LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Marilena dos Anjos Martins
ANÁLISE MOLECULAR DE ISOLADOS SERIADOS DE
C. neoformans NA CRIPTOCOCOSE: RECIDIVA OU
RE- INFECÇÃO?
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação
em
Ciências
da
Coordenadoria de Controle de Doenças da
Secretaria de Estado da Saúde de São
Paulo, para obtenção do Título de Mestre
em Ciências
Área de Concentração:
Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública
Orientadora:
Profa Dra Vera Lúcia Pereira- Chioccola
SÃO PAULO
2006
1
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pelo Centro de Documentação – Coordenadoria de Controle de Doenças/SES
©reprodução autorizada pelo autor
Martins, Marilena dos Anjos
Análise molecular de isolados seriados de C. neoformans na
criptococose: recidiva ou re-infecção? / Marilena dos Anjos Martins – São
Paulo, 2006.
Dissertação (mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Coordenadoria de Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde
de São Paulo.
Área de concentração: Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública
Orientador: Vera Lúcia Pereira-Chioccola
1. Criptococose 2. Síndrome de imunodeficiência adquirida 3.
Biologia molecular/métodos 4. Cryptococcus neoformans/isolamento &
purificação 5. Recidiva/prevenção & controle
SES/CCD/CD-131/06
2
3
DEDICATÓRIA
i
Aos meus pais Judite e Antonio (in memoriam), que sempre se
esforçaram e se sacrificaram para que eu estudasse. Muito obrigada por
terem me dado tanto amor. Tudo o que sou devo aos senhores.
Aos meus amores Martin e Eduardo, obrigada por
compreenderem minhas irritações e tentarem me ajudar. Vocês são muito
importantes na minha vida.
A todos os funcionários da Seção de Micologia do IAL Central.
Sem o incentivo e apoio de todos vocês eu não teria realizado esta tese.
ii
AGRADECIMENTOS
iii
A Dra Mara Cristina de Souza Pappalardo por sua disponibilidade
e atenção. O esforço do seu trabalho originou esta tese.
As estagiárias da FUNDAP Daniela Crema e Elaine Cristina
Cornetta pela colaboração na parte prática.
A todos os profissionais com quem eu tive oportunidade de
trabalhar. Não citarei nomes para não ser injusta, porque, todos vocês
direta ou indiretamente foram muito importantes para a construção do
profissional que sou hoje.
A todos os meus amigos, obrigada por fazerem parte da minha
vida.
Aos professores que formaram a banca de qualificação e
mestrado por sua valiosa contribuição.
Ao Programa de Pós-graduação da CCD e secretaria da pós
graduação do IAL pela gentileza e atenção.
Em especial a minha orientadora Dra Vera Lúcia PereiraChioccola, pelo entusiasmo, incentivo e disponibilidade para realização desta
tese. Sua experiência foi fundamental na condução deste trabalho. Saiba
que aprendi demais. A você meu carinho, admiração e minha sincera
gratidão.
iv
RESUMO
v
A criptococose é uma das micoses que mais acomete os
pacientes imunocomprometidos, principalmente aqueles com a síndrome da
imunodeficiência adquirida (aids). Ela é causada por Cryptococcus
neoformans, levedura capsulada com tropismo pelo sistema nervoso central.
O curso da doença é grave pela ocorrência de meningoencefalite
criptocóccica, freqüentemente fatal.
No Brasil, apesar da introdução do tratamento antiretroviral
(HAART), a criptococose é a segunda doença neurológica mais prevalente,
com várias recorrências e definidora de aids. O conhecimento da cepa
infectante pode contribuir para estratégias de tratamento e prevenção de
doença. Este estudo avaliou se as infecções recorrentes em pacientes com
aids são devido à persistência da cepa inicial ou aquisição de nova cepa ou
múltiplas cepas. Foram analisadas, retrospectivamente, 54 amostras de C.
neoformans isoladas de líquido cefalorraqueano (LCR) de 12 pacientes com
menigoencefalite criptocóccica e aids. Os pacientes foram divididos em dois
grupos. O grupo I foi composto por 3 pacientes (15 isolados) com pelo
menos dois episódios e duas hospitalizações. O grupo II foi composto por 9
pacientes (39 isolados) com um episódio e uma hospitalização. A análise
molecular dos isolados clínicos foi realizada pela eletroforese em campo
pulsado (PFGE) e pela análise do polimorfismo do DNA pela amplificação
aleatória (PCR-RAPD). Apesar de todos os isolados serem caracterizados
como C. neoformans var. neoformans sorotipo A, o PFGE e PCR-RAPD
mostraram significante polimorfismo genético entre os isolados provenientes
dos 12 pacientes. A princípio estes dados podem contribuir para melhor
entendimento da alta prevalência das infecções recorrentes e da
epidemiologia da doença. Os isolados dos pacientes pertencentes ao Grupo
I apresentaram diversidade genética entre as amostras coletadas na
primeira e na segunda hospitalização. Os perfis genéticos dos isolados dos
pacientes do grupo II sugerem que apenas dois foram infectados com uma
única cepa, uma vez que todos os isolados de cada paciente apresentaram
o mesmo genótipo. Os outros sete pacientes apresentaram isolados com
grande diversidade genética. Várias hipóteses podem explicar estes
vi
achados infecções por múltiplos isolados; re-infecções com novos isolados;
mutações dos isolados iniciais para adaptação e/ou para escapar do sistema
imune do hospedeiro e/ou da terapia antifúngica.
vii
ABSTRACT
viii
Cryptococcosis is the most common mycosis in immunodeficient
patients, principally in aids. The course of infection is a serious and often lifethreatening disease. This mycosis is caused by the encapsulated yeast
Cryptococcus neoformans that present tropism for the central nervous
system where cause cryptococcal menigoencephalitis. In Brazil, despite
HAART, cryptococcosis is the second most prevalent neurological disease
with several recurrences and a frequent aids-defining condition. The
knowledge the infecting strain can contribute to treatment strategies and
disease prevention. This study evaluated, retrospectively, if recurrent
infections in Brazilian aids patients are due to the persistence of the same
strain, a new or multiple strains. It was analyzed 54 C. neoformans isolated
of cerebrospinal fluid from 12 patients with aids and cryptococcal
meningoencephalitis. The patients were divided in two groups. The group I
was composed of 3 patients (15 isolates) with, at least, two different
episodes and two hospitalization periods. The group II was composed of 9
patients (39 isolates) with one episode and a single hospitalization. Pulsed
field gel electrophoresis (PFGE) and random amplified polymorphic DNA
analysis (PCR-RAPD) were used for typing the isolates. In spite of all
isolates to be characterized as C. neoformans var. neoformans serotype A,
PFGE and PCR-RAPD analysis verified significant genetic polymorphism
among the 12 patient’s isolates. These data could explain in part, the
epidemiology and high prevalence of recurrent infections of cryptococcal
meningoencephalitis in aids Brazilian patient. The isolates from Group I
presented genotype diversities among samples from first and second
hospitalizations. The data obtained from patients of Group II suggest that two
of them were infected with single strain since all isolates from each patient
had same genotype characteristics. The other seven patients presented
isolates with genetic diversities. The high molecular variety noted in isolates
could be explained by different hypothesis: infection with multiple isolates; reinfection with new isolates; mutations to adapt and escape of the host
immune system and/or the antifungal therapy.
ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
x
AIDS - síndrome da imunodeficiência adquirida
AFLP – amplificação dos fragmentos de DNA gerados por enzima de
restrição
Anfo B - anfotericina B
ATCC - American Type Culture Collection
CDC - Center for Disease Control
CGB - agar a base de L-canavanina, glicina e azul de bromotimol
CHEF - contour- clamped homogeneous electric field
CIM - concentração inibitória mínima
5-FC - 5-fluorcitosina
CNRE-1 - C. neoformans repetitive element 1
EK – eletrophoretic kariotyping (cariotipagem eletroforética)
EUCAST - European Commitee of Antibiotic Susceptibility Testing
FZ – fluconazol
g – aceleração da gravidade
GRUPO I – pacientes com uma única internação
GRUPO II – pacientes com mais de uma internação
GXM - glucoronoxilomanana
IIER – Instituto de Infectologia Emílio Ribas
IN - iniciador
IZ - itraconazol
HAART – highly active antiretroviral therapy
HIV – vírus da imunodeficiência humana
LCR- líquido cefalorraqueano
MEE - multilocus enzyme electroforese
NCCLS - National Commitee for Clinical Laboratory Standards
OFAGE – orthogonal field alternation gel eletrophoresis
pb – pares de base
PFGE – eletroforese em campo pulsátil
PCR-RAPD – random amplification of polymorphic DNA
RFLP - restriction fragment length polymorphism
SAME - serviço de arquivo médico
xi
SNC – sistema nervoso central
var. – variedade
xii
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
xiii
Página
Tabela 1 - Síntese dos dados e perfis moleculares por PFGE e PCRRAPD dos isolados do grupo I..................................................................44
Tabela 2 - Síntese dos dados e perfis moleculares por PFGE e PCRRAPD dos isolados dos pacientes do Grupo II
.....................................51
.
Figura 1- Ciclo de vida do Cryptococcus neoformans................................5
Figura 2 – Escolha dos iniciadores (in) para PCR-RAPD- perfis de bandas
gerados por C. neoformans sorotipos A (ATCC 32045), D (ATCC 28958) e
AD (ATCC 48184) com in 1 a 6 ............…….............................................41
Figura 3 – Provável sorotipo dos isolados clínicos - similaridades
observadas entre os perfis de bandas com in3 e in4 dos sorotipos A, D,
AD e o isolado clínico do paciente P1b e do paciente P2a......................41
Figura 4A - Grupo I- total de perfis de bandas gerados, por PFGE, nos
isolados dos pacientes com mais de uma internação (I-IX)......................45
Figura 4B- Representação esquemática da figura 4A.............................45
Figura 5A - Grupo I – perfis de bandas gerados, por PFGE, nos isolados
seriados dos pacientes com mais de uma internação (P1, P2, P3)......... 46
Figura 5B – Representação esquemática da figura 5A........................... 46
Figura 6 - Grupo I – total de perfis de bandas gerados, por PCR-RAPD
com in3, nos isolados dos pacientes com mais de uma internação (IIX)..............................................................................................................47
xiv
Figura 7 - Grupo I – perfis de bandas gerados, por PCR-RAPD com in3
nos isolados seriados dos pacientes com mais de uma internação (P1,
P2, P3).......................................................................................................47
Figura 8- Grupo I- total de perfis de bandas gerados por PCR-RAPD com
in4 nos isolados dos pacientes com mais de uma internação (I-VI).........48
Figura 9 - Grupo I- perfis de bandas gerados por PCR-RAPD com in4 nos
isolados seriados dos pacientes com mais de uma internação (P1, P2,
P3).............................................................................................................48
Figura 10A - Grupo II – total de perfis de bandas gerados por PFGE nos
isolados dos pacientes com uma internação ( I- XI ).................................52
Figura 10B – Representação esquemática da figura 10A........................52
Figura 11A - Grupo II – perfis de bandas gerados por PFGE nos isolados
seriados dos pacientes com uma internação (P4- P12)............................53
Figura 11B – Representação esquemática da figura 11A........................53
Figura 12- Grupo II – total de perfis de bandas, gerados por PCR-RAPD
com in3, dos isolados de pacientes com uma internação (I-XIII)..............54
Figura 13 – Grupo II – perfis de bandas gerados por PCR-RAPD, com
in3, nos isolados seriados dos pacientes com uma internação (P4P12)...........................................................................................................54
Figura 14 – Grupo II - total de perfis de bandas gerados por PCR-RAPD,
com in4, nos isolados dos pacientes com mais de uma internação (IXIII)............................................................................................................55
xv
Figura 15 – Grupo II - perfis de bandas gerados por PCR-RAPD, com
in4, nos isolados seriados dos pacientes com mais de uma internação
(P4-P12) .................................................................................................55
xvi
ÍNDICE
xvii
Página
1. INTRODUÇÃO............................................................................................1
1.1.Histórico....................................................................................................2
1.2. Morfologia e Ciclo de Vida.......................................................................3
1.3. Sorotipos do C. neoformans....................................................................6
1.4. Variedades do C.neoformans..................................................................6
1.5. Ecologia e Epidemiologia........................................................................8
1.6. Patogenia...............................................................................................11
1.7. Diagnóstico Laboratorial........................................................................12
1.8. Sensibilidade aos Antifúngicos..............................................................13
1.9. Antifúngicos e Tratamento.....................................................................14
1.10.Criptococose e Aids..............................................................................16
1.11. Tratamento da neurocriptococose em pacientes com Aids.................17
1.12. Genotipagem.......................................................................................18
1.12.1.
“Pulsed
Field
Gel
Eletrophoresis”
(PFGE)
ou
cariotipagem
eletroforética (CE)..........................................................................................18
1.12.2. “Random Amplification of Polymorphic DNA” (PCR-RAPD)………. .20
1.13. Variabilidade dos isolados de C. neoformans......................................21
1.14. Estudo Molecular da Criptococose Recorrente....................................22
2. OBJETIVOS ............................................................................................25
2.1. Objetivo Geral....................................................................................... 26
2.2. Objetivos Específicos............................................................................ 26
3. MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................27
3.1. Pacientes e amostras clínicas................................................................28
3.2.
Identificação dos isolados de C. neoformans e variedade..................29
3.3.
Cepas padrão de C. neoformans var. neoformans.............................30
3.4.
Obtenção de Protoplastos...............................................................….31
3.5.
PFGE..................................................................................................31
3.5.1. Extração de DNA cromossômico........................................................31
xviii
3.5.1. Corrida Eletroforética..........................................................................32
3.5.2. Critérios para leitura das bandas........................................................33
3.6.
PCR-RAPD.........................................................................................33
3.6.1. Extração de DNA genômico...............................................................33
3.6.2. Avaliação da extração do DNA genômico..........................................34
3.6.3. Quantificação do DNA genômico........................................................34
3.6.4. Seleção das seqüências iniciadoras.............................................…..35
3.6.5. Reação em cadeia da polimerase (PCR)............................…............35
3.6.6. Eletroforese em gel de agarose e poliacrilamida ...............................36
3.6.7. Critérios para leitura das bandas........................................................37
4.
RESULTADOS.....................................................................................38
4.1. Identificação bioquímica dos isolados....................................................39
4.2. Seleção das seqüências iniciadoras.......................................................39
4.3. Análise molecular dos isolados dos pacientes do Grupo I.....................42
4.4. Análise molecular dos isolados dos pacientes do grupo II.....................49
5.
DISCUSSÃO.........................................................................................56
6.
CONCLUSÕES...................................................................................65
7.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................67
8. ANEXOS...............................................................................................….84
xix
1. INTRODUÇÃO
1
1.1. Histórico
A criptococose é uma infecção fúngica causada por levedura
capsulada do gênero Cryptococcus. Este gênero compreende 34 espécies,
sendo Cryptococcus neoformans o principal patógeno, daí o termo
criptococose estar associado com infecção por C. neoformans. A doença foi
descrita pela primeira vez em 1894, pelo patologista alemão Busse. Ele
observou a presença de corpúsculos redondos a ovais em tumor de tíbia de
uma paciente que posteriormente morreu com infecção disseminada. Estes
corpúsculos cresceram em cultura. No mesmo ano, Sanfelice isolou a
levedura
capsulada
em
suco
de
pêssego
e
classificou-a
como
Saccharomyces neoformans. Em 1895, Sanfelice inoculou a S. neoformans
em animal e, assim, provou a sua patogenicidade. Ele também reconheceu a
semelhança entre esta levedura e a isolada por Busse. Em 1901, Vuillemin
re-classificou os fungos isolados por Busse e por Sanfelice para o gênero
Cryptococcus como C. hominis e C. neoformans respectivamente. Estas
leveduras não apresentavam os ascósporos que caracterizavam o gênero
Saccharomyces (Kwon-Chung et al., 1992).
Von Hansemann foi o primeiro a observar o fungo na meninge
humana em 1905. Verse, em 1914, fez o primeiro diagnóstico reconhecido de
meningite criptocóccica. Em 1935, Benham concluiu que os achados
referentes à morfologia, patologia e resposta imune de todos isolados
humanos eram pertencentes a uma única espécie, C. hominis com duas
variedades.
Benham, em 1950, propôs o nome de criptococose para a
doença e de Cryptococcus neoformans para o agente. Em 1954, Zimmerman
e Rappaport observaram a freqüente associação de criptococose com
desordens malignas do sistema linfático (Kwon-Chung et al., 1992).
2
No Brasil, o primeiro caso de neurocriptococose foi relatado em
1941, na cidade de São José de Rio Preto, São Paulo (Reis-Filho et al.,
1985).
1.2. Morfologia e Ciclo de Vida
Cryptococcus
neoformans
apresenta-se
sob
duas
formas:
assexuada (ou anamorfa ou imperfeita) e sexuada (ou teleomorfa ou
perfeita). A forma anamorfa apresenta-se como célula esférica ou ovalada
com gemulação multipolar e uma cápsula polissacáride. A parede celular é
espessa e o citoplasma contém estruturas globosas formadas por
substâncias refringentes à luz do microscópio. A virulência está intimamente
associada com a cápsula (Mendes-Giannini et al., 2001).
O ciclo de vida do C. neoformans foi descrito por Kwong-Chung
em 1975. O estado sexuado (basidiomiceto pertencente ao gênero
Filobasidiella) foi obtido pela conjugação, “in vitro”, de duas leveduras
compatíveis α e a. No ponto de contato entre as células ocorre a formação
de micélio dicariótico com septos dolipóricos e grampos de conexão. As
hifas produzem basídios terminais subglobosos a clavados, nos quais ocorre
a cariogamia e meiose. Os basidiósporos são produzidos em 4 pontos no
ápice dos basídios. São unicelulares, ovais, elípticos ou piriformes com
parede celular ligeiramente áspera (Kwong-Chung, 1975) (Figura 1).
Estudos citológicos e genéticos indicam que os 4 núcleos
produzidos pela primeira meiose permanecem no basídio e cada núcleo se
divide por mitose. Os núcleos “filhos” migram para dentro dos basidiósporos
enquanto o núcleo mãe se divide repetidamente formando de 20 a mais
basidiósporos uninucleados por cadeia. Os esporos, de uma única cadeia,
não são idênticos, porque os núcleos são aleatoriamente incluídos nos
3
esporos durante a formação da cadeia. Os basidiósporos são secos e
acapsulados, mas quando entram em contato com meio de cultura, incham e
tornam-se leveduras com brotamentos e cápsula (Kwong-Chung, 1976a;
Kwong-Chung, 1980). O estado perfeito das duas variedades (var.)
apresentam diferenças, dentre as quais a mais marcante é a forma e o
tamanho dos basidiósporos. Na var. neoformans os basidiósporos são
subglobosos a elípticos e delicadamente ásperos. Os produzidos da var.
bacillospora são estreitos, lisos, em forma de vara com ou sem curvatura
(Kwong-Chung, 1976b). Isolados clínicos e ambientais do tipo α são 30 a 40
vezes mais freqüentes que os do tipo a (Kwong-Chung et.al. 1978).
A forma anamorfa de C. neoformans pertence ao Reino Fungi;
Divisão Eumycota; Sub-divisão Deuteromycotina; Classe Blastomycetes;
Família Cryptococcaceae; Gênero Cryptococcus; Espécie neoformans;
Variedades neoformans e gattii. A forma teleomorfa (Filobasidiella
neoformans) pertence ao Reino Fungi; Filo Basidiomycota; Classe
Heterobasidiomycetes;
Ordem
Filobasidiales;
Família
Filobasidiaceae;
Gênero Filobasidiella; Espécie neoformans; Variedades neoformans e
bacillispora ( Lacaz et al., 2002).
4
basidiosporos
meiose
α
germinação
Basidio
cariogamia
dicarion
conjugação
Fase
haplóide
Figura 1. Ciclo de vida do Cryptococcus neoformans
In Kwong-Chung KJ: The Yeast a taxonomic study, 1998.
5
1.3. Sorotipos do Cryptococcus neoformans
As diferenças estruturais na composição da glucoronoxilomanana
(GXM), principal componente da cápsula do C. neoformans, levam a
diferenças antigênicas que são utilizadas para classificar, sorologicamente,
as cepas de C. neoformans.
As primeiras distinções entre as cepas de C. neoformans foram
feitas em 1935 por Benham que, por meio da reação de aglutinação e
precipitação verificou diferenças antigênicas no polissacáride capsular de C.
neoformans. Em 1949, Evans classificou os isolados de C. neoformans em
três sorotipos ( A, B, C). Mais tarde, Vogel identificou o quarto sorotipo ( D)
(Kwon-Chung, 1992).
Estudos posteriores realizados por Ikeda et al.(1982;1985)
caracterizaram os fatores antigênicos dos 4 sorotipos até então conhecidos
e propuseram um quinto sorotipo (AD). Assim, os fatores antigênicos do
sorotipo A são 1, 2, 3 e 7; do sorotipo B são 1, 2, 4 e 5; do sorotipo C são 1,
4 e 6; do sorotipo D são 1, 2, 3 e 8; e do sorotipo AD são 1, 2, 3, 7 e 8.
Os sorotipos estão agrupados em 2 variedades; os sorotipos A,
D e AD pertencem à espécie C. neoformans var. neoformans e os
sorotipos B e C à espécie C. neoformans var. gattii
(Kwon-Chung et
al.,1982b).
1.4.Variedades do Cryptococcus neoformans
Desde a descoberta que haviam dois estados sexuados
morfologicamente diferentes entre os isolados de C. neoformans tornou-se
claro que os isolados do sorotipo A e D são diferentes dos isolados sorotipo
B e C (Kwon-Chung, 1998).
6
Foram realizadas várias tentativas para elaborar meios seletivos
para
distinguir diferenças bioquímicas entre as duas variedades. Kwon-
Chung et al. (1982a) desenvolveram ágar à base de L-canavanina, glicina e
azul de bromotimol (CGB) e verificaram que a variedade gattii cresce no
meio CGB e hidrolisa a glicina, modificando o pH do meio e mudando a cor
para azul-cobalto. As variedades também podem ser distinguidas pela
habilidade de utilizar a D- prolina como fonte de nitrogênio. A var. gattii
apresenta assimilação de D-prolina positiva nas provas in vitro de
assimilação de fontes nitrogênio (Dufait et al., 1987).
Franzot et al.(1999) propuseram a criação de uma nova
variedade tendo como base as diferenças genotípicas existentes entre os
sorotipos A e D. Estes pesquisadores observaram que as cepas
apresentavam padrões distintos após hibridização da sonda CNRE-1 “C.
neoformans repetitive element 1” com o DNA dos sorotipos A e D e
posterior análise por RFLP (restriction fragment length polymorphism). A
análise da seqüência de nucleotídeos do gene URA 5 também apresentou
polimorfismo entre os dois sorotipos. Mesmo não sendo similares os
sorotipos A e D são membros da mesma espécie, pois são capazes de
cruzar e produzir a fase teleomórfica (Kwong-Chung, 1975). Com estas
evidências, os autores propuseram que o sorotipo D continuasse na
variedade neoformans, pois a descrição original da variedade havia sido
realizada com amostras deste sorotipo e sugeriram a criação de uma
nova variedade para o sorotipo A denominada de variedade grubii.
7
1.5. Ecologia e Epidemiologia
O primeiro isolado de C. neoformans foi obtido de suco de
pêssego em 1895 e, depois, do leite em 1901. Mais tarde, em 1951,
Emmons isolou amostras do solo e, em 1955, das excretas de pombos
(Rippon, 1988; Levitz, 1991).
As duas variedades diferem em seu “habitat” natural e distribuição
geográfica. C. neoformans var neoformans tem distribuição mundial sendo
freqüentemente isolado em fezes secas de pombos e solo contaminado com
fezes de aves. Ainda não está bem esclarecida a sua origem nas fezes das
aves, pois elas não são infectadas pela levedura. Supõe-se que as aves
resistam à infecção devido a alta temperatura corporal, que varia entre 41 e
43ºC. Acredita-se que as leveduras possam estar associadas à matéria em
decomposição (Kwon-Chung et al., 1992; Richardson et al., 1998).
No Brasil, amostras de C. neoformans var. neoformans já foram
isoladas de madeira em decomposição, dentro de ocos de árvores das
espécies Syzygium jambolana, Cassia grandis, Senna multijuga e Ficus
microcarpa em áreas urbanas da cidade do Rio de Janeiro. Estes dados
sugerem que esta variedade pode habitar diferentes locais não associados
às aves (Lazera et al., 1993; 1996).
Fezes de pombo são reservatórios dos sorotipos A e D mas, o
nicho ecológico desses sorotipos não é conhecido. O sorotipo D é raro,
exceto na Europa, em que é agente de 20 a 100% dos casos de criptococose
(Dromer et al, 1996).
C. neoformans var. gattii é predominante nas regiões tropicais e
subtropicais e em árvores do gênero Eucalyptus. É endêmico na Austrália,
sendo que 92% dos isolados humanos, dos coalas (animal nativo que se
alimenta de folhas de E. camaldulensis e E. tereticornis) e dos eucaliptos
exibem o mesmo perfil genético. Desta forma, existe uma clara associação
8
entre doença em mamíferos e exposição à árvore (Ellis et al., 1990; Sorrell et
al., 1997). No Brasil esta variedade já foi isolada de fezes de morcegos e de
árvores nativas como oiti (Moquilea tomentosa) e Guettarda acreana da
floresta amazônica (Lazera et al., 1993; Lazera et al., 1998; Lazera et al.,
2000; Fortes et al., 2001).
Num estudo epidemiológico realizado por Kwong-Chung et
al.(1984), o sorotipo B foi 4,5 vezes mais prevalente que o sorotipo C. A
maioria dos isolados do sorotipo C foi obtida de isolados provenientes do sul
da Califórnia. Callejas et al. (1998) relataram o isolamento deste sorotipo no
meio ambiente, em amendoeira (Terminalia catappa) na Colômbia (Callejas
et al., 1998).
A infecção em humanos ocorre por inalação de partículas
infecciosas de C. neoformans suspensas no ar, por meio de correntes de
vento ou distúrbios mecânicos. As leveduras encapsuladas (blastoconídeos)
são muito grandes (4-20μm) para penetrar e escapar dos mecanismos de
defesa do trato respiratório inferior. A hipótese mais favorável é de que as
partículas infecciosas (menores que 2 μm) sejam leveduras haplóides
acapsuladas dessecadas disseminadas por excretas secas de aves,
especialmente pombos (Ellis et al., 1990). Coletas de ar de ambientes com
excrementos de pombos demonstraram que existem partículas de C.
neoformans com diâmetros compatíveis com a deposição nos alvéolos, o
que reforça a hipótese de que a criptococose pode se originar de infecção
pulmonar (Powell, et al., 1972). Nas excretas de pombos expostos ao meio
ambiente são isoladas leveduras predominantemente do tipo de conjugação
“mating type” α, fase assexuada em que ocorre replicação haplóide das
leveduras (Sorrell et al., 1997). Outra hipótese, sugerida por Cohen (1982) é
que os basidiósporos da fase sexuada (1,8 a 2,5 μm de diâmetro) seriam os
propágulos infectantes. Os esporos são produzidos em grande quantidade
pelo basídio e são rapidamente aerolizados, podendo ser depositados mais
9
rapidamente nos alvéolos do que as células haplóides. Estudos de KwonChung et al. (1992) reforçam esta teoria, pois mostraram que os
basidiósporos são patogênicos quando inoculados em camundongos. Com
relação aos basidiósporos da var. gattii, Ellis et al. (1990) sugeriram que
estão presentes em eucaliptos.
A freqüência com que a população está exposta ao C.
neoformans var. neoformans indica que este agente tem caráter oportunista,
pois causa criptococose, preferencialmente, em pacientes imunossuprimidos.
Já a var. gattii acomete, preferencialmente, pacientes não imunossuprimidos
do sexo masculino após a segunda década de vida e em áreas geográficas
limitadas indicando comportamento de patógeno primário, assemelhando-se
a outros agentes de micoses sistêmicas (Rozenbaum et al., 1994).
A revisão de literatura realizada por Littman e Zimmerman mostrou
que havia 300 casos de criptococose registrados até 1955. Com o passar
dos anos os casos confirmados aumentaram drasticamente pelo uso de
terapias imunossupressoras (Kwong-Chung et al., 1992).
A prevalência da criptococose está relacionada com o número de
indivíduos imunocomprometidos na população e sua exposição com o meio
ambiente. Como a distribuição do fungo é mundial, a exposição humana é
um evento comum. Assim, a prevalência da criptococose na população pode
ser considerada um marcador sentinela para a porcentagem total de
indivíduos com imunidade deficiente (Casadevall et al., 1998). A prevalência
mundial de C neoformans em indivíduos com a síndrome da imunodeficiência
adquirida (aids) é a do sorotipo A, exceto em algumas áreas geográficas
como França, Itália e Dinamarca que prevalece o sorotipo D (Meyer et al.,
1999; Levitz, 1991). A infecção por sorotipo D é, significativamente, maior
entre pacientes com mais de 60 anos e em pacientes com infecção de pele
(Dromer et al., 1996).
10
No Brasil, estudos realizados nos estados do Rio de Janeiro e São
Paulo mostraram que a maioria dos pacientes foi infectada pelo C.
neoformans var. neoformans (sorotipos A e D) e, uma minoria foi infectada
por C. neoformans var. gattii (sorotipo B) (Lacaz, et al., 1983; Rozenbaum,
1990; Morales, 1999; Calvo et al., 1999; Rozenbaum et al., 1994; Nishikawa
et al., 2003).
A cidade de São Paulo apresenta clima tropical temperado. As
populações de pombos podem ser consideradas um problema, não somente
pelo grande número mas também, pela grande quantidade de fezes que são
depositadas em locais públicos servindo de substrato para C. neoformans
var.
neoformans.
Nesta
cidade,
também
é
comum
a
prática
de
reflorestamento de áreas públicas extensas, principalmente parques com
espécies de eucalipto, reconhecidas como hospedeiras de C. neoformans
var. gattii. Estas características permitem o estabelecimento de focos do
fungo na cidade (Montenegro Netto, 1998; Montenegro et al., 2000).
1.6. Patogenia
C. neoformans não faz parte da microbiota normal, mas pode ser
encontrado como organismo comensal transiente em humanos (Mitchell et
al. 1995). Pode também colonizar, eventualmente, o trato respiratório ou a
pele de indivíduos sadios e de pacientes com problemas broncopulmonares
(Randhawa et al., 1977a; Randhawa et al., 1977b). A doença se instala após
inalação de leveduras haplóides dessecadas ou de basidiósporos. Uma vez
no pulmão as leveduras dessecadas se hidratam e adquirem cápsula
polissacáride. Já os basidiósporos se convertem em blastoconídeos
encapsulados (Buchanan et al. 1998). A doença pode ser enquadrada nas
11
seguintes formas clínicas: forma pulmonar regressiva, forma pulmonar
progressiva e forma disseminada.
A forma pulmonar regressiva é encontrada em indivíduos sem
imunossupressão
e,
normalmente,
apresenta
infecção
pulmonar
assintomática ou sintomas de infecção respiratória leve, com resolução
espontânea. A forma pulmonar progressiva pode resultar da infecção
primária, ou mais freqüentemente, de reativação de um foco quiescente. Na
forma disseminada, a infecção pulmonar pode se disseminar por via
hematogênica e atingir outros órgãos como o sistema nervoso central,
causando meningoencefalite que é a principal manifestação clínica da
doença. Pele, ossos, olhos e mais raramente coração, fígado, glândula
supra-renal, tiróide e próstata podem, também ser acometidos. As principais
manifestações clínicas da meningoencefalite são: febre, cefaléia, mudanças
no nível de consciência (sonolência, confusão mental, estupor ou coma),
tonturas, irritabilidade, convulsões, distúrbios visuais, náuseas ou vômitos
(Rozenbaum, 1990; Moretti-Branchini et al., 2004).
1.7. Diagnóstico Laboratorial
Devido ao seu tropismo pelo sistema nervoso central, o líquido
cefalorraqueano (LCR) é o material biológico mais utilizado para o
diagnóstico laboratorial, porém, outros materiais biológicos podem ser
utilizados como: escarro, lavado brônquico, pus de lesões cutâneo-mucosas,
urina, tecidos obtidos por biópsia, secreção prostática, sangue e punção de
medula óssea (Mendes-Giannini et al., 2001).
Para a visualização microscópica da levedura, utiliza-se a
pesquisa direta com tinta da China ou Nigrosina para evidenciar a cápsula.
Para o isolamento da levedura em meio de cultura, o material biológico é
12
semeado em ágar Sabouraud e ágar BHI (Brain Heart Infusion). A
semeadura do material biológico em ágar Niger permite que o C.neoformans
desenvolva colônias com várias tonalidades de marrom devido a presença de
Guizotia abyssinica, que induz a produção de melanina mudando a cor da
colônia. A estes meios são adicionados antibióticos para inibir crescimento
de bactérias. Um método rápido e altamente sensível utilizado em fluidos
corpóreos como LCR, soro e urina é a detecção do antígeno polissacarídico
de C. neoformans, pela aglutinação com partículas de látex (MendesGiannini et al., 2001).
1.8. Sensibilidade aos Antifúngicos
Os testes de sensibilidade são ferramentas importantes para
determinação da resistência de um microorganismo frente a uma droga
antimicrobiana. A metodologia considerada padrão para o teste de
suscetibilidade aos antifúngicos para as espécies de Candida
Cryptococcus neoformans
e do
foi proposta pelo comitê norte-americano para
padronização de testes em laboratório clínico “National Commitee for Clinical
Laboratory Standards” (NCCLS) documento M27-A.
A avaliação da sensibilidade de um microorganismo frente a um
determinado fármaco é determinada pela concentração inibitória mínima
(CIM). A CIM é a menor concentração de antifúngico que inibe o crescimento
do microorganismo. Para a Anfotericina B a CIM corresponde ao tubo que
não tenha nenhum crescimento. Para a 5-fluorocitosina e azóis a inibição do
crescimento não é completa. Para estes antifúngicos, a CIM expressa o
coeficiente de inibição, não a ausência de crescimento e é a concentração do
antifúngico, igual ou menor que o tubo de inibição de 80% no macrométodo.
13
No micrométodo
considera-se para leitura da CIM, inibição de 50%
(Rodriguez-Tudela et al., 2001).
Com o intuito de melhorar a metodologia, um grupo de
pesquisadores europeus pertencentes ao “European Commitee of Antibiotic
Susceptibility Testing” (EUCAST) avaliou mudanças nas condições do teste
adequando-o para as diferentes espécies leveduras, em especial, nãofermentadoras de glicose, como Cryptococcus neoformans. Este comitê
propôs as seguintes modificações ao documento M 27-A (NCCLS, 1997):
adição de 2% de glicose ao meio RPMI-1640, inóculo de 0,5-2,5 X 105
UFC/ml e leitura em espectrofotômetro, com ponto de corte de 50% para
azóis e 5- fluorocitosina e de 95% para Anfotericina B, (Rodriguez-Tudela et
al., 2001). Os antifúngicos foram avaliados em 10 concentrações diferentes,
sendo que a concentração final dos antifúngicos, antes da adição do inoculo
da amostra variaram de 64 μg/ml a 0,125 μg/ml para FZ e 5-FC e de 16μg/ml
a 0,03μg/ml para AnfoB e IZ. O valor de CIM que separa as amostras em
sensível e resistente é denominado ponto de corte. No documento M27-A,
Rex et al. (1997) propuseram uma terceira categoria chamada de
sensibilidade dependente da dose (S-DD). Em 2002 o Doc. M27A2 substituiu
o anterior e é considerado o documento de referência para testes de
sensibilidade para Candida spp e C. neoformans.
1.9. Antifúngicos e Tratamento
Os principais antifúngicos utilizados para o tratamento da
criptococose são: anfotericina B (Anfo B), 5-fluorcitosina (5-FC), fluconazol
(FZ) e itraconazol (IZ). A Anfo B é um fármaco poliênico que atua na
membrana celular alterando sua permeabilidade e, consequentemente,
causando morte celular. A ação do fármaco é dependente da sua
14
concentração, podendo ser fungicida ou fungistática. Isso pode explicar as
recidivas após a suspensão da medicação. Para minimizar a intolerância e
nefrotoxicidade causada pela Anfo B convencional, preparada com
desoxicolato, foram desenvolvidas novas formulações como: Anfo B ligada a
complexo lipídico (ABLC, Abelcet), AnfoB lipossomal (Ambisome) e Anfo B
em dispersão coloidal (ABCD, Amphocil). Tais mudanças permitiram
aumentar
as
doses
diárias
do
paciente.
Apesar
das
dificuldades
metodológicas na detecção de isolados resistentes a Anfo B são raras as
espécies que apresentam resistência à droga (Pappalardo, 2002; Vivaldini,
2003).
A 5-FC é um fármaco que atua sobre a síntese de ácidos
nucléicos e apresenta excelente penetração no LCR. A resistência primária
das leveduras a este antifúngico é pouco freqüente, mas é comum o
surgimento de resistência secundária, ou adquirida durante o tratamento.
Dependendo da gravidade da infecção, associa-se 5-FC à Anfo B (Bodey,
1996; Pappalardo, 2002).
O FZ é uma droga azólica, fungistática que age inibindo a enzima
14 α-dimetilase dependente do citocromo P-450. Este processo interrompe
uma das etapas para formação do ergosterol, principal componente da
membrana citoplasmática dos fungos, levando a perda da permeabilidade
seletiva da célula (Andriole, 1998; Richardson et al., 1998).
O IZ é um triazólico que, assim como o FZ, exerce ação no
citocromo P-450 dos fungos, inibindo a síntese do ergosterol, causando
alteração e rompimento da membrana citoplasmática. Apresenta maiores
penetrações nos tecidos como pulmão, fígado e ossos, quando comparado
ao soro e ao LCR (Richardson et al., 1998). Apesar disso, muitos pacientes
com meningite criptocóccica foram tratados com sucesso na fase aguda da
doença (Pappalardo, 2002). O IZ é considerado droga de 2ª escolha
(Andriole, 1998).
15
1.10. Criptococose e aids
Primariamente, a criptococose era uma infecção rara e esporádica
que acometia indivíduos com deficiência imunológica mediada por célula T
como os pacientes com câncer, receptores de transplantes de órgãos e os
submetidos ao tratamento com corticosteróides. Após a década de 80 e a
introdução da aids, a infecção tornou-se uma das maiores causas de
meningites ou meningoencefalites e morte com ocorrência de 5 a 15% dos
casos (Kwon-Chung et al., 1990; Richardson et al.,1998).
A introdução da terapia antiretroviral (HAART–“highly active
antiretroviral therapy”) na metade da década de 90 reduziu as taxas de
infecções oportunistas em alguns países ocidentais. O uso de antiretrovirais
confere aumento da produção de células T CD4 e consequentemente,
resistência às infecções oportunistas. Em São Paulo, dados do Serviço de
Epidemiologia do Instituto de Infectologia Emílio Ribas mostraram que as
taxas de criptococose nos pacientes com Aids atendidos nesse hospital
diminuíram nos últimos anos, a saber: 7,7% em 1995; 7,4% em 1996; 8,2%
em 1997; 6,8% em 1998; 5,8% em 1999; 4,6% em 2000, 3,1% em 2001, se
mantendo a mesma até abril de 2002 (3,1%) (Pappalardo et al., 2003). No
Estado de São Paulo o porcentual de diagnóstico de criptococose em casos
notificados de Aids em maiores de 13 anos foi de 1,32 % em 2004.
(www.aids.gov.br).
Os sintomas predominantes são febre e/ou cefaléia. A infecção
começa a incidir em pacientes com baixo índice de células CD4 (< 50 a 100
células/mm3). Com a evolução da doença de base, torna-se mais difícil o
tratamento e o controle da infecção criptocóccica, levando a remissões
seguidas de recaídas da doença. O acometimento pulmonar pode variar
desde a presença de nódulos solitários assintomáticos até doença grave com
insuficiência respiratória aguda (Moretti-Branchini et al., 2004).
16
1.11. Tratamento da neurocriptococose em pacientes com
aids
A infecção pelo vírus HIV confere a criptococose certas
características que interferem na escolha do tratamento. É necessária a
instituição inicial de um tratamento de ataque que tem como objetivo
negativar as culturas, seguido de tratamento profilático das recidivas,
chamado de manutenção, por toda a vida. A elevada freqüência das
recidivas, após a cura aparente, caso não seja seguido um tratamento de
manutenção, sugere que alguns focos de infecção não foram erradicados. O
agravamento do déficit imunitário, provavelmente seja o fator que permite o
despertar dos focos quiescentes (Dupont, 1992).
O tratamento inicial dura cerca de 6 a 10 semanas ou até
negativar as culturas em LCR. Nesta fase, geralmente utiliza-se tratamento
com Anfo B. As recaídas são comuns em 50 a 75% dos casos,
principalmente se a terapia for interrompida. Em alguns casos pode ser
utilizado o FZ que, apesar de ser bem tolerado, para alguns pacientes é
ineficaz. Quando o tratamento da fase inicial é feito somente com azóis,
normalmente, há melhora clínica, mas as culturas em LCR permanecem
positivas. A seguir passa-se para a fase de manutenção que tem duração
variável dependendo da evolução clínica do paciente. O FZ é o fármaco de
eleição nesta fase do tratamento (Pappalardo, 2002).
Após a estabilidade do sistema imune pelo uso das terapias
antiretrovirais ocorre suspensão da medicação utilizada na fase de
manutenção da criptococose (Pappalardo, 2002).
Outra questão importante levantada por Brandt et al (1996b) é o
desenvolvimento de resistência a antifúngicos. Neste caso pode ocorrer
recorrência. Ainda não está claro se a terapia antifúngica crônica possibilita o
17
desenvolvimento de resistência de C. neoformans. Larsen et al (1989)
concluíram que mesmo após o uso de terapia antifúngica no tratamento da
meningite criptocóccica pode haver persistência de C. neoformans no trato
urinário, provavelmente na próstata, que seria um órgão reservatório da
infecção e responsável pela recorrência, principalmente, em pacientes com
Aids.
1.12. Genotipagem
1.12.1.
“Pulsed
Field
Gel
Eletrophoresis”
(PFGE)
ou
Cariotipagem Eletroforética (CE)
Schwartz et al.(1984), trabalhando com Saccharomyces cerevisiae
desenvolveram uma técnica capaz de separar moléculas de DNA maiores
que 2000 kB o que não seria possível em eletroforese convencional. Trata-se
de um sistema de eletroforese em gel de agarose capaz de fracionar
moléculas de DNA cromossomal, utilizando orientação perpendicular,
campos elétricos não uniformes e pulsos alternados. A mobilidade
eletroforética do DNA depende fortemente do tempo de pulso (duração do
campo aplicado) e a natureza do campo (uniforme e não uniforme). Os
tempos de pulso “switch time” inicial e final são estabelecidos de acordo com
o tamanho dos fragmentos a serem estudados. Os pequenos intervalos de
variação possibilitam uma melhor separação das bandas de menor peso
molecular enquanto que intervalos de variação maiores produzem melhor
resolução para bandas de maior peso molecular. A composição do tampão, a
temperatura, a voltagem selecionada e o tempo de corrida podem influenciar
na corrida eletroforética. Os autores também desenvolveram um método para
18
lise das células e manipulação de grandes moléculas de DNA na qual as
células são suspensas em agarose de baixo ponto de fusão e colocadas em
moldes antes de solidificarem. Estes moldes são introduzidos no gel de
corrida da eletroforese.
Os sistemas utilizados para a realização da eletroforese sofreram
várias modificações como o desenho do equipamento e distribuição dos
eletrodos na cuba de eletroforese. Dentre os diferentes sistemas existentes,
um dos mais utilizados é o sistema CHEF (Contour- Clamped Homogeneous
Electric Field) descrito por Chu, et al. (1986). O campo elétrico na cuba de
eletroforese é gerado por múltiplos eletrodos formando um contorno
hexagonal.
A utilização desta metodologia em fungos apresenta alguns
problemas. No caso de C. neoformans, a cápsula polissacáride interfere na
formação do protoplasto e conseqüentemente, na extração do DNA. Como
resultado
os
cariótipos
são
normalmente
borrados
ou
rompidos
incompletamente, especialmente na variedade gattii. Além disso, C.
neoformans produz nucleases que podem degradar o DNA de alta massa
molecular. Muitas vezes estes fatores fazem com que o número de
cromossomos e o padrão de bandas não sejam conclusivos (Cazin et al.,
1969; Wickes et al.,1994).
Polachek et al. (1989) utilizando o sistema de eletroforese
denominado “orthogonal field alternation gel electrophpresis” (OFAGE) foi o
primeiro a visualizar os cromossomos de C. neoformans. A var. gattii
apresentou 9 bandas cromossômicas com mobilidade menor que 580 kb
(sorotipos B e C). A var. neoformans sorotipo A apresentou 8 bandas
cromossômicas com mobilidade menor que 700 kb. O sorotipo D, além de
ser diferente dos perfis citados acima, mostrou variabilidade na distribuição
das bandas. A partir destes achados, vários trabalhos foram realizados com
objetivo de estudar a epidemiologia da doença.
19
1.12.2. “Random Amplification of Polymorphic DNA” (RAPD)
A técnica foi descrita por Williams et al. (1990) e consiste na
amplificação
seqüências
do
de
DNA
genômico
nucleotídeos
utilizando
arbitrárias.
iniciadores
Estes
simples
iniciadores
com
detectam
polimorfismo na ausência de informação da seqüência específica de
nucleotídeos e funcionam como marcadores genéticos. As seqüências de
nucleotídeos dos iniciadores são pequenas (9 ou 10 bases), com 50 a 80%
de G+C e sem seqüências palindrômicas. Quanto às condições de
amplificação, a principal diferença para a reação em cadeia da polimerase
(PCR) são as baixas temperaturas de anelamento (em torno de 36ºC). Esta
técnica pode ser utilizada para amplificar segmentos de DNA genômico de
uma grande variedade de espécies. Os polimorfismos entre os produtos
amplificados são freqüentemente detectados e são úteis como marcadores
genéticos.
A RAPD é ideal para tipagem de cepas de C. neoformans,
principalmente em estudos epidemiológicos em larga escala. Em análises
comparativas pode-se identificar a fonte de infecção, distinguir re-infecção de
falha no tratamento ou recidiva (Haynes et al.1995). Um dos primeiros
trabalhos realizados na genotipagem de C. neoformans utilizando RAPD foi
descrito por Crampin et al. (1993), no qual 12 isolados foram analisados (9
clínicos, 1 ambiental e 2 de coleção de cultura de países diferentes). Cada
isolado gerou um perfil de banda diferente que variou de 4 a 12 bandas com
tamanho variando de aproximadamente 100 a 1500 pb.
Chen et al. (1996) observaram, por RAPD, boa correlação entre os
perfis e sorotipos de C. neoformans var. neoformans. Verificaram que as
amostras dos pacientes estudados apresentaram padrões idênticos,
sugerindo, então, recidiva da infecção. Recomenda-se o uso de pelo menos
20
2
iniciadores
para
detectar
maior
polimorfismo
e
maximizar
a
reprodutibilidade (Micheli et al., 1993).
1.13. Variabilidade dos isolados de C. neoformans
Várias metodologias já foram utilizadas para estudar os perfis de
bandas dos isolados de C. neoformans como “multilocus enzyme
electrophoresis” (MLEE ou MEE); RAPD, utilizando-se diferentes seqüências
iniciadoras; RFLP com sonda CNRE-1; DNA fingerprint e PFGE ( Barchiesi et
al. 1995; Brandt et al. 1996a ; Brandt et al. 1996b; Currie et al., 1994; Franzot
et al. 1997; Fries et al. 1996; Haynes et al. 1995; Horta et al. 2001; Igreja et
al. 2004; Klepser et al. 1998; Perfect et al. 1989; Polachek et al. 1989; Spitzer
et al. 1993; Varma et al. 1995).
Os estudos moleculares mostraram que os isolados de C.
neoformans exibem diferentes graus de heterogeneidade genética entre
amostras clínicas e ambientais mesmo em pequenas áreas geográficas
(Curie et al., 1994). Acredita-se que exista maior diversidade de genótipos
entre isolados de C. neoformans var. neoformans do que entre os isolados
de C. neoformans var. gattii (Calvo et al., 2001). Os relatos de Meyer et al.,
1993 também sugerem que a variedade gattii é geneticamente mais
homogenia do que a var. neoformans.
As diferenças cromossômicas entre as cepas fazem com que a
cariotipagem seja uma ferramenta útil para propósitos epidemiológicos
(Perfect et al., 1993). O polimorfismo genômico detectado pela reação de
PCR-RAPD apresenta uma maior ou menor heterogeneidade nos perfis de
bandas dependendo do iniciador utilizado (Rezende, 2002).
Relatos envolvendo isolados brasileiros também mostraram
diferentes graus de heterogeneidade. Menor heterogeneidade foi verificada
21
por Franzot et al. (1997) em isolados do Rio de Janeiro e Belo Horizonte ( 14
cariótipos em 51 isolados) e por Calvo et al. (2001) em isolados provenientes
de várias regiões do Brasil (9 cariótipos em 25 isolados) ambos por PFGE.
Resultados semelhantes foram obtidos por Igreja et al.(2004) com “PCR
fingerprinting” de isolados do Rio de Janeiro e por Vivaldini (2003) e Aoki et
al. (1999), ambos por RAPD em isolados de São José do Rio Preto e
Campinas, respectivamente, ambas no Estado de São Paulo. Maior
heterogeneidade, por RAPD, foi verificada por Rezende (2002) em isolados
clínicos provenientes de Araraquara e Ribeirão Preto e por Horta et al.(
2002) com isolados do Rio Grande do Sul. Barreto de Oliveira et al., (2004)
demonstraram uma considerável diversidade genotípica em isolados
brasileiros pela amplificação seletiva de fragmentos de DNA gerados por
enzima de restrição (AFLP).
O conhecimento da variação genética de um patógeno é
essencial em diferentes aspectos como, relacioná-la com resposta imune do
hospedeiro, virulência, mecanismos de escape, evolução e adaptação do
microrganismo (Jain et al., 2005).
1.14. Estudos moleculares sobre a criptococose recorrente
Os métodos moleculares são normalmente utilizados para
distinguir diferenças entre as variedades e entre os sorotipos. São
extremamente úteis na resolução e distribuição das amostras, demonstrando
o grau de relacionamento do isolado inicial e o da recidiva no mesmo
paciente (Polachek et al., 1989; Wickes et al., 1994).
A revisão da literatura internacional envolvendo isolados seriados
de C. neoformans do mesmo paciente e utilizando diferentes metodologias
moleculares sugerem que, geralmente, os isolados da infecção inicial e os da
22
recorrência são os mesmos em todas as técnicas utilizadas (Franzot et al.,
1997; Perfect et al. 1989; Spitzer et al., 1992; Varma et al., 1992; Spitzer et
al., 1993; Brandt et al., 1996; Chen et al., 1996; Garcia-Hermoso et al., 1999;
Sukroongreung et al. 2001; Igreja et al., 2004).
Casos de padrão genotípico diferentes entre os isolados da
infecção inicial e os da recorrência foram relatados por Barchiesi et al.,1995;
Haynes et al., 1995; Fries et al., 1996; Sullivan et al., 1996; Almeida, 2000;
Rezende, 2002.
Outros autores sugerem casos de infecção mista, isto é, mais de
uma cepa de C. neoformans co-infectando o mesmo hospedeiro (Barchiesi
et al, 1995; Fries et al., 1996; Klepser et al., 1998; Rezende, 2002; Igreja et
al., 2004; Jain et al., 2005).
Brandt et al. (1996b) analisaram 102 isolados de 33 pacientes por
MEE, PFGE, RAPD e “DNA fingerprinting” com sonda CNRE-1. Todos os
isolados seriados do mesmo paciente foram idênticos por MEE, RAPD e
DNA fingerprinting. Porém por PFGE, em 24% dos pacientes os isolados
seriados mostraram perfis com pelo menos 2 bandas de diferença. Devido
às divergências de resultados os autores se mostraram relutantes em
sugerir que houve re-infecção por nova cepa somente com a alteração do
cariótipo sem que houvesse mudança nos perfis do RAPD, MEE ou RFLP.
Haynes et al. (1995) analisaram 10 isolados de 5 pacientes
empregando RAPD e “DNA fingerprinting” obtiveram perfis idênticos em 2
pacientes com isolados seriados coletados do mesmo episódio de
criptococose. Perfil diferente em um paciente entre dois isolados coletados
com diferença de 8 dias sugerindo infecção por mais de uma cepa. Outros
dois pacientes também apresentaram perfil diferente entre dois isolados
coletados com intervalo de 194 a 103 dias respectivamente, mas entre estas
coletas havia amostras com culturas negativas. Neste caso, os autores
sugeriram que houve re-infecção com uma nova cepa.
23
Mais tarde, Igreja (1999) estudando, por “PCR fingerprinting”,
isolados seriados de C. neoformans provenientes de pacientes do Rio de
Janeiro, observou que a maioria das amostras foi idêntica. Contudo, dois
pacientes apresentaram diferenças, em um deles os isolados diferiram em
subtipo e em outro os isolados foram bem diferentes quanto ao perfil de
bandas e a confirmação bioquímica concluiu que um dos isolados era da var.
gattii. Os mesmos resultados foram encontrados posteriormente, incluindose análise por RAPD (Igreja et al., 2004).
Resultados semelhantes foram obtidos por Vivaldini (2001) em
isolados de LCR provenientes de pacientes da cidade de São José do Rio
Preto (São Paulo). A análise por RAPD mostrou que os isolados seriados do
mesmo paciente apresentaram alto grau de similaridade genética sugerindo
que a infecção foi causada pela mesma cepa inicial. No estudo de Rezende
(2002), dos 5 pacientes com amostras seriadas, 2 apresentaram isolados
com perfis de bandas idênticos sugerindo recidiva pela mesma cepa inicial; 2
apresentaram perfis de bandas diferentes (isolados de sorotipos diferentes)
sugerindo infecção mista e um paciente com isolados do mesmo sorotipo
mas com perfis diferentes sugerindo re-infecção por nova cepa ou alteração
genética.
Esta dissertação estudou alguns aspectos da epidemiologia
molecular dos isolados seriados de C. neoformans de pacientes com Aids
provenientes da Grande São Paulo. A metodologia empregada foi análise
molecular por duas técnicas distintas, o PFGE para análise cromossômica do
DNA e o PCR-RAPD para análise de pequenos fragmentos utilizando dois
iniciadores diferentes.
24
2. OBJETIVOS
25
2.1. Objetivo Geral
Determinar se a análise molecular de isolados seriados de C.
neoformans, provenientes de pacientes com Aids e criptococose, podem
distinguir se infecções recorrentes são recidivas ou re-infecções.
2.2. Objetivos Específicos:
1- Estabelecer os perfis genotípicos de isolados clínicos de C.
neoformans por PFGE e PCR-RAPD;
2- Analisar a diversidade de perfis genotípicos entre os pacientes e
no mesmo paciente;
3- Correlacionar os perfis genotípicos dos isolados seriados com
os períodos da doença
26
3. MATERIAIS E MÉTODOS
27
3.1. Pacientes e amostras clínicas
Este estudo foi realizado utilizando-se amostras de C. neoformans
isoladas de LCR de 12 pacientes com meningoencefalite e Aids internados
no Instituto de Infectologia Emílio Ribas (IIER). As amostras foram coletadas
no período de 1995 a 1997. Elas foram previamente estudadas por
Pappalardo (2002) para análise dos testes de sensibilidade a antifúngicos
associados
às
informações
clínicas,
localidade,
data
de
coleta
e
administração de antifúngicos. Os critérios utilizados para a inclusão dos
pacientes no estudo de Pappalardo foram: a) pacientes com no mínimo 3
isolados de C. neoformans de LCR; b) 1ª coleta de LCR realizada no
momento do diagnóstico de criptococose de SNC e sem uso de Anfo B ou
FZ; c) idade maior ou igual a 13 anos; d) diagnóstico de Aids segundo
normas do CDC (1987); e) prontuário médico disponível no Serviço de
Arquivo Médico do IIER. O estudo da série de casos foi descritivo e
retrospectivo. Os dados epidemiológicos, clínicos e laboratoriais foram
consultados no período de 1997 a 2000 (Pappalardo, 2002).
Os isolados foram mantidos na seção de Micologia do Instituto
Adolfo Lutz de São Paulo, a –20ºC em caldo BHI contendo 20% de glicerol.
Do trabalho original, contendo 168 amostras isoladas de 35 pacientes, foram
recuperadas 54 isolados de 12 pacientes.
As amostras foram identificadas com a letra P (paciente), seguida
do número de amostras (P1 a P12). Cada isolado recuperado do mesmo
paciente recebeu uma letra, sendo “a” para o isolado inicial (primeira
amostra), “b”, “c” e assim por diante para as demais amostras seqüenciais.
Para atingir os objetivos propostos neste trabalho, as amostras
foram divididas em dois grupos: Grupo I - pacientes que foram internados
mais de uma vez e que tiveram amostras coletadas em ambas internações.
Pertencem a este grupo 3 pacientes totalizando 15 isolados; Grupo II –
28
pacientes que só foram internados uma vez e todos os isolados foram
coletados durante essa internação. Pertencem a este grupo 9 pacientes,
totalizando 39 isolados.
As tabelas 2 e 3 (Resultados) mostram todos os pacientes,
isolados e períodos de coleta.
3.2. Identificação dos isolados de Cryptococcus neoformans e
variedade
Para cada isolado congelado foi retirada uma alíquota e semeada
em ágar Sabouraud. A seguir, as placas foram incubadas a 30ºC até que
houvesse crescimento de colônias de leveduras. Todos os isolados foram re
identificados seguindo os métodos clássicos de identificação (Kwong-Chung,
1998). As provas descritas a seguir foram realizadas nas culturas de C.
neoformans semeadas em agar Sabouraud-dextrose-cloranfenicol incubadas
a 25°C por até 48h. Com exceção da prova de assimilação as demais foram
realizadas colocando-se uma pequena alçada da cultura nos diferentes
meios descritos abaixo:
- Hidrólise da uréia: foi semeada em agar uréia de Christensen e
incubada a 25ºC por 5 dias. A reação foi considerada positiva quando o meio
mudou de cor e tornou-se rosa.
- Presença de enzima fenoloxidase: foi semeada em agar Niger e
incubada a 30ºC por 72h. A reação foi positiva com o crescimento de
colônias de coloração marrom, indicando a presença da enzima.
- Crescimento à 37ºC: foi semeada em Agar Sabouraud e
incubada a 37ºC por até 4 dias. A reação positiva com o crescimento de
colônias de levedura.
29
- Assimilação de fontes de Carbono e Nitrogênio: Foi preparada
suspensão da levedura em solução fisiológica até obter a turbidez 2 da
escala de Mc Farland. Os meios de cultura “C” (meio isento de fontes de
carbono) e “N” (meio isento de fontes de nitrogênio) foram fundidos e
deixados atingir temperatura de 40ºC. Os meios fundidos foram vertidos em
placas de Petri 90 X 15 mm e a estes foram adicionados de 1 a 2 ml da
suspensão de leveduras. Após homogeneização e solidificação do agar,
foram adicionadas as fontes de carbono nas placas contendo meio “C” e as
fontes de nitrogênio na placa contendo meio “N”. Após incubação a 25ºC por
até 5 dias foram anotadas na ficha de identificação a presença ou ausência
de halo de crescimento ao redor da fonte testada.
- Determinação da variedade: foi semeada em tubo contendo agar
a base de L- canavanina, glicina e azul de bromotimol (CGB) e incubada a
25ºC por 5 dias. As culturas pertencentes a var. neoformans não crescem e
não modificam a cor do meio. As pertencentes a var. gattii crescem e fazem
com que o indicador torne o meio azul-cobalto.
3.3. Cepas padrão de C. neoformans
Para controle dos ensaios moleculares foram utilizadas cepas
padrão correspondentes aos três sorotipos da variedade neoformans. Tratase de cepas da American Type Culture Collection (ATCC) que são mantidas
na Seção de Micologia a -20º C em caldo BHI contendo 20% glicerol. As
cepas foram as seguintes: C. neoformans var. neoformans sorotipo A (ATCC
32045), C. neoformans var. neoformans sorotipo D (ATCC 28958) e C.
neoformans var. neoformans sorotipo AD (ATCC 48184). Para utilização
foram descongeladas, semeadas em agar Sabouraud contendo 0,05% de
cloranfenicol e incubadas a 30ºC por 48h.
30
3.4. Obtenção de protoplastos.
A metodologia, com algumas modificações, baseou-se em vários
protocolos (Perfect et al., 1989; Polachek et al., 1989; Barchiesi et al., 1995).
As amostras foram semeadas com descritas no item 3.2. Posteriormente
foram transferidas para tubos cônicos contendo 20 ml de meio líquido YEPD
(1% extrato de levedura; 2% dextrose; 2% bactopeptona) e incubadas a 30ºC
por 18 a 20 h sob agitação constante de 90g. As culturas foram centrifugadas
por 15 min a 2.800g a 4ºC (ALC 4239R). Após o descarte dos
sobrenadantes, os sedimentos foram lavados por 3 vezes com 20 ml de água
destilada estéril (por 15 min a 2.800g) e transferidos para tubos de 1,5 ml.
Para a digestão da cápsula e parede, as células foram ressuspensas com
200μl de tampão CES (20mM tampão citrato pH 5,6; 50mM EDTA pH 8,0;
0,9M sorbitol) contendo 10mg/ml de enzima lítica de Trichoderma harzianum
(Sigma) e incubadas a 37ºC por 2 a 3h, fazendo agitações constantes. Após
a incubação, os microtubos foram centrifugados a 4.100 g por 10 minutos a
4ºC, feitas três lavagens com 1ml de tampão CES e ressuspensos em 200μl
de tampão CES.
3.5. PFGE
3.5.1. Extração de DNA cromossômico
A metodologia baseou-se em vários protocolos (Perfect et al.,
1989; Polachek et al., 1989; Barchiesi et al., 1995) com modificações. Os
protoplastos dissolvidos em tampão CES receberam 250μl de 2% agarose
Low Melting Point (LMP) em água Milli Q e foram colocados nos moldes
31
adequados para confecção dos blocos. Após a polimerização a 4ºC por 20
min os blocos foram removidos dos moldes e colocados em tubos de 2 ml de
fundo chato ou placas de cultivo de tecido com 24 poços contendo 2 ml de
tampão NET (0,01M Tris HCl pH 7,5; 0,45M EDTA pH 8,0; 1% Laurilsarcosil)
e 100μl de proteinase K (20mg/ml). Os tubos ou placas foram incubados por
18h a 50ºC. A seguir foram realizadas 5 lavagens com EDTA 50mM pH 8,0
por 30 min a temperatura ambiente e sob agitação. Os blocos foram
mantidos no mesmo tampão e armazenados a 4ºC até o momento do uso.
3.5.2. Corrida eletroforética
Os blocos, contendo as amostras, e o marcador de peso molecular
de Saccharomyces cerevisiae (Bio-Rad) foram cortados na largura dos
dentes do pente a ser utilizado na eletroforese. Posteriormente foram
colocados em placas de cultura de células e lavados, novamente, com 50mM
EDTA pH 8,0 por 5 vezes com intervalos de 30 min entre as lavagens. O
pente contendo os blocos foi posicionado na plataforma do gel e foi
adicionado 1% agarose (Sigma) em TBE 0,5X (Tris-borato 0,045 M; EDTA
0,001M pH8,0). As corridas foram realizadas em aparelho CHEF DRII (Bio
Rad) contendo tampão TBE a 14ºC durante 29 horas, com 4,5 Volts/cm,
pulso inicial de 80 segundos e final de 200 segundos. Posteriormente, os
géis foram corados com 0,5 μg/ml brometo de etídio em água destilada
durante 20 a 30 minutos e visualizados em transiluminador ultravioleta com
longitude de onda de 302 nm (Syngene).
32
3.5.3. Critérios para leitura das bandas
Os tamanhos das bandas foram determinados pela comparação
com marcador de peso molecular e os perfis eletroforéticos dos isolados
foram comparados visualmente. Os isolados foram considerados idênticos
(mesmo tipo de DNA) quando todas as bandas forem exatamente iguais.
Foram considerados similares e identificados como subtipos quando a
diferença foi de uma banda. Foram considerados diferentes quando a
diferença foi de duas bandas ou mais (Barchiesi et al., 1995; Brandt et
al.,1996b; Franzot et al., 1997).
Para facilitar a análise das bandas, abaixo das imagens dos géis
foi colocada a representação esquemática. Esta representação foi realizada
sem auxílio de programas computacionais, apenas sobrepondo traços sobre
as bandas existentes na imagem. De acordo com a espessura dos traços
estabeleceu-se o seguinte critério:
1 banda
2 bandas
3 bandas ou mais
3.6. PCR-RAPD
3.6.1. Extração de DNA genômico
As extrações de DNA foram realizadas a partir dos protoplastos,
pelo método fenol/clorofórmio/isoamilálcool com modificações (Sambrook et
al.,1989). Os protoplastos foram digeridos com 200μl de tampão de lise
contendo 100μg/ml proteinase K; 50mM Tris-HCl pH 8,0; 25mM EDTA; 2%
SDS. Após a incubação a 50º C por 2 h, os tubos foram centrifugados a
10.000 g por 5 min e o sobrenadantes transferidos para outros microtubos.
33
Para promover a precipitação das proteínas foram adicionados aos
sobrenadantes 200μl de clorofórmio-isopropanol (24:1). As misturas foram
homogeneizadas e centrifugadas a 15.000g por 15 min. A parte aquosa de
cada tubo contendo somente os ácidos nucléicos foi transferida para um
novo microtubo. A precipitação das moléculas de DNA foi realizada
adicionando-se 3 vezes o volume de isopropanol. Os tubos foram
centrifugados a 15.000g por 10 min. Após o descarte dos sobrenadantes, os
sedimentos foram lavados com 200-500μl de etanol 70% e centrifugados a
15.000g por 10 min. Os sobrenadantes foram desprezados e os sedimentos
foram secos pela inversão do microtubo em papel de filtro. Aos sedimentos
foram acrescentados 50μl de H2O contendo 20μg/ml de RNAse e estocados
a –20ºC.
3.6.2. Avaliação da extração do DNA genômico
As amostras de DNA genômico foram analisadas por eletroforese
em agarose 2% contendo brometo de etídio. A presença de banda única e
bem definida no gel sob luz ultravioleta caracterizou a boa extração do DNA
genômico.
3.6.3. Quantificação do DNA
Cada amostra de DNA foi diluída 1:200 em H2O Milli Q estéril e
medida a absorbância em espectrofotômetro (HACH DR 4000U) no
comprimento de onda de 260 e 280 nm (luz ultravioleta). O grau de pureza
das extrações foi determinado pela razão entre as leituras DO 260/ DO 280
que deveria apresentar valores entre 1,8 e 2,0. Amostras que apresentaram
34
razão abaixo de 1,6 (presença de proteínas ou contaminantes) foram
novamente processadas. As leituras realizadas a 260 nm determinaram as
concentrações de DNA. Segundo Sambrook et al. (1989) absorbância igual a
1 equivale à concentração de 50μg/ml de DNA dupla fita.
3.6.4. Seleção das seqüências iniciadoras
Com objetivo de selecionar os oligonucleotídeos que gerassem o
melhor perfil de bandas para a leitura visual, as cepas padrões
correspondentes aos três sorotipos da variedade neoformans sorotipos A, D
e AD. foram ensaiadas por PCR-RAPD. Foram testadas 6 seqüências
arbitrárias de 10-mer, desenhadas especificamente para uso em PCR-RAPD
(Amersham Biosciences). Trata-se de seqüências universais que podem ser
utilizadas para qualquer microorganismo e são as seguintes: 1. 5’GGTGCGGGAA-3’ -(in1); 2. 5’-GTTTCGCTCC-3’ -(in2); 3. 5-GTAGACCCGT3’ -(in3); 4. 5’-AAGAGCCCGT-3’ -(in4); 5. 5’-AACGCGCAAC-3’ -(in5); 6. 5’CCCGTCAGCA-3’ -(in6).
3.6.5. Reação em cadeia pela polimerase (PCR)
As reações de amplificação foram realizadas com auxílio de um
kit Ready-to-Go/RAPD Analysis Beads (Amersham-Pharmacia-Biotech)
contendo of 1,5 unidades de Taq DNA polimerase; 10mM Tris-HCl, pH 8,3;
30mM KCl; 3mM MgCl2; 0,4mM de cada dNTP. Cada reação foi realizada
adicionando-se 1μl de cada amostra de DNA na concentração de 85 a 90
ng/μl e 25pmol do iniciador num volume final de 25μl. Foram escolhidos para
a análise dos isolados os oligonucleotídeos 3 e 4. As amplificações foram
35
realizadas em termociclador (Progene) e consistiram num ciclo inicial de
desnaturação de 5 min a 95ºC, 45 ciclos de desnaturação a 95ºC por 1 min,
anelamento por 36ºC por 1 min e extensão a 72ºC por 2 min. O procedimento
foi finalizado por um ciclo final de extensão por 10 min. Após o término da
reação os tubos contendo o DNA amplificado foram mantidos em freezer –
20ºC até o momento da corrida eletroforética.
3.6.6. Eletroforese em gel de agarose e poliacrilamida
Após amplificação, os produtos de PCR foram diluídos em
tampão de amostra (30% glicerol; 0,25% xilenocianol FF; 0,25% azul de
bromofenol) e aplicadas no gel de 2% agarose em TBE contendo 0,5μg/ml
brometo de etídio. As amostras foram submetidas à eletroforese em sistema
horizontal contendo TBE durante 50 minutos a 100V e 400mA. Os géis foram
visualizados em transiluminador ultravioleta com longitude de onda de 302
nm (Syngene). Alternativamente, para melhor discriminação das bandas, os
produtos amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de
poliacrilamida 3,5% em sistema eletroforético vertical contendo TBE durante
40 minutos a 100V e 400mA. Posteriormente, os géis foram corados com 0,5
μg/ml de brometo de etídio em água destilada, durante 20 minutos e
visualizados em transiluminador ultravioleta com longitude de onda de 302
nm (Syngene).
36
3.6.7. Critérios para leitura das bandas
As análises eletroforéticas dos produtos da amplificação foram
determinadas pela comparação visual dos tamanhos das bandas e pela comigração dos marcadores de peso molecular de 100 pb. Apesar da
padronização das concentrações dos DNA, algumas variações foram
observadas na intensidade do produto amplificado. Os perfis do PCR-RAPD
foram analisados de acordo com o número e reprodutibilidade das bandas
independentemente de sua intensidade (Chen et al., 1996). Os isolados
foram considerados idênticos quando todas as bandas forem exatamente
iguais e diferentes quando os isolados apresentarem qualquer diferença de
banda.
37
4. RESULTADOS
38
4.1. Identificação bioquímica dos isolados
Todos os isolados recuperados do congelamento apresentaram
cápsula ao exame direto com tinta da China, produção de fenoloxidase,
urease e crescimento a 37ºC. Na prova de assimilação de fontes de
nitrogênio, todos os isolados foram positivos para peptona e negativos para
KNO3. Na prova de assimilação de fontes de carbono, todas as amostras
foram positivas para a glicose, sacarose, maltose, trealose, L-raminose e
inositol. Apresentaram resultado positivo ou variável para celobiose e
negativo para lactose. Desta forma, todos os isolados foram identificados
como Cryptococcus neoformans. Quanto à determinação da variedade, os
isolados não cresceram no meio CGB e não assimilaram D-prolina, sendo
classificados como variedade neoformans.
4.2. Métodos moleculares
Em seguida, as amostras foram submetidas aos métodos
moleculares. Todos os isolados foram analisados por PFGE e por PCRRAPD.
Na PCR-RAPD optou-se pela corrida eletroforética em gel de
poliacrilamida 3,5%, por apresentar melhor discriminação entre as bandas,
principalmente as de menor intensidade.
Para a escolha das seqüências iniciadoras, os DNAs genômicos
das cepas padrões ATCC de C. neoformans sorotipos A, D e AD foram
testadas com os 6 iniciadores (Figura 2). Foram escolhidos os iniciadores 3
e 4 representados como in3 e in4 por gerarem perfis de bandas capazes de
permitir boa discriminação visual.
39
Além de selecionar os iniciadores foi possível comparar os perfis
eletroforéticos dos 3 sorotipos padrões (figura 3, in3 e in4) com os perfis
obtidos dos isolados dos pacientes. Esta metodologia confirmou que todos
isolados pertenciam ao sorotipo A.
40
pb
sorotipo A
sorotipo D
sorotipo AD
200-
*
*
*
*
* *
Figura 2. Escolha dos iniciadores para PCR-RAPD: Perfis de bandas de C.
neoformans var. neoformans sorotipos A (ATCC 32045), D (ATCC 28958) e AD
(ATCC 48184) com 6 iniciadores (in1a 6). Géis de poliacrilamida 3,5 % corados
pelo brometo de etídio. Marcador molecular 100pb. * iniciadores selecionados.
pb
in 3
*
in 4
*
*
*
1000-
500200P1b
A
D
AD
P2 a
A
D
AD
Figura 3-Provável sorotipo dos isolados clínicos – similaridades observadas
entre os perfis de bandas com in3 e in4 dos sorotipos A, D, AD e dois isolados
clínicos de paciente -P1(b) e P2(a). Géis de poliacrilamida 3,5 % corados pelo
brometo de etídio. Marcador molecular 100pb.
41
4.3. Análise molecular dos isolados dos pacientes do Grupo I
O Grupo I foi constituído de 15 isolados provenientes de três
pacientes (P1, P2, P3). Na primeira internação, durante a fase aguda, foram
tratados com Anfo B e, na fase de manutenção com FZ. Na 2º internação
voltaram ao tratamento com Anfo B.
O paciente P1 foi internado duas vezes com intervalo de 136 dias
entre as internações. Foram recuperados 6 isolados, três da 1ª internação
(a, b, c), com intervalos de coleta de aproximadamente 10 dias. Na segunda
internação foram recuperados 3 isolados (d, e, f), com intervalos de coleta
de 10 e 3 dias respectivamente. O paciente P2 foi internado duas vezes com
intervalo de 75 dias. Da 1ª internação foi recuperado um isolado (a) e da
segunda internação 3 isolados (b,c,d) com intervalos de 8 e 2 dias entre si.
O paciente P3 foi internado duas vezes com intervalo de 20 dias entre as
internações. Da 1ª internação foram recuperados 4 isolados (a, b, c, d) com
intervalos de aproximadamente 5 dias entre eles. Da 2ª foi recuperado um
isolado (e). A tabela 2 mostra a síntese destes dados.
Os isolados do Grupo I geraram 9 perfis eletroforéticos em PFGE
sendo que todos os pacientes apresentaram perfis de bandas distintos entre
si (Figura 4A). Para facilitar a visualização dos perfis eletroforéticos foi
confeccionada a representação esquemática das bandas (figura 4B).
Todos os isolados recuperados nas 1ª e 2ª internações do
paciente P1 apresentaram perfis idênticos entre si. Contudo, foram
diferentes entre a 1ª e a 2ª internação. Dos isolados do paciente P2 foram
obtidos dois perfis de bandas diferentes sendo que, o único isolado da 1ª
internação foi idêntico a um dos perfis da 2ª internação. Do paciente P3, os
quatro isolados da 1ª internação e o único isolado da 2ª apresentaram perfis
de bandas distintos entre si totalizando 5 isolados e 5 perfis distintos (figura
5A). A figura 5B mostra a representação esquemática das bandas.
42
Os isolados do Grupo I geraram no total 9 perfis de bandas na
PCR-RAPD utilizando-se o in3 (figura 6).
Na análise dos perfis de bandas dos isolados seriados de cada
paciente, os 6 isolados do paciente P1 apresentaram 3 perfis de bandas
distintos. Os coletados da 1ª internação geraram 1 perfil de banda e os da 2ª
internação três perfis de bandas sendo que um deles foi idêntico ao da 1ª
internação. Dos isolados do paciente P2 foram obtidos 3 perfis de bandas um
da 1ª internação e dois da 2ª internação. Do paciente P3 foram obtidos 3
perfis de bandas, dois da 1ª internação e um da 2ª internação (figura 7).
Com in4 foram obtidos 6 perfis de bandas distintos entre as
amostras provenientes dos pacientes do Grupo I (figura 8).
Na análise dos isolados seriados por paciente, os isolados dos
pacientes P1 apresentaram 2 perfis de bandas distintos, um perfil
proveniente da 1ª internação e 2 perfis de bandas na 2ª internação sendo
que um deles foi idêntico em ambas internações. O paciente P2, apresentou
resultado semelhante ao paciente P1. Os isolados do paciente P3
apresentaram dois perfis de bandas distintos um de cada internação (Figura
9).
A tabela 1 mostra, resumidamente, as diferenças de perfis de
bandas dos pacientes deste grupo.
43
Tabela 1. Síntese de dados dos isolados e perfis moleculares de C.
neoformans dos pacientes do Grupo I encontrados pelos métodos de
PFGE e PCR-RAPD.
Paciente
P1
P2
P3
Isolado-tempo
(dias)
Internação
Perfis de bandas (nº)
PFGE
RAPD
RAPD
in3
in4
a- 0
b - 10 dias
c - 20 dias
1ª
1
1•
1•
d -155 dias
e -160 dias
f - 163 dias
2ª
1
3•
2•
a–0
1ª
1•
1
1•
b - 75 dias
c - 84 dias
d - 86 dias
2ª
2•
2
2•
1ª
4
2
1
2ª
1
1
1
a- 0
b - 4 dias
c - 10 dias
d - 15 dias
e – 34 dias
• apresentaram 1 perfil de banda idêntico nas duas internações
44
Kb PM I
II III IV
V VI VII VIII IX
2200 –
1125750-
Figura 4A. Grupo I – perfis de bandas gerados por PFGE nos
isolados dos pacientes com mais de uma internação (I-IX). Gel de
agarose 1,1% corado por brometo de etídio. PM- marcador
molecular de S. cerevisiae.
Kb
I
II III IV
V VI VII VIII IX
2200 –
1 banda
2 bandas
1125-
3 bandas
750-
Figura 4B - Representação Esquemática da figura 4A.
45
Kb
PM
P1
P2
P3
1ª 2ª
1ª 2ª
2ª
1ª
2200-
1125750 -
#
2ª
Figura 5A. Grupo I – perfis de bandas gerados por PFGE nos isolados
seriados dos pacientes com mais de uma internação (P1, P2 e P3). Gel
de agarose 1,1% corado por brometo de etídio. PM- marcador
molecular de S. cerevisiae
Kb
P1
# internações
P2
P3
1 banda
2 bandas
2200-
3 bandas
1125750-
#
1ª 2ª
1ª 2ª
2ª
1ª
2ª
Figura 5B- Representação esquemática da Figura 5A.
46
1000-
500-
200-
Figura 6. Grupo I – total de perfis de bandas gerados por PCRRAPD com in3 nos isolados dos pacientes com mais de uma
internação (I-IX). Géis de poliacrilamida 3,5 % corados por brometo
de etídio. Marcador molecular 100pb
P1
P2
P3
pb
10001, 2
2
500-
200#
1, 2
1
2
2
1
2
Figura 7. Grupo I – perfis de bandas gerados por PCR-RAPD
com in3 dos isolados seriados dos pacientes com mais de
uma internação (P1, P2 e P3). Marcador molecular 100pb
# internações.
47
pb
I
II
III
IV
V
VI
1000-
500-
200-
Figura 8. Grupo I – total de perfis de bandas gerados por PCR-RAPD com
in4, nos isolados dos pacientes com mais de uma internação (I-VI). Géis de
poliacrilamida 3,5 % corados por brometo de etídio. Marcador molecular
100pb.
pb
P2
P1
P3
1000-
500-
200#
1,2
2
1,2
2
1
2
Figura 9. Grupo I – perfis de bandas gerados por PCR-RAPD com in4, nos
isolados seriados dos pacientes com mais de uma internação (P1, P2 e P3).
Marcador molecular 100pb
# internações
48
4.4. Análise molecular dos isolados dos pacientes do Grupo II
O Grupo II foi composto de 39 isolados de 9 pacientes (P4, P5,
P6, P7, P8, P9, P10, P11 e P12). Eles foram tratados na fase aguda da
seguinte forma: O paciente P9 recebeu Anfo B convencional e lipossomal e
os demais receberam Anfo B associado a FZ. Durante esta fase 4 pacientes
foram a óbito: P4, P5, P6, P7 e os demais passaram para a fase de
manutenção. Nesta fase, o paciente P11 recebeu AnfoB e os P8, P9, P10, e
P12 receberam FZ. O paciente P8 faleceu e os pacientes P9, P10, P11 e
P12 tiveram alta recebendo FZ. Foram recuperados os seguintes isolados:
do paciente P4, 2 isolados (a,b) com intervalo de coleta de 16 dias entre
eles. Do paciente P5, 4 isolados (a,b,c,d) com intervalos de 26 dias, 1 e 2
dias entre eles. Do paciente P6, 4 isolados (a,b,c,d) com intervalos de coleta
de 6 e 1 dia. Do paciente P7, 7 isolados (a,b,c,d,e,f,g) com intervalo de
coleta de 3, 1,4 e 1 dia. Do paciente P8, 2 isolados (a,b) com intervalo de
coleta de 20 dias. Do paciente P9, 8 isolados (a,b,c,d,e,f,g,h) com intervalo
de coleta de 5, 2, 3, 15 e 2 dias. Do paciente P10, 4 isolados (a,b,c,d), com
intervalo de coleta de 16, 8 e 7 dias. Do paciente P11, 4 isolados (a,b,c,d)
com intervalo de coleta de 2, 7 e 15 dias. Do paciente P12, 4 isolados
(a,b,c,d) com intervalo de coleta de 16, 5 e 9 dias. A síntese dos dados esta
expressa na tabela 2.
Os isolados do Grupo II geraram 9 perfis eletroforéticos na PFGE
(figura 10A). Para facilitar a visualização dos perfis de bandas foi
confeccionada a representação esquemática (figura 10B).
Os pacientes P8, P9 e P11 apresentaram dois perfis de bandas e
os demais um único perfil de banda. Quatro pacientes apresentaram
isolados com o mesmo perfil de banda (P5, P10, P11 e P12) (figura 11A). A
figura 11B, mostra a representação esquemática das bandas.
.
49
Os isolados do Grupo II geraram 13 perfis de bandas distintos na
PCR-RAPD utilizando-se o in3 (Figura 12).
A figura 13 mostra os perfis de bandas gerados pelo in3 nos
isolados seriados de cada paciente. Todos os isolados dos pacientes P4, P5,
P6, P7, P9 e P10 apresentaram um único perfil de banda. Os isolados dos
pacientes P8 e P12 apresentaram dois perfis e os isolados do paciente P11
três perfis distintos.
Com o in4 foram obtidos 13 perfis distintos entre os isolados
provenientes dos pacientes deste (figura 14).
Na análise dos isolados seriados de cada paciente, os isolados
dos pacientes P7, P9 e P10 apresentaram um único perfil de bandas e os
isolados dos pacientes P4, P5, P6, P8, P11 e P12 apresentaram dois perfis.
Os pacientes P4, P5 e P12 apresentaram isolados com perfis de bandas
idênticos (figura 15).
A tabela 2 mostra, resumidamente, as diferenças de perfis de
bandas dos pacientes deste grupo.
50
Tabela 2. Síntese dos dados e perfis moleculares, por PFGE e PCR-RAPD,
dos isolados dos pacientes do Grupo II.
Paciente
*P4
*P 5
*P 6
*P 7
*P 8
P9
P 10
P 11
P 12
Isolado-tempo
(dias)
a–0
b – 16
a-0
b- 26
c- 27
d- 29
a- 0
b–6
c–7
d–8
a- 0
b– 3
c– 4
d– 8
e– 9
f – 10
g – 11
a- 0
b- 20
a- 0
b- 5
c- 7
d - 10
e - 10
f - 25
g - 27
h- 29
a- 0
b – 16
c – 24
d – 31
a- 0
b- 2
c– 9
d – 23
a- 0
b – 16
c – 21
d - 30
Perfis de bandas (nº)
PFGE
RAPD
RAPD
in3
In4
1
1
2
1
1
2
1
1
2
1
1
1
2
2
2
2
1
1
1
1
1
2
3
2
1
2
2
* óbito
51
22001125 750 -
Figura 10A- Grupo II total de perfis de bandas gerados por PFGE nos
isolados dos pacientes com uma internação (I-IX). Gel de agarose 1,1%
corado por brometo de etídio. PM- marcador molecular de S. cerevisiae
I
Kb
II
III
IV
V
VI
VII VIII IX
22001 banda
2 bandas
1125 -
3 bandas
750 -
Figura 10B - Representação esquemática da figura 10A.
52
22001125 750 -
+
+
+
+
Figura 11A Grupo II – perfis de bandas gerados por PFGE nos isolados
seriados dos pacientes com uma internação (P4 a P12). Gel de agarose
1,1% corado por brometo de etídio. PM - marcador molecular de
S.cerevisiae
Kb
P4*
P5*
*óbito
P6*
P7*
+ perfis idênticos
P8*
P9
P10
P11
P12
22001 banda
2 bandas
1125 -
3 bandas
750 +
+
+
+
Figura 11B - Representação esquemática da figura 11A
53
bp I
II
III
IV V
VI VII VIII
IX X
XI XII XIII
1000500-
200-
Figura 12. Grupo II – total de perfis de bandas gerados por PCR-RAPD com
in3 nos isolados dos pacientes com uma internação (I a XIII). Géis de
poliacrilamida 3,5 % corados por brometo de etídio. Marcador molecular
100pb.
pb
P4*
P5* P6*
P7*
P8*
P9 P10
P11
P12
1000-
500-
200-
Figura 13. Grupo II – perfis de bandas gerados por PCR-RAPD com in3 nos
isolados seriados dos pacientes com uma internação (P4 a P12). Géis de
poliacrilamida 3,5 % corados por brometo de etídio. Marcador molecular
100pb. * óbito
54
pb
I
II
III
IV
V
VI
VII VIII
IX
1000-
- 1000
500-
- 500
200-
- 200
X XI
XII XIII
Figura 14. Grupo II – total de perfis de bandas gerados por PCR-RAPD
com in4 nos isolados dos pacientes com uma internação (I a XIII). Géis de
poliacrilamida 3,5 % corados por brometo de etídio. Marcador molecular
100pb.
1000500200+
+
+
Figura 15. Grupo II – perfis de bandas gerados por PCR-RAPD com in4
isolados seriados de pacientes com uma única internação internação (P4 a
P12). Géis de poliacrilamida 3,5 %
Marcador molecular 100pb
* óbito
corados por brometo de etídio.
+ perfis idênticos.
55
5. DISCUSSÃO
56
A epidemiologia da criptococose recorrente ainda é pouco
conhecida. Acredita-se que a maioria dos episódios de recorrência da
infecção seja devido à persistência da cepa infectante inicial, porém, não se
sabe a proporção dos casos de re-infecção com nova cepa. O entendimento
dessa distribuição pode contribuir para mudanças no esquema de
prevenção e tratamento da doença. Para diminuir o risco de re-infecção,
deve-se identificar e evitar possíveis fontes de exposição ambiental,
particularmente, em áreas urbanas onde o fungo é altamente prevalente.
Por outro lado, se a cepa que causou a infecção inicial for a causa de novas
infecções, então, deve-se desenvolver estratégias para melhorar a terapia e
efetiva erradicação da levedura (Spitzer et al., 1993; Haynes et al.,1995,
Brandt et al, 1996b; Sullivan et al., 1996).
A análise molecular dos isolados clínicos seriados de C.
neoformans é uma importante ferramenta no estudo da criptococose
recorrente. A revisão de literatura mostrou que os métodos moleculares
mais utilizados na caracterização genotípica foram PFGE e/ou PCR-RAPD
(Polachek et al., 1989; Spitzer et al., 1993; Perfect et al., 1993; Barchiesi et
al., 1995; Brandt et al., 1996a; Brandt et al., 1996b; Fries et al., 1996;
Franzot et al., 1997; Klepser et al., 1998; Sukroongreung et al., 2001). Neste
estudo optou-se pela aplicação de ambas metodologias. Porém, foi
necessário padronizar procedimentos nas diferentes etapas de ambas
metodologias para obtenção de perfis de bandas com boa discriminação.
Por ser mais laborioso, foram estudadas, inicialmente, as etapas
da extração de DNA cromossômico.
O primeiro passo foi estabelecer o tempo de incubação ideal para
que houvesse bom crescimento das leveduras e melhor ação da enzima
lítica. Este procedimento teve como base estudo conduzido por Wickes et al.
(1994), que demonstraram que o tempo ideal de crescimento é 16 a 20 h. Na
57
No período de incubação inferior a 16 h, as leveduras foram mais sensíveis à
ação da enzima e não produziram perfis nítidos. Por outro lado, nos períodos
superiores à 20h as células foram mais resistentes, resultando em bandas
pouco coradas pelo brometo de etídio devido à quantidade reduzida de DNA
liberada pela formação incompleta de protoplastos.
O segundo passo foi determinar a concentração de EDTA no
tampão de lise. Tanto C. neoformans quanto às enzimas utilizadas para
remoção da parede celular apresentam atividades nucleolíticas com isso, a
formação de bandas sofre variabilidade na corrida eletroforética devido à
degradação nucleolítica do DNA cromossomal. No tampão de lise foi utilizada
a concentração de 0,45M pois, altas concentrações de EDTA inibem a
atividade das DNAses (Varma et al., 1991; Wickes et al., 1994). Além disso,
a adição de citrato de sódio na solução de liberação de protoplastos (tampão
CES) eliminou a pré-incubação com β-mercaptoetanol ou dithilthreitol,
substâncias utilizadas para fragilizar a parede e permitir melhor ação da
enzima (Varma et al, 1991).
O terceiro passo foi escolher a enzima lítica. Como C. neoformans
apresenta cápsula polissacarídica e parede celular bem densa, para que o
material genético seja exposto é imprescindível que as leveduras tenham a
cápsula e parede celular digeridas para liberação dos protoplastos. A enzima
lítica de Trichoderma harzianum foi utilizada com base no estudo de Wickes
et al. (1994) que demonstraram ser esta mais efetiva que as enzimas
Novozyme (Novo Biolabs), e Mureinase (US Biochemical).
O quarto passo foi estabelecer as condições ideais para as
corridas eletroforéticas. No decorrer deste estudo foi possível observar que a
eletroforese em campo pulsado sofre variações que dependem da tensão da
rede elétrica em que está ligado o aparelho. Estas variações acarretaram
menor ou maior separação das bandas refletindo na determinação exata do
número de bandas. O uso de marcador molecular de Saccharomyces
58
cerevisiae, em todas as corridas, além de produzir perfil cromossômico
conhecido, permite o acompanhamento da corrida.
O quinto passo foi adotar critérios de leitura para determinar o
número de bandas. Cada banda corada pelo brometo de etídio correspondeu
a um cromossomo. As bandas coradas mais intensamente corresponderam a
dois cromossomos ou mais, dependendo da intensidade (Wickes et al., 1994;
Perfect et al., 1989).
A complexidade das etapas citadas acima pode explicar o fato de
não existir consenso quanto ao número exato de bandas encontradas na var.
neoformans. Os isolados analisados neste estudo apresentaram perfis
cromossômicos variando de 7 a 16 bandas mais, já foram descritas
variabilidade de 9 a 15 bandas cromossômicas (Perfect et al., 1989; Wickes
et al., 1994), 9 a 12 bandas (Barchiesi et al.,1995; Fries et al., 1996) e 6 a 11
bandas (Perfect et al., 1993). Com relação ao estudo comparativo entre os
perfis de bandas, de modo geral, existe consenso na análise visual das
bandas e na classificação dos isolados em idênticos, similares e diferentes
(Barchiesi et. al, 1995; Brandt et al.1996b; Franzot et al., 1997; Klepser et al.,
1998; Sukroongreung et al., 2001).
A extração de DNA para a PCR-RAPD iniciou-se a partir dos
protoplastos. A etapa adicional de lise da cápsula e parede celular
possibilitou uma excelente qualidade de DNA. Como a reprodutibilidade na
obtenção dos produtos amplificados é fator limitante na PCR-RAPD, a
otimização de cada um dos componentes da reação pode evitar este
problema (Sansinforiano et al., 2001). Optou-se pela utilização de Kit
comercial na tentativa de manter as concentrações dos reagentes sempre
constantes e também minimizar erros de pipetagem e contaminações. Esta
técnica utiliza a eletroforese horizontal para visualização dos produtos
amplificados e está menos sujeita às variações da rede elétrica que a PFGE.
As bandas produzidas são bem nítidas permitindo tanto leitura visual como
59
computadorizada. Como a PCR-RAPD utiliza iniciador aleatório não há
estimativa do número médio de bandas geradas. Diferentemente da PFGE,
os relatos de literatura não descrevem os critérios utilizados para
determinação do número de bandas e a classificação dos perfis idênticos,
similares ou diferentes. Então, neste trabalho, a contagem do número de
bandas não levou em conta a intensidade das bandas e os isolados foram
classificados como idênticos ou diferentes. Para melhorar a visualização das
bandas de menor massa molecular, a corrida eletroforética foi realizada em
gel de poliacrilamida.
Todos
os
54
isolados
analisados
foram
identificados
e
classificados como C. neoformans var. neoformans. Estes dados são
concordantes com outros relatos, principalmente brasileiros, que mostram
ser esta variedade a mais prevalente entre os pacientes imunossuprimidos,
em especial aqueles com aids (Mitchell et al., 1995; Rozenbaum et al., 1994;
Sullivan et al., 1996; Horta et al., 2002, Rezende, 2002; Martins, et al., 2003;
Nishikawa et al., 2003).
Além de verificar possíveis diferenças genéticas entre os isolados,
os métodos moleculares também podem ser utilizados para distinguir as
variedades e os sorotipos da espécie C. neoformans (Polachek et al., 1989,
Aoki et al., 1999; Rezende 2002; Wickes et al., 1994). Todos isolados foram
classificados como sorotipo A pela PCR- RAPD. Estes resultados foram
concordantes com outros relatos nacionais e internacionais, que indicam que
a infecção criptocóccica em pacientes com aids está associada ao sorotipo A
(Calvo et al., 1990; Nishikawa et al., 2003).
Os resultados obtidos, por ambas metodologias, sugerem que os
3 pacientes estudados no Grupo I possivelmente sofreram infecção mista
isto é, foram infectados por múltiplos isolados devido à presença de mais de
um perfil de banda. Os dados dos pacientes P1 e P2 reforçam esta hipótese
por apresentaram isolados com perfis idênticos na 1ª e 2ª internações.
60
Excetuando-se o paciente P2 e P3 que só tiveram um isolado recuperado da
1ª internação e 2ª internação, respectivamente, o paciente P1 apresentou
um único perfil de banda na 1ª internação por ambas metodologias. Tal
resultado não contradiz a hipótese de infecção por mais de um isolado
porque não se pode descartar o fato das colônias terem sido selecionadas
aleatoriamente.
A inclusão do Grupo II reforçou a idéia de que são freqüentes os
pacientes que se infectam com isolados diferentes uma vez que, apenas dois
pacientes (P7 e P10) se infectaram por uma única cepa. Acredita-se que
estes dados são bem consistentes pois, foram analisados 7 isolados do P7 e
4 do P10. Mais uma vez, não se pode descartar a idéia de que eles tenham
se infectado com cepas mistas mas, aleatoriamente, foi selecionada apenas
uma delas.
Nos demais pacientes, existem fortes evidências de que tenham
se infectado por mais de um isolado, caracterizando infecção mista.
As análises conjuntas dos perfis de banda obtidos pelas duas
metodologias permitiram a observação de macro e micro diferenças no
material genético dos isolados. A PFGE detectou diferenças cromossômicas
da ordem de kilo pares de base e a PCR-RAPD detectou alterações nas
seqüências de nucleotídeos. A utilização de dois iniciadores duplicou a
probabilidade de evidenciar essas pequenas alterações.
Estes dados são concordantes com outros (Fries et al.,1998) que
mostraram, pela PFGE, que 40% dos isolados seriados de C. neoformans de
pacientes com infecção crônica apresentavam pequenas diferenças nos
cariótipos. Este fenômeno foi reproduzido em laboratório demonstrando que
as mudanças no cariótipo ocorrem em algumas cepas durante infecção em
camundongos (Fries et al, 1996). Tais mudanças também foram observadas
”in vitro”, durante a manutenção da cepa em laboratório resultando na
atenuação da virulência (Franzot et al., 1998).
61
O motivo dessa alta diversidade genética ainda não está
totalmente esclarecido mais, é possível que o C. neoformans sofra
microevolução e passe a exibir novas características genotípicas e
fenotípicas para se adaptar as condições desfavoráveis do meio e escapar
da erradicação pelo sistema imune e assim continuar no organismo
(Sukroongreung et al.2001).
,As pesquisas sobre a criptococose recorrente indicam que as
infecções crônicas causadas por C. neoformans são freqüentes e difíceis de
erradicar, mesmo após terapia antifúngica prolongada. O mecanismo pela
qual C. neoformans persiste durante a infecção não está claro (Fries et al.,
1998). Os estudos de suscetibilidade a drogas antifúngicas de isolados
seriados não mostraram diferenças significativas entre MICs e, sugerem
que a persistência da infecção não está relacionada ao desenvolvimento de
resistência a estas drogas (Brandt et al., 1996b; Spitzer et al, 1993). Os
dados sobre a prova de sensibilidade resgatados do estudo de Pappalardo
(2002) mostraram que todos os isolados analisados aqui foram sensíveis a
Anfo B e apenas dois pacientes tiveram alteração nos MICs. No paciente P5
(Grupo II) o primeiro isolado foi sensível ao FZ e os demais resistentes. O
paciente P6 (Grupo II) alternou entre isolados sensíveis e resistentes a 5-FC
levantando a hipótese de infecção mista.
Estudo molecular anterior demonstrou a presença de mesmo perfil
de banda entre isolados ambientais e clínicos de C. neoformans reforçando
a idéia de que a infecção criptocóccica pode ser adquirida de reservatórios
ambientais (Currie et al., 1994).
Contudo, os relatos mostraram-se divergentes com relação ao
grau de diversidade. Estudos envolvendo isolados brasileiros, utilizando a
PCR-RAPD, verificaram alta diversidade genética em isolados ambientais de
Porto Alegre e Santa Cruz do Sul-Rio Grande do Sul e baixa nos isolados
clínicos de Porto Alegre e Belo Horizonte (Horta et al.,2002). Rezende (2002)
62
obteve perfis com grande variabilidade nos isolados das regiões de
Araraquara e Ribeirão Preto no Estado de São Paulo. Por sua vez, Vivaldini
(2003) e Aoki et al. (1999) demonstraram alto grau de similaridade dentre os
isolados das cidades de São José do Rio Preto e Campinas respectivamente,
ambas no Estado de São Paulo. Igreja (1999) encontrou resultados similares
em isolados do Rio de Janeiro. Franzot et al. (1997) também encontraram
baixa diversidade genética entre os isolados de C. neoformans das cidades
de Belo Horizonte e Rio de Janeiro quando comparadas com isolados de
Nova Iorque.
Os pacientes deste estudo residiam na cidade de São Paulo há
muitos anos. Trata-se de área urbana que oferece condições de exposição
ao fungo pela conhecida associação C. neoformans var. neoformans e
excretas de pombos. Este fato pode ter propiciado a inalação das leveduras
ao longo de anos. Por ocasião da imunodepressão causada pela aids surgiu
a doença. Garcia-Hermoso et al. (1999) evidenciaram período de latência
entre a infecção inicial assintomática e
posterior reativação da infecção
quando do diagnóstico de aids. Estudos sorológicos também demonstraram
que a infecção subclínica por C.neoformans é comum em pacientes
imunocompetentes (Houpt et al 1994).
Pelo que foi discutido acima parece que a prevalência da infecção
é alta mais a incidência de criptococose é relativamente baixa do que se
conclui que os mecanismos de defesa do hospedeiro normal são altamente
efetivos para prevenir a doença. Com a aquisição do HIV e posterior
desenvolvimento da aids, focos quiescentes desta levedura podem ser
reativados. Os pacientes deste estudo apresentavam contagem de CD4
menor que 100 células, indicando imunodeficiência grave, comprometendo a
imunidade mediada por células e oferecendo o “oportunismo” que C.
neoformans necessita para causar a doença.
63
Os dados apresentados aqui apontam para a hipótese de que os
pacientes foram infectados por mais de uma cepa de C. neoformans o que
pode contribuir para falhas terapêuticas. Por outro lado, não se pode
descartar a hipótese de que o fungo tenha sofrido microevolução para se
manter no organismo do hospedeiro levando a mudanças genéticas
observadas nos perfis de bandas.
64
e
6. CONCLUSÕES
65
Conclui-se com este trabalho que:
Os pacientes com aids foram infectados pelo Cryptococcus
neoformans var. neoformans sorotipo A.
Os isolados seriados destes pacientes apresentaram uma grande
variabilidade genética.
Com exceção de dois pacientes que provavelmente foram
infectados por uma única cepa, os demais foram infectados por múltiplas
cepas, independente de terem saído ou não hospitalização.
O mais provável é que os indivíduos inalem diferentes “cepas” ou
“isolados” em diferentes períodos. Numa imunossupressão, como no caso
da aids, diferentes isolados se multipliquem causando a doença. Existem a
seu favor os mecanismos de evasão para sobreviverem ao sistema imune.
Portanto, numa recorrência podem ocorrer situações diferentes.
A análise conjunta de duas técnicas moleculares facilitou a
interpretação dos resultados.
66
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
67
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8. ANEXOS
84
8.1. Anexo 1- Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de
Infectologia “Emílio Ribas”
8.1. Anexo 1- Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Infectologia
“Emílio Ribas”
85
8.2. Anexo 2- Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Adolfo
Lutz
86