Texto Completo - Apresentação

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PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
ÁREA DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS
Curso de Mestrado Acadêmico em Nanociências
ANA PAULA TASQUETTO DA SILVA
BIOMETRIA CUTÂNEA COM FORMULAÇÕES SEMISSÓLIDAS CONTENDO
NANOCÁPSULAS DE PALMITATO DE ASCORBILA
Santa Maria, RS
2012
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ANA PAULA TASQUETTO DA SILVA
BIOMETRIA CUTÂNEA COM FORMULAÇÕES SEMISSÓLIDAS CONTENDO
NANOCÁPSULAS DE PALMITATO DE ASCORBILA
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado
em Nanociências do Centro Universitário
Franciscano – UNIFRA de Santa Maria, como
requisito parcial para obtenção do título de
Mestre em Nanociências.
Orientadora: Profa Dra MARTA PALMA ALVES
Santa Maria, RS
2012
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Ficha Catalográfica
T199b
Silva, Ana Paula Tasquetto da
Biometria cutânea com formulações semissólidas contendo
nanocápsulas de palmitato de ascorbila / Ana Paula Tasquetto da
Silva; orientação Marta Palma Alves. – Santa Maria: Centro
Universitário Franciscano, 2012.
107 f. : il.
Dissertação (Mestrado em Nanociências) – Centro Universitário
Franciscano, 2012.
1. Palmitato de ascorbila 2. Nanocápsulas 3. Biometria cutânea
I. Alves, Marta Palma II. Tílulo
CDU 615.4:62-181.4
Elaborada pela Bibliotecária Zeneida Mello Britto CRB10/1374
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“Talvez meio caminho andado seja a gente acreditar no que faz. Mas acima de tudo, o
que mais nos incentiva, que mais nos valoriza e também mais nos torna conscientes da
nossa responsabilidade, é saber que os outros creem em nós. E não há palavras que
descrevam o que sentimos ao saber dos sacrifícios a que eles se impõem por crerem não
apenas em nós, mas também no que cremos.”
Albert Einstein
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AGRADECIMENTOS
Muitas pessoas estarão nestas páginas. Com certeza, cada uma delas será sempre lembrada,
pois todas contribuíram para este trabalho, cada uma à sua maneira. Não sei se saberei
expressar toda a minha gratidão, e talvez tenha esquecido de citar alguém, mas tenham
certeza de que cada um de vocês tem um lugar no meu coração e serei eternamente grata.
Primeiramente, agradeço a Deus que me concedeu capacidade física, emocional e intelectual
para realizar este trabalho, além de iluminar meus caminhos em todos os momentos.
Aos meus pais, Mário e Élida, que acreditaram e confiaram na minha capacidade, sempre me
incentivando a prosseguir... Pela educação que me transmitiram, marcada pela persistência e
dedicação para superar os obstáculos, para que eu pudesse atingir, assim, meus objetivos.
Pelo apoio que muitas vezes me fez ver as situações por outra maneira e que me foram
indispensáveis. Vocês foram mais do que essenciais na concretização desta vitória.
À minha família, que sempre torceu pelo meu sucesso e estiveram sempre presentes apesar da
distância. Em especial à Rafaella, Marcelo, Juliana, Marquinhos, Silvano, Thalita e Almir,
pelo incentivo e por me fazer perceber o lado positivo de cada dificuldade a ser superada, e
que, apesar das minhas longas ausências, sempre me esperavam com um sorriso no rosto e
uma palavra amiga. O apoio de vocês foi muito importante para eu chegar até aqui!!!
À minha querida orientadora, profª Marta Palma Alves, pelos ensinamentos transmitidos não
só para minha vida profissional, mas também como ser humano. Obrigada por toda
dedicação, disponibilidade, pela confiança depositada desde a graduação, pelas
oportunidades concedidas e, acima de tudo, pela amizade. E que nossa parceria continue
dando certo!!!
Ao professor Cristiano Rohden, pela co-orientação, ajuda e por toda atenção dispensada, por
ter acreditado em mim e no meu trabalho, pelo apoio, e pelas inúmeras sugestões que vieram
sempre para complementar ainda mais este trabalho.
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Aos professores Luis Bulhões, Renata Raffin, Patrícia Gomes e Sandra Cadore por todos os
conhecimentos compartilhados em muitos momentos, pela ajuda e apoio, e por sempre ter
uma resposta para minhas dúvidas. Obrigada por toda atenção e amizade durante esta
jornada!!!
Aos meus queridos colegas e amigos... em especial à Gabriela, Amanda, Michelli, Ricardo,
Graciela, Bibiana e Taiane pela companhia, incentivo, por dividir as inúmeras dúvidas que
surgiam ao longo do tempo, pelas ajudas em experimentos, mas sobretudo pelo
companheirismo, amizade, pelas muuuuuitas risadas compartilhadas, mesmo nos momentos
difíceis desta caminhada. Vocês fizeram meus dias no lab de Nano muito mais felizes!!!
Às minhas queridas “ICs”, Karoline e Alessandra, por todo auxílio e dedicação,
responsabilidade e competência, e por não me deixar desanimar em nenhum momento, por
mais difícil que ele tenha sido... mas acima de tudo agradeço pelo companheirismo, pelas
conversas, pelo ombro amigo, enfim, pela grande amizade que acabamos construindo.
Obrigada por tudo “maninhas”!!!
À Isabel Roggia, por toda atenção, incentivo e auxílio na realização deste trabalho, por
compartilhar seus conhecimentos, me fazendo entender sempre um pouco mais sobre este
“mundo nano”, tentando decifrar comigo as inúmeras dúvidas que surgiam... e agora,
mesmo distante, continua sempre presente, disposta a me ajudar, em qualquer momento. Isa,
obrigada por tudo, principalmente pela tua amizade!!!
Aos funcionários Rosane e Cláudio pelo auxílio prestado e pela amizade.
À CAPES, pelo apoio financeiro.
À profª Ivana Zanella pelo apoio e ajuda, à profª Solange Fagan pela oportunidade
concedida de estágio no Comitê de Ética desta instituição, o qual foi um aprendizado muito
importante; e aos demais professores pelo incentivo na realização deste Mestrado.
Enfim, a todos aqueles que estiveram ao meu lado... Muito Obrigada!!!
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RESUMO
O envelhecimento é um processo que ocorre naturalmente em nosso organismo, resultando em uma
série de mudanças estruturais em nossa pele, como a perda transepidérmica de água, aparecimento de
xerose senil (pele seca) e distúrbios de hiperpigmentação. A vitamina C é um poderoso antioxidante e
possui comprovada capacidade de inibição da melanogênese, torna-se um agente clareador cutâneo.
Entretanto, sua baixa estabilidade é uma séria limitação. Assim, o palmitato de ascorbila (PA), seu
derivado lipossolúvel, surge como um promissor agente para incorporação em formulações tópicas.
Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver, caracterizar e determinar a
estabilidade físico-química de formulações tópicas semissólidas contendo nanocápsulas de palmitato
de ascorbila, tendo como núcleo oleoso o óleo de rosa mosqueta. Associado a isso, foi verificada a
segurança do ativo in vivo, através de ensaios de biometria cutânea. Foram desenvolvidas e
caracterizadas suspensões contendo PA associado à nanocápsulas (NCPA) e uma suspensão de
nanocápsulas sem o ativo (NCBC), sendo que a estabilidade foi avaliada durante 90 dias (25 ºC ± 2 ºC
e 3 ºC ± 2 ºC). As suspensões de NCPA apresentaram inicialmente um teor de 82,95 %, pH 4,21,
diâmetro de partícula de 269,7 nm, índice de polidispersão em torno de 0,2 e potencial zeta de -47,03
mV. Posteriormente, foram incorporados em bases semissólidas de gel de Carbopol® o ativo na forma
livre (GPA) e associado à nanocápsulas (GNCPA), sendo armazenados, por 90 dias, para estudo de
estabilidade, através das determinações de pH, quantificação do teor de ativo, determinação das
características organolépticas, determinação da viscosidade e espalhabilidade. Todas as formulações
apresentaram inicialmente um pH levemente ácido e um aspecto homogêneo. Obteve-se uma maior
concentração de ativo no GNCPA, sugerindo que as nanocápsulas possam estar exercendo uma maior
proteção do PA. Contudo, foi possível observar uma diminuição em ambas as formulações, nas
diferentes temperaturas, após 90 dias de análise; sendo que, ao final deste período, o GNCPA
permaneceu com uma maior concentração de PA. Quanto aos aspectos reológicos, independente da
forma de dispersão do fármaco, as formulações apresentaram um caráter não-newtoniano e
comportamento pseudoplástico, e uma espalhabilidade adequada durante todo o período de análise.
Para o ensaio de biometria cutânea, foram selecionados vinte voluntários saudáveis, sendo que a cada
semana foram realizados testes de avaliação do conteúdo aquoso do estrato córneo (hidratação), pH,
perda transepidérmica de água, melanina e eritema, durante 90 dias. De acordo com os resultados
observados com relação à determinação da hidratação cutânea, observou-se uma redução mais
pronunciada (24 %) dos valores do conteúdo aquoso do estrato córneo nas regiões tratadas com GPA,
enquanto que com o GNCPA obteve-se um aumento na hidratação (21 %). Os valores de pH cutâneo
não sofreram alterações significativas durante o experimento para ambas formulações, sendo que estes
valores encontram-se dentro dos limites considerados satisfatórios para o uso de produtos tópicos. Foi
observado um aumento na perda transepidérmica de água para ambos os géis, entretanto, para o GPA
este aumento foi um pouco maior (39 %). Desta forma, evidenciou-se que as nanocápsulas apresentam
uma tendência para evitar a perda transepidérmica de água, o que favorece o grau de hidratação
cutânea e mantêm a integridade do estrato córneo. Nos resultados obtidos para conteúdo de melanina,
verificou-se uma redução deste parâmetro no decorrer do experimento para ambas as formulações,
sendo mais pronunciado no GNCPA (23 %). Os GNCPA e GPA não causaram eritema, configurando
a segurança na utilização destes produtos.
Palavras-chave: palmitato de ascorbila, nanocápsulas, biometria cutânea
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ABSTRACT
Aging is a natural occurring process in our body, resulting in a series of structural changes in our skin,
such as transepidermal water loss, senile xerosis (dry skin) and hyperpigmentation disorders. Vitamin
C is a powerful antioxidant and have ability to inhibit melanogenesis, and skin bleaching agent.
However, his low stability is a serious limitation. Thus, ascorbyl palmitate (AP), lipid-soluble
derivative, appears as a promising agent for incorporation in topical formulations. Thus, this study aim
to develop, characterize and determine the physical-chemical stability of topical semisolid
formulations containing nanocapsules of the ascorbyl palmitate, with the oily nucleus of the Rosehip
oil. Associated to this, the safety of the active in vivo by non-invasive biophysical analysis was
verified. Suspensions containing the PA associated to the nanocapsules (NCPA) and suspensions
without the active (NCBC) were developed and characterized, and stability was evaluated for 90 days
(25 °C ± 2 °C and 3 °C ± 2 °C). Inicially, the NCPA suspensions presented content equal to 82,95 %,
pH 4,21, average particle diameter of 269,7 nm, polydispersity index of around 0,2 and zeta potential
of -47,03 mV. After, the active in the free form (GPA) and associated to the nanocapsules (GNCPA)
were incorporated in semi-solid basis of Carbopol® gel and stored, for 90 days, for stability studies, by
determination of the pH, active content quantification, organoleptic characteristics determination,
viscosity determination and spreadability. All formulations presented slightly acidic pH and a
homogeneous aspect. We obtained a higher concentration of active GNCPA, suggesting that
nanocapsules may exert a greater protection of the PA. However, in both formulations in different
temperatures, after 90 days analysis a decrease was observed and the GNCPA remain with a higher
concentration of PA. Regarding to the rheological behavior, independently of drug dispersion, all
formulations showed a non-Newtonian character and pseudoplastic behavior together with an adequate
spreadability during the analysis period. For the bioengineering skin measurements, twenty healthy
volunteers were selected, and during 90 days, every week, were performed biometric skin tests
including stratum corneum water content (hydration), pH, transepidermal water loss, color and
erythema. According to the results observed in relation to the determination of skin hydration, there
was pronounced reduction (24 %) of the values of the stratum corneum water content in the areas
treated with GPA, while GNCPA obtained an increased in hydration (21 %). The skin pH values not
change significant during the experiment for both formulations, and this values are into the
satisfactory limits for the use in topical products. We observed an increase in transepidermal water
loss for both gels, however, to the GPA, this increased was slightly larger (39 %). Thus, it was evident
that the nanocapsules have a tendency to avoid the transepidermal water loss, favoring the skin
hydration degree and maintain the integrity of the stratum corneum. In the results obtained for melanin
content, there was a decrease in this parameter during the experiment for both formulations, being
more pronounced in GNCPA (23 %). The GNCPA and GPA did not cause erythema, configuring
security in the use of these formulations.
Keywords: ascorbyl palmitate, nanocapsules, non-invasive method.
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA - Ácido ascórbico;
ACN - Acetonitrila;
ANOVA - Análise de Variância;
BC - Branco;
BHT - Butil hidroxitolueno;
CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência;
DM - Diâmetro Médio;
DOPA - Diidroxifenilalanina;
DP - Desvio Padrão;
DPR - Desvio Padrão Relativo;
EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetra-acético;
FM - Fase móvel;
GPA - Gel contendo palmitato de ascorbila na forma livre;
GNCPA - Gel contendo palmitato de ascorbila na forma nanoencapsulada;
IPD - Índice de Polidispersão;
MeOH - Metanol;
NC - Nanocápsulas;
NCBC - Nanocápsulas sem ativo;
NCPA - Nanocápsulas contendo palmitato de ascorbila;
NCPAME - Nanocápsulas contendo palmitato de ascorbila e óleo de melaleuca;
NCPARM - Nanocápsulas contendo palmitato de ascorbila e óleo de rosa mosqueta;
NCPACE - Nanocápsulas contendo palmitato de ascorbila e óleo de cenoura;
NLS - Nanopartículas Lipídicas Sólidas;
NNI - National Nanotechnology Initiative;
PA - Palmitato de ascorbila;
PCL - Poli(ε-caprolactona);
PTEA - Perda Transepidérmica de Água;
TA - Taxa de associação;
U.A. - Unidades Arbitrárias;
UV - Ultravioleta.
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 – Fórmula estrutural da vitamina C........................................................................... 22
Figura 2 – Fórmula estrutural do palmitato de ascorbila ......................................................... 23
Figura 3 – Representação esquemática de nanocápsulas: a) fármaco adsorvido na parede
polimérica; b) fármaco disperso por toda a partícula ............................................................... 27
Figura 4 – Estrutura molecular do Eudragit® L100 ................................................................. 28
Figura 5 – Representação esquemática do local de aplicação das formulações no antebraço
dos voluntários.......................................................................................................................... 45
Figura 6 – Representação gráfica da curva de calibração ....................................................... 48
Figura 7 – Teor de PA em diferentes temperaturas, durante 90 dias de experimento. ............ 52
Figura 8 – Variação do diâmetro médio (nm) x tempo das NCPA (●) e das NCBC (■) ........ 59
Figura 9 – Valor de potencial zeta (-mV) obtido inicialmente para a amostra de nanocápsulas
contendo PA (NCPA). .............................................................................................................. 61
Figura 10 – Valor de potencial zeta (-mV) obtido inicialmente para a amostra controle de
nanocápsulas sem ativo (NCBC). ............................................................................................. 62
Figura 11 – Teor de PA nas formulações semissólidas em diferentes temperaturas, durante 90
dias de experimento. ................................................................................................................. 66
Figura 12 – Aspecto inicial das formulações semissólidas contendo palmitato de ascorbila na
forma livre (A) e na forma nanoencapsulada (B). .................................................................... 68
Figura 13 – Aspecto das formulações semissólidas contendo palmitato de ascorbila livre (A)
e nanoencapsulado (B) armazenados em 25 ºC ± 2 ºC, após 90 dias de experimento. ............ 68
Figura 14 – Aspecto das formulações semissólidas contendo palmitato de ascorbila livre (A)
e na forma nanoencapsulada (B) armazenados em 3 ºC ± 2 ºC, após 90 dias de experimento.69
Figura 15 – Análise inicial das curvas ascendentes dos reogramas das formulações de
GNCPA e GPA. ........................................................................................................................ 74
Figura 16 – Reograma para as formulações semissólidas de GNCPA e GPA, referentes aos
valores iniciais e finais. ............................................................................................................ 75
Figura 17 – Espalhabilidade inicial das formulações de GNCPA e GPA em função do peso
adicionado................................................................................................................................. 77
Figura 18 – Representação gráfica dos valores médios obtidos no período de 90 dias, no
ensaio de biometria cutânea, para o conteúdo aquoso presente no estrato córneo (n = 20) ..... 81
Figura 19 – Representação gráfica dos valores médios obtidos no período de 90 dias, no
ensaio de biometria cutânea, para os valores de pH (n = 20) ................................................... 84
Figura 20 – Representação gráfica dos valores médios obtidos no período de 90 dias, no
ensaio de biometria cutânea, para perda transepidérmica de água (n = 20) ............................. 86
Figura 21 – Representação gráfica dos valores médios obtidos no período de 90 dias, no
ensaio de biometria cutânea, para melanina (n = 20) ............................................................... 89
Figura 22 – Representação gráfica dos valores médios obtidos no período de 90 dias, no
ensaio de biometria cutânea, para os valores de eritema (n = 20) ............................................ 91
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ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1 - Composição das suspensões de nanocápsulas contendo palmitato de ascorbila
(NCPA) e na ausência do ativo (branco) .................................................................................. 37
Tabela 2 – Curva padrão usada para determinação do palmitato de ascorbila nas suspensões
.................................................................................................................................................. 38
Tabela 3 - Composição do gel hidrofílico contendo nanocápsulas de palmitato de ascorbila...
.................................................................................................................................................. 40
Tabela 4 – Teor de palmitato de ascorbila (%) associado à nanocápsulas com diferentes
antioxidantes e diferentes núcleos oleosos, armazenadas em 3 ºC ± 2 ºC, no período de 21
dias. ........................................................................................................................................... 50
Tabela 5 – Teor de palmitato de ascorbila (%) associado à nanocápsulas, no período de 90
dias, em 25 ºC ± 2 ºC e 3 ºC ± 2 ºC. ......................................................................................... 51
Tabela 6 – Valores de pH para as formulações contendo nanocápsulas de palmitato de
ascorbila (NCPA) e nanocápsulas sem o ativo (NCBC), no período de 90 dias, em 25 ºC ±
2 ºC e 3 ºC ± 2 ºC. .................................................................................................................... 55
Tabela 7 – Valores referentes ao diâmetro médio das partículas (DM) e índice de
polidispersão (IPD) para as formulações de nanocápsulas contendo palmitato de ascorbila
(NCPA) e nanocápsulas sem o ativo (NCBC), no período de 90 dias, para as amostras
armazenadas em 25 ºC ± 2 ºC e 3 ºC ± 2 ºC. ............................................................................ 57
Tabela 8 – Valores referentes ao potencial zeta (-mV) para as formulações de nanocápsulas
(NCPA) e nanocápsulas sem o ativo (NCBC), no período de 90 dias, em 25 ºC ± 2 ºC e 3 ºC ±
2 ºC. .......................................................................................................................................... 60
Tabela 9 – Teor de palmitato de ascorbila (%) referente às amostras de gel de Natrosol® e
Carbopol®, contendo o ativo na forma nanoencapsulada e na forma livre, no período de 35
dias. ........................................................................................................................................... 64
Tabela 10 – Teor de palmitato de ascorbila (%) referente às amostras de gel contendo o ativo
na forma nanoencapsulada (GNCPA) e na forma livre (GPA), no período de 90 dias, em
25 ºC ± 2 ºC e 3 ºC ± 2 ºC. ....................................................................................................... 65
Tabela 11 - Parâmetros referentes à aparência, cor e odor das formulações semissólidas
contendo palmitato de ascorbila na forma nanoencapsulada (GNCPA) e na forma livre (GPA),
armazenados em 25 ºC ± 2 ºC e 3 ºC ± 2 ºC por 90 dias. ......................................................... 67
Tabela 12 – Valores de pH para as amostras de gel contendo o ativo na forma
nanoencapsulada (GNCPA) e na forma livre (GPA), no período de 90 dias, em 25 ºC ± 2 ºC e
3 ºC ± 2 ºC. ............................................................................................................................... 70
Tabela 13 – Valores referentes à viscosidade (Pa.s-1), índice de plasticidade (n) e coeficiente
de consistência (k) das amostras de gel contendo o ativo na forma nanoencapsulada (GNCPA)
e na forma livre (GPA), no período de 90 dias. ........................................................................ 72
Tabela 14 – Valores referentes à espalhabilidade (mm2) das amostras de gel contendo o ativo
na forma nanoencapsulada (GNCPA) e na forma livre (GPA), no período de 90 dias. ........... 76
Tabela 15 – Determinação do conteúdo aquoso do estrato córneo realizado por biometria
cutânea utilizando gel contendo PA na forma nanoencapsulada (GNCPA) e na forma livre
(GPA) ....................................................................................................................................... 80
12
Tabela 16 - Determinação do pH realizado por biometria cutânea utilizando gel contendo PA
na forma nanoencapsulada (GNCPA) e na forma livre (GPA) ................................................ 83
Tabela 17 - Determinação da perda transepidérmica de água realizada por biometria cutânea
utilizando gel contendo PA na forma nanoencapsulada (GNCPA) e na forma livre (GPA).... 85
Tabela 18 - Determinação do conteúdo de melanina realizado por biometria cutânea
utilizando gel contendo PA na forma nanoencapsulada (GNCPA) e na forma livre (GPA).... 88
Tabela 19 - Determinação da presença de eritema realizado por biometria cutânea utilizando
gel contendo PA na forma nanoencapsulada (GNCPA) e na forma livre (GPA)..................... 90
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 15
1.1 Interdisciplinaridade ........................................................................................................... 17
2 REFERENCIAL TEÓRICO .............................................................................................. 18
2.1 PELE ................................................................................................................................... 18
2.2 MELANINA ....................................................................................................................... 19
2.3 MELASMA ........................................................................................................................ 20
2.4 DESPIGMENTANTES ...................................................................................................... 21
2.4.1 Vitamina C....................................................................................................................... 22
2.4.2 Óleo de Rosa Mosqueta ................................................................................................... 24
2.5 A PELE COMO VIA DE ADMINISTRAÇÃO TÓPICA ................................................. 25
2.6 NANOTECNOLOGIA ....................................................................................................... 26
2.7 BIOMETRIA CUTÂNEA .................................................................................................. 29
2.7.1 Determinação do conteúdo aquoso do estrato córneo (hidratação cutânea) .................... 30
2.7.2 Determinação do pH cutâneo .......................................................................................... 31
2.7.3 Determinação da intensidade de melanina e eritema....................................................... 32
2.7.4 Determinação da perda transepidérmica de água ............................................................ 33
3 METODOLOGIA................................................................................................................ 35
3.1 PREPARAÇÃO DAS SUSPENSÕES ............................................................................... 36
3.1.1 Determinação quantitativa do palmitato de ascorbila...................................................... 37
3.1.1.1 Construção da curva analítica ..................................................................................... 38
3.1.1.2 Teor de palmitato de ascorbila nas suspensões ........................................................... 38
3.1.2 Caracterização físico-química das suspensões contendo nanocápsulas de palmitato de
ascorbila .................................................................................................................................... 39
3.1.2.1. Determinação da Taxa de Associação (TA%) de PA nas suspensões de nanocápsulas
.................................................................................................................................................. 39
3.1.2.2 Determinação do pH .................................................................................................... 39
3.1.2.3 Determinação do diâmetro médio das partículas e índice de polidispersão (IPD) ..... 40
3.1.2.4 Potencial zeta................................................................................................................39
3.1.3 Estabilidade das suspensões de nanocápsulas contendo palmitato de ascorbila ............. 40
3.2 PREPARAÇÃO DAS FORMULAÇÕES SEMISSÓLIDAS ............................................ 40
3.2.1 Estudos de estabilidade das bases semissólidas .............................................................. 41
3.2.1.1 Teor de palmitato de ascorbila incorporado nas formulações semissólidas ............... 41
3.2.1.2 Determinação das características organolépticas ....................................................... 42
3.2.1.3 Determinação do pH .................................................................................................... 42
3.2.1.4 Avaliação da viscosidade ............................................................................................. 42
3.2.1.5 Determinação da espalhabilidade ................................................................................ 43
3.3 BIOMETRIA CUTÂNEA .................................................................................................. 43
3.3.1 Critérios de inclusão e exclusão para seleção de voluntários .......................................... 43
3.3.2 Condições experimentais ................................................................................................. 44
3.3.3 Estudos de biometria cutânea .......................................................................................... 44
3.3.3.1 Determinação do conteúdo aquoso do estrato córneo (grau de hidratação cutânea). 45
3.3.3.2 Determinação do pH cutâneo ....................................................................................... 46
3.3.3.3 Determinação da perda transepidérmica de água (PTEA) .......................................... 47
3.3.3.4 Determinação da intensidade de melanina e eritema .................................................. 46
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................................. 47
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ...................................................................................... 48
4.1 PREPARAÇÃO DAS SUSPENSÕES ............................................................................... 48
14
4.2 DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DO PALMITATO DE ASCORBILA ................ 48
4.2.1 Curva analítica ................................................................................................................. 48
4.3 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DAS SUSPENSÕES DE NANOCÁPSULAS
CONTENDO PALMITATO DE ASCORBILA ...................................................................... 49
4.3.1 Teor de palmitato de ascorbila nas suspensões ............................................................... 49
4.3.2 Determinação da Taxa de Associação (TA%) de PA nas suspensões de nanocápsulas.. 54
4.3.3 Determinação do pH ........................................................................................................ 57
4.3.4 Determinação do diâmetro médio das partículas e índice de polidispersão (IPD) .......... 60
4.3.5 Potencial zeta ................................................................................................................... 54
4.4 ESTUDOS DE ESTABILIDADE DAS BASES SEMISSÓLIDAS .................................. 63
4.4.1 Teor de palmitato de ascorbila incorporado nas formulações semissólidas .................... 63
4.4.2 Determinação das características organolépticas ............................................................ 67
4.4.3 Determinação do pH ........................................................................................................ 70
4.4.4 Avaliação da viscosidade................................................................................................. 72
4.4.5 Determinação da espalhabilidade .................................................................................... 75
4.5 BIOMETRIA CUTÂNEA .................................................................................................. 78
4.5.1 Estudos de biometria cutânea .......................................................................................... 79
4.5.1.1 Determinação do conteúdo aquoso do estrato córneo (grau de hidratação cutânea). 80
4.5.1.2 Determinação do pH cutâneo ....................................................................................... 82
4.5.1.3 Determinação da perda transepidérmica de água (PTEA) .......................................... 85
4.5.1.4 Determinação do conteúdo de melanina ...................................................................... 87
4.5.1.5 Determinação da presença de eritema ......................................................................... 90
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................................. 93
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 95
15
1 INTRODUÇÃO
Em um mundo cada vez mais globalizado e competitivo, a aparência física tornou-se
um aspecto de grande importância na sociedade contemporânea. As manchas da pele
(discromias), principalmente as faciais, não são estéticas e causam alguns transtornos que
dificultam o bem-estar do indivíduo no âmbito psicossocial (SATO et al., 2007).
As discromias são causadas, de modo geral, pela alteração na produção, na
transferência ou na perda de melanina da pele, podendo ser classificadas como hipercromias
ou hipocromias (NEVES, 2010). O melasma é uma hipermelanose comum, adquirida, que
tem como característica clínica principal manchas hiperpigmentadas simétricas, em geral na
face. O tratamento do melasma envolve o uso de agentes tópicos despigmentantes, além de
terapias físicas complementares (GUPTA et al., 2006; BANDYOPADHYAY, 2009).
Os despigmentantes, substâncias que atuam diretamente sobre a região discrômica
hiperpigmentada, têm sido largamente prescritos pelos dermatologistas. Sua formulação
contém um ou vários compostos ativos que podem ser classificados de acordo com seu
mecanismo de inibição da melanogênese. Entre os despigmentantes mais usados atualmente,
pode-se citar como exemplos: hidroquinona, ácido kójico, vitamina C, ácido fítico, dentre
outros (LEONARDI, 2004; GUIMARÃES et al., 2005; RENDON et al., 2006; PICARDO e
CARRERA, 2007).
A vitamina C tem sido usada em produtos cosméticos e dermatológicos, uma vez que
tem muitos efeitos favoráveis sobre a pele. Como um agente redutor, ela pode destruir agentes
agressivos oxidantes e radicais livres, e devido à sua capacidade para suprimir a pigmentação
da pele e decomposição de melanina, pode ser usada como despigmentante (SPICLIN,
GASPERLIN e KMETEC, 2001; GOSENCA et al., 2010). Porém, a sua instabilidade em
formulações aquosas e quando expostas ao oxigênio e à luz dificultam o emprego desta em
fórmulas tópicas (DALCIN, SCHAFFAZICK e GUTERRES, 2003; LEONARDI, 2004).
O palmitato de ascorbila, seu derivado lipossolúvel, apresenta-se como uma forma
mais estável da vitamina C e surge como um promissor agente para incorporação em
formulações tópicas (KRISTL et al., 2003). Este derivado apresenta atividade antioxidante
semelhante a vitamina C, penetra mais facilmente na pele e tem maior capacidade de proteger
16
os componentes cutâneos contra a ação dos radicais livres (PANEVA et al., 2011); além
disso, é um agente clareador da pele muito usado em cosméticos (YUAN et al., 2011).
Alguns autores também têm relatado a utilização do óleo de rosa mosqueta para o
tratamento da pele hiperpigmentada. Este óleo é obtido das sementes de uma planta originária
de regiões do Mediterrâneo e da Europa Central, a Rosa aff. rubiginosa, e além de diminuir
manchas em pele hiperpigmentada, apresenta propriedades de regeneração da pele, causando
efeitos nas suas camadas mais externas, como a diminuição de feridas, aumento da
cicatrização tecidual; e também revitalização das células das camadas mais internas,
responsáveis pela firmeza, hidratação e elasticidade da pele (SANTOS, VIEIRA e
KAMADA, 2009).
Atualmente, métodos têm sido estudados para diminuir a possibilidade de
fotodegradação de fármacos, como a sua inclusão em nanocápsulas, as quais têm demonstrado
bons resultados. As nanocápsulas são sistemas vesiculares em que o fármaco encontra-se no
interior de uma cavidade oleosa circundada por uma membrana polimérica, ou podendo
também ser encontrado adsorvido na membrana polimérica (SANTOS e FIALHO, 2008).
Além de proteger contra a fotodegradação, as nanocápsulas proporcionam maior performance
da
substância
ativa
na
pele.
Permitem
uma
liberação
gradual
da
substância,
concomitantemente com o aumento do tempo de contato com a mesma, evitando possíveis
irritações locais que poderiam ocorrer, caso o ativo estivesse livre, isto é, se todo ele estivesse
disponível para agir, de uma só vez (SCHMALTZ, SANTOS e GUTERRES, 2005).
Para o desenvolvimento de uma formulação dermocosmética, torna-se necessário a
utilização de métodos que comprovem a eficácia e a segurança de uso do produto
desenvolvido (DECCACHE, 2006). A biometria cutânea consiste no estudo das
características biológicas, mecânicas e funcionais da pele por meio de medidas objetivas e
criteriosas de algumas variáveis, por métodos cientificamente comprovados (LEONARDI,
GASPAR e MAIA CAMPOS, 2002; WISSING e MÜLLER, 2003; CAMARGO Jr., 2006;
OLIVEIRA, 2009). Os equipamentos utilizados para este fim permitem que diversos
parâmetros sejam avaliados, como por exemplo, conteúdo aquoso do estrato córneo
(hidratação), teor lipídico (oleosidade), pH, coloração da pele, perda transepidérmica de água,
dentre outros.
17
Baseado nos fatos relatados, o estudo de formulações contendo derivados de vitamina
C nanoencapsulada, através de ensaios de biometria cutânea, torna-se de grande relevância
para o desenvolvimento de formulações mais estáveis, seguras e eficientes. Além disso, tratase de um método não invasivo, rápido e seguro de se aplicar a humanos, uma vez que é
possível avaliar a pele in vivo, em tempo real, sem a necessidade de se violar sua integridade.
Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver, caracterizar e determinar a
estabilidade físico-química de uma formulação tópica semissólida contendo palmitato de
ascorbila na forma nanoencapsulada, tendo como núcleo oleoso o óleo de rosa mosqueta; e
posteriormente realizar ensaios in vivo de biometria cutânea.
1.1 Interdisciplinaridade
Inúmeros estudos estão sendo desenvolvidos no que se refere às potencialidades
terapêuticas de suspensões coloidais visando à obtenção de formulações biofarmacêuticas
mais eficazes (PAESE et al., 2009). Baseando-se na nanotecnologia, torna-se possível
desenvolver sistemas carreadores capazes de ultrapassar diversos problemas associados aos
sistemas convencionais, dentre eles a manutenção de estabilidade adequada, maior absorção,
controle de liberação e potencialização da atividade farmacodinâmica do ativo (SANTOS e
FIALHO, 2008).
Entretanto, há várias outras aplicações dessa nova tecnologia, como no uso de
catalisadores nanométricos para a proteção ao meio ambiente, maior capacidade de
armazenamento e processamento de dados computacionais, na economia de energia e também
para a criação de mecanismos de entrega de fármacos de maneira seletiva (drug delivery)
(SILVA, 2002).
Esta possibilidade de convergência das diferentes áreas como a Química, a Biologia e
a Física, é o que leva a nanotecnologia a ter uma multiplicidade de aplicações. Devido a esse
caráter interdisciplinar, acredita-se que a nanotecnologia tenha o potencial de revolucionar
áreas científicas e tecnológicas. Devido a isso, cabe ressaltar que este trabalho pode ser
desenvolvido devido ao caráter interdisciplinar do Mestrado em Nanociências, uma vez que
abrange conhecimentos específicos da Farmácia bem como de outras áreas, principalmente da
Química, sendo que princípios e reações químicas foram essenciais para o entendimento do
mecanismo de ação deste fármaco.
18
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 PELE
Para se ter ideia de como ocorrem as discromias, é preciso conhecer a estrutura da
pele. A pele é um órgão de revestimento complexo e heterogêneo, é o maior do corpo
humano, compreendendo 15 % do seu peso total, com superfície de aproximadamente 2 m2
num indivíduo adulto (LEONARDI, 2004; OLIVEIRA et al., 2004; NEVES, 2010).
A pele é formada por diferentes estruturas e com diversos tipos celulares, que atua
como uma barreira protetora dos órgãos internos ao ambiente, enquanto mantém o balanço
entre proliferação e descamação celular. Mais que qualquer outro tecido, é exposta a inúmeros
agentes químicos, físicos e microbiológicos, muitos dos quais induzem à formação de
espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio (GUARATINI, MEDEIROS e COLEPICOLO,
2007). É constituída basicamente por três camadas distintas: a epiderme, a derme e a
hipoderme (PRUNIERAS, 1994; HERNANDEZ e MERCIER-FRESNEL, 1999).
- EPIDERME: é a camada mais externa, constituída por um epitélio pavimentoso
estratificado e por células diferenciadas, como queratinócitos, células de Langerhans e células
de Merckel (OLIVEIRA et al., 2004; COELHO, 2005). É nela também que se encontram os
melanócitos, que compõe 13 % das células da epiderme (PRUNIERAS, 1994; LEONARDI e
CHORILLI, 2008; NEVES, 2010). Suas células constituem um sistema dinâmico, ou seja,
estão em constante renovação, desde sua junção com a derme até a superfície cutânea, onde se
efetua uma descamação permanente (LEONARDI, 2004).
A epiderme pode ser distinguida por quatro camadas, começando da mais profunda em
direção à superfície, há o estrato germinativo ou camada basal, o estrato espinhoso, o estrato
granuloso e o estrato córneo. A camada basal é formada por células mais jovens, que
apresentam uma intensa atividade mitótica, sendo responsável pela constante renovação da
epiderme. O estrato espinhoso encontra-se acima da camada basal, enquanto que o estrato
granuloso situa-se entre o estrato córneo e o espinhoso (LEONARDI, 2004). Já a porção
menos permeável da epiderme é o estrato córneo, onde as células são mais queratinizadas e o
teor de lipídios é mais elevado (LEONARDI e CHORILLI, 2008; NEVES, 2010).
- DERME: é a camada intermediária, que nutre a epiderme e protege o corpo contra
lesões mecânicas. Nessa camada estão presentes os folículos pilosos, as glândulas, as
19
terminações nervosas, os vasos sanguíneos, alguns tipos de células, sendo a maioria
fibroblastos, e as fibras de colágeno e elastina, responsáveis por sua elasticidade (OLIVEIRA
et al., 2004; COELHO, 2005; LEONARDI e CHORILLI, 2008). É um tecido resistente que
promove a flexibilidade e mantém a homeostase da pele (LEONARDI, 2004).
- HIPODERME: é a camada mais profunda, localizada abaixo da derme, e apresenta
espessura variável. É formada por células de gordura denominadas adipócitos, separadas entre
si por um interstício seroso o qual contém ácidos polissacarídeos que atuam como
lubrificantes. Funcionalmente, a hipoderme ajuda a manter a temperatura do corpo, facilita a
motilidade da pele em relação às estruturas subjacentes, na proteção mecânica do organismo
às pressões e traumatismos externos, além de funcionar como uma reserva energética – graças
às células de gordura (LEONARDI, 2004; OLIVEIRA et al., 2004; COELHO, 2005;
DECCACHE, 2006; NEVES, 2010).
2.2 MELANINA
A cor da pele humana é principalmente influenciada pela produção de melanina, um
pigmento castanho denso, de alto peso molecular, o qual assume o aspecto enegrecido, quanto
mais concentrado. Em humanos, esta pigmentação é dependente da atividade melanogênica,
dentro dos melanócitos, da taxa de síntese de melanina, bem como do tamanho, número,
composição e distribuição de partículas do citoplasma dos melanócitos, denominadas
melanossomas, além da natureza química da melanina que elas contêm (NICOLETTI et al.,
2002; GUPTA et al., 2006; MIOT et al., 2009).
Melanócitos são células fenotipicamente importantes, responsáveis pela pigmentação
da pele e dos pelos, contribuindo para a tonalidade cutânea, conferindo proteção direta aos
danos causados pela radiação ultravioleta (UV) (BARRY, 2005; MIOT et al., 2009). Estão
localizados na camada basal da epiderme (entre queratinócitos adjacentes), e ocasionalmente
na derme. Os melanócitos são menos numerosos que os queratinócitos, normalmente há um
melanócito circundado por 30 queratinócitos (PRUNIERAS, 1994; HERNANDEZ e
MERCIER-FRESNEL, 1999; LEONARDI, 2004).
A melanina é formada nos melanócitos por ação de uma enzima denominada
tirosinase. Devido à ação da enzima tirosinase, a tirosina é transformada em DOPA
(diidroxifenilalanina), e depois de ocorrerem vários passos bioquímicos esta substância é
20
transformada em melanina (eumelanina ou feomelanina). Quando a atividade desta enzima
está ausente ou reduzida, a melanina não é produzida, provocando uma condição conhecida
como albinismo (PRUNIERAS, 1994).
Nos melanócitos, a melanina produzida fica armazenada em estruturas específicas,
denominadas melanossomas (MIOT et al., 2009). Os melanossomos (grânulos de melanina)
são transferidos para os queratinócitos. À medida que os queratinócitos alcançam a superfície
cutânea, carregam a melanina, de modo que o pigmento é eliminado da epiderme por
descamação (NICOLETTI et al., 2002).
A produção de melanina pode ser aumentada, estimulando-se os melanócitos com
doses crescentes de luz UV. Pode-se também observar aumento da pigmentação na pele
humana em certos desequilíbrios hormonais. Existem ainda muitos outros fatores patológicos
e ainda alguns medicamentos que podem ocasionar alterações na cor da pele, ou seja,
discromias (LEONARDI, 2004).
Discromias são alterações na pigmentação da pele, causadas de modo geral, pela
alteração na produção, na transferência ou na perda de melanina pela pele. As alterações de
pigmentação são condicionadas por inúmeros fatores como genéticos, metabólicos,
nutricionais, endócrinos, inflamatórios, infecciosos, neoplásicos, agentes químicos e físicos.
As discromias podem ser classificadas como hipercromias (aumento da pigmentação da pele)
e hipocromias (diminuição da pigmentação da pele) (LEONARDI, 2004; NEVES, 2010).
2.3 MELASMA
Alguns autores afirmam que as desordens pigmentares são a terceira causa de
problema dermatológico, sendo que nesta epidemiologia estão incluídos o melasma e a
hiperpigmentação pós-inflamatória (AZULAY et al., 2003a; MIOT et al., 2009). As
hiperpigmentações são, em geral, distúrbios caracterizados pelo aumento de melanina e outros
pigmentantes na pele (SATO et al., 2007).
O melasma é uma condição clínica adquirida, caracterizada pela hiperpigmentação
simétrica progressiva de contornos e coloração irregulares, que vai do cinza ao marromescuro, em geral na face (testa, bochechas, queixo) ou em áreas fotoexpostas e, mais
raramente, no nariz, pálpebras e membros superiores, podendo ocorrer em ambos os sexos,
21
sendo mais frequente em mulheres (GUPTA et al., 2006; RENDON et al., 2006;
BANDYOPADHYAY, 2009; MIOT et al., 2009).
A etiopatogenia do melasma não é bem conhecida, mas fatores genéticos, radiação
UV, gravidez, contraceptivos orais, terapia hormonal de substituição, disfunção da tireóide,
deficiência nutricional, medicamentos fototóxicos e os cosméticos têm sido frequentemente
envolvidos (GUIMARÃES et al., 2005). Alguns autores acreditam que esta hiperpigmentação
está relacionada à elevação dos níveis séricos do hormônio melanócito estimulante, dos
estrógenos e da progesterona (AZULAY et al., 2003a).
O melasma ocupa uma posição de destaque nas entidades clínicas em dermatologia
por seu envolvimento de natureza visível, refletindo sobre os aspectos psicológicos da
qualidade de vida dos pacientes. Afirma-se que o melasma representa 70 % das dermatoses
em gestantes e que ocorre em 35 % das mulheres que usam anticoncepcionais, podendo,
porém, iniciar-se pós-menopausa (AZULAY et al., 2003a). A idade de aparecimento situa-se
entre 30 e 55 anos e o sexo masculino representa apenas 10 % dos casos
(BANDYOPADHYAY, 2009; MIOT et al., 2009).
O tratamento do melasma envolve o uso de agentes tópicos hipopigmentantes, tais
como a hidroquinona, tretinoína, ácido azeláico, vitamina C, ácido kójico, fotoprotetores,
dentre outros. Terapias físicas, como o peeling químico (ácido glicólico, ácido
tricloroacético), terapia com laser e dermoabrasão, semelhante ao utilizado em outras
desordens hiperpigmentares, também têm sido avaliados com graus variados de sucesso
(GUIMARÃES et al., 2005; RENDON et al., 2006).
2.4 DESPIGMENTANTES
Nos últimos anos o número de produtos para clareamento da pele cresceu e, com isso,
as opções terapêuticas se tornam cada vez mais difíceis (NICOLETTI et al., 2002; AZULAY
et al., 2003a). Os despigmentantes, substâncias que atuam diretamente sobre a região
discrômica hiperpigmentada, têm sido largamente prescritos pelos dermatologistas e, alguns
têm sido até mesmo empregados em formulações cosméticas. Entre os despigmentantes mais
usados atualmente, pode-se citar como exemplos: hidroquinona, ácido kójico, vitamina C,
arbutin, ácido fítico, dentre outros (LEONARDI, 2004; GUIMARÃES et al., 2005).
22
2.4.1 Vitamina C
A vitamina C (Figura 1) ou, simplesmente, ácido ascórbico (AA) é uma vitamina
hidrossolúvel e termolábil existente em frutas cítricas e vegetais, sendo também um dos
antioxidantes mais importantes presentes na pele. Apresenta-se na forma de pó cristalino
branco ou de cristais incolores, inodoros e de sabor amargo, sendo sua coloração alterada
quando exposta ao ar, luz e umidade. É solúvel também em álcool, e praticamente insolúvel
em clorofórmio e em éter (DALCIN, SCHAFFAZICK e GUTERRES, 2003; JURKOVIC et
al., 2003; SCOTTI et al., 2007; KRAMBECK, 2009).
Figura 1 – Fórmula estrutural da vitamina C (GUARATINI, MEDEIROS, COLEPICOLO, 2007)
A vitamina C tem sido utilizada em produtos cosméticos e dermatológicos, uma vez
que apresenta importantes efeitos fisiológicos sobre pele (JURKOVIC et al., 2003;
GOSENCA et al., 2010). Dentre estes efeitos, podem ser citados: a inibição da melanogênese,
resultando no clareando de manchas na pele; a promoção da síntese de colágeno, atuando
como um co-fator nas reações de hidroxilação de prolina e lisina; além disto, em função da
conhecida propriedade antioxidante deste composto, destaca-se a prevenção da formação de
radicais livres, que são os principais responsáveis pelos efeitos prejudiciais das radiações
solares, no envelhecimento cutâneo (KRAMBECK, 2009).
As primeiras publicações referentes ao uso tópico da vitamina C, inicialmente em
cobaias, datam da década de 1960. Entretanto, só mais recentemente tem-se dado valor a essa
via de aplicação (AZULAY et al., 2003b). A administração tópica de vitamina C pode
apresentar eficácia bastante reduzida, devido a sua instabilidade físico-química, quando
exposta à luz, altas temperaturas de armazenagem, valores de pH acima de 6,0 e em condições
aeróbicas (SPICLIN, GASPERLIN e KMETEC, 2001; DALCIN, SCHAFFAZICK e
GUTERRES, 2003).
A fim de superar este problema de alta instabilidade, derivados lipofílicos e
hidrofílicos da vitamina C têm sido amplamente empregados em formulações tópicas
23
(SPICLIN, GASPERLIN e KMETEC, 2001; DALCIN, SCHAFFAZICK e GUTERRES,
2003; LEONARDI, 2004; GONÇALVES e MAIA CAMPOS, 2009a). O palmitato de
ascorbila (ou L-ascorbil-6-palmitato) (Figura 2) é um éster de ácido graxo com caráter
lipofílico, tem ampla aplicação como aditivo antioxidante em produtos farmacêuticos,
médicos e cosméticos (PANEVA et al., 2011). Possui pH neutro, que não irrita a pele e
apresenta boa eficácia em formulações tópicas (LEONARDI, 2004; GUARATINI,
MEDEIROS e COLEPICOLO, 2007).
Figura 2 – Fórmula estrutural do palmitato de ascorbila (KRISTL, 2003)
Embora o palmitato de ascorbila (PA) seja mais estável que a vitamina C, sua baixa
estabilidade química e insolubilidade na água limitam suas utilizações (YOKSAN et al., 2010;
PANEVA et al., 2011). É importante considerar que a obtenção deste derivado se dá através
de uma modificação química no grupo hidroxila do ácido ascórbico (YUAN et al., 2011).
Ocorre uma reação de esterificação entre a cadeia carbônica (C16) oriunda do ácido
palmítico, e o anel enediol mantido inalterado, provindo do ácido ascórbico (PALMA et al.,
2002; DALCIN, SCHAFFAZICK e GUTERRES, 2003), resultando em uma estrutura com
ligação éster (R-CO-O-R), a qual fica extremamente suscetível à reações de hidrólise. Estas
reações ocorrem de forma irreversível, o que leva a instabilidade da formulação (BARRY,
2005).
Devido a isto, diversos estudos estão sendo realizados para promover uma maior
estabilidade deste ativo, dentre eles a incorporação em microemulsões (SPICLIN,
GASPERLIN e KMETEC, 2001), nanopartículas lipídicas sólidas e lipossomas (KRISTL et
al., 2003; TEERANACHAIDEEKUL et al., 2007), nanocápsulas e nanoemulsões (ZATTA,
2011). GOSENCA e colaboradores (2010) estudaram a estabilidade do PA em microemulsões
do tipo A/O e O/A, para aplicação tópica. Após 84 dias, o PA foi substancialmente oxidado
em ambos os tipos de microemulsões; no entanto, a quantidade de ativo inalterada nas
microemulsões A/O foi maior do que nas microemulsões O/A, sendo 29,3 % em comparação
com 14,5 %, respectivamente.
24
Outro promissor agente no aumento da sua estabilização seria a associação com
substâncias antioxidantes. A aplicação tópica de ativos naturais antioxidantes representa uma
estratégia de sucesso para a proteção da pele aos danos provocados pelos radicais livres. Neste
aspecto, pode-se ressaltar a atividade do óleo de rosa mosqueta, um antioxidante rico em
vitamina C, com propriedades cicatrizante, regenerativa e clareadora de manchas cutâneas
(FRANCO et al., 2007).
2.4.2 Óleo de Rosa Mosqueta
O óleo de rosa mosqueta (Rosa aff rubiginosa) é um líquido transparente, amarelo ou
avermelhado, apresentando sabor característico, sendo usualmente comercializado por
apresentar grande eficácia no tratamento da pele. Contém alta porcentagem de ácidos graxos
insaturados e poliinsaturados, ácido retinóico, taninos, flavonóides e carotenóides (FRANCO
et al., 2006).
As altas concentrações de vitamina C (400 mg/100 g) encontradas no óleo da sua
semente (FRANCO et al., 2007) têm importante papel na regeneração tecidual, sendo um
importante elemento para a formação e deposição das fibras colágenas sobre a cicatriz, além
de estimular, também, a proliferação celular; enquanto que a grande quantidade de compostos
antioxidantes, como polifenóis e carotenóides exercem efeito protetor sobre as novas células a
se formarem na lesão em regeneração (SANTOS, VIEIRA e KAMADA, 2009).
Nas últimas décadas, o grande interesse popular e tradicional pelo óleo de rosa
mosqueta motivou o interesse do meio científico por esse fitoterápico, resultando em diversos
estudos a respeito das suas propriedades. Warholm e colaboradores (2003), em estudo
experimental duplo-cego, obtiveram resultados na diminuição da dor e inflamação das
articulações em pacientes com osteoartrite. No mesmo ano, Thielemann e colaboradores
(2003) avaliaram o efeito de cremes à base de óleo de rosa mosqueta na atenuação dos efeitos
do envelhecimento, especialmente na atenuação de rugas de expressão, mostrando-se
altamente eficaz.
A incorporação deste óleo em formulações parece ser uma promissora terapia por
diminuir os efeitos da produção descontrolada de radicais livres e por prevenir e restaurar
lesões já formadas. Em cosméticos pode ser utilizado em concentrações de 2-10 % em cremes
25
e loções, ou aplicado diretamente na forma pura em quantidades reduzidas (LEITE e SARNI,
2003).
Os antioxidantes tópicos devem ser absorvidos pela pele e liberados para o tecido alvo
na sua forma ativa. Entretanto, muitos produtos se oxidam e se tornam inativos antes mesmo
de alcançarem o seu local de ação (SCOTTI et al., 2007; STEINER, 2008), pois este tipo de
substância só poderá oferecer uma proteção satisfatória, se for capaz de permear através do
estrato córneo, o qual representa a principal barreira para a permeação de fármacos
(WEBBER, 2003).
2.5 A PELE COMO VIA DE ADMINISTRAÇÃO TÓPICA
Para que se possa desenvolver adequadamente um produto de uso tópico bem como
compreender sua permeabilidade cutânea é preciso, primeiramente, conhecer muito bem
algumas características da pele humana. Apesar de sua natureza quase impermeável, conferida
especialmente pelo estrato córneo, algumas substâncias são capazes de penetrá-la (BETTONI,
2009). A pele apresenta características de permeabilidade dependentes de vários fatores, tais
como a espessura, a integridade e a hidratação do estrato córneo (GUTERRES, ALVES e
POHLMANN, 2007).
O estrato córneo (10-20 µm) pode atuar como um reservatório para formulações
aplicadas na pele, porém é a principal barreira para a permeação de substâncias ativas. Isso
ocorre porque se trata de uma região que contém muitos lipídios, organizados em camadas
lamelares, as quais acabam dificultando a difusão dos ativos (LEONARDI, 2004; BETTONI,
2009).
A maioria dos fármacos utilizados para o tratamento de problemas dermatológicos tem
como local de ação os tecidos mais profundos da pele. Nela, o fármaco necessita permear o
estrato córneo para chegar ao seu local de ação. Sendo assim, a utilização clínica de fármacos
por esta via está limitada pela capacidade destes ultrapassarem a barreira da pele (MARTINS
e VEIGA, 2002).
Em uma administração tópica, um fármaco pode penetrar no estrato córneo tanto pela
via transdérmica quanto pela via transfolicular. Em geral, partículas maiores que 10 µm
permanecem na superfície da pele, partículas entre 3 e 10 µm concentram-se nos folículos
pilosos e, quando menores que 3 µm, penetram nos folículos e no estrato córneo igualmente
26
(BETTONI, 2009). Dessa forma, diferentes estratégias têm sido propostas para aumentar a
permeação cutânea de fármacos, sobretudo com a evolução da tecnologia na produção de
cosméticos. Um exemplo desta evolução são os sistemas nanométricos, os quais possuem uma
área superficial adequada, que os torna altamente propícios para a aplicação de substâncias
lipofílicas, promovendo uma liberação homogênea do fármaco (GUTERRES, ALVES e
POHLMANN, 2007).
2.6 NANOTECNOLOGIA
A nanotecnologia vem sendo tratada como um dos principais recursos para o
desenvolvimento e inovação na área cosmética, sendo que estas nanoestruturas, aos poucos
começam a ser consideradas como sistemas tecnológicos viáveis para incorporação de
substâncias ativas, resultando no surgimento de novos produtos no mercado (SCHMALTZ,
SANTOS e GUTERRES, 2005; SANTOS e FIALHO, 2008). Além disso, ela tem sido
aplicada em vários campos, tais como biomédico, óptico, eletrônico, mecânico e químico,
assim como em bens de consumo, como alimentos (VIEGAS e ALMEIDA, 2009; MU e
SPRANDO, 2010).
De acordo com The National Nanotechnology Initiative (NNI), criado em 2001 para
coordenar as pesquisa em nanotecnologia, esta é definida como i) a investigação e
desenvolvimento de tecnologia em nível atômico, molecular ou macromolecular no
comprimento de aproximadamente 1-100 nm, ii) a criação e o uso de estruturas, dispositivos e
sistemas que possuem novas propriedades e funções por causa de seu pequeno tamanho e/ou
tamanho intermediário, e iii) a capacidade de controlar ou manipular a escala atômica.
A possibilidade de convergência das diferentes áreas como a química, a biologia e a
física, levam a nanotecnologia a ter uma multiplicidade de aplicações. Devido a esse caráter
interdisciplinar, acredita-se que a nanotecnologia tenha o potencial de revolucionar áreas
científicas e tecnológicas. Porém, até o presente momento esta tecnologia não é
regulamentada por nenhuma legislação ou resolução específica que possa fazer o registro de
produtos nesta escala. Com isso, existe a necessidade de se fazer pesquisas que venham
contribuir com a segurança destes produtos; já que os riscos envolvidos a partir da
miniaturização se dão, principalmente, às novas propriedades que os materiais em nanoescala
podem adquirir (VIEGAS e ALMEIDA, 2009).
27
Partículas
usadas
para
aplicações
terapêuticas
devem
ser
biodegradáveis,
biocompatíveis e fisicamente estáveis. Denominam-se nanopartículas os materiais que
pertençam à escala nanométrica em todas as suas dimensões. Estes sistemas nanoparticulados
são uma alternativa promissora como vetores ativos, devido à sua capacidade de liberação de
fármacos. Seu tamanho permite uma maior captação intracelular do que em outros sistemas de
partículas, também podem melhorar a estabilidade das substâncias ativas e ser biocompatível
com o tecido e células (MORA-HUERTAS, FESSI e ELAISSARI, 2010).
As nanopartículas utilizadas nos sistemas de entrega de fármacos são de interesse tanto
para a indústria de medicamentos como para a índústria cosmética. Exemplos incluem
nanoemulsões e nanocristais, lipossomas e niossomas, micelas, nanopartículas poliméricas,
nanopartículas lipídicas sólidas e carreadores lipídicos nanoestruturados, dentre outros (MU e
SPRANDO, 2010).
Um nanocosmético pode ser definido como sendo uma formulação cosmética que
veicula ativos ou outros ingredientes nanoestruturados e que apresenta propriedades
superiores quanto a sua performance em comparação com produtos convencionais. A
substância ativa, ao invés de ser adicionada diretamente no veículo cosmético, ou seja, na
forma livre, é encapsulada em vesículas nanométricas (SCHMALTZ, SANTOS e
GUTERRES, 2005).
- Nanocápsulas: são estruturas coloidais constituídas por vesículas de um fino
invólucro de polímero biodegradável e uma cavidade central com núcleo oleoso, no qual a
substância ativa encontra-se dissolvida neste núcleo e/ou adsorvida à parede polimérica
(Figura 3), sendo, por isso, consideradas um sistema reservatório, o qual apresenta diâmetro
submicrométrico, variando entre 10 a 1000 nm (SCHAFFAZICK et al, 2003).
Figura 3 - Representação esquemática de nanocápsulas: a) fármaco adsorvido na parede polimérica;
b) fármaco disperso por toda a partícula (BETTONI, 2009)
28
As nanocápsulas, por apresentarem alto potencial de encapsulamento de substâncias,
especialmente fármacos lipofílicos, são capazes de controlar a liberação de fármacos em sítios
de ação específicos. Além disso, aumentam a estabilidade in vivo e de armazenamento,
otimizam a velocidade de cedência, e melhoram o índice terapêutico ao aumentar a eficácia
e/ou reduzir a toxicidade de fármacos, reduzindo a absorção sistêmica (SCHAFFAZICK et
al., 2003; BETTONI, 2009). Há relatos também do seu uso para a proteção de diferentes
sistemas para aplicações farmacêuticas ou cosméticas, especialmente para substâncias
sensíveis à oxidação por variação de pH, presença de água ou por efeito de luz ultravioleta; ou
ainda, que degradam em temperaturas acima de 40 ºC (KÜLKAMP et al., 2009).
Os métodos de preparação de nanocápsulas podem ser classificados em métodos
baseados na polimerização de monômeros (cianoacrilatos de alquila) ou na dispersão de
polímeros pré-formados, tais como poli(ácido lático), poli(ácido lático-co-ácido glicólico),
poli(ε-caprolactona) e copolímeros do ácido acrílico ou metacrílico (Eudragit®).
Eudragits® são uma série de polímeros de acrilato e metacrilato, disponíveis em
diferentes formas iônicas. Dependendo do pH, estes polímeros se tornam adequados para
diferentes fins. Sua estrutura pode apresentar grupos ionizados e não ionizados, sendo
divididos em policátions, com a presença de grupos dimetilamino/aminoquaternário
(Eudragit® E, RL, RS e NE) e em poliânions, com a presença de grupos carboxilato
(Eudragit® L100 e S100) (MOUSTAFINE et al., 2005).
O Eudragit® L100 (Figura 4) é um copolímero pH-dependente, não tóxico, sendo
insolúvel em pH ácido e solúvel em soluções neutras ou alcalinas, liberando o fármaco
lentamente em meios com pH em torno de 6,0 (ESPOSITO et al., 2002; OLIVEIRA et al.,
2009). Possui alta estabilidade química (CEBALLOS et al., 2005), contém cerca de 50 % de
grupos carboxilas livre e apresenta peso molecular de 135 kD (CETIN, ATILA e
KADIOGLU, 2010).
Figura 4 – Estrutura molecular do Eudragit® L100 (MOUSTAFINE et al., 2005)
29
Atualmente o Eudragit® L100 tem muitas aplicações na indústria farmacêutica e
cosmética, principalmente como veículo para entrega de fármacos, em materiais de
revestimento entérico e no desenvolvimento de produtos com características físico-químicas
diferentes (CAPPELLA, BOERIS e PICÓ, 2011).
Já para a obtenção de nanocápsulas poliméricas o método mais comum é a
nanoprecipitação, também conhecido como nanodeposição do polímero pré-formado
(SANTOS e FIALHO, 2008; MAZZARINO et al., 2011). O método da deposição de
polímeros pré-formados foi proposto por FESSI e colaboradores (1989). Este processo
consiste em dissolver o polímero em um solvente orgânico que é miscível com a água (por
ex.: acetona ou etanol). Na fase orgânica também são adicionados o fármaco ou ativo
insolúvel ou pouco solúvel em água, o componente oleoso e um estabilizante lipofílico. A
fase orgânica é, então, adicionada à fase aquosa contendo um tensoativo hidrofílico sob
agitação magnética moderada. A vantagem de utilização deste método é a obtenção
espontânea, simples, eficiente e reprodutível de pequenas partículas com elevada capacidade
de encapsulação de fármacos. Esta mistura origina nanocápsulas com diâmetros médios
situados entre 200 e 500 nm (SCHAFFAZICK et al., 2003; MAZZARINO et al., 2011).
Entretanto, para o desenvolvimento de novas formulações cosméticas, é necessário a
utilização de métodos que comprovem sua eficácia e segurança. Antigamente, a dermatologia
apresentava métodos de análise pouco precisos. Com os avanços tecnológicos, porém,
surgiram as metodologias não invasivas de avaliação, as quais determinam a eficácia de uma
substância diretamente em seu local de ação (GUARATINI, MEDEIROS e COLEPICOLO,
2007).
2.7 BIOMETRIA CUTÂNEA
Durante as últimas décadas, ocorreu um aumento de informações e avanços científicos
relacionados à pesquisa cutânea. Existe um grande número de variáveis que podem ser
consideradas como indicativas do estado em que se encontra a pele em relação à sua
integridade e qualidade, em especial da epiderme, que podem ser mensuradas com
simplicidade de operação (GONÇALVES e MAIA CAMPOS, 2009a; OLIVEIRA, 2009). Há
um tempo atrás, a dermatologia e as áreas afins baseavam-se na maioria das vezes apenas na
observação clínica, o que, devido a sua subjetividade, pode ser considerado como um método
30
pouco preciso. Com os avanços tecnológicos, porém, surgiram as metodologias não invasivas
de avaliação (LEONARDI et al., 2002).
Dentre os métodos disponíveis para a avaliação de produtos dermocosméticos, as
metodologias in vivo não invasivas vêm sendo amplamente utilizadas na realização dos
estudos de eficácia durante o desenvolvimento de uma formulação cosmética (WISSING e
MÜLLER, 2003; CAMARGO Jr., 2006). É importante salientar que a legislação referente aos
produtos cosméticos e de higiene corporal exige dos seus responsáveis provas dos efeitos
reivindicados para os produtos colocados no mercado (FERREIRA, 2008).
A avaliação da eficácia de produtos cosméticos por biometria cutânea é mais exata e
precisa em comparação com a análise dos efeitos dos produtos avaliada pelos próprios
consumidores ou por apreciação clínica meramente visual (FERREIRA, 2008). Esta tem se
tornado uma área importante, uma vez que possibilita uma avaliação criteriosa dos efeitos na
pele humana, utilizando-se de voluntários, nas reais condições de uso de um produto. São
técnicas rápidas e seguras de se aplicar a humanos, uma vez que é possível avaliar a pele sem
a necessidade de se violar sua integridade, não causando qualquer agressão ou desconforto ao
voluntário (WISSING e MÜLLER, 2003; DECCACHE, 2006).
Nas últimas duas décadas, equipamentos de ampla aplicação (para cosmetologia,
medicina estética e dermatologia) têm sido apresentados, dando, assim, origem a novas
metodologias não invasivas de estudo cutâneo (LEONARDI et al., 2002; WISSING e
MÜLLER, 2003). Estes equipamentos de biometria cutânea fornecem informações relativas e
permitem que diversos parâmetros sejam avaliados, como por exemplo, conteúdo aquoso do
estrato córneo (hidratação), pH da pele, coloração da pele, perda transepidérmica de água,
dentre outros (DECCACHE, 2006; GUARATINI, MEDEIROS e COLEPICOLO, 2007),
através dos aparelhos denominados Corneometer®, Skin pH-meter®, Mexameter® e
Tewameter® (Courage-Khazaka Electronic, Alemanha), respectivamente.
2.7.1 Determinação do conteúdo aquoso do estrato córneo (hidratação cutânea)
O estado de hidratação da pele é de grande interesse do ponto de vista dermatológico,
cosmético e farmacêutico. Em cosmetologia, o grau de hidratação da pele, principalmente no
estrato córneo, está diretamente relacionada com a sua aparência (ou seja, a suavidade da
textura), enquanto que em dermatologia, a hidratação da pele é considerada como um
31
indicador do seu estado de saúde (ESPOSITO et al., 2007). O nível de hidratação da pele
depende de vários fatores como o poder higroscópico do estrato córneo, a taxa de
fornecimento de água pelas camadas mais internas da epiderme e a taxa de perda de água, via
evaporação (DECCACHE, 2006; FERREIRA, 2008).
O conteúdo aquoso do estrato córneo é mantido por um filme hidrolipídico encontrado
na pele, que tem como funções: formar uma barreira de proteção acídica evitando a
penetração de substâncias danosas ao organismo, proteger a pele do ressecamento e manter a
sua flexibilidade (CAMARGO Jr., 2006).
Dentre os vários métodos propostos para a determinação do conteúdo aquoso do
estrato córneo, o método da capacitância tem sido o mais empregado, pois utiliza corrente de
baixa frequência e é pouco afetado pela temperatura e umidade relativas. Este método é
considerado exato e reprodutível quando utilizado sob condições padronizadas, sendo uma
importante ferramenta para pesquisa cosmética, farmacológica e dermatológica (CAMARGO
Jr., 2006; DECCACHE, 2006).
O Corneometer® (Courage-Khazaka Electronic, Alemanha) baseia-se na medida da
capacitância, onde um campo elétrico penetra na pele e permite a determinação da diferença
entre constantes dielétricas (FERREIRA, 2008). A sonda capaz de medir esta capacitância é
composta de eletrodos que contém uma rede interdigital de ouro, não havendo contato
galvânico entre a sonda e a superfície da pele. Existe um campo elétrico de frequência
variando entre 40 a 75 kHz que é estabelecido na camada superior da pele. As mudanças na
capacitância são convertidas em unidades de hidratação que variam de 0 a 130 unidades
arbitrárias (UA), onde 0 unidade corresponde à pele muito seca e 130 unidades à pele muito
hidratada (Manual Courage-Khazaka Electronic, Alemanha).
Este equipamento tem sido reconhecido mundialmente como um instrumento eficiente
para medir a variação do teor de água no estrato córneo (ESPOSITO et al., 2007; CHENG et
al., 2008), e vem sendo muito utilizado por apresentar alta sensibilidade (WISSING e
MÜLLER, 2003; CAMARGO Jr., 2006).
2.7.2 Determinação do pH cutâneo
A natureza ácida da superfície cutânea foi descrita primeiramente por Hesus em 1892
e diversos trabalhos vêm investigando este parâmetro (LEONARDI et al., 2002;
32
DECCACHE, 2006). A pele apresenta pH levemente ácido (4,5 – 5,5), que contribui para que
ocorra proteção bactericida e fungicida em sua superfície (LEONARDI et al., 2002;
FERREIRA, 2008). O valor deste pH é determinado pelas substâncias hidrossolúveis que são
lançadas na pele, resultantes da secreção sudorípara, da secreção sebácea e da eliminação de
gás carbônico (DECCACHE, 2006).
O pH, isto é, a concentração hidrogeniônica da superfície cutânea, tem sido visto por
alguns pesquisadores como um importante indicador funcional, relacionado com a produção
de ácido lático, formação do manto hidrolipídico, manutenção da homeostase e funções
imunológicas (LEONARDI et al., 2002; DECCACHE, 2006).
A determinação e o controle do pH cutâneo, sob o ponto de vista cosmético e/ou
dermatológico, são de extrema utilidade, uma vez que este pH é frequentemente alterado em
consequência da utilização de produtos tópicos inadequados, expondo a pele a uma série de
agentes agressores, em especial microrganismos (LEONARDI et al., 2002).
Quanto às técnicas desenvolvidas para abordagem dessa variável têm-se destacado a
avaliação do pH através do aparelho Skin pH-Meter® (Courage-Khazaka Electronic,
Alemanha), considerado como o único método técnico e cientificamente comprovado. A
medição é rápida e sem dificuldades, garantindo resultados precisos (DECCACHE, 2006).
2.7.3 Determinação da intensidade de melanina e eritema
Os pigmentos melânicos e a hemoglobina são as moléculas que absorvem
especificamente certas porções do espectro luminoso, sendo responsáveis pelas variações de
tons de pele constatadas. A melanina determina a cor da pele, mas tem, sobretudo, uma
função fotoprotetora importante, pois permite filtrar os raios UV e neutralizar os radicais
livres (fatores do envelhecimento celular) (PRUNIERAS, 1994; HERNANDEZ e MERCIERFRESNEL, 1999). Já o eritema pode ser considerado como uma reação cutânea normal ao sol.
Entretanto, o eritema apresenta também uma correlação direta com os processos de irritação
da pele através do uso de cosméticos, sendo, por isso, frequentemente medido em testes para
avaliação da segurança dos produtos. Nestes casos, os vasos superficiais da derme são
dilatados, ocasionando um afluxo importante de sangue e consequentemente um rubor
momentâneo da pele (HERNANDEZ e MERCIER-FRESNEL, 1999).
33
Para satisfazer os requisitos para a determinação precisa da cor da pele, que se baseia
apenas em algumas características, o Mexameter® MX 18 (Courage-Khazaka Electronic,
Alemanha) foi projetado para medir a intensidade do eritema e pigmentação de melanina.
Neste equipamento, a célula fotoelétrica mede a luz refletida pela pele. São 16 emissores de
luz de diodo dispostos circularmente, emitindo luz em três comprimentos de onda definidos:
568 nm (verde), 660 nm (vermelho) e 880 nm (infravermelho). O índice de eritema é
calculado a partir da intensidade da absorção e reflexão da luz em 568 e 660 nm,
respectivamente, enquanto o índice de melanina é calculado a partir da intensidade da luz
absorvida e refletida em 660 e 880 nm, respectivamente (TAYLOR et al., 2006).
O Mexameter® tem sido utilizado principalmente para a avaliação de produtos
cosméticos. Foi relatado que este instrumento é altamente discriminatório e sensível o
suficiente para detectar pequenas diferenças na cor da pele, e também tem sido mencionado
que a reprodutibilidade da sua medida é satisfatória (PARK et al., 2006).
2.7.4 Determinação da perda transepidérmica de água
A perda transepidérmica de água (PTEA) é um método bem estabelecido para testar a
integridade do estrato córneo da pele humana (CHENG et al., 2008). A realização deste
estudo, ou seja, da difusão de água através do estrato córneo para a superfície, é de
fundamental importância, pois esta medida está relacionada com a função barreira da pele,
que exerce controle sobre a perda de líquidos por transpiração e evaporação, influenciando na
hidratação cutânea (ROSADO, ROLIM e RODRIGUES, 2005; CAMARGO Jr., 2006).
O mecanismo de regulação da temperatura corporal também influencia a PTEA, pois o
organismo compensa a diferença entre a temperatura corporal e a ambiente por meio da
evaporação de água. Quanto maior a temperatura ambiente, maior a PTEA (GONÇALVES e
MAIA CAMPOS, 2009a). Seu valor varia consideravelmente com a região anatômica e com a
espessura da pele, apresentando a face ventral do antebraço aproximadamente 4 g/h/m2 de
PTEA (ROSADO, ROLIM e RODRIGUES, 2005).
O aumento excessivo da PTEA indica que a função barreira da pele está prejudicada,
ou seja, a pele está susceptível a agentes externos e, também, à desidratação. Até mesmo
mudanças sutis na integridade da barreira podem ser detectadas através da sua medição. Este
tem sido um dos parâmetros usados para a avaliação dos efeitos que o meio ambiente, a
34
temperatura, algumas doenças e também formulações aplicadas topicamente exercem nas
trocas de água da pele com o ambiente (CHENG et al., 2008; GONÇALVES e MAIA
CAMPOS, 2009a).
O Tewameter® (Courage-Khazaka Electronic, Alemanha) é um equipamento baseado
no princípio da difusão, descrito por Adolf Fick em 1885, que vem sendo muito empregado
na determinação da perda transepidérmica de água. Permite medir valores de PTEA até 0,1
g/h/m2, à umidade relativa ambiente. Recentemente, foi lançado no mercado, um novo
modelo de Tewameter®, o TM300. Este modelo apresenta diversas vantagens: permite a
calibração do sistema antes da medição, efetua um pré-aquecimento da sonda, de forma rápida
e prática, reduzindo o tempo de estabilização necessário para o início das medições, o que se
traduz numa maior rapidez, operacionalidade e num maior rigor (ROSADO, ROLIM e
RODRIGUES, 2005).
35
3 METODOLOGIA
Matérias-primas, solventes e outros materiais

Acetonitrila grau cromatográfico – Merck®;

Ácido Etilenodiamino Tetra-acético (EDTA) – Nuclear®;

Ácido Orto-fosfórico P.A – Nuclear®;

Água MilliQ®;

Balança analítica AX 200 – Shimadzu®;

Butil-hidroxitolueno (BHT);

Carbopol
940®
(carbomer
2-Propenoic
acid,
polymer
with
2,2-
bis(hydroxymethyl)propane-1,3-diol 2-propenyl ether) – Henrifarma;

Centrífuga TDL80-2B – Centribio®;

Copolímero do ácido metacrílico (Eudragit® L100) – Röhm Pharma Polymers;

Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (CLAE) YL - Clarity, modelo YL9100
CLAE Systen;

Etanol grau cromatográfico – J.T.Baker®;

Evaporador rotatório 801 – Fisatom®;

Fosfato de potássio monobásico anidro – Synth®;

Membrana de acetato de celulose 0,45 µm - Millipore®;

Metanol grau cromatográfico – Merck®;

Mexameter® MX 18 – Courage-Khazaka Electronic, Alemanha;

Monoestearato de sorbitano (Span 60®) – Sigma Aldrich®;

Monooleato de sorbitano (Span 80®) – Sigma Aldrich®;

Palmitato de Ascorbila – Sigma Aldrich®;

Placas de vidro (espalhabilidade);

Polissorbato 80 (Tween 80®) – Via Farma®;

Potenciômetro Digimed®;

Propilenoglicol – Alpha Química®;

Óleo de Cenoura – Delaware®

Óleo de Melaleuca – Via Farma®;

Óleo de Rosa Mosqueta - Delaware®;
36

Sebumeter®/Corneometer®/Skin-pH-Meter®
-
Courage-Khazaka
Electronic,
Alemanha;

Solução conservante de Imidazolidinil ureia (Germal®);

Sorbitol – Alpha Química®;

Tewameter® TM 300 – Courage-Khazaka Electronic, Alemanha;

Tinogard TT® (Pentaerythrityl Tetra-di-t-Butyl Hydroxyhydrocinnamate) - Via
Farma®;

Viscosímetro rotacional Brookfield – RV DV -1+;

Vórtex P56 - Phoenix®;

Zetasizer® Nano-ZS – Malvern.
Métodos
As atividades experimentais deste trabalho foram desenvolvidas no Laboratório de
Nanotecnologia do Centro Universitário Franciscano – UNIFRA.
3.1 PREPARAÇÃO DAS SUSPENSÕES
As suspensões de nanocápsulas (NC) contendo palmitato de ascorbila (PA) foram
preparadas segundo o método de deposição interfacial de polímero pré-formado (FESSI et al.,
1989), utilizando os componentes descritos na Tabela 1. Estas suspensões foram
desenvolvidas baseando-se no trabalho de ZATTA (2011), entretanto foram feitas
modificações em alguns de seus componentes, como a troca do polímero, do óleo, do
antioxidante, da concentração de propilenoglicol e a adição de EDTA na fase aquosa.
37
Tabela 1 – Composição das suspensões de nanocápsulas contendo palmitato de ascorbila
(NCPA) e na ausência do ativo (branco)
Componentes
NCPA
Branco
Fase orgânica
%
%
Palmitato de ascorbila
0,3
-
Eudragit L100
1,0
1,0
Monoestearato de sorbitano
0,766
0,766
Óleo de rosa mosqueta
3,102
3,102
Tinogard TT®
0,1
0,1
Etanol
267,0
267,0
Fase aquosa
%
%
Polissorbato 80
0,766
0,766
Propilenoglicol
10,0
10,0
EDTA
0,1
0,1
Água MilliQ®
524,0
524,0
®
Os componentes da fase orgânica e da fase aquosa foram colocados separadamente em
um béquer e mantidos sob agitação magnética em banho-maria, à temperatura de
aproximadamente 35 ºC, durante 1 hora, sendo que o ativo (PA) foi adicionado à fase
orgânica no final do período de aquecimento. Com auxílio de um funil, a fase orgânica foi
vertida na fase aquosa e manteve-se a agitação durante 10 minutos. Esta mistura foi
concentrada a um volume final de 100 mL, em evaporador rotatório, para eliminação do
solvente orgânico e ajuste da concentração final de PA para 3 mg/mL.
Todas as suspensões foram preparadas em triplicata e acondicionadas em frascos de
vidro âmbar. Para fins comparativos, preparou-se uma suspensão na ausência do ativo (branco
– BC) (Tabela 1), utilizada como padrão na avaliação dos perfis físico-químicos de
estabilidade.
3.1.1 Determinação quantitativa do palmitato de ascorbila
O teor de PA foi quantificado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE),
de acordo com a técnica validada por Kristl e colaboradores (2003), com algumas
modificações, otimizando o método para os sistemas propostos no presente estudo.
38
As análises foram realizadas em cromatógrafo YL-Clarity, modelo YL9100 CLAE
Systen, equipado com bomba modelo YL9110, e detector ultravioleta com comprimento de
onda variável UV/VIS modelo YL916. Como fase estacionária utilizou-se coluna de fase
reversa Nucleosil C18 (120 x 4 mm I.D., 5 μm). A fase móvel (FM) consistiu de uma mistura
de metanol (MeOH) – acetonitrila (ACN) – tampão fosfato de potássio 0,02M pH 2,5
(40:40:20 – v/v). O volume de injeção foi de 20 μL, sob uma taxa de fluxo de 2 mL por
minuto, e detecção em 254 nm.
3.1.1.1 Construção da curva analítica
Para a construção da curva analítica foi diluído o equivalente 0,1 g de PA em metanol
(MeOH), em balão volumétrico de 100 mL (solução mãe). A partir dessa solução (1000
μg/mL) obtiveram-se os pontos da curva de 40, 50, 60, 70, 80 e 90 μg/mL. O procedimento
foi realizado em triplicata. Na Tabela 2, encontram-se as diluições e as concentrações finais
de PA, empregadas na curva analítica.
Tabela 2 – Curva analítica usada para determinação do palmitato de ascorbila nas suspensões
Balão (10 mL)
1
2
3
4
5
6
Solução padrão
(1000 μg/mL) (mL)
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
Solução diluente
(mL)
9,6
9,5
9,4
9,3
9,2
9,1
Concentração
(μg/mL)
40
50
60
70
80
90
As áreas médias, correspondentes a três determinações para cada diluição do ativo,
foram plotadas no eixo das ordenadas e as concentrações (μg/mL), no eixo das abscissas.
3.1.1.2 Teor de palmitato de ascorbila nas suspensões
Para determinação do teor de PA, foi retirada uma alíquota de cada suspensão,
correspondente a 750 μg de ativo, e transferida para um balão volumétrico de 10 mL, seguida
da adição de 3,0 mL de ACN e 3,0 mL de etanol, e colocadas em ultrassom por 30 minutos.
Após este tempo, adicionou-se 2 mL de fase móvel e deixou-se em vórtex por 10 minutos. Em
seguida, completou-se o volume com fase móvel, e as amostras foram novamente colocadas
em ultrassom por 30 minutos. Procedida a extração do ativo, as amostras foram centrifugadas
39
a 3500 rpm por 15 minutos, sendo posteriormente filtrado o sobrenadante em membrana
Millipore® 0,45 μm. Os valores das áreas das amostras foram aplicados na curva analítica e
calculados através da equação da reta, e o teor de PA foi expresso em μg/mL e porcentagem
(%).
3.1.2 Caracterização físico-química das suspensões contendo nanocápsulas de palmitato de
ascorbila
As suspensões foram analisadas quanto a taxa de associação, pH, diâmetro médio das
partículas, índice de polidispersão e potencial zeta.
3.1.2.1 Determinação da Taxa de Associação (TA%) de PA nas suspensões de nanocápsulas
A concentração de substância ativa associada à suspensão de nanocápsulas foi
determinada por CLAE, considerando a diferença entre o teor total de PA na formulação e a
quantidade presente na fase aquosa da suspensão. A quantidade total de PA foi determinada
conforme método descrito no item 3.1.1.
A quantificação de PA livre nas suspensões foi realizada pela técnica de ultrafiltraçãocentrifugação (FESSI et al., 1989), utilizando membranas Ultrafree® – MC Millipore 10,000
Å, durante 10 minutos a 7000 rpm. Desta maneira, as nanopartículas ficam retidas no filtro,
enquanto a fase aquosa contendo o ativo livre (não associado) passa através da membrana,
podendo ser quantificado a partir do ultrafiltrado, ao qual adicionou-se 300 μL de etanol e
300 μL de ACN. A quantificação do ativo foi realizada conforme a metodologia analítica
descrita no item 3.1.1.
3.1.2.2 Determinação do pH
A determinação do pH foi realizada diretamente nas suspensões, em potenciômetro
Digimed® previamente calibrado com soluções tampão pH 4,0 e 7,0.
3.1.2.3 Determinação do diâmetro médio das partículas e índice de polidispersão (IPD)
As determinações do diâmetro médio e do índice de polidispersão das nanopartículas
em suspensão foram realizadas através de espalhamento de luz dinâmico, no equipamento
Zetasizer®, Nano-ZS da Malvern. As suspensões foram diluídas 500 vezes (v:v) em água
MilliQ® e os resultados foram determinados através da média de três repetições.
40
3.1.2.4 Potencial zeta
O potencial zeta das suspensões de nanocápsulas foi obtido através da técnica de
mobilidade eletroforética no aparelho Zetasizer®, Nano-ZS da Malvern. As amostras foram
previamente diluídas 500 vezes (v:v) em cloreto de sódio 10 mM e filtradas em membrana
com 0,45µm. Os resultados foram expressos em milivolts (mV) a partir de uma média de três
determinações.
3.1.3 Estabilidade das suspensões de nanocápsulas contendo palmitato de ascorbila
As suspensões foram acondicionadas em frascos de vidro âmbar e armazenadas à
25 ºC ± 2 ºC e 3 ºC ± 2 ºC, durante o período de 90 dias. As amostras foram analisadas nos
tempos 0, 7, 15, 30, 60 e 90 dias, quanto ao teor e às suas características físico-químicas, de
acordo com os parâmetros descritos no item 3.1.1 e 3.1.2, respectivamente. Foram utilizados
como padrão suspensões de nanocápsulas sem ativo (branco), acondicionadas e armazenadas
nas mesmas condições que as demais suspensões. As análises foram realizadas em triplicata
para todas as amostras.
3.2 PREPARAÇÃO DAS FORMULAÇÕES SEMISSÓLIDAS
As suspensões de nanocápsulas contendo palmitato de ascorbila foram incorporadas
em gel hidrofílico. Os componentes utilizados na preparação deste gel contendo nanocápsulas
de PA estão descritos na Tabela 3.
Tabela 3 – Composição do gel hidrofílico contendo nanocápsulas de palmitato de ascorbila
Componentes
Concentração (%)
Dispersão de Carbopol 940® a 8% *
8,0
Trietanolamina
0,5
Sorbitol
5,0
Solução conservante (Imidazolidinil uréia 30%)
Suspensão de nanocápsulas contendo PA 3 mg/mL
1,0
qsp 100
* 8g de Carbopol® 940, 1g de conservante Nipagin/Nipazol e 91 mL de água MilliQ®
Para a preparação do gel foi adicionada à dispersão de Carbopol 940® a trietanolamina
e o sorbitol. Posteriormente adicionou-se, aos poucos, a suspensão de nanocápsulas contendo
PA, mantendo uma agitação constante até total homogeneização, seguindo da adição da
solução conservante.
41
Foi preparada, para fins comparativos, uma formulação contendo PA na forma livre;
sendo que o ativo foi previamente homogeneizado em polissorbato 80 (0,766 g) e monooleato
de sorbitano (0,766 g), sendo posteriormente adicionado ao gel. Logo após adicionou-se o
óleo de rosa mosqueta (3,102 g), o sorbitol (5,0 g), a água MilliQ® e a solução conservante
(1,0 g).
Todas as formulações foram preparadas em triplicata e acondicionadas em potes
plásticos de parede dupla, hermeticamente fechados, sendo que a concentração final de PA
nas formulações foi de 2,6 mg/g de gel.
3.2.1 Estudos de estabilidade das bases semissólidas
Para a determinação da estabilidade das formulações, as amostras foram armazenadas
em 3 ºC ± 2 °C e em 25 ºC ± 2 ºC durante o período de 90 dias. Os parâmetros analisados
foram: teor, características organolépticas, pH, viscosidade e espalhabilidade. As avaliações
foram feitas nos tempos 0, 7, 15, 30, 60 e 90 dias, exceto para as análises de viscosidade e
espalhabilidade, as quais foram feitas nos tempos 0 e 90 dias. As análises foram realizadas em
triplicata, para as formulações de gel contendo PA na forma livre e na forma
nanoencapsulada.
3.2.1.1 Teor de palmitato de ascorbila incorporado nas formulações semissólidas
Para a determinação do teor de PA nas formulações semissólidas foram pesados,
aproximadamente, 0,250 g de gel em balão volumétrico de 10 mL, sendo adicionados 3,0 mL
de ACN e 3,0 mL de etanol. As amostras foram colocadas em ultrassom por 30 minutos, e
logo após adicionou-se 2 mL de fase móvel, sendo posteriormente submetidas ao vórtex por
10 minutos. Em seguida, completou-se o volume com fase móvel, e as amostras foram
novamente colocadas em ultrassom por 30 minutos. Procedida a extração do ativo, as
amostras foram centrifugadas a 3500 rpm por 15 minutos, sendo posteriormente filtrado o
sobrenadante em membrana Millipore® 0,45 μm.
As amostras foram analisadas por CLAE, conforme método descrito anteriormente
(item 3.1.1). Os resultados obtidos, através das áreas dos picos, foram aplicados na curva
analítica e calculados através da equação da reta. O teor de PA em cada suspensão foi
expresso em μg/mL e porcentagem (%).
42
3.2.1.2 Determinação das características organolépticas
As características organolépticas avaliadas foram aparência, cor e odor. As amostras
foram acompanhadas por um período de três meses, sendo comparadas com as amostras
armazenadas em 25 ºC ± 2 ºC, as quais foram consideradas como controle. As amostras foram
classificadas de acordo com os seguintes critérios (ALVES, 1996):
1.
Condições normais e satisfatórias;
2.
Ligeira mudança de algum aspecto relativo à aparência, cor e odor da amostra;
3.
Incorporação de ar, algumas alterações da cor, odor, principalmente em termos
de rancificação;
4.
Início de separação de fases da amostra, notável coloração, produto com odor
alterado;
5.
Produto com fases separadas, produto fortemente corado; produto com odor
desagradável.
3.2.1.3 Determinação do pH
Para a determinação do pH das formulações semissólidas foi utilizado um
potenciômetro calibrado com soluções tampão pH 4,0 e 7,0. As leituras foram realizadas
diretamente nas formulações semissólidas.
3.2.1.4 Avaliação da viscosidade
A viscosidade das formulações semissólidas foi avaliada com auxílio de um
viscosímetro rotacional Brookfield, modelo RV DV-1+ com 10 velocidades. As análises
foram realizadas em triplicada, nas velocidades 5, 10, 20, 50 e 100 rpm utilizando o spindle
07. Para a realização das análises, a temperatura das amostras foi padronizada em 25 ºC ±
2º C, obedecendo-se o tempo de 1 minuto para o ajuste do fator de velocidade. A construção
dos reogramas foi feita através da representação gráfica da taxa de cisalhamento, em função
da tensão de cisalhamento. O comportamento reológico foi acompanhado ainda em função da
relação entre a viscosidade em função da taxa de cisalhamento.
43
3.2.1.5 Determinação da espalhabilidade
Para a determinação da espalhabilidade foi empregada a metodologia proposta por
Münzel e colaboradores (1959), modificada por Knorst em 1991. Foi utilizada uma placamolde circular de vidro (diâmetro = 20 cm; espessura = 0,2 cm), com orifício central de 1,2
cm de diâmetro, a qual foi colocada sobre uma placa-suporte de vidro (20 cm X 20 cm). Sob
essas placas posicionou-se uma folha de papel milimetrado. A amostra foi introduzida no
orifício da placa e a superfície nivelada com espátula; após, a placa-molde foi cuidadosamente
retirada. Sobre a amostra foi colocada uma placa de vidro de peso pré-determinado. Após 1
minuto, calculou-se a superfície abrangida através da medição do diâmetro em duas posições
opostas, com posterior cálculo do diâmetro médio.
Esse procedimento foi repetido acrescentando-se novas placas e padronizando-se o
intervalo de 1 minuto entre as placas. Após cada determinação, a superfície abrangida e o
peso da placa adicionada foram registrados. A espalhabilidade (Ei) determinada a 25 ºC e
calculada através da equação abaixo (DE PAULA et al., 1998):
Ei = (d2.π)/4
Onde:
Ei = espalhabilidade da amostra para peso i (mm2);
d = diâmetro médio (mm).
Os valores da espalhabilidade em função dos pesos adicionados foram determinados
através de 3 medições, calculando-se a média entre elas.
3.3 BIOMETRIA CUTÂNEA
3.3.1 Critérios de inclusão e exclusão para seleção de voluntários
Após a devida aprovação deste projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa envolvendo
seres humanos do Centro Universitário Franciscano – CEP/Unifra nº 293.2010.2 e CONEP nº
1246, foram selecionados 20 voluntários saudáveis, de ambos os sexos, com idade entre 20 e
40 anos. Os voluntários só fizeram parte do estudo após assinar o Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido (Anexo 1), declarando estar plenamente de acordo em participar
voluntariamente desta pesquisa.
44
Alguns critérios de exclusão foram adotados durante a seleção dos voluntários. Não
participaram da pesquisa os voluntários que apresentassem histórico ou sinais de
dermatopatologias, hipersensibilidade a algum componente da formulação, ou que
apresentaram sinais de irritação ou dermatite de contato associado. Também não participaram
da pesquisa voluntários em período de gestação ou lactação.
Foi protocolado, ainda, que qualquer intercorrência que pudesse ocorrer nos sujeitos
da amostra, estes receberiam atendimento clínico da médica Nara Maria Beck Martins, CRMRS 14909.
3.3.2 Condições experimentais
Inicialmente, os voluntários foram orientados a não utilizar nenhum produto cosmético
na região dos antebraços, e interromper o uso de qualquer produto uma semana antes do início
e durante as análises do presente estudo.
Após cada voluntário concordar em participar da pesquisa, assinar o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido, e ser compatível com os critérios estabelecidos para
seleção dos mesmos, recipientes contendo o gel foram distribuídos para que o produto fosse
aplicado pelo voluntário, em sua residência.
Foi padronizada uma quantidade aproximada de 0,5 g de gel para aplicação, com
auxílio de uma espátula, em cada antebraço. As aplicações foram realizadas uma vez ao dia, à
noite, durante 90 dias. No antebraço direito foi aplicado o gel contendo o palmitato de
ascorbila na forma livre (GPA); enquanto que no antebraço esquerdo foi aplicado o gel com o
palmitato de ascorbila na forma nanoencapsulada (GNCPA).
Os testes foram realizados segundo o método de caso-controle, onde cada indivíduo é
controle de si mesmo. A fim de evitar erros durante a aplicação, os voluntários foram
instruídos adequadamente em termos de quantidade e modo de uso de cada formulação,
segundo especificado no protocolo.
3.3.3 Estudos de biometria cutânea
No estudo de biometria cutânea, avaliou-se o efeito da formulação contendo palmitato
de ascorbila na forma nanoencapsulada e na forma livre, através de métodos biométricos não
45
invasivos capazes de medir a hidratação, a perda transepidérmica de água, o pH, o teor de
melanina e eritema da pele. Foram efetuadas medidas em pontos diferentes do antebraço dos
voluntários, partindo de uma distância de 5 cm do pulso, utilizando como parâmetro um
molde retangular (Figura 5). O número de medições realizadas foi determinado de acordo
com o tamanho da região a ser analisada, de tal forma a garantir que todo o local fosse
avaliado.
Figura 5 – Representação esquemática do local de aplicação das formulações no antebraço dos
voluntários (adaptado de FERREIRA, 2008)
As medidas de biometria cutânea foram realizadas antes do início da aplicação das
formulações (medidas basais), sendo este tempo, portanto, correspondente aos valores para o
controle do ensaio. Posteriormente, as leituras foram realizadas de 7 em 7 dias, no 7º, 14º, 21º,
28º, 35°, 42°, 49°, 56º, 63º, 70º, 77º, 84º e 90º. Estes estudos foram realizados em ambiente
climatizado e monitorado, com temperatura variando entre 22 °C e 25 °C, e umidade relativa
do ar entre 40-50 %. Os voluntários estavam na posição sentada, com o antebraço totalmente
apoiado em uma superfície plana, e as análises somente foram iniciadas após os voluntários
permanecerem de 10-15 minutos neste ambiente. Para a realização destes estudos, foram
utilizados equipamentos específicos para este fim, de acordo com o que segue:
3.3.3.1 Determinação do conteúdo aquoso do estrato córneo (grau de hidratação cutânea)
Para a realização deste estudo foi utilizado o equipamento Corneometer®, acoplado a
um software (SM_CM_PH), o qual mede o conteúdo aquoso do estrato córneo (determinando
assim o teor de água das camadas superficiais da epiderme até uma profundidade de cerca de
0,1 mm). Este método é baseado no princípio da medida da capacitância elétrica, ou seja, na
variação do valor da constante dielétrica da água (Manual Courage-Khazaka Electronic,
Alemanha). Um sensor do tipo caneta foi colocado em dez pontos diferentes do antebraço,
onde o final da análise foi sinalizado por um bip sonoro, sendo estas medidas registradas
automaticamente no aparelho.
46
3.3.3.2 Determinação do pH cutâneo
A análise do pH da superfície cutânea foi realizada por potenciometria direta, isto é,
por meio de um eletrodo especial de pontes simples, concebido através de uma fina membrana
de vidro e porcelana, cujo eletrólito é o KCl 3M. Esta análise foi feita através do equipamento
Skin-pH-meter®, acoplado a um software (SM_CM_PH).
O eletrodo foi calibrado antes de cada leitura com soluções tampão pH 4,0 e 7,0 e
colocado diretamente em contato com a pele dos voluntários em dez regiões distintas do
antebraço, sendo que um sinal sonoro indicou o término de cada medida (Manual CourageKhazaka Electronic, Alemanha).
3.3.3.3 Determinação da perda transepidérmica de água (PTEA)
Para a realização deste estudo foi utilizado o equipamento Tewameter® TM 300,
acoplado a um software (Multi Probe Adapter 5), cuja função é medir a perda transepidérmica
de água (em g/h/m2). O princípio de medição deste parâmetro baseia-se na Lei de Difusão,
descrito por Adolf Fick em 1885, que define a massa de água transportada por unidade de
superfície cutânea em um determinado período de tempo:
dm = - D . A . dp
dt
dx
onde:
A = superfície em m2;
m = água transportada (em g);
t = tempo (h);
D = constante de difusão;
p = pressão de vapor da atmosfera;
x = distância da superfície da pele ao ponto de medição (m).
Uma sonda foi colocada em dez pontos diferentes do antebraço, sendo que o final de
cada medição foi indicado por um bip sonoro, e estas medidas foram registradas
47
automaticamente no aparelho. Este método é aceito mundialmente como uma medida padrão
(Manual Courage-Khazaka Electronic, Alemanha).
3.3.3.4 Determinação da intensidade de melanina e eritema
Este método baseia-se na medida da luz absorvida e refletida, através de um
espectrofotômetro projetado para medir precisamente a cor da pele. O aparelho utilizado para
esta análise foi o Mexameter MX 18, acoplado a um software (Multi Probe Adapter 5), que
utiliza o princípio ótico para determinar a intensidade do eritema e da pigmentação da
melanina.
Uma sonda é aplicada sobre a superfície da pele (1,54 cm2), com pressão constante
através de uma mola. Assim que a sonda é colocada sobre a superfície da pele o processo de
medição começa automaticamente. A sonda é muito sensível e mostra uma larga escala de
valores de melanina e eritema (0-999), podendo detectar até mesmo a mais leve alteração na
cor da pele (Manual Courage-Khazaka Electronic, Alemanha).
A análise foi realizada em dez pontos diferentes do antebraço. Todos os resultados
foram expressos em valores numéricos, correspondendo ao valor médio de todas as medidas,
tanto de melanina como de eritema.
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A metodologia estatística dos dados incluiu análise descritiva de variáveis como
média, desvio padrão (DP), desvio padrão relativo (DPR) e análise de variância (ANOVA)
seguida pelo teste de Tukey, considerando-se níveis de significância de 95 %.
48
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 PREPARAÇÃO DAS SUSPENSÕES
As suspensões de nanocápsulas contendo PA apresentaram-se com um aspecto branco,
leitoso e com aparência homogênea. As suspensões de nanocápsulas sem o ativo
apresentaram-se da mesma forma, com um aspecto branco e aparência homogênea, não
havendo diferença visual entre as mesmas.
4.2 DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DO PALMITATO DE ASCORBILA
4.2.1 Curva analítica
A quantificação do teor de PA foi realizada de acordo com a técnica validada por
Kristl e colaboradores (2003). O PA foi diluído em metanol, em quantidade suficiente para
obter uma solução-mãe na concentração de 1 mg/mL. Estas soluções foram posteriormente
diluídas em FM (ACN:MeOH:tampão fosfato de potássio 0,02M - 40:40:20 – v/v), obtendose os pontos da curva nas concentrações de 40, 50, 60, 70, 80 e 90 μg/mL.
A curva analítica está representada na Figura 6, através do gráfico “Área do pico
versus Concentração” das soluções padrão contendo PA, obtendo-se a seguinte equação da
reta: y = 26,911x + 125,05, onde x = concentração real de ativo em μg/mL e y = área absoluta
do pico, apresentando um coeficiente de correlação de 0,9987.
Figura 6 – Representação gráfica da curva analítica
49
Através dos resultados obtidos, pode-se observar que a curva analítica do PA
apresentou regressão linear significativa (p<0,05), não havendo desvio significativo de
linearidade (p>0,05). Com isso, demonstra-se que a curva analítica pode ser utilizada para a
interpolação de valores experimentais, visando à determinação quantitativa do teor de PA.
4.3 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DAS SUSPENSÕES DE NANOCÁPSULAS
CONTENDO PALMITATO DE ASCORBILA
Muitos fatores combinados como a composição das nanocápsulas, o método de
preparação e as condições de armazenamento podem afetar a estabilidade dos sistemas
nanoencapsulados (MORA-HUERTAS, FESSI e ELAISSARI, 2010). Os parâmetros físicoquímicos geralmente utilizados para monitorar a estabilidade das suspensões poliméricas são
diâmetro médio de partícula, potencial zeta, teor de fármaco e pH (SCHAFFAZICK et al.,
2003).
Visando avaliar a estabilidade das referidas suspensões, armazenadas em 25 ºC ± 2 ºC
e 3 °C ± 2 ºC, o teor, o pH, o diâmetro médio de partícula, o IPD e o potencial zeta foram
monitorados durante 90 dias.
4.3.1 Teor de palmitato de ascorbila nas suspensões
As suspensões de nanocápsulas contendo PA foram desenvolvidas baseadas no
trabalho de ZATTA (2011), a qual utilizou PCL como polímero e óleo de açaí como núcleo
oleoso. Estas suspensões foram armazenadas durante 30 dias em temperatura ambiente (22 ºC
± 2 ºC), geladeira (4 ºC ± 2 ºC), estufa (40 ºC ± 2 ºC) e câmara UVC (254 nm). Logo após a
obtenção destas suspensões, as mesmas apresentaram um teor inicial de 97,51 %. Entretanto,
no 30º dia de armazenamento foi observada uma significativa perda de ativo, o qual
apresentou um teor de 24,42 % para a amostra a 4 ºC ± 2 ºC e 16,7 % para a amostra a 22 ºC ±
2 ºC, não sendo detectado nas demais condições.
Devido ao exposto, no presente trabalho foram feitas modificações em alguns dos
componentes desta suspensão desenvolvida por Zatta (2011), como a troca de polímero, a
mudança na concentração de propilenoglicol e a adição de EDTA; com o objetivo de
selecionar a formulação mais estável. As alterações na concentração de propilenoglicol
objetivaram uma maior proteção do ativo, já que por se tratar de um agente anti-hidrolítico, o
50
mesmo pode evitar ou diminuir as reações de hidrólise que possam ocorrer com o palmitato,
quando este estiver na presença de água.
Além destas modificações, foram desenvolvidas formulações com diferentes
antioxidantes e núcleos oleosos, sendo estes BHT e Tinogard TT®, e óleo de melaleuca
(NCPAME), óleo de rosa mosqueta (NCPARM) e óleo de cenoura (NCPACE),
respectivamente. As amostras foram armazenadas a 3 ºC ± 2 ºC e o teor de PA foi
quantificado inicialmente e após 21 dias (Tabela 4).
Tabela 4 – Teor de palmitato de ascorbila (%) associado à nanocápsulas com diferentes
antioxidantes e diferentes núcleos oleosos, armazenadas em 3 ºC ± 2 ºC, no período de 21 dias
Tinogard TT®
BHT
Inicial
21 dias
Inicial
21 dias
NCPAME
88,27 ± 1,44
81,24 ± 2,81
83,03 ± 0,38
74,17 ± 0,91
NCPARM
82,50 ± 0,16
74,93 ± 0,49
85,20 ± 1,56
72,93 ± 1,76
NCPACE
80,27 ± 0,88
75,01 ± 3,34
87,85 ± 0,02
73,30 ± 0,19
Valores referentes à média de três formulações ± desvio padrão (DP)
A partir dos dados obtidos, pode-se considerar que a quantificação inicial do teor de
PA nas três suspensões foi satisfatória. Apesar destes valores não estarem dentro da faixa
geralmente encontrada para nanopartículas, entre 90-110 %, (KRISTL et al., 2003; PAESE et
al., 2009; KÜLKAMP et al., 2009; FARIAS, 2011), deve-se levar em consideração a
instabilidade do fármaco já relatada anteriormente por diversos autores (SPICLIN et al., 2001;
TEERANCHAIDEEKUL et al., 2007; GOSENCA et al., 2010; ZATTA, 2011).
Após os 21 dias de análise, observou-se uma diminuição no teor de ativo para as três
formulações desenvolvidas, tanto com Tinogard TT® como com BHT. Avaliando,
comparativamente, o teor de PA obtido inicialmente foi maior nas suspensões que continham
BHT do que nas suspensões que continham Tinogard TT®, entretanto, ao final dos 21 dias de
análise estas suspensões apresentaram uma perda menor de ativo, sendo 7,97 % para as
NCPAME, 9,18 % para as NCPARM e 6,56 % para as NCPACE; enquanto que com BHT a
perda foi de 10,68 % para as NCPAME, 14,41 % para as NCPARM e 16,57 % para as
NCPACE. Isso confirma a estimativa de que a presença do Tinogard TT® promova uma
maior proteção do ativo no interior das nanocápsulas, representando um promissor sistema
para incorporação do PA.
51
Tendo em vista os resultados obtidos, a formulação escolhida para dar continuidade ao
trabalho foi a que utilizou Tinogard TT® como antioxidante e óleo de rosa mosqueta como
núcleo oleoso. Apesar da formulação que continha óleo de cenoura apresentar resultados mais
satisfatórios em relação ao teor, optou-se pela utilização do óleo de rosa mosqueta devido este
apresentar propriedades hipopigmentante, regenerativa e cicatrizante semelhantes ao PA
(FRANCO et al., 2007). A partir disto, foram preparadas suspensões de NCPA, de acordo
com a composição e método descritos no item 3.1.
Na Tabela 5 estão descritos os resultados referentes ao teor de PA associado à
nanocápsulas, as quais foram mantidas sob armazenamento em 25 ºC ± 2 ºC e 3 ºC ± 2 ºC por
um período de 90 dias.
Tabela 5 – Teor de palmitato de ascorbila (%) associado à nanocápsulas, no período de 90
dias, em 25 ºC ± 2 ºC e 3 ºC ± 2 ºC
NCPA
Inicial
25 ºC ± 2 ºC
82,95 ± 0,77 a
3 ºC ± 2 ºC
82,95 ± 0,77 a
7 dias
71,70 ± 1,33 b
82,20 ± 0,84 ab
15 dias
69,74 ± 0,85 bc
81,85 ± 0,97 abc
30 dias
67,54 ± 0,50 cd
73,43 ± 0,76 cd
60 dias
54,48 ± 3,66 e
72,86 ± 2,38 d
90 dias
52,47 ± 1,42 e
61,83 ± 4,24 e
Valores referentes à média de três formulações ± desvio padrão (DP)
a-b-c-d-e: as médias com as letras diferentes dentro da mesma coluna apresentaram diferença significativa entre
si (p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
Inicialmente, a suspensão de nanocápsulas contendo PA apresentou um teor
satisfatório de ativo (82,95 % ± 0,77). Entretanto, nas determinações seguintes observou-se
uma diminuição do teor, em ambas as temperaturas, sendo que as amostras armazenadas em
3 ºC ± 2 ºC tiveram uma perda significativa de ativo (p<0,05) a partir dos 30 dias de análise,
enquanto que as amostras armazenadas em 25 ºC ± 2 ºC já apresentaram esta perda a partir do
7º dia.
Isto mostra que o teor do ativo é dependente das condições de armazenamento, como
temperatura e presença ou ausência de luz, pois através dos resultados expostos acima pode-se
observar que a suspensão armazenada em 3 ºC ± 2 ºC manteve por mais tempo o ativo do que
a armazenada em 25 ºC ± 2 ºC.
52
A Figura 7 representa o teor de PA entre as formulações de NC armazenadas em 25 ºC
± 2 ºC e 3 ºC ± 2 ºC durante 90 dias.
Figura 7 – Teor de PA em diferentes temperaturas, durante 90 dias de experimento.
Ao final dos 90 dias de análise, a perda total de ativo foi de 36,75 % e 25,47 % para as
amostras armazenadas em 25 ºC ± 2 ºC e 3 ºC ± 2 ºC, respectivamente. Esta diferença foi
estatisticamente significativa (p<0,05) no teor inicial de PA em relação ao teor final para cada
uma das temperaturas. Com isso, foi possível evidenciar que a presença de luz e calor
favorece acentuadamente a decomposição do PA.
Sabe-se que a decomposição por oxidação e redução de fármacos é responsável pela
instabilidade de um número considerável de preparações farmacêuticas, como por exemplo,
vitaminas, antibióticos, esteróides (LACHMAN, DeLUCA e AKERS, 2001; DINIZ et al.,
2008). O emprego da vitamina C e, consequentemente, de seus derivados, tem sido dificultado
devido a sua alta suscetibilidade à degradação, sendo extremamente instável quando na
presença de luz, ar, altas temperaturas e até mesmo com a água. Considera-se que tais
condições podem facilmente desencadear uma reação de oxidação, o que leva a perda
completa de sua atividade biológica (KRAMBECK, 2009). Isto pode ser verificado pelo teor
de PA em diferentes amostras, no início do período de armazenamento, diferentemente da
formulação em questão, a qual apresentou uma maior concentração de ativo quando
comparada aos resultados de diversos estudos:
 Kristl e colaboradores (2003) incorporaram PA em diferentes sistemas carreadores,
como lipossomas e nanopartículas lipídicas sólidas (NLS). As formulações que
continham inicialmente 1 % de ativo, após 4 semanas de estudo, apresentaram
53
porcentagens de ativo não degradado iguais a 26 % para os lipossomas e 25 % para as
NLS, ou seja, ocorreu uma degradação de ativo em torno de 74 % para os lipossomas
e 75 % para as NLS.

 Teeranachaideekul e colaboradores (2007) avaliaram carreadores nanolipídicos
contendo PA em diferentes condições de armazenamento e na presença e ausência de
oxigênio. Após 30 dias obtiveram um teor de ativo não-degradado de 17 % (em 25 ºC)
e 46 % (em 4 ºC) nas formulações expostas ao oxigênio; enquanto que após 90 dias
obtiveram um teor maior que 85 % de ativo (em 25 º e 4 ºC) nas formulações que
permaneceram em ambiente sem oxigênio.

 Zatta (2011) desenvolveu diferentes sistemas nanoestruturados contendo PA, dentre
eles nanocápsulas (NCPA), nanoemulsões (NEPA) e nanodispersões (NDPA).
Inicialmente, estes sistemas apresentaram um teor de 97,51 % para as NCPA, 80,68 %
para as NEPA e 83,10 % para as NDPA. Após 30 dias de armazenamento, o teor
encontrado foi de 24,42 % para as NCPA e 21,37 % para as NEPA armazenadas em
4 ºC, sendo que nas NDPA o ativo não foi detectado.
Diante do exposto até o momento, é possível observar que a formulação em questão
manteve teores mais elevados de ativo, por um período de tempo maior, quando comparado
aos resultados encontrados nos estudos anteriormente citados. A associação do PA a sistemas
nanoestruturados, principalmente à nanocápsulas, constitui uma perspectiva inovadora para
sua estabilização e também uma importante solução para o beneficiamento de suas
propriedades. Isto se deve ao fato de que a membrana polimérica presente nestas
nanocápsulas apresenta um possível efeito protetor contra os danos causados por agentes
externos, prevenindo assim, a sua degradação (KÜLKAMP et al., 2009).
Sendo assim, pode-se dizer que as nanocápsulas foram capazes de conferir uma
proteção parcial ao PA frente à degradação química, além de ficar evidente que a refrigeração
mostrou ser a temperatura mais adequada para a manutenção da estabilidade desta
formulação.
54
4.3.2 Determinação da Taxa de Associação (TA%) de PA nas suspensões de nanocápsulas
A determinação do percentual de fármaco associado às nanopartículas é de
fundamental importância, não só para a determinação da efetividade do sistema como também
para o desenvolvimento e incorporação de ativos visando um alto índice terapêutico
(SCHAFFAZICK et al., 2003; ZATTA, 2011). Isso só será possível se o ativo estiver
eficientemente encapsulado.
No presente estudo, foram obtidos valores de eficiência de encapsulação para a
suspensão de NCPA de 97 %. De acordo com os valores encontrados, pode-se considerar o
método aplicado eficaz para a encapsulação do PA na concentração de 3 mg/mL, utilizando o
Eudragit® L100 como polímero e óleo de rosa mosqueta como núcleo oleoso.
A natureza química do fármaco e sua polaridade em particular, determinam a
eficiência de encapsulação. Neste sentido, fármacos hidrofílicos podem atingir valores
máximos de 10 % e nos casos de fármacos lipofílicos a eficiência de encapsulação é superior
a 70 % (MORA-HUERTAS, FESSI e ELAISSARI, 2010). Outros fatores também podem
influenciar a quantidade de fármaco associada aos sistemas nanoestruturados, dentre eles
pode-se citar, a natureza do polímero, o pH do meio, a quantidade de fármaco adicionada à
formulação, o tipo de tensoativo adsorvido à superfície polimérica e a natureza do óleo
utilizado (no caso das nanocápsulas) (SCHAFFAZICK et al., 2003).
Sendo assim, a taxa de encapsulação poderá apresentar diferentes valores. Dai e
colaboradores (2004) obtiveram valores de 98,2 % de ciclosporina A encapsulada com
Eudragit® L100. Cetin e colaboradores (2010) realizaram estudos com nanocápsulas de
diclofenaco sódico utilizando Eudragit® L100, obtendo taxa de associação no valor de 62 %.
Já para o desenvolvimento de nanocápsulas contendo melatonina, utilizando Eudragit® S100
como polímero e Miglyol® como núcleo oleoso, Schaffazick e colaboradores (2008)
encontraram valores de 50 % de ativo encapsulado.
4.3.3 Determinação do pH
Através do monitoramento do pH, em função do tempo, pode-se obter informações
relevantes sobre a estabilidade de suspensões nanoparticuladas (SCHAFFAZICK et al.,
2003). Na maioria das vezes, as alterações nos valores de pH podem indicar degradação do
polímero ou de algum outro componente, ou ainda, difusão do fármaco para o meio aquoso
55
(GUTERRES et al., 1995). Por exemplo, a diminuição dos valores de pH de suspensões
poliméricas, em um curto período de tempo, pode ser atribuída tanto à ionização de grupos
carboxílicos presentes no polímero, quanto à hidrólise, dependendo da hidrofobicidade do
poliéster (DINIZ et al., 2008).
O palmitato de ascorbila é um fármaco que possui característica de pH neutro, sendo
solúvel em meios ácidos, apresentando pKa na faixa de 4,26 (KOHLER, MANTSCH e
CASAL, 1988) e peso molecular de 414,54 Da.
Os valores médios de pH verificados para as suspensões contendo NCPA estão
descritos na Tabela 6.
Tabela 6 – Valores de pH para as formulações contendo nanocápsulas de palmitato de
ascorbila (NCPA) e nanocápsulas sem o ativo (NCBC), no período de 90 dias, em 25 ºC ±
2 ºC e 3 ºC ± 2 ºC
Formulações
NCPA
NCBC
Inicial
15 dias
25 ºC ± 2 ºC
4,21 ± 0,02
4,03 ± 0,06
3 ºC ± 2 ºC
4,21 ± 0,02
4,04 ± 0,01
25 ºC ± 2 ºC
4,53 ± 0,04
4,55 ± 0,05
3 ºC ± 2 ºC
4,53 ± 0,04
4,49 ± 0,12
30 dias
4,11 ± 0,04
4,13 ± 0,05
4,43 ± 0,09
4,61 ± 0,10
60 dias
3,93 ± 0,14
4,22 ± 0,11
4,64 ± 0,09
4,52 ± 0,04
90 dias
3,85 ± 0,09
4,20 ± 0,05
4,57 ± 0,07
4,55 ± 0,11
Valores referentes à média de três formulações ± desvio padrão (DP).
No presente estudo, os valores médios de pH mantiveram-se estáveis para as NCPA
armazenadas à 3 ºC ± 2 ºC, bem como para as NCBC, em ambas as temperaturas, enquanto
que as amostras de NCPA armazenadas em 25 ºC ± 2 ºC apresentaram diferença significativa
(p<0,05) a partir de 60 dias de análise. Esta diferença evidencia a instabilidade do ativo não só
em meio aquoso, como também, frente à condições de calor e luz. Devido a esta limitada
estabilidade, acredita-se que a diminuição do pH nas NCPA (25 ºC ± 2 ºC) esteja relacionada
com a degradação sofrida pelo ativo, já que a exposição a temperaturas moderadas também
levam à rápida hidrólise da molécula do PA, através de uma abertura irreversível no anel
enediol (provindo do ácido ascórbico), presente na sua estrutura (ROSA et al., 2007;
GONÇALVES e MAIA CAMPOS, 2009b).
56
Resultados inferiores foram obtidos por Zatta (2011) ao analisar suspensões contendo
nanocápsulas de palmitato de ascorbila, onde o pH inicial foi de 3,44 ± 0,05. Após 30 dias de
análise houve um decréscimo significativo (p<0,05) para todas as amostras, armazenadas em
4 ºC ± 2 ºC (3,12 ± 0,04), 22 ºC ± 2 ºC (2,56 ± 0,12), 40 ºC ± 2 ºC (2,87 ± 0,06) e câmara
UVC (2,87 ± 0,05).
Com relação aos valores encontrados neste estudo, os mesmos mostraram-se
adequados com o método de preparação e as matérias-primas utilizadas, de acordo com as
condições desejáveis para estabilização do ativo. Considera-se que os valores de pH
levemente mais ácidos, apresentados pelas NCPA, seja devido à presença do fármaco, o qual,
por apresentar um anel enediol em sua estrutura, confere acidez à formulação em que está
inserido (DALCIN, SCHAFFAZICK e GUTERRES, 2003). Isso pode ser confirmado ao
analisarmos comparativamente as NCBC (sem o ativo), as quais não apresentaram diferença
significativa (p>0,05) ao final dos 90 dias, o que evidencia a estabilidade do polímero e do
óleo de rosa mosqueta frente a diferentes temperaturas.
Por se tratar de um polímero pH dependente, o Eudragit® pode atuar como
polieletrólito, o que o torna adequado para diferentes fins (MOUSTAFINE et al., 2005),
podendo ser utilizado no desenvolvimento de produtos com características físico-químicas
diferentes (CEBALLOS et al., 2005; CAPPELLA, BOERIS e PICÓ, 2011). Schaffazick e
colaboradores (2002) desenvolveram nanocápsulas de diclofenaco utilizando Eudragit® S90
como polímero e benzoato de benzila como núcleo oleoso, e obtiveram um pH inicial em
torno de 5,22. A mesma autora (2008), ao desenvolver nanocápsulas de melatonina utilizando
Eudragit® S100, obteve um pH ácido em torno de 4,2.
Estudos relatam também, de uma forma geral, que suspensões de nanocápsulas
preparadas pelo método de nanoprecipitação apresentam valores de pH em torno de 4,0-6,0.
Ferrony (2009) desenvolveu nanocápsulas de PCL contendo dexametasona para o tratamento
da psoríase, obtendo pH de 4,8. Külkamp e colaboradores (2009) desenvolveram
nanocápsulas com ácido lipóico, e obtiveram um pH em torno de 4,66. Já Farias (2011)
desenvolveu nanocápsulas poliméricas contendo adapaleno, e obteve valores de pH em torno
de 5,3. Desta maneira, verifica-se que estes estudos têm apresentado valores de pH com
características ácidas, apesar dos ativos e do polímero serem quimicamente diferentes.
57
4.3.4 Determinação do diâmetro médio das partículas e índice de polidispersão (IPD)
A determinação do diâmetro de partícula e do índice de polidispersão em função do
tempo são parâmetros que devem ser estudados em preparações coloidais, visto que qualquer
mudança pode ser indício de agregação das partículas e, consequentemente, sedimentação do
sistema (GUTERRES et al., 1995).
Os valores de diâmetro médio e IPD verificados para as nanocápsulas contendo
palmitato de ascorbila e para as nanocápsulas sem o ativo estão descritos na Tabela 7.
Tabela 7 – Valores referentes ao diâmetro médio das partículas (DM) e índice de
polidispersão (IPD) para as formulações de nanocápsulas contendo palmitato de ascorbila
(NCPA) e nanocápsulas sem o ativo (NCBC), no período de 90 dias, para as amostras
armazenadas a 25 ºC ± 2 ºC e 3 ºC ± 2 ºC
NCPA
25 ºC ± 2 ºC
3 ºC ± 2 ºC
Inicial
DM (nm) ± DP
269,7 ± 0,14 a
IPD ± DP
0,172 ± 0,06
DM (nm) ± DP
269,7 ± 0,14 a
IPD ± DP
0,172 ± 0,06
30 dias
339,0 ± 1,47 b
0,432 ± 0,02
311,5 ± 2,38 ab
0,327 ± 0,04
60 dias
452,4 ± 0,98 c
0,434 ± 0,39
358,1 ± 0,95 bc
0,390 ± 0,11
90 dias
d
0,418 ± 0,03
c
0,465 ± 0,08
503,5 ± 2,12
481,0 ± 1,27
NCBC
Inicial
25 ºC ± 2 ºC
DM (nm) ± DP
IPD ± DP
319,5 ± 1,33 a
0,262 ± 0,02
3 ºC ± 2 ºC
DM (nm) ± DP
IPD ± DP
319,5 ± 1,33 a
0,262 ± 0,02
30 dias
290,6 ± 2,01 b
0,232 ± 0,04
308,5 ± 1,21 ab
0,182 ± 0,01
60 dias
279,3 ± 1,95 b
0,218 ± 0,09
308,1 ± 2,07 abc
0,136 ± 0,04
90 dias
230,6 ± 2,23 c
0,232 ± 0,07
281,4 ± 0,50 bc
0,275 ± 0,20
Valores referentes à média de três formulações ± desvio padrão (DP)
a-b-c-d: as médias com as letras diferentes dentro da mesma coluna apresentaram diferença significativa entre si
(p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
No presente estudo, as suspensões apresentaram inicialmente um diâmetro de partícula
e IPD satisfatórios para a aplicação requerida. De acordo com a Tabela 7, para a suspensão de
NCPA obteve-se um diâmetro médio inicial significativamente menor (p<0,05) do que o
apresentado pelas NCBC. O valor inicial do IPD obtido para as NCPA foi inferior a 0,2,
demonstrando uma adequada homogeneidade na distribuição do tamanho das partículas
(PAESE et al, 2009). Isto está de acordo com a literatura onde, segundo Mora-Huertas e
58
colaboradores (2010), o diâmetro médio de nanocápsulas preparadas pelo método de
deposição interfacial do polímero pré-formado é, em geral, entre 250 e 500 nm.
Para a suspensão de nanocápsulas de PA desenvolvida por Zatta (2011) foi obtido um
diâmetro médio inicial de 306,2 nm e IPD de 0,224, o qual foi significativamente maior do
que o apresentado pelas NCBC (248,0 nm). Teeranachaideekul e colaboradores (2007), ao
avaliar a estabilidade de carreadores nanolipídicos contendo PA, obtiveram um tamanho
médio de partícula, para todas as formulações, entre 190 e 270 nm e um IPD menor que 0,3.
Alguns fatores como a concentração do polímero na fase orgânica, a polaridade do
solvente, a concentração dos tensoativos (MORA-HUERTAS, FESSI e ELAISSARI, 2010) e
a natureza do óleo utilizado como núcleo (SCHAFFAZICK et al., 2003) são essenciais na
determinação do tamanho das nanocápsulas. Schaffazick e colaboradores (2002) verificaram
grande influência do componente oleoso sobre o diâmetro médio, onde nanoesferas
preparadas com Eudragit® S90 apresentaram valores inferiores às nanocápsulas preparadas
com o mesmo polímero. Cetin e colaboradores (2010), ao analisar nanocápsulas de Eudragit®
L100 contendo diclofenaco sódico, encontraram valores médios de tamanho de partícula de
274 nm, valores estes superiores quando comparado com o mesmo fármaco encapsulado com
Eudragit L100®:PLGA (20:80) (241 nm).
Por outro lado, a concentração do fármaco não parece influenciar no tamanho quando
elas são preparadas pelo método de deposição interfacial de polímero pré-formado (MORAHUERTAS, FESSI e ELAISSARI, 2010). Paese e colaboradores (2009) ao desenvolver
nanocápsulas contendo benzofenona-3 em diferentes concentrações não encontrou alteração
no tamanho das partículas, sendo que todas as suspensões apresentaram diâmetros médios
próximos a 250 nm.
No decorrer do período de armazenamento das suspensões foi possível observar
alterações nos valores de diâmetro médio. As suspensões de NCPA armazenadas em 25 ºC ±
2 ºC tiveram um aumento acentuado (p<0,05) no seu tamanho de partícula e IPD a partir dos
30 dias de análise; enquanto que as NCPA armazenadas em 3 ºC ± 2 ºC só apresentaram
aumento significativo (p<0,05) após 60 dias. A alteração nos valores de distribuição do
tamanho de partícula pode ser atribuída a um processo de difusão, onde o ativo migra das
nanocápsulas menores para as maiores, sendo que nas NCBC este efeito não foi observado.
59
As NCBC serviram como controle do experimento, sendo que a sua caracterização
físico-química é de suma importância, pois através delas podemos avaliar se houve alguma
alteração no comportamento destes sistemas com a incorporação do fármaco. No decorrer dos
90 dias foi possível observar que estas apresentaram uma diminuição significativa (p<0,05)
no seu tamanho, sendo que esta diferença se deu aos 30 dias para as suspensões armazenadas
em 25 ºC ± 2 ºC e aos 90 dias para as suspensões armazenadas em 3 ºC ± 2 ºC. O IPD para as
NCBC não apresentou diferença significativa (p>0,05) ao longo do estudo, em ambas as
temperaturas. A Figura 8 apresenta a evolução do tamanho de partícula das NCPA,
comparadas com as NCBC, durante os 90 dias de experimento.
500
450
d (nm)
400
350
300
250
0.0
6
2.0x10
6
4.0x10
6
6.0x10
6
8.0x10
t (s)
Figura 8 – Variação do diâmetro médio (nm) x tempo das NCPA (●) e das NCBC (■)
A proposta para explicar o aumento no tamanho das partículas das NCPA, baseada em
um transporte de massa por difusão através do filme polimérico, é original. O transporte de
ativos através do filme polimérico de nanocápsulas menores para as maiores é conhecido
como Ostwald ripening. Este efeito é comprovado, pois há um deslocamento na distribuição
de tamanho de partículas para maiores valores, decrescendo a população das nanocápsulas de
menor tamanho. Entretanto esse modelo tem sido utilizado com êxito para nanoemulsões. Em
emulsões a estabilidade é comprometida por processos de coalescência e, anterior a este
processo, tem sido observado o aumento das gotículas através deste mecanismo (TAYLOR,
1995, TAYLOR, 1998, CAPEK, 2004, TADROS et al., 2004). No caso das nanocápsulas
60
poliméricas tal mecanismo também pode ocorrer, onde as partículas de menor tamanho
transferem por difusão o ativo, no caso o PA, para as nanocápsulas de maior tamanho.
Os resultados indicam que há um tamanho crítico das NCPA, onde o potencial zeta
não tem importância na repulsão das nanopartículas. Esta condição promove a agregação das
NC enquanto que o aumento pelo transporte de massa por difusão através do filme polimérico
é atenuado.
4.3.5 Potencial zeta
O potencial zeta reflete o potencial de superfície das partículas, em razão da
dissociação de grupos funcionais na sua superfície ou da adsorção de espécies iônicas
presentes no meio aquoso de dispersão, o qual é influenciado pelas mudanças na interface
com o meio dispersante (GUTERRES, ALVES e POHLMANN, 2007; DINIZ et al., 2008).
Um valor de potencial zeta relativamente alto, em módulo, é importante para uma boa
estabilidade físico-química da suspensão, já que grandes forças repulsivas tendem a evitar a
agregação em função das colisões ocasionais de nanopartículas adjacentes. Quanto mais alto
for este potencial, maior a possibilidade de obter-se uma dispersão estável (SCHAFFAZICK
et al., 2003).
Os valores de potencial zeta obtidos para as nanocápsulas contendo palmitato de
ascorbila e para as nanocápsulas brancas estão descritos na Tabela 8.
Tabela 8 – Valores referentes ao potencial zeta (-mV) para as formulações de nanocápsulas
(NCPA) e nanocápsulas sem o ativo (NCBC), no período de 90 dias, em 25 ºC ± 2 ºC e 3 ºC ±
2 ºC
Formulações
NCPA
NCBC
Inicial
25 ºC ± 2 ºC
-47,03 ± 1,76 a
3 ºC ± 2 ºC
-47,03 ± 1,76 a
25 ºC ± 2 ºC
-26,77 ± 2,91
3 ºC ± 2 ºC
-26,77 ± 2,91
30 dias
-39,07 ± 0,64 b
-42,10 ± 1,27 abc
-31,13 ± 0,57
-31,00 ± 0,71
60 dias
-39,47 ± 1,52 bc
-42,40 ± 0,78 ab
-28,67 ± 1,20
-29,77 ± 1,41
90 dias
-37,70 ± 2,55 bc
-39,60 ± 1,85 bc
-29,27 ± 1,70
-31,50 ± 2,60
Valores referentes à média de três formulações ± desvio padrão (DP)
a-b-c-d: as médias com as letras diferentes dentro da mesma coluna apresentaram diferença significativa entre si
(p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
61
De acordo com os resultados expostos, a suspensão de NCPA obteve um potencial
zeta inicial de -47,03 mV (Figura 9), o qual foi significativamente maior (p<0,05) do que o
apresentado pelas NCBC. Entretanto, ambas as suspensões mantiveram elevado potencial zeta
durante os 90 dias de armazenamento, indicando baixa tendência de agregação e precipitação
das partículas, o que resultaria numa elevada probabilidade de manterem-se estáveis.
Schaffazick e colaboradores (2008), ao analisar nanocápsulas de Eudragit® S100
contendo melatonina, obtiveram um potencial zeta inicial de -33 mV. Jelvehgari e
colaboradores (2010) desenvolveram nanopartículas com quitosana de diferentes pesos
moleculares, utilizando Eudragit® L100-55, e encontraram valores de potencial zeta de -27,9
mV para as nanopartículas com quitosana de alto peso molecular e de -20,7 mV para as de
baixo peso molecular.
Figura 9 – Valor de potencial zeta (-mV) obtido inicialmente para a amostra de nanocápsulas
contendo PA (NCPA)
Depois de colocadas em 3 ºC ± 2 ºC e 25 ºC ± 2 ºC, foi observada uma diminuição
significativa (p<0,05) para os valores de potencial nas NCPA. Este fato pode ser explicado
pela maior presença de íons H+ oriundos do ativo (aumentando a acidez), pois segundo
Gouvêa e Murad (2001) a acidificação do meio promove uma diminuição dos valores de
potencial zeta, ou seja, as características ácido-básicas da superfície da partícula estão
intimamente relacionadas com o seu potencial. Outra hipótese seria a exposição de
grupamentos hidroxílicos, os quais resultam da ruptura das ligações éster presentes no ativo;
além dos grupamentos terminais carboxílicos do polímero estarem naturalmente expostos.
O potencial zeta de nanocápsulas depende, principalmente, da natureza química do
polímero, da natureza química do agente de estabilização e do pH do meio. Portanto, quando
nanocápsulas são preparadas a partir de polímeros de poliéster ou derivados de metacrilato,
como é o caso do Eudragit® L100, valores de potencial zeta negativo são obtidos devido à
62
presença de grupos terminal carboxílico (MORA-HUERTAS, FESSI e ELAISSARI, 2010).
Também a presença dos tensoativos monoestearato de sorbitano e polissorbato 80 faz com
que estes valores se mantenham negativos (SCHAFFAZICK et al., 2003). Este processo pode
ser evidenciado no presente estudo através dos resultados obtidos para as nanocápsulas sem
ativo, as quais apresentaram um potencial zeta inicial de -26,77 mV ± 2,91 (Figura 10).
Figura 10 – Valor de potencial zeta (-mV) obtido inicialmente para a amostra controle de
nanocápsulas sem ativo (NCBC)
Após 90 dias de armazenamento, não foi observado alteração significativa (p>0,05) do
potencial zeta para a NCBC em ambas as temperaturas. Este resultado pode ser justificado
pela presença do polímero, pois como já mencionado anteriormente, o mesmo apresenta
grupos terminais carboxílicos (MORA-HUERTAS, FESSI e ELAISSARI, 2010),
apresentando uma maior presença de íons negativos ao redor da partícula.
Zatta (2011), ao trabalhar com um polímero diferente do utilizado neste estudo (no
caso a PCL), também obteve valores negativos de potencial zeta tanto para as nanocápsulas
contendo PA (-33,2 mV) como para as nanocápsulas sem o ativo (-16,2 mV), sendo que, após
30 dias de estudo, os mesmos apresentaram um aumento significativo em seus valores, em
todas as temperaturas armazenadas (4 ºC, 22 ºC, 40 ºC) e UVC. Em outros estudos, onde
também foram avaliados o potencial zeta de formulações desenvolvidas com PCL, Paese e
colaboradores (2009) obteve -9,5 mV para nanocápsulas de benzofenona-3, Alves e
colaboradores (2005) encontraram valores em torno de -10 mV para nanocápsulas contendo
nimesulida e Bochi (2010) obteve -18,87 mV para nanocápsulas contendo meloxicam.
Segundo Diniz e colaboradores (2008), dispersões com valores de potencial zeta em
torno de 30 mV, positivo ou negativo, demonstram maior estabilidade devido à barreira de
alta energia entre as partículas. Sendo assim, estes resultados apresentam-se adequados para
manter o sistema estável, ou seja, os valores negativos encontrados possibilitam que as
63
partículas mantenham-se afastadas, evitando a formação de agregados e a precipitação das
nanoestruturas.
4.4 ESTUDOS DE ESTABILIDADE DAS BASES SEMISSÓLIDAS
Após a caracterização inicial das suspensões, estas foram incorporadas em
formulações semissólidas de gel de Carbopol®. Este veículo é uma forma cosmética muito
bem aceita pelo consumidor, apresenta um aspecto transparente, é de fácil aplicação, sendo
bem tolerado e facilmente removível da superfície da pele. Os géis hidrofílicos, geralmente,
têm um efeito emoliente e refrescante, são de secagem rápida e não deixam resíduos na pele
(OLIVEIRA, 2009).
A incorporação de nanopartículas em produtos cosméticos melhora a estabilidade e
promove a penetração de vários ativos como ácidos graxos insaturados, vitaminas e
antioxidantes; além de aumentar a eficácia e tolerância de filtros UV na superfície da pele, e
tornar o produto mais esteticamente agradável (MU e SPRANDO, 2010). Devido a isto,
alguns estudos de estabilidade em formulações contendo nanopartículas vêm sendo realizados
com o objetivo de desenvolver novos produtos com uma maior qualidade e segurança
(SCHAFFAZICK et al., 2002).
A estabilidade é um parâmetro necessário para garantir a qualidade do produto
cosmético ou farmacêutico, desde a sua fabricação até o término do seu prazo de validade.
Fatores relacionados à formulação, ao processo de fabricação, às condições ambientais, assim
como cada componente da formulação seja ativo ou não, podem influenciar na estabilidade do
produto (BRASIL, 2004).
Os estudos realizados para a determinação da estabilidade das formulações
semissólidas desenvolvidas no presente trabalho, após a incorporação do ativo no gel,
consistiram nas avaliações referentes à determinação do teor, pH, características
organolépticas, viscosidade e espalhabilidade das amostras armazenadas a 3 ºC ± 2 °C e a
25 ºC ± 2 ºC, durante 90 dias.
4.4.1 Teor de palmitato de ascorbila incorporado nas formulações semissólidas
Inicialmente, diferentes formulações semissólidas foram testadas com o objetivo de
avaliar a base mais estável para incorporação do PA. Para isso, foram preparados géis de
64
Natrosol® e de Carbopol®, onde a suspensão de NCPA foi incorporada. Nestas bases, para
fins comparativos, também foi incorporado o ativo na forma livre. Os géis foram armazenados
a 3 ºC ± 2 ºC e o teor de PA foi quantificado inicialmente e após 35 dias (Tabela 9).
Tabela 9 – Teor de palmitato de ascorbila (%) referente às amostras de gel de Natrosol® e
Carbopol®, contendo o ativo na forma nanoencapsulada e na forma livre, no período de 35
dias
Natrosol®
Carbopol®
Gel Nano
Gel Livre
Gel Nano
Gel Livre
Inicial
80,76 ± 1,35
71,89 ± 2,06
82,95 ± 1,16
73,48 ± 1,42
35 dias
42,15 ± 1,81
----
63,10 ± 1,58
45,26 ± 0,97
Valores referentes à média de três formulações ± desvio padrão (DP)
O teor inicial de PA no gel de Natrosol® contendo o ativo na forma nanoencapsulada
foi maior quando comparado ao gel que continha o ativo na forma livre. Nas determinações
seguintes, após 35 dias de refrigeração, observou-se uma diminuição nos níveis de PA para o
gel que continha o ativo na forma nanoencapsulada, enquanto que o gel contendo o ativo na
forma livre não pode ser quantificado. Já para o gel de Carbopol® obteve-se valores iniciais
maiores para o que continha o ativo na forma nanoencapsulada do que para o que continha o
ativo na forma livre. Após o 35º dia, a quantidade de ativo foi menor em ambos os géis,
entretanto, a formulação livre apresentou um teor muito menor do que a formulação
nanoencapsulada.
Avaliando, comparativamente, o teor de PA obtido nas diferentes bases semissólidas,
pode-se dizer que o gel de Carbopol® apresentou um teor maior de ativo para formulação
nanoencapsulada, tanto para as análises realizadas no período inicial do experimento como
após 35 dias; sendo que o gel de Natrosol® contendo o ativo na forma livre não pode ser
quantificado após 35 dias. Isto pode ser explicado pela diferença de polímero utilizado, já que
os carbômeros, como no caso do Carbopol®, são mais estáveis e menos suscetíveis à
degradação do que o gel de Natrosol® (QUEIROZ, 2008); além da instabilidade apresentada
pelo fármaco na forma livre.
Tendo em vista estes resultados, a formulação escolhida para incorporação do ativo,
tanto na forma nanoencapsulada como na forma livre, foi o gel de Carbopol®, já que este
apresentou uma maior estabilidade quando utilizado como veículo. A partir disto, foram
65
preparados géis contendo nanocápsulas de palmitato de ascorbila (GNCPA) e géis contendo
palmitato de ascorbila na forma livre (GPA), de acordo com a composição e método descritos
no item 3.2.
Na Tabela 10 estão descritos os resultados referentes ao teor das amostras contendo
PA na forma livre e na forma nanoencapsulada, quando incorporado em formulações
semissólidas, e mantidas sob o armazenamento em 25 ºC ± 2 ºC e 3 ºC ± 2 ºC por um período
de 90 dias.
Tabela 10 – Teor de palmitato de ascorbila (%) referente às amostras de gel contendo o ativo
na forma nanoencapsulada (GNCPA) e na forma livre (GPA), no período de 90 dias, em
25 ºC ± 2 ºC e 3 ºC ± 2 ºC
Formulações
GNCPA
GPA
Inicial
25 ºC ± 2 ºC
83,59 ± 3,18 a
3 ºC ± 2 ºC
83,59 ± 3,18 a
25 ºC ± 2 ºC
72,03 ± 3,37 a
3 ºC ± 2 ºC
72,03 ± 3,37 a
7 dias
51,76 ± 5,44 b
80,00 ± 7,08 ab
51,45 ± 5,44 b
64,07 ± 4,29 ab
15 dias
33,58 ± 6,03 c
76,42 ± 4,31 abc
32,77 ± 13,32 c
60,26 ± 5,32 abc
60 dias
26,92 ± 2,54 c
51,46 ± 7,99 d
---
32,14 ± 4,18 d
90 dias
---
51,26 ± 11,76 d
---
27,82 ± 6,64 d
Valores referentes à média de três formulações ± desvio padrão (DP)
a-b-c-d: as médias com as letras diferentes dentro da mesma coluna apresentaram diferença significativa entre si
(p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
--- Não foram detectados picos correspondentes ao PA.
De acordo com os resultados obtidos é possível observar que ambas as formulações
contendo PA apresentaram uma diminuição da concentração de fármaco, em todas as
temperaturas armazenadas durante o período de experimento, porém esta alteração do teor só
foi significativa (p<0,05) para os GNCPA e GPA mantidos em 3 ºC ± 2 ºC a partir de 60 dias
de estudo, enquanto que para os géis mantidos em 25 ºC ± 2 ºC esta diferença se deu já no 7º
dia de experimento.
O controle da instabilidade do PA é um desafio significativo no desenvolvimento de
formulações cosméticas. Tendo em vista os problemas nomeadamente já relacionados à
presença de luz, oxigênio e altas temperaturas, estudos realizados até o momento relatam a
instabilidade química deste ativo após a sua incorporação em sistemas coloidais. Spiclin e
colaboradores (2001) incorporaram PA, em diferentes concentrações, em microemulsões do
tipo água/óleo e do tipo óleo/água, as quais foram armazenadas a 22 ºC. Após 28 dias,
66
concentrações menores que 40 % de ativo foram recuperadas em todas as amostras,
concluindo que a instabilidade do PA foi resultado da sua degradação por oxidação, devido à
presença de oxigênio, íons metálicos e/ou luz.
A Figura 11 representa o teor de PA nanoencapsulado e na forma livre nas
formulações de géis armazenadas em 25 ºC ± 2 ºC e 3 ºC ± 2 ºC durante 90 dias.
Figura 11 – Teor de PA nas formulações semissólidas em diferentes temperaturas, durante 90 dias de
experimento
O GNCPA apresentou um teor inicial de 83,59 %. Para as amostras armazenadas em
TA houve uma perda de ativo de 38,08 % a partir dos 7 dias de análise, enquanto que para as
amostras armazenadas em 3 ºC ± 2 ºC essa diminuição ocorreu somente após 60 dias do início
do experimento. Já o GPA apresentou um teor inicial de 72,03 %. A partir do 7º dia de estudo,
esse teor decaiu em torno de 30 % para as amostras armazenadas em 25 ºC ± 2 ºC e 10 % para
as amostras armazenadas em 3 ºC ± 2 ºC; sendo que no 60º dia, em 25 ºC ± 2 ºC, não foi mais
possível detectar a presença do ativo. No 90º dia, devido ao intenso processo de degradação
do PA, ambas as formulações semissólidas armazenadas em 25 ºC ± 2 ºC apresentaram
concentrações inferiores à sensibilidade de detecção do método.
Zatta (2011) ao quantificar o teor de PA em amostras de creme-gel de Hostacerin
SAF® contendo o ativo nanoencapsulado (CGNCPA) e na forma livre (CGPA), em diferentes
valores de pH (3,0; 3,5; 4,5; 5,5 e 6,5), obteve teores iniciais entre 95 - 77 % para o CGNCPA
e entre 93 - 68 % para o CGPA. Entretanto, no 7º dia, não foi possível detectar a presença de
PA nas formulações contendo o ativo na forma livre, sob os valores de pH de 5,5 e 6,5; sendo
que no 15º dia ambas as formulações não puderam mais ser quantificadas.
67
De acordo com os resultados aqui expostos, e apesar do significativo decréscimo do
teor de ativo em ambas as formulações, nas diferentes temperaturas, obteve-se uma maior
quantificação para o GNCPA, indicando que as nanocápsulas mantiveram o teor do ativo por
um período de tempo maior, quando comparado com as mesmas formulações contendo o
ativo na forma livre, ou seja, as nanocápsulas exerceram uma ação protetora parcial frente ao
fármaco, permitindo manter maiores teores por um período de até 90 dias.
4.4.2 Determinação das características organolépticas
A determinação das características organolépticas tem se tornado um fator importante
no desenvolvimento de novas formulações, já que está relacionada aos parâmetros de
aceitação do produto pelo consumidor. Esta permite avaliar as alterações sofridas pelas
amostras em estudo por meio de análises comparativas, com objetivo de verificar a ocorrência
de alteração de cor, odor e modificações da aparência (BRASIL, 2004).
As formulações semissólidas contendo PA na forma nanoencapsulada e na forma livre
foram armazenadas e avaliadas durante 90 dias, em 25 ºC ± 2 ºC e 3 ºC ± 2 ºC. Os parâmetros
analisados através da observação visual, em relação à aparência, cor e odor, estão descritos na
Tabela 11.
Tabela 11 – Parâmetros referentes à aparência, cor e odor das formulações semissólidas
contendo palmitato de ascorbila na forma nanoencapsulada (GNCPA) e na forma livre (GPA),
armazenados em 25 ºC ± 2 ºC e 3 ºC ± 2 ºC por 90 dias
Formulações
25 ºC ± 2 ºC
3 ºC ± 2 ºC
Inicial
GNCPA
1
GPA
1
GNCPA
1
GPA
1
15 dias
1
2
1
2
30 dias
2
4
1
2
60 dias
2
5
2
3
90 dias
2
5
2
3
1. Condições normais, satisfatórias.
2. Ligeira mudança de algum aspecto relativo à aparência, cor e odor da amostra;
3. Incorporação de ar, início do desenvolvimento de coloração e/ou odor, principalmente em termos de
rancificação;
4. Início de notável coloração, produto com odor alterado;
5. Produto fortemente corado; produto com odor desagradável.
68
Inicialmente, todas as formulações apresentaram-se em condições normais e
satisfatórias, porém distintas entre si. As formulações contendo o ativo associado às
nanocápsulas (GNCPA) apresentaram coloração branca, enquanto que as formulações
contendo o ativo livre (GPA) apresentaram coloração levemente amarelada, ambas com
aspecto homogêneo e brilhante (Figura 12).
Figura 12 – Aspecto inicial das formulações semissólidas contendo palmitato de ascorbila na forma
livre (A) e na forma nanoencapsulada (B)
Como pode ser observado na Figura 13, após os 90 dias de análise, os géis
armazenados em 25 ºC ± 2 ºC apresentaram algumas alterações em relação aos parâmetros
analisados (aparência, cor e odor), principalmente o GPA, o qual demonstrou total
desestabilização. Entretanto, o GNCPA apresentou uma leve mudança em sua coloração e um
odor levemente ácido, mantendo sua aparência praticamente inalterada. A desestabilização
dos géis armazenados em 25 ºC ± 2 ºC está relacionada a fatores externos como a presença de
altas temperaturas e de oxigênio, fazendo com que o ativo se degrade mais facilmente em
compostos ácidos. Esta reação de oxidação pode ser facilmente evidenciada em relação à
coloração, pois a geração dos seus produtos de degradação confere a coloração caramelo à
formulação (KRAMBECK, 2009).
Figura 13 - Aspecto das formulações semissólidas contendo palmitato de ascorbila livre (A) e
nanoencapsulado (B) armazenados em 25 ºC ± 2 ºC, após 90 dias de experimento
No estudo realizado por Zatta (2011), onde tanto o ativo na forma nanoencapsulada
como na forma livre foi incorporado em base aniônica de Hostacerin SAF®, ambas as
amostras apresentaram-se completamente em estado líquido após o 21º dia de análise;
69
entretanto, o creme gel contendo NCPA permaneceu com sua coloração praticamente
inalterada, enquanto que o creme gel contendo PA na forma livre apresentou coloração mais
escura.
Para as formulações armazenadas em 3 ºC ± 2 ºC, pode-se observar que o GPA
apresentou alterações visíveis em relação à cor e ao odor após 90 dias de experimento, e
apesar do uso de conservante na formulação, este gel começou a apresentar fungos a partir do
60º dia de análise; enquanto que o GNCPA apenas apresentou uma discreta mudança em sua
coloração (Figura 14).
Figura 14 - Aspecto das formulações semissólidas contendo palmitato de ascorbila livre (A) e na
forma nanoencapsulada (B) armazenados em 3 ºC ± 2 ºC, após 90 dias de experimento
Apesar de ambas as formulações semissólidas serem feitas em gel de Carbopol®, uma
base hidrofílica, o GNCPA manteve suas características praticamente inalteradas ao final dos
90 dias de análise, em ambas as temperaturas. Desta forma, pode-se concluir que, para as
amostras mantidas em 3 ºC ± 2 ºC, as nanocápsulas estão promovendo uma proteção parcial
do fármaco, visto que a nanoencapsulação do ativo foi capaz de manter um melhor aspecto da
formulação semissólida durante um período maior de tempo.
Estudos desenvolvidos anteriormente por Ferrony (2009), utilizando sistemas
nanoparticulados, avaliou nanocápsulas contendo dexametasona incorporadas em creme gel.
O autor verificou um efeito protetor das mesmas, quando comparadas com a forma livre do
fármaco, onde as características organolépticas das formulações foram mantidas por um
período de tempo maior. Bruschi (2010) incorporou suspensões contendo nanocápsulas de
adapaleno em base semissólida de Carbopol® e pode observar que, após 90 dias as amostras
não sofreram alteração. Bochi (2010) trabalhou com nanocápsulas de meloxicam incorporadas
em formulações semissólidas, e também observou que as características organolépticas,
mantiveram-se por um período maior de tempo quando comparadas com formulações
semissólidas contendo o meloxicam na forma livre.
70
4.4.3 Determinação do pH
A determinação do pH de uma preparação para aplicação cutânea constitui um
parâmetro extremamente importante, uma vez que cada produto deve apresentar pH
compatível com a região do corpo onde se aplica. Sua medida é necessária para detectar
alterações de pH com o tempo, assegurando que o valor de pH esteja compatível com os
componentes da formulação e com o local de aplicação, evitando, dessa forma, significativas
irritações (OLIVEIRA, 2009).
A pele humana apresenta um pH levemente ácido, em torno de 5,5, o qual atua na
proteção contra bactérias e fungos. Dessa forma, as formulações de uso tópico devem
obedecer a uma faixa específica de pH, entre 3 e 10, pois do contrário podem provocar
alterações no pH da pele, permitindo a exposição desta a agentes sensibilizantes
(LEONARDI, GASPAR e MAIA CAMPOS, 2002).
A Tabela 12 apresenta os resultados de pH referentes às formulações de géis contendo
palmitato de ascorbila na forma nanoencapsulada e na forma livre.
Tabela 12 – Valores de pH para as amostras de gel contendo o ativo na forma
nanoencapsulada (GNCPA) e na forma livre (GPA), no período de 90 dias, em 25 ºC ± 2 ºC e
3 ºC ± 2 ºC
Formulações
GNCPA
GPA
Inicial
25 ºC ± 2 ºC
5,19 ± 0,11 a
3 ºC ± 2 ºC
5,19 ± 0,11
25 ºC ± 2 ºC
5,33 ± 0,02 a
3 ºC ± 2 ºC
5,33 ± 0,02 a
15 dias
5,14 ± 0,17 a
5,17 ± 0,17
5,19 ± 0,16 ab
5,24 ± 0,15 a
30 dias
5,08 ± 0,15 a
5,12 ± 0,18
4,85 ± 0,22 bc
5,16 ± 0,17 a
60 dias
4,97 ± 0,15 a
5,09 ± 0,18
4,54 ± 0,19 cd
5,07 ± 0,18 a
90 dias
4,88 ± 0,10 b
5,04 ± 0,20
4,27 ± 0,12 d
4,96 ± 0,14 b
Valores referentes à média de três formulações ± desvio padrão (DP)
a-b-c-d: as médias com as letras diferentes dentro da mesma coluna apresentaram diferença significativa entre si
(p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
No presente estudo, os valores de pH para os GPA e GNCPA não apresentaram
diferença significativa (p>0,05) entre si, quando comparados inicialmente. De acordo com a
Tabela 12, verifica-se que os valores de pH para ambas as formulações, armazenadas em
25 ºC ± 2 ºC, apresentaram uma diminuição significativa (p<0,05) entre os resultados iniciais
e ao término dos 90 dias de experimento, sendo que para o GPA esta diferença se deu a partir
71
dos 30 dias. Entretanto, para as amostras armazenadas em 3 ºC ± 2 ºC, os valores de pH
obtidos para o GNCPA não apresentaram mudanças significativas (p>0,05), enquanto que o
GPA apresentou diferença significativa (p<0,05) entre os resultados iniciais e ao final dos 90
dias. Acredita-se que a diminuição mais acentuada do pH no GPA, em 25 ºC ± 2 ºC, esteja
relacionada com a degradação sofrida pelo ativo, onde produtos ácidos seriam gerados
fazendo com que houvesse uma diminuição no pH das formulações (ZATTA, 2011).
Estes resultados estão de acordo com o que foi observado em relação às características
organolépticas para ambos os géis, principalmente para o GPA armazenado em 25 ºC ± 2 ºC,
o qual apresentou alterações significativas em relação à aparência, cor e odor após os 90 dias
de análise. Já o GNCPA apresentou uma leve mudança em sua coloração e um odor
levemente ácido, mantendo sua aparência praticamente inalterada. Desta forma, foi possível
observar que a associação do ativo às nanocápsulas foi capaz de manter um melhor aspecto da
formulação semissólida durante um período maior de tempo.
Assim como neste estudo, uma redução nos valores de pH também foi observado por
Zatta (2011) para este tipo de sistema, onde o palmitato de ascorbila na forma
nanoencapsulada e na forma livre foi incorporado em base de Hostacerin SAF®. Inicialmente,
esta formulação apresentou um pH próximo a 5,0, sendo que após 21 dias, obteve-se valores
finais de pH entre 2,5 e 3,0. Uma das possíveis causas relatadas pelo autor, seria o baixo valor
de pH do meio, o que promove a hidrólise da base de Hostacerin SAF® e do filme polimérico
nas nanocápsulas. Esta redução nos valores iniciais de pH foi igualmente verificada por
Ferrony (2009) em um experimento realizado com nanocápsulas contendo dexametasona
incorporada em um creme gel. Após 150 dias de experimento obteve-se um pH final de 6,1,
sendo que inicialmente esta formulação apresentou um pH em torno de 7,7.
Com relação ao presente estudo, considera-se que esta análise foi fundamental para
confirmar os resultados de teor do ativo das amostras armazenadas em 25 ºC ± 2 ºC, onde no
GNCPA, aos 90 dias, e no GPA, a partir dos 60 dias, o PA não pode mais ser quantificado.
Sendo assim, apesar da diferença de pH encontrada neste estudo, os mesmos encontram-se na
faixa adequada utilizada para formulações semissólidas de uso tópico.
72
4.4.4 Avaliação da viscosidade
O comportamento reológico e a viscosimetria têm sido estudados com o objetivo de
analisar e caracterizar a estabilidade físico-química de formulações frente aos efeitos causados
pela temperatura, pelo tempo ou até mesmo pela incorporação de ativos e de carreadores de
substâncias, como no caso de sistemas nanoestruturados (ALVES et al., 2007).
A reologia compreende o ramo da Física que estuda as condições de fluidez e de
deformação da matéria, as quais pretendem investigar as propriedades e o comportamento
mecânico de corpos que sofrem uma deformação (sólidos elásticos) ou um escoamento
(fluido), devido à ação de uma tensão de corte (OLIVEIRA, 2009). Uma compreensão
adequada das propriedades reológicas de materiais farmacêuticos é essencial à preparação, ao
desenvolvimento, à avaliação e ao desempenho das formas farmacêuticas (LACHMAN,
LIEBERMAN e KANIG, 2001; ROSSI, 2006).
Os valores referentes à viscosidade, índice de plasticidade (n) e coeficiente de
consistência (k) das formulações semissólidas contendo PA na forma nanoencapsulada e na
forma livre foram avaliados. Os parâmetros k e n podem ser usados para a caracterização de
formulações. A constante k está relacionada com a própria viscosidade do produto (KIM et
al., 2003), enquanto que o coeficiente n indica o grau de pseudoplastia do material, estando
relacionado com o comportamento da curva (ALMEIDA e BAHIA, 2003). Conforme pode
ser observado na Tabela 13, em relação ao índice de plasticidade e ao coeficiente de
consistência, não houve uma alteração significativa (p>0,05) em ambas as formulações
semissólidas contendo PA em função dos 90 dias de análise.
Tabela 13 – Valores referentes à viscosidade (Pa.s-1), índice de plasticidade (n) e coeficiente
de consistência (k) das amostras de gel contendo o ativo na forma nanoencapsulada (GNCPA)
e na forma livre (GPA), no período de 90 dias
GNCPA
GPA
Tempo
(dias)
Viscosidade*
(Pa.s-1) ± DP
n
k
Viscosidade*
(Pa.s-1) ± DP
n
k
Inicial
11.440 ±
1082,9
0,3027
289934,5
14.320 ±
4571,7
0,2839
362743,8
90 dias
11.660 ±
2969,8
0,3544
226516,5
7.320 ±
678,8
0,2141
287806,1
Valores referentes à média de três formulações ± desvio padrão (DP)
* Leituras realizadas na velocidade de 100 rpm usando o spindle 07
73
De acordo com os resultados apresentados na Tabela 13, é possível observar que a
forma livre apresentou valores iniciais maiores de viscosidade quando comparado com a
forma nanoencapsulada. Estes resultados demonstram que, apesar desta diferença entre as
formulações, o GNCPA manteve seus valores de viscosidade sem apresentar diferença
significativa (p>0,05) durante os 90 dias de análise; sendo que para o GPA ocorreu uma
diminuição significativa (p<0,05) da viscosidade quando submetido ao mesmo período (90
dias). Isto pode ser explicado devido ao fato de que os géis derivados de carbômeros, como o
Carbopol®, ao serem neutralizados formam bases fortes, ou seja, muito ávidas por reagir com
ácidos. Quando ativos ácidos são adicionados a esses géis, sua viscosidade reduz, levando à
perda da estabilidade das formulações (GONÇALVES e OLIVEIRA, 2007). Estes dados
também estão de acordo com os resultados obtidos em relação às características
organolépticas, onde o GPA apresentou alterações significativas com relação à aparência. Isto
mostra, mais uma vez, que as nanocápsulas estão promovendo uma proteção parcial do ativo
frente a este tipo de base semissólida, onde, partindo do pressuposto de que o ativo não se liga
ao polímero do gel (AULTON, 2005), o mesmo ficaria mais exposto a fatores externos,
fazendo com que o ativo se degrade mais facilmente; diferentemente do ativo
nanoencapsulado, o qual está protegido pela nanocápsula.
No estudo feito por Zatta (2011), formulações de creme-gel em base de Hostacerin
SAF®, contendo nanocápsulas de palmitato de ascorbila (CGNCPA) e contendo
nanoemulsões (CGNEPA) foram testadas. As formulações apresentaram uma viscosidade
máxima inicial de 3.526,667 Pa.s-1 para o CGNCPA e 3.336,667 Pa.s-1 para CGNEPA. O
ensaio revelou não haver diferença significativa (p>0,05) entre os valores de viscosidade de
tais formulações e em relação à formulação branca, que também foi testada. Entretanto,
devido a total desestabilização das formulações contendo o ativo, após 21 dias de estudo não
foi possível realizar a avaliação final. Ao comparar os valores de viscosidade encontrados por
Zatta (2011) com o presente estudo, pode-se observar que as formulações de Carbopol®
contendo PA apresentaram uma viscosidade maior do que as formulações de Hostacerin
SAF® contendo este mesmo ativo. A maior viscosidade apresentada pela base de Carbopol®
torna-se favorável à formulação, pois como já mencionado anteriormente, a adição de ativos
ácidos a essas bases, fazem com que as mesmas percam sua viscosidade, o que leva a uma
perda mais rápida da sua estabilidade (GONÇALVES e OLIVEIRA, 2007).
74
A Figura 15 representa o comportamento reológico obtido inicialmente pelo GNCPA e
pelo GPA. Para ambas as formulações a viscosidade máxima foi obtida em 100 rpm
apresentando valores de 11.440 Pa.s-1 para o GNCPA e 14.320 Pa.s-1 para GPA.
Figura 15 – Análise inicial das curvas ascendentes dos reogramas das formulações de GNCPA e GPA
Nenhuma outra forma farmacêutica reflete tão intensamente os efeitos da importância
da consistência como as preparações para aplicação cutânea. A consistência destas formas
afeta diretamente a facilidade com que a preparação se espalha e com que adere à zona de
aplicação, estando intimamente relacionada com as suas propriedades cosméticas; ou seja,
quanto maior a viscosidade, maior a resistência e menor a velocidade com que o fluido se
movimenta (ALMEIDA e BAHIA, 2003; ROSSI, 2006; OLIVEIRA, 2009), o que leva a uma
maior adesão à pele (AULTON, 2005).
O tipo de polímero empregado na preparação do gel e o tipo de nanoestrutura
incorporada podem influenciar o comportamento reológico da formulação e, assim,
influenciar na estabilidade física do produto (CORRÊA et al., 2005; ROSSI, 2006;
QUEIROZ, 2008; ALVES, RAFFIN e FAGAN, 2011). Através da análise das características
reológicas das formulações semissólidas contendo PA nanoencapsulado e na forma livre
(Figura 16), pode-se verificar que ambas as formulações apresentaram fluxo não-newtoniano
e comportamento pseudoplástico (n<1), indicando que a adição das nanopartículas não
modificou o comportamento reológico da formulação.
Este tipo de comportamento é desejado em formulações dermocosméticas, pois com a
força aplicada sua resistência inicial diminui, refletindo em uma maior facilidade de aplicação
(CORRÊA et al., 2005; GONÇALVES e MAIA CAMPOS, 2009b). De acordo com estudos
já realizados, várias formulações farmacêuticas e cosméticas, principalmente géis, emulsões e
suspensões constituídas com partículas de diâmetro inferior a 1 μm apresentam este
75
comportamento (ALVES, POHLMANN e GUTERRES 2005; BRUSCHI, 2010; FARIAS,
2011; ZATTA, 2011).
Figura 16 – Reograma para as formulações semissólidas de GNCPA e GPA, referentes aos valores
iniciais e finais
No comportamento pseudoplástico, quando a taxa de cisalhamento é aumentada, há
uma ruptura progressiva da estrutura do meio. Nas dispersões poliméricas e na maioria dos
sistemas semissólidos, o comportamento pseudoplástico surge em consequência da existência
de interações intermoleculares entre as cadeias poliméricas (LACHMAN, LIEBERMAN e
KANIG, 2001), sendo que, estes materiais têm sua viscosidade diminuída gradualmente à
medida que sua tensão de cisalhamento aumenta (CORRÊA et al., 2005; ROSSI, 2006;
GONÇALVES e MAIA CAMPOS, 2009b).
O tipo de influência que os sistemas nanoestruturados exercem nas formulações
semissólidas tem sido avaliado por diversos autores. Bruschi (2010) ao incorporar
nanocápsulas de adapaleno em gel de Carbopol®, avaliou as características reológicas da
formulação contendo o fármaco na forma nanoestruturada ou na forma livre e observou que
ambas apresentaram um comportamento não newtoniano com fluxo pseudoplástico. Este
comportamento ainda foi observado por Alves e colaboradores (2007) ao estudar o
comportamento reológico de hidrogéis contendo nanocápsulas, nanoesferas ou nanoemulsões
de nimesulida e observaram que todas as formulações estudadas, contendo nanocarreador ou
não, apresentaram comportamento não newtoniano pseudoplástico.
Dada a complexidade de materiais nanoestruturados e do uso recente destes sistemas
em produtos tópicos, a realização da análise reológica é essencial para que se possa
compreender as possíveis interações entre estas nanoestruturas e seus veículos (ALVES,
RAFFIN e FAGAN, 2011). Os valores de viscosidade encontrados no presente estudo podem
76
ser comparados com o comportamento reológico apresentado por diferentes formulações
semissólidas contendo nanocápsulas, quando incorporadas em gel de Carbopol® (PAESE et
al., 2009; BOCHI, 2010; BRUSCHI, 2010), onde foi possível observar que as formulações
contendo estes sistemas não sofreram alteração significativa de viscosidade ao final do tempo
de análise. Isso demonstra que as nanocápsulas não modificam as características originais da
formulação e, além disso, mantém as propriedades ativas do fármaco por um tempo maior.
4.4.5 Determinação da espalhabilidade
O estudo e a determinação das características reológicas são de grande importância
tanto para a indústria farmacêutica como cosmética, visto que a espalhabilidade dos produtos
devem ser reproduzidos a cada lote, garantindo assim, a qualidade tecnológica do produto
acabado (CORRÊA et al., 2005).
A espalhabilidade é definida como a expansão de uma formulação semissólida sobre
uma superfície após um determinado período de tempo. É uma das características essenciais
de formulações semissólidas para uso tópico, pois está intimamente relacionada com sua
aplicação no local de absorção e ação desejada (ZANIN et al., 2001).
Os valores de espalhabilidade para as formulações contendo PA na forma
nanoencapsulada e na forma livre encontram-se descritos na Tabela 14.
Tabela 14 – Valores referentes à espalhabilidade (mm2) das amostras de gel contendo o ativo
na forma nanoencapsulada (GNCPA) e na forma livre (GPA), no período de 90 dias
Formulações
Inicial
GNCPA
10.170,0 ± 209,2
GPA
8.030,0 ± 221,6
90 dias
9.870,0 ± 157,8
6.540,0 ± 234,1
Valores referentes à média de três formulações ± desvio padrão (DP)
De acordo com a Tabela 14, pode-se observar que o GNCPA manteve seus valores de
espalhabilidade, não apresentando diferença significativa (p>0,05) durante os 90 dias de
análise, quando comparado com os valores iniciais; enquanto que para o GPA ocorreu uma
pequena diminuição (p>0,05) da espalhabilidade após os 90 dias.
Zatta (2011) ao analisar a espalhabilidade dos creme-géis de Hostacerin SAF®
contendo PA na forma nanoencapsulada (CGNCPA), na forma nanoemulsionada (CGNEPA)
e na forma livre (CGPA), observou valores iniciais de 4.360,675 mm² para o CGNCPA,
77
5.287,89 mm² para o CGNEPA e 5.145,573 mm² para o CGPA; não havendo diferença
significativa entre eles. Comparando-se os valores de espalhabilidade encontrados por Zatta
(2011) com o presente estudo, pode-se observar que as formulações de Carbopol® contendo
PA nanoestruturado apresentou maior espalhabilidade que as formulações de Hostacerin
SAF® contendo este ativo, entretanto, ambas as formulações apresentaram valores de
espalhabilidade adequados. Desta forma, pode-se considerar que esta divergência,
provavelmente deva-se às diferenças entre os dois veículos utilizados.
Os valores de espalhabilidade obtidos inicialmente para as formulações de GNCPA e
GPA em função do peso adicionado estão representados na Figura 17.
Figura 17 – Espalhabilidade inicial das formulações de GNCPA e GPA em função do peso
adicionado
Quando desenvolve-se uma formulação para uso tópico, espera-se que a mesma tenha
uma boa espalhabilidade, apresentando boa aceitação pelo consumidor em relação à aparência
e sensação pelo contato inicial com a pele. Como já mencionado anteriormente, os géis com
caráter hidrofílico, como é o caso do Carbopol®, têm sido bastante utilizados como bases
dermatológicas, pois além de não serem gordurosos, apresentam fácil espalhabilidade e
podem veicular diferentes princípios ativos, além de carreadores de fármacos como
lipossomas e nanopartículas (CORRÊA et al., 2005; QUEIROZ, 2008). Somado a isso, o
caráter altamente lipofílico do PA confere potencialidade para uma eficiente permeação deste
ativo entre as camadas da pele (KRISTL et al., 2003; JURKOVIC et al., 2006).
Para ambas as formulações a espalhabilidade inicial obtida foi adequada, considerando
o efeito e o local de aplicação requerido, apresentando valores de 10.170 mm2 para o GNCPA
e 8.030 mm2 para GPA. Através destes valores, pode-se verificar que a incorporação da
78
suspensão de nanocápsulas conferiu um aumento da espalhabilidade das formulações,
comparando com o gel contendo o PA livre.
Em um estudo realizado por Bochi (2010), onde foi analisada a espalhabilidade dos
géis de Carbopol® contendo meloxicam na forma nanoencapsulada (GHNCM) e na forma
livre (GHM), foi possível observar valores iniciais de 3.004 mm2 para o GHNCM e 3.901
mm2 para o GHM, não havendo alterações significativas (p>0,05) no decorrer de 180 dias de
análise para o GHNCM, ao contrário do GHM que apresentou um aumento significativo
(p<0,05) ao término dos 180 dias de experimento. Ferrony (2009) ao analisar a
espalhabilidade de um creme-gel contendo dexametasona na forma nanoencapsulada
(CGNCDEXA) e na forma livre (CGDEXA) obteve valores iniciais de 6.184 mm2 para o
CGNCDEXA e de 4.364 mm2 para o CGDEXA. Após 150 dias, pode-se observar que o
CGNCDEXA manteve os seus valores inalterados, enquanto o CGDEXA apresentou um
aumento significativo (p<0,05) na espalhabilidade. Com isso, pode-se observar que a
incorporação das nanocápsulas nas bases semissólidas contribuiu para a manutenção das
características reológicas das formulações, apresentando maior estabilidade quando
comparado ao gel contendo os ativos na forma livre.
De acordo com os resultados encontrados no presente experimento, pode-se observar
que o gel de Carbopol® representou ser um veículo adequado para a incorporação de
suspensões contendo NCPA, visto que as características reológicas das formulações estudadas
foram mantidas durante todo o período de análise.
4.5 BIOMETRIA CUTÂNEA
De acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária, quando a um produto é
atribuído um beneficio específico, é necessária a comprovação de sua eficácia. A avaliação
dos efeitos imediatos de produtos cosméticos é de grande importância, uma vez que permite
verificar a ação destes produtos na pele logo após a sua aplicação, como por exemplo,
alteração na umectação cutânea ou na função barreira da pele (CAMARGO Jr., 2006).
A dermocosmética atual requer, para o desenvolvimento de uma formulação, a
utilização de métodos que comprovem a eficácia e a segurança de uso do produto
desenvolvido. A biometria cutânea tem se tornado uma importante área, capaz de gerar
79
ferramentas cada vez mais utilizadas na determinação científica de diversos parâmetros
(DECCACHE, 2006).
No presente trabalho a verificação in vivo dos parâmetros fisiológicos decorrentes da
aplicação da formulação, através dos testes de biometria cutânea, foi realizada com o gel
contendo NCPA (GNCPA) e com o gel contendo PA na forma livre (GPA). Para a realização
destes testes os seguintes parâmetros foram avaliados: conteúdo aquoso do estrato córneo, pH,
perda transepidérmica de água, melanina e presença de eritema; sendo calculada a média dos
valores obtidos.
A região dos antebraços dos voluntários foi a região corporal escolhida para a
realização do referido estudo, pois a mesma vem sendo empregada para a avaliação de
eficácia de produtos dermocosméticos. Esta região pode apresentar uma série de vantagens,
como o comprometimento dos voluntários ao estudo, devido a facilidade de aplicação e
avaliação. Considera-se ainda que nessa região ocorra menor interferência das condições
ambientais e do estilo de vida (CAMARGO Jr., 2006; ESPOSITO et al., 2007; ALEKSEEV,
SZABO e ZISKIN, 2008; CHENG et al., 2008).
Os resultados obtidos na avaliação dos efeitos das formulações aplicadas topicamente
foram submetidos à análise estatística, com objetivo de verificar se as alterações observadas
apresentavam diferença estatisticamente significativa. Os testes que melhor se adaptaram ao
modelo experimental foram a Análise de Variância (ANOVA), e para a comparação entre
variáveis, o teste de Tukey.
4.5.1 Estudos de biometria cutânea
Cabe ressaltar que a avaliação através dos ensaios de biometria cutânea tem sido
bastante utilizada para realização de estudos sobre a atividade de diferentes ativos na pele,
mas existem poucos trabalhos realizados com ativos em sistemas nanoparticulados. Desta
forma, torna-se de grande relevância a realização deste experimento, em função de que até o
presente momento, nenhum trabalho tem sido realizado com o PA nanoencapsulado para
determinação dos parâmetros analisados.
80
4.5.1.1 Determinação do conteúdo aquoso do estrato córneo (grau de hidratação cutânea)
A hidratação representa o elemento mais importante para preservar a condição física e
a aparência da pele (DECCACHE, 2006). O equilíbrio do conteúdo aquoso no estrato córneo
é imprescindível para a manutenção da eudermia, ou seja, das condições de normalidade da
pele, que é um dos principais objetivos das formulações cosméticas (GONÇALVES e MAIA
CAMPOS, 2009a).
O Corneometer® (Courage-Khazaka Electronic, Alemanha) é um instrumento utilizado
para medir a quantidade de umidade presente na camada exterior da pele e a capacidade da
pele em reter a umidade. Na prática, a técnica é usada para medir a diferença de hidratação do
estrato córneo antes e depois da aplicação de um produto cosmético (ESPOSITO et al., 2007).
Assim, considera-se que este parâmetro é um dos mais importantes na avaliação da função
barreira, além da chamada perda transepidérmica de água (GONÇALVES e MAIA
CAMPOS, 2009a). Os resultados obtidos para a determinação do conteúdo aquoso do estrato
córneo no antebraço dos voluntários são expressos em unidades arbitrárias (U.A.) e estão
demonstrados na Tabela 15 e Figura 18.
Tabela 15 – Determinação do conteúdo aquoso do estrato córneo realizado por biometria
cutânea utilizando gel contendo PA na forma nanoencapsulada (GNCPA) e na forma livre
(GPA)
Tempo
(dias)
Formulações
GNCPA
Inicial
7
14
21
28
35
42
49
56
63
70
77
84
90
Média (U.A.) ± DP*
34,87 ± 3,73 a
35,25 ± 5,94 ab
38,43 ± 5,97 abc
36,46 ± 5,99 abc
36,77 ± 4,42 abc
37,73 ± 5,54 abc
38,45 ± 5,21 bc
41,07 ± 4,87 d
42,34 ± 4,65 d
39,14 ± 5,65 bcd
41,72 ± 5,21 d
40,90 ± 4,32 d
43,12 ± 4,73 d
42,34 ± 5,05 d
GPA
DPR (%)
10,68
16,84
16,85
12,27
16,57
15,56
17,65
15,76
13,59
15,27
12,78
14,33
13,74
15,38
Média (U.A.) ± DP*
35,55 ± 3,08 a
35,96 ± 5,80 ab
37,89 ± 5,23 ab
36,24 ± 6,36 ab
35,65 ± 4,68 ab
35,76 ± 5,06 ab
35,02 ± 4,95 ab
34,97 ± 4,39 ab
33,92 ± 5,01 ab
33,45 ± 4,77 ab
30,78 ± 5,12 b
32,11 ± 4,49 b
31,29 ± 6,01 b
27,01 ± 4,84 c
DPR (%)
8,67
16,13
11,26
18,40
14,42
11,01
13,12
18,56
10,22
13,24
11,18
14,39
12,22
15,01
* Valores referentes à média de vinte voluntários ± desvio padrão (DP)
a-b-c-d: as médias com as letras diferentes dentro da mesma coluna apresentaram diferença significativa entre si
(p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
81
Através da comparação dos resultados obtidos pode-se observar (Tabela 15) que os
valores basais apresentaram alterações significativas (p<0,05) ao final dos 90 dias de
aplicação para ambas as formulações, sendo que com o uso do GNCPA, houve um aumento
significativo (p<0,05) do conteúdo aquoso no decorrer do experimento, enquanto que, o GPA
apresentou uma diminuição estatisticamente significativa (p<0,05) ao final dos 90 dias.
Conforme pode ser observado na Figura 18, os valores basais do GPA apresentaram
uma diminuição no conteúdo aquoso após o 70º dia de aplicação do produto. Entretanto, no
caso do GNCPA estes valores aumentaram a partir do 42º dia, ou seja, ocorreu um aumento
do conteúdo aquoso do estrato córneo com o uso prolongado da formulação.
Figura 18 – Representação gráfica dos valores médios obtidos no período de 90 dias, no ensaio de
biometria cutânea, para o conteúdo aquoso presente no estrato córneo (n = 20)
Os produtos dermocosméticos podem melhorar, manter ou prejudicar a hidratação
cutânea; sendo que estes efeitos podem ser influenciados pelo tipo de veículo ou pelos
ingredientes ativos que são incorporados em uma formulação (FERREIRA, 2008). Sendo
assim, estudos utilizando diversas formulações têm sido direcionados no sentido de
restabelecer os teores normais de água na pele. Wissing e Müller (2003) avaliaram a
hidratação cutânea de um creme O/A convencional em comparação com o mesmo creme
contendo NLS, durante 28 dias. Os autores observaram que o creme contendo as
nanopartículas foi significativamente mais efetivo que o creme convencional, aumentando em
31 % o conteúdo aquoso do estrato córneo, enquanto a formulação sem a adição das
nanopartículas aumentou 24 %. Desta forma, os autores sugerem que as nanopartículas
aumentam o grau de hidratação cutânea reduzindo, consequentemente, a perda
transepidérmica de água.
82
Esposito e colaboradores (2007) analisaram formulações tópicas inovadoras para a
hidratação da pele. Os experimentos foram realizados no antebraço de dez voluntários de
ambos os sexos, nos tempos 0 (valor basal) e após 5, 15, 30, 60, 90 e 120 min da aplicação.
Neste experimento os autores utilizaram veículos sem a incorporação de princípio ativo, com
objetivo de avaliar o poder de hidratação dos mesmos. Os autores observaram um poder de
hidratação pronunciado para o gel contendo nanovesículas em relação aos géis contendo
outras formas nanoestruturadas (lipossoma e NLS). O efeito de hidratação cutânea foi
considerado três vezes e meia maior, após 5 minutos da aplicação, e uma vez e meia após 2 h.
Pelo contrário, no caso dos géis contendo lipossomas ou NLS, o efeito inicial de hidratação
foi menos pronunciado e teve rápido retorno aos valores basais.
O grau de hidratação do estrato córneo é um fator de extrema importância na
preservação das condições físicas da pele. O estrato córneo de uma pele saudável deve manter
seu conteúdo aquoso acima de 10 %. Valores inferiores ou uma hidratação excessiva elevam o
risco de lesão por agentes externos, podendo causar dermatite e outras doenças de pele
(ALEKSEEV, SZABO e ZISKIN, 2008; FERREIRA, 2008). No presente estudo, pode-se
observar que o GNCPA aumentou em 22 % a hidratação do estrato córneo, enquanto que o
GPA diminuiu 24 % esta hidratação.
De acordo com os resultados encontrados pode-se concluir que, a associação do PA às
nanocápsulas foi vantajosa, pois mesmo com o uso prolongado do produto, o GNCPA foi
capaz de manter as características fisiológicas da pele, contribuindo para o aumento da
hidratação cutânea.
4.5.1.2 Determinação do pH cutâneo
A manutenção do pH cutâneo está diretamente ligada ao equilíbrio do manto
hidrolipídico, da homeostase e de funções imunológicas da pele. A pele possui a capacidade
de regeneração do pH fisiológico em algumas situações, mas é desejável que uma formulação
apresente pH compatível com a região desejada (DECCACHE, 2006).
O valor de pH na superfície da pele pode ser considerado normal em uma faixa de 4,5
a 5,5; sendo determinado com um equipamento denominado pH-metro. Outros métodos já
conhecidos para a determinação do valor de pH, como os métodos colorimétricos e os de
avaliação da capacidade tamponante, são imprecisos ou perigosos para a saúde. As medidas
83
eletroquímicas com o Skin pH-meter® (Courage-Khazaka Electronic, Alemanha) não tem
efeitos colaterais sobre a pele humana (Manual Courage-Khazaka Electronic, Alemanha).
Os resultados referentes à determinação do pH no antebraço dos voluntários durante
90 dias estão demonstrados na Tabela 16 e Figura 19.
Tabela 16 – Determinação do pH realizado por biometria cutânea utilizando gel contendo PA
na forma nanoencapsulada (GNCPA) e na forma livre (GPA)
Tempo
Formulações
(dias)
GNCPA
GPA
Inicial
7
14
21
28
35
42
49
56
63
70
77
84
90
Média ± DP
4,93 ± 0,99
5,41 ± 0,59
5,82 ± 0,66
5,79 ± 0,74
5,56 ± 0,83
5,82 ± 0,75
5,57 ± 0,38
5,52 ± 0,47
5,61 ± 0,76
5,73 ± 0,51
5,68 ± 0,82
5,59 ± 0,69
5,63 ± 0,77
5,57 ± 0,94
DPR (%)
20,10
10,94
11,40
11,86
13,45
14,28
12,33
11,45
10,56
12,37
13,88
10,63
11,29
12,73
Média ± DP
5,10 ± 1,34
6,01 ± 0,84
5,89 ± 0,66
5,71 ± 0,64
5,73 ± 1,02
5,94 ± 0,39
5,61 ± 0,45
5,87 ± 0,90
5,74 ± 0,76
5,69 ± 0,65
5,80 ± 1,12
5,92 ± 1,17
5,75 ± 0,97
5,61 ± 0,84
DPR (%)
26,18
13,98
11,25
10,72
15,98
07,13
15,89
14,23
13,67
10,27
12,38
11,19
14,66
15,23
* Valores referentes à média de vinte voluntários ± desvio padrão (DP)
a-b-c-d: as médias com as letras diferentes dentro da mesma coluna apresentaram diferença significativa entre si
(p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
De acordo com os resultados obtidos, pode-se observar que em relação aos valores
basais houve um aumento de pH após 90 dias de aplicação, para ambos os produtos testados
(Figura 19). Entretanto, a comparação entre as médias não apresentou diferença significativa
(p>0,05) entre os valores iniciais e finais tanto para o GNCPA como para o GPA (Tabela 16),
sendo que estes valores mantiveram-se dentro de uma faixa considerada normal (4,5-5,5)
(PRUNIERAS, 1994).
84
Figura 19 – Representação gráfica dos valores médios obtidos no período de 90 dias, no ensaio de
biometria cutânea para os valores de pH (n = 20)
Em estudos que envolvem avaliação do pH cutâneo é comum que algumas variações
sejam observadas na realização destas análises, sem com isto significar algum
comprometimento da pele. Deccache (2006) ao analisar um gel creme contendo DMAE, na
face de 21 voluntários, nos tempos 0, 15 e 30 dias, não observou diferença significativa
(p>0,05) nos primeiros 15 dias de uso da formulação. Porém, ao comparar os valores iniciais
(3,37) com os finais (5,13), após 30 dias de experimento, foi possível observar claramente um
aumento médio nos valores nominais obtidos para a determinação do pH facial e a ocorrência
de diferença estatística significante entre este período de avaliação (p<0,01).
Já Leonardi e colaboradores (2002) ao avaliar o efeito do pH cutâneo em 40 mulheres,
com idade entre 30 e 45 anos, que fizeram uso de uma emulsão O/A acrescida ou não de
vitamina A, E ou ceramidas, não observaram alteração nos valores de pH. As medidas foram
efetuadas no antebraço das voluntárias nos tempos de 7 e 30 dias após auto-aplicação diária
(duas vezes ao dia) dos produtos envolvidos no estudo. Os autores puderam observar que a
presença das vitaminas A ou E, ou da ceramida não alterou de maneira significativa o pH da
pele, o que mostra que as formulações estudadas foram adequadas para o uso cosmético.
O pH ácido é fundamental para o desempenho das funções primárias de defesa do
invólucro cutâneo, nomeadamente bactericida e fungicida (FERREIRA, 2008). Um produto
dermocosmético aplicado sobre a pele não deve alterar o seu pH fisiológico. Alguns trabalhos
apontam a ligação entre o pH e algumas patogenias como dermatite de contato, dermatite
atópica, ictiose, acne vulgar e infecções por C. albicans. Fatores exógenos como o uso de
alguns medicamentos e cosméticos podem obviamente afetar o pH da pele (LEONARDI,
GASPAR e MAIA CAMPOS, 2002; DECCACHE, 2006). Em vista disso, vale ressaltar a
85
importância das formulações analisadas no presente experimento não causarem alterações no
pH cutâneo.
4.5.1.3 Determinação da perda transepidérmica de água (PTEA)
A integridade do estrato córneo é, provavelmente, o fator mais importante na
resistência da pele a substâncias irritantes e sensibilizantes, e pode ser facilmente monitorada
usando medidas da perda transepidérmica de água (GONÇALVES e MAIA CAMPOS,
2009a).
Existem diferentes abordagens para medir a perda transepidérmica de água, entre os
quais o dispositivo mais comumente usado é o aparelho denominado Tewameter ®, que
emprega um gradiente de pressão de vapor d'água medido de acordo com a Lei de Fick
(CHENG et al., 2008). Os resultados obtidos através da determinação da perda
transepidérmica de água no antebraço dos voluntários são expressos em g/h/m2 e estão
demonstrados na Tabela 17 e Figura 20.
Tabela 17 – Determinação da perda transepidérmica de água realizada por biometria cutânea
utilizando gel contendo PA na forma nanoencapsulada (GNCPA) e na forma livre (GPA)
Tempo
(dias)
Formulações
GNCPA
2
Inicial
7
14
21
28
35
49
56
63
70
77
84
90
Média (g/h/m ) ± DP*
3,28 ± 0,99
2,35 ± 0,69
3,80 ± 2,09
3,80 ± 1,35
2,98 ± 1,41
4,17 ± 2,08
3,86 ± 1,16
3,76 ± 1,63
4,67 ± 1,84
4,12 ± 2,05
3,94 ± 1,44
4,43 ± 1,05
4,57 ± 1,78
GPA
DPR (%)
30,20
29,11
55,03
35,57
47,35
49,88
29,91
43,36
39,44
40,77
43,87
38,94
40,12
Média (g/h/m2) ± DP*
4,42 ± 0,92 a
3,56 ± 0,83 ab
4,77 ± 1,84 ab
4,57 ± 2,33 ab
4,26 ± 1,56 ab
5,42 ± 2,69 ab
5,36 ± 1,58 ab
5,69 ± 3,00 ab
5,54 ± 3,26 ab
5,99 ± 2,37 ab
6,07 ± 2,13 b
6,21 ± 3,04 b
6,17 ± 2,29 b
DPR (%)
20,93
23,26
38,47
50,99
36,53
37,94
29,48
52,72
58,92
40,75
37,89
41,34
43,79
* Valores referentes à média de vinte voluntários ± desvio padrão (DP)
a-b-c-d: as médias com as letras diferentes dentro da mesma coluna apresentaram diferença significativa entre si
(p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
De acordo com os resultados apresentados, pode-se observar que houve um aumento
dos valores basais, para ambas as formulações, ao final dos 90 dias de aplicação (Figura 20).
Conforme os valores expressos na Tabela 17, apesar de ter ocorrido este aumento na PTEA,
86
para o GNCPA este não foi estatisticamente significativo (p>0,05) ao final do experimento,
sendo que 4 g/h/m2 é considerado um valor normal de PTEA para a região analisada.
Entretanto, para o GPA este aumento foi um pouco maior, sendo significativo (p<0,05), a
partir do 77º dia. Desta forma, pode-se dizer que as nanocápsulas apresentam uma tendência
para evitar a PTEA, e consequentemente, mantêm a integridade do estrato córneo.
Figura 20 – Representação gráfica dos valores médios obtidos no período de 90 dias, no ensaio de
biometria cutânea, para perda transepidérmica de água (n = 20)
Substâncias caracterizadas como hidratantes podem atuar por dois mecanismos
diferentes: o mecanismo passivo, onde há a prevenção da perda de água da pele, criando uma
barreira superficial sobre a mesma e o mecanismo ativo, onde há a retenção de água na pele
devido às características higroscópicas (CAMARGO Jr, 2006). Sendo assim, em paralelo aos
estudos de avaliação do conteúdo aquoso do estrato córneo, a determinação da PTEA é de
fundamental importância, pois permite avaliar os efeitos dos produtos à nível da barreira
cutânea, a qual é responsável pelo controle sobre a perda de líquidos por transpiração e
evaporação (FERREIRA, 2008).
Além do tipo de veículo utilizado, a concentração do ativo é outro fator que pode
influenciar nas características fisiológicas da pele. Dal’Belo e colaboradores (2006)
realizaram estudos com formulações contendo diferentes concentrações de extrato de Aloe
vera liofilizado (0,10 %, 0,25 % e 0,50 %). Os experimentos foram realizados no antebraço de
20 voluntários do sexo feminino, durante um período de duas semanas. Os autores
observaram que a PTEA basal não sofreu alteração quando comparada aos valores
encontrados, após uma e duas semanas de análise, para todas as concentrações, indicando que
a presença de Aloe vera nas formulações não alterou a função barreira da pele.
87
Cheng e colaboradores (2008) avaliaram uma formulação contendo glicerina, tocoferol
e pantenol. As análises foram realizadas nos antebraços de 30 voluntários do sexo feminino,
uma vez por semana, durante um período de três semanas. Os resultados demonstraram que a
formulação apresentou uma tendência a diminuir a PTEA após 1, 2 e 3 semanas de aplicação,
sendo que as diferenças encontradas não foram significativas estatisticamente.
Atualmente há poucos trabalhos utilizando análises biofísicas não invasivas para
avaliação de sistemas nanoparticulados, entretanto, Farias (2011) analisou a perda
transepidérmica de água em formulações de gel contendo adapaleno na forma
nanoencapsulada e na forma livre. Foram realizadas análises durante 63 dias, em 20
voluntários do sexo feminino. A formulação contendo o fármaco na forma livre apresentou
um aumento estatisticamente significativo (p<0,05) na PTEA após 35 dias de aplicação do
produto testado. Porém, ao analisar o gel contendo adapaleno nanoencapsulado, observa-se
uma redução estatisticamente significativa (p<0,05) na PTEA após 63 dias de experimento.
Desta forma foi sugerido que as nanopartículas reduziram a PTEA, um dos principais efeitos
adversos provocados pela administração tópica do adapaleno.
Conforme os resultados expostos anteriormente, pode-se concluir que, a associação do
PA às nanocápsulas contribuiu para a redução do ressecamento da pele, pois impediu o
aumento da PTEA causada pelo ativo na forma livre, o qual foi estatisticamente significativo.
4.5.1.4 Determinação do conteúdo de melanina
A melanina, pigmento responsável pela coloração da pele e dos cabelos, atua como um
verdadeiro filtro óptico, absorvendo as radiações e transformando-as em calor (decomposição
térmica), captando a energia e neutralizando os radicais livres originados pela radiação
(COELHO, 2005). O Mexameter® MX 18 especificamente mede o conteúdo de melanina e
hemoglobina na pele.
O presente experimento seguiu a classificação determinada por Fitzpatrick e
colaboradores (1974), os quais determinam seis fototipos cutâneos que variam de acordo com
a coloração da pele, de mais clara a mais escura. No presente estudo, 20 % dos voluntários
apresentaram fototipo IV (pele morena, cabelos castanhos escuros e olhos escuros), 53 %
apresentaram fototipo III (pele clara a morena clara, cabelos loiros ou castanhos claros e olhos
88
claros) e 27 % apresentaram os demais fototipos. Os resultados obtidos na determinação da
melanina no antebraço dos voluntários estão demonstrados na Tabela 18 e Figura 21.
Tabela 18 – Determinação do conteúdo de melanina realizado por biometria cutânea
utilizando gel contendo PA na forma nanoencapsulada (GNCPA) e na forma livre (GPA)
Tempo
Formulações
(dias)
GNCPA
GPA
Inicial
7
14
21
28
35
42
49
56
63
70
77
84
90
Média ± DP*
145,33 ± 39,48
145,91 ± 39,47
141,80 ± 40,37
139,71 ± 41,31
139,20 ± 42,40
132,83 ± 43,91
131,91 ± 39,79
127,74 ± 42,23
125,80 ± 42,35
123,87 ± 40,84
119,39 ± 40,39
119,12 ± 39,73
115,98 ± 39,62
112,73 ± 39,07
DPR (%)
27,16
27,05
30,97
30,35
29,00
30,18
30,16
33,06
33,66
30,74
31,92
29,05
29,86
30,77
Média ± DP*
144,72 ± 40,18
141,35 ± 38,70
135,74 ± 40,91
134,27 ± 39,06
132,90 ± 45,58
137,02 ± 44,75
135,88 ± 39,06
132,89 ± 44,12
125,21 ± 40,58
125,28 ± 43,33
124,37 ± 38,75
125,01 ± 41,07
125,39 ± 39,38
124,93 ± 40,21
DPR (%)
27,76
27,38
30,14
29,09
34,29
32,66
28,75
44,12
32,41
29,07
33,26
28,63
30,96
31,22
* Valores referentes à média de vinte voluntários ± desvio padrão (DP)
a-b-c-d: as médias com as letras diferentes dentro da mesma coluna apresentaram diferença significativa entre si
(p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
Através da comparação dos resultados obtidos pode-se observar uma diminuição do
conteúdo de melanina no decorrer do experimento para ambas as formulações. Conforme
pode ser observado na Tabela 18, tanto para o GNCPA como para o GPA esta diminuição não
foi estatisticamente significativa (p>0,05); entretanto, o GNCPA apresentou uma diminuição
mais pronunciada quando comparado com o GPA. Provavelmente esta diminuição esteja
associada à ação regulatória do palmitato sobre a atividade dos melanócitos, visto que uma de
suas principais propriedades é inibir a síntese de melanina, resultando no clareamento cutâneo
(KRAMBECK, 2009).
89
Figura 21 – Representação gráfica dos valores médios obtidos no período de 90 dias, no ensaio de
biometria cutânea, para melanina (n = 20)
A determinação da cor da pele é importante não só para definir o fototipo cutâneo, mas
também para avaliar os efeitos de produtos cosméticos, como os despigmentantes, protetores
solares e autobronzeadores. Hwang e colaboradores (2009) avaliaram o índice de melanina
em 40 voluntários com melasma através da aplicação de um serum contendo ácido Lascórbico 25 % associado a N-metil-2-pirrolidona e dimetil isossorbida (C’ensil). O serum foi
aplicado na face dos pacientes duas vezes ao dia, durante 16 semanas. Os resultados
demonstraram que houve uma diminuição estatisticamente significativa no índice de melanina
após 16 semanas de experimento quando comparado com os valores basais. Com isso os
autores puderam concluir que a formulação estudada foi efetiva para o tratamento do
melasma.
Silva (2009) analisou o índice de melanina em formulações de creme gel contendo
benzofenona-3 na forma nanoencapsulada e na forma livre. Foram avaliados 20 voluntários
do sexo feminino, durante 30 dias. Através da comparação dos resultados obtidos observou-se
uma diminuição do conteúdo de melanina no decorrer do experimento, entretanto,
estatisticamente estes resultados não apresentaram diferença significativa (p>0,05). A autora
concluiu que esta diminuição provavelmente estaria associada ao uso do filtro solar.
Ao analisar separadamente cada voluntário com fototipo diferente, foi possível
observar que aqueles com pele mais clara apresentaram uma diminuição mais rápida no
conteúdo de melanina, quando comparado com os voluntários de fototipo III e IV,
principalmente para o GNCPA.
Com base nos resultados obtidos no presente experimento evidenciou-se que o PA,
tanto na forma nanoencapsulada quanto na forma livre, reduziu o índice de melanina com o
90
uso prolongado do produto. Entretanto, mesmo esta diminuição não sendo estatisticamente
significativa (p>0,05), ela foi mais pronunciada para o GNCPA.
4.5.1.5 Determinação da presença de eritema
O crescente uso de cosméticos tem contribuído para um aumento alarmante na
incidência de dermatite desenvolvida por este tipo de produto. As reações cutâneas têm sido
observadas mais frequentemente na face, no antebraço e na axila, constituindo em torno de
10 %, o índice de incidência deste tipo de reação (MEHTA e REDDY, 2003).
O índice de eritema tem uma correlação direta com os processos de irritação da pele e
é frequentemente usado em testes para avaliação da segurança dos produtos. Para a realização
destas medidas fez-se uso do aparelho Mexameter® MX 18, o qual utiliza o principio óptico
para determinar a intensidade de eritema. Os resultados obtidos na determinação do eritema
no antebraço dos voluntários estão demonstrados na Tabela 19 e Figura 22.
Tabela 19 – Determinação da presença de eritema realizado por biometria cutânea utilizando
gel contendo PA na forma nanoencapsulada (GNCPA) e na forma livre (GPA)
Tempo
(dias)
Inicial
7
14
21
28
35
42
49
56
63
70
77
84
90
Formulações
GNCPA
Média ± DP*
225,88 ± 54,07
223,61 ± 50,26
223,23 ± 39,89
223,27 ± 43,96
222,83 ± 43,64
224,15 ± 44,34
223,19 ± 45,98
222,23 ± 47,89
221,49 ± 53,71
222,98 ± 49,19
223,32 ± 50,03
223,46 ± 48,72
223,54 ± 49,25
223,79 ± 49,33
GPA
DPR (%)
23,94
22,28
17,79
24,84
21,88
18,93
20,88
28,69
25,89
22,88
24,33
20,82
22,47
23,59
Média ± DP*
222,71 ± 49,57
222,00 ± 46,32
221,58 ± 43,95
222,95 ± 56,91
223,46 ± 57,15
223,98 ± 42,47
222,96 ± 40,74
223,64 ± 41,19
222,79 ± 50,66
223,41 ± 55,34
223,79 ± 42,33
223,21 ± 44,03
222,98 ± 43,19
222,57 ± 42,28
DPR (%)
22,26
20,87
20,02
25,30
25,35
18,80
17,80
32,03
24,38
25,93
21,38
24,76
19,89
20,93
* Valores referentes à média de vinte voluntários ± desvio padrão (DP)
a-b-c-d: as médias com as letras diferentes dentro da mesma coluna apresentaram diferença significativa entre si
(p<0,05) de acordo com o teste de Tukey.
De acordo com as avaliações realizadas pode-se observar que tanto para o GNCPA
como para o GPA não houve qualquer indício de irritação (Figura 22), uma vez que os valores
basais obtidos para os géis não apresentaram alteração significativa após 90 dias de uso das
91
formulações (Tabela 19), ou seja, não foram estatisticamente diferentes (p>0,05). Entretanto,
pode-se observar uma maior redução na formação de eritema para o GNCPA, o que vem a
corroborar com os dados de PTEA, os quais foram menores para esta formulação (não sendo
estatisticamente significativo), diminuindo assim a suscetibilidade à irritação cutânea.
Figura 22 – Representação gráfica dos valores médios obtidos no período de 90 dias, no ensaio de
biometria cutânea, para os valores de eritema (n = 20)
Este tipo de avaliação tem sido realizado para diversos produtos cosméticos. Gaspar e
Maia Campos (2007) realizaram estudos com formulações contendo vitamina A (0,6 %), C (2
%), E (2 %) e seus derivados (acetato, palmitato), suplementada com uma combinação de
filtro UV. Os experimentos foram feitos no dorso de camundongos sem pelo, onde o índice de
eritema foi medido. A formulação contendo vitaminas A, C e E e um filtro UV fotoinstável
(metoxicinamato de octila) não provocou qualquer irritação. A formulação contendo
vitaminas A, C e E e um filtro UV fotoestável (benzofenona-3) também não provocou
irritação, uma vez que os valores obtidos para estas formulações não foram estatisticamente
diferentes. No entanto a formulação que continha apenas vitaminas provocou uma irritação
com um aumento no índice de eritema, podendo-se concluir desta forma, que o filtro solar
poderá contribuir não só no sentido de evitar a formação de eritema decorrente da ação da
radiação, mas também diminuir o eritema provocado por outras substâncias em decorrência de
uma possível fotodegradação destes componentes.
Gomes (2007) avaliou o índice de eritema na pele de camundongos sem pelo,
comparando formulações semissólidas contendo ácido retinóico 0,025, 0,05 e 0,1 % com
formulações contendo palmitato de retila 0,025, 0,05 e 1 %. Após 5 dias de experimento,
apenas as formulações contendo 0,025 e 0,05 % de ácido retinóico e 1,0 % de palmitato de
retinila aumentaram, de maneira estatisticamente significativa, o índice de eritema da pele dos
camundongos sem pelo, quando comparados com a região que recebeu apenas a aplicação do
92
veículo. O autor pode concluir, analisando os resultados, que os grupos tratados com as
formulações contendo as duas menores concentrações de ácido retinóico ainda estavam em
processo de aumento da vascularização e os grupos tratados com a maior concentração deste
já estavam no final do processo e com a vascularização e, consequentemente, com o eritema
reduzidos.
Com base nos resultados encontrados no presente estudo, pode-se concluir que o
GNCPA foi capaz de reduzir o índice de eritema em uma concentração um pouco maior do
que o GPA. Desta forma, as formulações contendo o fármaco nanoencapsulado podem ser
indicadas para pacientes com pele sensível, visto que todos os resultados apresentados até o
momento (hidratação, pH, PTEA e melanina) favorecem a redução a suscetibilidade de uma
possível irritação cutânea, o que configura a segurança na utilização da formulação.
93
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A partir dos resultados encontrados no presente trabalho, é possível obter algumas
conclusões em relação ao estudo realizado:
 A associação entre o óleo de rosa mosqueta, como núcleo oleoso; o Eudragit L100®,
como filme polimérico e o Tinogard TT®, como antioxidante, presente na composição
das nanocápsulas, possibilitaram um teor inicial satisfatório do palmitato de ascorbila,
demonstrando ser um promissor sistema carreador para incorporação deste ativo.
 Em relação às formulações semissólidas, ambas apresentaram um significativo
decréscimo no teor de PA, entretanto, o GNCPA apresentou 61,32 % de ativo em
comparação com 38,62 % do GPA, para as amostras a 3 ºC, no final dos 90 dias de
análise. Desta forma, pode-se concluir que as nanocápsulas exercem proteção parcial
frente ao fármaco, além da base semissólida de gel de Carbopol® mostrar-se adequada
para este tipo de sistema.
 As características organolépticas referentes à aparência, cor e odor das formulações
nanoencapsulada e livre, sofreram alterações durante todo o experimento, em ambas as
temperaturas, principalmente o GPA que demonstrou total desestabilização quando
armazenado em 25 ºC ± 2 ºC.
 Os valores de viscosidade foram mantidos estáveis para o GNCPA durante todo o
período de análise, enquanto que para o GPA, houve um decréscimo estatisticamente
significativo no decorrer do estudo. Foi possível verificar, também, que ambas as
formulações apresentaram fluxo não-newtoniano e comportamento pseudoplástico,
indicando que a adição das nanocápsulas não modificou o comportamento reológico
da formulação.
 Quanto à espalhabilidade, o GNCPA manteve seus valores de espalhabilidade durante
os 90 dias de análise, quando comparado com os valores iniciais, o que não foi
observado para o GPA que apresentou uma pequena diminuição da espalhabilidade
durante todo o período de estudo.
 Quanto aos testes de biometria cutânea, nos resultados obtidos para hidratação
cutânea, observou-se uma redução nos valores do conteúdo aquoso do estrato córneo
nas regiões tratadas com o GPA; enquanto que para o GNCPA foi possível observar
um aumento neste parâmetro, o que indica que as nanocápsulas melhoraram a
hidratação cutânea.
94
 Para os valores de pH verificou-se uma tendência a elevação do mesmo, porém estes
valores mantiveram-se dentro de uma faixa considerada normal (4,5-5,5).
 Na perda transepidérmica de água, pode-se observar um aumento significativo para o
GPA, diferentemente do GNCPA, onde o aumento deste parâmetro não foi
significativo. Assim, evidenciou-se que as nanocápsulas poliméricas são capazes de
sustentar a perda transepidérmica de água, favorecendo o grau de hidratação cutânea e
mantendo a integridade do estrato córneo.
 Ocorreu uma diminuição no conteúdo de melanina, ao final dos 90 dias de
experimento, tanto para o GNCPA como para o GPA, mas apesar desta diferença não
ser significativa, pode-se observar que esta redução foi mais pronunciada no GNCPA.
Provavelmente, esta diminuição esteja associada à ação regulatória do PA sobre a
atividade dos melanócitos.
 Ambas as formulações não causaram irritação cutânea, entretanto o GNCPA foi capaz
de reduzir este índice em uma porcentagem um pouco maior, o que diminui a
suscetibilidade da formação de eritema que o fármaco na forma livre possa vir a
causar, configurando a segurança na utilização da formulação nanoencapsulada.
 Em vista do exposto, e também da melhor estabilidade apresentada pelas NCPA em
comparação com a forma livre, tem-se como perspectivas futuras a continuidade desta
pesquisa buscando aumentar ainda mais o tempo de estabilidade do palmitato de
ascorbila. Para isso, sugere-se a incorporação deste ativo em outros sistemas
nanoestruturados, como nanopartículas lipídicas sólidas e lipossomas; bem como a
secagem das suspensões por liofilização e incorporação das mesmas em diferentes
bases semissólidas, como silicones, buscando indicativos que levam a conclusões
definitivas sobre a estabilidade deste ativo.
95
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ANEXOS
ANEXO 1 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Título do projeto: Biometria cutânea com formulações semissólidas contendo nanocápsulas
de palmitato de ascorbila.
Objetivos: Preparar suspensões de nanocápsulas contendo palmitato de ascorbila e incorporar
em um gel; Determinar e comparar o nível de hidratação, pH, conteúdo de água presente na
pele e capacidade oclusiva, após aplicação do palmitato de ascorbila na forma livre e na forma
nanoencapsulada; Verificar o potencial de irritação das formulações, através da determinação
do índice de melanina/eritema por método colorimétrico.
Justificativa: O estudo de formulações tópicas contendo vitamina C nanoencapsulada,
através de ensaios de biometria cutânea, torna-se de grande relevância para o
desenvolvimento de produtos mais estáveis, seguros e eficazes. Além disso, trata-se de um
método não invasivo, rápido e seguro de se aplicar a humanos, uma vez que é possível avaliar
a pele in vivo, em tempo real, sem a necessidade de se violar sua integridade.
Pelo presente termo de consentimento, declaro que fui informado(a) de forma clara,
das justificativas, dos objetivos e dos procedimentos da pesquisa.
Fui informado(a) ainda:
 Da liberdade de participar ou não da pesquisa, tendo assegurado essa liberdade sem
quaisquer represálias atuais ou futuras, podendo retirar meu consentimento em qualquer etapa
do estudo sem nenhum tipo de penalização ou prejuízo;
 Da segurança que não serei identificado(a) e que se manterá o caráter confidencial das
informações relacionadas com a minha privacidade, a proteção da minha imagem;
 Da garantia que as informações não serão utilizadas em meu prejuízo;
 Da liberdade de acesso aos dados de estudo em qualquer etapa da pesquisa;
 Da segurança de acesso aos resultados da pesquisa;
 A pesquisa observará também a sua adequação no que diz respeito aos princípios
científicos que a justifiquem e com possibilidades concretas de responder incertezas,
prevalecendo sempre às probabilidades dos benefícios esperados sobre os riscos previsíveis;
 Dos riscos e benefícios do presente estudo, assim como da garantia de receber resposta a
qualquer pergunta ou esclarecimento a qualquer dúvida a cerca da metodologia, riscos,
benefícios e outros aspectos relacionados com a pesquisa desenvolvida.
Qualquer intercorrência que possa ocorrer nos sujeitos da amostra, estes terão
atendimento clínico da médica Nara Maria Beck Martins, CRM-RS 14909.
Neste termo e considerando-me livre e esclarecido(a), consinto em participar da
pesquisa proposta, pelo período de 3 meses, resguardando as autoras do projeto a propriedade
intelectual das afirmações geradas e expressando a concordância com a divulgação pública
dos resultados. As responsáveis pelo estudo são profª Drª Marta Palma Alves (9614-1293) e a
acadêmica Ana Paula Tasquetto da Silva (9963-3772).
108
Declaro que recebi cópia do presente Termo de Consentimento.
Nome do participante: ___________________________________
Assinatura do participante: ________________________________
Nome do(s) pesquisador(es):____________________________
Assinatura da(s) pesquisadora(s): ________________________
Nome da testemunha: _________________________________
Assinatura da testemunha: _____________________________