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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO Período: Setembro/2014 a Agosto/2015 ( ) PARCIAL (X) FINAL IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO Título do Projeto de Pesquisa: (ao qual está vinculado o Plano de Trabalho): ANÁLISES FITOQUÍMICA E FARMACOGNÓSTICA DE ESPÉCIES AMAZÔNICAS: Petivera alliacea L. e Eupatorium ayapana V. Nome do Orientador: Marcieni Ataíde de Andrade Titulação do Orientador: Doutora Faculdade: Farmácia Unidade: Instituto de Ciências da Saúde – ICS Laboratório: Farmacognosia Título do Plano de Trabalho: Composição química de frações obtidas de extratos com diferentes polaridades de Eupatorium ayapana V. Nome do Bolsista: Daniele Hidemi Okabe Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/CNPq ( ) PIBIC/CNPq-AF ( ) PIBIC/UFPA - AF ( ) PIBIC/UFPA-AF ( ) PIBIC/INTERIOR (X) PIBIC/FAPESPA ( ) PARD ( ) PARD – renovação ( ) PADRC ( ) Bolsistas PIBIC do edital CNPq 001/2007 RESUMO DO RELATÓRIO ANTERIOR AVALIAÇÃO SAZONAL DA EXPRESSÃO DE CUMARINA EM Eupatorium ayapana V. (ASTERACEAE) Eupatorium ayapana V. (Asteraceae) é uma espécie vegetal da Amazônia, conhecida popularmente por Japana, bastante utilizada na medicina tradicional. A principal classe de metabólito secundário desta espécie é das cumarinas. Por isso, esse estudo avaliou a influência da sazonalidade na expressão de cumarinas por esta planta. O material vegetal foi coletado em dois períodos (seco e chuvoso) no município de Acará-PA. Para obtenção da droga vegetal foi selecionado partes aéreas da espécie e submetidas ao processo de secagem, pulverização e extração consecutiva com solventes de polaridade crescente (hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol). Os extratos foram analisados por Cromatografia de Camada Delgada (CCD), utilizando a cumarina 1,2-benzopirona como padrão, onde os extratos com melhores perfis de cumarinas foram selecionados para análise espectrofotométrica. Realizou-se uma varredura espectral no intervalo de 280 nm a 400 nm para selecionar o comprimento de onda e comparar espectros dos extratos e padrão. Determinou-se a absorbância de diferentes diluições do padrão, no comprimento de onda selecionado, para obtenção da curva de calibração e quantificou-se o teor de cumarinas nos extratos. Dentre os extratos analisados por CCD, o de diclorometano e de acetato de etila apresentaram os melhores perfis de cumarinas, que foram selecionados para análises espectrofotométricas. Na varredura espectral o padrão de cumarina apresentou dois picos de absorção (289 e 313 nm), sendo selecionado o de maior absorção. A curva de calibração apresentou correlação linear entre a concentração e absorbância, deste modo, foi possível constatar que o teor de cumarinas nos extratos do período chuvoso foi maior do que nos extratos do período seco, demonstrando que a sazonalidade pode exercer efeito positivo na produção de cumarinas pela planta e permitindo sugerir que o melhor período de coleta para E. ayapana V. é o chuvoso. Palavras chave: Eupatorium ayapana V., cumarinas, sazonalidade. INTRODUÇÃO A utilização de plantas e produtos naturais no tratamento de doenças é uma prática que sempre esteve presente no decorrer da história da humanidade. O emprego de plantas medicinais para a manutenção e a recuperação da saúde tem ocorrido ao longo dos tempos, desde as formas mais simples de tratamento local até as formas tecnologicamente sofisticadas de fabricação industrial (MELO, 2012). As plantas medicinais apresentam ampla diversidade de metabólitos secundários com diferentes atividades biológicas (SIMÕES et al. 2003). Mediante o consumo cada vez mais frequente de plantas medicinais, sob forma de chás e/ou cápsulas, estudos devem ser desenvolvidos a fim de avaliar a sua composição (ANDRADE et al, 2005). A família Asteraceae pode ser considerada uma das mais importantes fontes de espécies vegetais de interesse terapêutico, dado o grande número de plantas pertencentes a ela com uso medicinal (MELO, 2012). Asteraceae é uma das maiores famílias de plantas e compreende cerca de 1.600 gêneros e 23.000 espécies (ANDENBERG et al, 2007). Na região amazônica, Eupatorium ayapana Veuten (Asteraceae) é uma das espécies da família bastante utilizada com fins terapêuticos, possuindo atividade antimicrobiana (GUPTA et al. 2002), antioxidante (BEPARI et al. 2013), hemostática (DI STASI, 1989) e antidiarreica (CORRÊA, 1984). Eupatorium triplinerve e Ayapana triplinervis são sinonímias da espécie, que na região é conhecida popularmente como Japana. Estudos acerca da espécie E. ayapana apontam classes de constituintes isolados do extrato das folhas, sendo eles: cumarinas e esteroides (GUPTA et al. 2002). Os compostos ativos que já foram isolados e identificados pertencem majoritariamente à classe das cumarinas (CHATURVEDI e MULCHANDANI, 1989; NATAJARAM e NATAJARAM, 1979; BOSE e ROY, 1936, GARG e NIGAM, 1970; TRANG et al., 1992, 1993). Outros estudos já identificaram diversos tipos de derivados triterpênicos e derivados aromáticos no óleo essencial da espécie (GUPTA et al., 2004; MAIA et al., 1999; GAUVIN-BIALECKI & MARODON, 2008; GARG e NIGAM, 1970; GARG e NAKHARE, 1993; BEGUM et al., 2010). JUSTIFICATIVA A ampliação das opções terapêuticas ofertadas a população, com garantia de acesso a plantas medicinais, fitoterápicos e serviços relacionados à fitoterapia, com segurança, eficácia e qualidade, na perspectiva da integralidade da atenção à saúde, é uma importante estratégia com vistas à melhoria da atenção à saúde da população e a inclusão social. Tratando-se de uma prática que estimula a participação direta da população no processo saúde-doença, propomos realizar uma avaliação de espécies amazônicas sobre o sistema nervoso central enfocando análises comportamentais, fitoquímicas e antioxidantes. Quanto mais detalhadas forem as informações, maiores serão as chances de a pesquisa trazer subsídios de interesse para se avaliar não somente a eficácia, mas garantir segurança ao uso de plantas medicinais e dos seus produtos fitoterápicos. Sabe-se que o Brasil é o país de maior biodiversidade do planeta que, associada a uma rica diversidade étnica e cultural que detém um valioso conhecimento tradicional associado ao uso de plantas medicinais, tem o potencial necessário para desenvolvimento de pesquisas com resultados em tecnologias e terapêuticas apropriadas. Dentre o arsenal da biodiversidade da flora encontrado na região amazônica destacamos as espécies medicinais encontradas na região do estado do Pará, com sua amplitude para tratar diversos males, enfermidades entre outros usos. Muitas destas plantas possuem alegação de uso para atuarem no Sistema Nervoso Central (SNC) como Mucuracaá, Japana, Marapuama, entre outras. Tais alegações precisam ser confirmadas a fim de contribuírem para a utilização segura e eficaz das espécies medicinais. Estudos na área comportamental com plantas da biodiversidade amazônica são escassos, evidenciando uma lacuna no conhecimento científico da utilização de espécies nativas da região amazônica. Sendo estudo de utilização de plantas medicinais estratégico para nosso país, este projeto propõe através de suas ações, auxiliar no aprimoramento desta ação governamental e contribuir para o conhecimento e a prática utilizada pela população amazônica, viabilizando não apenas maior acesso a medicamentos, mas também garantir maior confiabilidade no uso seguro e aos possíveis riscos à saúde. Como o desenvolvimento do projeto proposto, os resultados obtidos pela equipe poderão beneficiar toda a população amazônica que faz uso de plantas medicinais no tratamento de diversas enfermidades através da prática popular. Assim como os órgãos da área da saúde e mesmo ambientais do Estado do Pará que poderão utilizar os resultados como subsídios na avaliação da utilização de tais plantas. Um dos objetivos maiores deste trabalho é fornecer dados que possam servir de suporte para programas de produção de fármacos e certificação de produtos naturais, garantido a melhoria da qualidade de vida da população. Desta forma, este projeto pleiteia dentro do seu contexto se unir as linhas e diretrizes da Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, aprovada por meio do Decreto Nº 5.813, de 22 de junho de 2006, que estabelece objetivos comuns voltados à garantia do acesso seguro e uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos em nosso país, ao desenvolvimento de tecnologias e inovações, assim como ao fortalecimento das cadeias e dos arranjos produtivos, ao uso sustentável da biodiversidade brasileira e ao desenvolvimento do Complexo Produtivo da Saúde. OBJETIVO GERAL Caracterizar a composição química de frações obtidas a partir de extratos com diferentes polaridades de Eupatorium ayapana V. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Obter extratos de diferentes polaridades: atividade realizada; Realizar a avaliação fitoquímica dos diferentes extratos extratos de Eupatorium ayapana V: atividade realizada; Realizar o fracionamento dos extratos por cromatografia líquida nos extratos de Eupatorium ayapana V: atividade realizada; Traçar o perfil cromatográfico das frações por Cromatografia de Camada Delgada atividade realizada; Determinar o teor de cumarinas nas frações por espectrofotometria: atividade não desenvolvida por falta de recursos, em compensação foi realizado uma varredura espectral das frações. MATERIAIS E MÉTODOS COLETA E IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL VEGETAL A espécie Eupatorium ayapana V. foi coletada em abril de 2014 no município de Acará-PA. Amostras do material vegetal foram selecionadas para preparação de exsicatas que tiveram identificação botânica realizada por especialistas do Herbário João de Mursa Pires do Museu Paraense Emílio Goeldi, onde se encontra depositada com o número de registro MG123913. OBTENÇÃO DA DROGA VEGETAL As amostras de partes aéreas do material vegetal foram cuidadosamente selecionadas, lavadas com água corrente e submetidas à secagem em temperatura ambiente por 24 horas e estufa com fluxo de ar forçado (40ºC) durante 48 horas. O material resultante foi pulverizado em um moinho de facas para obtenção da droga vegetal. ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS DA DROGA VEGETAL A análise físico-química da droga vegetal foi realizada por meio de determinações dos teores de umidade, cinzas totais e insolúveis através de técnicas preconizadas pela Farmacopéia Brasileira (2010). Os resultados expressam a média de três determinações para cada amostra de droga vegetal. PREPARAÇÃO DE EXTRATOS DE DIFERENTES POLARIDADES A droga vegetal foi submetida à extração, com solventes de diferentes polaridades (Hexano, Acetato de etila e Metanol), através do processo de maceração. Os extratos obtidos foram concentrados em evaporador rotativo para eliminação dos solventes. PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA DOS DIFERENTES EXTRATOS OBTIDOS Os diferentes extratos e a droga vegetais foram submetidos a testes de prospecção fitoquímica para identificação de grupos de constituintes químicos (MATOS, 1997; COSTA, 1987), sendo os seguintes: alcaloide; polifenóis; esteroides e terpenóides; cumarinas; flavonoides; antraquinonas. Para cada classe de compostos, preparou-se uma solução extrativa de uma droga vegetal padrão que foi utilizada como controle positivo. A prospecção fitoquímica foi realizada por CCD, para isso foram utilizadas cromatoplacas de alumínio recobertas por sílica gel 60G F254 Merck, o sistema de eluente e reveladores utilizados para cada constituinte químico estão representados no Quadro 1. Quadro 1. Droga vegetal padrão, substância química padrão, sistema de eluentes e reveladores utilizados para cada constituinte químico na CCD. Constituinte Substância Droga vegetal padrão Sistema de eluente Revelador químico padrão 1. Tolueno:acetato de Alcalóides Pilocarpina etila:dietanolamina A. Dragendorff (70:20:10) B. Solução 2. Tolueno:acetato de Flavonóides Citrus sinensis Quercetina metanólica de etila:metanol:ácido cloreto de alumínio fórmico (75:25:10:6) 2% C.Solução Compostos Stryphnodendron 3.Tolueno:acetato de Ácido Tânico metanólica de fenólicos adstringens etila:metanol:ácido cloreto férrico fórmico (40:30:30:10) (FeCl3) 1% Esteróides e 4. Tolueno: D.Reativo de Panax ginseng terpenóides clorofórmio:metanol Liebermann(40:40:10); burchard 5. Tolueno:éter (1:1), E. Solução 1,2 – Cumarinas saturado com ácido etanólica de benzopirona acético glacial 10%. hidróxido de potássio 10% E. Solução 6. Acetato de Antraquinonas Rhamnus purshiana etanólica de etila:metanol:água hidróxido de (100:13,5:10); potássio 10% FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS O extrato com melhor perfil cromatográfico para cumarinas foi submetido à partição por Cromatografia Líquida em Coluna (CLC). Utilizou-se uma coluna de vidro preenchida por sílica gel 60 (70-230 mesh ASTM) e a eluição foi realizada com diferentes proporções dos solventes hexano, acetato de etila e metanol. Os parâmetros utilizados neste fracionamento estão detalhados no Quadro 2. As frações foram concentradas em evaporador rotativo. Quadro 2. Parâmetros utilizados para fracionamento do extrato de acetato de etila por CLC. Parâmetros Especificações Altura da coluna 40 cm Diâmetro da coluna 4 cm Massa de sílica gel 100 g Amostra de extrato 4,5 g Fase móvel 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Volume de fase móvel 500 mL Hexano:acetato de etila (9:1) Hexano:acetato de etila (7:3) Hexano:acetato de etila (1:1) Acetato de etila (100%) Acetato de etila:metanol (1:1) Metanol:acetato de etila (7,5:2,5) Metanol (100%) PERFIL CROMATOGRÁFICO DAS FRAÇÕES Baseados em métodos proposto por Wagner e Bladt (2001) e Costa (1987), foi realizado um perfil de detecção cromatográfica por Cromatografia de Camada Delgada (CCD) nas frações coletadas por CLC para detecção de cumarinas. O sistema de solvente utilizado foi hexano:acetato de etila (8:2) sob luz UV-365 nm a fim de detectar a presença de cumarinas, que é evidenciada pela formação de mancha verde-fluorescente e/ou a azulfluorescente. As frações que apresentaram estas manchas foram selecionadas para a continuidade das análises. VARREDURA ESPECTRAL O extrato de acetato de etila e as frações foram diluídos em metanol para concentração de 1 mg/mL e foram submetidos à uma varredura em espectrofotômetro (PerkinElmer/Lambda 650) no intervalo de comprimento de onda entre 700 nm a 190 nm com diminuição regressiva de 0,1 nm, modo leitura rápida, utilizando cubetas de quartzo com 1,0 cm de caminho óptico. Deste modo, compararam-se os espectros das frações e do extrato. RESULTADOS E DISCUSSÃO ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS DA DROGA VEGETAL O teor de umidade está apresentado na tabela 1. Observa-se que o valor da média está entre 8 e 14%, estando de acordo com a Farmacopeia Brasileira. O excesso de água nas amostras é prejudicial para sua qualidade, pois favorece a atividade enzimática e a proliferação de microrganismos que poderão decompor os princípios ativos da planta (NASCIMENTO et al. 2005, apud BACCHI, 1996). Os teores de cinzas totais e insolúveis estão apresentados na Tabela 1. A determinação do teor de cinzas permite a verificação de impurezas inorgânicas não voláteis que podem estar presentes como contaminantes (FARIAS, 2003). Assim, os resultados de cinzas totais da droga mostram que a presença de materiais inorgânicos é pequena, estando a droga adequada para sua utilização. O teor de cinzas insolúveis também apresentou baixo índice. As cinzas insolúveis em ácido clorídrico permitem a verificação de contaminantes como resíduo de terra ou areia (FARIAS, 2003). Tabela 1. Resultado da análise físico-química da droga vegetal. Análise Teor de umidade Teor de cinzas totais Teor de cinzas insolúveis Média ± Desvio Padrão 10,733 ± 0,002 % 5,667 ± 0,001 % 0,033 ± 0,033 % RENDIMENTO DOS EXTRATOS Os rendimentos dos extratos são demostrados na Tabela 2. Observa-se que o metanol extraiu uma quantidade maior de metabólitos, permitindo sugerir que a planta possua em maiores quantidades constituintes polares. Em contrapartida, o hexano apresentou o menor rendimento, evidenciando uma quantidade pequena de constituintes apolares. Tabela 2. Rendimento percentual (m/v) dos extratos obtidos. Extrato Hexano Acetato de etila Metanol Rendimento 1,16% 2,29% 5,17% PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA A detecção fitoquímica foi realizada nos extratos e na droga vegetal com o intuito de comparar o perfil fitoquímico, assim a detecção para a droga foi realizada de modo direcionado para cada metabólito. Os diferentes extratos e a droga vegetal foram submetidos a uma série de reações de caracterização fitoquímica, os resultados de metabólitos secundários analisados nos extratos e na droga vegetal estão apresentados na Tabela 3. Observou-se a presença de cumarinas, polifenóis, esteroides e triterpenos nos extratos e na droga vegetal. Houve diferença em relação à presença de O-heterosídeos e C-heterosídeos, no extrato o resultado foi negativo e na droga vegetal foi positivo, esse resultado pode ser atribuído aos diferentes métodos de extração. Tabela 3. Prospecção fitoquimica nos extratos da E. ayapana. Grupo químico Indicador Extratos Hexano Alcaloides (C. calisaya) Antraquinonas (R. purshiana) Flavonoides (C. sininsis) Esteroides e triterpenos (P. ginseng) Cumarinas Dragendorff Bouchadart Mayer Complexação com ácido tânico Reação para identificação de Antraquinonas Livres Reação para identificação de Oheterosídeos Reação para identificação de C-heterosídeos Shinoda Hidróxido de sódio Cloreto de alumínio Reação oxalo-bórica Reação de liebermann bouchardat Hidróxido de Potássio . - Acetato de etila - Metanol Droga vegetal Padrão - - +++ +++ +++ - - - - +++ - - - - +++ NA NA - +++ +++ NA NA - + +++ - - - +++ +++ +++ - - - - +++ ++ + + + + +++ ++ +++ +++ * Cloreto férrico NA NA + ++ +++ Acetato de cobre NA NA + ++ +++ Acetato de chumbo NA NA + ++ +++ Complexação com NA NA + ++ +++ gelatina NA: Não aplicável; (+): Pouco reativo; (++): Reativo; (+++): Fortemente reativo; (-): Negativo; *: A própria droga vegetal é considerada padrão. Polifenóis (S. adstringens) A prospecção fitoquímica realizada por CCD nos extratos e na droga vegetal pode ser observada na Tabela 4. A Figura 1 e 2 da Tabela 4 apresentam o perfil cromatográfico para cumarinas. Na Figura 1, observa-se mancha azul-fluorescente nas aplicações dos extratos de diferentes polaridades e extrato etanólico direcionado. A Figura 2 apresenta a placa após revelação, no qual, observa-se o padrão de cumarina com mancha verde fluorescente, assim como, mancha azul-fluorescente de mesmo fator de retenção. Segundo WAGNER e BLADT (2001), as cumarinas substituídas podem ser visualizadas na cor azul-verde brilhante sob luz UV 365 nm, diferentemente das cumarina não substituídas que somente apresentam fluorescência após tratamento com KOH, sendo esta fluorescência verde-amarelo. Logo, infere-se que as cumarinas presentes nos extratos e droga vegetal são derivados substituídos. Na Tabela 4, a Figura 3 e 4 apresenta o perfil cromatográfico para antraquinonas livres e heterosídeos, observa-se a presença de banda vermelha nas aplicações A e E e banda marrom na aplicações C e D na Figura 3; e na Figura 4 somente na aplicação D. Conforme WAGNER e BLADT (2001), utilizando sistema de eluente e revelador semelhantes aos utilizados, as antraquinonas aparecem em bandas vermelhas ou marrons na luz visível. As aplicações A, C e E da Figura 3 e a aplicação D da Figura 4 são de padrões de antraquinonas, sendo assim, observou-se a presença de antraquinonas apenas na solução etérea do extrato ácido de E. ayapana (aplicação D na Figura 3). Permitindo sugerir a presença de compostos antraquinônicos O-heterosídeos na droga vegetal e a ausência desses compostos nos diferentes extratos. O perfil cromatográfico para esteroides e triterpenos está apresentado na Figura 5 da Tabela 4, observa-se que o comportamento dos diferentes extratos da E. ayapana é semelhante ao extrato hidroalcoolico de Panax Giseng, com as mesmas cores e fatores de retenção, permitindo assim, sugerir a presença de esteroides e triterpenos na espécie E. ayapana. O fator de retenção é a razão entre a distância percorrida pela substância em questão e a distância percorrida pela fase móvel, segundo Braz et al. 2011, todas as identificações por CCD são baseadas no fator de retenção e na comparação da cor das manchas entre amostra e um padrão, quando a placa é borrifada com um revelador específico. No perfil cromatográfico para alcaloides na Figura 6 da Tabela 4, observa-se que o padrão apresentou uma banda na coloração laranja visualizados em luz visível e os diferentes extratos da E. ayapana não apresentaram essas bandas. Segundo Wagner e Bladt (2001), a presença de bandas laranja-marrom em luz visível indica a presença de alcaloides, ao empregar o mesmo sistema de eluente e revelador. Assim, sugere-se a ausência deste metabólito na E. ayapana. O perfil cromatográfico para flavonoides está apresentado na Figura 7 da Tabela 4, verificou-se que a quercetina e o extrato etanólico de C. sinensis, padrões de flavonoides, apresentaram comportamentos distintos aos extratos de E. ayapana quando visualizados sob luz UV de 365 nm, apresentando bandas com fatores de retenção diferentes. Assim, os resultados permitiram sugerir a ausência de flavonoide na espécie E. ayapana. Na Figura 8 da Tabela 4, observa-se a CCD para polifenóis, no qual se constatou que o extrato e a solução aquosa da E. ayapana apresentam perfis cromatográficos muito semelhantes ao do padrão e da droga vegetal padrão, com bandas marrons em luz visível e com o mesmo fator de retenção, permitindo assim sugerir a presença de polifenóis. Com exceção dos compostos antraquinônicos, todos os metabólitos testados apresentaram resultados semelhantes quando comparadas as diferentes técnicas de detecção, CCD, prospecção fitoquímica dos extratos e prospecção fitoquímica direcionada com a droga vegetal. Tabela 4. Resultados das análises cromatográficas nos extratos e droga vegetal realizados com sistemas de eluentes e reveladores citados na Tabela 1. Cont. Fig. 1. Cumarinas. A B C D E A: Extrato hexânico; B: Extrato de acetato de etila; C: Extrato metanólico; D: Extrato etanólico da E. ayapana. E: Padrão (1,2-benzopirona 1mg/mL) Eluente: 5 Revelador: Não utilizado Fig. 2. Cumarinas. A B C D E A: Extrato hexânico; B: Extrato de acetato de etila; C: Extrato metanólico; D: Extrato etanólico da E. ayapana. E: Padrão (1,2-benzopirona 1mg/mL) Eluente: 5 Revelador: E Tabela 4. Resultados das análises cromatográficas nos extratos e droga vegetal realizados com sistemas de eluentes e reveladores citados na Tabela 1. A: Solução etérea de R. purshiana Fig. 4. Antraquinonas. Fig. 3. Antraquinonas. (Antraquinonas livres); B: Solução etérea de E. ayapana; A B C D E A B C D E F C: Solução etérea do extrato ácido de R. purshiana (O- heterosídeos); D: Solução etérea do extrato ácido de E. ayapana; E: Fase clorofórmica do extrato tratado com FeCl3 de R. purshiana (C- heterosídeos); F: Fase clorofórmica do extrato tratado com FeCl3 de E. ayapana. A: Extrato do metanólico; B: Extrato de acetato de etila; C: Extrato Hexânico; D: Extrato hidroalcoolico R. purshiana. E: Extrato hidroalcoolico E. ayapana Eluente: 6 Revelador: E Eluente: 6 Revelador: E Fig. 5. Esteróis e Triterpenos. A B C D E Fig. 6. Alcalóides. A: Extrato hidroalcoolico de Panax Giseng; B: Extrato etanólico de E. ayapana; C: Extrato hexânico; D: Extrato de acetato de etila; E: Extrato metanólico. A B C D Eluente: 1 Revelador: A Eluente: 4 Revelador: D Fig. 7. Flavonóides. A B C D E F A: Extrato hexânico; B: Extrato de acetato de etila; C: Extrato metanólico; D: Padrão (pilocarpina 1mg/mL) Fig. 8. Polifenóis. A: Extrato hexânico; B: Extrato de acetato de etila; C: Extrato metanólico; D: Extrato etanólico de C. sinensis; E: Extrato etanólico de E. ayapana; F: Padrão (quercetina 0,3 mg/mL). Eluente: 2 Revelador: B A B C D A: Extrato metanólico B: Padrão ( solução metanólica de ácido tânico) C: Extrato aquoso de S. adstringens D: Extrato aquoso de E. ayapana. Eluente: 3 Revelador: C PERFIL CROMATOGRÁFICO DAS FRAÇÕES O extrato de acetato de etila foi selecionado, pois apresentou o melhor perfil cromatográfico para cumarinas e foi submetido a fracionamento por CLC, onde obteve-se um total de 13 frações. O perfil cromatográfico das frações obtidas por CLC pode ser visualizado na Figura 9. Observa-se que as frações de 4 a 10 apresentaram duas manchas sugestivas de cumarinas, uma verde-fluorescente de menor intensidade e outra azul-fluorescente de maior intensidade, sugerindo a presença de diferentes tipos de compostos cumarínicos. Fr 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Figura 9. Perfil cromatográfico por CCD das frações obtidas por CLC sob luz UV 365 nm. As frações foram reunidas conforme semelhanças nas características cromatográficas por CCD e no perfil de pigmentação das frações em luz visível (Tabela 5). Sendo as frações de 4 a 10 selecionadas para varredura espectral. Tabela 4. Reunião e rendimento em miligramas (mg) das frações obtidas por CLC. Frações Rendimento (mg) Frações 1 e 2 599 Fração 3 518 Fração 4 201 Fração de 5 a 9 1431 Fração 10 1036 Fração 11,12,13 176 VARREDURA ESPECTRAL A varredura espectral realizada com o Extrato de Acetato de Etila no comprimento de onda de 190 a 700 nm está apresentado na figura 10. Observa-se a presença de quatro picos principais, sendo eles no comprimento de onda de 233 nm, 293 nm, 346 nm e 408 nm. Figura 10. Varredura espectral do Extrato de Acetato de Etila no comprimento de onda de 190 a 700 nm. O perfil espectral das frações obtidas por CLC submetidas à varredura em espectrômetro (190 a 700 nm) pode ser observado na Figura 16. Observa-se que a fração reunida (5 a 9), quando comparados as demais frações, apresentou picos de absorção mais elevados, fato previsto conforme a diferença observada no perfil cromatográfico das frações (Figura 9). Figura 11. Varredura espectral das frações obtidas por CLC no comprimento de onda de 190 a 700 nm. A escopoletina, derivado cumarínico, possui picos de absorção no comprimento de onda de 226 nm, 296 nm, 338 nm e 339 nm (BATH et al. 2011), comportamento similar ao obtido na varredura espectral do extrato de Acetato de etila e na fração reunida. Segundo Krauter et al. 2013, dependendo do solvente utilizado e do substituinte da cadeia lateral da base estrutural de cumarina (1,2-benzopirona) ocorre a interferência de emissão e absorção do derivado cumarínico. Em relação ao solvente, conforme Marcolan et al. 2011, quanto maior a polaridade dos solventes melhor a intensidade do sinal espectral, facilitando a interação da luz UV com o derivado cumarínico, justificando a utilização do metanol em todas as análises espectrofotométricas. Assim, os picos de absorção do extrato de Acetato de Etila e da fração reunida sugere a presença de um ou mais derivados cumarínicos. Ao todo, sete tipos de cumarinas foram isolados em E. ayapana: a ayapanina, ayapina, dafnetina, éter dimetil dafnetina, éter 7-metildafnetina, hidragetina e umbeliferona. (GAUVIN-BIALECKI, 2009; TAYLOR, 2006), permitindo sugerir a presença de ayapina em E. ayapana. CONCLUSÃO Os parâmetros de qualidade para droga vegetal foram estabelecidos por análises físicoquímicos. Na prospecção fitoquímica por testes colorimétricos, precipitação e CCD, detectou-se a presença de cumarinas, polifenóis, esteroides e triterpenos nos extratos e na droga vegetal e de heterosídeos antraquinônicos apenas na droga vegetal. Sendo que o perfil cromatográfico de cumarinas permitiu selecionar o extrato acetato de etila para fracionamento. Por CLC foram obtidas 13 frações, e após análise as frações 4 a 10 foram selecionadas por apresentar duas manchas sugestivas de cumarinas, uma verde-fluorescente e outra azulfluorescente, que após análise por CCD (UV 365 nm) foram identificadas como frações cumarínicas, e foram reunidas de acordo com semelhanças no perfil cromatográfico e na coloração. Na varredura espectral das frações e extrato de acetato de etila observou-se que a fração reunida e o extrato de acetato de etila apresentou comportamento semelhante a compostos cumarínicos, como a ayapina e a escopoletina, com picos de absorção correspondentes, permitindo assim sugerir a presença de ayapina em E. ayapana. REFERÊNCIAS ANDENBERG, A.A., et al. Compositae. Pg. 61- 588. In: J.W. Kadereit & C. Jeffrey (Eds.). Flowering Plants Eudicots Asterales, Vol. VIII. The Families and Genera of Vascular Plants, K. Kubitzki (Ed.). Springer – Verlag. 2007. ANDRADE, E. C. B. de; ALVES, S. P.; TAKASASE, I. Extração Seqüencial de Cobre, Ferro e Zinco em Ervas Medicinais. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas; v.25, n.(4), p. 844-848, out.-dez. 2005. BHATT MEHUL, K.; DHOLWANI KISHOR, K.; SALUJA AJAY, K. Isolation and structure elucidation of Scopoletin from Ipomoea reniformis (Convolvulaceae). Journal of Applied Pharmaceutical Science, v. 1, n. 05, p. 138-144, 2011. 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