios do grupo OCH3
do anel aromático e para os derivados 14d e 14e foram observados um
singleto, em torno de 2,40ppm, referentes aos hidrogênios do grupo CH3 do
anel aromático. Para todos os derivados foram observados um dubleto
referentes aos hidrogênios H2`,6`, em torno de 8,35 ppm. Para os derivados
14a, 14e, 14g, 14h, 14i, 14j e 14k, foram observados ainda um
duplodubleto em torno de 7,50ppm, referente ao hidrogênio H4`. Para os
derivados 14b, 14c, 14d, 14f, 14l e 14m este hidrogênio não pôde ser
evidenciado, pois ocorre a formação de um multipleto. Para os derivados
14a, 14g, 14h, 14i, 14j e 14k foram observados um duplodubleto, em torno
de 7,70ppm, referentes aos hidrogênios H3’,5’. Para os derivados 12a, 12e,
12f, 12j e 12l, os sinais não pôdem ser evidenciados, pois ocorre a
formação de um multipleto. O hidrogênio H10 , foi identificado como
singleto, em
8,84, 8,45 e 8,09ppm para os derivados 14h, 14j e 14l
respectivamente, como dubleto, em 8,40, 7,92, 7,89, 8,01 e 8,03ppm para
os derivados 14a, 14e, 14g, 14i e 14k, respectivamente. Para os derivados
14b, 14c, 14d, 14f, 14m este hidrogênio não pôde ser evidenciado, pois
houve a formação de um multipleto. O hidrogênio H9 , foi identificado
103
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Tese de doutorado
como duplodubleto, em 7,95ppm para o derivado 14a, como dubleto, em
7,84, 7,89, 8,95 e 8,03ppm para os derivados 14e, 14g, 14i e 14k,
respectivamente. Para os derivados 14c e 14m este hidrogênio não pôde ser
evidenciado, pois houve a formação de um multipleto. O hidrogênio H8 ,
foi identificado como duplodubleto, em 7,70ppm para o derivado 14a,
como dubleto, em 8,05ppm para o derivado 14h. Para os derivados 14b,
14d, 14f, 14j e 14l este hidrogênio não pôde ser evidenciado pois houve a
formação de um multipleto. O hidrogênio H7 , foi identificado como
singleto, em 8,24, 8,22, 8,02, 8,60ppm para os derivados 14e, 14g, 14h e
14i, respectivamente como dubletos, em 7,81, 9,02, 8,02 e 8,42ppm para os
derivados 14a, 14j, 14k e 14m, respectivamente. Para os derivados 14b,
14c, 14d, 14f, 14m este hidrogênio não pôde ser evidenciado, pois houve a
formação de um multipleto.
Para os derivados do tipo 15, destacam-se os sinais singletos em
torno de 8,80 e 9,40ppm, referentes aos hidrogênios H1 e H5 ,
respectivamente. Os hidrogênios H2’
e 6’
foram identificado como dubleto
em 8,26, 8,42 e 8,39ppm, para os derivados 15a, 15b e 15c,
respectivamente. Os hidrogênios H3’
e
5’
foram identificados como
duplodubletos em 7,68, 7,78 e 7,75ppm, para os derivados 15a, 15b e 15c,
respectivamente. O hidrogênio H4’ foi identificado como duplodubleto em
7,50, 7,59 e 7,56ppm, para os derivados 15a, 15b e 15c, respectivamente.
O hidrogênio H7 foi identificado como singleto em 7,91ppm para o
derivado 15b, e como dubleto em 7,93ppm para o derivado 15c. O
hidrogênio H8 foi identificado como dubleto em 7,68 e 7,76ppm para os
derivados 15a e 15c. O hidrogênio H9 foi identificado como dubleto em
8,26ppm para o derivado 15a, e como singleto, em 8,92ppm para o
derivado 15b. Todos os derivados apresentaram um sinal singleto em torno
de 1,40ppm referente ao grupamento CH3 ligado ao anel aromático.
104
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Tese de doutorado
O espectro bidimencional de correlação heteronuclear (1Hx13CHETCOR-nJCH, n=1), associado às informações obtidas através da técnica
APT permitiram a identificação dos carbonos para os derivados do tipo 14,
destacando um sinal em torno de 148ppm referente ao carbono C3a e o sinal
em torno de 151,00ppm referente ao carbono C5. Para os derivados 14a,
14b, 14c e 14e, foram observados os sinais em torno de 137,00 e 116ppm,
referente aos carbonos C1 e C6a, respectivamente. Pôde-se ainda identificar
para os derivados 14a, 14b, 14c e 14e, os carbonos C2’
122ppm os carbonos C3’
e 5’
e 6’
em torno de
em torno de 128ppm e os carbonos C4’ em
torno de 125ppm. O carbono C1’ apresentou deslocamento químico em
torno de 143ppm, para os derivados 14a, 14b e 14e. O carbono C10a
apresentou deslocamento químico em torno de 145,00ppm, para todos os
derivados e o carbono C11b deslocamento químico em torno de 108ppm
para os derivados 14a e 14d. Para os derivados 14b e 14c este carbono
apresentou deslocamento químico em torno de 101ppm. Os derivados 14b
e14c, apresentaram um sinal em torno de 56ppm, referente ao carbono do
grupo Ar-OCH3. O derivado 14d, apresentou um sinal em 21,90ppm
referente ao carbono do grupo Ar-CH3. Os derivado 14e-14m, não tiveram
seus espectros realizados devido dificuldade de solubilidade.
O espectro bidimencional de correlação heteronuclear (1Hx13CHETCOR-nJCH, n=1), associado às informações obtidas através da técnica
APT permitiram a identificação dos carbonos para os derivados do tipo 15,
destacando um sinal em torno de 161ppm, referente ao carbono C9 e o sinal
em torno de 151,00ppm referente ao carbono C3a e ainda um em sinal em
torno de 153ppm, referente ao carbono C5. Foram observados também, os
sinais em torno de 137,00 e 117ppm, referentes aos carbonos C1 e C6a,
respectivamente. Pôde-se identificar para os carbonos C2’
123ppm os carbonos C3’
e 5’
e 6’
em torno de
em torno de 128ppm e os carbonos C4’ em
torno de 125ppm. O carbono C1’ apresentou deslocamento químico em
105
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Tese de doutorado
torno de 143ppm. O carbono C10a apresentou deslocamento químico em
torno de 150,00ppm, e o carbono C11b deslocamento químico em torno de
107ppm. O derivado 15c, apresentou um sinal em 23,39ppm referente ao
carbono do grupo Ar-CH3. Os derivado 15a e 15b, não tiveram seus
espectros realizados devido a dificuldade de solubilidade.
106
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Tese de doutorado
Tabela 19: Dados de RMN 1H (300MHz, DMSO) de 14a-m obtidos por
experimentos de 1D(1H). Deslocamentos químicos (δ) relativos ao TMS.
1
10
R1
11
10a
N
11b
N2
N
11a
9
3a
8
6a
6
7
3`
1`
3
4`
6`
N4
5a
2`
5`
5
Cl
1
H
1
14a
14b
14c
14d
14e
14f
14g
14h
14i
14j
14k
14l
14m
8,92(s)
8,99(s)
8,96(s)
8,99(s)
9,11(s)
9,08(s)
8,97(s)
8,92 (s)
9,01(s)
9,34(s)
9,06(s)
9,05(s)
8,95(s)
7,877,55(m)
7,877,55(m)
7,797,57(m)
7,92
(d;8,4)
7,84
(d;8,4)
7,997,53(m)
7,89
(d;8,1)
7,89
(d;8,1)
8,40(d)
1H(8,1)
7,95
(dd;8,1)
7,70
(dd;8,1)
7,81
(d;8,1)
7,787,56(m)
7,787,56(m)
7,877,55(m)
7,797,57(m)
7,797,57(m)
9,40(s)
9,36 (s)
9,45 (s)
9,42 (s)
9,44 (s)
8,33
(d;7,5)
7,50
(dd;7,5)
7,52
(dd;7,5)
8,31
(d;8,0)
7,787,56(m)
7,787,56(m)
8,38
(d;8,7)
7,877,55(m)
7,877,55(m)
8,40
(d;8,4)
7,797,57(m)
7,797,57(m)
8,41
(d;8,4)
7,58
(dd;7,8)
7,77
(dd;7,8)
Ar-OCH3
-
4,07(s)
3,99(s)
-
Ar-CH3
-
-
-
1,39(s)
10
9
8
7
5
2`e 6`
4’
3`e 5`
14a - R1= H
14b - R1= m-OCH3
14c - R1= p-OCH3
14d - R1= m-CH3
14e - R1= p-CH3
14f - R1= m-Cl
14g - R1= p-Cl
14h - R1= m-NO2
14i - R1 = p-NO2
14j - R1 = m-F
14k - R1 = p-F
14l - R1 = m-Br
14m - R1 = p-Br
7,26(s)
-
-
-
8,24(s)
7,997,53(m)
7,997,53(m)
-
8,84(s)
8,05
(d;7,5)
8,01
(d;8,1)
8,95
(d;8,1)
-
8,45(s)
7,837,62(m)
9,02
(d;8,4)
8,03
(d;7,5)
8,03
(d;7,5)
8,09(s)
-
7,927,52(m)
7,927,52(m)
8,02
(d;8,4)
7,907,50(m)
7,907,50(m)
8,42
(d;8,4)
-
-
8,22(s)
8,02(s)
8,60(s)
9,38 (s)
9,31 (s)
9,40 (s)
9,31 (s)
9,49 (s)
9,37 (s)
9,30 (s)
9,40 (s)
8,41
(d;8,4)
7,997,53(m)
7,997,53(m)
8,27
(d;8,1)
7,46
(dd;7,5)
7,65
(dd;7,5)
8,31
(d;7,5)
7,52
(dd;7,5)
7,71
(dd;7,5)
8,25
(d;7,5)
7,46
(dd;7,5)
7,66
(dd;7,5)
8,20
(d;7,5)
7,25
(dd;7,5)
7,41
(dd;7,5)
8,32
(d;7,5)
7,51
(dd;7,5)
7,69
(dd;7,5)
8,30
(d;7,5)
7,907,50(m)
7,907,50(m)
8,30
(d;7,5)
7,927,52(m)
7,927,52(m)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
1,38(s)
-
-
-
-
-
-
-
-
107
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Tese de doutorado
Tabela 20: Dados de RMN 1H (300MHz, CDCl3) de 15a-c obtidos por
experimentos de 1D(1H). Deslocamentos químicos (δ) relativos ao TMS.
1
11
10
N
R1
10a
N
N2
11b
N
11a
9
3a
8
6a
7
6
N4
5a
2`
3`
1`
3
4`
6`
5`
15a - R1= 4-CH3
15b - R1= 5-CH3
15c - R1= 6-CH3
5
Cl
1
H
1
10
9
8
7
5
2`e 6`
4’
3`e 5`
Ar-CH3
15a
8,72 (s)
8,26 (d, 7,5)
7,68 (d, 7,5)
9,44 (s)
8,26 (dd, 7,5)
7,50 (dd, 7,5)
7,68 (dd, 7,5)
1,37 (s)
15b
8,72 (s)
8,92 (d, 7,5)
7,91 (s)
9,58 (s)
8,42 (d, 7,5)
7,59 (dd, 7,5)
7,78 (dd, 7,5)
1,42 (s)
15c
8,83 (s)
7,67 (d, 7.5)
7,93 (d, 7.5))
9,41 (s)
8,39 (d, 7.5)
7,56 (dd, 7.5)
7,75 (dd, 7.5)
1,39 (s)
108
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Tese de doutorado
13
Tabela 21: Dados de RMN
C (75.00 MHz,DMSO) de 14a-m obtidos
por experimentos de 1D(13C). Deslocamentos químicos (δ) relativos ao
TMS.
1
10
R1
11
10a
N
11b
N2
N
11a
9
3a
8
6a
7
6
5
Cl
C
1
3a
5
5a
6
6a
7
8
9
10
10a
11a
11b
1’
2’, 6’
3’, 5’
4’
Ar-OCH3
Ar-CH3
14a
138,89
148,92
151,16
123,05
150,77
115,79
126,45
126,38
132,20
129,38
145,52
146,15
107,97
143,84
121,95
128,93
124,67
-
3`
1`
3
N4
5a
2`
14b
139,10
148,00
151,02
124,50
127,20
158,10
145,30
100,6
143,55
122,14
128,90
126,40
55,70
-
4`
6`
5`
14a - R1= H
14b - R1= m-OCH3
14c - R1= p-OCH3
14d - R1= m-CH3
14e - R1= p-CH3
14f - R1= m-Cl
14g - R1= p-Cl
14h - R1= m-NO2
14i - R1 = p-NO2
14j - R1 = m-F
14k - R1 = p-F
14l - R1 = m-Br
14m - R1 = p-Br
14c
131,21
148,01
151,02
124,48
157,50
116,31
127,23
158,07
139,07
145,33
100,60
122,14
128,99
126,43
55,67
-
14d
135,10
149,05
151,10
150,50
116,10
126,45
137,10
129,10
145,00
146,00
108,10
143,10
121,98
128,90
123,20
21,90
109
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Tese de doutorado
Tabela 22: Dados de RMN
13
C (75.00 MHz,DMSO) de 15a-c obtidos
por experimentos de 1D(13C). Deslocamentos químicos (δ) relativos ao
TMS.
1
11
10
N
R1
10a
N
11b
N2
N
11a
9
3a
8
6a
7
6
N4
5a
2`
3`
1`
3
4`
6`
5`
15a - R1= 4-CH3
15b - R1= 5-CH3
15c - R1= 6-CH3
5
Cl
C
1
3a
5
5a
6
6a
7
8
9
10a
11a
11b
1’
2’, 6’
3’, 5’
4’
Ar-CH3
15c
137,29
151,54
153,89
119,50
117,13
138,46
121,00
161,50
150,72
143,86
107,58
133,44
123,79
128,29
125,88
23,39
110
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Tese de doutorado
4.3 - Tentativa de ciclização por reação em Microondas:
A tentativa de ciclização utilizando microondas doméstico (potência
máxima) foi realizada utilizando como matéria–prima um derivado do tipo
10 variando o tempo de reação até ser observado o consumo do reagente e
formação do produto, o que foi observado com 15 minutos de reação.
Esquema 19.
Esquema
19:
Tentativa
de
Obtenção
Benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridinas
do
(14),
por
sistema
3H-
Microondas
doméstico ( potência máxima).
H3C
N
H
N
N
N
N
Microondas
N
Cl
H
CO2Et
H3C
Microondas
N
N
N
N
15 minutos
H3C
N
N
N
16
Após a análise dos resultados obtidos, pode-se verificar que não
ocorreu a ciclização e sim uma descarboxilação obtendo-se o 4-fenilamino3-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina. Este resultado pôde ser evidenciado
pelos espectros de FT-IV e RMN 1H.
No espectro de FT-IV observou-se o desaparecimento, da absorção
referente a carbonila em 1680 cm-1, do grupo carboetoxi. O rendimento do
descarboxilado não foi otimizado pois o objetivo era a ciclização e não a
descarboxilação. Tabela 23.
111
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Tese de doutorado
Tabela 23: Rendimento, ponto de fusão e principais dados de infravermelho do produto descarboxilado.
Subst.
16
R1
H
Rend(%)
47
IV(cm-1)
3271(νNH); 1579 e
PF
1495(νC=C e νC=N)
No espectro de RMN-1H deste produto, os assinalamentos dos
hidrogênios
foram
efetuados
levando-se
em
consideração,
as
multiplicidades dos sinais, constantes de acoplamento e integrações. A
tabela 24 mostra os assinalamentos dos átomos de hidrogênio desta
substância. Pode-se destacar os sinais dubletos em 6.65 e 8.25ppm,
referente aos hidrogênios H5 e H6 , respectivamente.
Tabela 24: Dados de
1
H (300MHz, CDCl3) de 16 obtidos por
experimentos de 1D(1H). Deslocamentos químicos (δ) relativos ao TMS.
3``
2``
4``
H
1``
5``
H3C
6``
4
5
3a
3
2
N
6
N
N
7a
N
1
7
1`
6`
2`
5`
3`
4`
1
H
CH3-N
5
6
2`e 6`
3`e 5`
4`
2``
3``
4``
5``
6``
N-H
12a
1.23(s)
6.65(d; 9.0)
8.25(d; 9.0)
8,23(d, 8.1)
7,60-7,20(m)
7,60-7,20(m)
7,60-7,20(m)
7,60-7,20(m)
7,60-7,20(m)
7,60-7,20(m)
7,60-7,20(m)
9.90(s)
112
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Tese de doutorado
4.4 - RESULTADOS DE ATIVIDADE ANTIVIRAL
Os testes de atividade antviral (HSV-1 e HIV-1) foram realizados em
um projeto de cooperação entre o laboratório de síntese de heterociclos
(LASINTHET) sob a orientação da Dra. Alice Maria R. Bernardino, e o
laboratório de biologia celular e molecular, sob orientação da Dra: Izabel
C.P.P. Frugulhetti. Foram feitos estudos dos efeitos dos novos compostos
na replicação do vírus HSV - 1 em culturas de células VERO ( rim de
macaco verde africano). O efeito citotóxico dos derivados do novo sistema
foi avaliado através de análises morfólogicas e moleculares da célula
hospedeira.
Os testes de atividade antiviral (Vírus Mayaro e Estomatite Vesicular),
foram realizados em um projeto de cooperação entre o laboratório de
síntese de heterociclos (LASINTHET) sob a orientação da Dra. Alice Maria
R. Bernardino, e o laboratório de Virolologia Molecular II da UFRJ,
através do Dr. Moacyr Alcoforado Rebello.
4.4.1 - AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-HSV-1 DOS
DERIVADOS 10a-m, 11a-e, 12a-m, 13a-d e 14a-m e 15a-c.
Células
As novas substâncias sintetizadas foram testadas utilizando-se
células VERO crescidas em meio DMEN suplementado com 2% de soro
fetal bovino e 8% de soro bovino. As células foram infectadas com HSV-1,
e mantidas por 1h à 370C, em atmosfera de 5% de CO2. Após adsorção o
inóculo viral foi desprezado e substituído por meio DMEN, contendo ou
não os novos derivados. Após 72h o título viral foi determinado, segundo o
método de Reed δ Muench83.
113
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Tese de doutorado
Citotoxicidade Dos Compostos
Para determinarmos a citotoxicidade dos compostos utilizamos a
metodologia de exclusão do corante viral azul de Trypan, foi realizada uma
triagem dos compostos na concentração inicial de 700µM. Em seguida, foi
determinado os valores de CC-50 para os compostos mais promissores.
Pôde-se destacar os compostos 10h, 14j, 12k, 11d, 11e, como promissores,
sendo os 10h, 11d e 11e os monos citotóxicos, apresentando valores de
CC-50, aproximadamente de 1000µM. Comparando com o aciclovir
(ACV), CC-50 de 850µM, percebemos que os compostos apresentam
resultados excelentes.
Inibição Do Efeito Citopático Viral
Para realizarmos a triagem da atividade antiviral dos compostos
utilizamos metodologia de Reed & Munch. A concentração utilizada foi de
50µM. (tabelas 25, 26 e 27).
114
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Tese de doutorado
Tabela 25: Efeito dos compostos 10a-m e 11a-e sobre a viabilidade
celular e inibição do efeito citopático.
R1
H
N
N
N
CO2Et
N
Substâncias
10a
10b
10c
10d
10e
10f
10g
10h
10i
10j
10k
10l
10m
11a
11b
11b
11c
11d
10a - R1= H
10b - R1= m-OCH3
10c - R1= p-OCH3
10d - R1= m-CH3
10e - R1= p-CH 3
10f - R1= m-Cl
10g - R1= p-Cl
10h - R1= m-NO 2
10i - R1 = p-NO 2
10j - R1 = m-F
10k - R1 = p-F
10l - R1 = m-Br
10m - R1 = p-Br
R1
H
N
N
N
% de inibição do efeito
citopático
90,0
98,0
75,5
90,0
69,2
60,0
92,0
90,0
0,0
0,0
ND
70,0
75,0
ND
ND
60,0
90,0
90,0
N
CO2Et
11a - R1= H
11b - R1= 3-CH3
11c - R1= 4-CH3
11d - R1= 5-CH3
11e - R1= 6-CH3
N
Viabilidade celular (%)
97,0
85,0
100,0
87,0
96,0
86,0
100,0
99,0
100,0
100,0
ND
100,0
100,0
ND
ND
100,0
100,0
100,0
115
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Tese de doutorado
Tabela 26: Efeito dos compostos 12a-m e 13a-d sobre a viabilidade
celular e inibição do efeito citopático.
R1
H
N
N
N
CO2H
N
Substâncias
12a
12b
12c
12d
12e
12f
12g
12h
12i
12j
12k
12l
12m
13a
13b
13c
13d
12a - R1= H
12b - R1= m-OCH3
12c - R1= p-OCH3
12d - R1= m-CH3
12e - R1= p-CH3
12f - R1= m-Cl
12g - R1= p-Cl
12h - R1= m-NO2
12i - R1 = p-NO2
12j - R1 = m-F
12k - R1 = p-F
12l - R1 = m-Br
12m - R1 = p-Br
R1
H
N
N
N
% de inibição do
efeito citopático
0,0
75,5
80,6
38,5
58,4
68,0
68,0
20,6
80,0
68,0
ND
84,0
37,0
ND
75,0
60,0
21,0
N
CO2H
N
13a - R1= 3-CH 3
13b - R1= 4-CH3
13c - R1= 5-CH 3
13d - R1= 6-CH3
Viabilidade celular
(%)
91,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
88,0
100,0
100,0
ND
100,0
92,0
ND
100,0
100,0
100,0
116
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Tese de doutorado
Tabela 27: Efeito dos compostos 14a-m e 15a-c sobre a viabilidade
celular e inibição do efeito citopático.
N
N
N
R1
N
Cl
Substâncias
14a
14b
14c
14d
14e
14f
14g
14h
14i
14j
14k
14l
14m
15a
15b
15c
14a - R1= H
14b - R1= m-OCH3
14c - R1= p-OCH3
14d - R1= m-CH3
14e - R1= p-CH3
14f - R1= m-Cl
14g - R1= p-Cl
14h - R1= m-NO2
14i - R1 = p-NO2
14j - R1 = m-F
14k - R1 = p-F
14l - R1 = m-Br
14m - R1 = p-Br
N
N
R1
% de inibição do
efeito citopático
20,6
50,0
80,0
68,0
75,0
80,0
60,0
80,0
87,0
91,0
65,0
30,0
30,0
11,0
ND
65,0
N
N
N
Cl
15a - R1= 4-CH3
15b - R1= 5-CH3
15c - R1= 6-CH3
Viabilidade celular
(%)
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
95,0
100,0
100,0
100,0
97,0
ND
89,0
117
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Tese de doutorado
Efeito Das Drogas Na Inibição Do Crescimento Viral .
Para determinação da concentração dos compostos capazes de inibir
em 50% a produção de partículas virais, o vírus foi crescido na presença de
diferentes concentrações dos compostos. Os compostos mais promissores
foram 10h, 11d, 11e, 12k e 14j. (Tabela 26). Alguns destes compostos
apresentaram índice de seletividade maior que o ACV (860µM).
Tabela 28: Valores de EC-50 E CC-50 dos compostos 10h, 11d, 11e,
12k e 14j.
O2N
H
N
N
H
H
CO2Et
N
N
N
N
N
10h
H3C
N
CO 2Et
N
H3C
N
N
11e
H
N
N
N
CO2Et
N
N
11d
F
N
N
CO 2H
F
N
N
N
N
Cl
14j
12k
Substâncias
10h
11d
11e
12k
14j
CC-50(µM)
1000
1000
1000
600
600
EC-50(µM)
6,78
0,01
0,1
2,2
0,07
SI
141,4
100000
10000
272,4
8571
118
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Tese de doutorado
Infecção Curso-Temporal
Para este experimento foram escolhidas as substâncias 11d, 11e e 14j,
por apresentarem maiores valores de SI. Foi possível avaliar em qual
momento do ciclo replicativo viral as moléculas podem estar atuando. Para
isso as células VERO foram infectadas durante diferentes momentos da
replicação viral, a saber, adsorção, penetração, 0-3 h.p.i, 3-6 h.p.i e 620h.p.i. Foi observado que as substâncias 11d e 11e inibiram,
significamente, a adsorção viral, no entanto o derivado 14j, parece atuar em
duas etapas distintas da replicação viral, provavelmente na fase alfa ( 0-3
h.p.i.) e na fase gama ( 6-20 h.p.i.). figura 12.
Figura: 12 – Infecção curso temporal
Infectado
11d
11e
14j
119
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Tese de doutorado
4.4.2 - AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL PARA OS
DERIVADOS
(14a-m),
FRENTE
a
ENZIMA
TRANSCRIPTASE REVERSA (HIV-1).
A enzima transcriptase reversa foi obtida através da transformação
da E. coli DH5α com plasmídeo pUC 12N como descrito na metodologia.
Através da análise da atividade enzimática foi observado o efeito dos
diferentes derivados em uma concentração de 50µM das mesmas.
TABELA 29: efeito dos derivados 14a-m frente a inibição da atividade
da enzima Transcriptase Reversa.
N
N
N
R1
N
Cl
Compostos
R1
AZT
14a
14b
14c
14d
14e
14f
14g
14h
14i
14j
14k
14l
14m
H
m-OCH3
p-OCH3
m-CH3
p-CH3
m-Cl
p-Cl
m-NO2
p-NO2
m-F
p-F
m-Br
p-Br
14a - R1= H
14b - R1= m-OCH3
14c - R1= p-OCH3
14d - R1= m-CH3
14e - R1= p-CH3
14f - R1= m-Cl
14g - R1= p-Cl
14h - R1= m-NO2
14i - R1 = p-NO2
14j - R1 = m-F
14k - R1 = p-F
14l - R1 = m-Br
14m - R1 = p-Br
Enzima Transcriptase Reversa
(% de inibição de vírus - 50µM)
97,38
12,31
22,23
41,55
33,52
43,70
25,64
33,26
-
Os derivados que apresentaram melhores resultados foram 14d e
14h, quando comparados com o AZT.
120
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Tese de doutorado
4.4.3 - EFEITO DOS DERIVADOS FRENTE À REPLICAÇÃO DO
VÍRUS MAYARO
A replicação viral foi analizada em células VERO na presença de
concentrações diferentes dos compostos 12a e 12e. Foi avaliado ainda a
citotoxicidade (CC-50) e a concentração dos compostos que inibem 50% a
replicação viral. Tabela 30.
Tabela 30: Efeito citotóxico (CC-50), concentração que inibe 50% de
crescimento viral e Índice de seletividade(SI).
H
R
N
N
N
CO2H
N
12a - R1= H
12e - R1= p-CH3
Substâncias
CC-50
Concentração que inibe
SI
50% a replicação viral.
12a
135,81
4,8
28
12f
37,4
0,52
71
Após este estudo, foi analisado o efeito do derivado 12a e 12f na
replicação do vírus Mayaro, onde pôde-se observar que a atividade antiviral
é dose-dependente, e que para o derivado 12a e 12f, nas doses acima de
10µM e 1,0µM, respectivamente, a inibição é superior a 90%. Figuras 13 e
14.
121
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Tese de doutorado
Figura 13: Efeito do derivado 12a sobre a replicação do vírus Mayaro
em células VERO.
H
N
N
N
CO2H
N
122
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Tese de doutorado
Figura 14: Efeito do derivado 12f sobre a replicação do vírus Mayaro
em células VERO.
H
N
CO2H
Cl
N
N
N
Foi analisada a síntese de proteínas em células VERO tratadas com o
derivado 12f e infectadas com o vírus Mayaro. Pode-se verificar que o
tratamento com o composto não oferece inibição significativa da síntese de
proteínas celulares. Nas células infectadas, observamos uma inibição da
síntese das proteínas celulares provocada pela infecção viral. Pode-se
observar também que o tratamento inibiu a síntese da proteína de capsídeo
viral (p32).
123
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Tese de doutorado
4.1.1 - OUTROS RESULTADOS DE ATIVIDADE BIOLÓGICA
AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DO VÍRUS DA
ESTOMATITE VESICULAR
Foram realizados testes de avaliação da atividade antiviral, frente ao
vírus da estomatite vesicular. Os derivados testados foram os 12c, 12e, 12g,
12h, 12i, 12l, 12m, 14f e 14g. Os resultados estão descritos na tabela 31.
Tabela 31: Efeito citotóxico (CC-50), concentração que inibe 50% de
crescimento viral e Índice de seletividade(SI).
H
R
N
N
N
Substâncias
CC-50
CO2H
N
N
12a - R1 = H
12b - R1= m-OCH3
12c - R1 = p-OCH3
12e - R1 = p-CH3
12g - R1= p-Cl
12h - R1= m-NO2
12i - R1 = p-NO2
12l - R1 = m-Br
12m - R1 = p-Br
R1
N
N
N
Cl
14f - R1= m-Cl
14g - R1 = p-Cl
Concentração que inibe 50% a
SI
replicação viral.
12c
172,8
Negativo
-
12e
19,3
15,0
1,3
12g
126,6
12,5
10,1
12h
34,6
Negativo
-
12i
13,2
Negativo
-
12l
14,5
1,3
11,3
12m
34,9
3,5
10,0
14f
245,8
Negativo
-
14g
346,3
20,0
17,3
A substância 14g foi a que apresentou maior índice de seletividade
(SI) podendo ser alvo de futuros estudos sobre a inibição da replicação
deste vírus.
124
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Tese de doutorado
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
Durante a realização deste trabalho, ocorreu a possibilidade de um
projeto de cooperação entre o laboratório de síntese de heterociclos
(LASINTHET) sob a orientação da Dra. Alice Maria R. Bernardino, e o
Laboratório de Bioquímica e Modelagem Molecular (LaBioMol), sob
orientação da Dra: Helena Carlos Castro. Foram feitos estudos dos efeitos
dos derivados ácidos sobre o crecimento de cepas resistentes, gram positivo
e negativo, de pacientes do Hospital Universitário Antônio Pedro.
125
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Tese de doutorado
As substâncias 12b, 12d, 12i e 12k, apresentaram halo de inibição de
16, 64, 16 e 16mm contra a cepa de Staphilococcus aureus 8148. Este halo
nos orienta para continuação em testes posteriores, pois o diâmetro de halo
considerado como significativo pela literatura é de ≥ 16mm. A tabela 32 .
Tabela 32: Resultados de atividade antimicrobiana para os derivados
(12a-m).
Substãncias
R1
Staphylococcus epidermidis (µg/mL)
12a
H
-
12b
m-OCH3
16
12c
p-OCH3
-
12d
m-CH3
64
12e
p-CH3
-
12f
m-Cl
-
12g
p-Cl
-
12h
m-NO2
-
12i
p-NO2
-
12j
m-F
16
12k
p-F
-
12l
m-Br
16
12m
p-Br
-
126
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Tese de doutorado
5 – Conclusões
127
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Tese de doutorado
5 – CONCLUSÕES:
Foram sintetizados 18 derivados ésteres do tipo 10a-m e 11a-e
propostos para o trabalho, sendo 14 destes novos derivados (10b, 10d, 10f,
10h, 10i, 10j, 10k, 10l, 10m, 11a, 11b, 11c, 11d e 11e).
R1
R1
H
H
N
N
CO2Et
N
N
10a - R1= H
10b - R1= m-OCH3
10c - R1= p-OCH3
10d - R1= m-CH3
10e - R1= p-CH3
10f - R1= m-Cl
10g - R1= p-Cl
10h - R1= m-NO2
10i - R1 = p-NO2
10j - R1 = m-F
10k - R1 = p-F
10l - R1 = m-Br
10m - R1 = p-Br
N
N
N
CO2Et
N
N
11a - R1= H
11b - R1= 3-CH3
11c - R1= 4-CH3
11d - R1= 5-CH3
11e - R1= 6-CH3
Foram sintetizados 17 derivados ácidos do tipo 12a-m e 4 do tipo
13a-m, sendo 13 destes novos (12b, 12d, 12f, 12h, 12i, 12j, 12k, 12l, 12m,
13a, 13b, 13c e 13e).
R1
R1
H
H
N
N
N
CO2H
N
12a - R1= H
12b - R1= m-OCH3
12c - R1= p-OCH3
12d - R1= m-CH3
12e - R1= p-CH3
12f - R1= m-Cl
12g - R1= p-Cl
12h - R1= m-NO2
12i - R1 = p-NO2
12j - R1 = m-F
12k - R1 = p-F
12l - R1 = m-Br
12m - R1 = p-Br
N
N
N
N
CO2H
N
13a - R1= 3-CH3
13b - R1= 4-CH3
13c - R1= 5-CH3
13d - R1= 6-CH3
128
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Tese de doutorado
Foram sintetizados 13 derivados tetraciclicos do tipo 14a-m, sendo
11 novos (14b, 14e, 14f, 14g, 14h, 14i, 14j, 14k, 14l e 14m
N
N
N
R1
N
Cl
14a - R1= H
14b - R1= m-OCH3
14c - R1= p-OCH3
14d - R1= m-CH3
14e - R1= p-CH3
14f - R1= m-Cl
14g - R1= p-Cl
14h - R1= m-NO2
14i - R1 = p-NO2
14j - R1 = m-F
14k - R1 = p-F
14l - R1 = m-Br
14m - R1 = p-Br
Foi sintetizado um sistema inédito 3H-pirido[2,3-c]pirazolo[3,4-h]-1,6naftiridina e representado por três derivados deste sistema 15a-c.
N
N
R1
N
N
N
15a - R1= 4-CH3
15b - R1= 5-CH3
15c - R1= 6-CH3
Cl
129
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Tese de doutorado
Quanto a atividade anti-HSV-1, foram testadas 51 substâncias.
Destacando os 10h, 11d, 11e, 12k e 14j com baixa citotoxicidade e efeito
citopático elevados, que obtiveram índice de seletividade(SI) 141,4;
100000; 10000; 272,4; 8571, respectivamente. Estes resultados são
excelentes, comparados ao Aciclovir, que apresenta índice de seletividade
800.
H 3C
H
N
CO2Et
O2N
N
N
H
N
N
N
N
H 3C
N
N
CO2Et
N
11e
11d
F
N
N
N
N
10h
H
CO2Et
H
N
CO2H
N
N
N
N
N
N
F
N
Cl
14j
12k
O teste de infecção curso temporal (mecanismo de ação), para os
derivados 11d, 11e e 14j, indica que os derivados 11d e 11e, inibiram
significamente a adsorção viral e o derivado 14j inibiu duas fases do
processo de replicação (fase alfa e gama).
H3C
H
H
N
N
N
CO2Et
H3C
N
CO2Et
N
11e
11d
F
N
N
N
N
N
N
N
N
N
130
Cl
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14j
Tese de doutorado
Foram testados os derivados tetracíclicos 14a-m, quanto à atividade
anti-HIV-1. Comparativamente ao AZT, os derivados que apresentaram
maior inibição foram os 14d e 14h, 41,55 e 43,70%,respectivamente.
H3C
N
N
N
N
N
N
O2N
N
N
Cl
Cl
14h
14d
Quanto à atividade frente ao vírus mayaro, foram testados os
derivados 12a e 12e, que apresentaram, nas concentrações de 10µM e
1,0µM, inibição em torno de 90%, que representa um excelente resultado.
H
N
N
N
12a
H3C
H
N
CO2H
N
N
N
CO2H
N
12e
131
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Tese de doutorado
Os derivados 12c, 12e, 12g, 12h, 12i, 12l, 12m, 14f e 14g foram
testados frente o vírus da estomatite vesicular, destacando o derivado 14g,
que apresentou maior valor de índice de seletividade (SI), podendo ser
considerado um futuro alvo na busca de fármacos que inibem a replicão
deste vírus.
R1
H
N
N
N
CO2H
N
N
12e - R1= p-CH3
12g - R1= p-Cl
12l - R1 = m-Br
12m - R1 = p-Br
N
N
N
Cl
Cl
Foram avaliados a atividade antimicrobiana, para os derivados 12am, sendo os derivados 12b, 12d, 12j e 12l os que apresentaram halo de
inibição > 16mm frente a bactéria Staphylococcus epidermidis, podendo ser
consideradas substâncias com perfil antimicrobiano.
R1
H
N
N
N
CO2H
N
12b - R1= m-OCH3
12d - R1= m-CH3
12j - R1 = m-F
12l - R1 = m-Br
132
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6- EXPERIMENTAL
133
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Tese de doutorado
5 – EXPERIMENTAL
Os solventes e reagentes utilizados neste trabalho foram adquiridos
no comércio e quando necessário foram tratados convenientemente.
Nas análises por cromatografia em camada fina, foram utilizados
cromatofolhas de sílica gel em poliéster com indicador UV (254nm), marca
SIGMA.
Os pontos de fusão foram determinados em aparelho FISATOM –
MODELO – 430D e não foram corrigidos.
Os dados espectrais foram obtidos em espectrofotômetro de IV
marca PERKIM-ELMER FT-IR, de feixe duplo, em pastilhas de KBr
anidro. Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear foram obtidos em
aparelho Varian Unityplus 300Mhz operando a uma frequência de
299,95Mhz para próton e 75,42 Mhz para carbono. As amostras foram
dissolvidas nos solventes especificados (TMS como referência interna), á
temperatura ambiente ou a temperatura de até 600C, se necessário para
espectros de 13C, em tubos de RMN de 5mm. Os espectros de massas foram
realizados em um aparelho do tipo Hewlett packard 5985 instrumento de
alta resolução, utilizando técnica de impacto de elétrons (70eV).
134
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Tese de doutorado
ü Síntese do 5-amino-4-carboetoxi-1-fenil-1H-pirazol (3)
Em balão de fundo redondo, adaptado com condensador de refluxo,
colocou-se 0,009 mol de fenilidrazina (0,97g) e 10mL de etanol. A mistura
foi agitada e deixada sob refluxo. Através do condensador de refluxo foram
adicionados, lentamente, 0,009 mol (1.52g) de etoximetilenocianoacetato
de etila dissolvido em etanol. A mistura reacional foi mantida sob refluxo
por 20 minutos. (O derivado 5-amino-4-carboetoxi-1-fenilpirazol (3), foi
obtido após ter sido lavado com etanol e sendo obtido sob a forma de um
sólido amarelo).
Rendimento: 85%
p.f.: 970C
IV (KBr, cm-1): 3397-3130(νNH2); 1683(νC=O); 1658(δNH2)
ü Síntese do 5-amino-1-fenil-1H-pirazol (4)
Em balão de fundo redondo adaptado a um condensador de refluxo
adicionou-se 0,006 mol (1,50g) de 5-amino-4-carboetoxi-1-fenil-1Hpirazol (3) e 20 mL de ácido fosfórico 85%, em seguida levou-se a agitação
e refluxo por 6 horas à 1700C. Após o término da reação, verte-se em gelo,
neutraliza-se com hidróxido de sódio 5%, extrai com dicloro-metano, secase com sulfato de sódio anidro e após evaporação obtêm-se o derivado 5amino-1-fenilpirazol (4) sob a forma de óleo.
Rendimento: 75%
IV (KBr, cm-1): 3460-3100 (υ N-H2);
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 6.99(d, H-3), 5.54(d, H-4),
7.50-7.30(5H,m), 3.88(s, NH).
135
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Tese de doutorado
ü α-carboetoxi-β-(1-fenil-1H-pirazolilamino)acrilato de etila (6).
Em balão de fundo redondo, adaptado com condensador de refluxo,
colocou-se 0,07 mol (11,13g) de 5-amino-1-fenil-1H-pirazol (4), e 0,07
mol ( 15,00mL) de etoximetilenomalonato de dietila e 20 mL de etanol. A
mistura reacional foi mantida sob refluxo por 2 horas. O derivado αcarboetoxi-β-(1-fenil-pirazolilamino)acrilato de etila (6), foi isolado sob a
forma de um sólido branco, após recristalização em etanol/água.
Rendimento: 77%
p.f.: 86-70C
IV (KBr, cm-1):3433(υ N-H); 1687 e 1641(υ C=O);
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 6.22(s, H-4), 8.22(d, 12,9, Hβ), 7.61-7.42(5H, m), 4.23(q, OCH2), 1.30(t, CH2CH3), 11.05(d, 12.6, NH).
ü 5-carboetoxi- 4-cloro-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina (7).52
Em balão de fundo redondo, adaptado a um condensador de refluxo,
munido com tubo de cloreto de cálcio, adicionou-se 0,03 mol (10g) de αcarboetoxi-β-(1-fenil-1H-pirazolilamino)acrilato de etila (6) e 21 mL de
oxicloreto de fósforo. A mistura reacional foi mantida sob refluxo por 8
horas. Após o final da reação, verte-se em gelo picado, filtra-se e o
derivado 5-carboetoxi-4-cloro-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina (7) foi
obtido após ter sido lavado com água gelada até pH neutro.
Rendimento: 68%
p.f.: 96-80C
IV (KBr, cm-1): 1721 (υ C=O)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 8.37(s, H-3), 9.11(s, H-6),
8.20(d, 8.7, H-2’), 7.54(dd, 7.5, H-3’), 7.37(dd, 7.5, H-4’), 4.47(q, 7.2,
OCH2), 1.45(t, 6.9, CH2CH3).
136
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Tese de doutorado
ü Reação
de
obtenção
dos
4-(fenilamino)-5-carboetoxi-1H-
pirazolo[3,4-b]piridina ( 10a-m) e 4-(piridilamino)-5-carboetoxi1H-pirazolo[3,4-b]piridina (11a-e).
MÉTODO GERAL
Em balão de fundo redondo, adaptado a um condensador de refluxo,
adicionou-se 0,004 mol de 5-carboetoxi-4-cloro-1-fenil-1H-pirazolo[3,4b]piridina (7) e 0,006 mol de uma anilina 8 adequada. A mistura recional
foi mantida sob refluxo, com tempo de reação variando de 2-6h a
temperatura de 1400C. Após o término a mistura reacional foi diluída com
água, basificada com hidróxido de sódio 10% até pH 8-9, extraída com
diclorometano, seca (com sulfato de sódio anidro e evaporado o solvente).
Os derivados do tipo 10 e 11 foram obtidos após recristalização em etanol.
Obtenção dos 4-(fenilamino)- 5-carboetoxi-1-fenil-1H-pirazolo[3,4b]piridina (10a-m).
Estes derivados foram obtidos pelo
método descrito
anteriormente a partir da reação do derivado 4-cloro-1-fenil-1Hpirazolo[3,4-b]piridina-5-carboxilato de etila 7 com diferentes anilinas 8
obtendo-se os derivados do tipo 10.
ü 4-(fenilamino)-5-carboetoxi-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina (10a).
Quantidade de anilina utilizada: 2.14g
Tempo de reação: 2 h
Rendimento: 76%
p.f.: 1960C
IV
(KBr,
cm-1):
3420(νNH);1678(νC=O);1590
e
1500(ν(C=C)
e
νC=N);1270 e 1066(νC-C)
137
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Tese de doutorado
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 6,81(s, H-3); 9,04(s, H-6);
8,08(d, 8.7, H-2’,6’), 7,51-7,26(10H, m), 4,42(q, 7.1, CH2), 1,42(t, 7.1,
CH3), 10,61(s, N-H);
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 135.70 (C-3), 99.70( C-3a),
13
137.42 (C-4), 105.12 (C-5), 149.50
(C-6), 150.30 (C-7a), 131.95 (C-1’),
121.50 (C-2’, 6’), 128.30 (C-3’, 5’), 126.80 (C-4’), 158.10 (C-1’’), 120.40
(C-2’’), 128.50 (C-3’’), 140.12 (C-4’’), 128.50 (C-5’’), 120.40 (C-6’’),
164.98 (CO2Et), Ar-OCH3 (Ar-CH3), 60.50 (CH2CH3), 13.70(CH2CH3);
ü 4-(3’-metoxifenil)amino-5-carboetoxi-1-fenil-1H-pirazolo[3,4b]piridina (10b).
Quantidade de anilina utilizada: 2.32g
Tempo de reação: 2 h
Rendimento: 63%
p.f.: 1350C
IV (KBr, cm-1): 3435(νNH);1678(νC=O);1586 e 1500(ν(C=C) e νC=N);
1270 e 1066(νC-C);
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 6.77(s, H-3), 8.95(s, H-6),
8.16(d,8.7, H-2’,6’), 7.13(dd,7.5, H-3’,5’), 7.41(dd,7.5, H-4’), 7.51(s, H2’’), 7.55(d,7.8, H-4’’), 7.60 (dd,7.5, H-5’’), 7.53(d,7.8, H-6’’),4.43(q,7.0,
CH2),
RMN
1.43 (t,7.0, CH3), 10.51(s, N-H), 3.86(s, Ar-OCH3);
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 135.81 (C-3), 98.10 (C-3a),
13
137.35 (C-4), 101.69 (C-5), 147.49 (C-6), 149.91 (C-7a), 131.86 (C-1’),
118.64 (C-2’, 6’), 127.88 (C-3’, 5’), 126.31 (C-4’), 157.65 (C-1’’), 120.23
(C-2’’), 148.50 (C-3’’), 109.82 (C-4’’), 123.55 (C-5’’), 110.98 (C-6’’),
164.64 (CO2Et), 57.93
(Ar-OCH3), 69.48 (CH2CH3), 11.40 (CH2CH3);
EM: m/z 388,15321[M+] (100); 342,11180 (100); 271,10042 (5);
244,08777(2); 171,06055 (7); 77,04092 (6).
138
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Tese de doutorado
ü 4-(4’-metoxifenil)amino-1-fenil-5-carboetoxi-1H-pirazolo[3,4b]piridina (10c).
Quantidade de anilina utilizada: 2.32g
Tempo de reação: 2 h
Rendimento: 52%
p.f.: 1480C
IV (KBr, cm-1): 3435(νNH);1672(νC=O);1592 e 1512(ν(C=C) e νC=N);
1267 e 1066(νC-C);
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 6.60(s, H-3), 8.98(s, H-6),
8.19(d,8.7, H-2’,6’), 7.63(dd,7.5, H-3’,5’), 7.45(dd,7.5, H-4’), 7.22(d,8.7,
H-2’’), 7.50(d,8.7, H-3’’), 7.22 (d,8.7, H-5’’), 7.22(d,8.7, H-6’’),
4.49(q,7.2, CH2), 1.48(t,7.2, CH3), 10.46(s, N-H), 3.96(s, Ar-OCH3);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 134.08
(C-3), 99.95 (C-
3a), 138.15 (C-4), 103.93 (C-5), 152.24(C-6), 150.87 (C-7a), 131.05 (C1’), 120.95 (C-2’, 6’), 128.60 (C-3’, 5’), 125.98 (C-4’), 158.53 (C-1’’),
114.62(C-2’’), 128.55 (C-3’’), 151.85 (C-4’’), 128.55 (C-5’’), 114.62 (C6’’), 167.19 (CO2Et), 55.03 (Ar-OCH3), 60.15 (CH2CH3), 13.74 (CH2CH3).
EM: m/z 372,15870[M+] (85); 326,12064 (100); 300,13490 (9); 163,06130
(7 ); 77,04092 (4).
ü 4(3’-metilfenil)amino-5-carboetoxi-1-fenil-1H-pirazolo[3,4b]piridina 10d;
Quantidade de anilina utilizada: 2.23g
Tempo de reação: 2 h
Rendimento: 67%
p.f.: 1870C
IV (KBr, cm-1): 3210(νNH);1680(νC=O);1584e 1506(ν(C=C) e νC=N);
1274 e 1066(νC-C);
139
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Tese de doutorado
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 6.75(s, H-3), 9.03(s, H-6),
8.21(d,8.7, H-2’,6’), 7.68-7.41(7H, m), 4.51(q,7.2, CH2), 1.51(t,7.2, CH3),
10.53(s, N-H), 3.37(s, Ar-CH3);
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 135.50 (C-3), 101.10 (C-3a),
13
138.40 (C-4), 105.15 (C-5), 153.02 (C-6), 152.98 (C-7a), 133.01 (C-1’),
122.01 (C-2’, 6’), 128.70 (C-3’, 5’), 126.15 (C-4’), 158.10 (C-1’’), 120.50
(C-2’’), 129.00 (C-3’’), 138.50 (C-4’’), 124.00 (C-5’’), 120.50 (C-6’’),
166.95 (CO2Et), 1.70 (Ar-CH3), 61.60 (CH2CH3), 15.10 (CH2CH3).
ü 4(4’-metilfenil)amino-5-carboetoxi-1-fenil-1H-pirazolo[3,4b]piridina (10e).
Quantidade de anilina utilizada: 2.23g
Tempo de reação: 2 h
Rendimento: 63%
p.f.: 1560C
IV (KBr, cm-1): 3435(νNH);1678(νC=O);1596e 1499(ν(C=C) e νC=N);
1265 e 1065(νC-C);
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 6.73(s, H-3), 9.04(s, H-6),
8.23(d,8.7, H-2’,6’), 7.67(dd,7.5, H-3’,5’), 7.54-7.46(5H, m), 4.53(q,7.2,
CH2), 1.53(t,7.2, CH3), 10.52(s, N-H), 3.38(s, Ar-CH3);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ):135.55 (C-3),
101.74
(C-3a),
139.67 (C-4), 105.43 (C-5), 153.69 (C-6), 151.78 (C-7a), 137.36 (C-1’),
122.42 (C-2’, 6’), 131.39 (C-3’, 5’), 130.02 (C-4’), 158.68 (C-1’’), 122.42
(C-2’’), 128.14 (C-3’’), 138.68 (C-4’’), 128.14 (C-5’’), 122.42 (C-6’’),
168.67 (CO2Et), 21.72 (Ar-CH3), 61.63 (CH2CH3), 15.16 (CH2CH3).
140
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Tese de doutorado
ü 4-(3’-clorofenil)amino-5-carboetoxi-1-fenil-1H-pirazolo[3,4b]piridina 10f .
Quantidade de anilina utilizada: 2.35g
Tempo de reação: 2 h
Rendimento: 68%
p.f.: 1820C
IV (KBr, cm-1): 3208(νNH);1681(νC=O);1592e 1505(ν(C=C) e νC=N);
1279 e 1067(νC-C);
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 6.92(s, H-3), 9.03(s, H-6),
8.20(d,8.7, H-2’,6’), 7.68-7.56(5H, m), 7.47(dd,7.5, H-4’), 7.73(dd,8.7, H5’’), 4.50(q,7.2, CH2), 1.47(t,7.2, CH3),10.57(s, N-H);
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 133.94 (C-3), 101.52 (C-3a),
13
138.32 (C-4), 104.41(C-5), 152.29 (C-6), 152.09 (C-7a), 133.59 (C-1’),
121.12 (C-2’, 6’), 130.41 (3’, 5’), 128.65
(C-4’), 158.80 (C-1’’), 124.88
(C-2’’), 149.19 (C-3’’), 140.44 (C-4’’), 127.06 (C-5’’), 126.12 (C-6’’),
167.09 (CO2Et), 60.34
(CH2CH3), 13.76 (CH2CH3).
EM: m/z 392,10435 [M+] (95); 346,06091 (100); 311,09595 (25);
283,09918 (15 ); 173,03200 (7); 110,99878 (4); 77,03763 (10).
ü 4-(4’-clorofenil)amino-5-carboetoxi-1-fenil-1H-pirazolo[3,4b]piridina 10g.
Quantidade de anilina utilizada: 2.35g
Tempo de reação: 2 h
Rendimento: 64%
p.f.: 1590C
IV (KBr, cm-1): 3218(νNH);1681(νC=O);1589e 1516(ν(C=C) e νC=N);
1265 e 1066(νC-C);
141
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Tese de doutorado
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 6,94(s, H-3), 9,05(s, H-6),
8,08(d, 8.7, H-2’,6’), 7,51-7,25(7H, m), 4,42(q, 7.1, CH2), 1,42(t, 7.1,
CH3), 10,51(s, N-H);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 134.49
(C-3), 104.17 (C-
3a), 138.35 (C-4), 105.68 (C-5), 152.32 (C-6), 152.64 (C-7a), 133.09 (C1’), 121.20 (C-2’, 6’), 128.87 (3’, 5’), 126.32 (C-4’), 158.40 (C-1’’),
123.38 (C-2’’), 126.67 (C-3’’), 145.76 (C-4’’), 126.67 (C-5’’), 123.38 (C6’’), 166.73 (CO2Et), 60.76
(CH2CH3), 13.81 (CH2CH3).
ü 4-(3’nitrofenil)amino--5-carboetoxi-1-fenil -1H-pirazolo[3,4b]piridina (10h).
Quantidade de anilina utilizada: 2.41g
Tempo de reação: 4 h
Rendimento: 60%
p.f.: 1720C
IV (KBr, cm-1): 3207(νNH);1681(νC=O);1590e 1513(ν(C=C) e νC=N);
1271 e 1075(νC-C)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 7.25(s, H-3), 9.13(s, H-6),
8.30(d,8.7, H-2’,6’), 7.74(dd,7.5, H-3’,5’), 7.55(dd,7.5, H-4’), 8.50(s, H2’’), 8.44(d,8.1, H-4’’), 7.97(dd,8.7, H-5’’), 8.10(d,8.7, H-6’’), 4.55(q,7.2,
CH2), 1.55(t,7.2, CH3), 10.75(s, N-H);
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 134.88(C-3), 102.72 (C-3a),
13
138.88 (C-4), 105.26 (C-5), 153.02 (C-6), 152.60 (C-7a), 133.27 (C-1’),
122.10 (C-2’, 6’), 129.49 (C-3’, 5’), 126.94 (C-4’), 158.91 (C-1’’), 120.98
(C-2’’), 148.91 (C-3’’), 140.93 (C-4’’), 121.97 (C-5’’), 120.98 (C-6’’),
167.61 (CO2Et), 61.21 (CH2CH3), 14.50 (CH2CH3).
EM: m/z 403,12863 [M+] (100); 357,09045 (70); 311.09466 (30);
283,10117 (30 ); 256,08533 (7); 77,03626 (11).
142
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Tese de doutorado
ü 4-(4’-nitrofenil)amino-5-carboetoxi-1-fenil-1H-pirazolo[3,4b]piridina (10i).
Quantidade de anilina utilizada: 2.41g
Tempo de reação: 4 h
Rendimento: 69%
p.f.: 1760C
IV (KBr, cm-1): 3208(νNH);1681(νC=O);1590e 1513(ν(C=C) e νC=N);
1270 e 1091(νC-C)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 7.18(s, H-6), 9.09(s, H-6),
8.25(d,8.7, H-2’,6’), 7.68(dd,7.5, H-3’,5’), 7.50(dd,7.5, H-4’), 7.74(d,8.7,
H-2’’), 8.43(d,8.7, H-3’’), 8.43(d,8.7, H-5’’), 7.74(d,8.7, H-6’’), 4.45(q,7.2,
CH2), 1.46(t,7.2, CH3), 10.67(s, N-H);
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 134.49(C-3), 104.17 (C-3a),
13
138.35 (C-4), 105.68 (C-5), 152.10 (C-6), 152.04 (C-7a), 133.67 (C-1’),
121.12 (C-2’, 6’), 128.87 (C-3’, 5’), 126.32 (C-4’), 158.76 (C-1’’), 123.38
(C-2’’), 124.97 (C-3’’), 144.07 (C-4’’), 124.97 (C-5’’), 124.97 (C-6’’),
166.73 (CO2Et), 60.76 (CH2CH3), 13.81 (CH2CH3).
EM: m/z 403,12461 [M+] (100); 357,07820 (45); 311.08910 (80);
283,08977 (30); 256,08447 (7); 77,03500 (11).
ü 4-(3’-fluorofenil)amino-5-carboetoxi-1-fenil-1H-pirazolo[3,4b]piridina 10j ;
Quantidade de anilina utilizada: 2.25g
Tempo de reação: 2 h
Rendimento: 82%
p.f.: 2060C
IV (KBr, cm-1): 3249(νNH);1676(νC=O);1593e 1506(ν(C=C) e νC=N);
1283 e 1091(νC-C)
143
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Tese de doutorado
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 7.03(s, H-3), 9.13(s, H-6),
8.30(d,8.7, H-2’,6’), 7.77-7.53(7H, m), 4.57(q,7.5, CH2), 1.55(t,7.0, CH3),
10.67(s, N-H);
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 134.20 (C-3), 104.01 (C-3a),
13
138.40 (C-4), 105.70 (C-5), 153.01 (C-6), 152.10 (C-7a), 135.00 (C-1’),
121.07 (C-2’, 6’), 128.06 (C-3’, 5’), 127.00 (C-4’), 158.70 (C-1’’), 123.20
(C-2’’), 148.00 (C-3’’), 142.12 (C-4’’), 120.30 (C-5’’), 112.65 (C-6’’),
167.00 (CO2Et), 60.50
(CH2CH3), 13.50 (CH2CH3).
EM: m/z 376,12275 [M+] (90); 330,08058 (100); 303,07368 (10);
236,20421 (7); 165,03244 (11); 83,07803 (14).
ü 4-(4’-fluorofenil)amino-5-carboetoxi1-fenil--1H-pirazolo[3,4b]piridina (10k).
Quantidade de anilina utilizada: 2.41g
Tempo de reação: 4 h
Rendimento: 80%
p.f.: 1730C
IV (KBr, cm-1): 3217(νNH);1683(νC=O);1590 e 1509(ν(C=C) e νC=N);
1290 e 1066(νC-C)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 6.81(s, H-3), 9.11(s, H-6),
8.29(d,8.7, H-2’,6’), 7.77-7.56(7H, m), 4.58(q,7.5, CH2), 1.50(t,7.5, CH3),
10.62(s, N-H);
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 134.08 (C-3), 104.30 (C-3a),
13
138.21 (C-4), 105.60 (C-5), 153.26 (C-6), 153.30 (C-7a), 137.05 (C-1’),
121.20 (C-2’, 6’), 128.10 (C-3’, 5’), 126.90 (C-4’), 158.11 (C-1’’), 120.30
(C-2’’), 146.02 (C-3’’), 148.00 (C-4’’), 146.02 (C-5’’), 120.30 (C-6’’),
166.98 (CO2Et), 60.21 (CH2CH3), 13.92 (CH2CH3).
144
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Tese de doutorado
EM: m/z 376,13367 [M+] (90); 330,09180 (100); 303,08291 (10);
274,08153 (5); 165,04838 (8); 77,17700 (7).
ü 4-(3’-bromofenil)amino-5-carboetoxi-1-fenil--1H-pirazolo[3,4b]piridina (10l) .
Quantidade de anilina utilizada: 2.61g
Tempo de reação: 2 h
Rendimento: 75%
p.f.: 1800C
IV (KBr, cm-1): 3224(νNH);1679(νC=O);1596 e 1504(ν(C=C) e νC=N);
1279 e 1066(νC-C)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 6.88(s, H-3), 8.99(s, H-6),
8.17(d,8.7, H-2’,6’), 7.64-7.57(3H,m), 7.43(dd,7.5, H-4’), 7.82(s, H-2’’),
7.75(dd,7.5, H-5’’), 7.75(d,7.5, H-6’’), 4.44(q,7.5, CH2), 1.44(t,7.5, CH3),
10.53(s, N-H);
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 134.76 (C-3), 102.02 (C-3a),
13
138.98 (C-4), 104.99 (C-5), 153.03 (C-6), 153.20 (C-7a), 133.09 (C-1’),
121.83 (C-2’, 6’), 129.17 (C-3’, 5’), 126.84 (C-4’), 158.00 (C-1’’), 120.02
(C-2’’), 150.11 (C-3’’), 139.05 (C-4’’), 121.00 (C-5’’), 120.02 (C-6’’),
167.89 (CO2Et), 61.09 (CH2CH3), 14.48 (CH2CH3).
EM: m/z 436,05399 [M+] (85); 392,00998 (55); 358,13943 (10); 311,09562
(100); 283,09590 (30); 256,08710 (8); 222,57337 (15); 155,54822 (18);
95,07887 (23).
145
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Tese de doutorado
ü 4-(4’bromofenil)amino-5-carboetoxi-1-fenil-1H-pirazolo[3,4b]piridina (10m).
Quantidade de anilina utilizada: 2.61g
Tempo de reação: 2 h
Rendimento: 75%
p.f.: 1870C
IV (KBr, cm-1): 3219(νNH);1683(νC=O);1593 e 1514(ν(C=C) e νC=N);
1280 e 1072(νC-C)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 6.88(s, H-3), 8.99(s, H-6),
8.15(d,8.7, H-2’,6’), 7.60-7.50(7H, m), 4.45(q,7.5, CH2), 1.40(t,7.5, CH3),
10.50(s, N-H);
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 134.10 (C-3), 101.48 (C-3a),
13
138.48 (C-4), 104.55 (C-5), 153.35 (C-6), 152.15 (C-7a), 132.68 (C-1’),
121.41 (C-2’, 6’), 129.01 (C-3’, 5’), 128.86 (C-4’), 158.20 (C-1’’), 120.15
(C-2’’), 126.46 (C-3’’), 138.53 (C-4’’), 126.46 (C-5’’), 120.15 (C-6’’),
167.44 (CO2Et), 60.50 (CH2CH3), 13.53 (CH2CH3).
EM: m/z 436,05358 [M+] (65); 390,01168 (15); 311,09221 (100);
283,09354 (20); 256,08226 (4); 155,54525 (12); 77,17351(10).
146
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Tese de doutorado
Obtenção dos 4-(piridilamino)- 5-carboetoxi-1-fenil-1H-pirazolo[3,4b]piridina (11a-e).
Estes
derivados
foram
obtidos
pelo
método
descrito
anteriormente a partir da reação do derivado 5-carboetoxi-4-cloro-1-fenil1H-pirazolo[3,4-b]piridina 7 com diferentes amino-piridinas 9 obtendo-se
os derivados do tipo 11.
ü 4-(piridil)amino-5-carboetoxi-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina
(11a).
Quantidade de anilina utilizada: 2.15g
Tempo de reação: 6 h
Rendimento: 50%
p.f.: 1350C
IV (KBr, cm-1): 3110(νNH);1706(νC=O);1592 e 1500(ν(C=C) e νC=N);
1266 e 1083(νC-C)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 8,70 (s, H-3), 9,09 (s, H-6),
8,21(d, 7,5, H-2’,6’), 7,73(dd, 7,5, H-3’,5’), 7,55(dd, 7,5, H-4’), 7,497,44(2H, m), 6,52(dd, 8,7, H-5’’), 8,00(d, 8,7, H-6’’), 4,46(q,,7,0, CH2),
1,42(q, 7,0, CH3);
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 136.98 (C-3), 106.20 (C-3a),
13
145.80 (C-4), 107.70 (C-5), 151.59 (C-6), 152.40 (C-7a), 136.10 (C-1’),
122.54 (C-2’, 6’), 129.25 (C-3’, 5’), 126.80 (C-4’), 157.25 (C-2’’), 114.01
(C-3’’), 139.50 (C-4’’), 115.11 (C-5’’), 152.10 (C-6’’), 167.50 (CO2Et),
24.06 (Ar-CH3), 61.64 (CH2CH3), 14.50 (CH2CH3).
147
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Tese de doutorado
ü 4-(3’-metoxipiridil)amino-5-carboetoxi-1-fenil-1H-pirazolo[3,4b]piridina (11b).
Quantidade de anilina utilizada: 2.23g
Tempo de reação: 6 h
Rendimento: 50%
p.f.: 1650C
IV (KBr, cm-1): 3125(νNH);1693(νC=O);1594 e 1501(ν(C=C) e νC=N);
1294 e 1079(νC-C)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 9,40 (s, H-3), 9,50 (s, H-6),
9,10 (d, 7,5, H-2’,6’), 8,30-7,20(6H, m), 4,45(q,7,0, CH2), 1,45(q,7,0,
CH3), 2,20 (s, Ar-CH3);
ü 4-(4’-metoxipiridil)amino-5-carboetoxi-1-fenil-1H-pirazolo[3,4b]piridina (11c).
Quantidade de anilina utilizada: 2.23g
Tempo de reação: 6 h
Rendimento: 50%
p.f.: 1930C
IV (KBr, cm-1): 3110(νNH);1695(νC=O);1595 e 1501(ν(C=C) e νC=N);
1269 e 1078(νC-C)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 8,90 (s, H-3), 9,26 (s, H-6),
8,38 (d, 7,5, H-2’,6’), 7,82(dd, 7,5, H-3’,5’), 7,63(dd, 7,5, H-4’),
8,38(d,7,5, H-6’’), 4,62(q, 7,0, CH2), 1,58(q, 7,0, CH3), 3,50(s, Ar-CH3);
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 135,16 (C-3), 101,20 (C-3a),
13
145,40 (C-4), 103,40 (C-5), 152.44 (C-6), 152,39 (C-7a), 139,00 (C-1’),
122,21 (C-2’, 6’), 130,09 (C-3’, 5’), 127,89 (C-4’), 157,50 (C-2’’), 117,83
148
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Tese de doutorado
(C-3’’), 139,13 (C-4’’), 120,34 (C-5’’), 152,12 (C-6’’), 164,25 (CO2Et),
21,90 (Ar-CH3), 62,52 (CH2CH3), 14,82 (CH2CH3).
ü 4-(5’-metoxipiridil)amino-carboetoxi-1-fenil-5-1H-pirazolo[3,4b]piridina (11d).
Quantidade de anilina utilizada: 2.23g
Tempo de reação: 6 h
Rendimento: 69%
p.f.: 1800C
IV (KBr, cm-1): 3110(νNH);1696(νC=O);1593 e 1500(ν(C=C) e νC=N);
1270 e 1069(νC-C)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 8,30 (s, H-3), 8,71 (s, H-6),
8,12 (d, 7,5, H-2’,6’), 7,52(dd, 7,5, H-3’,5’), 7,33(dd, 7,5, H-4’), 7,33(dd,
7,5, H-3’’), 7,52(dd, 7,5, H-4’’), 8,13(d, 7,5, H-6’’), 4,38(q, 7,0, CH2),
1,40(q, 7,0, CH3), 9,56 (s, N-H), 3,30 (s, Ar-CH3);
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 136.74 (C-3), 107.07 (C-3a),
13
145.50 (C-4), 108.01 (C-5), 152.79 (C-6), 152.51 (C-7a), 134.05 (C-1’),
121.79 (C-2’, 6’), 129.69 (C-3’, 5’), 126.56 (C-4’), 157.10 (C-2’’), 121.69
(C-3’’), 139.41 (C-4’’), 119.45 (C-5’’), 152.02 (C-6’’), 167.14 (CO2Et),
26.13 (Ar-CH3), 60.93 (CH2CH3), 14.61 (CH2CH3).
149
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Tese de doutorado
ü 4-(6’-metoxipiridil)amino-5-carboetoxi-1-fenil-1H-pirazolo[3,4b]piridina (11e).
Quantidade de anilina utilizada: 2.23g
Tempo de reação: 6 h
Rendimento: 60%
p.f.: 1900C
IV (KBr, cm-1): 3161(νNH);1678(νC=O);1592 e 1504(ν(C=C) e νC=N);
1258 e 1085(νC-C)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 7,86 (s, H-3), 8,75 (s, H-6),
8,03(d, 7,5, H-2’,6’), 7,42(dd,7,5, H-3’,5’), 7,21(dd, 7,5, H-4’), 6,95(dd,
7,5, H-3’’), 6,95(dd, 7,5, H-5’’), 4,07(q, 7,0, CH2), 1,10(q, 7,0, CH3), 10,63
(s, N-H), 3,18 (s, Ar-CH3).
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 139.11 (C-3), 105.09 (C-3a),
13
145.70 (C-4), 107.07 (C-5), 152.56 (C-6), 152.51 (C-7a), 136.84 (C-1’),
121.56 (C-2’, 6’), 129.42 (C-3’, 5’), 126.66 (C-4’), 157.17 (C-2’’), 112.79
(C-3’’), 139.39 (C-4’’), 119.66 (C-5’’), 151.74 (C-6’’), 167.80 (CO2Et),
23.92 (Ar-CH3), 61.18 (CH2CH3), 14.27(CH2CH3).
EM: m/z 373,15334 [M+] (55); 327,11025 (25); 300,12305 (100);
256,02203 (5); 163,55252 (8); 77,17140 (7).
150
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Tese de doutorado
ü Obtenção dos Ácidos 4-(fenilamino)-1H-pirazolo[3,4-b]piridina5-carboxílicos (12a-m)
e dos ácidos 4-(piridilamino)-1H-
pirazolo[3,4-b]piridina-5-carboxílicos (13a-d).
MÉTODO GERAL
Em balão de fundo redondo adaptado a condensador de refluxo,
adicionou-se à 0,003 mol dos derivados ésteres do tipo 10 e 11, 10 mL de
hidróxido de sódio 20% e 10 mL de etanol. A mistura reacional foi mantida
sob refluxo por 1 hora. Após o término da reação adicionou-se carvão
ativo, filtrou-se a quente, dilui-se com água e obteve-se os derivados ácidos
do tipo 12 e 13 após precipitação com HCl 10%.
Obtenção dos ácido 4-(fenilamino)-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina5-carboxílico (12a-m).
Estes derivados foram obtidos pelo método geral, descrito
anteriormente, a partir da reação dos derivados 4-anilino-1-fenil-5carboetoxi -1H-pirazolo[3,4-b]piridina (10a-m).
Ácido
4-(fenilamino)-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina-5-carboxílico
(12a)
Quantidade de 10a : 0,99g
Rendimento: 86%
p.f.: 2290C
IV (KBr, cm-1):
3435-2598(νOH); 1654(νC=O); 1590 e 1439(νC=C e
νC=N);
RMN 1H(300MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 7,01(s, H-3), 9,02(s, H-6),
8,23(d, 8.1, H-2’,6’), 7,86-7,45(8H, m), 10,78(s, N-H);
151
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Tese de doutorado
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 135.40 (C-3), 100.02 (C-3a),
13
151.70 (C-4), 105.50 (C-5), 153.10 (C-6), 153.50 (C-7a), 114.25 (C-1’),
122.25 (C-2’, 6’), 131.52 (C-3’, 5’), 129.15 (C-4’), 140.23 (C-1’’), 126.40
(C-2’’), 139.50 (C-3’’), 126.90 (C-4’’), 139.50 (C-5’’), 126.40 (C-6’’),
170.20 (CO2H).
Ácido 4-(3’-metoxifenil)amino-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina
-5-carboxílico (12b).
Quantidade de 10b : 1,08g
Rendimento: 90%
p.f.: 2350C
IV (KBr, cm-1): 3330-2590(νOH); 1654(νC=O); 1590 e 1270 (νC=C e
νC=N)
RMN 1H(300MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 6.91(s, H-3), 9.05(s, H-6),
8.27(d,7.5, H-2’,6’), 7.69(dd,7.5, H-3’,5’), 7.51(dd,7.5, H-4’), 7.667.61(4H, m), 10.88(s, N-H), 3.95(s, Ar-OCH3);
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 139.32 (C-3), 101.84 (C-3a),
13
151.19 (C-4), 105.08 (C-5), 153.77
(C-6), 153.05 (C-7a), 114.38 (C-1’),
122.04 (C-2’, 6’), 131.31 (C-3’, 5’), 129.73 9C-4’), 140.76 (C-1’’), 119.66
(C-2’’), 161.09 (C-3’’), 127.06 (C-4’’), 135.24
(C-5’’), 113.13 (C-6’’),
170.64 (CO2H), 56.10 (Ar-OCH3).
EM: m/z 360,12379 [M+] (100); 298,08825 (10); 230,57425 (4); 171,06160
(8); 77,17826 (13).
152
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Tese de doutorado
Ácido 4-(4’-metoxifenil)amino-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina
-5-carboxílico (12c)
Quantidade de 10c: 1,08g
Rendimento: 91%
p.f.: 2610C
IV (KBr, cm-1): 3430-2588(νOH); 1654(νC=O); 1589 e 1439 (νC=C e
νC=N);
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 6.70(s, H-3), 9.03(s, H-6),
8.26(d,7.5, H-2’,6’), 7.69(dd,7.5, H-3’,5’), 7.51(dd,7.5, H-4’), 7.28(d,8.7,
H-2’’), 7.56(s, H-3’’), 7.56(d,8.7, H-5’’), 7.28(d,8.7, H-6’’), 10.77(s, N-H),
4.02(s, Ar-OCH3);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 131.32
(C-3), 100.59 (C-
3a), 151.37 (C-4), 104.19 (C-5), 152.98 (C-6), 152.27 (C-7a), 114.19 (C1’), 121.15(C-2’, 6’), 128.72 (C-3’, 5’), 126.14 (C-4’), 138.52 (C-1’’),
120.00 (C-2’’), 134.27 (C-3’’), 158.71 (C-4’’), 128.84 (C-5’’), 114.00 (C6’’), 169.80 (CO2H), 55.28 (Ar-OCH3).
Ácido 4-(3’-metilfenil)amino-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina
-5-carboxílico(12d)
Quantidade de 10d : 1,03g
Rendimento: 90%
p.f.: 2370C
IV (KBr, cm-1): 3482-2592(νOH); 1650(νC=O); 1584 e 1434 (νC=C e
νC=N);
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 6.71(s, H-3), 8.95(s, H-6),
8.16(d,7.5, H-2’,6’), 7.60(dd,7.5, H-3’,5’), 7.52(dd,7.5, H-4’), 7.447.32(4H, m), 10.81(s, N-H), 2.21(s, Ar-CH3);
153
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Tese de doutorado
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 138.99 (C-3), 101.46 (C-3a),
13
151.11 (C-4), 104.79 (C-5), 153.36 (C-6), 152.61 (C-7a), 124.42 (C-1’),
127.89 (C-2’, 6’), 130.08 (C-3’, 5’), 129.43 (C-4’), 140.03 (C-1’’), 126.79
(C-2’’), 139.18 (C-3’’), 128.92 (C-4’’), 134.88 (C-5’’), 121.79(C-6’’),
170.33 (CO2H), 21.30 (Ar-CH3).
EM: m/z 344,13178 [M+] (95); 326,11951 (100); 297,11572 (5); 270,10950
(3); 199,93871 (4); 73,35493 (4).
Ácido 4-(4’-metilfenil)amino-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina
-5-carboxílico(12e)
Quantidade de 10e : 1,03g
Rendimento: 92%
p.f.: 2580C
IV (KBr, cm-1): 3430-2603(νOH); 1654(νC=O); 1588 e 1438 (νC=C e
νC=N);
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 6.67(s, H-3), 8.95(s, H-6),
8.18(d,7.5, H-2’,6’), 7.61-7.40(7H, m), 10.73(s, N-H), 2.47(s, Ar-CH3);
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 134.87 (C-3), 100.12 (C-3a),
13
151.35 (C-4), 104.50 (C-5), 153.50 (C-6), 152.86 (C-7a), 139.12 (C-1’),
121.71 (C-2’, 6’), 130.73 (C-3’, 5’), 129.34 (C-4’), 139.12 (C-1’’), 126.64
(C-2’’), 137.87 (C-3’’), 136.72 (C-4’’), 137.87 (C-5’’), 126.64(C-6’’),
170.31 (CO2H), 21.07 (Ar-CH3).
154
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Tese de doutorado
Ácido 4-(3’clorofenil)amino-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina
-5-carboxílico (12f).
Quantidade de 10f : 1,09g
Rendimento: 93%
p.f.: 2360C
IV (KBr, cm-1): 3488-2766(νOH); 1649(νC=O); 1587 e 1434 (νC=C e
νC=N);
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 7.01(s, H-3), 9.07(s, H-6),
8.27(d,7.5, H-2’,6’), 7.74-7.62 (5H, m), 7.52(dd,7.5, H-4’), 7.79(s, H-2’’),
10.92(s, N-H);
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 132.99 (C-3), 100.53 (C-3a),
13
148.63 (C-4), 103.27 (C-5), 151.62 (C-6), 150.89 (C-7a), 120.13 (C-1’),
125.20 (C-2’, 6’), 130.01 (C-3’, 5’), 127.77 (C-4’), 139.33 (C-1’’), 124.05
(C-2’’), 137.26 (C-3’’), 126.18 (C-4’’), 132.39 (C-5’’), 120.13(C-6’’),
168.40 (CO2H).
EM: m/z 364,07926 [M+] (100); 311,10332 (20); 283,10468 (9); 236,22030
(3); 155,55160 (7); 77,17758 (20).
Ácido 4-(4’clorofenil)amino-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina
-5-carboxílico (12g).
Quantidade de 10g : 1,09g
Rendimento: 89%
p.f.: 2680C
IV (KBr, cm-1): 3430-2603(νOH); 1654(νC=O); 1588 e 1441 (νC=C e
νC=N);
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 6.87(s, H-3), 8.97(s, H-6),
8.17(d,7.5, H-2’,6’), 7.61(dd,7.5, H-3’,5’), 7.42(dd,7.5, H-4’), 7.58(d,8.7,
155
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Tese de doutorado
H-2’’), 7.67(d,8.7, H-3’’), 7.67(d,8.7, H-5’’), 7.58(d,8.7, H-6’’), 10.77(s,
N-H);
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 131.76 (C-3), 101.47 (C-3a),
13
150.05 (C-4), 104.32 (C-5), 153.01 (C-6), 152.28 (C-7a), 121.26 (C-1’),
128.54 (C-2’, 6’), 128.95 (C-3’, 5’), 128.95 (C-4’), 138.44 (C-1’’), 126.32
(C-2’’), 134.22 (C-3’’), 137.93 (C-4’’), 129.67 (C-5’’), 121.26 (C-6’’),
169.67 (CO2H).
Ácido 4-(3’nitrofenil)amino-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina
-5-carboxílico (12h).
Quantidade de 10h : 1,13g
Rendimento: 90%
p.f.: 2550C
IV (KBr, cm-1): 3401-2603(νOH); 1674(νC=O); 1590 e 1439 (νC=C e
νC=N);
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 7.12(s, H-3), 9.04(s, H-6),
8.22(d,7.5, H-2’,6’), 7.65(dd,7.5, H-3’,5’), 7.46(dd,7.5, H-4’), 8.42(s, H2’’), 8.35(d,8.7, H-4’’), 7.88(d,8.7, H-5’’), 8.03(d,8.7, H-6’’), 10.99(s, NH);
RMN
C (75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 138.21(C-3), 102.14 (C-3a),
13
148.85 (C-4), 104.31 (C-5), 152.71 (C-6), 152.02 (C-7a), 120.21 (C-1’),
126.11 (C-2’, 6’), 132.08 (C-3’, 5’), 130.58 (C-4’), 148.16 (C-1’’), 121.32
(C-2’’), 140.06 (C-3’’), 128.72 (C-4’’), 134.05 (C-5’’), 120.98 (C-6’’),
168.27 (CO2H).
EM: m/z 375,09687 [M+] (100); 310,09034 (27); 211,20865 (8); 178,57242
(23); 145,62161 (9); 121,49006 (10); 77,17135 (9).
156
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Tese de doutorado
Ácido 4-(4’nitrofenil)amino-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina
-5-carboxílico (12i).
Quantidade de 10j : 1,13g
Rendimento: 93%
p.f.: 2560C
IV (KBr, cm-1): 3409-2603(νOH); 1678(νC=O); 1590 e 1460 (νC=C e
νC=N);
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 7.16(s, H-3), 9.06(s, H-6),
8.23(d,7.5, H-2’,6’), 7.65(dd,7.5, H-3’,5’), 7.46(dd,7.5, H-4’), 7.74(d,8,7,
H-2’’), 8.40(d,8.7, H-3’’), 8.40(d,8.7, H-5’’), 7.74(d,8.7, H-6’’), 11.01(s,
N-H);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 139.5 (C-3),
130.31
(C-3a),
148.20 (C-4), 104.97 (C-5), 153.71 (C-6), 153.10 (C-7a), 120.30 (C-1’),
126.02 (C-2’, 6’), 133.20 (C-3’, 5’), 129.91 (C-4’), 148.17 (C-1’’), 121.36
(C-2’’), 139.41 (C-3’’), 127.31 (C-4’’), 131.72 (C-5’’), 120.30(C-6’’),
170.48 (CO2H).
EM: m/z 375,09575 [M+] (100); 311,09014 (45); 283,09583 (26);
204,83632 (23); 138,51953 (12); 116,02373 (20); 83,21144 (14).
Ácido 4-(3’fluorofenil)amino-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina
-5-carboxílico (12j).
Quantidade de 10j : 1,04g
Rendimento: 95%
p.f.: 2580C
IV (KBr, cm-1): 3412-2586(νOH); 1675(νC=O); 1590 e 1412 (νC=C e
νC=N);
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 7.04(s, H-3), 9.08(s, H-6),
8.28(d,7.5, H-2’,6’), 7.79-7.54(6H, m), 7.49(dd,7.5, H-4’), 10.98(s, N-H);
157
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Tese de doutorado
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 134.89(C-3), 102.39 (C-3a),
13
150.46 (C-4), 105.06 (C-5), 153.63 (C-6), 152.97 (C-7a), 115.08 (C-1’),
121.94 (C-2’, 6’), 129.61 (C-3’, 5’), 126.98 (C-4’), 141.40 (C-1’’), 121.94
(C-2’’), 139.21 (C-3’’), 123.32 (C-4’’), 131.97 (C-5’’), 114.81 (C-6’’),
170.41 (CO2H).
EM: m/z 348,10136 [M+] (100); 304,11069 (7); 274,07411 (4); 198,04128
(4); 165,04218 (10); 77,17166 (12).
Ácido 4-(4’fluorofenil)amino-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina
-5-carboxílico (12k).
Quantidade de 10k : 1,04g
Rendimento: 95%
p.f.: 2320C
IV (KBr, cm-1): 3487-2586(νOH); 1649(νC=O); 1589 e 1461 (νC=C e
νC=N);
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 6.82(s, H-3), 9.06(s, H-6),
8.27(d,7.5, H-2’,6’), 7.57(dd,7.5, H-3’,5’), 7.52(dd,7.5, H-4’), 7.71(d,8,1,
H-2’’), 7.70(dd,8.1, H-3’’), 7.70(dd,8.1, H-5’’), 7.71(d,8.1, H-6’’), 10.90(s,
N-H);
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 135.09 (C-3), 102.12 (C-3a),
13
151.67 (C-4), 105.20 (C-5), 153.95 (C-6), 153.25 (C-7a), 117.67 (C-1’),
122.19 (C-2’, 6’), 130.23 (C-3’, 5’), 129.85 (C-4’), 139.49 (C-1’’), 122.19
(C-2’’), 136.20 (C-3’’), 127.19 (C-4’’), 130.34 (C-5’’), 117.37 (C-6’’),
170.74 (CO2H).
EM: m/z 348,09602 [M+] (100); 330,08555 (90); 303,07501 (6); 236,21129
(7); 83,08373 (20).
158
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Tese de doutorado
Ácido 4-(3’bromofenil)amino-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina
-5-carboxílico (12l).
Quantidade de 10l : 1,22g
Rendimento: 90%
p.f.: 2460C
IV (KBr, cm-1): 3490-2580(νOH); 1650(νC=O); 1587 e 1460 (νC=C e
νC=N);
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 6.65(s, H-3), 8.72(s, H-6),
7.93(d,7.5, H-2’,6’), 7.50-7.31(5H, m), 7.17(dd,7.5, H-4’), 7.57(s, H-2’’),
12.90(s, CO2H), 10.57(s, N-H);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 134.48 (C-3), 102.08 (C-3a),
150.07 (C-4), 104.79 (C-5), 153.34 (C-6), 152.66 (C-7a), 120.50 (C-1’),
125.94 (C-2’, 6’), 130.55 (C-3’, 5’), 129.60 (C-4’), 141.04 (C-1’’), 121.58
(C-2’’), 138.89 (C-3’’), 126.63 (C-4’’), 131.76 (C-5’’), 120.50(C-6’’),
170.04 (CO2H).
EM: m/z 410,00421 [M+] (100); 339,37886 (8); 311,07759 (100);
210,05296 (7); 76,04006 (5).
Ácido 4-(4’bromofenil)amino-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina
-5-carboxílico (12m).
Quantidade de 10m : 1,22g
Rendimento: 90%
p.f.: 2650C
IV (KBr, cm-1): 3431-2580(νOH); 1651(νC=O); 1591 e 1442 (νC=C e
νC=N);
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 6.87(s, H-3), 8.95(s, H-6),
8.16(d,7.5, H-2’,6’), 7.59(dd,7.5, H-3’,5’), 7.40(dd,7.5, H-4’), 7.50(d,8,7,
H-2’’), 7.78(d,8.7, H-3’’), 7.78(d,8.7, H-5’’), 7.50(d,8.7, H-6’’), 13.00(s,
CO2H), 10.73(s, N-H);
159
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Tese de doutorado
RMN
C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 132.59 (C-3), 101.51 (C-3a),
13
149.90 (C-4), 104.51 (C-5), 153.00 (C-6), 152.28 (C-7a), 115.00 (C-1’),
120.03 (C-2’, 6’), 128.78 (C-3’, 5’), 126.30 (C-4’), 138.49 (C-1’’), 120.03
(C-2’’), 134.23 (C-3’’), 121.25 (C-4’’), 128.94 (C-5’’), 115.00 (C-6’’),
169.70 (CO2H).
EM: m/z 410,00732 [M+] (13); 386,21067 (4); 311,08624 (100); 283,04687
(13); 82,30021 (5).
Obtenção dos ácido 4-(piridilamino)-1-fenil-1H-pirazolo[3,4b]piridina-5-carboxílico (13a-m).
Estes derivados foram obtidos pelo método geral, descrito
anteriormente, a partir da reação dos derivados 4-(piridilamino)-1-fenil-5carboetoxi-1H-pirazolo[3,4-b]piridina (11b-e).
ü Ácido
4-(3’-metoxipiridil)amino-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-
b]piridina-5-carboxílico (13a).
Quantidade de 11b: 1,04g
Tempo de reação: 1 h
Rendimento: 85%
p.f.: 2520C
IV (KBr, cm-1): 3400-2500(νOH); 1678(νC=O); 1595 e 1465 (νC=C e
νC=N);
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ) 8.86(s, H-3), 9.10(s, H-6),
8.25(d, 8.0, H-2’,6’), 7.65(dd, 7.5, H-3’,5’), 7.46(dd, 7.5, H-4’), 7.36(d,7.5,
H-4’’), 7.77(dd,7.5, H-5’’), 8.35(d,7.5, H-6’’), 11.45(s, CO2H), 9.51(s, NH), 3.31(s, Ar-CH3)
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ):
160
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Tese de doutorado
ü Ácido
4-(4’-metoxipiridil)amino-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-
b]piridina- 5-carboxílico (13b).
Quantidade de 11c: 1,04g
Tempo de reação: 1 h
Rendimento: 93%
p.f.: 2250C
IV (KBr, cm-1): 3426-2600(νOH); 1678(νC=O); 1596 e 1439 (νC=C e
νC=N);
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 8.81(s, H-3), 9.08(s, H-6),
8.23(d, 8.0, H-2’,6’), 7.61(dd, 7.5, H-3’,5’), 7.44(dd, 7.5, H-4’), 7.95(s, H3’’), 7.70(d,7.5, H-5’’), 8.43(d,7.5, H-6’’), 11.36(s, CO2H), 9.46(s, N-H),
3.27(s, Ar-CH3);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ):
ü Ácido
4-(5’-metoxipiridil)amino-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-
b]piridina-5-carboxílico (13c).
Quantidade de 11d: 1,04g
Tempo de reação: 1 h
Rendimento: 80%
p.f.: >3000C
IV (KBr, cm-1): 3491-2580(νOH); 1674(νC=O); 1588 e 1409 (νC=C e
νC=N);
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 8.42(s, H-3), 9.07(s, H-6),
8.22(d, 8.0, H-2’,6’), 7.69(dd, 7.5, H-3’,5’), 7.51(dd, 7.5, H-4’), 7.90(d,7.5,
H-3’’), 7.42(d,7.5, H-4’’), 7.73(s, H-6’’), 11.37(s, CO2H), 3.56(s, N-H);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ):
161
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Tese de doutorado
ü Ácido
4-(6’-metoxipiridil)amino-1-fenil-1H-pirazolo[3,4-
b]piridina-5-carboxílico (13d).
Quantidade de 11e: 1,04g
Tempo de reação: 1 h
Rendimento: 90%
p.f.: 2380C
IV (KBr, cm-1): 3400-2580(νOH); 1679(νC=O); 1592 e 1457 (νC=C e
νC=N);
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 8.61(s, H-3), 9.06(s, H-6),
8.26(d, 8.0, H-2’,6’), 7.63(dd, 7.5, H-3’,5’), 7.43(dd, 7.5, H-4’), 7.22(d,7.5,
H-3’’), 7.85(dd,7.5, H-4’’), 7.20(d,7.5, H-5’’), 11.65(s, CO2H), 3.45(s, ArCH3);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ):
EM: m/z 345,11121 [M+] (88); 300,11327 (100); 163,54639 (10); 92,04155
(9).
162
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Tese de doutorado
Obtenção dos derivados dos sistemas 3H-Benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6naftiridinas (14a-m) e 3H-pirido[2,3-b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridínas
(15a-c).
MÉTODO GERAL
Em balão de fundo redondo, adaptado a um condensador de refluxo,
munido com tubo de cloreto de cálcio, adicionou-se 0,0005 mol dos
derivados ácidos do tipo 12 e 13 e 3 mL de oxicloreto de fosfóro (POCl3).
A mistura reacional foi mantida sob refluxo, com tempo de reação variando
para cada derivado. Após o final da reação, verte-se em gelo picado,
basifica-se a pH 8-9, com hidróxido de sódio 10% e após filtragem seguida
de recristalização em etanol, obtêm-se os derivados com rendimento de
reação variando para cada produto obtido.
ü 6-Cloro-3-fenil-3H- benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina (14a-m).
Estes derivados foram obtidos pelo método citado anteriormente a
partir de uma reação de ciclização dos ácidos 4-anilino-1-fenil-1Hpirazolo[3,4-b]piridina-5-carboxílico (12a-m) com oxicloreto de fósforo.
163
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Tese de doutorado
ü 6-Cloro-3-fenil-3H-benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina (14a)
Quantidade de 12a: 0,17g
Tempo de reação: 3 h
Rendimento: 70%
p.f.: 2590C
IV (KBr, cm-1): 3084(νC-H); 1596 e 1502(νC=C e νC=N)
RMN 1H (300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 8.92(s, H-1), 8.40(d, 8.1, H10), 7.95(dd;8.1, H-9), 7.70(dd;8.1, H-8), 7.81(d;8.1, H-7), 9.40(s, H-5),
8.33(d;7.5, H-2’,6’), 7.50(dd;7.5, H-3’,5’), 7.52(dd;7.5, H-4’);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ):
EM: m/z 330,0 [M+] (50); 307,1 (100); 289,1 (55); 176,1 (100);
ü 6-Cloro-3-fenil-9-metoxi-3H-benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina
(14b).
Quantidade de 12b: 0,18g
Tempo de reação: 3 h
Rendimento: 65%
p.f.: >3000C
IV (KBr, cm-1): 3083(νC-H); 1595 e 1504(νC=C e νC=N)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 8.99(s, H-1), 7.26(s, H-10),
7.78-7.56(6H, m), 9.36 (s, H-5), 8.31(d; 8.0, H-2’,6’), 4.07(s, Ar-OCH3);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ):
EM: m/z 360,07037 [M+] (100); 316,04259 (7); 205,46065 (3); 180,03158
(7); 127,56506 (4); 77,03569 (5).
164
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Tese de doutorado
ü 6-Cloro-3-fenil-8-metoxi-3H-benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina
(14c).
Quantidade de 12c: 0,18g
Tempo de reação: 3 h
Rendimento: 70%
p.f.: >3000C
IV (KBr, cm-1): 3084(νC-H); 1597 e 1503(νC=C e νC=N)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 8.96(s, H-1), 7.87-7.55(m),
7.87-7.55(6H, m), 9.45 (s, H-5), 8.38(d;8.7, H-2’,6’), 3.99(s, Ar-OCH3);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ):
EM: m/z 360,1 [M+] (15); 329,2 (23); 307,0 (100); 289,1 (48); 176,1 (55).
ü 6-Cloro-3-fenil-9-metil-3H-benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina
(14d).
Quantidade de 12d: 0,17g
Tempo de reação: 3 h
Rendimento: 65%
p.f.: >3000C
IV (KBr, cm-1): 3083(νC-H); 1595 e 1503(νC=C e νC=N)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 8.99(s, H-1), 7.79-7.57(6H,
m), 9.42 (s, H-5), 8.40(d;8.4, H-2’,6’), 1.39(s, Ar-CH3);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ):
165
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Tese de doutorado
ü 6-Cloro-3-fenil-8-metil-3H-benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina
(14e).
Quantidade de 12e: 0,18g
Tempo de reação: 3 h
Rendimento: 69%
p.f.: >3000C
IV (KBr, cm-1): 3084(νC-H); 1590 e 1503(νC=C e νC=N)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 9.11(s, H-1), 7.92(d;8.4, H10), 7.84(d;8.4, H-9), 8.24(s, H-7), 9.44 (s, H-5), 8.41(d;8.4, H-2’,6’),
7.58(dd;7.8, H-3’,5’), 7.77(dd;7.8, H-4’), 1.38(s, Ar-CH3);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ):
ü 6,9-Dicloro-3-fenil-3H-benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina (14f).
Quantidade de 12f: 0,18g
Tempo de reação: 3 h
Rendimento: 60%
p.f.: >3000C
IV (KBr, cm-1): 3082(νC-H); 1598 e 1503(νC=C e νC=N)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 9.08(s, H-1), 7.99-7.53(6H,
m), 9.38 (s, H-5), 8.41(d;8.4, H-2’,6’);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ):
EM: m/z 364,01693 [M+] (100); 302,03316 (4); 183,00218 (12); 149,01226
(13); 83,07698 (8).
166
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Tese de doutorado
ü 6,8-Dicloro-3-fenil-3H-benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina (14g).
Quantidade de 12g: 0,18g
Tempo de reação: 3 h
Rendimento: 68%
p.f.: >3000C
IV (KBr, cm-1): 3084(νC-H); 1598 e 1503(νC=C e νC=N)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 8.97(s, H-1), 7.89(d;8.1, H10), 7.89(d;8.1, H-9), 8.22(s, H-7), 9.31 (s, H-5), 8.27(d;8.1, H-2’,6’),
7.46(dd;7.5, H-3’,5’), 7.65(dd;7.5, H-4’);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ):
ü 6-Cloro-3-fenil-9-nitro-3H-benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina
(14h).
Quantidade de 12h: 0,19g
Tempo de reação: 3 h
Rendimento: 60%
p.f.: >3000C
IV (KBr, cm-1): 3084(νC-H); 1596 e 1503(νC=C e νC=N)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ) 8.92 (s), 8.84(s), 8.05(d;7.5),
8.02(s), 9.40 (s), 8.31(d;7.5), 7.52(dd;7.5), 7.71(dd;7.5);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ):
EM: m/z 375,03743 [M+] (100); 329,04491 (25); 293,06669 (8); 77,02894
(12).
167
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Tese de doutorado
ü 6-Cloro-3-fenil-8-nitro-3H-benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina
(14i).
Quantidade de 12i: 0,19g
Tempo de reação: 3 h
Rendimento: 60%
p.f.: 2800C
IV (KBr, cm-1): 3100(νC-H); 1592 e 1500(νC=C e νC=N)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ) 8.92 (s, H-1), 8.84(s, H-10),
8.05(d;7.5, H-9), 8.02(s, H-7), 9.40 (s, H-5), 8.31(d;7.5, H-2’,6’),
7.52(dd;7.5, H-3’,5’), 7.71(dd;7.5, H-4’)
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ):
ü 6-Cloro-3-fenil-9-fluoro-3H-benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina
(14j).
Quantidade de 12j: 0,17g
Tempo de reação: 3 h
Rendimento: 60%
p.f.: 2750C
IV (KBr, cm-1): 3100(νC-H); 1600 e 1503(νC=C e νC=N)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ) 9.34(s, H-1), 8.45(s, H-10),
7.83-7.62(m), 9.02(d;8.4, H-7), 9.49 (s, H-5), 8.20(d;7.5, H-2’,6’),
7.25(dd;7.5, H-3’,5’), 7.41(dd;7.5, H-4’);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ):
EM: m/z 348,04188 [M+] (100); 321,02846 (11); 174,01290 (12); 77,02629
(10).
168
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Tese de doutorado
ü 6-Cloro-3-fenil-8-fluoro-3H-benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina
(14k).
Quantidade de 12j: 0,17g
Tempo de reação: 3 h
Rendimento: 60%
p.f.: 2780C
IV (KBr, cm-1): 3051(νC-H); 1598 e 1503(νC=C e νC=N)
RMN 1H (300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 9.06(s, H-1), 8.03(d;7.5, H-10),
8.03(d;7.5, H-9), 8.02(d;8.4, H-7), 9.37 (s, H-5), 8.32(d;7.5, H-2’,6’),
7.51(dd;7.5, H-3’,5’), 7.69(dd;7.5, H-4’);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ):
ü 9-Bromo-6-cloro-3-fenil-3H-benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina
(14l).
Quantidade de 12j: 0,20g
Tempo de reação: 3 h
Rendimento: 60%
p.f.: >3000C
IV (KBr, cm-1): 3052(νC-H); 1593 e 1503(νC=C e νC=N)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ) 9.05(s, H-1), 8.09(s, H-10),
7.90-7.50(5H, m), 9.30 (s, H-5), 8.30(d;7.5, H-2’,6’);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ):
EM: m/z 409,96178 [M+] (100); 382,95184 (5); 330,04865 (8); 267,06399
(7); 129,70243 (6); 77,02766 (9).
169
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Tese de doutorado
ü 8-Bromo-6-cloro-3-fenil-3H-benzo[b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridina
(14m).
Quantidade de 12j: 0,20g
Tempo de reação: 3 h
Rendimento: 60%
p.f.: >3000C
IV (KBr, cm-1): 3085(νC-H); 1596 e 1501(νC=C e νC=N)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ) 8.95(s, H-1), 7.92-7.52(5H, m),
8.42(d;8.4, H-7), 9.40 (s, H-5), 8.30(d;7.5, H-2’,6’);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ):
ü 6-cloro-3-fenil-3H-pirido[2,3-b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridínas
Estes derivados foram obtidos pelo método citado anteriormente a
partir de uma reação de ciclização dos ácidos 4-aminopiridina-1-fenil-1Hpirazolo[3,4-b]piridina-5-carboxílico (13a-m), com oxicloreto de fósforo.
6-cloro-3-fenil-7-metil-3H-pirido[2,3-b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridínas
(15a).
Quantidade de 13b: 0,17g
Tempo de reação: 6 h
Rendimento: 60%
p.f.: 2300C
IV (KBr, cm-1): 3085(νC-H); 1596 e 1501(νC=C e νC=N)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 8.72 (s, H-1), 8.26 (d, 7.5, H9), 7.68 (d, 7.5, H-8), 9.44 (s, H-5), 8.26 (dd, 7.5, H-2’,6’), 7.50 (dd, 7.5,
H-3’,5’), 7.68 (dd, 7.5, H-4’), 1.37 (s, Ar-CH3);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ):
170
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Tese de doutorado
6-cloro-3-fenil-8-metil-3H-pirido[2,3-b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridínas
(15b).
Quantidade de 13c: 0,17g
Tempo de reação: 6 h
Rendimento: 60%
p.f.: 2550C
IV (KBr, cm-1): 3084(νC-H); 1596 e 1502(νC=C e νC=N)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 8.72 (s, H-1), 8.92 (d, 7.5, H9), 7.91 (s, H-7), 9.58 (s, H-5), 8.42 (d, 7.5, H-2’,6’), 7.59 (dd, 7.5, H3’,5’), 7.78 (dd, 7.5, H-4’), 1.42 (s, Ar-CH3);
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ):
6-cloro-3-fenil-9-metil-3H-pirido[2,3-b]pirazolo[3,4-h]-1,6-naftiridínas
(15c).
Quantidade de 13d: 0,17g
Tempo de reação: 6 h
Rendimento: 60%
p.f.: 2470C
IV (KBr, cm-1): 3084(νC-H); 1596 e 1502(νC=C e νC=N)
RMN 1H ( 300 MHz, DMSO – d6, TMS, δ): 8.83 (s, H-1), 7.67 (d, 7.5, H8), 7.93 (d, 7.5, H-7), 9.41 (s, H-5), 8.39 (d, 7.5, H-2’,6’), 7.56 (dd, 7.5, H3’,5’), 7.75 (dd, 7.5, H-4’), 1.39 (s, Ar-CH3)
RMN 13C ( 75 MHz, DMSO – d6, TMS, δ):
171
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Tese de doutorado
ENSAIO BIOLÓGICO
ü AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DOS DERIVADOS NO
VÍRUS HSV-1
ü Células e Vírus
No presente estudo foram utilizadas células VERO (rins de macaco
verde africano), cedidas pelo Dr. Stephen J. Keller, da Universidade de
Cincinatti, e o vírus herpes simples tipo-1(HSV-1), cedido pela Profa.
Márcia Wigg do departamento de virologia da UFRJ.
ü Cultivo e manutenção de células
As células foram cultivadas em meio Dulbecco ( Dulbecco's
Modidied Eagle Medium), suplementado com estreptomicina, 10mg%,
penicilina, 5000 U, NaHCO3, 225mg%,fungizona, 0.25mg%, soro fetal
bovino(fazenda Pigue) inativado pelo calor ( 560C - 1 hora), 2% (v/v); soro
bovino, 8% (v/v), garamicida, 5mg%. Culturas para manutenção foram
desenvolvidas em garrafas de plástico para cultura de tecido mantidas em
estufa a 370C e em atmosfera de 5% de CO2. O repique das culturas
confluentes foi realizado de acordo com o seguinte procedimento: as
monocamadas de células foram lavadas duas vezes com solução tampão
estéril de PBS-EDTA ( solução salina de fosfato contendo NaCl 0.8%, KCl
0.02%, NaHPO4 0.15, NaH2PO4 0.02% E EDTA 1Mm).Foi adicionado
uma solução de tripsina 0,25%, em PBS e o frasco mantido à temperatura
de 370C por 2-3 minutos. Após a tripsinização, as células foram dispersadas
em meio de cultura apropriado, sendo agitadas suavemente. A suspensão de
células foi dividida em novos frascos na proporçào de 1:4.
172
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Tese de doutorado
ü Infecção das células com vírus Herpes simples tipo 1
A infecção das células VERO com
HSV seguiu o seguinte
procedimento: o meio de cultura de cada frasco foi removido e substituído
por 250ml de meio isento de soro, contendo um volume adequado de
suspensão de vírus estoque. A multiplicidade de infecção utilizada foi 1
pfu/célula. As placas foram mantidas a 370C e agitadas suavemente a cada
10 minutos durante 1 hora. Após esse período as partículas não adsorvidas
foram retiradas e meio de cultura novo foi adicionado às monocamadas,
mantidas a 370C em atmosfera de 2.5% de CO2 durante 48 horas.
ü Determinação da citotoxicidade
Diferentes concentrações dos novos derivados foram preparadas em
meio de Eagle modificado por DMEN e foram adicionados sobre culturas
de células VERO, com o objetivo de obter a concentração máxima não
tóxica (CMNT). Inicialmente, a ação tóxica dos derivados sobre as células
foi avaliada diretamente, observando-se as monocamadas de células ao
microscópio óptico invertido e verificando-se as alterações morfológicas
celulares. A viabilidade das células VERO foi determinada pela técnica de
exclusão do corante Azul de Tripan (Sigma CO), a 0,4g% em tampão PBS.
Para avaliação da viabilidade, as células foram mantidas em placas de 24
poços e aliquotas de 0,2mL das culturas foram retiradas e tratadas com
diferentes concentrações das substâncias por 48 horas. A seguir, esse
volume foi misturado com igual volume da solução corante e 0,3mL de
PBS. Após 10 minutos, aproximadamente 10µL desta suspensão foi
recolhida para contagem das células em câmara de Neubauer, com auxílio
de microscópio óptico. Os resultados foram expressos como porcentagem
de células viáveis em relação ao controle. Os valores obtidos foram
representativos de uma média de três experimentos realizados.
173
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Tese de doutorado
ü Determinação da atividade antiviral
Nos testes de atividade antiviral foram utilizados os vírus herpes
simples tipo 1 ( amostras isoladas no Departamento de Virologia da UFRJ).
A avaliação da atividade antiviral dos novos derivados foi realizada
utilizando-se células cultivadas em microplacas de 96 cavidades.. As
células VERO crescidas em meio DMEM suplemantado com 2% de soro
fetalbovino, foram infectadas com HSV-1, adsorvidas por 1h à 370C, em
atmosfera de 50% de CO2. Após adsorção o inóculo viral foi desprezado e
substituído por meio DMEM contendo ou não os derivados na
concentração de 50µM. Após 72h a inibição do efeito citopático induzido
pelo vírus foi determinada segundo método de Reed e Muench66.
ü AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DOS DERIVADOS NA
ATIVIDADE DA TRANSCRIPTASE REVERSA
RECOMBINANTE DO VÍRUS HIV-1
Preparo Dos Derivados
Os derivados tetracíclicos (14a-m), foram pesados em balança
analítica e solubilizados em água ou dimetil sufóxido. A seguir serão
preparadas soluções-estoque que serão estilizadas através de filtração em
membrana millipore 0,22 um, aliquotadas e congeladas a - 20o C.
As drogas sintetizadas pelo Instituto de Química, serão diluídas
em DMSO 100% estéril e congeladas.
ü Transcriptase reversa HIV-1
O Dr. Stephen H. Hughes do NCI-Frederick Cancer Institute,
Frederick MD nos enviou a enzima transcriptase reversa e os mutantes
correspondentes aos clones # 2822 (com ausência de atividade
polimerase, mas com atividade ribonuclease) e o clone # 8868 (contendo
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atividade polimerase, mas com ausência de atividade ribonuclease). As
bactérias DH5α contendo os plasmídeos serão crescidas por 12-16 horas
em incubadora com agitação orbital a 37°C. As células serão coletadas
por centrifugação a 10.000 rpm por 2 minutos e o sedimento lavado com
tampão contendo 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH
7.4. As bactérias serão rompidas em tampão contendo 0,2 M NaCl, 20 %
glicerol (v\v), 1 % Triton X-100, 1 mM EDTA, 2 mM ditiotreitol, 25
mM Tris-HCl, pH 8.0 e o lisado mantido a 4°C por 15 minutos. O
material insolúvel removido por centrifugação a 10.000 rpm por 2
minutos e o sobrenadante contendo a enzima serão mantidos em freezer
a - 20°C.
As transcriptases reversa do vírus da leucemia aviária (AMV) e da
leucemia murina foram adquiridas da Sigma.
ü Filtração em gel
As proteínas solúveis do lisado bacteriano (conforme descrito acima)
serão filtradas em colunas Sephadex G-25, com o objetivo de remover
possíveis inibidores da atividade enzimática. A coluna será préequilibrada com 0,2 M de NaCl, 2 mM de ditiotreitol, 0,2% de Triton X100, 20% glicerol, 25 mM de Tris-HCl, pH 7,4. Após a filtragem, as
colunas serão lavadas com o mesmo tampão utilizado para equilíbrio. A
concentração de proteínas será determinada nas frações coletadas e
posteriormente avaliada para as atividades polimerase e ribonuclease H.
ü Eletroforese em gel de poliacrilamida
As proteínas serão analisadas em gel de poliacrilamida SDS-PAGE
conforme descrito por Laemmli (1970). O sedimento celular será
rompido com tampão contendo, 1% SDS, 1% β-mercaptoetanol, 10 %
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glicerol e 50 mM de Tris Hcl, pH 6,8; 10 µg/ml de azul de bromofenol,
aquecido por 2 minutos a 100°C. A amostra será submetida a gel de
poliacrilamida 10% contendo 0,1% de SDS e corado com azul de
comassie 0,1%.
ü Minipreparação de DNA plasmidial
O procedimento adotado baseia-se na técnica descrita por Holmes e
Quigley (1981), com modificações. As bactérias serão inoculadas em 20 ml
de meio de cultura NZY contendo Ampicilina (100 µg/ml) e incubadas a
37 °C durante 12-16 horas, sob agitação. A cultura será dividida em tubos
eppendorf e centrifugada a 12.000xg por 2 minutos. O meio aspirado ao
máximo e as células de cada tubo ressuspensas em 0,35 ml de tampão
STET (sacarose 8g%, Triton X-100 (Sigma), 0,5 % (V/V); EDTA, pH 8,0,
50 mM; Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM). A seguir, serão adicionados 25 µl de
solução de lisozima (Sigma) (10mg/ml em TE pH 8,0) e a suspensão
agitada em vortex por 3 segundos. Os tubos serão colocados em banho
maria a 100 °C por 1 minuto e imediatamente centrifugados a 12.000 xg
por 15 minutos. Os sobrenadantes serão removidos e transferidos para
novos tubos. Em seguida, serão adicionados 40 µl de acetato de sódio 3 M,
pH 5,2 e 420 µl de isopropanol, os tubos serão misturados por inversão e
incubados a -70 °C por 30 minutos. As amostras serão centrifugadas a
12.000 xg por 15 minutos e os precipitados de cada tubo lavados com
etanol 70%, secos em nitrogênio e ressuspensos em 50 µl de TE pH 8,0. As
amostras serão reunidas duas a duas em tubo e adicionado 1 µl de Rnase A
(Boehringer Mannheim, 10 mg/ml). Os tubos mantidos a 37 °C por 30
minutos e então adicionados igual volume de clorofórmio. Após agitação
em vortex por 30 segundos as amostras serão centrifugadas a 12.000xg por
2 minutos. As fases aquosas passadas para tubos novos e novamente
extraídas com clorofórmio, conforme descrito. Em seguida as amostras
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serão precipitadas pela adição de 1/2 volume de acetato de amônia 7,5 M e
2 volumes de etanol 100% gelado, com incubação a -70 °C por 30 minutos.
Os tubos serão centrifugados a 12.000 xg por 15 minutos e os precipitados
lavados em etanol 70%. Após secos os precipitados serão ressuspensos em
100 µl de TE e mantidos a 4 °C.
ü Eletroforese em gel de agarose
A integridade dos DNAs plasmidiais será observada através de
eletroforese em gel de agarose (Sambrook et al., 1989). Alíquotas de 1 µl
serão retiradas e preparadas para a análise, pela adição de 3 µl de solução
corante (xileno cianol 0,02g%, azul de bromofenol, 0,02g%, glicerol, 50%
(V/V)e então aplicadas no gel. O gel para um volume de 20 ml (agarose 0,8
g%) será constituído de agarose pura (GIBCO BRL), 0,16 g, tampão Tris
acetato 0,04 M, pH 8,0, 20 ml; solução de brometo de etídio (10 mg/ml) 1
µl. Foi utilizado o sistema mini-gel da GIBCO BRL e montado conforme
instruções do fabricante. O tampão de corrida utilizado (130 ml) consistirá
de Tris-acetato 0,04 M, pH 8,0. Durante a corrida a voltagem será mantida
constante em 80 V por 40-50 minutos. O gel será retirado e analisado em
transluminador para ser fotografado.
ü Avaliação da atividade polimerase da enzima transcriptase
reversa
A mistura de reação para a atividade polimerase conterá em 10 µl de
reação: 50 mM de Tris-HCl, pH 7,8, 50 mM de KCl, 6 mM de MgCl2, 1
mM de ditiotreitol, 1 mg/ml de BSA, 5µM de dTTP, 20 µCi/ml de
[3H]dTTP (62 Ci/mmol), 0.20 DO de poly (rA).o (dT) e 1 mol da
enzima. O tempo de incubação será de 30 minutos a 37°C, e a reação
será interrompida pela adição de TCA 10%, contendo 20 mM de
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pirofosfato de sódio. O precipitado será então coletado em filtro
Whatman GF/C e lavado com TCA 10%. A radioatividade será
determinada através de cintilação líquida.
ü AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DOS DERIVADOS NA
REPLICAÇÃO DO VÍRUS MAYARO E VSV.
Cultura de células
Células VERO foram crescidas em meio DMEN ( meio de Eagle
modificado por Dulbecco), suplementado com NaHCO3 2,25%; 2% de soro
fetal bovino; 8% de soro bovino 500U/mL penicilina; 100µg/mL de
estreptomicina e anfotericina B( fungizona 2,5 µg/mL).
Vírus
Os estoques de vírus foram preparados em células BHK-21 e
mantidos na temperatura de –700C.
Para propagação dos vírus, culturas de BHK-21 confluentes foram
infectadas com vírus Mayaro ou VSV estoque, com MOI igual a 0,1. A
suspensão de vírus estoque foi diluída em meio de cultura contendo 2% de
soro fetal bovino.
A titulação de infectividade do vírus foi feita através da técnica de
contagem de placas em células TC, (rim de macaco).
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Tratamento das Drogas
Os derivados foram preparados em DNSO e adicionado ao meio de
cultura das células, nas concentrações indicadas (após a adsorção ou
estágio da cultura).
ü ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
Bactérias e condições de crescimento
As amostras de bactérias foram isoladas de pacientes do Hospital
Universitário Antônio Pedro (HUAP) e identificadas pelos métodos
microbiológicos e bioquímicos tradicionais. Os testes antibacterianos
preliminares com as substâncias isoladas foram realizados tanto em
bactérias Gram-positivas, como por exemplo: Enterococcus faecalis,
Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis, como Gramnegativas, como: Acinetobacter calcoaceticus, Enterobacter cloaceae,
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas
aeruginosa e Serratia marcesens.
Testes de sensibilidade em discos
Para estes testes, discos de papel Whatman n° 1 (5 mm de diâmetro)
eram embebidos em solução da substância: 5mg/mL durante 3 horas. Os
discos eram deixados secando por um período de 24 horas, à 37ºC. Assim
preparados, os discos eram colocados sobre a superfície de uma camada de
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bactérias, preparada como descrito a seguir: cultura com 5 horas de
crescimento à 37ºC (~1,0 x 109 ufc/mL) era diluída a 1:100 em NaCl
(0,85g/100mL). Uma alíquota de 0,3 mL é então espalhada (com swab)
sobre o ágar nas placas de petri. As placas eram colocadas à 37ºC durante
30 minutos. Feito isto, os discos eram assentados sobre as camadas das
bactérias (4 a 5 discos por placa). As placas eram incubadas à 37ºC por 24
horas e a sensibilidade determinada através da medida do diâmetro do halo
(zona) de inibição. Esta sensibilidade era considerada significativa quando
a zona de inibição for ≥ 16 mm. O DMSO, os antibióticos clínicos:
ciprofloxacina, gentamicina e vancomicina, juntamente com a cepa ATCC
(American Type Culture Collection) 29213 de S. aureus eram usados como
referências.
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7 - Referências Bibliográficas
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